專利名稱：用作病毒感染標記的RNase L抑制劑的制作方法
愛滋病(AIDS)(獲得性免疫缺陷綜合癥)是二十世紀公眾健康的主要威脅。由于愛滋病生物學上的可變性質(zhì)、它在個體之間微妙的傳播方式以及它的不能輕易探測到它真正存在的疾病“潛伏期”，使愛滋病迅速陷入規(guī)?？涨暗牧餍胁±Ь场Ｊ聦嵣?，即使已投入了龐大的財力和物力來提高其診斷能力，可利用的技術(shù)仍然達不到在任何一部分人群中有力地控制這一問題所必需的要求。例如參見題為“使用HTLV-Ⅲ抗體試驗的經(jīng)驗，有關(guān)篩選的最新資料、實驗室與流行病相關(guān)性”的專題討論會會議錄，該討論會由國立衛(wèi)生研究所，F(xiàn)DA，醫(yī)藥和生物中心及疾病防治中心聯(lián)合發(fā)起，1985年7月31日在馬里蘭州的Bethesda的國立衛(wèi)生研究所舉行，還可參見Budiansky，S的“Nature”316卷96頁，1985年7月11日。
人體免疫缺陷病毒(HIV)存在幾個不同的名稱，LAV是法國巴黎的Pasteur研究所分離出來的愛滋病病毒的名稱;HTLV-Ⅲ是美國馬里蘭州Bethesda的國家衛(wèi)生研究所分離出來的該病毒的名稱。在本文中，這種HIV病毒經(jīng)常被稱為一般命名的HTLVⅢ或LAV或HIV，而不打算在它們之間進行區(qū)分。此外，本說明書中的術(shù)語“HIV”包括與產(chǎn)生愛滋病相關(guān)的任何一種病毒和所有其它的病毒，而不論它們是否被分離出來。單數(shù)形式的HIV指包括任何一種類型的HIV，而不管它們的基因內(nèi)容是什么。類似地，愛滋病癥狀一般指的是包括HIV(如上定義的)、ARC或AIDS相關(guān)的綜合癥、淋巴結(jié)病綜合癥(LAS)和其它引起大致類似臨床狀況的病毒引起的癥狀。
愛滋病是隨受人體免疫缺陷病毒HIV感染引起的免疫系統(tǒng)逐漸惡化而來的。在愛滋病的早期，細胞中免疫性由于損失了表達所謂T4抗原的T細胞(由胸腺來的)受到損傷，T細胞的亞單元主要是T助體和誘導物細胞組成。T4細胞缺陷可能導致幾種細胞中介免疫性的缺陷，其中包括NK(天然殺傷細胞)的缺陷、LAK(淋巴因子激活的殺傷細胞)缺陷和溶胞T細胞缺陷。在愛滋病中還存在B細胞(骨髓得到的)缺陷。
雖然愛滋病自一個階段過渡到另一階段的速度是能改變的，但它似乎是一種逐漸發(fā)展的疾病，這些階段已經(jīng)有了被命名的分類。存在一些受HTV感染而無癥狀(血清陽性)的個體，這些人通過存在抗該病毒的循環(huán)抗體被判斷的(M、G、Sarngadharan等人“Science”224卷506頁，1984年)。如果他們沒有任何其它標記，則按WalterReed分類法(R、R、Redfield等人“NewEnglandJournalofMedicine”314卷，131頁，1956年)，他們是WR1期病人。也稱他們?yōu)锳RC前期病人(ARC是愛滋病相關(guān)綜合癥)，盡管這些個體中的某些人可能永遠不會發(fā)展成ARC癥狀。這些病人中的一些人可能會發(fā)展成淋巴結(jié)病(WR2)并顯示出T4細胞缺陷(WR3)。接著，淋巴細胞經(jīng)受抗原刺激的增生能力和抗原刺激的r干擾素生成的能力下降了，這些WR4期病人開始失去被延緩了的皮膚過敏性。WR5期病人通常是無(細胞免疫)反應性的，他們出現(xiàn)帶狀皰疹感染、口腔念珠菌病(鵝口皰)、或者包括持續(xù)高燒、夜里盜汗、疲倦、腹瀉和/或體重下降在內(nèi)的ARC癥狀，這種ARC階段通常還以進行性免疫力衰變?yōu)樘卣?。最后，WR6期病人經(jīng)受機會致病菌的感染，構(gòu)成“全爆發(fā)”型(full-blown)愛滋病，這種病人有50%在12個月內(nèi)死亡(H.W.Murray等人“NewEnglandJournalofMedicine”310卷883頁，1984年)。
現(xiàn)在說明天然2′-5′A抗病毒防御途徑的HIV相關(guān)抑制劑(一種或多種)。這些研究結(jié)果涉及到對各種病毒性疾病(如皰疹、還原病毒感染等)和/或潛伏癌病癥狀的一個新的診斷和/或治療方法。
干擾素誘導的2-5A(2′-5′寡腺苷酸)合成酶/RNaseL系統(tǒng)是宿主對病毒感染防御機制的一部分。這個系統(tǒng)中的一些組成部分包括(ⅰ)dsRNA(雙股核糖核酸)相關(guān)的2-5A合成酶，(ⅱ)內(nèi)源性2-5A和(ⅲ)一種2-5A相關(guān)的內(nèi)源性RNaseL(內(nèi)源性核糖核酸酶)。在2-5A合成酶/RNaseL途徑中這些組成部分中的任何一個有缺陷都會導致全部或部分喪失抗病毒作用。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，某些病毒感染的人以及經(jīng)受干擾素治療的人的血清和外周血液單核細胞(PBMC)中的2-5A合成酶的水平升高。因此，在PBMC中誘導2-5A合成酶似乎具有雖然有限但有潛在的診斷價值。然而，在PBMC中的2-5A合成酶水平的增高表示某些病毒疾病中的病沉重期狀態(tài)，但是，這種增高相反也是干擾素對其它病毒感染有效治療的癥兆。在愛滋病病人的血清中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了干擾素，但盡管如此，對已從ARC發(fā)展到AIDS的個體來說，顯示出2-5A合成酶的持續(xù)增高。如果發(fā)現(xiàn)2-5A合成酶/RNaseL系統(tǒng)中的其它組成部分(如細胞內(nèi)的2-5A或RNaseL)不起作用，就能解釋這些極大的實驗室/臨床的矛盾。為了探索這種可能性，需要弄清在體內(nèi)合成的2-5A的特征和RNaseL的作用，下面我將詳細說明之。
以下參照附圖進一步描述本發(fā)明，在這些附圖中

圖1是聚丙烯酰胺凝膠電泳板的照片，顯示了由LAS、ARC或AIDS人體的PBMC提取物中提取的2-5A的RNaseL的活性，它是由核蛋白體的RNA分裂測定法確定的;
圖2是一個顯示PBMC提取物中RNaseL活性水平的凝膠電泳板照片，它由核蛋白體的RNA分裂測定法確定，圖3是一個顯示PBMC中核蛋白體的RNA分裂活性恢復的凝膠電泳板照片;以及圖4是一個說明2′-5′寡腺苷酸/RNaseL途徑的流程圖。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種由感染了人體免疫缺陷病毒的細胞釋放的或促使其釋放的抑制劑物質(zhì)。這種抑制劑似乎是實際附著在酶RNaseL、2′-5′寡腺苷酸/RNaseL途徑的最終產(chǎn)物上，使整個免疫系統(tǒng)功能紊亂，造成HIV不可控地增殖。這里所公開的是直接或間接識別這些抑制劑的技術(shù)，是通過RNaseL的缺少或RNaseL的失活，或通過在2′-5′A/RNaseL途徑中存在生化中間產(chǎn)物的抑制劑來識別的，這種(些)抑制劑起檢測HIV存在或表現(xiàn)基本相似臨床狀況的有關(guān)病毒存在的標記的作用。
還討論了這種標記對病人的“全爆發(fā)型”愛滋病發(fā)展階段的預后意義，特別是對于那些外周血液和“包括血液、血液成分”移植器官的細胞和細胞提取物在內(nèi)的組織中有HIV抗體的病人。還描述了用于使RNaseL激活和/或?qū)NaseL抑制物質(zhì)除去或使之失活的步驟。通過激活RNaseL和/或除去或失活RNaseL抑制物質(zhì)或病毒相關(guān)抑制劑來治療AIDS和有關(guān)病毒以及監(jiān)測這樣一些病毒的發(fā)展的醫(yī)療方法也是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明還包括利用一種RNaseL的特異抑制劑或在2′-5′A/RNaseL途徑中的生化中間產(chǎn)物的病毒相關(guān)抑制劑作為抗原、在體內(nèi)和體外制取這些病毒抗體的步驟。
在患淋巴結(jié)病(LAS)、愛滋病相關(guān)的綜合癥(ARC)和獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)病人的外周血液單核細胞(PBMC)提取物中測量2-5A合成酶/RNaseL抗病毒途徑的各個成分。結(jié)果表明，在患愛滋病的人體中，2-5A合成酶水平提高很大，而患ARC和LAS的個體中，2-5A合成酶處在基本水平上。然而，與2-5A合成酶(2-5A)的變化無關(guān)，在患LAS、ARC和AIDS人體內(nèi)探測到高的2-5A內(nèi)源性濃度(最大為35nM)。如由結(jié)合測定法，核-纖維素酶測定法及核蛋白體RNA測定法測定的那樣，這種被提取的2-5A事實上是功能性的。不管內(nèi)源的功能性2-5A的濃度提高了多少，在任何一個患LAS、ARC和AIDS人體內(nèi)都沒有顯示出任何被激活的RNaseL。但是，在所有健康個體的PBMC中，即使他們的內(nèi)源性2-5A的濃度低于5nM，RNaseL卻被激活?；旌蠈嶒炋峁┝嗽?個患LAS、ARC和AIDS病人的5個病人中都存在RNaseL抑制劑的證據(jù)。這種抑制劑被轉(zhuǎn)移并能在人929細胞提取物中阻止2-5A誘發(fā)的rRNA的RNaseL-特異降解。一種這樣的RNaseL抑制劑是TCA和乙醇可沉淀的。通過RNaseA或蛋白酶處理可消除對RNaseL作用的抑制。我的研究表明，在患LAS、ARC和AIDS人的PBMC中，一種內(nèi)源性dsRNA(雙股核糖核酸)激活了2-5A合成酶，這使得內(nèi)源性2-5A的濃度增加。在患LAS、ARC和AIDS人的PBMC中，一種HIV誘發(fā)的RNaseL抑制劑阻止了功能性2-5A激活RNaseL的能力。
這里我指出了用特異的和敏感的測定法得到的PBMC提取物中2-5A的濃度和RNaseL功能的測定值，我們證實了在患LAS、ARC和AIDS病人PBMC中的2-5A合成酶/RNaseL抗病毒系統(tǒng)中的缺陷取決于RNaseL抑制劑的存在，而不取決于非功能的2-5A的合成。這里報導的數(shù)據(jù)強調(diào)指出，現(xiàn)在能夠用合理而清晰的生物化學觀點來解釋發(fā)生在病毒-感染細胞中明顯自相矛盾的相互作用。
將結(jié)合到丙烯酸珠(1mg)上的RNaseA或結(jié)合到羧基甲基纖維素(1mg)(Sigma化學公司)上的蛋白酶浸入到30℃的NP40溶胞緩沖劑(16)(10μL)中2小時，然后以15微升的最終容積將其與PBMC提取物(100μg/每次測定)混合，并在30℃下再保溫2小時。在這第二次保溫期間輕輕地用手指渦動試管幾次。在不加任何酶的情況下保溫對照試樣。通過離心分離作用(10000×g，5分鐘，室溫)將固定化酶形成沉淀小片。將5微升的上清液加到L929細胞提取物(每個檢測試樣150微克蛋白)中，并用rRNA分裂測定法測定RNaseL的特異活性。
從PBMC提取物分離出來的內(nèi)源性2-5A的特性進一步由rRNA分裂測定法來說明。用從PBMC分離出來的2-5A的RNase人產(chǎn)生的分裂圖案與從L929細胞提取物中由真正的2-5A得到的圖案有明顯的差別(圖1，將第3、5、7和9徑跡與第10徑跡比較)。例如，由PBMC分離出來的內(nèi)源性2-5A激活了來自L929細胞的RNaseL，從而分裂了28S和18SrRNA，形成三個特異的分裂產(chǎn)物(見圖1第10徑跡)。對觀察到的分裂圖案中這些差異的解釋可能是在PBMC內(nèi)被合成的內(nèi)源性2-5A與真正的2-5A有差別。
放射性結(jié)合測定法已被用來估算游離的(不是2-5A激活的)RNase L、一種目前已知是2-5A靶酶的水平。也可以使用與我的發(fā)現(xiàn)同樣相關(guān)的其它靶酶?；糒AS、ARC和AIDS人體PBMC提取物的游離RNase L水平比正常人低5-7倍(表1第4列)，但是放射性結(jié)合測定法在內(nèi)源性2-5A和P3A4〔32P〕PCP競爭與RNase L結(jié)合的檢測中只有有限的用途，其結(jié)果是放射性結(jié)合測定法得到的結(jié)果不能準確地反映出RNase L的水平。因此，確定2-5，A激活的RNase L的水平是必不可少的。為了達到這一目的，我使用了一個下面將要描述的新的敏感技術(shù)，該技術(shù)允許從小到1毫升外周血液中分離出來的PBMC提取物中測量激活的RNase L，這一技術(shù)是以2-5A激活的RNase L對γRNA的分裂特異性為基礎(chǔ)的。
由于在PBMC中的γRNA是低于探測水平的，所以HL929細胞(L929細胞系的一種RNaseL缺陷的亞克隆)提取物被代替作為γRNA。HL929細胞根據(jù)布達佩斯條約被存放在美國馬里蘭州Rockville的“美國典型培養(yǎng)物收集中心”(AmericatypeCultureCollection)，入藏號 。為利用這種測定法，我們能夠證實，在患LAS、ARC和AIPS人的PBMC提取物中，如果存在功能性2-5A高的細胞內(nèi)積累，那么該提取物中的RNaseL是沒有活性的(圖2，第2-第6徑跡)。從所有被試驗的健康人得到的PBMC提取物顯示出即使2-5A以小于5nM(表1，第2列)存在時，也存在能產(chǎn)生特異的分裂產(chǎn)物(圖2，第7徑跡)的活性RNaseL。
從我觀察到的在受LAS、ARC和AIDS感染病人的PBMC提取物中存在生物活性的2-5A這件事提出了為什么這種RNaseL是失活的這樣一個問題。為了確定RNaseL沒有活性(由圖2的第2-6徑跡證實)是由于無功能的RNaseL引起的還是由RNaseL活性的抑制劑引起的，進行了下述混合實驗。將包含功能性RNaseL的L929細胞提取物與患LAS、ARC和AIDS病人提取的PBMC提取物相混合、并一起被培養(yǎng)，探測不到任何RNaseL特異分裂產(chǎn)物形成(圖1，第3、5和7徑跡)。
重要的是要指示，與RNaseL的激活有直接關(guān)系的內(nèi)源性2-5A(圖1，第3，5和7徑跡)相對于得到這些樣品的細胞提取物至少代表4倍的稀釋(圖1的第2、4和6徑跡)。這些資料表明，在患LAS、ARC和AIDS人的PBMC內(nèi)存在一種或多種TCA-不能溶解的RNaseL的抑制劑。這樣一種抑制劑在健康人體內(nèi)未被找到，因為他們的PBMC提取物在和L929細胞提取物共同培養(yǎng)后產(chǎn)生出RNaseL特異分裂產(chǎn)物(圖1的第8徑跡)。類似地，健康人體的PBMC的TCA可溶性組分也產(chǎn)生特異分裂產(chǎn)物(圖1的第9徑跡)。從功能性2-5A的存在以及這種假定的RNaseL抑制劑是TCA和乙醇可沉淀的這一事實表明RNaseL抑制劑不是一種最近在培養(yǎng)基中的HSV-1和還原病毒感染細胞中已經(jīng)被識別出來的2-5A類似物。
我的利用固定在固體載體上的退化酶的實驗對于從患LAS、ARC和AIDS人的PBMC提取物中發(fā)現(xiàn)的RNaseL(一種或多種)抑制劑的性質(zhì)提供了重要的新的理解和認識。當將從患AIDS人中得到的PBMC提取物與固相蛋白酶或RNaseA一起培養(yǎng)、并隨后再和L929細胞提取物共同培養(yǎng)，RNaseL的活性就得到了恢復，其證據(jù)就是出現(xiàn)了特異分裂產(chǎn)物(圖3中，將第1和第2徑跡與第3徑跡作比較)。
我現(xiàn)在的研究方法證實，在患LAS、ARC和AIDS人的PBMC中的2-5A合成酶/RNaseL抗病毒系統(tǒng)的缺陷可以歸咎于一種RNaseL抑制劑，而不是由于缺少功能性2-5A。RNaseL抑制劑存在于患LAS、ARC和AIDS人中分離出來的PBMC提取物中，這就表明這種抑制劑可能存在于典型的還原病毒疾病發(fā)展的所有階段，而且這種抑制劑還和其它亞急性/慢性的病毒/病源體感染有關(guān)。如果考慮到我以前的報導，即這里試驗的所有來自LAS、ARC和AIDS病人的PBMC都有HIVRNA(由分子雜化作用測定)和HIV感染中心(通過淋巴細胞聯(lián)合培養(yǎng)測定)，則RNaseL抑制劑很可能是病毒誘發(fā)的。
這里報導的研究結(jié)果表明，病毒的復制修改了2-5A合成酶/RNaseL系統(tǒng)，因而不能充分表達和/或保持天然的抗病毒狀態(tài)。很可能是由HIV和/或其它共存還原病毒編碼的蛋白質(zhì)(一種或多種)或RNA(一種或多種)能夠抑制RNaseL的活性。
實施例在Ficoll-Hypaque(聚蔗糖和3，5-二乙酰胺基-2，4，6-三碘苯甲酸鈉的商品名)上分離出外周血液單核細胞(PBMC);在單層培養(yǎng)基中維持L929和HL929(L929的一種RNaseL缺陷的亞克隆);在甘油緩沖液中制備L929和HL929的細胞質(zhì)提取物，并在NP40溶胞緩沖液中制備PBMC提取物，所有這些都按公知步驟進行。這些提取物的蛋白質(zhì)濃度范圍是1-15微克/微升。
利用Poly(rI)-poly(rc)-瓊脂糖來確定2-5A合成酶在被分離的PBMC提取物(每個檢測試樣50微克蛋白)中的活性。在經(jīng)氟利昂/三辛胺中和化后，2-5A從PBMC提取物的TCA可溶組分中被分離出來。然后將TCA提取的2-5A凍干，并重新溶解在水中，使得所有的樣品在一個相當于5微克蛋白/微升的水容積中被標準化。用L929細胞提取物作RNase L源，在放射性結(jié)合測定法中測定PBMC提取物中存在的2-5A的濃度。在加到每個檢測的P3A4〔32P〕PCP(比活度3000居里/毫摩爾，Amersham)的18900次衰變/分中，在沒有附加2-5A情形下，有9400次衰變/分被結(jié)合到RNase L上。在加有5微升的被分離的2-5A樣品的檢測中，大約有9-14%的P3A4〔32P〕pCp被取代。通過與用真正的2-5A的一組校正曲線作比較就確定了PBMC中2-5A的濃度，并且2-5A的濃度還要以25微克/微升的細胞質(zhì)蛋白濃度的計算為基礎(chǔ)。從PBMC分離出來的2-5A的濃度還在用L929細胞提取物作RNase L源的核-纖維素酶測定法中被測定。在這一測定法中，由2-5A產(chǎn)生的RNase L的活性是以poly(U)〔32P〕pCp到酸可溶性碎片的轉(zhuǎn)換為基礎(chǔ)的。在有2.5微升被分離的2-5A樣品存在的情況下，大約有5-20%總的poly(U)〔32P〕pCp(15，000次衰變/分)被分裂。濃度也是如上一樣，通過用真正的2-5A的一組校正曲線來確定。在將20000次衰變/分的P3A4〔32P〕pCp加到PBMC提取物(每次檢測50微克蛋白)中后，在放射性結(jié)合測定法中測量了游離的RNase L的水平測得的結(jié)果如下
在體外測定法中測量了由患LAS、ARC和AIDS人體獲得的PBMC提取物中的干擾素誘發(fā)酶(2-5A合成酶)的活性，并如上表1所示，與健康人提取物中的活性進行比較。在患AIDS人體(3號與5號)中的2-5A合成酶水平比從正常人觀察到的水平高16和20倍(見表1第1列)。對比之下，在患LAS、ARC和伴有Kaposi氏肉瘤(KS)的愛滋病病人(4號)中，2-5A合成酶水平僅提高1.3至5倍，這一結(jié)果支持了由其它人進行的基本觀測結(jié)果。
為了確定2-5A合成酶的這種體外測量是否是體內(nèi)功能性酶的一個指示，將2-5A從PBMC中提取出來。從PBMC提取物的TCA可溶組分獲得的2-5A的生物活性通過放射性結(jié)合測定法和核-纖維素酶測定法被廣泛地說明。由這兩種測定方法確定的2-5A的濃度相類似(表1第2和3列)。由方法A和方法B獲得的結(jié)果之間的一致性(表1第2和3列)顯示出，從人體PBMC提取物分離出來的2-5A能夠像真正的2-5A那樣以同樣的程度結(jié)合到由L929細胞得到的RNaseL上，并激活它。
現(xiàn)在能夠首次如下地解釋LAS、ARC和AIDS中的2-5A合成酶和內(nèi)源性2-5A之間明顯沒有定量相關(guān)性的原因(表1，將第1列與第2和3列比較)。在體外測定法中確定2-5A合成酶是以經(jīng)過poly(rI)-poly(rC)-瓊脂糖部分純化為基礎(chǔ)的;因此，這種測定法僅僅測量了在體內(nèi)被dsRNA激活的游離2-5A合成酶。但是內(nèi)源性2-5A合成酶的直接測量要加上2-5A降解酶(即2′-磷酸二酯酶和磷酸酯酶)。因此，在患LAS、ARC和AIDS人體PBMC內(nèi)2-5A的積累表示了這種2-5A降解酶的一個低的活性。在PBMC中存在2-5A也表示存在一個至今尚未在正常人和愛滋病病人內(nèi)探測到的內(nèi)源性dsRNA。
失配的雙股核糖核酸(RNA)是大分子RNA的一種已知形式(見美國專利4024222和美國專利4130641)，其中雙螺旋的不穩(wěn)定阻止了堿基的配對。失配的dsRNA因它的干擾素誘導特征而眾所周知，這種誘導特性表明了一個與干擾素誘導本身無關(guān)的機理(如歐洲專利申請83305426.5，申請日1983年8月15日，名稱為“AntiproferativeActiondsRNAonTumorCells”)。
失配雙股RNA的一個典型的治療實例是由多核糖肌苷酸和多核糖胞苷酸/尿苷酸復合物形成的合成dsRNA，如rInr(Cx，U或G)n，其中x的值從4到29，例如這里被稱為AMPLIGEN 的rInr(C12U)n，美國馬里蘭州Rockville的HEM研究公司登記的一個美國注冊商標。已經(jīng)研究了許多失配dsRNA聚合物，它們的性質(zhì)都類似于Ampligen。失配dsRNA比其它形式的天然的和/或合成的dsRNA的主要治療優(yōu)點是它們在動物和人體內(nèi)的毒性低。例如，Lampson等人的美國專利3666646描述了一些能夠觸發(fā)各種干擾素相關(guān)效應的早期dsRNA復合物，但是這些化合物的毒性排除了它們在癌癥或有關(guān)疾病治療中的任何臨床應用。
現(xiàn)已知道，失配dsRNA，如Ampligen，對人的某些癌癥、尤其是腎癌有治療作用。雖然當前認為dsRNA僅僅是一種“干擾素誘發(fā)物”，但是dsRNA對完全耐受干擾素本身的人的某些癌癥是有效的，這在本申請人的歐洲專利申請83305426.5中已作了全面的描述。
在另一份專利申請中(見歐洲專利申請86306582.7，申請日1986年8月26日，題為“ModulationofVirus-RelatedEventsbyDouble-StrandedRNAs”)，發(fā)明人描述了用Ampligen作為原型dsRNA時dsRNA對人體細胞培養(yǎng)物中愛滋病病毒的抑制作用。
用“匹配dsRNA”來指對應兩個股之間的氫鍵(堿基的堆積)相對來說是完整的那些dsRNA，即在每29個依次接續(xù)的堿基殘基中，中斷平均小于1個堿基對。因此，應當相應地理解術(shù)語“失配dsRNA”。
這種dsRNA可以是包含一定比例、如5個中1個至30個中1個的尿嘧啶基或胍基的多肌苷酸和多胞苷酸的復合物、polyI·poly(C4-29X＞U或G)。
這種dsRNA可以具有rIn·(C12U)n·的通式，下面將討論dsRNA的其它合適的例子。
在本發(fā)明中使用的失配dsRNA最好是以從poly(Cn，U)和poly(Cn，G)中選出的共聚核苷酸為基礎(chǔ)，其中n是數(shù)值從4到29的一個整數(shù)，并且它是通過修改rIn·rCn以便沿多核糖胞苷酸(rCn)股的方向加入不配對的堿基(尿嘧啶基或胍基)形成的多核糖肌苷酸和多核糖胞苷酸復合物的失配類似物。另一方面，可以通過修改多核糖肌苷酸(rIn)的核糖基主鏈，例如通過加入2′-0甲基核糖基殘基，從poly(I)·poly(C)dsRNA得到這種失配dsRNA。這些rIn·rCn失配類似物最好是具有通式rIn·r(C12，U)n的那些，它們在Carter和Ts′o的美國專利4130641和4024222中被描述，它們的公開內(nèi)容通過引用被結(jié)合到本申請中。那里所描述的dsRNA總的來說是適合用于本發(fā)明的。
在本發(fā)明中使用的失配dsRNA的具體例子包括poly(I)·poly(C4，U)poly(I)·poly(C7，U)poly(I)·poly(C13，U)poly(I)·poly(C22，U)poly(I)·poly(C20G)poly(I)·poly(C29G)以及poly(I)·poly(Cp)23G＞p預期由本發(fā)明得出的藥物組合物包括那些適合于在適當藥物載體中的腸胃道外施用的組合物。例如，非腸道的溶液、懸浮體、分散體都可以根據(jù)需要用滅菌的或無熱源的、有或沒有生理上可接受的鹽的水作為溶劑/稀釋劑、按照已有的制藥技術(shù)被制取。
施用失配dsRNA的量最好足以使在運離輸注部位的地方，在注入后不久的全身血液循環(huán)中得到的最大血濃度從0.01微克/毫升、通過體液直到1000微克/毫升。
另外，可將一個有效的濃度在注入受血者之前加到血液產(chǎn)品中。在這種情況下，操作者可以簡單地參照一張將受血者的重量與他或她的體液容積相互聯(lián)系起來的體液容積標準表，它上面的容積是病人的體液容積和為用必要量的dsRNA平衡面利用的體液容積的總和。一個60至70公斤病人的體液容積約為5至6公斤。
權(quán)利要求
1.一種用于確定人體免疫缺陷病毒和引起大致類似臨床癥狀其它病毒存在的方法，包括在一種動物的細胞提取物中確定一種RNaseL抑制劑的存在，該抑制劑是指示HIV存在或與HIV有關(guān)的基因信息存在的一種標記。
2.一種如權(quán)利要求1所述的用于確定隱伏在人體生物液體或細胞中的人體免疫缺陷病毒存在的方法，包括探測人體生物液體或細胞中核糖核酸酶(RNase)L抑制劑的存在。
3.一種如權(quán)利要求2所述的方法，其中的生物液體是血液或血液成分。
4.一種用于確定HIV侵入動物體內(nèi)可能性的診斷試驗，包括檢查該動物組織的一種提取物并確定存在或不存在至少一種如權(quán)利要求1所述的RNase L抑制劑，存在這種抑制劑肯定地表明存在HIV病毒的侵入。
5.一種監(jiān)測從HIV或引起類似生物化學的和/或臨床癥狀的病毒中得以逐漸恢復的方法，該方法包括如下步驟(1)決定在病人細胞的一種提取物中存在或不存在至少一種RNase L抑制劑，如果探測到一種RNase L抑制劑，(2)施用一定量的dsRNA，其量要足以減少HIV誘發(fā)條件或其它引起類似生化和/或臨床狀況的這樣一些病毒的RNase L抑制劑的量，以及(3)繼續(xù)施用dsRNA直到病人的臨床癥狀穩(wěn)定或改善。
6.一種如權(quán)利要求1或5所述的方法，其中的dsRNA是一種失配的dsRNA。
7.一種如權(quán)利要求6所述的方法，其中的dsRNA是一種包含從1/5到1/30的尿嘧啶基或胍基的多核糖肌苷酸和多核糖胞苷酸的復合物。
8.一種如權(quán)利要求7所述的方法，其中的dsRNA具有通式rIn·(C12，U)n。
9.一種賦予對HIV免疫性的方法，包括給動物施用RNase L的一種HIV特異抑制劑，或施用在2′-5′A/RNase L途徑中的生化中間物的一種病毒相關(guān)抑制劑作為一種抗原。
10.一種治療HIV的方法，包括對HIV感染的動物施用一種有效劑量的物質(zhì)，該物質(zhì)能去除RNase L的HIV特異抑制劑或在2′-5′A/RNase L途徑中的生化中間產(chǎn)物的病毒相關(guān)抑制劑，并繼續(xù)施用直到該抑制劑有很大改變?yōu)橹埂?br> 全文摘要
描述了天然2′-5′A抗病毒防卸途徑的HIV相關(guān)抑制劑、診斷步驟和材料、以及治療病毒疾病的方法。在患LAS、ARC和AIDS病人體內(nèi)的HIV誘發(fā)抑制劑被分離出來和識別。功能性2-5A在這些病人的外周血液單核細胞(PBMC)中不能激活RNase L；內(nèi)源性dsRNA、尤其是失配的dsRNA激活2-5A合成酶，從而通過內(nèi)源性2-5A使2-5A合成酶的濃度增加。
文檔編號A61K39/29GK1043569SQ8810169
公開日1990年7月4日 申請日期1988年3月3日 優(yōu)先權(quán)日1987年12月23日
發(fā)明者威廉·安·卡特 申請人:Hem研究公司