專利名稱:一種口蹄疫基因工程多肽疫苗佐劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為一種口蹄疫基因工程多肽疫苗佐劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是當(dāng)今世界上最為嚴(yán)重的家畜傳染病之一，主要危害豬、牛、羊等偶蹄類動物，且爆發(fā)范圍廣，傳播迅速，動物感染后死亡率高，給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因而被國際獸醫(yī)局列為A類傳染病之首。
基因工程多肽疫苗由于安全性好，易于保存，效果理想等優(yōu)點具有廣闊的應(yīng)用前景。然而基因工程疫苗免疫原性相對較弱，為了更好地激發(fā)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使其對口蹄疫病毒(FMDV)具有足夠的抵抗力，有必要尋求更為簡便有效的方法提高基因工程多肽疫苗的免疫活性。
增強(qiáng)疫苗免疫活性的方法不僅取決于改進(jìn)疫苗中相關(guān)抗原組分的構(gòu)成，還取決于添加合適的佐劑來刺激免疫系統(tǒng)，提高對抗原物質(zhì)的免疫應(yīng)答。一個理想的佐劑應(yīng)該特異性的輔助疫苗刺激免疫系統(tǒng)，同時不會對動物產(chǎn)生副作用。干擾素-α(Interferon，IFN-α)是一類具有抗病毒作用的細(xì)胞因子家族，在正常生理條件下，它在動物體內(nèi)僅有少量組成型表達(dá)；但是當(dāng)病毒或細(xì)菌感染動物體時，該細(xì)胞因子被大量誘導(dǎo)表達(dá)用于機(jī)體細(xì)胞抵御病原入侵。近年來，IFN-α優(yōu)良的免疫調(diào)節(jié)功能被發(fā)現(xiàn)并成為免疫學(xué)的研究熱點。這包括激活B細(xì)胞并輔助B細(xì)胞快速產(chǎn)生針對病原的多克隆抗體；誘導(dǎo)NK細(xì)胞及T細(xì)胞的增值并增加其細(xì)胞毒活性；輔助CD8+記憶T細(xì)胞的生長，延長記憶T細(xì)胞的生存時間；并且對IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6等免疫刺激細(xì)胞因子具有表達(dá)上調(diào)作用。以上的研究成果表明，以IFN-α作為佐劑來提高基因工程多肽疫苗的免疫活性在理論上具有可行性。有文獻(xiàn)表明國外已開展家豬IFN-α作為佐劑與疫苗聯(lián)用預(yù)防口蹄疫的相關(guān)工作。其內(nèi)容為將家豬IFN-α克隆入人重組腺病毒5(h-Ad5)真核表達(dá)載體中，與以h-Ad5為載體的A型口蹄疫重組DNA疫苗聯(lián)用，免疫注射家豬后有對口蹄疫病毒有理想預(yù)防效果，家畜受保護(hù)率為80％。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提出一種以DNA真核表達(dá)載體為基礎(chǔ)的口蹄疫基因工程多肽疫苗佐劑及其制備方法，并將該佐劑應(yīng)用于動物體評估其效果。
本發(fā)明提出的基因工程多肽疫苗佐劑，是由家豬干擾素-α基因通過分子生物學(xué)技術(shù)克隆入真核表達(dá)載體獲得的重組質(zhì)粒。其中，家豬干擾素-α功能基因是指家豬干擾素基因家庭中的任一亞型基因，真核表達(dá)載體可以是以具有真核啟動子、原核啟動子以及原核抗性基因為特征的任一DNA表達(dá)載體。
家豬干擾素-α基因家族一共有14條干擾素-α功能基因，該基因家族各亞型基因的核苷酸同源性達(dá)96％-100％。其中有8條功能基因是包括23個氨基酸的信號肽并且全長為189個氨基酸的完整基因，有6條功能基因是包括23個氨基酸的信號肽并且全長為181個氨基酸的完整基因。家族內(nèi)的各功能基因均具有相似的刺激免疫、用作佐劑的功能。本發(fā)明涉及的干擾素-α基因可以是家豬干擾素-α多基因家族中任一亞型的基因。在應(yīng)用實例中，家豬干擾素-α基因編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.1，其核苷酸序列為SEQID NO.2。
該口蹄疫基因工程多肽疫苗新型佐劑，是在真核表達(dá)載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建而成。DNA真核表達(dá)載體可以是具有以下特征的任一種真核表達(dá)質(zhì)粒(1)構(gòu)建該真核表達(dá)質(zhì)粒所用的真核表達(dá)載體同時帶有原核復(fù)制子；(2)該質(zhì)粒帶有真核啟動子；(3)該質(zhì)粒具有原核選擇抗性基因及合適的多克隆位點，便于基因插入及篩選。
本發(fā)明所應(yīng)用的真核表達(dá)載體具體是以具有真核啟動子、原核復(fù)制子以及原核抗性基因為特征的任一DNA載體。實施例中使用的pcDNA真核表達(dá)質(zhì)粒(Invitrogen公司產(chǎn)品)，在帶有SV40復(fù)制子和CMV啟動子的同時帶有pUC ori復(fù)制子和amp抗性基因。除pcDNA以外，其他系列具有該特征的真核表達(dá)載體均可以用作佐劑的構(gòu)建。
實施例中我們通過RT-PCR的方法從家豬肝臟總RNA中獲得包括23個氨基酸的信號肽并且全長為189個氨基酸的家豬IFN-α基因，以EcoRI和XhoI為酶切位點插入表達(dá)載體pcDNA3，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中。
本發(fā)明的佐劑的制備方法包括基因制備、重組、蛋白活性測定、質(zhì)粒大規(guī)模抽提等步驟，具體如下(1)通過RT-PCR的方法從家豬肝臟總RNA中得到IFN-α完整基因，在實施中，其核苷酸序列為SEQ ID NO.2；(2)將上述基因插入原核克隆載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測序并與GenBank提供的家豬IFN-α序列進(jìn)行對比，確定獲得了正確的基因；(3)上述基因插入真核表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抽提質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞40-50小時，收集上清培養(yǎng)基利用WISH細(xì)胞/水皰性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus)活性測定系統(tǒng)和PK15細(xì)胞/偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus)活性測定系統(tǒng)分別測定家豬IFN-α活性，確定構(gòu)建的重組質(zhì)粒可以表達(dá)活性的家豬IFN-α蛋白。
(4)陽性菌株在35-40℃發(fā)酵培養(yǎng)10-15小時，收集菌體；破碎菌體并用堿裂解法大規(guī)模制備表達(dá)載體質(zhì)粒；利用PBS緩沖液稀釋質(zhì)粒到合適的濃度，配制成本發(fā)明所述的多肽疫苗佐劑。
本發(fā)明還提出所述佐劑的應(yīng)用，具體是將其與口蹄疫基因工程多肽疫苗聯(lián)合注射動物。證明該佐劑能有效輔助疫苗刺激動物體免疫應(yīng)答。在實施例中該佐劑與O型口蹄疫基因工程多肽疫苗聯(lián)用，一次免疫注射家豬后即可對口蹄疫病毒具有理想的預(yù)防效果。
本發(fā)明涉及的O型口蹄疫基因工程多肽疫苗(專利號02137011.7)，是以家豬自體IgG為載體蛋白，口蹄疫病毒抗原多肽連接在載體蛋白的C末端，構(gòu)成一融合蛋白，其中抗原多肽采用口蹄疫病毒VP1蛋白中具有抗原性的氨基酸肽段，并將其組成多拷貝的串聯(lián)結(jié)構(gòu)，在肽段連接處加入氨基酸多肽作為接頭。
實施例中將口蹄疫病毒抗原多肽連接在載體蛋白的C端，構(gòu)成融合蛋白。為了使抗原多肽表達(dá)成融合蛋白后能夠更好地體現(xiàn)抗原性，我們適當(dāng)選取了IgG重鏈恒定區(qū)作為載體蛋白，如后述實施例中采用豬IgG重鏈恒定區(qū)第30位至328位共299個氨基酸肽段作為載體蛋白；FMDV抗原多肽則采用O型口蹄疫病毒VP1蛋白中3個主要抗原表位，即21ヘ40、141ヘ160、200ヘ213三個氨基酸肽段，并將其組成141ヘ160AA-21ヘ40AA(或200ヘ213AA)-141ヘ160AA的串聯(lián)結(jié)構(gòu)，在肽段連接處加入適當(dāng)氨基酸多肽作為接頭，如后述實施例中采用141ヘ160AA(“Y”)-Pro-Gly(“M”)-21ヘ40AA(“X”)-Gln-Phe-Glu-Leu-Glu-Phe-Met-Val-Pro-Ser-Arg(“N”)-141ヘ160AA(“Y”)的抗原多肽結(jié)構(gòu)，前后兩個接頭分別是2個和11個氨基酸。
其結(jié)構(gòu)特征如下抗原基因的兩端各有一個拷貝的編碼141ヘ160位氨基酸的DNA序列，中間是一個拷貝的編碼21ヘ40位氨基酸的DNA序列；連接這些序列的兩個接頭分別是2個和11個氨基酸。
