專利名稱:γ-球蛋白的病毒滅活熱處理方法以及經(jīng)過熱處理的含有這種蛋白的水溶液的制作方法
本項發(fā)明是關(guān)于含有γ-球蛋白的水溶液的一種熱處理方法。更確切地說，是本發(fā)明是關(guān)于γ-球蛋白的一種穩(wěn)定的熱處理方法。在此方法中，將某種選定的穩(wěn)定劑加到γ-球蛋白的水溶液里，在低溫巴斯德消毒后，也就是在60℃進(jìn)行10小時處理后，並未觀察到γ-球蛋白二聚體或多聚體的增加，也未觀察到抗補體活性的提高。
各種含有血漿蛋白質(zhì)組分的免疫球蛋白，特別是含有IgG作為主要成分的γ-球蛋白制劑已廣泛用于預(yù)防和治療各種傳染性疾病。然而，它們並未經(jīng)受熱滅菌，原因是(1)它們的熱穩(wěn)定性很差;(2)它們含有對各種病毒和細(xì)菌的多種抗體，而這些抗體的活性很容易失去。
然而，當(dāng)從血漿蛋白質(zhì)組分制備γ-球蛋白時，不可能完全消除病毒(例如肝炎病毒)污染的可能性。因此，使γ-球蛋白制劑預(yù)先在60℃經(jīng)受10小時的熱處理是很重要的。這種處理在血液組分制備技術(shù)中，已被廣泛認(rèn)為是使污染病毒失活的一種方法。
然而，當(dāng)在一種常規(guī)的水溶液，如生理鹽水中進(jìn)行這種處理時，該溶液在短時間里變得混濁，大部分活性喪失，蛋白質(zhì)分子發(fā)生變性。
經(jīng)廣泛研究之后，發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，在為使肝炎病毒失活而進(jìn)行熱處理時，若從單糖、雙糖和糖醇中選出至少一種(在下文通常稱之為基本穩(wěn)定劑)，加到含有γ-球蛋白的水溶液中，則γ-球蛋白抗熱處理的熱穩(wěn)定性得到顯著改善。還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)除了所說的基本穩(wěn)定劑外，還將從中性氨基酸、中性無機酸鹽、表面活性劑以及有機羧酸鹽中選出的至少一種物質(zhì)(在下文通常稱之為輔助穩(wěn)定劑)加到該溶液中時，γ-球蛋白的熱穩(wěn)定性進(jìn)一步提高。本發(fā)明是在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上完成的。
此外，按照本發(fā)明方法進(jìn)行熱處理，可以將γ-球蛋白水溶液中所含的γ-球蛋白的二聚體或多聚體解離為它的單體。
在根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行熱處理前，含γ-球蛋白的水溶液可以是處于從未純化的含γ-球蛋白的水溶液到已純化水溶液之間的任何純化階段的γ-球蛋白水溶液。不過，處于部分純化或純化階段的水溶液接受熱處理較為有利。該水溶液最好含有0.1～30%(重量/體積)的蛋白質(zhì)(γ-球蛋白)。該水溶液的pH值一般是4.5～10，最好用一適宜的緩沖溶液調(diào)節(jié)到pH6到8。
至于加到含有γ-球蛋白水溶液中的基本穩(wěn)定劑，單糖中較好的例子包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖和果糖，雙糖中較好的例子包括蔗糖、麥芽糖和乳糖，而糖醇中較好的例子包括甘露糖醇、山梨糖醇和木糖醇，但它們並不限于這些例子。基本穩(wěn)定劑的加入量為每100毫升γ-球蛋白水溶液10-100克，最好是40-100克。
本項發(fā)明所使用的輔助穩(wěn)定劑中，中性無機酸鹽包括，舉例來說，堿金屬或堿土金屬鹵化物如氯化鈉、氯化鉀和氯化鎂。它們的加入量為每100毫升γ-球蛋白水溶液0.1-10克。
中性氨基酸(即單-氨基單-羧基的氨基酸)的例子包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。它們的加入量是每100毫升γ-球蛋白水溶液1-20克。
在本發(fā)明中所涉及的有機羧酸是一種包含一個烴基和一個與烴基相連的羧基取代基的化合物。烴基可以是飽和的，也可以是不飽和的;可以是鏈狀的(直鏈或支鏈)，也可以是環(huán)狀的。烴基的例子包括烷基和芳基(例如苯基)。在上述有機羧酸中羧基可以有多個，但最好是一個或兩個。另外，上述有機羧酸可以帶一個羥基。有機酸最好有約3到約15個碳原子。
有機羧酸的鹽的種類沒有特殊限制，只要它在生理上是可接受的。這種鹽的較好的例子包括堿金屬鹽，例如鈉鹽和鉀鹽，以及堿土金屬鹽，例如鈣鹽。特別好的是鈉鹽和鉀鹽。有機酸鹽的具體例子尤其包括下列酸的堿金屬鹽(鈉或鉀鹽)丙酸、丁酸、戊酸、辛酸、己酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸和苯乙醇酸。有機酸鹽的加入量是每100毫升γ-球蛋白水溶液1-30克。
本發(fā)明中可應(yīng)用的表面活性劑的例子包括非離子的表面活性劑，例如烷代苯基-聚氧乙烯，其分子量為500-1000〔例如Tri-ton(注冊商標(biāo))和Nonidet(注冊商標(biāo))〕;如膽汁酸鹽等陰離子表面活性劑，例如?；悄懰徕c;陽離子表面活性劑，例如氯苯殺克;以及具有表面活性的多元醇類，例如某種高分子量的氧化丙烯共聚物，其分子量為2000-12000〔例如Pluronic(注冊商標(biāo))F68〕它們的加入量最好是每100毫升γ-球蛋白水溶液約0.002-約0.05克。
為了僅使污染病毒失活，熱處理應(yīng)該在足夠高的溫度下進(jìn)行足夠長的時間。例如，熱處理在50-70℃，最好是約60℃下進(jìn)行5-20小時，最好是10小時。
為了檢驗按照本發(fā)明進(jìn)行熱處理的效果，按下述方法測試了在有基本穩(wěn)定劑存在和沒有基本穩(wěn)定劑存在的情況下進(jìn)行加熱對各種病毒的傳染性的效果，這些病毒是人們擔(dān)心在γ-球蛋白制劑中有可能存在的。因此，將水痘病病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、水泡病毒、Chikun-gunya病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩基病毒或仿病毒加到γ-球蛋白溶液樣品中，所得混合物在60℃熱處理10個小時，然后測定這些病毒隨著時間的推移所保留下來的傳染性。已發(fā)現(xiàn)，在10小時后，不論有無穩(wěn)定劑，傳染性均完全消失。該結(jié)果使人想到，當(dāng)依照本發(fā)明進(jìn)行熱處理時，除了上面所用的那些病毒外，其它病毒也將失去它們的傳染性
在進(jìn)行有本項發(fā)明的基本穩(wěn)定劑存在的上述熱處理之后，檢查生成的產(chǎn)物的外觀和性質(zhì)，並進(jìn)一步定量測定γ-球蛋白的二聚體或多聚體、測定抗補體活性、測定麻疹抗體的滴定度並進(jìn)行急性毒性試驗。如后面的實例中所示，所得結(jié)果表明γ-球蛋白的二聚體或多聚體及抗補體活性均有減少，但抗體滴定度仍保持著。這表明，由本發(fā)明方法可得到極為安全且在醫(yī)療上具有高效的γ-球蛋白制劑。
這樣獲得的產(chǎn)品呈液態(tài)。視包裝單位的大小，將其配制成含50-10000毫克γ-球蛋白的單位產(chǎn)品，配制時如果原來使用的是高度純化的γ-球蛋白作為原料，則將所得產(chǎn)品直接用于配制;如果產(chǎn)品是由一種粗產(chǎn)品制得的，則在按已知的純制方法進(jìn)行處理，然后根據(jù)需要，進(jìn)行透析或無菌過濾，再將其用于配制。其儲存方法並無特別限制，只需避免高溫。不過，在溫度不高于30℃時儲存最好，或者，愿意的話，可以制成一種冷凍干燥制品。
這樣處理的γ-球蛋白即可直接用于給藥，或者，在已知的某種預(yù)備處理進(jìn)行后-例如以可供針劑用的蒸餾水稀釋或溶解或透析之后用于給藥。對于成人，一般劑量為每次每公斤體重2500-5000毫克γ-球蛋白，而對未成年人，為每次每公斤體重100-150毫克。
以下實例進(jìn)一步說明了本發(fā)明，但本發(fā)明並不限于這些實例。
在這些實例中，由于混濁度成為一個問題，故測定吸收度-600nm處的光密度，以反映外觀情況。
二聚體或多聚體的量是借助于高性能的液相色譜測定的。
按照Kabatt和Meyer的方法〔Experimental Immunochemistry，225(1961)〕以及Nishioka和Okada的方法[Men eki no Seikagaku(Biochemistry of immuni-ty)103，(1971);Published by Kyoritsu ShuppanCo。測定抗補體活性。也就是，將一樣品加到100個單位補體內(nèi)測定在所得混合液中殘存的補體單位數(shù)。抗補體活性用所減少的單位表示。
麻疹抗體滴定度是根據(jù)血細(xì)胞凝集作用抑制試驗測定的，並且用國際單位(IU/150mg)表示。
實例1
下述實驗是為證實本發(fā)明的穩(wěn)定效果而做的。將含有約30%的γ-球蛋白多聚體溶液調(diào)節(jié)到5%的濃度，用如此制備的樣品進(jìn)行實驗。樣品中加入各種基本穩(wěn)定劑(所加的量在表1中說明)之后，在60℃熱處理樣品10小時，接著，測定該溶液的混濁度(600nm光密度)、多聚體的數(shù)量以及抗補體的活性。所獲得的結(jié)果表明，由于加入穩(wěn)定劑，處于加熱中的γ-球蛋白的穩(wěn)定性得到了改善(表1)。
此外還證實多聚體，特別是二聚體的量減少了。


實例2
按各種濃度將葡糖加到含有大約20%(W/V)多聚體的γ-球蛋白溶液中，並且將所得混合物中的γ-球蛋白濃度調(diào)節(jié)到5%(W/V)所獲得的溶液在60℃熱處理，隨著時間的推移，測定600nm的光密度值、多聚體的數(shù)量、抗補體活性以及麻疹抗體的滴定度。
不含葡糖的體系在1小時內(nèi)就變混濁，這表明發(fā)生了變性。含有添加的葡糖的體系則表現(xiàn)為γ-球蛋白的穩(wěn)定性隨著葡糖加入量的增加而增加。加入100克葡糖的體系並不變混濁，甚至在60℃加熱10小時后，麻疹抗體滴定度也不見減少。此外，二聚體的含量減少到僅剩10%，抗補體活性也減少到19單位(表2)。


實例3
除了基本穩(wěn)定劑葡糖外，以中性氨基酸(甘氨酸)、中性鹽(氯化鈉)，有機羧酸鹽(檸檬酸鈉)以及表面活性劑(Pluronic
F68)中選出一或兩種輔助穩(wěn)定劑，也將它(們)加到γ-球蛋白溶液中，測定所得溶液中γ-球蛋白的對于在60℃熱處理10小時的穩(wěn)定性。試驗是用一種和例1中所用相同、只是含約15%(W/V)的多聚體的γ-球蛋白溶液進(jìn)行的。
在各為100毫升的γ-球蛋白溶液內(nèi)均加入75克葡糖，並且分別加入5.8%(W/V)的氯化鈉、5%(W/V)的甘氨酸、10%(W/V)的檸檬酸鈉、0.01%(W/V)的Pluronic
F68以及5.8%(W/V)氯化鈉和0.01%(W/V)的Pluroric
F68這兩種輔助穩(wěn)定劑的組合，對由此形成的各個體系都進(jìn)行60℃，10小時的熱處理。所得結(jié)果如表3所示。這些結(jié)果表明，多聚體的含量和抗補體活性可由于輔助穩(wěn)定劑的加入而進(jìn)一步降低。


實例4
急性毒性試驗是根據(jù)一種安全試驗的方法進(jìn)行的。
將實例3的已經(jīng)過60℃、10小時熱處理的樣品A、B、C、D、E和F均對無菌生理鹽水充分透析。然后，通過尾靜脈按每只動物0.5和1.0毫升的總量分別給5只一組的各組小鼠用藥。觀察7天后未發(fā)現(xiàn)反常。
權(quán)利要求
1、熱處理γ-球蛋白水溶液而使病毒失活的一種方法，包括從單糖、雙糖和糖醇中選出至少一種穩(wěn)定劑，加到γ-球蛋白水溶液中，加入的量要能使其中的γ-球蛋白穩(wěn)定，並且在50℃-70℃將水溶液加熱足夠長的一段時間，以消除病毒的傳染性。
2、根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中水溶液含有按蛋白質(zhì)計為0.1-30%(W/V)的γ-球蛋白。
3、根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中水溶液的pH值為4.5-10。
4、根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中穩(wěn)定劑的量為每100毫升該溶液10-100克。
5、根據(jù)權(quán)利要求
4的方法，其中穩(wěn)定劑的量為100毫升該溶液40-100克。
6、根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中，除了穩(wěn)定劑外，為了在單獨使用該穩(wěn)定劑的基礎(chǔ)上進(jìn)一步降低抗補體活性，還加入至少一種有效量的輔助穩(wěn)定劑，輔助穩(wěn)定劑是從中性氨基酸、中性無機酸鹽、具有3-15個碳原子的有機羧酸以及表面活性劑中選出的。
7、根據(jù)權(quán)利要求
6的方法，其中，中性氨基酸的量為每100毫升該溶液1-20克。
8、根據(jù)權(quán)利要求
6的方法，其中，有機羧酸的量為每100毫升該溶液1-30克。
9、根據(jù)權(quán)利要求
6的方法，其中，無機酸鹽的量為每100毫升該溶液0.1-10克。
10、根據(jù)權(quán)利要求
6的方法，其中，表面活性劑的量為每100毫升該溶液0.002-0.05克。
11、根據(jù)權(quán)利要求
1的方法制備的經(jīng)病毒滅活的γ-球蛋白水溶液。
專利摘要
當(dāng)處理添加有單糖、雙糖或糖醇等至少一種穩(wěn)定劑的γ-球蛋白水溶液時，這種溶液可以經(jīng)受消毒熱處理而不失去其活性。穩(wěn)定劑有在進(jìn)行處理之前減少有害多聚體或γ-球蛋白的抗補體活性，卻保留抗各種病毒和細(xì)菌的多種抗體的滴定度的作用。而可能含有的病毒的傳染性則完全被消除。 將中性氨基酸、中性無機鹽、有機羧酸鹽或表面活性劑等另一種穩(wěn)定劑和上述穩(wěn)定劑一起使用有助于穩(wěn)定劑的作用。
文檔編號A61L2/00GK86101708SQ86101708
公開日1986年9月17日 申請日期1986年2月18日
發(fā)明者平尾豐, 瓜生勝寬, 上村八尋 申請人:株式會社綠十字導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan