專利名稱：二萜內(nèi)酯化合物的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抗炎癥及免疫抑制作用的新的二萜內(nèi)酯化合物的合成方法。
現(xiàn)有技術(shù)中已知，中藥雷公藤(tripterygium Wilfordii)主要分布于中國的閩、浙、贛、皖、湘、臺灣等省份，其根部可用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。特別是從雷公藤根皮中分離得到雷公藤內(nèi)脂醇(Triptolide)作為已知的二萜內(nèi)酯化合物，具有抗腫瘤作用[J.Amer.Chem.Soc.，第94卷，第7194頁(1972)]。本發(fā)明者將雷公藤內(nèi)酯醇的三個環(huán)氧中的一個環(huán)氧在一定條件下打開，并進(jìn)一步將生成物乙酰化合成出了新的二萜內(nèi)酯化合物，經(jīng)藥理試驗(yàn)證明，這一類化合物有很好的抗炎癥及免疫抑制作用。
本發(fā)明的目的是以雷公藤根皮中分離得到的雷公藤內(nèi)酯醇(Triptolide)作為制備新的二萜內(nèi)酯化合物的原料，通過化學(xué)方法，用不同試劑打開雷公藤內(nèi)酯醇的11，12-環(huán)氧而得到一系列雷公藤內(nèi)酯醇的衍生物，這些化合物具有抗炎癥和抑制免疫作用。
本發(fā)明的化合物用下述結(jié)構(gòu)式表示
其中，R1＝鹵素、羥基、甲氧基及丙硫基;R2＝羥基和乙酰基。在合成上式化合物時，將R1＝H的化合物與雷公藤內(nèi)酯醇(Triptolide)一起反應(yīng)，進(jìn)一步將其生成物與無水醋酸反應(yīng)是合成二萜內(nèi)酯化合物的方法特征。
本發(fā)明中，鹵族原子是氟、氯、溴、碘。以R1＝H的化合物為例，列舉了氯化氫，溴化氫，碘化氫等鹵化氫，及甲醇，丙硫醇等。制備本發(fā)明中各化合物的反應(yīng)條件不盡相同，但一般都是在比較溫和的條件下完成。反應(yīng)溫度也容易控制，如冰箱2-3℃，室溫以及＜70℃進(jìn)行，條件比較易控制。所用試劑也是常用試劑，如乙醚，甲醇，丙酮，二氯甲烷等。反應(yīng)時間有長(兩周)有短(20-30分鐘)。詳見制備各化合物實(shí)例。
用本發(fā)明的方法合成的上述化合物的各組衍生物都具有抗炎癥及免疫抑制作用。下面詳細(xì)說明本發(fā)明化合物的合成方法，但并不限制本發(fā)明。其中例1 a;R1＝Cl，R2＝OH，例2 b;R1＝Br，R2＝OH，例3 c;R1＝-OCH3，R2＝OH，例4 d;R1＝OH，R2＝OH，例5 e;R1＝-SCH2CH2CH3，R2＝OH，例6 f;R1＝Cl，R2＝-OCH2CH3，實(shí)施例1[a的合成]在20mg雷公藤內(nèi)酯醇中加入1ml 0.4N的鹽酸-冰醋酸(0.35ml的36%鹽酸溶于1ml冰醋酸中)，加蓋在冰箱(3-4℃)中放置16-18小時。在反應(yīng)液中加入5倍量的水，有白色沉淀生成，用乙醚提取3次。合并乙醚層，用水洗至中性后，用無水硫酸鈉干燥。過濾去掉無水硫酸鈉，揮發(fā)乙醚。殘?jiān)霉枘z薄層層析分離(展開劑2%甲醇/氯仿)，收集含有a的組分，用5%甲醇/氯仿洗脫，所得到的含a的粗組分，用氯仿重結(jié)晶得到18mg a的白色針狀結(jié)晶。收率為82%。
用x-線單晶衍射法也證明了該化合物的結(jié)構(gòu)。
m.p.256-258℃M S m/z(%);
396(M+，0.88)，378(0.42)，361(1.88)，
343(34.91)，273(17.06)，247(39.04)，229(17.33)，149(26)，121(23)，105(32)，71(100)IR γkBrmaxcm-1;
3530(羥基)，1751，1673(α，β-不飽和γ-內(nèi)脂)1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm);
0.89(3H，d，J＝6.97Hz，C16-3H)，1.00(3H，J＝6.60Hz，C17-3H)1.12(3H，s，C20-3H)，1.27，1.61(2H，C1-2H)，1.98(1H，t，C6-βH)，2.17，2.32(2H，C2-2H)，2.20(1H，m，C6-αH)，2.56(1H，sept，C15-H)，2.75(1H，m，C5-H)，3.12(1H，d，J＝1.46Hz，C14-H)，3.45(1H，d，J＝5.86Hz，C7-H)，3.90(1H，d，J＝5.13Hz，C11-H)，4.26(1H，dd，J＝5.13，1.46Hz，C12-H)，4.74(2H，m，C19-2H)13C-NMR(400MHz，DMSO)δ(ppm)13.27(q，C28)，15.17(q，C16)，15.38(q，C17)，17.01(t，C2)，23.26(t，C6)，28.98(d，C15)，30.41(d，C1)，35.74(s，C18)，39.88(d，C5)，57.66(d，C11)，
59.08(d，C12)，61.31(d，C7)，70.74(t，C19)，76.24(d，C14)，125.27(s，C3)，161.20(s，C4)，174.19(s，C18)，60.51，70.20，76.58(C8，C9，C13)實(shí)施例2[b的合成]20mg雷公藤內(nèi)酯醇溶于15ml丙酮中，加入1ml水和0.5ml的濃溴化氫后回流25分鐘。反應(yīng)后加30ml水，減壓除去一部分丙酮，用15ml二氯甲烷提取3次，以無水硫酸鎂干燥二氯甲烷層，減壓揮發(fā)二氯甲烷，殘留物用二氯甲烷-石油醚重結(jié)晶后得到18mg b的板狀結(jié)晶。收率為75%。
硅膠薄層層析條件95份氯仿∶5份甲醇。
m.p.230～232℃，Rf＝0.64元素分析計(jì)算值(%);C54.55，H5.68，Br17.95實(shí)測值(%);C54.25，H5.79，Br18.93MSm/z(%)361(M+-Br，3)，343(M+-Br-H2O，14)，325(5)，271(9)，241(9)，189(18)，167(23)，151(27)，137(84)，43(100)H-NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm);
0.88(3H，d，J＝7Hz，C16-3H)，0.98(3H，d，J＝7Hz，C17-3H)，1.11(3H，s，C20-3H)，1.22(1H，m)，1.61(1H，q，J＝4.12Hz)，2.00(1H，m)，2.15(1H，m)，2.33(1H，m)，2.62(2H，m)，
3.14(1H，s，C14-H)，3.38(1H，d，J＝6Hz，C7-H)，3.84(1H，d，J＝4Hz，C11-H)，4.14(1H，d，J＝4Hz，C12-H)，4.68(2H，br，s，C19-2H)Kedd′s顯色劑紫紅色，實(shí)施例3[C的合成]在2g中性氧化鋁中加入150μl無水甲醇并攪拌20分鐘。用40ml無水二氯甲烷溶解30mg雷公藤內(nèi)酯醇后加到前面的氧化鋁中，室溫放置10小時，攪拌下加入1ml無水甲醇，室溫放置1周。過濾反應(yīng)液，用甲醇洗脫氧化鋁，合并甲醇液，揮發(fā)甲醇液。殘留物上硅膠柱分離(展開劑是氯仿)，從第5組份中(20ml/組份)分離出目的物。用二氯甲烷-石油醚重結(jié)晶后得到3mgC的針狀結(jié)晶。收率為10%。
硅膠薄層層析條件為95份氯仿∶5份甲醇。
m.p.272-274℃，Rf＝0.75Kedd′s顯色劑，紫紅色(斑點(diǎn))高分辨質(zhì)譜分子量392.1837分子式;C21H28O7MSm/z(%);
392(M+，100)，377(M+-CH3，43.89)，271(1.5)1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm);
0.90(3H，d，J＝7Hz，C16-3H)，1.06(3H，J＝7Hz，C16-3H)，
1.17(3H，s，C20-3H)，1.58(1H，q，J＝5.12Hz)，1.9(1H，m)，2.10(1H，m)，2.22(2H，m)，2.35(1H，m)，2.91(1H，m)，3.44(3H，s，OCH3)，3.53(1H，d，J＝3Hz，C11-H)，3.63(1H，br，s，C14-H)，4.34(1H，d，J＝3Hz，C12-H)，4.71(2H，br，s，C19-2H)，實(shí)施例4[d的合成]20mg雷公藤內(nèi)酯醇溶于10ml甲醇中，并加入5ml蒸餾水，5ml磷酸緩沖液(PH7.4)及200μl NHEt2，室溫?cái)嚢韬蠓胖?周。反應(yīng)液用2N硫酸中和，加20ml水稀釋，用10ml氯仿提取4次。提取液用無水硫酸鎂干燥后，揮發(fā)，殘餾物上硅膠柱分離(展開劑1%甲醇/氯訪)，從第6組份中分離出目的物(20ml組份)。丙酮重結(jié)晶得到16mg d的白色粉末。收率為76%。
硅膠薄層層析條件95份氯仿∶5份甲醇。
Rf＝0.50 m.p.180-182℃Kedd′s顯色劑紫紅色(斑點(diǎn))，MSm/z(%);361(M++1-H2O，2)，342(M+-2H2O，3)，317(5)，259(7)，231(9)，193(7)，151(12)，71(31)，43(100)1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm);
0.69(3H，d，J＝7Hz，C16-3H)，0.92(3H，d，C28-3H)，0.94(3H，d，J＝7Hz，C17-3H)，1.24(1H，m)，1.38(1H，q，J＝4.12Hz)，2.13(1H，m)，
2.28(2H，m)，2.85(1H，m)，3.46(1H，d，J＝2Hz，C11-H)，3.56(1H，d，J＝6Hz，C7-H)，4.31(1H，d，J＝2Hz，C12-H)，4.76(2H，m，C19-2H)，實(shí)施例5[e的合成]30mg雷公藤內(nèi)酯醇溶于3.5ml甲醇中，加入3.5ml磷酸緩沖液(PH7.4)及400μl丙硫醇，室溫?cái)嚢韬蠓胖?周，加20ml水稀釋反應(yīng)液，10ml二氯甲烷提取4次。提取液用無水硫酸鎂干燥后揮發(fā)，殘留物上硅膠柱分離(展開劑1%甲醇/氯仿)，從第3組份(25ml/組份)中分離出目的物。以二氯甲烷-石油醚重結(jié)晶得到22mg e的針狀結(jié)晶。收率為61%。
硅膠薄層層析條件96份氯仿∶4份甲醇。
Rf＝0.40 m.p.240-242℃Kedd′s顯色劑紫紅色(斑點(diǎn))，元素分析表明含有硫。
IR γkBrmaxcm-1;
3450(羥基)，1750，1680(α，β-不飽和γ-內(nèi)脂)MSm/z(%);
437(M++1，7)，436(M+，2)，389(5)，343(7)，315(63)，273(9)，160(26)，71(29)，43(100)
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ(ppm);
0.75(3H，d，J＝6Hz，C16-3H)，0.92(3H，d，J＝6Hz，C17-3H)，0.94(3H，s，C28-3H)，0.98(3H，t，J＝6Hz，CH3CH2CH2S-)，1.27(1H，m，C1-αH)，1.41(1H，q，J＝5，12Hz，C1-βH)，1.60(2H，m，CH3CH2CH2S-)，1.82(1H，q，J＝13，15Hz，C6-βH)，1.98(1H，m，C2-βH)，2.13(1H，m，C2-αH)，1.17(1H，m，C6-αH)，2.21(1H，m，C15-H)，2.65(2H，m，-CH2-S-)，2.7(1H，m)，2.87(1H，d，J＝8.5Hz，)，3.16(1H，d，J＝5Hz，C12-H)，3.34(1H，d，J＝6Hz，C7-H)，3.73(1H，d，J＝5Hz，C11-H)，4.83(2H，m，C19-2H)，實(shí)施例6[f的合成]20mg的a溶于1ml吡啶中，加入1ml無水醋酸后放置一周。反應(yīng)液倒入20ml冰水中，用15ml二氯甲烷提取3次。合并二氯甲烷層，用10ml水洗脫，無水硫酸鎂干燥后揮發(fā)，殘留物上硅膠柱分離(展開劑2%甲醇/氯仿)，從第3組份中(15ml/組份)分離出目的物。以二氯甲烷-石油醚重結(jié)晶得到18mg f的板狀結(jié)晶。收率為61%。
硅膠薄層層析條件為95份氯仿∶5份甲醇。
Rf＝0.55，m.p.194-196℃
用x-線單晶衍射方法證明了該結(jié)構(gòu)式。
Kedd′s顯色劑紫紅色(斑點(diǎn))MSm/z(%);
439(M++1，3)，395(M+-COCH3，3)，343(16)，247(23)，151(14)，71(30)，43(100)1H-NMR(400MHz，CDCl)δ(ppm);
0.91(3H，d，J＝7Hz，C16-3H)，1.03(3H，d，J＝7Hz，C17-3H)，1.07(3H，s，C20-3H)，1.27(1H，m)，1.64(1H，m)，1.98(1H，t，J＝13Hz)，2.14(3H，s，-COCH3)，2.23(1H，m)，2.35(1H，m)，2.75(1H，m，C5-H)，3.50(1H，d，J＝6Hz，C7-H)，3.80(1H，d，J＝4Hz，C11-H)，4.12(1H，d，J＝4Hz，C12-H)，4.68(2H，m，C19-2H)，實(shí)施例7藥理結(jié)果用本發(fā)明方法所合成的二萜內(nèi)酯化合物經(jīng)用溶血素抗體生成試驗(yàn)及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)證明有很好的抗炎癥及免疫抑制作用。結(jié)果如下1.二萜內(nèi)酯化合物對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的抑制作用取18-22克C57雄性小鼠，在無菌操作下取脾臟，剪碎后，將脾細(xì)胞懸于HanK′S液中，洗細(xì)胞3次，再以1640培養(yǎng)液配成7×106脾細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，加該細(xì)胞懸液于96孔板中，每孔50μl，除空白對照外，其余各孔均加Con A 50μl(0.125μg)，給藥孔除Con A外，還加測試樣品50ml，各孔均以1640培養(yǎng)液補(bǔ)足最終體積至200μl，各測試樣品均有各自的對照及刺激對照(即Con A)，各組均有4個平行孔。將96孔板置于37℃ CO2孵箱培養(yǎng)48小時，取出每孔加3H-TdR20μl(0.3μci)繼續(xù)培養(yǎng)6小時。取出后收集細(xì)胞于玻璃纖維膜上。80℃烤干，置膜片于甲苯閃爍液中計(jì)數(shù)，以3H-TdR摻入DNA的放射性相對數(shù)量CPM來表示淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的高低，計(jì)算測試樣品對淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的抑制率。
抑制率(%)＝ (刺激對照CPM-測試樣品CPM)/(刺激對照CPM) ×100組別 藥物濃度(mg/ml) CPM(X±SE) 抑制率(%)空白對照 1061.0±238.8刺激對照 47197.7±5039.5化合物 C1×10-548223.0±3956.1 -2.21×10-457626.8±7145.9 -22.01×10-316364.3±1835.3＊ 65.31×10-2904.8±244.8＊＊ 98.11×10-1487.3±109.1＊＊ 99.0空白對照 1218.5±139.0刺激對照 41997.5±4664.7化合物f 1×10-56011.5±277.6＊＊ 85.7
1×10-4629.5±141.6＊＊ 98.51×10-3606.0±136.9＊＊ 98.61×10-2345.5±103.1＊＊ 99.11×10-1221.0±53.9＊＊ 99.5空白對照 889.3±60.7刺激對照 24106.0±4596.9化合物b 1×10-12413.0±172.0＊ 98.31×10-16397.8±43.6＊ 98.31×10-8282.8±30.5＊ 98.81×10-6182.3±50.8＊ 99.2空白對照 787.5±126.5刺激對照 24011.3±2525.5化合物a 1×10 1781.5±326.9＊＊ 92.61×10 21747.3±3723.2 9.41×10 7545.3±1806.4＊ 68.61×10 1642.3±618.2＊＊ 93.2＊P＜0.01 ＊＊P＜0.0012.二萜內(nèi)酯化合物對小鼠溶血素抗體生成的影響取20-24克昆明種小鼠，腹腔注射綿羊紅血球(SRBC)0.2ml(2×109SRBC/ml)，4小時后隨機(jī)分組，對照組i.p.生理鹽水，各給藥組按劑量i.p.測試樣品溶液，每日一次，共四天，于免疫第5天摘眼球取血，分離血清，將稀釋血清加SRBC及豚鼠血清，置于37℃，10分鐘，即產(chǎn)生溶血，取上清，加都氏液即呈紅棕色，于540nm比色，同時測SRBC半數(shù)溶血O.D.(即半量SRBC加都氏液)，計(jì)算半數(shù)溶血值HC50，以HC50值的高低表示血清中溶血素抗體含量的水平。
樣品HC50＝ (樣品O.D.)/(SRBC半數(shù)溶血的O.D.) ×血清稀釋倍數(shù)組別劑量(mg/kg) HC50抑制率(%)對照 32.8±8.0環(huán)磷酰胺 10 4.1±1.1 91.9＊＊合成物 c 0.1 11.7±2.6 64.3＊＊f 0.1 15.3±3.0 53.3＊＊b 0.1 5.4±1.2 83.6＊＊a 0.1 6.8±1.4 79.4＊＊＊P＜0.05 ＊＊P＜0.001
說明書勘誤表頁行 誤 正1 16 R2＝羥基和 R2＝氫和2 8 R2＝OH R2＝H9 R2＝OH R2＝H10 R2＝OH R2＝H11 R2＝OH R2＝H12 R2＝OH R2＝H13 R2＝-OCH2CH3R2＝COCH35 8 氧化鋁 氧化鋁(400℃放置3小時)25 C16-3H C17-3H11 13 1×10 1×10-1214 1×10 1×10-1015 1×10 1×10-816 1×10 1×10-權(quán)利要求
1.一種以如下結(jié)構(gòu)式表示人工合成的二萜內(nèi)酯化合物的方法，
其中，R1=鹵素、羥基、甲氧基和丙硫基；R2=羥基和乙?；?，其特征在于在合成所述二萜內(nèi)酯化合物時，用R1=H的化合物與雷公藤內(nèi)酯醇(Triptolide)一起反應(yīng)，然后再將其生成物與無水酯酸反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以如下結(jié)構(gòu)式表示人工合成的二萜內(nèi)酯化合物的方法，上述化合物具有抗炎及免疫抑制作用。
文檔編號A61P29/00GK1050021SQ8910694
公開日1991年3月20日 申請日期1989年9月8日 優(yōu)先權(quán)日1989年9月8日
發(fā)明者呂燮余, 鄭家潤, 馬鵬程, 張崇璞, 陳沄, 于德泉, 吳若, 梁曉天, 張正行 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所, 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所