在基因水平上將此串聯(lián)結(jié)構(gòu)連接在IgG重鏈恒定區(qū)的C末端，形成融合基因，表達(dá)獲得融合蛋白。該融合蛋白具有下列特點(1)在基因水平上，載體蛋白基因大小約為900bp，抗原肽基因大小約為240bp，整個融合基因大小約為1.2kb。
(2)在蛋白水平上，載體蛋白只包含豬IgG重鏈恒定區(qū)第30位到第328位氨基酸肽段，即299個氨基酸；抗原多肽為上述的串聯(lián)肽段，其中21ヘ40位氨基酸肽段是一T細(xì)胞表位，141ヘ160位氨基酸肽段是B細(xì)胞表位。整個融合蛋白分子量約為50kDa。
本發(fā)明還涉及到該佐劑的應(yīng)用方法。本發(fā)明涉及的佐劑其優(yōu)點在于與基因工程疫苗聯(lián)用時可降低基因工程疫苗的用量，而且只須與多肽疫苗進(jìn)行一次聯(lián)合免疫即可使動物機(jī)體產(chǎn)生足夠的免疫力，并且藥效持久，使免疫的動物對口蹄疫病毒具有理想的預(yù)防效果。
本發(fā)明涉及的家豬IFN-α作為免疫刺激因子，不僅可以直接利用重組質(zhì)粒作為疫苗佐劑，還可以將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入豬減毒沙門氏菌或?qū)⒓邑i干擾素-α基因與重組腺病毒載體相連作為疫插佐劑。由于IFN-α刺激免疫系統(tǒng)具有廣譜性的特點，因此本發(fā)明提出的新型佐劑不僅可與O型口蹄疫基因工程多肽疫苗聯(lián)合使用，還可以與其他亞型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗聯(lián)用，預(yù)防不同亞型的口蹄疫病毒。同時，我們也提出該佐劑與某一型某一毒株的FMDV基因序列為依據(jù)構(gòu)建的疫苗廣泛適用于易感動物預(yù)防同型口蹄疫病毒的不同毒株，原因是同型口蹄疫病毒的不同毒株之間變異較小，以該佐劑和疫苗聯(lián)合免疫的動物對這些毒株具有交叉免疫力。
對本發(fā)明提出的新型佐劑與O型口蹄疫基因工程多肽疫苗進(jìn)行免疫效力檢驗。以一定量的該聯(lián)合疫苗一次免疫未被自然感染過的豬，一定時間后以O(shè)型口蹄疫病毒進(jìn)行攻擊，結(jié)果顯示，該佐劑與疫苗聯(lián)用對實驗動物具有十分理想的保護(hù)效果(見表1)。利用固相阻斷ELISA檢測病毒攻擊后動物血清中病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的結(jié)果表明，佐劑與疫苗聯(lián)合免疫的動物在病毒攻擊7天及14天以后體內(nèi)無病毒復(fù)制(見表2)。
表1佐劑和疫苗聯(lián)合免疫動物的免疫保護(hù)效果
注佐劑干擾素DNA2mg；多肽疫苗IgG-FMDV重組蛋白6mg表2病毒攻擊疫苗免疫動物后血清中病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測
注1佐劑干擾素DNA 2mg；多肽疫苗IgG-FMDV重組蛋白6mg注2利用固相阻斷ELISA測定動物血清中非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，數(shù)據(jù)為三頭動物阻斷百分率率的平均值。當(dāng)非結(jié)構(gòu)蛋白阻斷率≥20％時可判斷動物感染病毒，說明病毒在動物體內(nèi)復(fù)制。
具體實施方式下面以豬口蹄疫O型基因工程多肽疫苗和本發(fā)明涉及的新型佐劑為例進(jìn)一步具體描述本發(fā)明。
佐劑的構(gòu)建過程。取得家豬肝臟樣品并利用總RNA抽提試劑(Trizol，Invitrogen公司產(chǎn)品)抽提肝臟總RNA，通過RT-PCR的方法從家豬肝臟總RNA中獲得包括23個信號肽并且全長為189個氨基酸的家豬IFN-α基因，其核苷酸序列為SEQ.ID.NO.2，其編碼的氨基酸序列為SEQ.ID.NO.1，將上述基因插入原核克隆載體pMD18-T(TaKaRa公司產(chǎn)品)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，挑取陽性克隆測序并與GenBank提供的家豬IFN-α序列進(jìn)行對比，確定獲得了正確的基因；將上述基因以EcoRI和XhoI為酶切位點插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(Invitrogen公司產(chǎn)品)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得的陽性克隆命名為pcDNA-IFN。抽提pcDNA-IFN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞40-50小時，收集上清培養(yǎng)基利用WISH細(xì)胞/水皰性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus)活性測定系統(tǒng)和PK15細(xì)胞/偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus)活性測定系統(tǒng)分別測定家豬干擾素-α活性，確定構(gòu)建的重組質(zhì)粒可以表達(dá)活性的家豬IFN-α蛋白。
多肽疫苗的構(gòu)建過程(專利號02137011.7)。用化學(xué)方法合成VP1基因中編碼200ヘ213、141ヘ160位氨基酸片段的DNA序列和接頭DNA序列，在基因水平上串聯(lián)成為141ヘ160AA-200ヘ213AA-141ヘ160AA的一級結(jié)構(gòu)，并將其插入克隆載體pBluescriptIIKS。取1ug pBluescriptIIKS用EcoRI和BamHI雙酶切，于37℃反應(yīng)兩小時，電泳割膠回收大片段。將此大片段DNA與上述串聯(lián)片段混合，在T4 ligase等作用下發(fā)生連接反應(yīng)。獲得的重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)于氮芐青霉素平板中，37℃倒置過夜。挑取白色轉(zhuǎn)化子，以BstEII單酶切、EcoRI和BamHI雙酶切、PCR擴(kuò)增、DNA測序分析鑒定轉(zhuǎn)化子，從而獲得陽性克隆。用EcoRI和BamHI雙切上述陽性克隆，電泳割膠回收小片段。同樣用這兩個限制性內(nèi)切酶雙切表達(dá)質(zhì)粒載體pTrcHisA，電泳割膠回收大片段。與上述同理連接、轉(zhuǎn)化與篩選，最終獲得陽性克隆，命名為pXZ860。
將pXZ860和pcDNA-IFN以LB培養(yǎng)液為發(fā)酵液，37℃攪拌速度6000rpm通氣培養(yǎng)。PXZ860在培養(yǎng)2小時(OD值約0.8)后加入終濃度1mM的IPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)8小時收集菌體，再將菌體懸浮于破壁液中，用95W功率的超聲儀破壁5分鐘；超聲后5000rpm離心20分鐘收集抗原蛋白，將其配成油乳劑即可獲得多肽疫苗。pcDNA-IFN培養(yǎng)過夜并收集菌體，以堿裂解法大規(guī)模抽提質(zhì)粒DNA，利用PBS將質(zhì)粒稀釋到1mg/ml即可獲得所述多肽疫苗的新型佐劑。
最后將上述疫苗及佐劑用于免疫口蹄疫易感動物。有關(guān)動物抗病毒能力檢測實驗結(jié)果見表1及表2。
本發(fā)明涉及的序列如下SEQ ID NO.1MAPTSAFFTALVLLSCNAICSLGCDLPQTHSLAHTRALRLLAQMRRISPFSCLDHRRDFGFPQEALGGNQVQKAQAMALVHEMLQQTFQLFSTEGSAAAWDESLLHQFCTGLDQQLRDLEACVMQEVGLEGTPLLEEDSILAVRKYFHRLTLYLQEKNYSPCAWEIVRAEVMRVFSSSRNLQDRLRKKESEQ ID NO.2ATGGCCCCAACCTCAGCCTTCTTCACAGCCCTGGTGCTACTCAGCTGCAATGCCATCTGCTCTCTGGGCTGTGACCTGCCTCAGACCCATAGCCTGGCGCACACCAGGGCCCTGAGGCTCCTGGCACAAATGAGGAGAATCTCCCCCTTCTCCTGCCTGGACCACAGAAGGGACTTTGGATTCCCCCAAGAGGCCTTGGGGGGCAACCAGGTCCAGAAGGCTCAAGCCATGGCTCTGGTGCATGAGATGCTCCAGCAGACCTTCCAGCTCTTCAGCACAGAGGGCTCGGCTGCTGCCTGGGATGAGAGCCTCCTGCACCAGTTCTGCACTGGACTGGATCAGCAGCTCAGGGACCTGGAAGCCTGTGTCATGCAGGAGGTGGGGCTGGAAGGGACCCCCCTGCTGGAGGAGGACTCCATCCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCACAGACTCACCCTCTATCTGCAAGAAAAGAACTACAGCCCCTGTGCCTGGGAGATCGTCAGGGCAGAAGTCATGAGAGTCTTCTCTTCCTCCAGAAACCTGCAAGACAGACTCAGGAAGAAGGAGTGA
權(quán)利要求
1.一種口蹄疫基因工程多肽疫苗佐劑，其特征在于是由家豬干擾素-α基因通過分子生物學(xué)技術(shù)克隆至真核表達(dá)載體獲得的重組質(zhì)粒，家豬干擾素-α功能基因是指家豬干擾素基因家庭中的任一亞型基因，真核表達(dá)載體可以是以具有真核啟動子、原核啟動子以及原核抗性基因為特征的任一DNA表達(dá)載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的口蹄疫基因工程多肽疫苗佐劑，其特征在于所述家豬干擾素-α完整基因編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.1，其核苷酸序列為SEQ ID NO.2。
3.一種口蹄疫基因工程多肽疫苗佐劑，其特征在于由權(quán)利要求
1中所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入豬減毒沙門氏菌或?qū)⒓邑i干擾素-α基因與重組腺病毒載體相連而獲得。
4.一種如權(quán)利要求
1所述的口蹄疫基因工程多肽疫苗佐劑的制備方法，包括基因制備、重組、蛋白活性測定及表達(dá)載體質(zhì)粒的大規(guī)模抽提，其特征在于具體步驟如下(1)通過RT-PCR的方法從家豬肝臟總RNA中得到家豬干擾索-α完整基因；(2)將上述基因插入原核克隆載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測序并與GenBank提供的家豬IFN-α序列進(jìn)行對比，確定獲得了正確的基因；(3)上述基因插入真核表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抽提質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，收集上清培養(yǎng)基利用WISH細(xì)胞/水皰性口炎病毒活性測定系統(tǒng)和PK15細(xì)胞/偽狂犬病毒活性測定系統(tǒng)分別測定家豬干擾素-α活性，確定構(gòu)建的重組質(zhì)?？梢员磉_(dá)活性的家豬IFN-α蛋白；(4)陽性菌株在35-40℃發(fā)酵培養(yǎng)10-15小時，收集菌體；破碎菌體并大規(guī)模制備表達(dá)載體質(zhì)粒；利用PBS緩沖液稀釋質(zhì)粒到合適的濃度，配制得本發(fā)明所述的多肽疫苗佐劑。
5.如權(quán)利要求
1或4所述的口蹄疫基因工程多肽疫苗佐劑的應(yīng)用，其特征在于該佐劑與O型、Asia I型、A型或C型幾種不同血清型的多肽疫苗聯(lián)用，用于預(yù)防該型口蹄疫，或者以某一型某一毒株的FMDV基因序列為依據(jù)構(gòu)建的疫苗與該佐劑聯(lián)用，用于預(yù)防同型口蹄疫病毒不同毒株的感染。
專利摘要
本發(fā)明屬遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為一種口蹄疫基因工程多肽疫苗佐劑及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明涉及的佐劑是將家豬干擾素－α基因利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆入真核表達(dá)載體獲得的重組質(zhì)粒。其中家豬干擾素－α基因是指家豬干擾素－α多基因家族中的任一亞型的基因；真核表達(dá)載體可以是具有真核啟動子、原核復(fù)制子以及原核抗性基因為特征的任一種DNA表達(dá)載體。該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌擴(kuò)增并通過堿裂解法獲得大量質(zhì)粒，并用PBS緩沖液稀釋質(zhì)粒到一定濃度，配制成本發(fā)明所述的多肽疫苗佐劑。動物試驗證明，該佐劑安全性好，效果顯著，與O型口蹄疫基因工程疫苗聯(lián)用，一次免疫注射家豬后即可對口蹄疫病毒具有理想的預(yù)防效果，家畜受保護(hù)率達(dá)100％。
文檔編號A61K39/135GK1994470SQ200610147664
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月21日
發(fā)明者鄭兆鑫, 嚴(yán)維耀, 程功, 劉明秋 申請人:復(fù)旦大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan