專利名稱：穩(wěn)定化的成纖維細(xì)胞生長因子組合物及其生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定化的成纖維細(xì)胞生長因子(下文簡稱為FGF)或其突變蛋白的組合物及其生產(chǎn)方法。
FGF最初是作為對纖維母細(xì)胞如BALB/c3T3細(xì)胞表現(xiàn)有生長促進(jìn)作用的因子被分離的(Gospodarowicz，Nature249123，1974)。目前已經(jīng)知道FGF幾乎對所有中胚分化的細(xì)胞均有生長促進(jìn)作用。根據(jù)等電點可將FGF粗略地分為兩類堿性FGF(下文簡稱bFGF)和酸性FGF(下文簡稱aFGF)。因為對內(nèi)皮細(xì)胞有強(qiáng)生長促進(jìn)作用和血纖維蛋白溶酶原激活性誘導(dǎo)作用，這兩種類型的FGF都可能用作血管形成促進(jìn)劑、創(chuàng)傷治療藥物、及血栓形成和動脈硬化的預(yù)防和治療藥物。
雖然已用常規(guī)方法由動物器官如牛垂體中純化了FGF，甚至純化到單一物質(zhì)水平，但這種常規(guī)方法存在某些缺點，如生產(chǎn)量有限以及因其是由異種動物衍生的而可能出現(xiàn)不期望的抗原性。目前已發(fā)展了一種大量生產(chǎn)FGF的方法，其中包括利用DNA重組技術(shù)在微生物或動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)克隆的人FGF基因(參見FEBSLetters，213189-194，1987和歐洲專利公開237，966號)。
在水溶液中FGF將迅速喪失其活性，而且減壓凍干亦容易降低其生物學(xué)活性。再者，當(dāng)長期使用(如通靜脈點滴)FGF時，將不可避免地在給藥期間降低其效力，從而造成嚴(yán)重問題。
據(jù)報導(dǎo)，可通過給予某種氨基葡萄糖多聚物(glycosaminoglycan)如肝素來防止FGF失活(JournalofGellularphysiology，128475，1986)，但因為肝素有很強(qiáng)的抗凝血活性，故很難用于注射等方法。
為了改善FGF在溶液中及凍干條件下的穩(wěn)定性，已研究了可配制成注射劑的各種物質(zhì)，但迄今尚無找到滿意的穩(wěn)定化方法，仍有待建立這樣一種方法。
基于這些情況，本發(fā)明人進(jìn)行了一系列研究并發(fā)現(xiàn)使FGF或其突變蛋白與硫酸葡萄糖多聚物如存在于水溶液中的硫酸葡萄糖接觸，可顯著地提高FGF或其突變蛋白的穩(wěn)定性。
本發(fā)明提供了(1)一種穩(wěn)定化的組合物，其包含(a)FGF或其突變蛋白及(b)硫酸葡萄糖多聚物(2)一種生產(chǎn)穩(wěn)定化的組合物的方法，其包括使FGF或其突變蛋白與水溶液中的硫酸葡萄糖多聚物接觸;以及(3)一種穩(wěn)定FGF或其突變蛋白的方法，其包括使FGF或其突變蛋白與水溶液中的硫酸葡萄糖多聚物接觸。
用于本發(fā)明的FGF可以是堿性FGF(下文簡稱bFGF)或酸性FGF(下文簡稱aFGF)。
作為本發(fā)明之FGF的例子，可提到的有哺乳動物衍生的FGF哺乳動物包括人、猴、豬、牛、羊和馬。
所說的FGF包括由已發(fā)現(xiàn)含有FGF之各種器官如腦或垂體中提取的FGF以及由DNA重組技術(shù)產(chǎn)生的FGF。
作為所說的FGF的例子，可提到的有DNA重組技術(shù)產(chǎn)生的FGF(PCT國際專利公開WO/87/01728號;FEBSLetter，213189-194，1987;歐洲專利公開237，966號)。
在本說明書中，有時將重組人堿性FGF簡稱為rhbFGF。
本發(fā)明中FGF突變蛋白基本上指改變了原始肽鏈或蛋白質(zhì)順序所產(chǎn)生的氨基酸順序;所說的改變包括插入氨基酸、某些組成氨基酸被刪去或被其他氨基酸取代。
插入氨基酸包括至少插入一個氨基酸。
刪去組成氨基酸包括至少刪去一個bFGF構(gòu)成氨基酸。
構(gòu)成氨基酸被其他氨基酸取代包括至少有一個組成氨基酸被其他氨基酸取代。
有至少一個加到bFGF上之氨基酸的突變蛋白中，所說的至少一個氨基酸不包括起始密碼的蛋氨酸，它是用于表達(dá)肽鏈和信號肽的的。
插入的氨基酸的數(shù)目至少是1個，但只要不喪失bFGF特性，其可以是任何數(shù)目。優(yōu)選的氨基酸應(yīng)包括一些蛋白質(zhì)的某些或全部氨基酸順序。具有該順序的蛋白質(zhì)是與bFGF同源的并表現(xiàn)有與bFGF相似的活性。
刪去至少一個bFGF構(gòu)成氨基酸的突變蛋白中缺失的bFGF組成氨基酸的數(shù)目，只要不喪失bFGF的特征，其可以是任何數(shù)目。
這種刪去組成氨基酸的例子，可以是氨基末端或羧基末端的缺失;即缺失人bFGF氨基末端中的10個殘基;
Met-Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly-Ser
人bFGF氨基末端中的14個殘基Met-Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Phe-Pro人bFGF氨基末端中的41個殘基123441Met-Pro-Ala-Leu-…-Val人bFGF羧基末端中的61個殘基8788146147Lys-Cys-……-Lys-Ser此外，作為組成氨基酸被刪除的該突變蛋白的例子，有一種bFGF突變蛋白的缺少羧基末端7-46氨基酸殘基。
刪去氨基酸順序時，最好是分別在rhbFGF第102、106、115、119、124、130和138位氨基酸處開始的氨基酸順序。
這些氨基酸順序可以被另一氨基酸取代。
在取代前已有至少1個被其他氨基酸取代之bFGF組成氨基酸的突變蛋白中，只要不喪失bFGF的任何特性，取代bFGF-構(gòu)成氨基酸的數(shù)目可以是任何數(shù)目。
作為取代前的組成氨基酸，其可以是半胱氨酸和除半胱氨酸以外的氨基酸。其中優(yōu)選的是半胱氨酸。上述除半胱氨酸以外的組成氨基酸可以是天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、絲氨酸、纈氨酸等。
當(dāng)取代前的組成氨基酸是半胱氨酸時，取代的氨基酸最好是中性氨基酸。這些中性氨基酸包括甘氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和蛋氨酸;其中優(yōu)選的是絲氨酸和蘇氨酸。
當(dāng)取代前組成氨基酸是半胱氨酸以外的任何一氨基酸時，其他取代的氨基酸應(yīng)選擇在疏水性、親水性或電荷等性質(zhì)上與取代前的氨基酸不同的氨基酸。
當(dāng)取代前的組成氨基酸是天冬氨酸時，取代的氨基酸包括天冬酰胺、蘇氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和精氨酸;優(yōu)選的是天冬酰胺和精氨酸。
當(dāng)取代前的氨基酸的精氨酸時，取代的氨基酸包括谷氨酰胺、蘇氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸;其中優(yōu)選的是谷氨酰胺。
當(dāng)取代前的組成氨基酸是甘氨酸時，取代的氨基酸包括蘇氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、谷氨酸和精氨酸;其中優(yōu)選的是蘇氨酸。
當(dāng)取代前的組成氨基酸是絲氨酸時，取代的氨基酸包括蛋氨酸、丙氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和天冬氨酸;其中優(yōu)選的是蛋氨酸。
當(dāng)取代前的組成氨基酸是纈氨酸時，取代的氨基酸包括絲氨酸、亮氨酸、脯氨酸、甘氨酸、賴氨酸和天冬氨酸;其中優(yōu)選的是絲氨酸。
作為取代前的組成氨基酸，優(yōu)選的是天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、絲氨酸和纈氨酸。
作為取代的氨基酸，優(yōu)選的是天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、絲氨酸和纈氨酸。
作為有關(guān)突變蛋白中取代的優(yōu)選方案，最好用絲氨酸取代半胱氨酸(即半胱氨酸被絲氨酸取代)。
在所說的取代中，可發(fā)生不少于兩處的取代，最好是兩或三處取代。
本發(fā)明的突變蛋白可聯(lián)合有2或3處上述的插入、刪除和取代。
作為突變蛋白，優(yōu)選的是其中至少有一個人堿性FGF的組成氨基酸已被其他氨基酸取代的突變蛋白。
除常規(guī)DNA重組技術(shù)外，還可使用定點突變法產(chǎn)生本發(fā)明的突變蛋白。所說的技術(shù)是已知的，并已在GeneticEngineering(Lather，R.F和Lecoq，J.P.，AcademicPresspp31-50，1983)中作過描述，在GeneticFngineeringPrinciplesandMethods(Smith，M.andGillan，S.，PlenumPress，Vol.3，pp1-32，1981)中描述了寡核甘酸定點突變技術(shù)。
可按下述步驟產(chǎn)生編碼本發(fā)明突變蛋白的結(jié)構(gòu)基因，例如(a)使誘變寡核甘酸引物與FGF結(jié)構(gòu)基因的一條單鏈DNA雜交(所說的引物互補(bǔ)于鏈內(nèi)包含將被取代之半胱氨酸密碼子的區(qū)域或互補(bǔ)于包含與該密碼配對之反密碼的區(qū)域，但其中會發(fā)生一個錯誤配對，即該密碼與另一氨基酸的密碼錯配，或者使該密碼與另一反密碼錯配。
(b)使用DNA聚合酶延長引物以形成一突變的異源雙鏈，以及(c)復(fù)制該突變的異源雙鏈。
然后分離攜帶突變基因的噬菌體DNA，并將其插入質(zhì)粒中。
使用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)化株。
將所說的轉(zhuǎn)化株在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，以使之產(chǎn)生突變蛋白。
用于本發(fā)明之FGF突變蛋白的例子包括BiophsicalResearchCommunications，151701-708(1988)，歐洲專利公開281，822號、歐洲專利公開288，687號(歐洲專利申請88103047.2號，相當(dāng)于日本專利申請50249號/1988)、歐洲專利申請89101162.9號(1988年1月24日提交)等所述的突變蛋白。
可用于本發(fā)明的硫酸多聚葡萄糖包括硫酸葡聚糖(dextransulfate)，硫酸環(huán)糊精、硫酸β-1，3多聚葡萄糖。所說的葡萄糖是-D-葡萄糖聚合物的一種硫酸酯衍生物。所說的硫酸葡聚糖硫的含量最好不小于3%(W/W)，特別優(yōu)選的含量是大約12至20%(W/W)，更進(jìn)一步的優(yōu)選范圍是16-20%(W/W)。尤其優(yōu)選的是葡聚糖。
用于本發(fā)明的硫酸葡萄糖包括葡聚糖的硫酸酯，葡聚糖是借助微生物如腸膜狀明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)的作用由蔗糖產(chǎn)生的。硫酸葡聚糖是葡聚糖的硫酸酯，其基本結(jié)構(gòu)是α-(1-6)鍵，且硫含量一般不少于12%左右。最好為大約16-20%。平均分子量范圍約1，000至4，000，000最佳范圍為大約3，000至1000，000，而且硫酸葡聚糖是很易溶于水的。硫酸葡聚糖是一種已知化合物，其可用已知方法產(chǎn)生。
本發(fā)明所用硫酸環(huán)糊精中環(huán)糊精的例子包括借助微生物如浸麻芽孢桿菌(Bacillusmacerans)的作用由淀粉產(chǎn)生的環(huán)糊精。環(huán)糊精(由多個α(1-4)鍵連接的D-葡萄糖分子構(gòu)成的一種環(huán)結(jié)構(gòu))，可按成環(huán)D-葡萄糖分子的數(shù)目分為多種類型α型(6個分子)、β型(7個分子)、γ型(8個分子)，及其他類型。上述的任何一種類型都可用于本發(fā)明。
硫酸環(huán)糊精是由這些環(huán)糊精的硫酸酯化作用產(chǎn)生的酯，該硫酸酯化作用是按照已知的方法進(jìn)行的。硫酸酯化方法的例子包括美國專利2，923，704號和日本專利申請公開36422號/1975中描述的方法。
硫酸環(huán)糊精的硫含量一般在3%(W/W)以上，最好是大約12-24%(W/W)。硫酸環(huán)糊精具有很易溶于水的特性。
按硫含量計算，用于本發(fā)明之硫酸環(huán)糊精硫酸化的程度可處于超過12%(W/W)的任何水平;其中最好是含有大約16-21%(W/W)硫的硫酸環(huán)糊精。再者，可使用具有不同硫酸酯化程度之硫酸環(huán)糊精的混合物，也可使用純化到單一硫酸酯化程度的單一硫酸環(huán)糊精?？赏ㄟ^將含有硫酸環(huán)糊精之堿金屬鹽的反應(yīng)混合物濃縮至于，將所得濃縮物溶解在水中并將該水溶液與親水溶劑混合完成純化過程以分離所需的產(chǎn)物。
用于本發(fā)明之硫酸β-1，3-葡聚糖中β-1，3-葡聚糖的例子有由產(chǎn)堿桿菌屬或土壤桿菌屬微生物產(chǎn)生的直鏈β-1，3-葡聚糖，β-1，3-葡聚糖也可以是呈低分子量聚合物形式的，如有經(jīng)水解長直鏈β-1，3-葡聚糖而得到的直鏈β-1，3-葡聚糖結(jié)構(gòu)。
已知凝膠多糖Curdlan(也稱為可熱凝膠化多糖PS〔〔thermogelablepolysaccharidepS〕，購自WakoPureChenicalIndustries有限公司〕是一種非水溶性的可熱凝膠化的、不分支的葡萄糖聚合物，其僅具有直鏈β-1，3-葡聚糖鍵，并由屬于產(chǎn)堿桿菌屬或土壤桿菌屬的微生物菌株產(chǎn)生(日本專利公開7000號/1968，32673號/1973和32674號/1973)。凝膠多糖生產(chǎn)菌糞產(chǎn)堿桿菌變種myxogenesNTK-u菌株、放射土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)菌株和放射土壤桿菌U-19菌株分別列于1982年第15版美國典型培養(yǎng)物菌株分類目錄(AmericanTypeCultureCollectionCatalogueofStrains)中ATCC-21680、ATCC-6466和ATCC-21679號下。
日本專利申請公開83798號/1980中已詳細(xì)描述了凝膠多糖部分水解物(低分子量衍生物)的性質(zhì)及其生產(chǎn)方法。
所說的直鏈β-1，3-葡聚糖是由下列結(jié)構(gòu)通式代表的化合物
(Ⅰ)其中n代表由40至大約1000的整數(shù)。
上述β-1，3葡聚糖可具有低于1000的任何平均聚合度(DP)。特別推薦DP范圍為6至大約300的部分水解物，且最好是DP為15至大約200的部分水解物。
應(yīng)提到的是，式(Ⅰ)中的n和DP之間有DP-2＝n的關(guān)系。
本發(fā)明所用直鏈β-1，3-葡聚糖的硫酸酯是這些β-1，3葡聚糖或其較低分子量聚合物的未端單糖或中間單糖中3個羥基發(fā)生磺化反應(yīng)而形成的酯;一般使用平均取代度(DS)為每單糖單位0.5至3的酯，最好使用DS為1至2的酯。
可使硫酸化劑如氯磺酸或硫酐與一種有機(jī)堿的復(fù)合物，如吡啶、二甲基甲酰胺、三甲胺或二甲胺作用于β-1，3-葡聚糖，完成β-1，3-葡聚糖或其低分子量聚合物的硫酸酯化作用(JournalofBiologicalChernistry，2392986，1964)。
用于本發(fā)明的硫酸β-1，3-葡聚糖很易溶于水，且具有很低的毒性。
β-1，3-葡聚糖硫酸酯的硫含量一般在5%(W/W)以上最好為約10-24%(W/W)，且很易溶于水。
用于本發(fā)明的硫酸葡萄糖聚合物對溫血動物的毒性很低，因此用于本發(fā)明的FGF或其突變蛋白組合物對溫血動物具有可安全地口服或胃腸道外途徑給藥的優(yōu)點。
用于本發(fā)明的硫酸葡萄糖聚合物可以是游離狀態(tài)或某種鹽形式的。作為鹽，可以是鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、三甲基銨鹽等。
當(dāng)使硫酸葡萄糖聚合物與水溶液中的FGF或其突變蛋白接觸時可首先加入游離狀態(tài)的硫酸葡萄糖聚合物，然后加入足夠量的堿或酸調(diào)整pH。加入一種堿后，硫酸葡糖聚可在水溶液中形成鹽，或以游離硫酸葡聚糖與呈鹽形式之硫酸葡聚糖混合物共存。
當(dāng)使本發(fā)明的FGF或其突變蛋白與水溶液中的硫酸葡萄糖聚合物接觸時，最好在二元或三元羧酸存在下進(jìn)行，以得到更為穩(wěn)定的FGF或其突變蛋白。
二元羧酸的例子包括酒石酸、馬來酸、蘋果酸、富馬酸等。
三元羧酸的例子包括檸檬酸、異檸檬酸等。
上述羥酸可以是游離的或呈鹽形式的。也可以將游離羧酸加到水溶液中，再向其中加入足夠量的堿或酸以調(diào)整pH。加入堿后，硫酸葡聚糖可在水溶液中形成鹽，或以游離硫酸葡聚糖與呈鹽形式之硫酸葡聚糖混合物共存。
當(dāng)使FGF或其突變蛋白與水溶液中的硫酸葡聚糖接觸時，硫酸葡聚糖的量相對于1摩爾FGF或其突變蛋白為大約0.1至100摩爾，最好為大約0.5至4摩爾。
水溶液中葡聚糖的優(yōu)選濃度為大約0.0005至5%(W/V)，最好為大約0.01至1%(W/V)。
水溶液中FGF的優(yōu)選濃度范圍為大約0.0005至5%(W/V)，最好為大約0.01至1%(W/V)。
羧酸的量，如作為其在水溶液中的濃度較好范圍為1mM至1M，最好是10mM至500mM。
為了使FGF或其突變蛋白在水溶液中與硫酸葡萄糖多聚物接觸并進(jìn)一步與羧酸接觸，只要使這些材料在水溶液中混合即可達(dá)到目的。
對于水溶液，可使用任何適于注射的水溶液;特別是可使用蒸餾水、生理鹽水及葡萄糖溶液。本發(fā)明中也可使用磷酸鹽緩沖液、Tris-羥甲基-氨基甲烷-HCl緩沖液等緩沖液作為水溶液。
當(dāng)FGF或其突變蛋白、硫酸葡萄糖多聚物和羧酸混合時，它們可分別為水溶液狀態(tài)，或?qū)⑦@些固態(tài)材料混合后溶于水?？稍?至40℃的溫度范圍內(nèi)，3至10最好5至9的pH范圍內(nèi)混合這些材料?；靹蛩璧臅r間一般為大約1至30分鐘。
借助上述方法，即可制得FGF或其突變蛋白的穩(wěn)定化的組合物。
可以證實，在所說的穩(wěn)定化的FGF或其突變蛋白的組合物中，F(xiàn)GF或其突變蛋白與硫酸葡聚糖以一定比例結(jié)合在一起形成了一種復(fù)合物;可以根據(jù)需要分離FGF或其突變蛋白的復(fù)合物。分離和收集的方法包括使用Sephadex或TSK凝膠的凝膠過濾法、使用DEAE-或CM-Toyopearl的離子交換層析法，以及等電點分離法。因此，可按照需要分離并收集FGF或其突變蛋白的復(fù)合物，或者可直接使用未經(jīng)分離的組合物。
如此得到的復(fù)合物是由FGF或其突變蛋白與硫酸葡萄糖多聚物以大約1∶0.5至1∶5的比例形成的復(fù)合物。應(yīng)注意的是，所說的復(fù)合物在高濃度鹽(如1MNaCl)存在下會發(fā)生解離;分離過程中必須避免使用有高離子強(qiáng)度的溶劑。
如此便得到了穩(wěn)定化的FGF或其突變蛋白的組合物。因此，如下述工作實施例中所顯示的，本發(fā)明的組合物對熱、pH和蛋白酶是穩(wěn)定的。
特別是本發(fā)明的組合物在酸性、堿性以及中性條件下都是穩(wěn)定的。
FGF或其突變蛋白的組合物可安全地直接經(jīng)口服或非胃腸道途徑用于溫血動物(如人、小鼠、大鼠、倉鼠、兔、狗、貓)，或者加在與醫(yī)藥上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑構(gòu)成的醫(yī)藥組合物(如注射劑，片劑、膠囊、溶液、軟膏)中給藥。
所說的制劑最好是注射液形式的，如用于注射的溶液、冷凍制劑或凍干制劑。
可按照已知的醫(yī)藥生產(chǎn)方法，使用醫(yī)學(xué)上可接受的添加劑、稀釋劑、佐劑等將所說的組合物配制成醫(yī)藥組合物。
將組合物配制成可注射的水溶液時，可按標(biāo)準(zhǔn)方法使用水作為溶劑(如蒸餾水)、水溶性溶劑(如生理鹽水、林格氏液)或油性溶劑(如芝麻油、橄欖油)等溶劑，或必要時使用助溶劑(如水楊酸鈉、乙酸鈉)、緩沖液(如檸檬酸鈉、甘油)、等滲劑(如葡萄糖、轉(zhuǎn)化糖)、穩(wěn)定劑(如人血清白蛋白、聚乙二醇)、防腐劑(如苯甲醇、苯酚)或止痛劑(如氯化苯甲烴胺、鹽酸普魯卡因)等添加劑制備所需的溶液。
如將所說的組合物配制成用于注射的固體制劑時，如可使用稀釋劑(如蒸餾水、生理鹽水、葡萄糖)、賦形劑(如羧甲基纖維素(CMC)、精氨酸鈉)、防腐劑(如苯甲醇、氯化苯甲烴銨、苯酚)或止痛劑(如葡萄糖、葡糖酸鈣、鹽酸普魯卡因)以常規(guī)方法生產(chǎn)所需的制劑。
另外，將所說的組合物配制成醫(yī)藥制劑時，可加入單糖(如葡萄糖)、氨基酸、各種鹽和人血清白蛋白;也可以加入等滲劑、pH調(diào)節(jié)劑、止痛劑、防腐劑等以制備FGF或其突變蛋白的穩(wěn)定的和有效的制劑。
按上述方法制得的FGF或其突變蛋白的組合物具有成纖維細(xì)胞生長促進(jìn)作用及其他作用，十分穩(wěn)定而且毒性很低;因此，可將其用作燒傷、創(chuàng)傷、手術(shù)后組織的愈合促進(jìn)劑，或基于其血管形成作用，用作血栓形成或動脈硬化的治療藥物。
該組合物也可以用作細(xì)胞生長加速劑。
根據(jù)本發(fā)明的FGF或其突變蛋白的組合物，當(dāng)作為上述醫(yī)藥使用時，可以適當(dāng)劑量對上述溫血動物給藥，根據(jù)給病途徑及癥狀等，按FGF或其突變蛋白的劑量計算，每天給藥量為大約1-100μg/Kg體重。
根據(jù)本發(fā)明的FGF或其突變蛋白的組合物，當(dāng)其用作加速細(xì)胞生長的試劑時，最好將其加到培養(yǎng)基中，以便其含量按FGF或其突變蛋白的量計算達(dá)到每升培養(yǎng)基0.01至10μg，最好是每升培養(yǎng)基0.1至10μg。
因為可以按上述方法使FGF或其突變蛋白與水溶液中的硫酸葡聚糖接觸來穩(wěn)定之并能夠獲得穩(wěn)定化的FGF或其突變蛋白的組合物，所以有可能將FGF或其突變蛋白配制成同時穩(wěn)定維持其作用的醫(yī)藥制劑。
另外，因為與肝素相比硫酸葡萄糖多聚物的抗凝血作用較弱，故使用本發(fā)明的組合物不會有抗凝血作用方面的麻煩。
使FGF或其突變蛋白在水溶液中與硫酸葡聚糖接觸，即可得到FGF或其突變蛋白的穩(wěn)定化的組合物?？蓪GF或其突變蛋白的穩(wěn)定化的組合物配制成保持了FGF或其突變蛋白之作用的醫(yī)藥組合物。


圖1顯示了編碼人bFGF的堿基順序及由之推導(dǎo)出的氨基酸順序。
圖2顯示了rhbFGF突變蛋白CS23之組合物和實施例12中所得低分子量肝素的凝膠過濾圖形。
用于下述工作實施例中的重組人堿性FGF(以下縮寫為rhbFGF)是按歐洲專利公開(以下簡稱EP公開)237，966號中所述的方法產(chǎn)生的。因此，所說的rhbFGF是按照EP公開237，966號的實施例1。3和6或8中所述方法，使用大腸桿菌K12MM294/pTB669(IFO14532，F(xiàn)EPMBP-1281)的轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生并純化的。
用于下述實施例中的重組人堿性FGF突變蛋白CS23(以下也簡稱為rhbFGF突變蛋白CS23)是按照EP公開281，822的實施例7和24、EP公開288，687號(EP申請88103047.2號，相當(dāng)于日本專利申請50249號/1988)的參考實施例10，或BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications，151701-708(1988)中所述的方法產(chǎn)生的。因此，已按照下述參考實施例1至3中所述的方法(所用方法與上述參考文獻(xiàn)中所述方法相同)，使用轉(zhuǎn)化株大腸桿菌MM294/pTB762(IFO14613，F(xiàn)ERMBP-1645)制得了所說的rhbFGF突變蛋白CS23。
上述轉(zhuǎn)化株大腸桿菌K12MM294/pTB669(攜帶用于下述參考實施例1的質(zhì)粒pTB669)和大腸桿菌MM294/pTB762(見下述參考實施例3)已寄存在InstituteforFermentation，Osaka(IFO)，Japan和
FermentationResearchInstitute，AgencyofIndustrialScienceandTechnology，MinistryofInoternationalTradeandIndustry(FRI)，Japan。它們的寄存登記號與寄存日期如表1所示。對于于寄存在FRI的樣品，開始是用FERMP號代表其寄存登記號。后按照布達(dá)佩斯條約改變寄存并已用FERMBP號代表寄存登記號。
表1轉(zhuǎn)化體IFOFR1FERMP-8918大腸桿菌K12IFO14532FERMBP-1281MM294/pTB669(1986年8月11日)(1986年8月21日)FERMp-9409大腸桿菌IFO14613FERMBP-1645MM294/pTB762(1987年5月27日)(1987年6月11日)大腸桿菌K12MM294/pTB669和大腸桿菌K12MM294/pTB762也已分別在1987年2月26日和1988年2月9日寄存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏號分別為CCTCCM87005，CCTCCM88005。
上述或下列參考實例所述的人bFGF氨基酸順序內(nèi)氨基酸編號中，圖1所示人bFGF氨基酸順序N未端的Met定為第一個氨基酸。
參考實施例1含突變蛋白編碼堿基順序之重組DNA的產(chǎn)生(1)人bFGF基因之M13載體的克隆用限制性酶EcoRI和BamHI消化按歐洲專利公開237，966號實施例3制得的質(zhì)粒pTB669。用限制性酶EcoRI和BamHI消化噬菌體載體M13mp8(J.Messing，MethodsinEnzymology，10120-78，1983)復(fù)制形式(RF)DNA，并與消化pTB669得到的人bFGFDNA片段混合。然后借助T4DNA連接酶使混合物連接在一起;將連接的DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM105菌株可感染細(xì)胞內(nèi);使用Xgal作為指示劑，將所得轉(zhuǎn)化株接種在平皿上(J.Messing等，NucleicAcidsResearch，9309-321，1981);挑出含有重組噬菌體的噬斑(白色噬斑);用雙脫氧核甘酸合成鏈終止法〔J.Messing等，NNucleicAcidsResearch9309，1981)測定重組區(qū)的堿基順序，借以證實已成功地插入了人bFGFDNA。
由該M13-Po克隆純化單股噬菌體DNA，然后將其作為模板用于合成寡核甘酸定點誘變。
(2)位點特異性誘變在0.1mM三磷酸腺甘(ATP)、50mM Tris-(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸鹽(Tris-HCl，pH8.0)，10mM MgCl2、5mM二硫蘇糖醇(DTT)和9單位T4激酶存在下，在50μl總反應(yīng)體積中，37℃用T4激酶將40微微摩爾合成寡核甘酸5′＞CGTTCTTGCTGTAGAGCCGCT＜3′(第26位的Cys改變?yōu)镾er的引物，其中Rsa I的識別順序已消失)處理1小時。將該激酶處理的引物(12微微摩爾)在50μl含有50mM NaCl、1.0mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM MgCl2和10mM β-巰基乙醇的混合物中于67℃加熱5分鐘，于42℃加熱25分鐘，從而使引物與5μg單股(ss)M13-PO DNA雜交。然后在冰上冷卻退火的混合物，并將其加到50μl含0.5mM三磷酸脫氧核甘酸(dNTP)、80mM Tris-HCl(pH7.4)、8mM MgCl2、100mM NaCl、9單位DNA聚合酶I Klenow片段、0.5mM ATP和2單位T4 DNA連接酶的反應(yīng)混合物中，使反應(yīng)于37℃進(jìn)行3小時，再于25℃進(jìn)行2小時，然后加入2μ10.2mM EDTA終止反應(yīng)。用反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化可感染的JM105細(xì)胞;使如此得到的轉(zhuǎn)化株生長過夜，然后從培養(yǎng)物上清液中分離ssDNA。使用該ssDNA作模板進(jìn)行第2輪引物延伸，將凝膠純化的RF型DNA轉(zhuǎn)化到可感染的JM 105細(xì)胞中，將所得轉(zhuǎn)化細(xì)胞散布在瓊脂平皿上培養(yǎng)過夜，得到噬菌斑。
(3)定點誘變重復(fù)上面(2)的方法，但所用的合成寡核甘酸引物是5′＞AACGATTAGCGCTCACTCC＜3′其改變是半胱氨酸-70-編碼密碼子變?yōu)榫幋a絲氨酸的密碼子(產(chǎn)生了限制性內(nèi)切酶HaeⅡ的識別順序)。
(4)定點誘變重復(fù)上面(2)所述的方法，但所用的合成寡核甘酸引物是5′＞GTAACAGACTTAGAAGCTAGT＜3′其改變是半胱氨酸-88-編碼密碼子變?yōu)榫幋a絲氨酸的密碼子(產(chǎn)生了限制性內(nèi)切酶AluⅠ的識別順序)。
(5)定點誘變重復(fù)上面(2)中所述的方法＝但所用的合成寡核甘酸引物是5′＞TCGAAGAAGAAAGACTCATCC＜3′其改變是使半胱氨酸-93-編碼密碼子變?yōu)榫幋a絲氨酸的密碼子(產(chǎn)生了限制性內(nèi)切酶HinfⅠ的識別順序)。
(6)產(chǎn)生誘變之噬斑的篩選和鑒定將含突變之M13-PO噬斑的各平皿(見上述(1))和2個含未突變之M13-PO噬菌斑的平皿冷卻到4℃，每個平皿的噬斑轉(zhuǎn)移到2個園形硝酸纖維素濾膜上，其中對于第一個濾膜，是將干濾膜在瓊脂平皿上放置5分鐘，對于第二個濾膜則放置15分鐘。然后將濾膜在浸于0.2NNaOH、1.5MNaCl和0.2%TritonX-100中的厚濾紙上放置5分鐘，再使之在浸于0.5MTris-HCl(pH7.5)和1.5MNaCl內(nèi)的濾紙上放置5分鐘以上，以中和之。按同樣方法將濾膜在浸于2×SSC(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鈉)中的濾紙上洗2次，并在真空烘箱內(nèi)于80℃下干燥2小時。兩個互相重迭的濾膜與10ml(每個濾膜)pH值為7.0的DNA雜交緩沖溶液(5×SSC)于55℃預(yù)雜交4小時，所說的雜交緩沖溶液含有4×Denhardt′s溶液(聚乙烯吡咯烷酮、Ficoll和牛血清白蛋白，1×＝0.02%)、0.1%十二烷基磺酸鈉(SDS)、50mM磷酸鈉緩沖溶液(pH值為7.0)和100μg/ml變性的鮭魚精子DNA。與105Cpm/ml寡核甘酸引物于42℃雜交24小時。在含有0.1%SDS和較少量SSC的洗滌溶液中于50℃下將濾膜洗30分鐘。然后，先用含有2×SSC的緩沖溶液洗濾膜，使用蓋氏(Gejger)計數(shù)儀檢測含未突變M13-PO噬斑之對照濾膜上的放射活性。逐步降低SSC濃度，反復(fù)洗對照濾膜，直到該濾膜不再留有可測出的放射性。使用的SSC濃度最小為0.1×SSC。將濾膜風(fēng)干，并進(jìn)行放射自顯影(-70℃下對膠片曝光2-3天)。使用激酶處理的寡核酸探針篩選10，000個突變的M13-PO噬斑和1100個未突變的對照噬斑。對照噬斑均未與探針雜交，而有3至110個突變的M13-PO噬斑與探針雜交。
取1個突變的M13-PO噬斑，并接種于JM105培養(yǎng)基中由上清液中制備ssDNA，并由細(xì)菌細(xì)胞沉淀中制取雙股(ds)DNA。使用適當(dāng)?shù)墓押烁仕嵋锖蛃sDNA分析堿基順序。
結(jié)果，分別證實TGC(Cys-26)密碼子已改變?yōu)門CT(Ser)密碼子;TGT(Cys-70)密碼子變?yōu)锳GC(Ser)密碼子;TGT(Cys-88)密碼子變?yōu)門CT(Ser)密碼子;TGT(Cys-93)密碼子變?yōu)門CT(Ser)密碼子。
經(jīng)突變的M13-PO噬菌體中，將其中密碼子Cys-26已變?yōu)镾er編碼密碼子的噬菌體定名為M13-P1;將其中密碼Cys-70已變?yōu)镾er編碼密碼子的噬菌體定名為M13-P2，將其中密碼子Cys-88已變?yōu)镾ev編碼密碼子的噬菌體定名為M13-P3;并將其中密碼子Cys-92已變?yōu)镾er編碼密碼子的噬菌體定名為M13-P4。
參考實施例2產(chǎn)生誘變之噬菌體的篩選和鑒定將含有參考實施例1中制得的突變M13-P2噬菌斑的各平皿和2個含有參考實施例1中制得之未突變M13-P2噬菌體噬斑的平皿冷卻到4℃，并將每個平皿中的噬斑轉(zhuǎn)移到2個園形硝酸纖維素濾膜上，方法是對于第一個濾膜使放置在瓊脂平皿上的干濾膜保持5分鐘，對于第二個濾膜則保持15分鐘。然后使濾膜在浸于0.2N NaOH、1.5M NaCl和0.2%Triton X-100內(nèi)的厚濾紙上放置5分鐘，然后移到浸于0.5MTris-HCl(pH7.5)和1.5M NaCl內(nèi)的濾紙上放置5分鐘以上以中和之。將濾膜放在浸于2×SSC(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鈉)內(nèi)的濾紙上以同樣方法洗兩次，并放在真空烘箱內(nèi)于80℃下干燥2小時。于55℃下使那些相互重迭的濾膜在10ml/升pH值為7.0的DNA雜交緩沖溶液(5×SSC)中預(yù)雜交4小時，所說的DNA雜交緩沖溶液含有4×Denhard′t溶液(聚乙烯吡咯烷酮，F(xiàn)icoll和牛血清白蛋白，1×＝0.02%)、0.1%十二烷基磺酸鈉(SDS)、50mM磷酸鈉緩沖溶液(其pH值為7.0)和100μg/ml變性的鮭魚精子DNA。與105cpm/ml的寡核甘酸引物在42℃下雜交24小時。每一濾膜在含有0.1%SDS和較低量之SSC的洗滌用緩沖溶液中于50℃下洗30分鐘。然后先用含有2×SSC的緩沖溶液中洗濾膜;使用蓋氏計數(shù)儀檢測含有未突變M13-P2噬斑之對照濾膜上的放射活性。隨著逐步降低SSC濃度，反復(fù)洗滌這些濾膜，直到對照濾膜上不再留有可檢測到的放射活性。所用的SSC濃度最低為0.1×SSC。將濾膜風(fēng)干并進(jìn)行放射自顯影(于-70℃下對膠片曝光2至3天)。使用激酶處理的寡核甘酸探針篩選10，000個突變的M13-P2噬斑和100個未突變的對照噬斑。對照噬斑均未與探針雜交，而有3至10個突變的M13-P2噬斑與探針雜交。
取一個突變的M13-P2噬斑，并接種于JM105培養(yǎng)基中。由所得上清液中制備ssDNA，并由細(xì)菌細(xì)胞沉淀中制取雙股(ds)DNA。使用適當(dāng)?shù)墓押烁仕嵋锖蛃sDNA分析堿基順序。
結(jié)果，分別證實TGC(Cys-26)密碼子已改變?yōu)門CT(Ser)密碼子;TGT(Cys-88)密碼子變?yōu)門CT(Ser)密碼子;且TGT(Cys-93)密碼子變?yōu)門CT(Ser)密碼子。
突變的M13-P2噬菌體中，將其中第26位和70位Cys密碼子已變?yōu)榫幋aSer之密碼子的噬菌體定名為M13-P12;將其中密碼子Cys-70和Cys-88已變?yōu)榫幋aSer之密碼子的噬菌體定名為M13-P23;并將其中密碼子Cys-70和Cys-93已變?yōu)榫幋aSer之密碼子的噬菌體定名為M13-P24。
參考實施例3編碼人bFGF突變型之基因在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)(1)表達(dá)人bFGF突變蛋白之質(zhì)粒pTB762的構(gòu)建使用限制性內(nèi)切酶EcoRI和PstⅠ切割參考實施例2中制得的M13-P23復(fù)制型(RF)，以得到含有人bFGF突變蛋白編碼區(qū)的約0.5KbDNA片段。
另外，使用EcoRI-PstⅠ切割含有trp啟動子的質(zhì)粒ptrp781(Kurokawa，T.等，NucleicAcidsResearch，113077-3085，1983)DNA，以分離出含有trp啟動子、四環(huán)素抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制起始位點的約3.2KbDNA片段。通過T4DNA連接酶反應(yīng)將上述含有編碼人bFGF突變蛋白之基因區(qū)的0.5KbEcoRI-PstⅠDNA片段與該3.2KbDNA片段連接在一起，以構(gòu)建表達(dá)人bFGF突變型的質(zhì)粒pTB762。
使用該質(zhì)粒pTB762轉(zhuǎn)化大腸桿菌MM294，從而得到攜帶含突變蛋白CS23編碼基因之質(zhì)粒pTB762的大腸桿菌菌株MM294/pTB762(IFO14613，F(xiàn)ERMBP-1645)。
(2)細(xì)菌細(xì)胞抽提物的制備將上述轉(zhuǎn)化株培養(yǎng)在含有1%葡萄糖、0.4%酪蛋白水解物和8μg/ml四環(huán)素的M9培養(yǎng)基中，當(dāng)Klett值變?yōu)榇蠹s200時，加入濃度達(dá)25μg/ml的3β-吲哚丙烯酸，然后再培養(yǎng)4小時以上。培養(yǎng)后，收集細(xì)菌細(xì)胞并懸浮于含有1/20量20mMTris-HCl(pH7.6)的10%蔗糖溶液中。向該懸浮液內(nèi)加入苯甲基磺酰氟(PMSF)濃度達(dá)1mM，EDTA達(dá)10mM、NaCl達(dá)0.1M、鹽酸亞精胺達(dá)10mM及溶菌酶達(dá)100μg/ml(各數(shù)字均為終濃度值)，將混合物于0℃下放置45分鐘，然后超聲處理30秒鐘。將該溶液以18，000rpm離心(Sorval離心機(jī)，SS34旋子)30分鐘得到上清液，然后即可用作細(xì)菌細(xì)胞抽提物。
(3)細(xì)菌細(xì)胞抽提物的人bFGF活性以每小井2×103細(xì)胞的量，將小鼠BALB/C3T3細(xì)胞接種到Nunc 96小井微量滴定板(平底)的各小井內(nèi)并培養(yǎng)之，其中每小井各裝有0.2ml含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。第二天更換含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)3天后，向各小井內(nèi)加入10μl已預(yù)先用含0.5%BSA之DME培養(yǎng)基作5倍系列稀釋的細(xì)菌細(xì)胞抽提物繼續(xù)培養(yǎng)。20小時后，向各小井內(nèi)加入2μl3H-Tdr(5Ci/mmol，0.5mci/ml RCC Amersham)。6小時后，經(jīng)用含有0.2%胰蛋白酶-0.02%EDTA的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)處理以使細(xì)胞脫壁，并使用Titertech細(xì)胞收獲器將細(xì)胞收集到玻璃濾器上，然后使用閃爍計數(shù)儀測定細(xì)胞攝入的3H-Tdr量。
結(jié)果可見得自大腸桿菌MM294/pTB762的細(xì)菌細(xì)胞抽提物具有FGF活性。
如此得到其中人bFGF的70和83位Cys已被Ser取代的rhbFGF突變蛋白CS23。
(4)使上述(3)中得到的25ml抽提物(由500ml培養(yǎng)物制得)通過已用20mMTris-HCl，pH7.4(在0.2MNaCl溶液中)平衡過的DEAE纖維素(DE52，Whatman，UK)柱(2cm×10cm)，以從抽提物中除去核酸成分。合并柱的流出物和用20mMTris-HCl(pH7.4，在0.5MNaCl溶液中)洗柱的洗出液(即通過DEAE柱的60ml部分)。
使該部分通過裝有肝素的ShodexAF-pakHR-984柱(8mmID×5cm，日本ShowaDenko公司生產(chǎn))進(jìn)行高效液相層析(Gilson，法國)。先用20mMTris-HCl溶液(pH7.4)，然后用20mMTris-HCl(pH7.4)，0.5MNaCl溶液洗柱，再用20mMTris-HCl(pH7.4)，0.5M至2MNaCl梯度進(jìn)行線性梯度洗脫(體積60ml，流速1.0ml/分)。
發(fā)現(xiàn)在第15至25分鐘洗脫的峰值部分含有rhbFGF突變蛋白CS23;收集該部分?；谌毡綯akaraShuzo有限公司生產(chǎn)之牛腦FGF標(biāo)準(zhǔn)樣品(純度95%以上)的FGF活性，計算出該部分的比活性為1.1mgFGF蛋白/mg蛋白質(zhì)。
參考實施例4β-環(huán)糊精十四烷基磺酸酯鈉鹽的制備(a)5gβ(-環(huán)糊精溶解在250ml二甲基甲酰胺中。在5分鐘內(nèi)向該溶液中加入15g三氧化硫-三甲胺配鹽，同時于70℃下攪拌該溶液，然后于恒溫下繼續(xù)攪拌16小時。冷卻后向混合物內(nèi)加入250ml乙醇，然后移去上清液，收集不溶性材料，并用小量乙醇洗滌之。將沉淀溶解于250ml水中并過濾不溶性物質(zhì)。向濾出液內(nèi)加入75ml30%(W/V)乙酸鈉的水溶液，并于室溫下攪拌1小時。
(b)在減壓下將如上述方法制得的含β環(huán)糊精十四烷基磺酸酯之鈉鹽的反應(yīng)混合物濃縮至干。將濃縮物溶解在75ml水中。向該溶液內(nèi)加入150ml乙醇，并移去上清液收集膠質(zhì)固體物。加入30ml乙醇后磨碎膠質(zhì)固體物，然后經(jīng)過濾收集并干燥，得到10.3g目的化合物。
元素分析(分子式為C42H56O77S14Na14)計算值C，19.68;H2.20;S，17.51(%)測定值C，20.67;H，3.40;S，16.29(%)〔α〕22D+83.5°(C＝1.55，水)水含量1.5%(W/W)(KarlFischers方法)參考實施例5將2.9g平均聚合度為540的β-1，3-葡聚糖(凝膠多糖)懸浮于100ml二甲基甲酰胺中。向該懸液內(nèi)加入由13.5g氯磺酸和11.7g三乙胺合成的12.5g三乙胺-磺酸，然后在冰水浴中攪拌下反應(yīng)24小時。使反應(yīng)混合物對0.5M碳酸氫銨充分透析，然后凍干得到4.4g目的產(chǎn)物。如此制得的β-1，3-葡聚糖硫酸酯的銨鹽平均取代度(DS)為1.04(硫含量為12.7%)。
參考實施例6用90%甲酸部分水解(95℃，40分鐘)平均聚合度為540的β-1，3葡聚糖得到2.5gβ-1，3-葡聚糖低分子量聚合物(平均聚合度6)，并將其懸浮于150ml二甲基甲酰胺中。向該懸液內(nèi)加入50g三乙胺-磺酸，然后在冰水浴中攪拌下反應(yīng)24小時。使反應(yīng)混合物通過已用0.02M碳酸氫銨平衡的床體積為2.5l的SephadexG-25(細(xì)粒的)柱進(jìn)行凝膠過濾。用苯酚磺酸法分析洗脫物的糖含量。然后合并各含糖部分并凍干，得到5.6gβ-1，3-葡聚糖硫酸酯。如此得到的所需產(chǎn)物的DS值為1.12(硫含量為13.3%)。
參考實施例7用90%甲酸部分水解(90℃，40分鐘)平均聚合度為540的β-1，3-葡聚糖，將所得2.5gβ-1，3-葡聚糖低分子量聚合物(平均聚合度為26)懸浮于150ml二甲基甲酰胺中。向該懸液內(nèi)加入50g三乙胺-磺酸，然后在冰水浴中攪拌下反應(yīng)24小時。按參考實施例6中所述的同樣方法處理反應(yīng)混合物，得到6.1gβ-1，3-葡聚糖硫酸酯的銨鹽。如所制得的所需產(chǎn)物DS值為1.22(硫含量為14.0%)。
參考實施例8用85%甲酸部分水解(80℃，30分鐘)平均聚合度為540的β-1，3-葡聚糖，并將所得2.5gβ-1，3-葡聚糖低分子量聚合物(平均聚合度為131)懸浮于100ml二甲基甲酰胺中。向該懸浮液內(nèi)加入12.5g三乙胺-磺酸，然后在冰水浴中攪拌下反應(yīng)24小時。使反應(yīng)混合物對0.5M碳酸氫銨充分透析，然后凍干得到3.9gβ-1，3-葡聚糖硫酸酯的銨鹽。如此制得的所需產(chǎn)物的DS為1.46(硫含量為15.4%)。
參考實施例9按下面(1)或(2)中所述的方法，在下列實施例中檢測FGF活性。
(1)將懸浮于含5%小牛血清之DMEM培養(yǎng)基內(nèi)的小鼠BALB/c3T3細(xì)胞，以每小井0.2ml(2×103個細(xì)胞)的量接種于Nunc 96小井微量滴定極(平底)中并培養(yǎng)之。第二天更換含0.5%的小牛血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)3天后，向各小井內(nèi)加入10μl預(yù)先用含0.5%BSA之DME培養(yǎng)基5倍分步系列稀釋的細(xì)菌細(xì)胞抽提物繼續(xù)培養(yǎng)。20小時后，每小井各加2μl3H-Tdr(5Ci/mmol，0.5mci/ml RCC Amersham)。6小時后，經(jīng)用含0.2%胰蛋白酶-0.02%EDTA的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)處理以使細(xì)胞脫壁，并借助Titertech細(xì)胞收獲器將細(xì)胞收獲到玻璃濾器上，然后使用閃爍計數(shù)器測定細(xì)胞攝入的3H-Tdr量。
(2)將預(yù)先用含有10%小牛血清之DMEM培養(yǎng)基依次稀釋(每次稀釋2倍)的樣品，以每小井50μl的量加到Nunc 96小井微量滴定極(平底)的各小井內(nèi)，然后將購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的胎牛心臟內(nèi)皮細(xì)胞(CRL 1395)以每小井50μl(2×103個細(xì)胞)的量接種到各小井內(nèi)并培養(yǎng)3天。每小井再加入20μl MTT溶液(5mg/ml PBS，Sigma)。4.5小時后，加入100μl 10%SDS-0.01N HCl并將平板在保溫箱內(nèi)放置過夜，然后使用Titertech Multiscan測定590nm處吸光率(Tada等，Journal of Immunological Methods，931157，1986)。
實施例1向含有10%胎牛血清的DulbeccoMEM培養(yǎng)基(Virology8396，1959)內(nèi)加入終濃度為10μg/ml的rhbFGF，再加入硫酸葡聚糖的鹽至終濃度達(dá)到25μg/ml，并于37℃下保溫24小時。硫酸葡聚糖的鹽是平均分子量分別為
5，000、7，500或500，000的鈉鹽。作為對照組，是在同樣培養(yǎng)基內(nèi)未加入硫酸葡聚糖鈉。表2中顯示了24小時后保留的活性。對照組基本上沒有FGF活性，而試驗組則穩(wěn)定地保留了FGF活性。
表2添加劑保留的FGF活性(%)硫酸葡聚糖鈉100(平均分子量5，000)硫酸葡聚糖鈉100(平均分子量，7，500)硫酸葡聚糖鈉100(平均分子量500，000)未加4實施例2向含有10%胎牛血清的DulbeccoMEM培養(yǎng)基內(nèi)加入rhbFGF突變蛋白CS23達(dá)終濃度為10μg/ml，再加入硫酸葡聚糖的鹽使之達(dá)到終濃度為25μg/ml，于37℃下將培養(yǎng)基保溫24小時。硫酸葡聚糖的鹽是平均分子量分別為5，0007，500或500，000的鈉鹽。作為對照組，使用了未加硫酸葡聚糖鈉的同種培養(yǎng)基。表3中顯示了24小時后保留的活性。對照組中，基本上沒有保留活性，而試驗組則穩(wěn)定地保留了FGF活性。
表3添加劑保留的FGF活性(%)硫酸葡聚糖鈉93(平均分子量5，000)硫酸葡聚糖鈉100(平均分子量7，500硫酸葡聚糖鈉100(平均分子量500，000)未加6實施例3向20mM磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4)內(nèi)加入rhbFGF使之終濃度達(dá)到10μg/ml，再加入不同比例的硫酸葡聚糖鈉(平均分子量7，500;硫含量17.4%)，然后于37℃下保溫72小時。所加硫酸葡聚糖鈉的量，相對于rhbFGF，濃度分別達(dá)到0至16M。作為對照，使用了不含硫酸葡聚糖的同種培養(yǎng)基。表4中顯示了72小時后保留的活性。
表4rhbFGF/硫酸葡聚糖保留的FGF活性(%)鈉的摩爾比例1∶0＜31∶0.25151∶1991∶4951∶16100實施例4向20mM磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4)內(nèi)加入rhbFGF使之終濃度達(dá)到10μg/ml，再加硫酸葡聚糖鈉和/或檸檬酸鈉然后冷凍干燥。硫酸葡聚糖鈉(平均分子量7，500，硫含量17.4%)濃度為25μg/ml，而檸檬酸鈉濃度為50mM。加入蒸餾水重新配制凍干的材料，然后測定其保留活性。結(jié)果如表5所示。
表5添加劑保留的FGF活性(%)硫酸葡聚糖鈉100檸檬酸鈉48硫酸葡聚糖鈉+檸檬酸鈉97未加6實施例5向20mM磷酸緩沖溶液(pH7.4)內(nèi)加入rhbFGF使之終濃度達(dá)到10μg/ml，再加入硫酸葡聚糖鈉(平均分子量7，500;硫含量17.4%)終濃度為25μg/ml，然后于37℃下保溫72小時。另一方面，代替上述硫酸葡聚糖鈉，向上述磷酸鹽緩沖液內(nèi)單獨或與硫酸葡聚糖鈉(25μg/ml)混合加入終濃度達(dá)0.4M的檸檬酸鈉、蘋果酸鈉、馬來酸鈉、富馬酸鈉或酒石酸鈉，然后于37℃下保溫24小時。表6中顯示了72小時后的保留活性。
表6添加劑保留的FGF活性(%)硫酸葡聚糖鈉91檸檬酸鈉72檸檬酸鈉+硫酸葡聚糖鈉100蘋果酸鈉40蘋果酸鈉+硫酸葡聚糖鈉93馬來酸鈉54馬來酸鈉+硫酸葡聚糖鈉94富馬酸鈉35富馬酸鈉+硫酸葡聚糖鈉90酒石酸鉀鈉63酒石酸鉀鈉+硫酸葡聚糖鈉97未加2實施例6向50mM檸檬酸鈉溶液(pH7.4)內(nèi)加入濃度達(dá)100μg/ml的rhbFGF，再向混合物內(nèi)加入硫酸葡聚糖的鹽使之終濃度達(dá)到40μg/ml(摩爾比1∶1)，然后于56℃下保溫30分鐘。所用硫酸葡聚糖的鹽為平均分子量7，500的鈉鹽。以未添加硫酸葡聚糖的一組作為對照。表7列出30分鐘后保留的活性。由表7中所示的結(jié)果證市，對照組的FGF活性幾乎幾乎完全喪失，而硫酸葡聚糖組中即使在高溫下仍穩(wěn)定地保留了FGF活性。
表7添加劑保留的FGF活性(%)硫酸葡聚糖鈉100(平均分子量7，500)未加11實施例7向2mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)內(nèi)加入濃度達(dá)100μg/ml的參考實施例3中制得的rhbFGF突變蛋白CS23。再向該混合物中加入平均分子量為7，500的硫酸葡聚糖鈉至終濃度為46μg/ml(摩爾比1∶1)，然后于37℃，pH3.0、5.0、7.4或9.7等不同pH條件下保溫2小時。表8顯示了保溫2小時后保留的FGF活性。
由表8所示的結(jié)果可以看出，對照組在各PH條件下FGF活性均顯著降低，但硫酸葡聚糖組的FGF活性則保持在高水平。
表8添加劑PH保留的FGF活性(%)硫酸葡聚糖鈉3.080硫酸葡聚糖鈉5.0100硫酸葡聚糖鈉7.4100硫酸葡聚糖鈉9.787未加3.030未加5.045未加7.460未加9.728實施例8向8mMHCl中加入?yún)⒖紝嵤├?中制得的rhbFGF突變蛋白CS23及平均分子量為7，500的硫酸葡聚糖鈉，終濃度分別為100μg/ml和94μg/ml(摩爾比1∶1)，然后加入胃蛋白酶達(dá)4μg/ml(終pH2.1)。對照組未添加硫酸葡聚糖鈉。反應(yīng)混合物于37℃保溫30分鐘，并測定保留的FGF活性(表9)。對照組中幾乎失去所有rhbFGF突變蛋白CS23的活性，而硫酸葡聚糖鈉組雖經(jīng)胃蛋白酶消化仍可穩(wěn)定地保留FGF活性。
表9添加劑保留的FGF活性(%)硫酸葡聚糖鈉98未加2實施例9向20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中加入?yún)⒖紝嵤├?中制得的rhbFGF突變蛋白MS23，終濃度為100μg/ml，再向該混合物中加入平均分子量為7，500的硫酸葡聚糖鈉達(dá)94μg/ml(摩爾比1∶1)，然后加入終濃度達(dá)4μg/ml的胰蛋白酶或α-胰凝乳蛋白酶。該混合物于37℃保溫16小時。用未添加硫酸葡聚糖的一組作為對照。對照組幾乎沒有保留的rhbFGF突變蛋白CS23的活性，但存在胰蛋白酶或α-胰凝乳蛋白酶的硫酸葡聚糖鈉組仍穩(wěn)定地保留了活性(表10)。
表10酶添加劑保留的FGF活性(%)胰蛋白酶硫酸葡聚糖鈉95胰蛋白酶未加4α-胰凝乳蛋白酶硫酸葡聚糖鈉92α-胰凝乳蛋白酶未加6
實施例10向含有10%胎牛血清的DulbeccoMEM培養(yǎng)基內(nèi)加濃度達(dá)10μg/ml的rhbFGF，再向該混合物中加入終濃度達(dá)500μg/ml參考實施例4中制得的β-環(huán)糊精十四烷基硫酸鈉鹽或參考實施例5至8中制得的β-1，3-葡聚糖硫酸的銨鹽，然后于37℃保溫24小時。所用β-1，3-葡聚糖硫酸酯的銨鹽的平均聚合度為6(硫含量13.5%)、26(硫含量為14.0%131(硫含量為15.4%)或540(硫含量為12.7%)。以未添加硫酸化葡聚糖的一組作為對照組。表11中顯示了保溫24小時后保留的FGF活性。對照組中幾乎喪失了所有FGF活性，但β-環(huán)糊精硫酸酯或β-1，3-葡聚糖硫酸酯組中則穩(wěn)定地保留了FGF活性。
表11添加劑保留的FGF活性(%)β-環(huán)糊精十二烷基硫酸酯鈉鹽100β-1，3-葡聚糖硫酸酯銨鹽75(平均聚合度6)β-1，3-葡聚糖硫酸酯銨鹽100(平均聚合度26)β-1，3-葡聚糖硫酸酯銨鹽100(平均聚合度131)β-1，3-葡聚糖硫酸酯銨鹽100(平均聚合度540)未加4
實施例11向含有10%胎牛血清的Dulbecco′sMEM培養(yǎng)基內(nèi)加入濃度達(dá)10μg/ml的rhbFGF突變蛋白CS23，再向該混合物中加入終濃度達(dá)500μg/ml的參考實施例4中制得的β-環(huán)糊精十四烷基硫酸酯鈉鹽或參考實施例5至8中制得的β-1，3-葡聚糖硫酸酯銨鹽。然后于37℃下保溫24小時。所用的β-1，3-葡聚糖硫酸酯銨鹽平均聚合度為6(硫含量13.5%)、26(硫含量14.0%)、131(硫含量15.4%)或540(硫含量12.7%)。將未添加硫酸化葡聚糖的一組作為對照組。表12顯示保溫24小時后保留的FGF活性。對照組中幾乎失去所有FGF活性，但加有β-環(huán)糊精硫酸酯或β-1，3-葡聚糖硫酸酯組則穩(wěn)定地保留了FGF活性。
表12添加劑保留的FGF活性(%)β-環(huán)糊精十四烷基硫酸酯鈉鹽100β-1，3-葡聚糖硫酸酯銨鹽100(平均聚合度6)β-1，3-葡聚糖硫酸酯銨鹽100(平均聚合度26)β-1，3-葡聚糖硫酸酯銨鹽100(平均聚合度131)β-1，3-葡聚糖硫酸酯銨鹽100(平均聚合度540)未加6
實施例12按1∶1的體積比混合得自參考實施例3的rhbFGF突變蛋白CS23(980μg/ml)和平均分子量為7，500的葡聚糖硫酸酯鈉。將200μl等份的組合物加到TSK-凝膠3000SW(日本Tosoh公司)柱(0.75×60cm)上，并用含有0.1M Na2SO4的0.1M磷酸鹽緩沖液(PH6.0)洗柱，流速為1.0ml/分。測230nm吸光率監(jiān)測蛋白質(zhì)。混合物產(chǎn)生兩個峰(見圖2)峰Ⅰ(用Ⅰ標(biāo)出)和峰Ⅱ(用Ⅱ標(biāo)出)。分別收集和分析兩個峰證明峰Ⅰ為含rhbFGF突變蛋白CS23和葡聚糖硫酸酯鈉鹽(1∶4)的復(fù)合物，峰Ⅱ是葡聚糖硫酸酯鈉鹽。
由圖2估計上述復(fù)合物的分子量約為45，000。
實施例13制備含0.5mgrhbFGF、0.23mg葡聚糖硫酸酯鈉鹽、15mg檸檬酸鈉穩(wěn)定的注射用水溶液(pH7.4)。
實施例14制備含0.5mgrhbFGF突變蛋白CS23、0.23mg葡聚糖硫酸酯鈉鹽、15mg檸檬酸鈉的穩(wěn)定的注射用水溶液(pH7.4)。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)含(a)成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)或其突變蛋白和(b)硫酸葡萄糖多聚物之穩(wěn)定化組合物的方法，其包括使FGF或其突態(tài)蛋白與硫酸葡萄糖多聚物在含水介質(zhì)上接觸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中組合物包含F(xiàn)GF或其突變蛋白與硫酸葡萄糖的復(fù)合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其包含F(xiàn)GF突變蛋白和葡聚糖硫酸酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中FGF突變蛋白是其中至少一個人堿性FGF組成氨基酸被其他氨基酸取代的突變蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中突變蛋白是rhbFGF突變蛋白CS23，該突變蛋白中人bFGF之70位和88位的半胱氨酸被絲氨酸取代。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中硫酸葡萄糖多聚物硫含量不少于約3%(W/W)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中硫酸葡萄糖多聚物的硫含量不少于約12至20%(W/W)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中硫酸葡萄糖多聚物(glucan sulfate)是葡聚糖硫酸酯((dextran sulfate)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中硫酸葡萄糖多聚物是環(huán)糊精硫酸酯。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中硫酸葡萄糖多聚物是β-1，3-葡聚糖硫酸酯。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包含二或三元羧酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其包括制備進(jìn)一步含有醫(yī)藥上可接受之載體、賦形劑或其稀釋劑的醫(yī)藥組合物的方法。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中組合物是注射劑、注射用溶液、冷凍制劑或凍干制劑形式的。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中組合物是呈注射劑形式的。
15.一種穩(wěn)定成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)或其突變蛋白的方法，其包括使FGF或其突變蛋白與硫酸葡萄糖多聚物在水溶液中接觸。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中使FGF突變蛋白與硫酸葡萄糖多聚物接觸。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中FGF突變蛋白是其中至少一個人堿性FGF組成氨基酸被其他氨基酸取代的突變蛋白。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中突變蛋白是rhb突變蛋白CS23，該突變蛋白中人bFGF之70和88位的半胱氨酸被絲氨酸取代。
19.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中硫酸葡萄糖多聚物的硫含量不少于大約3%(W/W)。
20.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中硫酸葡萄糖多聚物的硫含量大約為12至20%(W/W)。
21.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中硫酸葡萄糖多聚物是葡聚糖硫酸酯(dextran sulfate)。
22.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中硫酸葡萄糖多聚物是環(huán)糊精硫酸酯。
23.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中硫酸葡萄糖多聚物是β-1，3-葡聚糖硫酸酯。
24.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其進(jìn)一步包含二或三元羧酸。
全文摘要
將成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)或其突變蛋白在水溶液中與硫酸葡萄糖多聚物接觸而使FGF或其突變蛋白穩(wěn)定化。由此得到的由(a)FGF或其突變蛋白和(b)硫酸葡萄糖多聚物構(gòu)成的組合物得以穩(wěn)定化，因而能夠很方便地作為藥物用于溫血動物。
文檔編號A61K31/715GK1038765SQ8910397
公開日1990年1月17日 申請日期1989年6月5日 優(yōu)先權(quán)日1988年6月6日
發(fā)明者加藤光一, 河原賢治, 鍛治尾知子 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社