專利名稱：疫苗及其制備方法
本申請是美國專利申請909，964號的部分繼續(xù)申請。
本發(fā)明涉及一種疫苗，更確切地說涉及一種含有細(xì)菌鞭毛的疫苗，該細(xì)菌鞭毛與抗原部分結(jié)合時(shí)，可增強(qiáng)對抗原的免疫應(yīng)答。
疫苗在此被定義為一種抗原部分的懸浮液，通常包括侵染劑，或侵染劑的某些部分，注入機(jī)體可產(chǎn)生自動(dòng)免疫。組成疫苗的抗原部分可以是從微生物提純而來的天然產(chǎn)品，也可以是一種合成產(chǎn)品或通過遺傳工程生產(chǎn)的蛋白質(zhì)，肽或類似的產(chǎn)品。佐劑在此被定義為任何與所注射的免疫原相混合即可增強(qiáng)免疫應(yīng)答的物質(zhì)。半抗原在此被定義為一種可選擇性地與適宜的抗體反應(yīng)的物質(zhì)，但半抗原本身通常不是免疫原。大多數(shù)半抗原都是小分子，但有些大分子也能起半抗原的作用。結(jié)合在此被定義為兩個(gè)或多個(gè)分子的共價(jià)或其它形式的連接。
60年前，證實(shí)了通過接種作為與化膿菌或與各種添加化合物的混合物的疫苗有可能增強(qiáng)對白喉和破傷風(fēng)的抗毒素反應(yīng)。從那時(shí)起，醫(yī)務(wù)人員和免疫學(xué)家就試圖用佐劑加強(qiáng)免疫應(yīng)答，同時(shí)試圖減小經(jīng)常出現(xiàn)的副作用。
生物合成和重組DNA技術(shù)使具有抗原決定簇的疫苗發(fā)展起來，抗原決定簇以前是不可能產(chǎn)生的。例如，目前可使用的疫苗包括在致免疫方面模仿鏈球菌，淋球菌和口蹄疫，愛滋病(HIV-1病毒)和瘧性抗原的合成肽。
對寄生物病瘧疾的研究尤為重要。這種疾病每年在世界范圍內(nèi)侵襲2億以上的人，從發(fā)病率和失業(yè)率來看它是世界上最嚴(yán)重的疾病。遺傳工程技術(shù)已被用于鑒定，并且已經(jīng)大量生產(chǎn)出幾種瘧原蟲的蛋白。特別是，一種來自子孢期的12個(gè)氨基酸的肽已被確定為擔(dān)負(fù)著重要的抗原位點(diǎn)?？乖撎厥怆牡目贵w在注射后可立即殺死寄生物。令人遺憾的是，這種肽本身不能產(chǎn)生適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答。
為了誘導(dǎo)對子孢子肽的有效的免疫應(yīng)答，與肽同時(shí)注入了佐劑。然而，到目前為止，與肽一起使用的佐劑尚未產(chǎn)生令人滿意的結(jié)果。因此，在發(fā)展可增強(qiáng)半抗原的抗原決定簇的免疫原性的有效，無毒性佐劑方面已引起人們的關(guān)注。此外，還需要與常規(guī)的疫苗一起使用時(shí)，能引起更早的，更有效的，或更持久的應(yīng)答的佐劑。當(dāng)抗原的供給受到限制或生產(chǎn)抗原較昂貴時(shí)，這種佐劑也將是很有用的。
直到最近，佐劑的開發(fā)一直是以經(jīng)驗(yàn)為根據(jù)的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的化合物。這些化合物在物質(zhì)和功能方面顯然是多種多樣的，即很難發(fā)現(xiàn)統(tǒng)一的佐劑作用機(jī)制。這些機(jī)制的闡明落后于目前在了解免疫系統(tǒng)方面的進(jìn)展。
佐劑的這種多樣性給其分類上帶來了困難。這些佐劑有時(shí)可按其來源分類，如為礦物質(zhì)細(xì)菌產(chǎn)物，植物產(chǎn)物，合成產(chǎn)物，或宿主產(chǎn)物。按此分類法第一類是非細(xì)菌佐劑，如鋁化物。1926年描述了鋁化物作為佐劑的首次應(yīng)用。從那時(shí)起，用鋁鹽沉淀的抗原或與鋁化物混合的抗原或吸附到鋁化物上的抗原就一直廣泛用于增強(qiáng)動(dòng)物和人的免疫應(yīng)答。鋁化物和類似的佐劑可能通過下列機(jī)制起作用使抗原的分泌減慢，從而延長抗原與出現(xiàn)抗原的細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞或?yàn)V泡-樹狀細(xì)胞)之間的相互作用時(shí)間。此外，使免疫活性細(xì)胞聚集到感染區(qū)域。在免疫后7天兔的局部淋巴結(jié)中已證實(shí)了鋁顆粒的存在，并且另一個(gè)重要功能可能是抗在淋巴結(jié)本身含T細(xì)胞區(qū)域的抗原。佐劑的效價(jià)顯示出與淋巴結(jié)的炎癥相關(guān)聯(lián)。許多研究已進(jìn)一步證實(shí)與鋁鹽一起給藥的抗原導(dǎo)致體液免疫增強(qiáng)，而細(xì)胞免疫只稍有增強(qiáng)，這一點(diǎn)可通過延遲型超敏反應(yīng)來測定。氫氧化鋁也已被描述為可激活補(bǔ)充途徑。這一機(jī)制在局部炎癥應(yīng)答以及免疫球蛋白生產(chǎn)和B細(xì)胞記憶方面可起一定作用。疏水物部分的平均集合分子量在大約4000至8000道爾頓之間;b是使聚氧丙烯(POP)占八嵌段共聚物總分子量約60%至90%的數(shù)。
鞭毛可用作引導(dǎo)抗體對小的抗原決定簇如半抗原，藥物，肽類起長期，高效價(jià)和高親合力的反應(yīng)的非常有效的佐劑。肽類可以是合成性或遺傳工程制成的。遺傳工程制成的肽舉例有那些現(xiàn)在可獲得的用于瘧疾病的肽。改進(jìn)的疫苗包括小的抗原決定簇與鞭毛的結(jié)合物，它可用來透導(dǎo)強(qiáng)烈并長期的胸腺依賴IgG抗體反應(yīng)。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種疫苗，它對產(chǎn)生對小免疫原性決定簇的長期并強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)特別有效。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種有效的疫苗，它可以應(yīng)用一種合成肽，如瘧疾病肽，以產(chǎn)生能使個(gè)體免受瘧原蟲侵襲的持久性的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的另一目的是提供一種有效的疫苗，它可以利用愛滋病毒的合成性肽以產(chǎn)生有效地防治該疾病的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的另一目的是提供一種疫苗，它能刺激動(dòng)物或人的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對小的免疫原決定簇如肽或半抗原的強(qiáng)烈并長期的IgG反應(yīng)。
本發(fā)明的另一目的是提供一種很少或不引起局部變態(tài)反應(yīng)的疫苗。
本發(fā)明的另一目的是提供一種可以被冷凍干燥的疫苗。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供可以與疫苗制劑一起使用的佐劑。
本發(fā)明的這些目的以及其它目的，特點(diǎn)以及優(yōu)點(diǎn)，在閱讀了以下的發(fā)明詳述和權(quán)利要求書后會(huì)變得更加明顯的。


圖1顯示了用結(jié)合有沙門氏菌鞭毛蛋白的三硝基酚(TNP)所免疫的小鼠的抗體效價(jià)。
圖2顯示了用結(jié)合有沙門氏菌鞭毛蛋白的TNP所免疫的小鼠的劑量反應(yīng)。
圖3顯示了用結(jié)合有雞胚清蛋白(hEA)的TNP免疫的小鼠與用結(jié)合有沙門氏菌鞭毛蛋白的TNP所免疫的小鼠之間的免疫反應(yīng)比較結(jié)果。
首先由于鋁化物非常安全，所以目前它們是最常用的人類佐劑。然而，它們并非沒有問題。含有鋁的疫苗有時(shí)可引起局部反應(yīng)。雖然變應(yīng)性現(xiàn)象通常不是臨床問題，但據(jù)說鋁化物還是通過依賴T細(xì)胞的機(jī)制將嗜曙紅細(xì)胞吸引到感染區(qū)域，如果在抗原活化后注射鋁化物，則可誘導(dǎo)IgE應(yīng)答，并可得到對IgE應(yīng)答具有輔助功能的帶特異性菌體的細(xì)胞群。此外，不能將含有鋁的疫苗凍干，因而必須冷藏運(yùn)輸和貯存，因而有被污染的危險(xiǎn)。
最后，最重要的問題是，鋁化物在誘導(dǎo)持久的防御疾病能力方面不總是成功的。因此盡管鋁鹽一直是對只需抗體應(yīng)答的強(qiáng)免疫原來說足以產(chǎn)生保護(hù)作用的佐劑，但當(dāng)其與弱免疫原類的瘧疾合成肽一起用來引導(dǎo)許多感染所需類型的細(xì)胞免疫應(yīng)答時(shí)是無效的。
另一大類佐劑是細(xì)菌來源的佐劑。近來這類佐劑已被純化和合成(如胞壁酰二肽，類脂A)并且宿主介體已被克隆(白細(xì)胞介素1和2)，提供了用于研究的化學(xué)特征化產(chǎn)品。近十年已在細(xì)菌來源活性成分的三種佐劑的化學(xué)純化方面取得很大進(jìn)步，這三種佐劑是百日咳博代氏桿菌(Bordetellapertussis)，脂多糖和弗氏完全佐劑。
由于百日咳博代氏桿菌能夠通過對T-淋巴細(xì)胞群的作用增強(qiáng)細(xì)胞免疫，所以是值得關(guān)注的。對于脂多糖和弗氏完全佐劑，佐劑的有效部分已被鑒定并合成，這些有效部分可用來研究結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系和有可能修飾原始佐劑以產(chǎn)生一個(gè)更有益的毒性治療比例。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)脂多糖及其各種衍生物(包括類脂A)在與脂質(zhì)體或其它脂類乳劑結(jié)合時(shí)是強(qiáng)效佐劑。這些具有足夠慢的毒性用于人類的衍生物是否能夠生產(chǎn)尚無定論。弗氏完全佐劑是多數(shù)試驗(yàn)研究的標(biāo)準(zhǔn)。然而，它可引起嚴(yán)重的局部或全身性發(fā)炎反應(yīng)，其嚴(yán)重程度足以使宿主喪失活動(dòng)能力或殺死宿主。所以不能將它用于人。
佐劑也可以通過其所推薦的作用機(jī)制來分類。這種分類類型必然有幾分任意性，因?yàn)槎鄶?shù)佐劑可能通過一個(gè)以上的機(jī)制起作用。佐劑可通過抗與天然蛋白分子結(jié)合的決定簇也已被證明分別有利于協(xié)助作用和抑制作用。免疫原載體與抗原的結(jié)合能夠改變在對該抗原的應(yīng)答中產(chǎn)生的同型抗體。來自各種被囊細(xì)菌的純化多糖是胸腺依賴抗原，這是由于其具有多重抗原決定簇的多出性。當(dāng)它們代表這些細(xì)菌的保護(hù)性抗原時(shí)，所產(chǎn)生的IgM抗體就限制了預(yù)防疾病的效能。因此，來自腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)和流感嗜血桿菌(Haemophilnsinfluenza)b型的多糖已與蛋白(如破傷風(fēng)類毒素)結(jié)合。這些結(jié)合制劑以胸腺依賴抗原的身份而起作用并誘導(dǎo)對多糖部分的IgG應(yīng)答以及免疫記憶。同樣，非胸腺依賴多糖載體對增強(qiáng)小肽的免疫原性沒有多大潛力，例如對于需要胸腺依賴IgG免疫應(yīng)答的瘧疾來說所涉及的那些小肽。
Feldmann和Lee的出版物闡述了沙門氏菌的鞭毛抗原是典型的可刺激強(qiáng)烈的IgM抗體應(yīng)答的非胸腺依賴抗原(見Feldmann，M，etal.，“TheRelationshipbetweenAntigenicStmcetureandtheRequirementforThymus-derivedcellsintheImmuneResponse”，J.Exp.Med.，Vol.134，pp103-119，1971;andLee，etal.，“DeclineandSpontaneousRecoveryoftheMonoclonalRerponsetoPhosphorylineduringRepeatedInmunization”J.Immun.，Vol.113，pp1644-1646，1974)。這一公開的資料將使人們相信對于需要胸腺依賴IgG抗體應(yīng)答的瘧疾肽或其它小抗原來說非胸腺依賴抗原作為佐劑或載體沒有多大潛力。
很可能沒有區(qū)分載體與佐劑的精確轉(zhuǎn)變點(diǎn)。顯然，載體部分有助于被稱為固有佐劑性的抗原特性。通過使蛋白聚集或吸附到免疫原載體或惰性載體上可增加抗原的大小，從而增強(qiáng)佐劑性。因此吸附抗原和增強(qiáng)免疫應(yīng)答的物質(zhì)，如氫氫化鋁，乳汁粒，皂土，或脂質(zhì)體都被稱為佐劑。然而，這一抗原聚集的觀察結(jié)果只代表有限的佐劑作用的觀察，而佐劑作用現(xiàn)被公認(rèn)為是相當(dāng)復(fù)雜的。原定位和釋放，或通過對構(gòu)成免疫系統(tǒng)的細(xì)胞(如肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)的直接作用而起作用。佐劑可借以增強(qiáng)免疫應(yīng)答的另一種機(jī)制是通過造成抗原貯存而起作用。這將有助于鋁化物，油乳劑，脂質(zhì)體，和合成聚合物的佐劑活性。脂多糖和胞壁酰二肽的佐劑活性似乎主要通過巨噬細(xì)胞的激活作為媒介，而百日咳博代氏桿菌同時(shí)侵襲巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。最近推測的免疫增強(qiáng)法，如單核細(xì)胞激活素和淋巴激活素的利用，和抗原，載體，增強(qiáng)免疫應(yīng)答的佐劑的操作是普遍盛行的。
小的免疫原，如瘧疾合成肽，可與較大的蛋白或其它載體連接增強(qiáng)免疫應(yīng)答。分子大小和與免疫原性有關(guān)的抗原的復(fù)雜性之間的關(guān)系影響分子上抗原決定簇的有效性。這種關(guān)系首先是由Landsteiner注意到的，那時(shí)他證實(shí)了為了刺激免疫應(yīng)答需要復(fù)雜的具有較大(載體)分子的小基團(tuán)。然而，所需要的機(jī)制基礎(chǔ)有待于試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了載體的作用和用來表達(dá)免疫原性的分子上的兩個(gè)抗原決定簇的需求。這些決定簇代表著可分別與T和B淋巴細(xì)胞相互作用的載體和半抗原決定簇。然而，載體的影響除了簡單的抗原性之外通過在T-依賴性體液應(yīng)答中T細(xì)胞的激活而擴(kuò)大。
抗原分子上決定簇的結(jié)合能夠通過T助細(xì)胞和T抑制細(xì)胞的差別激活影響免疫應(yīng)答。證實(shí)這一結(jié)果的模式系統(tǒng)是通過基因控制應(yīng)答小鼠(C57B1/6)和非應(yīng)答小鼠(DBA/1)對合成三元共聚物L(fēng)-谷氨酸60-L-丙氨酸30-L-酪氨酸10(GAT)的體液應(yīng)答。C57 B1/6小鼠可應(yīng)答該多肽，而DBA/1小鼠只有在GAT與甲基化牛血清白蛋白(MBSA)偶聯(lián)條件下才會(huì)應(yīng)答。然而，如果在用GAT-MSBA免疫之前用GAT給小鼠注射，則不會(huì)出現(xiàn)可檢測的對GAT的抗體應(yīng)答。對這些觀察的解釋是GAT可刺激應(yīng)答小鼠中的T助細(xì)胞，但更可能是激活非應(yīng)答小鼠中的T抑制細(xì)胞。抑制細(xì)胞的這一優(yōu)勢甚至當(dāng)與MBSA偶聯(lián)時(shí)也可防止對GAT的應(yīng)答。然而，如果初次免疫是用GAT-MBSA，則T助細(xì)胞被載體部分的激活將有助于使由GAT激活的任何抑制細(xì)胞不起作用。
小肽和其它半抗原在不使用佐劑情況下不能引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。目前可用的多數(shù)佐劑都不能引起有效地保護(hù)動(dòng)物或人不受感染劑感染的免疫應(yīng)答。因此，所需要的是一種能夠用于動(dòng)物或人的疫苗，該疫苗應(yīng)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)向能夠保護(hù)動(dòng)物或人免受感染的肽或其它半抗原進(jìn)行持久和有效的免疫應(yīng)答。
根據(jù)本發(fā)明提供了一種人或動(dòng)物對肽或其它小的半抗原進(jìn)行免疫特別有效的疫苗。這種改進(jìn)了的疫苗對肽或其它小的半抗原具有長期有效的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明包括與小的抗原決定簇如肽或其它小的半抗原相結(jié)合的一種細(xì)菌蛋白。本發(fā)明中所用的細(xì)菌蛋白是細(xì)菌鞭毛。鞭毛可來自任何具鞭毛的微生物;但優(yōu)選來自沙門氏菌(Salmonella)的鞭毛。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，為某一目的所優(yōu)選的鞭毛菌應(yīng)該依據(jù)其特定抗原的要求而進(jìn)行，在本發(fā)明中并沒有嚴(yán)格限制。細(xì)菌鞭毛可以是天然的聚合化形式，也可以是再次聚合化的鞭毛蛋白。
本發(fā)明還包括將結(jié)合的鞭毛和肽與佐劑如嵌段共聚物一起施用。可與本發(fā)明的疫苗一起使用的佐劑優(yōu)選嵌段共聚物，該共聚物包括在乙二胺起始物上接上親水性聚氧乙烯(POE)而成的共聚物。然后，將疏水性聚氧丙烯(POP)的聚合物加到親水性POE嵌段上。這樣就得到一種八
其中，a是使聚氧乙烯(POE)所代表的親水物部分占該化合物總分子量的約10%至40%的數(shù);由聚氧丙烯(POP)所組成的八嵌段共聚物的該圖還顯示了兩種化合物在加有和不加有佐劑Polyphore32∶5(CyRxCorporation，Atlanta，Geogia)的比較結(jié)果。
本發(fā)明包括一種疫苗，它在免疫動(dòng)物和人抵抗小肽或其它半抗原方面特別有用。根據(jù)本發(fā)明，小肽或半抗原與從微生物得來的鞭毛相結(jié)合。鞭毛可以得自任何具鞭毛的微生物，但優(yōu)選得自沙門氏菌的鞭毛。應(yīng)當(dāng)理解的是，對任何特殊目的所優(yōu)選的細(xì)菌(從其獲取鞭毛)應(yīng)依據(jù)該目的特殊抗原要求，本發(fā)明并沒有嚴(yán)格限制。
有效細(xì)菌具有單根鞭毛，而另一些則具有鞭毛叢，再有一些細(xì)菌則在整個(gè)細(xì)胞表面都分布有鞭毛。細(xì)菌鞭毛的直徑在10至35nm之間，其長度有時(shí)會(huì)超過10至15μm，或者是細(xì)胞直徑的許多倍。大多數(shù)細(xì)菌鞭毛表現(xiàn)出規(guī)則的和獨(dú)特的卷曲，波長約2.5μm。
當(dāng)本質(zhì)為蛋白質(zhì)的細(xì)菌鞭毛在pH3被酸化時(shí)，它們被解離為稱作鞭毛蛋白的相同的單體亞單位，其分子量在大多數(shù)種類中約為40000。在適當(dāng)?shù)膒H和鹽濃度條件下，鞭毛蛋白單體將同時(shí)再聚集，所形成的結(jié)構(gòu)與原來的鞭毛相同，具有與天然鞭毛波長相同的周期性的卷曲。
在實(shí)踐本發(fā)明時(shí)，可以使用天然形式的完整細(xì)菌鞭毛，或被一些固定劑所固定的完整細(xì)菌鞭毛。此外，重新聚合的鞭毛蛋白適合用于本發(fā)明的實(shí)踐中。據(jù)信，本發(fā)明的一個(gè)要點(diǎn)是，制劑中包括一種聚合物，它由鞭毛蛋白分子規(guī)則地排列成幾何形式而組成，產(chǎn)生具特定微生物典型結(jié)構(gòu)的延長的鞭毛。
抗原是化合物，當(dāng)引入導(dǎo)哺乳動(dòng)物中時(shí)，其結(jié)果是會(huì)形成抗體。根據(jù)本發(fā)明，可用的抗原的代表是蛋白質(zhì)、糖蛋白和核蛋白，如肽荷爾蒙，血清蛋白，補(bǔ)體蛋白，結(jié)合因子，以及病毒或細(xì)菌產(chǎn)物。病毒或細(xì)菌的產(chǎn)物可以是生物通過酶切所產(chǎn)生的組分，或是由本專業(yè)領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的重組DNA技術(shù)所產(chǎn)生的生物的組分。以下是抗原的部分代表的名單蛋白質(zhì)糖蛋白核蛋白肽荷爾蒙血清蛋白補(bǔ)體蛋白結(jié)合因子微生物產(chǎn)物病毒產(chǎn)物細(xì)菌產(chǎn)物真菌產(chǎn)物特異免疫原清蛋白血管緊張素舒緩激肽降鈣素癌胚抗原絨膜促乳素絨膜促腺性激素促皮質(zhì)激素促紅細(xì)胞生成素因子Ⅷ纖維蛋白原α-2H球蛋白促濾泡素胃泌素硫酸鹽胃泌素胰高血糖素促性腺激素結(jié)合珠蛋白乙肝表面抗原免疫球蛋白胰島素促脂解激素促黑激素催產(chǎn)素腸促胰酶素胎盤催乳激素prathryin血管緊張素原促乳素生長激素促生長因子生長激素抑制素促甲狀腺激素加壓催產(chǎn)素胸腺生成素后葉加壓素α-1-胎蛋白α-2H球蛋白髓磷脂髓磷脂堿性蛋白半抗原是化合物，當(dāng)與致免疫載體相結(jié)合并引入到脊索動(dòng)物體中時(shí)，將會(huì)激發(fā)形成對該半抗原為特異性的抗體。半抗原的代表有類固醇，如雌激素及可的松類，小分子量的肽，其它小分子量的生物化合物，藥品，如抗生素，化療化合物，工業(yè)污染物，香料，食品添加劑，食物的污染物，和/或它們的代謝物或衍生物。
本專業(yè)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已經(jīng)熟知了一些被揭示的由細(xì)菌培養(yǎng)物中制備鞭毛的方法。優(yōu)選的方法是如在此所述的Kobayashi，Rinker，和Koffler方法的改進(jìn)[Arch.Biochem.Biophys，84，342-362(1959)]。
傷寒沙門氏菌(Salmonekkatyphi)TY2菌株在游動(dòng)性瓊脂中生長。應(yīng)選擇出高度游動(dòng)的生物，因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生大量的鞭毛。然后將這些生物接種到20升的類胰蛋白酶豆汁培養(yǎng)基中，以37℃培養(yǎng)大約30小時(shí)，直至Log生長期的終止。此時(shí)，加入甲醛產(chǎn)生0.3%的懸浮液可以殺死這些生物。最好用離心法收集生物體，但應(yīng)注意避免產(chǎn)生過量的剪切力。然后在搖瓶中劇烈搖動(dòng)20分鐘將鞭毛從生物體上取下。同樣，也可以使用那些既能產(chǎn)生剪切力以切下鞭毛而同時(shí)又不破壞生物體的混合器或裝置。
用差速離心法將鞭毛與細(xì)胞體分開。用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)用離心機(jī)以約2000rpm離心可以將細(xì)胞體除去。然后以30000rpm超速離心收集鞭毛。鞭毛再經(jīng)重懸浮，再超速離心，倒去可溶性污染物。大的污染物將在透明的鞭毛濾餅的底部形成黑點(diǎn)，將其用物理方法除去。由20升細(xì)菌培養(yǎng)物中得到的終產(chǎn)物為大約100mg純凈的鞭毛。
將未固定的鞭毛以約pH2過夜酸化可以產(chǎn)生鞭毛蛋白。這一處理解離子鞭毛蛋白，產(chǎn)生了分子量約為30000的鞭毛蛋白單體。當(dāng)單體在中性pH放置至少24小時(shí)，它們會(huì)集合成聚合化的鞭毛。。作為小抗原的佐劑或載體，重新聚合成的鞭毛具有與天然鞭毛相近的效力。鞭毛蛋白單體或其蛋白水解片段的效力就差得多。
用本專業(yè)領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的任何一種標(biāo)準(zhǔn)方法都可以將抗原半抗原或肽化學(xué)結(jié)合到鞭毛上。其中之一最有效和最簡單的方法是使用戊二醛。戊二醛是二價(jià)的交聯(lián)化合物，它以共價(jià)鍵將肽與鞭毛連起來并進(jìn)而固定鞭毛制劑。其它化學(xué)交聯(lián)劑或化學(xué)抗原衍生物和二硝基費(fèi)苯也是有效的。
連到鞭毛上的抗原量依具體的情況而不同，本發(fā)明對此并不嚴(yán)格限制。優(yōu)選的是每個(gè)鞭毛蛋白單體有2-10個(gè)單位的肽或半抗原，這樣的鞭毛制劑是有效的。
結(jié)合鞭毛制劑用透析，離心或其它標(biāo)準(zhǔn)方法純化。然后以約100μg/ml的濃度將該材料重懸浮于鹽水中。這種制劑以每次1～100μg的低劑量注射是有效的。在很多情況下，10μg的劑量就產(chǎn)生令人滿意的反應(yīng)?？梢匀魏畏奖愕耐緩阶⑸?，如靜脈內(nèi)，皮下，肌肉或腹膜內(nèi)。對許多疫苗來講，皮下或肌肉方式一般是最方便的。
例如，注射20μg結(jié)合有二硝基苯酚的傷寒沙門氏菌鞭毛，其結(jié)果是對半抗原DNP的特異性IgG抗體效價(jià)在注射后第一周末上升并保持幾個(gè)月。
對鞭毛和結(jié)合有鞭毛的抗原的免疫反應(yīng)的持續(xù)現(xiàn)象是沒有預(yù)料到的和不尋常的。這種材料并不在注射部位形成抗原的局部沉積。所注射的鞭毛劑量的約90-95%均被分解并在24小時(shí)內(nèi)被排泄出。在局部淋巴結(jié)的生發(fā)中心內(nèi)有一部分該材料被保留較長時(shí)間。據(jù)信，這種抗原存在于生發(fā)中心的現(xiàn)象是負(fù)責(zé)抗體的長期生產(chǎn)的。
本發(fā)明具有許多超過以往佐劑制劑的優(yōu)點(diǎn)。它在注射部位幾乎不引起發(fā)炎并且是完全可被生物降解的。這正與油乳劑或無機(jī)鹽，如鋁的情況相反。只需很小劑量的抗原就可產(chǎn)生長期的免疫反應(yīng)。很大部分的抗體是固體補(bǔ)體的IgG，它是抗瘧疾，子孢子和其它重要感染所需要的。當(dāng)與固定劑如戊二醛相結(jié)合制備時(shí)，則產(chǎn)物更加穩(wěn)定。毫無疑問，它可以被冷凍干燥和在室溫儲(chǔ)存。當(dāng)用鹽水重新配制后，在冰箱內(nèi)可以穩(wěn)定幾周，在室溫下可以穩(wěn)定幾天。
同可能在敏感宿主中產(chǎn)生感染的活減毒疫苗不同，本發(fā)明的疫苗制劑僅包括聚合的蛋白，僅含有痕量的多糖。
本發(fā)明疫苗制備劑的優(yōu)選劑量是5-500μg。每種疫苗的最適劑量依據(jù)的是結(jié)合有鞭毛蛋白的抗原和被免疫的動(dòng)物或人的免疫條件。
本發(fā)明的疫苗還包括將該疫苗與佐劑一起使用以增強(qiáng)免疫反應(yīng)。優(yōu)選的可與本發(fā)明疫苗一起使用的佐劑(PolyphoreTM32∶5 Cyt Rx，Corporation，Atlanta，Georgia)是一種嵌段共聚物，它包括在乙二胺起始物上建立親水性聚氧乙烯(POE)所形成的聚合物。然后在親水性聚氧乙烯嵌段上加上疏水性聚氧丙烯(POP)聚合物。結(jié)果形成一種八嵌段共聚物，其通式如下疏水物-親水物-疏水物
其中，a是使POE所代表的親水物部分占化合物總分子量約10%～40%的數(shù);
由POP組成的八嵌段共聚物的疏水物部分的平均聚集分子量為約4000～9000道爾頓;
b是使POP占總八嵌段共聚物分子量的約60%～90%的數(shù)。
優(yōu)選的佐劑具有下列通式疏水物-親水物-疏水物
其中a約等于5，b約等于32。
另一種可與本發(fā)明疫苗共用的共聚物具下述通式
其中疏水物(C3H6O)的分子量約為2000～5000，化合物的總分子量約為2300～6000(Cyt Rx，Corporation，Atlanta，Georgia)。
優(yōu)選的佐劑具下式通式
其中疏水物(C3H6O)的分子量約為4300，親水部分(C2H4O)a的重量百分比約為10%(Cyt Rx，Corporation，Atlanta，Georgia)。
聚合物的嵌段是在堿性催化劑存在下，以高溫和高壓的條件將氧化乙烯和氧化丙烯縮合到四功能乙二胺起始物上而形成的。依統(tǒng)計(jì)學(xué)而言，在每個(gè)共聚物中用以形成聚合物鏈的單體單位的數(shù)目是可以變化的。所給出的分子量是在每種制劑中共聚物分子重量的近似平均值。對這些嵌段共聚物的進(jìn)一步描述請參見美國專利2674619號和2979528號，通過在此引述，將它們合并于本文(還可參見“AReciewofBloekPolymerSurfactans”，Schmolka，I.R.，J.Am，OilChemists′Soc.，54∶110-116，(1977)和BlockandGraftCopolymerization，Volume2，editedbyR.J.Ceresa，JohnWiley&Sons，NewYork，(1976)，通過在此引述，將它們也合并于本文)。
本發(fā)明的疫苗與八嵌段共聚物相混合并施用給人或動(dòng)物。優(yōu)選的與本發(fā)明疫苗一起使用的佐劑的數(shù)量約為0.1mg至5.0mg，更好的是約0.5mg至2.0mg。
以下的具體實(shí)施例將進(jìn)一步說明本發(fā)明的增強(qiáng)生物體對小半抗原的免疫反應(yīng)的情況。應(yīng)當(dāng)理解的是，對本專業(yè)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是明顯的其它實(shí)施例也均包括在本發(fā)明中，而且本發(fā)明也不僅限于這些具體的實(shí)施例。
實(shí)施例1傷寒沙氏菌TY2菌株在游動(dòng)性瓊脂中生長。然后將生物體接種到20升類胰蛋白酶豆汁培養(yǎng)其中以37℃培養(yǎng)30小時(shí)，直至Log生長期的終止。加入甲醛殺死生物體以形成0.3%的懸浮液。離心收集生物體。此時(shí)要小心避免過度剪切力。然后在搖瓶中劇烈搖動(dòng)20分鐘將鞭毛從生物體上取下。其它的既能產(chǎn)生使鞭毛脫離的剪切力并同時(shí)又不破壞生物體本身的混合器或裝置也都可使用。
用差速離心將鞭毛與細(xì)胞體分開。用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)用離心機(jī)以2000rpm離心除去細(xì)胞體。再以30000rpm超速離心收集鞭毛。超速離心后，將鞭毛重懸浮，再用超速離心機(jī)離心，倒掉可溶性污染物。大的污染物在透明的鞭毛濾餅的底部形成黑點(diǎn)，將其用物理方法除去。從20升細(xì)菌培養(yǎng)物中獲得的終產(chǎn)物約為100mg純凈的鞭毛。
實(shí)施例2將鞭毛在pH約為2的條件下酸化12小時(shí)產(chǎn)生鞭毛蛋白。這一處理解離了鞭毛蛋白以產(chǎn)生三個(gè)鞭毛蛋白單體，它們的分子量約為30000。當(dāng)將單體在中性pH放置至少24小時(shí)，則它們重新結(jié)合形成聚合化的鞭毛。
實(shí)施例3戊二醛是二價(jià)交聯(lián)化合物，它將肽與鞭毛共價(jià)結(jié)合并進(jìn)一步固定鞭毛制劑。這些將功能團(tuán)結(jié)合到蛋白質(zhì)上的方法是本專業(yè)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的。其它的化學(xué)交聯(lián)劑或化學(xué)抗原衍生物，如二硝基氟苯均是有效的。
實(shí)施例4結(jié)合鞭毛制劑用透析，離心或任何其它的標(biāo)準(zhǔn)方法提純。將該材料以約100μg/ml的濃度重新懸浮于鹽水中。這一制劑在每次注射1-100μg的低劑量時(shí)就是有效的。在許多情況下，10μg的劑量就可產(chǎn)生令人滿意的反應(yīng)。該材料可以任何方便的方式注射，如靜脈內(nèi)，皮下，肌肉和腹膜內(nèi)。通常對許多疫苗來講，最方便的是皮下和肌肉注射。
實(shí)施例5
用酶聯(lián)免疫檢測法(ELISA)來確定抗三硝基苯酚半抗原的抗體。它是Saunder(見Saunders，G.C.，“Theartofsolidphaseenzymeimmunoassayincludingselectedprotocds”，inImmuassaysintheClinicalLaboratory，AlanR.Liss，NewYork，pp.111-112，1979)原來公開的方法的一種改進(jìn)。
該檢測法中使用了蛋白質(zhì)，牛血清清蛋白，冰凝膠減小了粘附在塑料基質(zhì)上的蛋白質(zhì)的變性，并且使用蛋白質(zhì)的表面活性劑減小了導(dǎo)致本底值升高和靈敏度降低的非特異性蛋白吸附。用戊二醛將抗原連到BSA包被的96孔微滴板上。洗去未結(jié)合的戊二醛。加到板上的抗原通過戊二醛的游離醛基共價(jià)結(jié)合到板上。
剩下的醛基用賴氨酸封閉，該板處于備用。用各種稀釋度的抗血清接種這些板，沖洗，然后接種第二抗體，如結(jié)合有過氧化酶的山羊抗鼠IgG或其一種亞成分。清洗這些板并加入底物(例如帶過氧化物的正苯二胺)。再用TitertekMultiscan光度計(jì)在429nm處讀出吸收值。計(jì)算抗體的效價(jià)，為產(chǎn)生1/3至1/2最大本底O.D值所需的抗血清稀釋值。通過與樣品同時(shí)進(jìn)行的抗血清參考對比使之標(biāo)準(zhǔn)化。這樣有利于比較在不同天所測的效價(jià)。各種抗體的相對親合力可以從分析由O.D值對血清稀釋度所作的曲線的斜率來估計(jì)出。
實(shí)施例6在以下實(shí)驗(yàn)中，將平均每根鞭毛結(jié)合有4個(gè)TNP分子的鞭毛25μg給小鼠在后足墊接種。注射時(shí)配以0.5ml鹽水。接種后的第8，19，30，50和90天，測定抗TNP的特異性抗體。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見圖1。正如可見到的那樣，對結(jié)合TNP的鞭毛的免疫反應(yīng)在90天后仍然很顯著。對常規(guī)TNP結(jié)合物如結(jié)合TNP的雞胚清蛋白的反應(yīng)期就短得多，而且抗體較價(jià)也低得多。僅注射一次在可溶性蛋白質(zhì)載體上的半抗原，動(dòng)物經(jīng)常都不產(chǎn)生可檢測量的抗該半抗原的抗體。
實(shí)施例7通過注射不同劑量的結(jié)合TNP的鞭毛來測定小鼠的反應(yīng)劑量。給小鼠后足墊接種平均每個(gè)鞭毛蛋白分子(分子量約40000)結(jié)合有4個(gè)TNP分子的鞭毛。注射時(shí)配以0.5ml鹽水。給小鼠注射的濃度如下4μg，10μg，25μg和50μg。接種后的第8和第19天測定在對TNP結(jié)合鞭毛的反應(yīng)中所產(chǎn)生的抗體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。
實(shí)施例8圖3比較了小鼠對結(jié)合有TNP的雞胚清蛋白(hEA)與結(jié)合有TNP的細(xì)菌鞭毛蛋白的免疫反應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)中，按與鞭毛相同的方式用反應(yīng)衍生性三硝基苯磺酸(TNBS)將TNP與hEA相結(jié)合。給小鼠后足墊注射100μg結(jié)合含有TNP和hEA或25μg結(jié)合有TNP的鞭毛。注射后的第10天，根據(jù)實(shí)施例5測定抗體較價(jià)。如圖3所示，根據(jù)所測定的抗體效價(jià)可知，結(jié)合有TNP的鞭毛比結(jié)合有TNP的hEA所引起的免疫反應(yīng)顯著很多。應(yīng)當(dāng)注意的是，在本實(shí)驗(yàn)中，所用的TNP-hEA的量是結(jié)合有TNP的鞭毛的4倍(100μg-hEA對25μg結(jié)合有TNP的鞭毛)。
實(shí)施例9
給小鼠施以與實(shí)施例9相同的制劑，但為外加入1.0mgPolyphore32∶5佐劑(CytRxCorporation，Atlanta，GA)。給小鼠后足墊施以100μgTNP-hEA或25μg結(jié)合有TNP的鞭毛。10天后，按實(shí)施例5測定抗體的效價(jià)。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果列于圖3。如圖所示，佐劑提高了對TNP-hEA和結(jié)合有TNP的鞭毛的免疫反應(yīng)。然而，由結(jié)合有TNP的鞭毛所引起的免疫反應(yīng)比由TNP-hEA所引起的更顯著得多。
應(yīng)當(dāng)理解的是，以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，并且在不脫離權(quán)利要求書中所述的本發(fā)明的范圍和精神的條件下，還可作出許多改型和變化方案。
權(quán)利要求
1.一種疫苗，該疫苗含有有效量的與抗原結(jié)合的細(xì)菌鞭毛蛋白。
2.權(quán)利要求1的疫苗，其中的細(xì)菌鞭毛從沙門氏菌種中分離。
3.權(quán)利要求2的疫苗，其中沙門氏菌種是傷寒沙門氏菌。
4.權(quán)利要求1的疫苗，其中抗原選自下列一組物質(zhì)半抗原、藥物、肽、蛋白質(zhì)、多糖、脂類、糖脂和糖肽。
5.權(quán)利要求1的疫苗，其中抗原來源于瘧原蟲。
6.權(quán)利要求1的疫苗，其中抗原來源于人的免疫缺乏病毒。
7.權(quán)利要求1的疫苗，其中鞭毛由重新聚合的鞭毛蛋白所組成。
8.權(quán)利要求1的疫苗，其中疫苗與佐劑一起給藥。
9.權(quán)利要求8的疫苗，其中佐劑的結(jié)構(gòu)式如下
其中a為用聚氧乙烯(C2H4O)a(POE)表示的親水物部分的數(shù)目，聚氧乙烯約占該化合物總分子量的10%～40%;由聚氧丙烯(C3H6O)b(POP)組成的八嵌段共聚物的疏水物部分的平均聚集分子量約為5000～7000道爾頓;和b為聚氧丙烯(C3H6O)b(POP)的數(shù)目，八嵌段共聚物的聚氧丙烯部分約占該化合物總分子量的60%～90%。
10.權(quán)利要求8的疫苗，其中佐劑的結(jié)構(gòu)式如下
其中a約等于5，b約等于32。
11.權(quán)利要求8的疫苗，其中佐劑的結(jié)構(gòu)式如下其中疏水物(C3H6O)的分子量約為2000～5000，該化合物的總分子量為2300～6000。
12.權(quán)利要求8的疫苗，其中佐劑的結(jié)構(gòu)式如下其中疏水物(C3H6O)的分子量為4300，親水物(C2H4O)a的重量百分比約為10%。
13.一種使人或動(dòng)物免疫的方法，該方法包括施用有效量的與抗原結(jié)合的細(xì)菌鞭毛蛋白的步驟。
14.權(quán)利要求13的方法，其中的細(xì)菌鞭毛從沙門氏菌種中分離。
15.權(quán)利要求14的方法，其中沙門氏菌種是傷寒沙門氏菌。
16.權(quán)利要求13的方法，其中抗原選自下列一組物質(zhì)半抗原、藥物、肽、蛋白質(zhì)、多糖、脂類、糖脂和糖肽。
17.權(quán)利要求13的方法，其中抗原來源于瘧原蟲。
18.權(quán)利要求13的疫苗，其中抗原來源于人的免疫缺乏病毒。
19.權(quán)利要求13的方法，其中鞭毛由重新聚合的鞭毛蛋白所組成。
20.權(quán)利要求13的方法，其中疫苗與佐劑一起給藥。
21.權(quán)利要求20的方法，其中佐劑的結(jié)構(gòu)式如下
其中a為用聚氧乙烯(C2H4O)a(POE)表示的親水物部分的數(shù)目，聚氧乙烯約占該化合物總分子量的10%～40%;由聚氧丙烯(C3H6O)b(POP)組成的八嵌段共聚物的疏水物部分的平均聚集分子量約為5000～7000道爾頓;和b為聚氧丙烯(C3H6O)b(POP)的數(shù)目，八嵌段共聚物的聚氧丙烯部分約占該化合物總分子量的60%～90%。
22.權(quán)利要求20的方法，其中佐劑的結(jié)構(gòu)式如下
其中a約等于5，b約等于32。
23.權(quán)利要求20的方法，其中佐劑的結(jié)構(gòu)式如下其中疏水物(C3H6O)的分子量約為2000～5000，該化合物的總分子量為2300～6000。
24.權(quán)利要求20的方法，其中佐劑的結(jié)構(gòu)式如下其中疏水物(C3H6O)的分子量為4300，親水物(C2H4O)a的重量百分比約為10%。
25.一種生產(chǎn)改進(jìn)疫苗的方法，該方法包括(a)從細(xì)菌中分離鞭毛蛋白;和(b)使所說的鞭毛與抗原結(jié)合。
26.權(quán)利要求25的方法，其中的鞭毛蛋白從沙門氏菌種中分離。
27.權(quán)利要求26的方法，其中沙門氏菌種是傷寒沙門氏菌。
28.權(quán)利要求25的方法，其中抗原選自下列一組物質(zhì)半抗原、藥物、肽、蛋白質(zhì)、多糖、脂類、糖脂和糖肽。
29.權(quán)利要求25的方法，其中抗原來源于瘧原蟲。
30.權(quán)利要求25的疫苗，其中抗原來源于人的免疫缺乏病毒。
31.權(quán)利要求25的方法，其中鞭毛由重新聚合的鞭毛蛋白所組成。
32.權(quán)利要求25的方法，其中疫苗與佐劑一起給藥。
33.權(quán)利要求32的方法，其中佐劑的結(jié)構(gòu)式如下其中a為用聚氧乙烯(C2H4O)a(POE)表示的親水物部分的數(shù)目，聚氧乙烯約占該化合物總分子量的10%～40%;由聚氧丙烯(C3H6O)b(POP)組成的八嵌段共聚物的疏水物部分的平均聚集分子量約為5000～7000道爾頓;和b為聚氧丙烯(C3H6O)b(POP)的數(shù)目，八嵌段共聚物的聚氧丙烯部分約占該化合物的總分子量60%～90%。
34.權(quán)利要求32的方法，其中佐劑的結(jié)構(gòu)式如下
其中a等于5，b等于32。
35.權(quán)利要求32的方法，其中佐劑的結(jié)構(gòu)式如下其中疏水物(C3H6O)的分子量約為2000～5000，該化合物的總分子量為2300～6000。
36.權(quán)利要求32的方法，其中佐劑的結(jié)構(gòu)式如下其中疏水物(C3H6O)的分子量為4300，親水物(C2H4O)a的重量百分比約為10%。
37.一種疫苗佐劑，該佐劑含有具有下式的共聚物
其中a為用聚氧乙烯(C2H4O)a(POE)表示的親水物部分的數(shù)目，聚氧乙烯約占該化合物總分子量的10%～40%;由聚氧丙烯(C3H6O)b(POP)組成的八嵌段共聚物的疏水物部分的平均聚集分子量約為5000～7000道爾頓;和b為聚氧丙烯(C3H6O)b(POP)的數(shù)目，八嵌段共聚物的聚氧丙烯部分約占該化合物總分子量的60%～90%。
38.權(quán)利要求37的疫苗佐劑，其中佐劑的結(jié)構(gòu)式如下
其中a等于5，b等于32。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種與小的抗原決定簇結(jié)合的細(xì)菌蛋白，如肽或其它小的半抗原。用于本發(fā)明的細(xì)菌蛋白是細(xì)菌鞭毛。該鞭毛可來源于任何具有鞭毛的微生物，但最好是來自沙門氏菌種的鞭毛。細(xì)菌鞭毛可以天然聚合的形式存在或可為重新聚合的鞭毛蛋白。該疫苗對接種給人或動(dòng)物以抵抗肽或其它小的半抗原是尤為有效的。改進(jìn)的疫苗可提供對肽或小的半抗原持久和有效的免疫應(yīng)答。
文檔編號A61K39/39GK1030019SQ87106498
公開日1989年1月4日 申請日期1987年9月22日 優(yōu)先權(quán)日1986年9月22日
發(fā)明者羅伯特·L·胡恩特 申請人:埃默里大學(xué)