專利名稱:以親和力層析法純化血紅素及改良血紅素的制作方法
本發(fā)明系關(guān)于血紅素基無(wú)細(xì)胞遞氧體(hemoglobin-based acellular oxygen carriers)，尤其系一種藉親和力層析法技術(shù)純化血紅素及改良的血紅素。
研究于發(fā)展無(wú)細(xì)胞遞氧溶液以應(yīng)用為一血液取代注重兩方面，即血紅素基之溶液及過(guò)氟碳物質(zhì)(perfluorocarbon substances)如在必羅(Biro)之例子說(shuō)明(Can.Med.Assoc.J，Vol.129，1983，Pp.237-244)。目前的工作已指示，過(guò)氟碳類為較不適合，原因是，例如，特別的臨床條件為其應(yīng)用上之需要及毒性問(wèn)題。因此，現(xiàn)在的研究系集焦于潛在血紅素基血液取代。因?yàn)檠t素于溶液(而非它在自然發(fā)現(xiàn)于紅血球中)在生理而言并非為滿意遞氧體，發(fā)展具有優(yōu)良遞氧及循環(huán)特征之血紅素衍生物被委任。
于本研究中血紅素之主要來(lái)源是目前“落后”輸血者“紅血球在自然上含有豐富之血紅素。從這此來(lái)源血紅素之隔離藉數(shù)種方法而已達(dá)成，該等方法為牽涉從其他紅血球細(xì)胞蛋白質(zhì)及從細(xì)胞基質(zhì)(cell stroma)之血紅素分離方法。
純化血紅素之標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)為離子交換層析法(ion-exchange chromatography)。此技術(shù)已經(jīng)很廣泛的被用于分析(analytical)及診斷(diagnostic)應(yīng)用(例如，參考Benesch and Benesch;Meth Enzymol.，Vol.76，PP，174-179，1981;及Hsia et al，J.Chromatog.，Vol.303，PP.425-428，1984)。
然而，一種較迅速及特殊之純化技術(shù)為親和力層析法，它選擇上隔離生物分子，藉其對(duì)某種分子、原子團(tuán)、離子、或基稱為配合基(ligands)而與生物分子形成復(fù)合物之束縛特殊性。一般上，在此技術(shù)中，配合基在一層析的凝膠上是制動(dòng)的，而一含所需分子之溶液經(jīng)由凝膠而傳送。所需之分子是保留在凝膠上，是憑藉其特殊束縛配合基，而同時(shí)其他存在于此溶液之成份被洗提。
已得曉，血紅素特別的束縛小多元陰離子性分子，尤其是2，3-二磷酸甘油酸鹽(2，3-diphosphoglycerate)(DPG)及三磷酸腺苷(adenosine triphosphate)(ATP)，自然的存在于哺乳類紅血球(Benesch and Benesch Nature，Vol，221;P.618，1969)。血紅素之束縛處位置即束縛進(jìn)行位置是位于或接近血紅素之四聚物結(jié)構(gòu)之中心(Arkone，A.，Nature，Vol.237，P.146，1972)。這些多元陰離子性分子束縛血紅素于位置為重要的在于調(diào)整氧束縛親和力，因多元陰離子性分子之束縛異形位阻上影響了血紅素之組成進(jìn)而引起這些和氧束縛親和力之減少(Benesch and Benesch，Biochem，Biophys.Res.Comm.，Vol.26，P.162，1967)相反的，氧束縛于血紅素異形位阻上減少了血紅素對(duì)多元陰離子之親和力。因此，氧血紅素(Oxyhemoglobin)很弱的束縛DPG及ATP。這在奧卡大(Ogata)及麥康尼爾((Mcconnell)(Ann.N.Y.Acad.Sc.Vol.222，P.56，1973)描述之旋轉(zhuǎn)標(biāo)記ATP(spin-labelled ATP)束縛氧血紅素及無(wú)氧血紅素有表示。
較特定的，上述多元陰離子性分子之束縛處是一般上介于血紅素之B-血球蛋白(B-glebin)鏈之間，而可被認(rèn)為是介于鏈之間的一“裂縫”。在紅血球之自然條件下，這裂縫是由-DPG(于其醛類形式)之分子所占據(jù)。當(dāng)血紅素與氧束縛時(shí)以形成氧血紅素，一結(jié)構(gòu)重組形成而產(chǎn)生DPG由裂縫冒出而它被認(rèn)為裂縫關(guān)閉之有效性。氧的一分子束縛該四聚物的血紅素實(shí)際上增加其氧親和力，以束縛至一第二、第三及第四個(gè)氧分子。
以往，血紅素的研究及嘗試以制備無(wú)細(xì)胞溶液血紅素以用于血液取代，曾揭露一廣泛種類之多元陰離子性基及分子將在束縛處或裂縫處自然的由DPG所占據(jù)束縛。某種此研究，曾經(jīng)是嘗試的一部份以提供四聚物性血紅素之B-鍵于溶液中之束縛以抵消(counteract)四聚物性血紅素之不期望之傾向以解離成二聚物。在血細(xì)胞之自然血紅素，此功能至少在某部份由裂縫里的DPG來(lái)滿足，然而在溶液里，該DPG趨向由溶液擴(kuò)散。于那些物質(zhì)將會(huì)在裂縫束縛當(dāng)做“DPG取代”為各種有機(jī)磷酸鹽、二磷酸鹽(diphosphates)及聚磷酸鹽，例如吡哆醛磷酸鹽(pyridoxal phosphate);磷酸類或核酸類例如ADP，ATP，嘌呤核苷(guanosine)磷酸鹽，胞嘧啶磷酸鹽(cytosine phosphates)，胸腺嘧啶磷酸鹽(thymine phosphates)，尿嘧啶磷酸鹽(uracil phosphate)等;肌醇磷酸鹽(inositol phosphates)碳水化合物磷酸鹽及硫酸鹽;單碳水化合物及聚碳水化合物等。對(duì)于熟悉此技術(shù)者，有各種此類的束縛物質(zhì)為習(xí)知的，及出版在相關(guān)之科學(xué)文獻(xiàn)里。
因?yàn)檠t素的氧化作用而形成氧血紅素有效的使血紅素之多元陰離子性束縛處(“關(guān)閉裂縫”)不活潑，根據(jù)習(xí)知技術(shù)，是有必要開發(fā)血紅素之多元陰離子束縛之特性，或的確進(jìn)行調(diào)整氧束縛親和力，是藉化學(xué)上改良多元陰離子束縛處，而該血紅素為脫氧。然而，血紅素存在于溶液中或混合物以基氧狀況曝露于空氣，i.e(氧)血紅素。的確，很難維持血紅素溶液于未氧化作用情況，經(jīng)步驟涉到溶液與空氣的接觸，eg一層析步驟。因?yàn)榇朔N難題，親和力層析法之技術(shù)不曾用于習(xí)用上以純化血紅素。
出乎意料的，它被發(fā)現(xiàn)(氧)血紅素可利用親和力層析法技術(shù)來(lái)隔離及純化。當(dāng)然，所描述的技術(shù)，可應(yīng)用于未氧化作用血紅素的隔離及純化作用。
本發(fā)明包含了利用親和力層析法以隔離及從完整血液或其他來(lái)源或混合物之純化，是憑藉血紅素之可逆束縛經(jīng)其多元陰離子束縛處至一多元陰離子制動(dòng)于一層析的凝膠支持。此一發(fā)現(xiàn)允許了血紅素在那狀態(tài)之純化，其中在正當(dāng)試驗(yàn)室條件下它占優(yōu)勢(shì)。
根據(jù)本發(fā)明，提供一種從含(氧)血紅素溶液或混合物以隔離(氧)血紅素的方法，包括(a)制止一特定束縛血紅素由其多元陰離子束縛處之多元陰離子于層析的凝膠;及(b)經(jīng)該凝膠傳遞含(氧)血紅素溶液或混合物，其中該(氧)血紅素是保留于凝膠中，而溶液或混合物的其他成份被洗提。
尤其是，如果(氧)血紅素溶液傳過(guò)ATP-瓊脂糖凝膠時(shí)(商業(yè)上可獲得或以習(xí)知方法來(lái)制備)，它被觀察到血紅素是被凝膠所保留，而產(chǎn)生了被稱為“紅凝膠(red gel)”。在紅凝膠中，血紅素之氧束縛特征，就如由氧解離曲線(oxygen dissociation curve)所表示，是與其溶解ATP復(fù)合物(P50-35mmHg)相同而較在Bls-Tris緩沖劑溶液(P50-7mmHg)之血紅素相同。因此，在紅凝膠之血紅素由ATP束縛異形位阻上改良至該多元陰離子處。另外一些證據(jù)，含任何各種競(jìng)爭(zhēng)陰離子溶液的引入造成血紅素由凝膠之洗提(elution)。這一些競(jìng)爭(zhēng)陰離子，由遞減的有效性之按次療為肌醇己磷酸鹽＞ATP
比哆醛磷酸鹽
DPG＞二磷酸腺苷＞磷酸鹽離子＞氯離子。除了紅凝膠之氧解離動(dòng)力外，這種特殊及可逆束縛表示了(氧)血紅素的特殊束縛至多元陰離子親和力凝膠之功能上的表現(xiàn)。
此發(fā)現(xiàn)，與氧及多元陰離子相互獨(dú)占束縛之報(bào)告有矛盾，是歸于下列。第1，該ATP-瓊脂糖膠給予血紅素一高局部ATP濃度，化學(xué)計(jì)算上為有利于束縛。第2，它被相信，疏水性空間分子(spacer molecule)連接ATP至凝膠，及瓊脂糖凝膠物質(zhì)本身;扮演以增加ATP束縛至血紅素之多元陰離子束縛處。然而，它并非推斷本發(fā)明是限制于任何特別理論或作用方式，或者它被限制于瓊脂糖凝膠，ATP配合基及特殊疏水性空間分子之特別應(yīng)用。
因此，親和力層析法技術(shù)可被應(yīng)用于(氧)血紅素之隔離及純化作用。這表示了對(duì)傳統(tǒng)技術(shù)的改良，它特定的在-1步驟層析法上隔離高純度的血紅素，利用溫和條件而不分裂蛋白質(zhì)之原始結(jié)構(gòu)，它可容易的適合用于大規(guī)模批式制備，對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)血紅素基血液之取代是必須的。最后，有關(guān)于本產(chǎn)物之功能品質(zhì)，此步驟選擇上隔離血紅素與其束縛多元陰離子完整之能力，而產(chǎn)生了功能上完整血紅素而同時(shí)排除了不期望之雜質(zhì)。
本發(fā)明之程序通常被實(shí)施，由提供一塔(column)含有該層析的凝膠及使含(氧)血紅素溶液流過(guò)該塔，隨后，再由適當(dāng)洗提試劑處理，此一步驟之操作并非必要的。如果需要，可在一關(guān)閉槽器中具有攪拌器混合該溶液及凝膠，固體及液體被分離，例如，以過(guò)濾法或離心法，及隨后以液體洗提劑重覆該操作步驟。
于本發(fā)明實(shí)施例中之目的，(氧)血紅素是由在親和力凝膠上之親和力層析法隔離，包括一多元陰離子性分子由一疏水性空間群(交聯(lián)劑)連接至一層析的凝膠，以習(xí)知方法支持。多元陰離子性配合基之例子為二磷酸甘油酸鹽(diphosphoglycerate)，核苷磷酸鹽(nucleoside phosphate)，肌醇磷酸鹽及硫酸鹽等等。的確，任何多元陰離子配合基，它能束縛于束縛處或裂縫自然的由血紅素之DPG所占據(jù)將可被利用。如前述曾經(jīng)討論，此種例子為習(xí)知及出版。
更佳，用于層析的凝膠配合基，至少用于試驗(yàn)室目的為ATP。然而，在一較大規(guī)模，ATP趨向于純化的困難度，該配合基不應(yīng)堅(jiān)固的束縛于該(氧)血紅素，而使(氧)血紅素從凝膠的洗提面臨困難。如果(氧)血紅素束縛太過(guò)緊固，那么，在應(yīng)用適當(dāng)強(qiáng)洗提試劑，例如變性蛋白質(zhì)(protein denaturing)可會(huì)造成副反應(yīng)。如果應(yīng)用有機(jī)多元磷酸鹽，配合基至(氧)血紅素之鍵強(qiáng)度呈現(xiàn)增強(qiáng)當(dāng)磷酸鹽基增加時(shí)，最適當(dāng)鍵強(qiáng)度是由三，四，及戊一磷酸鹽類所衍出，使得較佳形成配合基化合物為核苷三及四磷酸鹽，例如ATP.肌醇四磷酸鹽，股醇戊一磷酸鹽及其類似，包括其混合物。配合基分子是化學(xué)上鍵合至凝膠基，使得磷酸鹽，硫酸鹽或碳水化合物官能基為完整的與多元陰離子束縛處或在血紅素之裂編進(jìn)行反應(yīng)。在ATP情況時(shí)，它可被鍵合于凝膠經(jīng)由腺苷(adenosine)之N-6位置或8-位置，或例如，經(jīng)由過(guò)碘酸鹽(poriodate)氧化的核糖部份。
層析的凝膠提供了一交聯(lián)劑或空間群，它是一有效的化學(xué)鏈群共鍵的聯(lián)接至凝膠的一端及提供了一反應(yīng)性基于另一端給予配合基之化學(xué)聯(lián)接。這些空間群并不需要為直線化學(xué)基，它將提供一空間介于凝膠脊及配合基連接的反應(yīng)基，為至少大約5
，而較佳為至少6
。實(shí)際上，這表示它應(yīng)含至少為4個(gè)直線按排的原子，由官能基分離凝膠。要不然，不充足的配合基負(fù)荷于層析的凝膠將會(huì)發(fā)生。該空間群將為疏水性，使得在層析法程序時(shí)應(yīng)用含水溶液時(shí)它們不會(huì)斷裂。它們對(duì)于混合物之所有將被分離之成份，應(yīng)該為安定及惰性，及對(duì)于將被應(yīng)用之洗提試劑。適合之試劑被應(yīng)用與凝膠之反應(yīng)以提供適合空間群之例子為己二酸(adipic acid)，二氨基己烷(diamiohexane)及其衍生物，例如己二酸二肼(adipic dihydrazide)及其他習(xí)知二酸類(diacids)及二氨基化合物。
適合的層析的凝膠之選擇是介于習(xí)知技術(shù)，及可由各種商業(yè)上可獲得之產(chǎn)物而制備，只要某種基本準(zhǔn)則被觀察。凝膠需要大致上是不溶于水，可被衍導(dǎo)及無(wú)毒性。它需要能容忍重生條件及處理程序，以符合消毒(sterile)，衛(wèi)生的輸送需要。因此;它一定容易的可消毒，而不損害到其化學(xué)性質(zhì)。
層析的凝膠架例子為瓊脂糖(agarose)及矽膠。
一般上，改良的交聯(lián)多糖類層析的凝膠為有效，如由那些商業(yè)上可獲得的所舉例，如從汛馬，A.S.(Pharmacia A.S.)而得的商品，其商品名稱如，士哈力士(sephadex)士哈拉士(sepharase)、士哈里(sepharyl)及士哈糖(sepharose)。商業(yè)上可獲得層析的凝膠及改良的矽膠也適合。在很多情況，該凝膠可獲得時(shí)已有空間官能基連接。它們可具有官能氨基(amino)、環(huán)氧基(Epoxy)或羥基(hydroxy groups)，除此之外，它們將具有適當(dāng)?shù)呐浜匣?，化學(xué)上連接至該空間群，使得有效的預(yù)備用于本發(fā)明之程序。
層析的步驟如下列進(jìn)行。一含(氧)血紅素及其他成份的溶液，成份如，紅血球胞質(zhì)蛋白質(zhì)，與空氣平衡被注入親和力凝膠及在對(duì)血紅素束縛于凝膠上之有利條件下洗提，根據(jù)習(xí)知的親和力層析法。漸漸的，非血紅素成份從凝膠洗提而血紅素被保留，而使得血紅素呈現(xiàn)紅色。條件之后轉(zhuǎn)換成有利于從凝膠血紅素的解離，及它洗提為一純血紅素部分。較佳之條件以使血紅素從凝膠之洗提為利用一緩沖劑，該劑含一陰離子與親和凝膠之多元陰離子部份競(jìng)爭(zhēng)特殊束縛于血紅素，因此，由凝膠上取代。緩沖劑為不影響血紅素之束縛于多元陰離子部份Bis-Tris緩沖劑，PH7.0已發(fā)現(xiàn)為適合。
根據(jù)本發(fā)明的另一目的，申請(qǐng)者之血紅素純化技術(shù)可被用于由一液體反應(yīng)混合物含改良的血紅素及末改良的血紅素，以移出未改良血紅素之殘余，隨著血紅素之化學(xué)上之改良以改良其遞氧及循環(huán)特征。該反應(yīng)牽涉到血紅素的改良為典型的未完成及產(chǎn)生了未改良及改良的血紅素混合物。未改良血紅素殘余在體內(nèi)呈現(xiàn)問(wèn)題，這是由于過(guò)量的氧束縛親和力，它之迅速的由循環(huán)活動(dòng)中排泄，及可能的血管縮小活動(dòng)(Vasoconstrictor activity)。雖然這種未改良的血紅素目前從改良的血紅素含反應(yīng)混合物所移出，在一分析規(guī)模上以離子交換層析法，一般上，但是它并不以一大規(guī)模來(lái)制備。在未移出大致上所有未改良的血紅素之前，該產(chǎn)品是不能被人類所接受。
在此及以后，本申請(qǐng)者之技術(shù)很明顯的由改良的反應(yīng)混合物(在一制備規(guī)模上)移出未改良血紅素殘余，這包括了在血紅素改良過(guò)程的一重要品質(zhì)管制步驟當(dāng)做無(wú)細(xì)胞遞氧溶液之一制備的起始物質(zhì)。
尤其系，在此改良的血紅素為純化，無(wú)細(xì)胞血紅素，其多元陰離子束縛處一DPG同類物已共價(jià)鍵的由習(xí)知的方法連接，為了(a)安定溶液中之血紅素之原始四聚物結(jié)構(gòu)，及(b)異形位阻上降低了血紅素氧束縛親和力，模仿該規(guī)定，它是在紅血球中，由DPG或其自然發(fā)生同類物，例如，肌醇戊磷酸鹽ATP等所自然的呈現(xiàn)。
該反應(yīng)混合物包含了改良反應(yīng)的產(chǎn)物，被認(rèn)為是含有改良的血紅素，及血紅素殘余，此殘余為未改良血紅素，它的存在是因末完成自然改良反應(yīng)，及DPG同類物，例如ATP，其他核苷磷酸鹽，肌醇三，四及戊一磷酸鹽，吡哆醛磷酸鹽，乙醛酸(glyoxylic acid)等。
反應(yīng)混合物根據(jù)習(xí)知的親和力層析法傳過(guò)多元陰離子親和力塔。在未改良的血紅素分子，該多元陰離子束縛處是未被占據(jù)及因此，該分子藉凝膠而保留，經(jīng)由凝膠多元陰離子部份之特殊束縛至此處而保留。相反的，在改良的血紅素分子中，多元陰離子束縛處是由共價(jià)鍵的連接的多元陰離子或其他改良據(jù)所占據(jù)。因此，改良的血紅素將不特定的束縛于凝膠上，且是以不保留的部份被洗提。
因此，多元陰離子親和力層析法是可容易的由一混合物之非血紅素成份分離血紅素，這是根據(jù)本發(fā)明之第1目的，及同時(shí)也可從未改良的血紅素分離改良的血紅素，不管利用何種改良步驟，基于多元陰離子束縛處之狀態(tài)。這允許血紅素之純化，尤其系從非傳統(tǒng)來(lái)源，其傳統(tǒng)純化技術(shù)的利用為不合理的，及亦允許制備一實(shí)際純的改良而紅素部份，藉加入一層析步驟于任何習(xí)知的改良步驟。
當(dāng)本發(fā)明之程序被用于分離未改良血紅素，由一改良血紅素適于血液之取代用，例如，ATP-血紅素，吡哆醛磷酸鹽(PYP)-血紅素或二羥醋酸化的(G)血紅素，該產(chǎn)生的純化改良血紅素顯示意外的及未預(yù)測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。例如，因此純化的改良血紅素用為一血液取代顯示一明顯的血管縮小活動(dòng)的減少，此一問(wèn)題是以往應(yīng)用此化合物所面臨之問(wèn)題。另外，該純化產(chǎn)物顯示了有效的減少氧之親和力，如與由其他方法純化之改良血紅素做比較。因此被獲得之一APT-血紅素具有大致上相同于完整血液之氧束縛性質(zhì)。
下列之圓式說(shuō)明為本發(fā)明之實(shí)施例圖1為于一ATP-瓊脂糖親和力塔層析之血紅素之洗提描繪。
10μl(50μg)之無(wú)基質(zhì)血紅素(stroma-free hemoglobin)(SFH)于一分析毛細(xì)管塔填有10μl之AGATP凝膠之層析譜。由緩沖劑A(50mM Bis-Tris緩沖劑，PH7.0)之SFH洗提表示只有高峰“a”，未保留部份(點(diǎn)線部份)。置入緩沖劑B之斜率(10mM ATP于緩沖劑A，以斷線表示斜率)產(chǎn)生了一保留部份之洗提，高峰“b”(實(shí)線)。實(shí)驗(yàn)之條件如下流量0.1 ml/min，溫度大約為20℃，利用-FPLC層析系統(tǒng)(Pharmacis Model LCC 500型)。該層析的凝膠為一瓊脂糖凝膠以CNBr及己二酸二肼(adipic dihydrazide)處理以提供化學(xué)空間群，而以O(shè)-ATP為配合基。它是商業(yè)上以此形式而購(gòu)得，隨時(shí)可用。
圖2為藉AGATP凝膠SFH之氧親和力之改良。
SFH在AGATP凝膠(實(shí)線)及簡(jiǎn)單瓊脂糖凝膠(斷線)于50mM Bis-Tris緩沖劑，PH7.0于37℃下之氧解離曲線。該曲線是藉-Hem-O-Scan氧解離分析器而獲得，應(yīng)用相同的層析凝膠。
圖3為SFH在醋酸纖維素(cellulose acetate)之電游子透入圖形，于AGATP凝膠層析法前及后電游子透入法(Electropheresis)在二乙基丙二
脲緩沖劑，PH8.8進(jìn)行。路徑1及2按順序的為保留的及未保留的部份(參閱圖一)。路徑3為起始SFH之標(biāo)準(zhǔn)樣品。箭頭“c”及“d”指示SFH之不明少部份成份，在未保留部份為多。電游子透入法于米拉(Mylax)支撐醋酸纖維于200V進(jìn)行45分鐘及并染以春紅S(Ponceau S)。
例1藉瓊脂糖-ATP親和力層析法純化無(wú)基質(zhì)血紅素于本例子中，(氧)血紅素之來(lái)源是無(wú)基質(zhì)血紅素。瓊脂糖-己二酸-腺苷酸-5′-三磷酸鹽(AGATP)(Agarose-adipic-adenosine-5′-triphosphate)是由萊姆等氏(Lomed et al)(Biochem Biophys Acta，Vol 304，P.231，1973)方法所制備。無(wú)基質(zhì)血紅素(SFH)是由拉美娜等氏(Rabiner er al)(J.Exp.Med.，Vol.126，P.1127，1967)之方法所制備。SFH首先滲析3次改變，50mM Bis-Tris緩沖劑，PH7.0(緩沖劑A)，及隨后500μl(20mg)的SFH溶液用于-Pharmacia HR5/5塔填有大約1ml的AGATP凝膠以相同之緩沖劑來(lái)平衡。該塔以10個(gè)床體積之緩沖劑A，以流量為0.5ml/min來(lái)清洗。至到洗提液(eluent)為清澈之后經(jīng)由一直斜率置入緩沖劑R(緩沖劑A含1-mN ATP)以洗提該保留部份。保留的及未保留的部分者皆被收集，濃縮及滲析緩沖劑A。對(duì)于各部份，醋酸纖維素電游子透入法于二乙基丙二酼脲緩沖劑，pH8.8(高解度緩沖劑，Gelman Sciences)被制備，利用起始SFH制備成一標(biāo)準(zhǔn)樣品。對(duì)于氧解離研究一小量之紅凝膠再浮懸于2μl之緩沖劑A及其氧解離曲線利用-Hem-O-Scan氧解離分析器來(lái)測(cè)量。為了成一標(biāo)準(zhǔn)樣品，SFH與瓊脂糖凝膠之混合懸浮在溶液中而其氧解離曲線相同的獲得。
圖1顯示了血紅素之束縛于緩沖劑A之AGATP凝膠上，及該選擇斜率洗提描繪是由加入10mM ATP于緩沖劑A所產(chǎn)生。這顯示血紅素是特殊的保留經(jīng)束縛凝膠之ATP部份至其多元陰離子束縛處。本特殊性之另一證明為SFH系由下列陰離子從凝膠取代，按下列之遞減有效性肌醇己磷酸鹽＞ATP
吡哆醛磷酸鹽
二磷酸甘油酸鹽＞二磷酸腺苷＞磷酸鹽離子＞氯離子(結(jié)果沒(méi)顯示)。圖2顯示一典型接至AGATP凝膠血紅素之氧解離曲線。該血紅素-AGATP復(fù)合物被顯示具P50之35mmHg，相同于SFH，在四克分子當(dāng)量之ATP存在時(shí)，當(dāng)做比較時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)SFH-瓊脂糖混合物具有-P50之12mmHg。
因此，(氧)血紅素被顯示具有AGATP之足夠親和力以形成一穩(wěn)定復(fù)合物。束縛SFH至AGATP降低了SFH之氧親和力至一水平相等于可溶的SFH-ATP復(fù)合物，顯示該復(fù)合物的形成是因?yàn)镾FH之特定束縛于凝膠之ATP部份。SFH之醋酸纖維素電游子透入法指示了少量成份(圖3)之存在，其中有兩者從保留部份中消失。這些少量帶之兩者在未保留部份(路徑2)呈增加，而其一在保留部份(路徑2)增加。另外，在未保留部份高度電游子透入流動(dòng)時(shí)，血紅素亦增加。因此，多元陰離子親和力層析法被顯示為改良了SFH之純度及品質(zhì)。
很慶興的雖然例1應(yīng)用無(wú)基質(zhì)血紅素為(氧)血紅素之來(lái)源，其他的(氧)血紅素來(lái)源亦可被應(yīng)用，包括用過(guò)血液(例如從開心手術(shù))，人類胎盤萃取(human placenial extract)，及血紅素含有由生物技術(shù)上方法生產(chǎn)之溶液。
例2藉瓊脂糖-ATT親和力層析法純化二羥醋酸化血紅素在此例子中，顯示本發(fā)明的第2目標(biāo)，改良二羥醋酸化血紅素(G-Hb)根據(jù)阿卡耶等氏(Acharya et al)(Fed Proc.，F(xiàn)ed.Amer.Soc.Exp Biol.，Vol 41，P.1174，1982)之方法制備。利用一康寧2500 CO-奧西表(corning 2500 CO-oximeter)測(cè)量血紅素之濃度。瓊脂糖-己烷-腺核-5′-三磷酸鹽(ATP-瓊脂糖)(第4種)于每ml之凝膠含有9.2μ莫耳之ATP，是由Pharmacia P-L生物化學(xué)所購(gòu)得。血紅素溶液之親和力層析法是利用-Pharmacia快速蛋白質(zhì)液體層析系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行。所利用之實(shí)驗(yàn)條件是相同于例1所描述的。
為了測(cè)試ATP-瓊脂糖親和力層析法是否能純化改良的血紅素，該血紅素二羥醋酸化混合物(G-Hb反應(yīng)混合物)經(jīng)過(guò)塔及其餾出部份之特征有如上述例1。這產(chǎn)生了一相同洗提描繪(其結(jié)果沒(méi)顯示)由謝爾等氏(Hsia et al)所報(bào)導(dǎo)的(J.Chrom.，Vol 303，PP.425-428，1984)表示一未保留高峰G-Hb-I及一保留高峰G-Hb-Ⅱ。
起始溶液之氧解離曲線及其ATP-瓊脂糖部份表示下列P50之順序G-Hb-Ⅱ＜G-Hb反應(yīng)混合物＜G-Hb-ⅠG-Hb-Ⅰ P50是大約2倍G-Hb-Ⅱ。再次的，其結(jié)果是相同于謝爾等氏(Hsis et al)所報(bào)導(dǎo)的(J.Chrom.，Vol 303，PP.425-428，1984)。此結(jié)果再次確定于二羥醋酸化血紅素制備中異代生殖(hetero goneity)是由于二羥醋酸化作用之延伸變化。氧解離曲線向右移是與二羥醋酸化之延伸相比例。因此，瓊脂糖-ATP親和力層析法能以適當(dāng)氧親和力純化改良的血紅素(G-Hb-Ⅰ)。
因此，本純化技術(shù)一般上可用于純化改良血紅素，(例如，吡哆醛磷酸鹽及ATP改良血紅素)。所產(chǎn)生的純改良血紅素被認(rèn)為是一優(yōu)越起始原料以制備血紅素基血取代，因?yàn)樗哂羞m當(dāng)?shù)南蛴修D(zhuǎn)移氧親和力及它與血管收縮的未改良血紅素?zé)o關(guān)。
例3過(guò)時(shí)的紅血球可從加拿大紅十字會(huì)(Canadian Red Cross)獲得。無(wú)基質(zhì)血紅素(SFH)如例1中所制備。三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate)及偏過(guò)碘酸鈉(Sodium Metaperiodate)是由適馬化學(xué)公司(Sigma Chemical Company，St Louis Missouri)購(gòu)得。過(guò)碘酸鹽氧化的ATP是根據(jù)羅等氏(Lowe et al)(Biochem Soc.Trans.，Vol.7(1979)P.1131)之方法制備。ATP-瓊脂糖是由萊姆等氏(Lamed et al)之方法制得(請(qǐng)參閱例1)。
ATP-血紅素是依據(jù)格林堡及馬佛(Greenburg and Maffuid)之改良方法制備參閱“臨床及生物研究之進(jìn)展”(Progress in clinical and Biological Reasearch”Vol 22，血液取代研究之進(jìn)展(Advances in Blood Substitute Research)，Alan R.Liss，Inc.，New York(1983)9。在這改良步驟中，2ml的辛醇(caprylic alcohol)加入每100ml的7%血紅素于5mM磷酸鹽緩沖劑，PH7.0。吹入氮?dú)?小時(shí)以使血紅素溶液脫氧。需要過(guò)碘酸鹽氧化的ATP于50mM Bis-Tris緩沖劑PH7.0之含量，該劑曾在氮?dú)饷撗蹼S后加入脫氧的血紅素溶液而產(chǎn)生一克分子比率為1.2∶1 ATP∶血紅素，以氮?dú)獯等敕磻?yīng)混合物(ATP-血紅素溶液)90分鐘，錫佛(Schiff)基之ATP-血紅素共軛物以硼氫化鈉(NaBH4)還原，于1mM氟氧化鈉(NaOH)于一克分子比為20∶1 NaBH4/血紅素。再次的，利用N2吹入混合物中2小時(shí)。
在完成還原步驟后，該溶液被氧化作用及滲析50mM Bis-Tris，PH7.0溶液的層化(aliquots)部份含有大約50mg之血紅素隨后經(jīng)過(guò)-塔填有5ml之ATP-瓊脂糖凝膠(大約30%之塔容量)，它亦已以50mM Bis-Tris，PH7.0平衡。未保留血紅素部份是藉5個(gè)體積相同緩沖劑洗提，而保留部份隨后以0.2M Nacl于50mM Bis-Tris，PH7.0平衡。未保留血紅素部份是藉5個(gè)體積相同緩沖劑洗提，而保留部份隨后以0.2M Nacl于50mM Bis-Tris，PH7.0來(lái)洗提。餾出部份被收集，濃縮，及滲析50mM Bis-Tris，PH7.0平衡。未保留血紅素部分是藉5個(gè)體積相同緩沖劑洗提，而保留部份隨后以0.2M Nacl于50mM Bis-Tris，PH7.0來(lái)洗提。餾出部份被收集，濃縮，及滲析50mM Bis-Tris，PH7.0，以一薄膜濃縮器進(jìn)行，該儀器制造公司為P-Micro proDicon，Pierce，Rockford，lilinois。各部分之氧解離曲線是山-Aminco Hem-O-Scan氧解離分析器進(jìn)行測(cè)量，該儀器制造者為美國(guó)儀器公司(American Instrument Company，Silver Spring，Maryland)。P50是直接的由氧解離曲線讀得。該未保留血紅素部份，即，ATP-血紅素具有-P50為35，而保留部份，氧血紅素有-P50為5mmHg。
不超過(guò)100μg之血紅素于0.01M之丙二酸鹽(malonate)，PH5.7(緩沖劑A)之樣品應(yīng)用于一HR5/5莫若士(Monos)預(yù)填塔(Pharmacia)以緩沖劑A平衡。餾出部份以一直線斜率之緩沖劑B(0.3M LiCl緩沖劑A)在一Pharmacia LCC 500 FPLC系統(tǒng)上洗提，該系統(tǒng)系由Pharmacis，Montreal，Canada所制備。
從塔而得之產(chǎn)物洗提描繪(elution profile)指示了未改良血紅素，具有其多元陰離子束縛處完整，是能束縛于ATP-瓊脂糖及因此，保留于塔上同時(shí)由改良的血紅素，含一或多個(gè)ATP分子共價(jià)鍵的占據(jù)其陰離子束縛處，是以未保留部份洗提。該未改良的血紅素可容易的回收以進(jìn)行另外的改良。該結(jié)果顯示，接近藉ATP-瓊脂糖親和力層析法從反應(yīng)混合物的改良血紅素及未改良的血紅素之定量分離。
例4吡哆醛磷酸鹽改良血紅素(Pyp-Hb)是以F.地文杜多(F.Devenuto)及A.奇那(A.Zegna)的方法制備。(J.Surg.Res.34，PP.205-212，1983)。該反應(yīng)混合物產(chǎn)物含有大約75%Pyp-Hb，而其他剩余的為殘余未改良Hb?；旌衔镆原傊?ATP凝膠處理而液體殘余由固體物理上分離。液體殘余進(jìn)行分析而發(fā)現(xiàn)大致上為純Pyp-Hb。固體凝膠是以ATP處理(第1批)而另外一批以氯離子處理，成為競(jìng)爭(zhēng)陰離子，而大致上純血紅素由此回收。
權(quán)利要求
1.一種由含(氧)血紅素溶液或混合物隔離(氧)血紅素之方法，包括(a)制動(dòng)一多元陰離子特定的束縛血紅素經(jīng)由其多元陰離子束縛處于一層析的凝膠；及(b)經(jīng)由凝膠傳送該含(氧)血紅素溶液或混合物，其中該(氧)血紅素保留于凝膠上，而同時(shí)溶液或混合之其他成份被洗提(eluted)。
2.一種由(氧)血紅素溶液或混合物隔離(氧)血紅素之方法，包括(a)提供一層析的凝膠它具有一制動(dòng)多元陰離子，特定的經(jīng)由其多元陰離子束縛處束縛血紅素;及(b)經(jīng)由凝膠傳送含(氧)血紅素溶液或混合物，其中(氧)血紅素是選擇上保留于凝膠上，而同時(shí)其他成份經(jīng)由此傳送。
3.如權(quán)利要求
第1項(xiàng)或第2項(xiàng)所述之方法，其中該多元陰離子由下列所選擇，包括核苷三磷酸鹽(nucleoside triphosphate)，1，3-二磷酸甘油酸鹽(diphosphoglycerate)，一肌醇磷酸鹽及一肌醇硫酸鹽(inositol sulphate)。
4.如權(quán)利要求
前項(xiàng)所述之方法，其中該層析的凝膠是由下列所選擇，包括了交聯(lián)聚蔗糖凝膠(cross linked polysaccharide gels)及矽膠(silica gel)。
5.如權(quán)利要求
前項(xiàng)所述之方法，其中該多元陰離子是藉一疏水性化學(xué)空間群連接至層析的凝膠。
6.如權(quán)利要求
第5項(xiàng)所述之方法，其中該空間群是由下列之劑類選擇，包括己二酸(adipic acid)，二氨基己烷及己二酸二肼(adipic acid dihydrazine)。
7.如權(quán)利要求
前項(xiàng)所述之方法，其中該多元陰離子是三磷酸腺苷(adenosine triphosphate)或肌醇四或戊磷酸鹽。
8.如權(quán)利要求
前項(xiàng)所述之方法，其中該凝膠為瓊脂糖凝膠(agarose gel)。
9.如權(quán)利要求
第8項(xiàng)所述之方法，其中所述化學(xué)空間群劑為己二酸。
10.如權(quán)利要求
第1項(xiàng)或第2項(xiàng)所述之方法，其中包括了隨后之步驟(c)引入一陰離子進(jìn)入層析的凝膠，它與在原有凝膠之多元陰離子競(jìng)爭(zhēng)，其中(氧)血紅素由凝膠被洗提。
11.如權(quán)利要求
第10項(xiàng)所述之方法，其中該競(jìng)爭(zhēng)陰離子，由遞減效能是從下列選擇包括肌醇己磷酸鹽，三磷酸腺苷，吡哆醛磷酸鹽(pyridoxal phosphate)，二磷酸甘油酸鹽，二磷酸腺苷，磷酸鹽離子及氯離子。
12.一種由一液體溶液含無(wú)基質(zhì)血紅素中分離無(wú)基質(zhì)血紅素(stroma-free hemoglobin)的方法，包括(a)經(jīng)由一凝膠復(fù)合物傳送含溶液無(wú)基質(zhì)血紅素，它包括一層析的凝膠具有制動(dòng)一多元陰離子，特定的束縛血紅素經(jīng)由多元陰離子束縛處;及(b)引入一陰離子進(jìn)入該凝膠復(fù)合物，它與原先含于凝膠中之多元陰離子競(jìng)爭(zhēng)，其中純化了的無(wú)基質(zhì)血紅素由凝膠被洗提。
13.如權(quán)利要求
第12項(xiàng)所述之方法，其中于步驟(b)所引入之陰離子及無(wú)基質(zhì)血紅素溶液兩者皆包括一適當(dāng)緩沖劑，它并不干擾血紅素之束縛于多元陰離子。
14.一種由一液體反應(yīng)混合物含改良的及未改良的血紅素分離未改良的血紅素之方法，包括(a)經(jīng)由一多元陰離子/層析的凝膠復(fù)合物傳送該反應(yīng)混合物，復(fù)合物含一多元陰離子它特定的束縛血紅素經(jīng)由其多元陰離子束縛處，在一層析凝膠上制動(dòng)，其中未改良血紅素是保留在凝膠上而改良的血紅素經(jīng)過(guò)該凝膠;及(b)引入一多元陰離子進(jìn)入凝膠復(fù)合物，它與原先在凝膠之多元陰離子競(jìng)爭(zhēng)，其中純化的未改良血紅素由凝膠洗提出。
15.如權(quán)利要求
第14項(xiàng)所述之方法，其中所述之多元陰離子/層析的凝膠復(fù)合物為ATP-瓊脂糖凝膠(ATP-agarose gel)。
16.如權(quán)利要求
第14項(xiàng)或第15項(xiàng)所述之方法，其中該競(jìng)爭(zhēng)陰離子以遞減有效能由下列選出，包括肌醇己磷酸鹽，三磷酸腺苷，吡哆醛磷酸鹽，二磷甘油酸鹽，二磷酸腺苷，磷酸鹽離子及氮離子。
17.如權(quán)利要求
第14項(xiàng)所述之方法，其中該改良的血紅素為二羥醋酸化的血紅素(glyoxylated hemoglobin)。
18.如權(quán)利要求
第14項(xiàng)所述之方法，其中改良的血紅素為ATP-血紅素。
19.如權(quán)利要求
第15項(xiàng)所述之方法，其中該改良的血紅素為吡哆醛磷酸鹽-血紅素。
專利摘要
本發(fā)明揭示有關(guān)一種借親和力層析法(affinity chromatography)技術(shù)純化血紅素之方法。與目前所相信的相反，氧及選擇的多元陰離子與血紅素之束縛并非互相獨(dú)占的。新穎的方法包括制動(dòng)一多元陰離子，它是特別的經(jīng)其多元陰離子束縛處束縛血紅素于一層析的凝膠，且經(jīng)由凝膠把含溶液或混合物之血紅素傳送。因此，血紅素被保留在凝膠中，而雜質(zhì)從凝膠洗提出。此新穎方法亦可用于由一液體反應(yīng)混合物含改良血紅素及未改良血紅素，把未改良血紅素分離出來(lái)。
文檔編號(hào)C07K1/22GK86104458SQ86104458
公開日1987年7月1日 申請(qǐng)日期1986年6月26日
發(fā)明者夏仁長(zhǎng) 申請(qǐng)人:希莫索爾公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan