專利名稱:人類白細(xì)胞介素-2的分析方法和試劑的制作方法
本發(fā)明涉及人類白細(xì)胞介素-2的分析方法和試劑。
白細(xì)胞介素-2(以下簡稱為IL-2)是經(jīng)植物凝集素或抗原刺激后由T細(xì)胞產(chǎn)生的一種淋巴細(xì)胞活素。一些報(bào)導(dǎo)表明IL-2具有以下生物活性，如胞毒T-細(xì)胞的誘導(dǎo);脾臟B細(xì)胞抗體產(chǎn)生的誘導(dǎo);天然殺傷細(xì)胞的激活以及在體外刺激T細(xì)胞的長期生長。這些生物活性的具備使得IL-2在治療免疫缺乏疾病和癌癥的臨床應(yīng)用方面引起了人們的關(guān)注。然而，由于通過細(xì)胞培養(yǎng)的方法所產(chǎn)生的IL-2極少，使得在高劑量時(shí)它的臨床效果的檢驗(yàn)進(jìn)展很慢。而重組DNA技術(shù)的迅速發(fā)展，使大規(guī)模生產(chǎn)重組IL-2(以下簡稱r L-2)在最近成為可能，這樣IL-2效果的檢驗(yàn)便開始了。
傳統(tǒng)的IL-2生物活性的測(cè)定方法是用生物測(cè)定法〔Biochemical Biophysical Research Communications 109，363(1982)〕，用該方法測(cè)定血液中IL-2的濃度極限是1至10μg/ml。然而，由于IL-2在極微量時(shí)即可表現(xiàn)出其生物活性。因此急需一種比上述方法準(zhǔn)確度更高的生物測(cè)定方法。
發(fā)明者致力于發(fā)展一種高靈敏度高準(zhǔn)確度的測(cè)量人類IL-2的方法，并發(fā)現(xiàn)可以用免疫酶標(biāo)的分析方法(EIA)達(dá)到此目的。該方法所用抗IL-2的抗體是通過重組人類IL-2免疫動(dòng)物而得到的，其測(cè)量的靈敏度要比過去的生物測(cè)定法有很明顯的提高，在這一發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上的進(jìn)一步研究即導(dǎo)致了本發(fā)明。
本發(fā)明的內(nèi)容是(1)一種測(cè)量人類白細(xì)胞介素-2的分析方法。該方法是將樣品用夾心免疫酶標(biāo)測(cè)定法進(jìn)行分析。所用試劑包括固定在載體上的抗體、抗原及用標(biāo)記物標(biāo)記的抗體，其中固定在載體上的抗體及標(biāo)記抗體或其片段是來源于溫血?jiǎng)游锏目怪亟M人類白細(xì)胞介素-2的抗體。
(2)一種通過夾心方法的人類白細(xì)胞介素-2的免疫化學(xué)分析法測(cè)定藥盒，其中包括(a)一種由溫血?jiǎng)游锂a(chǎn)生的抗重組的人白細(xì)胞介素-2的抗體或其片段。
(b)一種由溫血?jiǎng)游锂a(chǎn)生的抗重組人類白細(xì)胞介素-2的抗體或其片段與標(biāo)記試劑的連接。
(3)一種由溫血?jiǎng)游锂a(chǎn)生的抗重組的人白細(xì)胞介素-2的抗體或其片段。
(4)一種由溫血?jiǎng)游锂a(chǎn)生的抗重組的人白細(xì)胞介素-2的抗體或其片段與標(biāo)記試劑的連接。
該夾心方法所用的溫血?jiǎng)游锂a(chǎn)生的抗重組的人白細(xì)胞介素-2的抗體是通過以重組的人白細(xì)胞介素-2為抗原免疫溫血?jiǎng)游锂a(chǎn)生的。
在本發(fā)明說明書中，固定在載體上的抗體稱為第一抗體，而用標(biāo)記物標(biāo)記的抗體稱為第二抗體。
用重組的人白細(xì)胞介素-2作為抗原時(shí)應(yīng)考慮到用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的一些肽類具有與天然白細(xì)胞介素-2相似的生物活性或免疫活性，或具有與IL-2受體或抗IL-2抗體的結(jié)合活性。
就重組的人IL-2來講，與其有關(guān)的一些肽類有多肽(Ⅰ)〔PCT/JP84/00460說明書的例1。(申請(qǐng)日1984年9月26日)相應(yīng)于1986年4月2日公開的EPC專利第176299號(hào)〕該多肽是用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的，其氨基酸順序如圖1所示，其中對(duì)其生物和免疫活性必需的氨基酸序列的片段也可應(yīng)用。
作為重組的人白細(xì)胞介素-2，包括在氨基端缺少一個(gè)氨基酸的多肽(Ⅰ)片段(EPC專利公開第91539號(hào));在氨基端缺少4個(gè)氨基酸的多肽(Ⅰ)片段(日本專利公開第126088/1985號(hào));及在羧基端缺少幾個(gè)氨基酸的多肽(Ⅰ)片段。
進(jìn)一步，作為重組的人IL-2，所提到的多肽還有的是通過去除或替換其它氨基酸，如上述提到的多肽(Ⅰ)中的一些組成氨基酸而得到的。例如，將多肽(Ⅰ)中第125位的半胱氨酸殘基換成絲氨酸殘基(日本專利第93093/1984號(hào)，相應(yīng)于美國專利第4518584號(hào))。
所述的多肽在其氨基端可以有一個(gè)甲硫氨酸，而所述多肽及在氨基端含有一個(gè)甲硫氨酸的多肽的混合物均可以使用。
作為溫血?jiǎng)游?，建議不要用人，已提到的動(dòng)物有兔子、綿羊、山羊、大鼠、小鼠、豚鼠、牛、馬和豬等，鳥類有雞、鴿子、鴨、鵝、及鵪鶉等。
重組的人IL-2作為抗原其劑量是根據(jù)所用動(dòng)物抗體產(chǎn)生的有效范圍來確定。建議用0.1至10mg的重組的人IL-2，例如兔子用1mg，山羊用4mg，與Freund氏完全佐劑混合，通過背部或后足底部的皮下注射或肌肉內(nèi)注射等方法給藥，每2周給1至10次。產(chǎn)生的抗人IL-2抗體，可從處理動(dòng)物的血液經(jīng)離心后所得到的血清中獲得。(若用兔子作材料，一般是在免疫7至12天后從其耳靜脈中收集血液)例如，得到的血清先用硫酸銨鹽析，產(chǎn)生的沉淀通過離心收集后溶于硼酸緩沖液或其它溶液中。得到的溶液再經(jīng)過一個(gè)接有r L-2載體的親和析層柱分離〔日本專利申請(qǐng)176306/1984號(hào)說明書(申請(qǐng)日1984年8月23日)，相應(yīng)于1986年3月17日
公開日本專利第53300/1986號(hào)〕，即可得到純化的抗體。
通過上述步驟可得到第一抗體及第二抗體。最好用兩種不同的動(dòng)物免疫以產(chǎn)生第一抗體或第二抗體。山羊等可產(chǎn)生相對(duì)大量的抗體，建議用來產(chǎn)生第一抗體。而兔子等建議用來產(chǎn)生第二抗體。
這樣獲得的抗體其抗體效價(jià)為104至106或更多(EIA方法)，這樣獲得的抗體也可識(shí)別天然的人白細(xì)胞介素-2。
作為標(biāo)記抗體的第二抗體最好首先用以下方法處理抗體首先通過傳統(tǒng)方法用胃蛋白酶局部消化除去其不變區(qū)，產(chǎn)生抗體片段F(ab′)2′，后者通過還原產(chǎn)生抗體片段Fab′。
作為抗體片段，提到的有F(ab′)2及Fab′。片段F(ab′)2是通過傳統(tǒng)的胃蛋白酶降解抗體得到的。片段Fab′是通過傳統(tǒng)方法還原片段F(ab′)2得到的。胃蛋白酶降解及還原方法是根據(jù)已述的方法，例如在應(yīng)用生物化學(xué)學(xué)報(bào)(Journal of Applied Biochemistry，4，41-57(1982)上的方法進(jìn)行的。在此處所用的夾心方法中，抗體與標(biāo)記試劑的連接是通過將抗體與標(biāo)記試劑在pH6到8的緩沖液中于10℃～55℃條件下反應(yīng)10分鐘到24小時(shí)產(chǎn)生的。
作為標(biāo)記試劑，應(yīng)提到的是標(biāo)記酶，例如過氧化物酶〔如辣根過氧化物酶(以下簡稱為HRP)〕，蘋果酸脫氧酶及β-半乳糖苷酶，以上所提到的標(biāo)記酶中以辣根過氧化物酶為最好。
所用酶可以做成順丁烯二酰亞胺的形式以使反應(yīng)能溫和地進(jìn)行。(日本專利公開第90054/1984號(hào)，相應(yīng)于EPC專利公開第1098078號(hào))。
連接反應(yīng)按如下方法進(jìn)行。首先，標(biāo)記試劑如反應(yīng)式
其中n為0至5的整數(shù)，R為一個(gè)化學(xué)鍵或二價(jià)的6元碳?xì)洵h(huán)，(如1，2-，1，3-和1，4-環(huán)己烯，1，2-，1，3-和1，4-亞苯基)。
所示的化合物在pH6～8的緩沖液中于10℃～55℃反應(yīng)10分鐘到24小時(shí)。緩沖液是如0.1M磷酸緩沖液(pH7.0)或0.05M的磷酸緩沖液(pH6.3)。
這樣獲得的順丁烯二酰亞胺化的標(biāo)記試劑可通過如凝膠層析的方法純化。適合于所述凝膠層析用的填充物有Sephadex G-25(Pharmacia Fine Chemical瑞典)或Biogel P-2(Bio- Rad Laboratories，美國)等等。
順丁烯二酰亞胺化的標(biāo)記試劑與第二抗體進(jìn)行反應(yīng)的范例如下所述第二抗體或其片段在巰基乙醇胺的存在下被還原，未參與反應(yīng)的物質(zhì)通過凝膠過濾除去。得到的抗體或其片段再與順丁烯二酰亞胺化的標(biāo)記試劑反應(yīng)。
所述的反應(yīng)可通過將二種反應(yīng)物在0℃至40℃的緩沖液中互相接觸1至48小時(shí)而完成。所述的緩沖液如含有5mM的乙二胺四乙酸鈉的0.1M的磷酸緩沖液(pH6.0)。
這樣產(chǎn)生的標(biāo)記抗體可通過如凝膠層析的方法純化。作為凝膠層析所用的填充物除其它以外需要提到的如Ultrogel ACA44(LKB，瑞典)或Sephacryl S-200(Pharmacia Fine Chemical，瑞典)。
特別提到，當(dāng)過氧化物敏作為標(biāo)記敏時(shí)，反應(yīng)按如下方法進(jìn)行過氧化物酶(如辣根過氧化物酶)按約2∶20∶1的重量比加到抗體中，混合物在緩沖液中，于0至40℃反應(yīng)1至48小時(shí)?？捎玫木彌_液包括含有5mM乙二胺四乙酸鈉的0.1M的磷酸緩沖液(pH6.0)。產(chǎn)生的過氧化物酶標(biāo)記的抗體，經(jīng)凝膠過濾純化后，作為第二抗體。
目前測(cè)定人類IL-2的方法是根據(jù)傳統(tǒng)的免疫酶標(biāo)夾心方法的原理及過程而發(fā)展的。
夾心法的操作過程在酶學(xué)方法(Methods in Enzymology 84，26(1982)〕;免疫方法學(xué)報(bào)〔Journcl of Innunological Methods，8，223(1975)〕，及EPC專利公開〔EPC Patent Publicatioys No49898，No88368及No109078〕中都有敘述。
根據(jù)本發(fā)明的夾心法可舉例如下首先將抗體吸附于免疫盤中，并用牛血清白蛋白處理。樣品液(如血液、血清、血漿、尿、胸膜液、骨髓液及各種器官提取液等)加入后再加入第二抗體和標(biāo)記酶以使反應(yīng)進(jìn)行。然后加入一種標(biāo)記酶的底物(如含有過氧化氫的鄰苯二胺水溶液)于反應(yīng)產(chǎn)物中測(cè)量產(chǎn)物的吸收值。根據(jù)與事先制作的標(biāo)準(zhǔn)物吸收曲線(見圖2)相比較計(jì)算產(chǎn)品溶液中IL-2的含量。本方法最小可測(cè)到10至40pg/ml的IL-2。
下面，以測(cè)定cynomolgus猴靜脈血中的IL-2為例更詳細(xì)地?cái)⑹鰷y(cè)定人IL-2的本方法。
將r L-2通過靜脈給藥的方法，以0.2至100μg/0.5ml/Kg的劑量處理每一個(gè)cynomolgus猴(雌性，2.5至4公斤，每組三個(gè)猴)。在注射5，15，30分鐘及1，2，4，6，24小時(shí)后收集動(dòng)物血液1至5毫升。每個(gè)血樣品在室溫放置3至5小時(shí)后，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，分離血清，并將每個(gè)樣品按1/5，1/10，1/50，1/100，1/300及1/1000的比例用小牛血清稀釋。每個(gè)稀釋樣品按如下方法測(cè)量其IL-2的含量將100μl抗r L-2的山羊Ig G溶液(蛋白含量為15μg/ml)放到免疫盤(Nunc Inc)的小池中，4℃放置16至20小時(shí)。吸走溶液后小池用300μl PBS洗3次，然后加入200μl 1%的牛血清白蛋白溶液，置4℃16到20小時(shí)后，小池再用PBS洗滌。然后加入100μl r L-2溶液或稀釋的樣品液，4℃放置16至20小時(shí)后用PBS洗滌小池5次。然后加入100μl抗r L-2的兔Fab′-HRP溶液，室溫放置4小時(shí)，小池再用PBS洗后加入100μl底物溶液室溫下置黑暗中保溫20至40分鐘以使反應(yīng)進(jìn)行。反應(yīng)通過加入100μl 2M的硫酸溶液而終止，然后用Titertek MultiskanMc測(cè)量產(chǎn)物在492nm處的吸收值。每一樣品中r L-2的濃度通過其與圖2所示標(biāo)準(zhǔn)曲線吸收值的比較而計(jì)算得到。給藥的結(jié)果如圖4所示。(r L-2劑量為100μg/0.5ml/kg)。
該結(jié)果表明本方法可以以高于生物測(cè)定100倍或更多的靈敏度來測(cè)量血液中r L-2的濃度。因此可以肯定本方法提供了一個(gè)有用的測(cè)定臨床樣品(如血液、血清、血漿、尿、胸膜液骨髓液等)中的IL-2的含量及檢驗(yàn)IL-2在組織及器官中分布的方法。
特別是當(dāng)使用以r L-2為抗原而制備的抗體時(shí)，更準(zhǔn)確的IL-2測(cè)定由于抗體特性的準(zhǔn)確度而成為可能。
測(cè)定人IL-2的夾心法分析藥盒及分析程序舉例如下1.測(cè)定試劑(1)稀釋緩沖液新生小牛血清(在56℃處理30分鐘)……100ml乙基汞硫代水楊酸鈉……0.01g用0.02M磷酸緩沖液-鹽pH7.0(PBS)稀釋至1升，于4℃貯存。
(2)牛血清白蛋白(BSA)溶液牛血清白蛋白……10g乙基汞硫代水楊酸鈉……0.01g溶于1升PBS中，56℃處理30分鐘，于4℃貯存。
(3)抗r L-2山羊Ig G(第一抗體)使用前將貯液用稀釋緩沖液稀釋至15μg Ig G/ml。
(4)連接過氧化物敏的抗r L-2的兔Fab′(第二抗體)使用前用稀釋緩沖液將貯液稀釋到3.5μg蛋白/ml(5)底物緩沖液向含有0.01%乙基汞硫代水揚(yáng)酸鈉的100ml0.1M草酸緩沖液pH5.5中加入66μl30%的H2O2溶液，并貯存于4℃。
使用時(shí)先用100ml該溶液溶解44mg鄰苯二胺即制成底物溶液。
(6)r L-2標(biāo)準(zhǔn)溶液將r L-2貯液用稀釋緩沖液稀釋成
0.04單位/毫升。稀釋液按1ml/每瓶分裝于-20℃保存。
2.測(cè)定程序(1)取100μl按1∶25用PBS稀釋的抗r L-2山羊Ig G溶液(15μg/ml)置Nunc免疫盤的每一個(gè)小池中，置4℃放置16～24小時(shí)。
(2)棄去溶液并用PBS(每個(gè)池用300μl)洗3次。
(3)每個(gè)池中加入200μl BSA溶液，置4℃放置16～24小時(shí)。
(4)棄去溶液并用PBS(300μl)洗盤3次。
(5)加入100μl待測(cè)血清或r L-2標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.001，0.002，0.004，0.008，0.012，0.016或0.02單位/毫升)置4℃放置16～24小時(shí)。用稀釋緩沖液稀釋待測(cè)血清及r L-2。
(6)棄去溶液，用PBS(300μl)洗盤5次。
(7)加入100μl連接有過氧化物酶的抗r L-2兔Fab′(與稀釋緩沖液之比為1∶50)，室溫放置4小時(shí)。
(8)棄去溶液，用PBS(300μl)洗盤5次。
(9)加入100μl底物溶液，在黑暗中室溫作用30分鐘。
(10)加入100μl 2MH2SO4終止酶反應(yīng)。
(11)在Titertek Multisken上測(cè)量樣品在492nm處的光密度。
(12)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算r L-2濃度。
本測(cè)定方法提供了一個(gè)比生物測(cè)定法靈敏度更高的方法。該方法比生物測(cè)定法的靈敏度高出約100倍。此外該方法的測(cè)量值與生物測(cè)定法測(cè)量值之間的相關(guān)系數(shù)也很高，達(dá)0.999，因此，可以認(rèn)為該方法準(zhǔn)確反應(yīng)了真實(shí)的樣品生物活性。(圖3)在觀察人白細(xì)胞介素-2加到血清中之后的回收實(shí)驗(yàn)中，檢驗(yàn)該方法中樣品血清含量的影響。結(jié)果表明，當(dāng)血清濃度為40%或較少時(shí)，不會(huì)對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)產(chǎn)生有害影響。
本法也可以測(cè)定天然的人白細(xì)胞介素-2。
以超過傳統(tǒng)方法的靈敏度，本法所測(cè)定人IL-2可以準(zhǔn)確地將人IL-2作為蛋白而識(shí)別，從而進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。因此該方法對(duì)測(cè)定臨床樣品等其它樣品中極少量的IL-2特別有用。
圖示的簡要說明圖1表示重組人IL-2的氨基酸序列的一例。
圖2表示在實(shí)施例4中測(cè)量重組IL-2及天然IL-2的結(jié)果。
圖3表示在參比實(shí)施例2中獲得的本測(cè)定方法與生物測(cè)定法相關(guān)性。
圖4表示實(shí)施例5中獲得的cynomolgus猴血中r L-2濃度的測(cè)量結(jié)果。
圖5表示通過參比實(shí)施例3中獲得的經(jīng)過滅活處理的重組IL-2的測(cè)定結(jié)果。
在圖1中氨基酸的簡寫是根據(jù)IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的或有關(guān)領(lǐng)域常用的寫法。其中氨基酸都是L-型。
本發(fā)明通過以下參比實(shí)施例及實(shí)施例對(duì)之進(jìn)行更詳細(xì)的敘述。應(yīng)記住本發(fā)明并不局限于這些。
以下材料在下述參比實(shí)施例和實(shí)施例中要用到r L-2根據(jù)實(shí)施例6中描述的方法產(chǎn)生的。實(shí)施例6見日本專利公開第115528/1985號(hào)，相當(dāng)于EPC專利公開第145390號(hào)。三種蛋白濃度0.75，1.195，及1.25mg/ml(5mM醋酸銨pH5.0)被用到。
牛白蛋白溶液牛白蛋白(Cohn第5組分，由日本Daiichi Kagaku提供)溶解在含有0.145M氯化鈉的0.02M磷酸緩沖液(pH6.8以下簡稱PBS)中，至濃度為1%，然后于56℃加熱30分鐘。加入乙基汞硫代水楊酸鈉(Sigma Ina)至濃度為0.001%，配好的溶液貯存于4℃。
小牛血清溶液新生小牛血清(M.A.Bioprochuct Inc)于56℃加熱30分鐘立即通過濾紙(Toyo Filter No 5C)過濾。濾出液溶于0.02M PBS中至濃度為10%。然后加入乙基汞硫代水楊酸鈉至0.001%，配得的溶液貯存于4℃。
辣根過氧化物酶結(jié)合的抗兔Ig G(簡稱為抗兔Ig G-HRP(Miles-Yeda Inc.)在用小牛血清液稀釋1/40000倍后再應(yīng)用。
辣根過氧化物酶結(jié)合的抗山羊Ig G(簡稱為抗山羊Ig G-HRP)抗山羊Ig G-HRP(Cappel Inc.)在用牛血清液稀釋1/40000的濃度后再用。
蛋白含量測(cè)定蛋白濃度用蛋白分析藥盆(Bio-Rad Laboratories Ltd)及牛血清白蛋白(Sigma Inc.)作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定。
底物溶液30%的過氧化氫水溶液加到含0.01%乙基汞硫代水楊酸鈉，pH5.5的0.1M草酸緩沖液中，然后貯存于冰箱中。在即將試驗(yàn)前，將鄰苯二胺溶于上述溶液中至40mM。
參比實(shí)施例1(固相r L-2的生產(chǎn))1克用溴化氰活化的Sepharose 4B(Pharmacia AB)置于玻璃濾器中用20ml0.001N的鹽酸充分溶脹，然后用200毫升0.001N的鹽酸液充分洗滌。此外，向10mlr L-2溶液(蛋白含量為1.25mg/ml)中加入1ml 1M的硼酸鈉溶液，用1N的氫氧化鈉調(diào)至pH8.4。得到的溶液加入上述處理的溴化氰激活的Sepharose 4B，混合物置4℃16小時(shí)以使反應(yīng)進(jìn)行。反應(yīng)完成后得到的凝膠置于玻璃濾器中用100ml 0.1M的硼酸鈉溶液洗滌。洗好的凝膠加到10ml含有1M乙醇胺的0.1M硼酸鈉溶液中，4℃放置2小時(shí)并慢慢攪拌以使封閉余下的活性基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。然后依次用100ml 0.1M硼酸鈉，100ml其中含有1M氯化鈉的0.1M醋酸鈉溶液(pH4.0)及100ml含有1M氯化鈉的硼酸緩沖液(pH8.0)、來洗滌凝膠。洗好的凝膠懸浮于0.02M硼酸緩沖液中狀柱并置4℃保存。該柱的r L-2的吸附量約11mg。
實(shí)施例1(抗-r L-2山羊Ig G的生產(chǎn))(a)抗-r L-2山羊血清的生產(chǎn)
4ml r L-2溶液(蛋白含量0.75mg/ml)與4ml Freund氏完全佐劑(Difco Laboratories Inc.)一起混合。得到的溶液通過肌肉給藥處理山羊，兩周的時(shí)間內(nèi)處理7次，然后收集山羊血液。該血液在室溫放置5小時(shí)、4℃放置16小時(shí)后于3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，得到的上清即抗-r L-2山羊血清。
(b)抗-r L-2山羊Ig G的生產(chǎn)將20毫升通過程序(a)獲得的抗r L-2山羊血清置于燒杯中，在攪拌中加入硫酸銨至飽和濃度40%，置4℃放16小時(shí)，得到的溶液于10，000rpm離心10分鐘，得到上清及各種沉淀，除去上清后的沉淀溶于35ml 0.02M硼酸緩沖液(pH8.0)中，然后在同樣的緩沖液中用Spectropore膜(Spectrum Medical Inc.)于4℃透析16小時(shí)，然后于10，000rpm離心10分鐘，從上清中除去沉淀，得到的50ml上清分為兩份并通過一個(gè)裝有通過參比實(shí)施例1中過程而得到的固相化r L-2的凝膠柱。然后用0.02M硼酸緩沖液(pH8.0)充分洗柱并用0.1M醋酸緩沖液(pH4.5)洗柱直至洗出液在280nm波段的吸收消失。洗好的柱用0.2M的甘氨酸鹽酸緩沖液洗脫，得到的洗脫組分立即加入1/10體積的1M Na2HPO4，得到的溶液用1N氫氧化鈉調(diào)至pH7后即在0.02M硼酸緩沖液(pH8.0)中于4℃透析16小時(shí)。然后于10，000rpm離心10分鐘，得到的上清即抗-r L-2山羊Ig G，加入乙基汞硫代水楊酸鈉至0.001%后，置4℃保存。
(c)抗-r L-2山羊Ig G特性(1)蛋白含量為0.1至0.8mg/ml(2)抗體效價(jià)為104至106或更高(EIA方法)(3)純度為80至90%或更高實(shí)施例2(抗r L-2)兔Ig G的生產(chǎn))(a)抗r L-2兔血清的生產(chǎn)1ml r IL-2(蛋白濃度為1.195mg/ml)與1ml Freund氏完全佐劑混合。產(chǎn)生的混合物通過肌肉內(nèi)給藥方法注射到實(shí)驗(yàn)兔子(雄性，Rabbiton stock Farm)的背部及大腿，2周內(nèi)處理三次，在最后一次注射的一周之后，從中央耳靜脈收集血液，置4℃，16小時(shí)后，于3000rpm離心10分鐘，得到的上清即抗-r L-2兔血清。
(b)抗-r L-2兔Ig G的生產(chǎn)抗-r L-2兔Ig G的生產(chǎn)與實(shí)施例1(b)中所述方法相同。
(c)抗-r L-2兔Ig G的特性(1)蛋白含量為0.1至0.8mg/ml(2)抗體效價(jià)為104至106或更高(EIA方法)(3)純度為80%至90%或更高。
實(shí)施例3(抗體與過氧化物酶連接物的生產(chǎn))(a)抗-r L-2兔Fab′片段的生產(chǎn)用火棉膠袋(Sartorius Inc.)將實(shí)施例2(b)中獲得的28ml抗-r L-2兔Ig G濃縮至約1.5ml得到的濃縮液再在0.1M醋酸緩沖液(pH4.5)中于4℃透析16小時(shí)，再于10，000rpm離心10分鐘，從上清中除去沉淀。上清中加入120μg胃蛋白酶后置37℃保溫16小時(shí)以便反應(yīng)進(jìn)行。向反應(yīng)液中加入200μl 0.2M的Na2HPO4后，用1N氫氧化鈉溶液調(diào)pH至8.0，并通過Sephadex G-150柱(柱大小為，1.5×45cm)進(jìn)行凝膠過濾，得到的溶液即含有抗體片段F(ab′)。該溶液用火棉膠袋在4℃濃縮至約1.5ml，濃縮液再于0.1M醋酸緩沖液(pH5.0)中，置4℃透析2小時(shí)。得到的透析液，加入0.4M的2-巰基乙醇胺至終濃度為20m M后，置37℃保溫90分鐘以使反應(yīng)進(jìn)行。反應(yīng)液通過一個(gè)Sephadex G-25(Pharmacia AB)層析柱(1.0×80cm)后，用含有5mM乙二胺四乙酸鈉的0.1M磷酸緩沖液(pH6.0)作為洗脫液進(jìn)行段分離，得到的光吸收在280nm波長的抗-r L-2Fab′保存在4℃。
(b)順丁烯二酰亞胺化辣根過氧化物酶的生產(chǎn)將10mg辣根過氧化物酶(簡稱HRP，可從Bochring Mannhein AG獲得)溶解在1.4ml 0.1M的磷酸緩沖液(pH6.8)中，得到的溶液加入100μl含于4.18mg N-羥基琥珀酰亞胺N-環(huán)己基甲基順丁烯二酰亞胺碳酸的N-二甲基-甲酰胺溶液，室溫放置1小時(shí)使反應(yīng)進(jìn)行。反應(yīng)液于2500rpm離心10分鐘得到上清。上清經(jīng)過Sephadex G-25層析(1.0×80cm)，用0.1M磷酸緩沖液(pH6.8)作為洗脫液，得到主要成分即順丁烯二酰亞胺化辣根過氧化物酶。
(c)抗-r L-2兔Fab′辣根過氧化物酶連接物(抗-r L-2兔Fab′-HRP)的生產(chǎn)將(a)和(b)中分別獲得的抗-r L-2兔Fab′和順丁烯二酰亞胺辣根過氧化物酶混合在一起，用火棉膠袋在4℃將其濃縮至約1ml。得到的濃縮液置4℃20小時(shí)以使反應(yīng)進(jìn)行。反應(yīng)液經(jīng)過Ultrogel Ac A44(LKB Inc)層析柱(1.0×80cm)并用0.1M磷酸緩沖液作為洗脫液進(jìn)行洗脫，得到的活性組分加入牛白蛋白至0.1%，乙基汞硫代水楊酸鈉至0.001%于4℃貯存。
實(shí)施例4(血清r L-2濃度的測(cè)定)首先將從實(shí)施例1(b)中獲得的100μl抗-r L-2山羊Ig G溶液(蛋白含量15μg/ml)放在免疫盤(Nunc.Inc.)的小池中，置4℃16到20小時(shí)。除去溶液后將小池用300μl PBS洗三次，然后加入200μl 1%牛血清白蛋白溶液，于4℃放置16至20小時(shí)，再用PBS洗小池后加入100μl r L-2溶液或用小牛血清稀釋的樣品溶液，置4℃16至20小時(shí)，再用PBS洗小池后加入100μl從實(shí)施例3(c)中獲得的抗-r L-2兔Fab′-HPR溶液，室溫放置4小時(shí)后再用PBS洗小池，然后加入100μl底物溶液，于黑暗中在室溫放置20至40分鐘以使反應(yīng)進(jìn)行。加入100μl 2M的硫酸溶液終止反應(yīng)后，用Titertek Multiskan Mc(Flow Laboratories Inc.)在492nm處測(cè)量每一個(gè)樣品的吸收值。結(jié)果如圖2中-O-所示。
天然IL-2濃度的測(cè)量與上述方法相同。所用的天然IL-2是根據(jù)Biochemical and Biophysical Research Communication vol.127，No1.page180-190(1985)中所述的方法生產(chǎn)的。
天然IL-2的測(cè)量結(jié)果如圖2中-●-所示。
實(shí)施例5(通過靜脈注射r L-2后的cynomolgus猴血液中r L-2濃度的測(cè)定)r L-2按100μg/0.5ml/kg的劑量通過靜脈注射給cynomolgus猴(雌性，2.5至4公斤重，3只猴一組)注射5、15、30分鐘，1，2，4，6和24小時(shí)后收集3ml猴血。每個(gè)血樣品在室溫放置3小時(shí)后于3000rpm離心10分鐘，分離樣品血清。r L-2的測(cè)定按實(shí)施例4中所述的方法進(jìn)行。結(jié)果如圖4所示。
參比實(shí)施例2(生物測(cè)定法與本方法測(cè)量數(shù)據(jù)的相關(guān)性)r L-2按濃度為3.75，7.5，15，30和60ng/ml加入到含有20%胎牛血清的RPM I-1640培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中r L-2的濃度分別按照實(shí)施例4中的方法和Biochemical and Biophysical Research Communications Vol.109，No2，pp363～369(1982)中所描述的生物測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。
結(jié)果在5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)(n＝5)中，二種方法的相關(guān)系數(shù)(r)為0.999。相關(guān)性用線性方程Y＝1.02X+1.04表示。
參比實(shí)施例3含有145至170μg/ml r L-2的樣品在pH12，37℃處理5，15，30分鐘及1，2，3小時(shí)，或同樣的樣品在75℃處理0.5，1，2和5小時(shí)。
這樣得到的產(chǎn)物按實(shí)施例4中的夾心方法及參比實(shí)施例2中的生物測(cè)定法進(jìn)行測(cè)量。
結(jié)果如圖5所示。在22次實(shí)驗(yàn)(n＝22)中，二種方法之間的相關(guān)系數(shù)(r)為0.989，其相關(guān)關(guān)系用線性方程Y＝1.06X+3.74表示。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定人白細(xì)胞介素-2的方法，其特征在于，對(duì)樣品用酶標(biāo)免疫法反應(yīng)，所用材料包括一種固定于載體上的抗體，一種抗原及一種用標(biāo)記試劑標(biāo)記的抗體，其中固定于載體上的抗體及標(biāo)記抗體是源于溫血?jiǎng)游锏目怪亟M人白細(xì)胞介素的抗體或其片段。
2.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的分析方法，其中重組人白細(xì)胞介素-2是一種如圖1中所示氨基酸序列的多肽。
3.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的分析方法，其中的片段是抗體片段Fab′。
4.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的分析方法，其中抗體是經(jīng)過親合層析純化的。
5.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的分析方法，其中標(biāo)記試劑為辣根過氧化物酶。
6.一種用于夾心方法測(cè)量人白細(xì)胞介素-2的免疫化學(xué)分析藥盒，它包括(a)來源于溫血?jiǎng)游锏目怪亟M人白細(xì)胞介素-2的抗體或其片段，(b)一種來源于溫血?jiǎng)游锏目怪亟M人白細(xì)胞介素-2的抗體或其片段與標(biāo)記試劑的連接物。
7.根據(jù)權(quán)項(xiàng)6所述的分析藥盒，其中重組人白細(xì)胞介素-2是一種含如圖1所示那樣氨基酸序列的多肽。
8.根據(jù)權(quán)項(xiàng)6所述的分析藥盒，其中片段為抗體Fab′片段。
9.根據(jù)權(quán)項(xiàng)6所述的分析藥盒，其中抗體是通過親和層析純化的。
10.根據(jù)權(quán)項(xiàng)6所述的分析藥盒，其中標(biāo)記試劑為辣根過氧化物酶。
11.一種來源于溫血?jiǎng)游锏目怪亟M人白細(xì)胞介素-2的抗體或其片段。
12.根據(jù)權(quán)項(xiàng)11中所述的抗體，其中重組的人白細(xì)胞介素-2是含如圖1所示氨基酸序列的多肽。
13.根據(jù)權(quán)項(xiàng)11所述的抗體，其中的片段為抗體片段Fab′。
14.根據(jù)權(quán)項(xiàng)11所述的抗體，其中抗體是通過親和層析純化。
15.一種來源于溫血?jiǎng)游锏目怪亟M人白細(xì)胞介素-2的抗體或其片段與標(biāo)記試劑的連接物。
16.根據(jù)權(quán)項(xiàng)15所述的連接物，其中重組人白細(xì)胞介素-2是一種含圖1所示那樣氨基酸序列的多肽。
17.根據(jù)權(quán)項(xiàng)15所述的連接物，其中片段為抗體片段Fab′。
18.根據(jù)權(quán)項(xiàng)15所述的連接物，其中抗體通過親和層析純化。
19.根據(jù)權(quán)項(xiàng)15所述的連接物，其中標(biāo)記試劑為辣根過氧化物酶。
專利摘要
一種免疫酶標(biāo)夾心方法測(cè)定人類白細(xì)胞介素-2，要比生物測(cè)定的靈敏度明顯提高。所述的夾心方法中，抗重組人白細(xì)胞介素-2的抗體是來源于溫血?jiǎng)游锏目贵w或其片段。
文檔編號(hào)C07K14/55GK86104525SQ86104525
公開日1987年2月25日 申請(qǐng)日期1986年7月22日
發(fā)明者守谷教彥, 加藤光一, 西村紀(jì) 申請(qǐng)人:武田藥品工業(yè)株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan