專利名稱：雜種單克隆抗體的生產(chǎn)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雜種單克隆抗體。更具體地說，本發(fā)明涉及一種具有兩種特異性的雜種單克隆抗體(后面簡稱為雜種MoAb)，這兩種特異性分別針對纖維蛋白和血栓溶解物質(zhì);并涉及一種產(chǎn)生所述抗體的多雜交瘤(polydoma)。
本發(fā)明還涉及一種血栓溶解藥劑，它含有上述的雜種MoAb和與其免疫偶聯(lián)的血栓溶解物質(zhì)。
血栓溶解療法長期以來被用于治療血栓類疾病，例如心肌梗塞、動脈栓塞和大腦梗塞;最初，臨床應(yīng)用的有效的血栓溶解藥劑是鏈激酶(后面縮寫為SK)、尿激酶(后面縮寫為UK)等。UK的應(yīng)用尤其廣泛，因為它有較強的纖維蛋白溶解作用;但其不利之處在于它對纖維蛋白的選擇性很低，它也作用于纖維蛋白原，從而引起受療病人的出血傾向。由于這一弊病，組織血纖維蛋白溶酶原活化因子(后面縮寫為TPA)和尿激酶原(后面縮寫為ProUK)被作為第二代血栓溶解藥劑使用。與UK相比較，這些藥劑對于纖維蛋白具有更高的選擇性，因此可望減輕UK引起出血傾向的副作用;到目前為止已進行了許多研究。近年來，由于利用基因重組技術(shù)已能夠大量生產(chǎn)這些藥物，人們?nèi)找媾υ噲D將它們用于臨床治療中(歐洲重組組織型血纖維蛋白溶酶原活化因子合作研究小組TheLancet，842，1985)。
但這些臨床應(yīng)用的努力揭示出TPA等也具有某些缺陷，例如，1)TPA的半壽期很短(2-3分鐘)，因此對于血栓溶解來說要求進行大量長期的施用;2)這種高劑量治療并不總是具有減輕出血傾向的效應(yīng)。
在這種情況下，研究并開發(fā)了更有效的血栓溶解藥劑，已經(jīng)生產(chǎn)了修飾過的TPA、UK-TPA或ProUK-TPA雜種蛋白等。對于修飾型TPA來說，已通過基因工程制備了缺乏部分糖鏈結(jié)構(gòu)的TPA突變蛋白，這部分結(jié)構(gòu)被認為是半壽期降低的原因。這樣就避免了肝細胞糖鏈受體對TPA的捕獲，改善了TPA在血液中的動力學(xué)狀況。對于UK-TPA雜種蛋白來說，UK的強血栓溶解作用和TPA的纖維蛋白親和性被結(jié)合利用，從而降低了施用劑量。與傳統(tǒng)的血栓溶解藥劑相比較，這些藥劑雖然可望稍微減輕出血傾向，但顯著的改善作用仍有待于進一步的研究和開發(fā)。
以后又出現(xiàn)了第三代血栓溶解藥劑，即以定靶抗體為基礎(chǔ)的蛋白復(fù)合物。也就是說，通過化學(xué)方式使基本上不與纖維蛋白原反應(yīng)而僅對纖維蛋白具有高親和性的抗體與UK(C.Bode等人，Science229∶765，1985)或TPA(M.S.Runge等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84∶7659，1987)結(jié)合，從而開發(fā)出了僅溶解纖維蛋白而不溶解纖維蛋白原的血栓溶解藥劑。據(jù)報道，在離體或活體實驗中，所有這些定靶抗體的血栓溶解藥劑都表現(xiàn)出比簡單的UK或TPA強3-100倍的效應(yīng)。但是，這些蛋白復(fù)合物都具有由抗體與血栓溶解酶的化學(xué)結(jié)合帶來的缺陷，例如，1)抗體活性與酶活性都在化學(xué)結(jié)合過程中有所降低;2)很難得到抗體與酶的比例為1∶1的蛋白復(fù)合物;或3)蛋白質(zhì)的變性加速了藥劑在受療病人體內(nèi)的代謝。


圖1顯示由參考實例2所述的EIA法制備的抗TPA特異性抗體TPA1-41和TPA1-70的稀釋曲線(見實例2)。
圖2顯示由參考實例3所述的EIA法制備的抗UK特異性抗體UK1-3和UK1-87的稀釋曲線(見實例3)。
圖3顯示由參考實例8所述的EIA法制備的抗TPA-抗人纖維蛋白雙特異性抗體FT2-14的稀釋曲線(見實例4)。
圖4顯示由參考實例9所述的EIA法制備的抗UK-抗人纖維蛋白雙特異性抗體FU1-74的稀釋曲線(見實例5)。
圖5顯示實例4-③制備的雙特異性抗體FT2-14與偶聯(lián)有纖維蛋白的紙圓片的結(jié)合量。在圖5中，■顯示在纖維蛋白原(3mg/ml)存在下得到的結(jié)果;□顯示在沒有纖維蛋白原存在時得到的結(jié)果(見實例6)。
圖6顯示TPA與實例4-③制備的雙特異性抗體FT2-14構(gòu)成的免疫復(fù)合物(●)與簡單TPA(○)之間的酶活性比較結(jié)果(見實例7)。
圖7顯示TPA在用實例4-③制備的雙特異性抗體FT2-14預(yù)處理并結(jié)合有纖維蛋白的Cellulofine顆粒上(TPA/FT2-14)和在未處理的結(jié)合有纖維蛋白的Cellulofine顆粒上(TPA)溶解纖維蛋白的能力(見實例8)。
圖8顯示簡單UK以及UK和實例5-③制備的雙特異性抗體FU1-74構(gòu)成的免疫復(fù)合物的纖維蛋白溶解能力(見實例9)。
圖9顯示單獨使用TPA或結(jié)合使用TPA和實例4-③制備的雙特異性抗體FT2-14所得到的纖維蛋白溶解能力(○)，以及單獨使用UK或結(jié)合使用UK和實例5-③制備的雙特異性抗體FU1-74所得到的纖維蛋白溶解能力(●)(見實例10)。
圖10顯示在家兔頸靜脈血栓模型中，實例4-③制備的雙特異性抗體FT2-14對TPA血栓溶解能力的增強結(jié)果(見實例11)。
圖11顯示小鼠雜交瘤FU2-16的培養(yǎng)上清液的稀釋曲線，該雜交瘤是實例13制備的，它能夠產(chǎn)生抗UK-抗人纖維蛋白的雙特異性抗體(見實例13)。
圖12顯示通過參考實例3和10所述的EIA法制備的UK1-3、1-87和1-6各自的稀釋曲線(見實例3、12和14)。圖12(A)顯示與UK的反應(yīng)性;圖12(B)顯示與低分子量UK的反應(yīng)性。
圖13顯示由參考實例11所述的UK酶活中和測試法得到的抗UK單克隆抗體UK1-3、1-87和1-6各自的酶活抑制曲線(見實例3、12和15)。
為了解決上述有關(guān)活體中代謝、纖維蛋白親和性、血栓溶解能力等問題，并考慮到最近發(fā)展起來的雙特異性雜種單克隆抗體這一新技術(shù)，本發(fā)明者制備了一種雙特異性雜種單克隆抗體與血栓溶解物質(zhì)比例為1∶1的免疫復(fù)合物，它們的抗體活性和血栓溶解活性都沒有下降。制備方法是使血栓溶解物質(zhì)與雙特異性雜種單克隆抗體免疫偶聯(lián)，從而產(chǎn)生一種沒有副作用的特異于纖維蛋白的血栓溶解藥劑。因此，本發(fā)明提供了一種雙特異性雜種MoAb，它的兩種特異性分別針對纖維蛋白和血栓溶解物質(zhì);并提供了一種產(chǎn)生此抗體的多雜交瘤。
本發(fā)明還提供了一種血栓溶解藥劑，它含有上述雙特異性雜種單克隆抗體和與其免疫偶聯(lián)的一種血栓溶解物質(zhì)。
任一種產(chǎn)生抗纖維蛋白抗體的雜交瘤都能用于本發(fā)明中，只要它產(chǎn)生特異于纖維蛋白并基本上不與纖維蛋白原結(jié)合的MoAb就行。例如，使用通過纖維蛋白溶解產(chǎn)生的纖維蛋白的α-鏈N端肽段或β-鏈N端肽段作為免疫原可制備這樣一種特異于纖維蛋白的抗體(K.Y.Hui等人，Science222∶1129，1983，或日本未審查專利公開93800/1988)。雖然任一種纖維蛋白都可接受，只要是動物來源的就行，但優(yōu)選人纖維蛋白;尤其優(yōu)選的是，使用相應(yīng)于人纖維蛋白β鏈N端部分的肽。使這樣得到的纖維蛋白特異性抗體與載體蛋白偶聯(lián)，然后免疫動物(如家兔、大鼠、小鼠、豚鼠)而得到抗體生成細胞。然后從免疫動物體內(nèi)收集抗體生成細胞如脾細胞或淋巴結(jié)細胞，并與骨髓瘤細胞相融合。對這樣得到的雜交瘤細胞進行篩選，選出基本上不與纖維蛋白原反應(yīng)而與纖維蛋白特異結(jié)合的抗體生成細胞。人纖維蛋白β鏈N端肽最好具有如下氨基酸順序H-Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-R-Cys-OH其中，R代表一個由Lys-Arg-Glu-Glu代表的肽或其部分。C端的Cys用來作為與載體蛋白化學(xué)結(jié)合的接頭部分。因此，通過預(yù)先用N-(γ-馬來酰亞胺丁酰氧基)琥珀酰亞胺(后面縮寫為GMBS)使載體蛋白馬來酰亞胺化，或用3-(2-吡啶連二硫基)丙酸N-琥珀酰亞胺基酯(后面縮寫為SPDP)使載體蛋白連二硫吡啶基化，能使該肽通過肽中C端Cys的SH基與載體蛋白進行化學(xué)結(jié)合。
任一種血栓溶解物質(zhì)都能用于本發(fā)明中，只要它是能夠溶解血栓的蛋白或促進血栓溶解的物質(zhì)就行。這類物質(zhì)的例子有蛋白酶或其前體和血栓溶解促進劑(例如TPA、UK、ProUK、SK、胰蛋白酶、血纖維蛋白溶酶、C蛋白、S蛋白)。優(yōu)選使用蛋白酶，尤其優(yōu)選TPA、UK等。單鏈或雙鏈TPA都可以。至于UK，可以使用單鏈或雙鏈低分子量UK、ProUK等(E.Haber等人，Science243∶51，1989)。可用已知方法制備抗體生成雜交瘤，即根據(jù)標準方法用上述蛋白免疫動物，使產(chǎn)生的抗體生成細胞與骨髓瘤細胞或其他細胞融合。尤其是，對于產(chǎn)生抗體生成雜交瘤的方法來說，優(yōu)選使用用低分子量UK免疫動物而得到的抗體生成細胞。在制備能夠產(chǎn)生針對血栓溶解物質(zhì)的抗體的雜交瘤時，可以使用與產(chǎn)生抗纖維蛋白抗體生成雜交瘤相同的方法，即免疫動物，然后使得到的抗體生成細胞與骨髓瘤細胞或其他細胞融合。
用于免疫的動物的實例包括家兔、大鼠、小鼠和豚鼠。在生產(chǎn)MoAb時尤其優(yōu)選使用小鼠。可根據(jù)普通方法進行接種，例如，以2-3周的間隔，在背部或腹部皮下或腹膜內(nèi)接種在等量(0.1ml)生理鹽水和弗氏完全佐劑中的1-100μg，優(yōu)選10-25μg免疫原蛋白乳劑。
從這些免疫動物(例如小鼠)中選擇具有高抗體效價的個體;在最后一次免疫3-5天后收集脾和/或淋巴結(jié);使其中包含的抗體生成細胞與骨髓瘤細胞融合。這種融合可以根據(jù)已知方法進行。促融合劑(fusogen)的例子有聚乙二醇(后面縮寫為PEG)和仙臺病毒。優(yōu)選使用PEG?？梢允褂玫墓撬枇黾毎档睦佑蠳S-1、P3U1和SP2/0;優(yōu)選使用P3U1。脾細胞與骨髓瘤細胞的比例優(yōu)選前者是1-10，后者是1。建議在混合物中加入分子量為1，000-6，000的PEG，使其濃度達10-80%，并在20-37℃，優(yōu)選30-37℃下保溫3-10分鐘。
可用各種方法篩選抗纖維蛋白抗體生成雜交瘤。例如，使纖維蛋白原吸附在微量滴定板上，然后再通過凝血酶的作用使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白。然后，在過量纖維蛋白原的存在下，在固定有纖維蛋白的微量滴定板上加入雜交瘤的培養(yǎng)上清液，然后通過酶免疫檢測法(后面縮寫為EIA)測定培養(yǎng)上清液中與平板結(jié)合的抗纖維蛋白特異抗體的效價。選擇抗體效價呈陽性的雜交瘤，用補充有HAT(次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷)的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并立即進行克隆，一般通過有限稀釋分析等即可容易地進行克隆。用上述方法測定克隆的雜交瘤培養(yǎng)上清液的抗體效價，選擇出穩(wěn)定產(chǎn)生高效價抗體的雜交瘤，即可得到所需的產(chǎn)生單克隆抗纖維蛋白特異性抗體的雜交瘤。
根據(jù)上述方法制備的產(chǎn)生抗纖維蛋白抗體的雜交瘤實例包括FIB1-11和FIB2-11，二者都描述于下面的實例1中。
使用吸附有血栓溶解物質(zhì)的微量滴定板，通過EIA法很容易篩選出產(chǎn)生針對血栓溶解物質(zhì)的抗體的雜交瘤。可根據(jù)上述標準方法進行克隆，得到所需的抗體生成雜交瘤。
根據(jù)上述方法制備的抗TPA抗體生成雜交瘤的實例包括TPA1-41、TPA1-70和TPA2-14，它們都描述于下面的實例2中?？筓K抗體生成雜交瘤的實例包括描述于下面實例3中的UK1-3、UK1-87，以及描述于實例12中的UK1-6。
可用一些已知方法來制備產(chǎn)生本發(fā)明雙特異性雜種MoAb的多雜交瘤(如HiroshiAramoto等人，Protein，NucleicAcidandEnzyme33∶217，1988)。雖然可以使用這些方法中的任一種，但可以提及其中的兩種①使上述產(chǎn)生針對血栓溶解物質(zhì)的抗體的HAT抗性雜交瘤逐步適應(yīng)于補充有5-溴脫氧尿苷(后面縮寫為BrdU)的培養(yǎng)基，然后克隆胸苷激酶缺陷株使其對HAT敏感;與此相似，使產(chǎn)生抗纖維蛋白特異性抗體的HAT抗性雜交瘤對8-氮鳥嘌呤(后面縮寫為AZG)有抗性，然后克隆次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶缺陷株使其對HAT敏感;根據(jù)標準方法使這兩個克隆的雜交瘤融合而得到四雜交瘤，用補充有HAT的培養(yǎng)基對其進行篩選，選出分泌能與纖維蛋白和血栓溶解物質(zhì)二者結(jié)合的雜種MoAb的四雜交瘤，然后克隆;②用熒光素異硫氰酸酯(后面縮寫為FITC)標記產(chǎn)物抗纖維蛋白特異性抗體的雜交瘤，用四甲基若丹明異硫氰酸酯(后面縮寫為TRITC)標記產(chǎn)生針對血栓溶解物質(zhì)的抗體的另一個雜交瘤，然后根據(jù)標準方法使這兩個雜交瘤融合;將得到的細胞懸浮液加到熒光素活化細胞分選儀(后面縮寫為FACS)中，選擇和克隆同時具有FITC綠色熒光和TRITC紅色熒光的四雜交瘤。也可以反過來利用兩種親本株的標記來選擇和克隆四雜交瘤。
用這些方法進行細胞融合時，可以使用促融合劑如仙臺病毒或PEG、電激或其他方式。優(yōu)選使用PEG。下面給出了一個實例，但它并不限制本發(fā)明。通常使用聚合度約為1，000-6，000的PEG，濃度約為10-80%，處理時間約為0.5-30分鐘。在優(yōu)選條件下可達到高效率融合，例如，保持約35-55%的PEG6，000，與細胞于37℃下接觸約4-10分鐘。
可用上述補充有HAT的培養(yǎng)基等選擇多雜交瘤。為此目的，用8-AZG、6-硫鳥嘌呤(6-TG)或5-BrdU進行化學(xué)適應(yīng)，得到對各化學(xué)試劑具抗性的細胞株。通過在融合細胞中導(dǎo)入新標記可使用各種選擇培養(yǎng)基。這類選擇培養(yǎng)基的實例包括補充有新霉素的培養(yǎng)基和補充有潮霉素B的培養(yǎng)基(B.Sugden等人，MolecularandCellularBiology5∶410，1985)。
還有另一種已知方法，就是使用不同熒光染料標記的兩個雜交瘤相互融合，然后用FACS選擇雙標記的雜種雜交瘤(L.Karawajew等人，J.ofImmunologicalMethods96∶265，1987)。
可用各種方法篩選生產(chǎn)雜種抗體的雜交瘤。例如，可以將下列方法經(jīng)適當組合或修改后加以使用①結(jié)合使用分別用于篩選產(chǎn)生抗纖維蛋白特異抗體的雜交瘤和用于篩選產(chǎn)生針對血栓溶解物質(zhì)抗體的雜交瘤的上述EIA法;②檢測雙特異性雜種抗體的EIA法，即當所用針對血栓溶解物質(zhì)的抗體與抗纖維蛋白特異性抗體屬于不同的亞類時，將有關(guān)培養(yǎng)上清液加至偶聯(lián)有纖維蛋白的微量滴定板上，然后加入HRP標記的血栓溶解物質(zhì);③檢測雙特異性抗體的EIA法，即將有關(guān)培養(yǎng)上清液加至偶聯(lián)有纖維蛋白的微量滴定板上，然后加入HRP標記的抗小鼠IgG亞類特異性抗體。
將對于雜種抗體活性呈陽性的多雜交瘤立即進行克隆，此過程一般很容易通過有限稀釋分析等完成。用上述方法測定克隆的多雜交瘤培養(yǎng)上清液的抗體效價，選擇出穩(wěn)定產(chǎn)生高效價抗體的多雜交瘤，即可得到所需的產(chǎn)生單克隆雜種抗體的多雜交瘤。
本發(fā)明的上述多雜交瘤一般可用已知方法在液體培養(yǎng)基或動物(如哺乳動物如小鼠)腹膜腔內(nèi)培養(yǎng)?？梢越Y(jié)合使用已知的生化技術(shù)從培養(yǎng)液和腹水液中純化出抗體。例如，離心細胞培養(yǎng)液或腹水液;取出得到的上清液進行鹽析(通常使用硫酸銨或硫酸鈉)。將產(chǎn)生的蛋白沉淀溶于適當?shù)娜芤褐胁⑼肝觯缓笸ㄟ^柱層析(離子交換柱、凝膠過濾柱、A蛋白柱、羥磷灰石柱等)分離和純化所需抗體。例如，通過這種分離純化步驟從1升培養(yǎng)上清液中大約產(chǎn)生1-5mg雜種MoAb，以蛋白重量計，純度在80%以上。從20ml腹水液中可得到產(chǎn)率為3-10mg的同樣抗體。
這樣得到的雜種MoAb是一種均一蛋白;它用蛋白酶(如胃蛋白酶)等處理時產(chǎn)生能與纖維蛋白和血栓溶解物質(zhì)二者結(jié)合的F(ab′)2或其他片段，它們都可象本發(fā)明的雜種MoAb一樣用于同樣的目的。
根據(jù)上述方法制備的產(chǎn)生雜種抗體的多雜交瘤實例包括下面實例4、5和13中所述的四雜交瘤。
除了由抗纖維蛋白MoAb生成雜交瘤和產(chǎn)生針對血栓溶解物質(zhì)的抗體的另一雜交瘤形成的四雜交瘤，也就是上面作為例子提及的生產(chǎn)本發(fā)明雜種MoAb的多雜交瘤以外，還可以使用由產(chǎn)生一種MoAb的雜交瘤與產(chǎn)生另一種MoAb的細胞所形成的三雜交瘤、通過使產(chǎn)生不同MoAb的細胞融合(在用EB病毒等永久化以后)而得到的雜交瘤及其他雜交瘤，它們都可用于同樣的目的，只要它們能產(chǎn)生本發(fā)明的雜種MoAb就行。
如果這些多雜交瘤產(chǎn)生小鼠IgGMoAb，則能夠制備一種小鼠-人嵌合抗體，方法是制備一個編碼可變或高可變區(qū)的DNA，該區(qū)含有這種雙特異性雜種MoAb的抗原識別位點，然后利用基因操作技術(shù)(Z.Steplewski等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85∶4852，1988)使該DNA與編碼人IgG恒定區(qū)的基因結(jié)合。優(yōu)選使用這種嵌合抗體是因為它施用于人時的抗原性較低。
有一些已知方法可用來本發(fā)明的雙特異性雜種MoAb或由血栓溶解物質(zhì)和雙特異性雜種MoAb制備的選擇性血栓溶解蛋白復(fù)合物進行血栓溶解治療，這些方法包括①預(yù)先對血栓病患者施用本發(fā)明的雜種MoAb，在一段足夠長的時間后施用血栓溶解物質(zhì)如TPA或UK，使它與病人體內(nèi)形成的血栓結(jié)合;②對血栓病患者同時施用雜種MoAb和血栓溶解物質(zhì);③預(yù)先使雜種MoAb和血栓溶解物質(zhì)反應(yīng)，分離出未反應(yīng)的血栓溶解物質(zhì)后，給血栓病患者施用所得到的選擇性血栓溶解蛋白復(fù)合物。
本發(fā)明的血栓溶解藥劑、雜種MoAb或血栓溶解物質(zhì)可直接制成注射劑等，或在用濾膜等過濾除去細菌(這是必需的步驟)以后與藥學(xué)上可接受的適當載體、賦形劑、稀釋劑等混合，施用給哺乳動物(例如小鼠、大鼠、貓、狗、豬、牛、猴、人)，以達到治療血栓或阻塞性疾病的目的，例如治療心肌梗塞、外周動靜脈梗阻、視網(wǎng)膜動靜脈梗阻、大腦梗塞和肺栓塞。
雖然本發(fā)明的血栓溶解藥劑的日劑量取決于疾病的種類、癥狀和施用途徑，但對成年心肌梗塞患者的靜脈施用劑量一般是(例如)對于雜種MoAb來說大約0.02-1mg/kg，優(yōu)選大約0.04-0.4mg/kg;對于血栓溶解物質(zhì)來說，TPA大約為0.01-0.5mg/kg，優(yōu)選大約0.02-0.2mg/kg，UK大約為0.01-0.5mg/kg，優(yōu)選大約0.02-0.2mg/kg。
本發(fā)明的雜種MoAb能夠與纖維蛋白特異結(jié)合，而基本上不與纖維蛋白原反應(yīng)，并且能與血栓溶解物質(zhì)特異結(jié)合而不破壞其纖維蛋白溶解能力。因此能夠容易地制備雜種MoAb與血栓溶解物質(zhì)1∶1的免疫復(fù)合物;它們的結(jié)合使用能夠?qū)ρㄟM行選擇性和高效率的溶解或去除。
通過上面所述的方法，使用本發(fā)明的雜種MoAb并結(jié)合使用一種血栓溶解物質(zhì)，能夠?qū)ρㄟM行選擇性和高效率的溶解或去除，所述雜種MoAb能夠與目標血栓部位特異結(jié)合，而基本上不與纖維蛋白原結(jié)合。
實例下面通過參考實例和工作實例對本發(fā)明進行更詳細的描述;這些實例并不限制本發(fā)明的范圍。
實例中所用的動物細胞系都如下表所示進行了保藏。
動物細胞系(IFO)IFO編號(FRI)FERM編號小鼠雜交瘤FIB1-1150174BP-2081小鼠雜交瘤FIB2-1150175BP-2082小鼠雜交瘤TPA1-4150178BP-2085小鼠雜交瘤TPA1-7050179BP-2086小鼠雜交瘤TPA2-1450194BP-2519小鼠雜交瘤UK1-350176BP-2083小鼠雜交瘤UK1-8750177BP-2084小鼠雜交瘤UK1-650208BP-2548小鼠雜種雜交瘤(四雜50180BP-2158交瘤)FT2-14小鼠雜種雜交瘤(四雜50185BP-2334交瘤)FU1-74小鼠雜種雜交瘤(四雜50207BP-2547交瘤)FU2-16IFO大阪發(fā)酵研究所FRI國際工貿(mào)部發(fā)酵研究所在本說明書中，氨基酸和肽采用由IUPACIUB生化命名委員會(CBN)認可的簡寫系統(tǒng)來簡寫表示;下面給出了簡寫的實例。注意，如果在特定氨基酸等中可能存在有光學(xué)異構(gòu)體，則都是L-異構(gòu)體，除非特別指出。
Gln谷氨酰胺殘基Asp門冬氨酸殘基Pro脯氨酸殘基Tyr酪氨酸殘基Val纈氨酸殘基Lys賴氨酸殘基Glu谷氨酸殘基Ala丙氨酸殘基Asn門冬酰胺殘基Leu亮氨酸殘基Phe苯丙氨酸殘基Gly甘氨酸殘基His組氨酸殘基Ser絲氨酸殘基Thr蘇氨酸殘基Ile異亮氨酸殘基Trp色氨酸殘基Arg精氨酸殘基Met蛋氨酸殘基Cys半胱氨酸殘基參考實例1測定抗纖維蛋白抗體的EIA在96孔微量滴定板上以每孔50μl加入在磷酸緩沖液(PBS，pH7.3)中的1mg/ml人纖維蛋白單體溶液，其中含有3.3M脲和0.01%EDTA。將此微量滴定板于4℃下放置過夜，加入150μl含有2%酪蛋白和0.01%水楊乙汞的PBS，制備出敏化平板。然后，將在PBS中的10mg/ml人纖維蛋白原溶液(含有100單位/ml肝素和3mM苯甲磺酰氟)與等量的有關(guān)雜交瘤培養(yǎng)上清液混合。在室溫下反應(yīng)30分鐘后，在上述經(jīng)纖維蛋白敏化的平板中加入100μl混合物，然后在室溫下保溫2小時。用含有0.05%吐溫20的PBS(PBS-TW)充分洗滌平板后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗小鼠IgG抗體，然后于室溫下反應(yīng)2小時。
洗滌平板后，在每孔中加入含有作為酶底物的鄰苯二胺和H2O2的0.1M檸檬酸緩沖液，然后在室溫下進行酶反應(yīng)。加入1N硫酸終止反應(yīng)，用Multiscan(由Flow Co.生產(chǎn))在492nm波長下對成色色素進行定量。
參考實例2測定抗TPA抗體的EIA在96孔微量滴定板上以每孔100μl加入5μg/mlTPA溶液，于4℃放置過夜，然后加入150μl含有2%酪蛋白和0.01%水楊乙汞的PBS，制得敏化平板。除去上述溶液并用PBS-TW洗滌平板后，加入100μl有關(guān)雜交瘤培養(yǎng)上清液，在室溫下反應(yīng)2小時。然后，用參考實例1的方法進行酶反應(yīng)，并測定抗體效價。
參考實例3測定抗UK抗體的EIA
用與參考實例2相同的方法制備UK敏化平板，但用UK代替TPA，然后用相同方法測定抗UK抗體的效價。
參考實例4測定抗纖維蛋白-抗TPA雜種抗體的EIA①如參考實例1制備纖維蛋白敏化平板，加入有關(guān)雜交瘤培養(yǎng)上清液，然后于室溫下反應(yīng)2小時。用PBS-TW洗滌平板后，加入生物素標記的TPA，然后于室溫下反應(yīng)2小時。然后加入抗生物素蛋白-HRP復(fù)合物，然后在室溫下反應(yīng)1小時。用參考實例1的方法測定與固相結(jié)合的HRP活性。
參考實例5測定抗纖維蛋白-抗UK雜種抗體的EIA①使用參考實例4中的方法，但用生物素標記的UK代替生物素標記的TPA。然后，以相同方式測定抗生物素蛋白-抗UK雜種抗體的效價。
參考實例6纖維蛋白溶解中和測試在TPA溶液(終濃度20ng/ml)或UK溶液(終濃度25ng/ml)中加入有關(guān)雜交瘤培養(yǎng)上清液的稀釋液，然后于37℃反應(yīng)1小時。然后將反應(yīng)混合物以每孔5μl加至纖維蛋白-瓊脂糖平板上，然后于37℃保溫2-6小時。測量產(chǎn)生的纖維蛋白溶解斑的直徑，確定雜交瘤培養(yǎng)上清液中MoAb中和TPA或UK酶活性的能力。
參考實例7測定抗纖維蛋白-抗TPA雜種抗體的EIA②如參考實例2制備TPA致敏平板，加入含有雜種抗體的有關(guān)溶液，然后于室溫下反應(yīng)2小時。用PBS-TW洗滌平板后，加入HRP標記的抗小鼠IgG1(γ1鏈特異性)抗體(可由Cosmo-BioK.K.購得)，然后于室溫下反應(yīng)2小時。用PBS-TW充分洗滌平板后，用參考實例1的方法測定與固相結(jié)合的HRP活性。
參考實例8測定抗纖維蛋白-抗TPA雜種抗體的EIA③如參考實例2制備TPA致敏平板，加入含有雜種抗體的有關(guān)溶液，然后于室溫下反應(yīng)2小時。用PBS-TW洗滌平板后，加入實例1-①所述的用生物素標記的人纖維蛋白β鏈N端肽(1-11)-BSA復(fù)合物，然后于室溫下反應(yīng)2小時。然后加入抗生物素蛋白-HRP復(fù)合物，然后于室溫下反應(yīng)1小時;用參考實例1的方法測定與固相結(jié)合的HRP活性。
參考實例9測定抗纖維蛋白-抗UK雜種抗體的EIA②如參考實例3制備UK致敏平板，加入含有雜種抗體的有關(guān)溶液，然后于室溫下反應(yīng)2小時。用PBS-TW洗滌平板后，加入實例1-①所述的用生物素標記的人纖維蛋白β鏈N端肽(1-11)-BSA復(fù)合物，然后于室溫下反應(yīng)2小時。然后加入抗生物素蛋白-HRP復(fù)合物，然后于室溫下反應(yīng)1小時;用參考實例1的方法測定與固相結(jié)合的HRP活性。
參考實例10測定抗低分子量UK抗體效價的EIA如參考實例2所述，制備用低分子量UK(雙鏈低分子量UK，可得自JCRCo.)代替TPA而致敏的平板，以相同方式測定抗低分子量UK的抗體效價。
參考實例11UK酶活中和測試在UK溶液(終濃度1.7μg/ml)中加入有關(guān)抗體溶液，反應(yīng)于室溫下進行30分鐘。在反應(yīng)混合物中加入合成的肽底物S-2444(1mM，焦谷氨酰甘氨酰精氨酰對硝基苯胺，由KabiCo.生產(chǎn))。于37℃反應(yīng)15分鐘后，測量釋放出的對硝基苯胺(在405nm處的光吸收)。
實例1制備產(chǎn)生小鼠抗人纖維蛋白單克隆抗體的雜交瘤①免疫原的制備首先用GMBS使12mg/2ml牛血清清蛋白(BSA)的水溶液馬來酰亞胺化(以每摩爾BSA13摩爾的比例引入馬來酰亞胺基)，向其中加入3.3mg人纖維蛋白β鏈N端肽(1-11)-Cys，它是用肽合成儀(430A型，AppliedSystemCo.)根據(jù)已知的固相合成法制備的。然后于30℃反應(yīng)1小時，產(chǎn)生人纖維蛋白β鏈N端肽(1-11)-BSA復(fù)合物。用生理鹽水透析3次(3l×3)后，將此復(fù)合物貯存在冰凍條件下，然后作為免疫原使用。
②免疫向生理鹽水中的1mg/ml肽-BSA復(fù)合物溶液中加入等量的弗氏完全佐劑，然后在小鼠(♀，n＝10∶0.1mg/0.2ml/小鼠)背部和腹部作皮下免疫。以2-3周的間隔，通過接種與等量弗氏不完全佐劑結(jié)合的免疫原再進行5次免疫。
③細胞融合最后一次免疫3天后，切下脾臟，按標準方法制備脾細胞懸浮液(大約108個細胞)。加入2×107個小鼠骨髓瘤細胞(P3U1)后，根據(jù)Koehler和Milstein的方法(Nature 256∶495，1975)用PEG6000進行細胞融合。
融合過程完成后，將細胞混合物懸浮于HAT培養(yǎng)基中，其中含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷，然后培養(yǎng)10天。完成親本細胞的選擇后，立即用不含氨基蝶呤的HT培養(yǎng)基替換HAT培養(yǎng)基，然后作進一步培養(yǎng)。
④雜交瘤的選擇和克隆根據(jù)參考實例1所述的EIA法，測定雜交瘤培養(yǎng)上清液的抗體效價，該方法使用吸附有人纖維蛋白單體的微量滴定板作為固相。在融合10-20天后，出現(xiàn)雜交瘤并檢測出與人纖維蛋白特異結(jié)合的抗體。通過有限稀釋分析，對具有特別強親合力的雜交瘤進行克隆。
通過EIA篩選克隆的雜交瘤的培養(yǎng)上清液;選擇與人纖維蛋白有強親合力的雜交瘤。
結(jié)果得到了小鼠雜交瘤FIB1-11和FIB2-11，二者都產(chǎn)生能在高濃度纖維蛋白原存在下與纖維蛋白特異結(jié)合的MoAb。這兩個雜交瘤分別產(chǎn)生抗體FIB1-11和FIB2-11，用Ouchterlony方法鑒定，二者都是免疫球蛋白類和亞類中的IgG1。
根據(jù)參考實例1所述的EIA法，在有和沒有纖維蛋白原存在的情況下，測定這兩種抗人纖維蛋白特異性抗體FIB1-11和FIB2-11。結(jié)果示于表1。注意，用作對照的是抗人纖維蛋白原抗體FIB2-162。
表1.測定抗纖維蛋白抗體的EIA1)光吸收(492nm)單克隆抗體在沒有纖維蛋白原存在下在纖維蛋白原存在下2)FIB1-110.500.20FIB2-110.510.16FIB2-1620.320.01
1)參考實例1所述的EIA。
2)終濃度5mg/ml。
實例2產(chǎn)生小鼠抗TPA單克隆抗體的雜交瘤的制備①免疫向200μg/ml市售單鏈TPA(可得自ChuoKagakuKogyoK.K.)的生理鹽水溶液中加入等量的弗氏佐劑。在BALB/c小鼠(♀，20μg/0.2ml/小鼠)的背部和腹部皮下施用此乳液，然后以2-3周的間隔再作加強免疫。在3次加強免疫后10天，對具有最大血清抗體效價的動物靜脈施用TPA抗原溶液(50μg/0.1ml生理鹽水/小鼠)。
②細胞融合根據(jù)實例1-③所述方法進行細胞融合。
③雜交瘤的選擇和克隆根據(jù)參考實例2所述的EIA法篩選雜交瘤，使用結(jié)合有TPA的微量滴定板。然后根據(jù)實例1-④的方法得到抗TPA-MoAb生成雜交瘤。從這些雜交瘤中得到一個小鼠雜交瘤TPA1-41，它產(chǎn)生抗TPAMoAb，它與TPA特異結(jié)合而不破壞其纖維蛋白溶解能力;一個小鼠雜交瘤TPA1-70，它產(chǎn)生一種TPA中和抗體;一個小鼠雜交瘤TPA2-14，它產(chǎn)生一種TPA非中和性抗體，它與血纖維蛋白溶酶原活化因子抑制劑(PAI)競爭性地與TPA結(jié)合。用Ouchterlony方法鑒定出，分別由這三個雜交瘤產(chǎn)生的抗體TPA1-41、TPA1-70和TPA2-14分別是免疫球蛋白類和亞類中的IgG2b、IgG1和IgG1。
圖1顯示了用參考實例2所述的EIA法測定這些抗TPA特異抗體TPA1-41(-●-)和TPA1-70(-▲-)的結(jié)果。
實例3產(chǎn)生小鼠抗UK單克隆抗體的雜交瘤的制備①免疫按與實例2-①完全相同的方法進行小鼠免疫，但使用UK(由NipponSeiyaku生產(chǎn))代替實例2-①所述的TPA。
②細胞融合根據(jù)實例1-③所述方法進行細胞融合。
③雜交瘤的選擇和克隆用參考實例3所述的EIA法篩選雜交瘤，使用結(jié)合有UK的微量滴定板。然后按照實例1-④的方法獲得抗UKMoAb生成雜交瘤。從這些雜交瘤中得到小鼠雜交瘤UK1-3和UK1-87，二者都產(chǎn)生與UK特異結(jié)合而不破壞其纖維蛋白溶解能力的抗UKMoAb。用Ouchterlony方法鑒定出，分別由這兩個雜交瘤產(chǎn)生的抗體UK1-3和UK1-87分別是免疫球蛋白類和亞類中的IgG1和IgG2b。
圖2顯示了用參考實例3所述的EIA法測定這些抗UK特異抗體UK1-3(-●-)和UK1-87(-▲)的結(jié)果。
實例4具有抗TPA-抗人纖維蛋白雙特異性的雜種單克隆抗體的生產(chǎn)①細胞融合將實例1得到的產(chǎn)生抗人纖維蛋白抗體的雜交瘤FIB1-11和實例2得到的產(chǎn)生抗TPA抗體的雜交瘤TPA1-41，分別在含有0.5μg/mlFITC和1.5μg/mlTRITC的Iscove-HamF-12培養(yǎng)基中于37℃保溫30分鐘，以進行熒光染色。然后加入LSM溶液(可購自WakoPureChemicalIndustriesLtd.)，并除去死細胞。然后使這兩個雜交瘤以1∶1的比例混合在一起，然后根據(jù)實例1-③所述方法用PEG6000進行細胞融合。
于37℃保溫2小時后，將細胞混合物加到FACS中，從而得到25，000個熒光素-若丹明雙染色的細胞。在96孔微量滴定板上以每孔10個細胞接種這些雙染色細胞并進行培養(yǎng)，微量滴定板預(yù)先以5×105個細胞/孔接種小鼠胸腺細胞作為喂養(yǎng)細胞。
②雜種雜交瘤的選擇和克隆從融合1-2周后發(fā)生細胞增殖的小孔中取培養(yǎng)上清液分別進行參考實例1、2、7和8所述的EIA法，測定抗體活性。以同樣方式測定分別由實例1-④和2-③得到的雜交瘤FIB1-11和TPA1-41的培養(yǎng)上清液的抗體活性作為對照。結(jié)果示于表2。
通過有限稀釋分析，對表現(xiàn)出高雜種抗體效價的小孔進行克隆;得到所需的產(chǎn)生雙特異性抗體的小鼠雜種雜交瘤(四雜交瘤)FI2-14。
表2.由雜種雜交瘤產(chǎn)生的抗體的特異性EIA抗體效價4)抗TPA-抗TPA-抗雜交瘤培抗纖維蛋抗小鼠纖維蛋白β養(yǎng)上清液白5)抗TPA6)IgG17)鏈N端肽8)雜種雜交瘤A1)0.66 0.99 1.90 2.45雜種雜交瘤B1)0.30 0.60 0.51 2.19FIB1-112)0.29 0.00 0.01 0.00TPA1-413)0.01 1.01 0.01 0.00
1)實例4-②得到的雜種雜交瘤。
2)實例1-④得到的雜交瘤。
3)實例2-③得到的雜交瘤。
4)以492nm處的光吸收表示(見參考實例1)。
5)參考實例1所述的EIA。
6)參考實例2所述的EIA。
7)參考實例7所述的EIA。
8)參考實例8所述的EIA。
③雜種抗體的純化對6只BALB/c小鼠預(yù)先腹膜內(nèi)施用0.5ml礦物油，然后以5×106個細胞/小鼠腹膜內(nèi)接種小鼠雜種雜交瘤(四雜交瘤)FT2-14。大約10-20天后，收集20ml積存的腹水液，用50%飽和的硫酸銨進行鹽析，得到IgG組分。在20mM PBS(pH7.5)中透析后，將IgG組分加到偶聯(lián)有纖維蛋白的Cellulofine柱上，用pH2.9的0.2M甘氨酸-HCl緩沖液洗脫。在PBS中透析后，將酸洗脫組分加到偶聯(lián)有TPA的Sepharose 4B柱上，用pH2.3的0.2M甘氨酸-HCl緩沖液洗脫。洗脫液在PBS中透析，得到9.4mg雙特異性抗體FT2-14。
對得到的抗體進行參考實例8所述的EIA法;畫出雙特異性抗體的稀釋曲線。結(jié)果示于圖3。從圖3中明顯可見，所得到的抗體對TPA和纖維蛋白都表現(xiàn)出強烈的親合力。
實例5具有抗UK-抗人纖維蛋白雙特異性的雜種單克隆抗體的生產(chǎn)
①細胞融合根據(jù)實例4-①所述的方法，將實例1得到的產(chǎn)生抗人纖維蛋白抗體的雜交瘤FIB1-11和實例3得到的產(chǎn)生抗UK抗體的雜交瘤UK1-3，分別用FITC和TRITC進行熒光染色，然后用PEG6000進行細胞融合。將細胞混合物加到FACS中;選擇并培養(yǎng)雙染色的細胞。
②雜種雜交瘤的選擇和克隆從融合1-2周后發(fā)生細胞增殖的小孔中取培養(yǎng)上清液，分別進行參考實例1、3和9所述的EIA法，測定其抗體活性。以同樣方式測定分別由實例1-④和3-③得到的雜交瘤FIB1-11和UK1-3的培養(yǎng)上清液中的抗體活性作為對照。
通過有限稀釋分析，對表現(xiàn)出最大雜種抗體活性的小孔進行克隆，得到所需的產(chǎn)生雙特異性抗體的小鼠雜交瘤FU1-74。
③雜種抗體的純化根據(jù)實例4-③所述方法收集腹水液，然后用硫酸銨鹽析，用偶聯(lián)有纖維蛋白的柱和偶聯(lián)有UK的柱進行免疫親和層析;從大約20ml腹水液中得到14mg本發(fā)明的抗UK-抗人纖維蛋白雙特異性抗體FU1-74。
將得到的抗體進行參考實例9所述的EIA法;畫出雙特異性抗體的稀釋曲線。結(jié)果示于圖4。從圖4明顯可見，所得到的FU1-74抗體對UK和纖維蛋白都有很強的親合力。
實例6抗TPA-抗人纖維蛋白雙特異性抗體FT2-14的性質(zhì)①將直徑9.5mm的紙圓片浸于2mg/ml人纖維蛋白原溶液中，然后加入人凝血酶(50NIH單位/ml)，在紙圓片上形成纖維蛋白凝塊。充分洗滌后，將此偶聯(lián)有纖維蛋白的紙圓片在纖維蛋白原(3mg/ml)存在下浸于實例4-③得到的雙特異性抗體FT2-14的溶液中。用HRP標記的抗小鼠IgG2b抗體測定與紙圓片結(jié)合的抗體量。結(jié)果示于圖5。
在纖維蛋白原(3mg/ml)存在下得到的纖維蛋白親合力(■)差不多與不存在纖維蛋白原時得到的親合力(□)相等，表明本發(fā)明的FT2-14抗體特異于纖維蛋白。
實例7抗TPA-抗人纖維蛋白雙特異性抗體FT2-14的性質(zhì)②使不同濃度的TPA與實例4-③得到的雙特異性抗體FT2-14的溶液于37℃反應(yīng)30分鐘，后者的摩爾濃度為TPA的4.3倍，從而產(chǎn)生TPA和FT2-14抗體的免疫復(fù)合物(TPA/FT2-14抗體)。然后加入3mM肽合成底物S-2288(由KaviCo.生產(chǎn))，于37℃反應(yīng)2小時。在405nm處測定所釋放的對硝基苯胺的光吸收;將上述TPA-FT2-14抗體復(fù)合物的酶活性與簡單TPA作比較。結(jié)果示于圖6。
在圖6中，●顯示TPA/FT2-14抗體復(fù)合物的酶活性，○顯示簡單TPA的酶活性。結(jié)果證實，TPA即使與本發(fā)明的雙特異性抗體FT2-14結(jié)合，也完全不降低其酶活性。
實例8抗TPA-抗人纖維蛋白的雙特異性抗體FT2-14的性質(zhì)③根據(jù)已知方法(EtsukoEbisui等人，Seikagaku54∶732，1982)，將人纖維蛋白原通過結(jié)合固定在Cellulofine顆粒(可購自SeikagakuKogyoK.K.)上，然后通過加入人凝血酶使其轉(zhuǎn)化成纖維蛋白。在0.2g這種纖維蛋白-Cellulofine顆粒復(fù)合物中加入10μg/500μlFT2-14抗體溶液，然后于37℃反應(yīng)90分鐘。充分洗滌后，使反應(yīng)混合物與100ngTPA于37℃反應(yīng)40分鐘。洗滌后，使反應(yīng)混合物與加入的血纖維蛋白溶酶原(3單位/ml)于37℃反應(yīng)1小時。用FDP-EIA藥盒(由AmericanDiagnosticsCo.生產(chǎn))對釋放到上清液中的肽(纖維蛋白降解產(chǎn)物FDP)進行定量。
結(jié)果示于圖7。
TPA對用雙特異性抗體FT2-14預(yù)處理的纖維蛋白-Cellulofine顆粒比對未處理的纖維蛋白-Cellulofine顆粒有更強的效應(yīng);抗體增強了TPA的纖維蛋白溶解能力。
實例9抗UK-抗人纖維蛋白雙特異性抗體FU1-74的性質(zhì)①將2.5μlUK溶液(25ng/ml)和實例5-③得到的雙特異性抗體FU1-74的溶液(40ng/ml或160ng/ml)一起注射到參考實例6所述的纖維蛋白-瓊脂糖平板的一個孔中，然后于37℃反應(yīng)4小時。然后，測量所產(chǎn)生的纖維蛋白溶解斑，并與用簡單UK得到的纖維蛋白溶解斑比較。結(jié)果示于圖8。與簡單UK比較，與FU1-74抗體共存導(dǎo)致其纖維蛋白溶解能力提高3-5倍。
實例10抗TPA-抗人纖維蛋白雙特異性抗體FT2-14和抗UK-抗人纖維蛋白雙特異性抗體FU1-74的體外纖維蛋白溶解能力的增強使用實例8得到的纖維蛋白-Cellulofine顆粒裝填的柱分別與實例4-③得到的FT2-14(0-100μg/ml)和實例5-③得到的FU1-74(0-50μg/ml)相偶聯(lián)，然后用含有0.01%TritonX-100的PBS(PBS-T)洗滌。以200μg/400ml的量和240ml/小時的流速，對FT2-14處理柱注射TPA溶液，對FU1-74處理柱注射UK溶液。用PBS-T洗柱后，將Cellulofine顆粒載體轉(zhuǎn)移至試管中，與加入的血纖維蛋白溶酶原(4.5單位/1.5ml)于37℃反應(yīng)2小時。加入等量的6mM對脒基苯基甲磺酰氟后，用EIA藥盒(由AmericanDiagnosticaCo.生產(chǎn))測量由Cellulofine顆粒釋放出的纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)。結(jié)果示于圖9。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未用抗體處理的纖維蛋白-Cellulofine顆粒上的TPA(○)和UK(●)的纖維蛋白溶解能力相比較，在100μg/mlFT2-14處理的纖維蛋白-Cellulofine顆粒(○)中，纖維蛋白溶解能力提高3.8倍，在50μg/mlFU1-74處理的纖維蛋白-Cellulofine顆粒(●)中提高8.5倍。
實例11抗TPA-抗人纖維蛋白雙特異性抗體FT2-14的體內(nèi)血栓溶解能力的增強①家兔頸靜脈血栓模型的制備雄性家兔(2.5-3.5kg)通過腹膜內(nèi)注射戊巴比妥(90mg/1.5ml/家兔)和脲烷(1.5mg/3ml/家兔)而麻醉，然后將血液取樣插管插至右股靜脈中，在左頸靜脈中插入血液注射插管和一根棉線。在寬約3cm的區(qū)段夾住頸靜脈阻斷血流，然后依次加入生理鹽水和0.2ml含有10U/ml凝血酶的12mM CaCl2溶液洗滌血管內(nèi)部。向洗滌過的血管中注射0.2ml由股靜脈收集的自體血液。立即取下插管;連接產(chǎn)生的開口。然后將動物放置30分鐘使血液凝結(jié)。
②有關(guān)藥物溶液的注射對血栓模型家兔腹膜內(nèi)(250U/kg)和皮下(500U/kg)注射肝素;從頸靜脈摘下夾子。然后將注射針頭插入另一側(cè)的耳靜脈，然后靜脈內(nèi)注射有關(guān)藥物溶液，注射量為2ml/家兔，即總劑量體積的10%。然后持續(xù)注射剩余的90%體積，流速為6ml/小時，時間共4小時。4小時后，取出吸附于棉線上的血栓稱量其濕重。所用的有關(guān)藥物溶液是生理鹽水對照、TPA溶液(0.25mg/kg和1.0mg/kg)、FT2-14抗體溶液(1.2mg/kg)和實例4-③得到的TPA/FT2-14抗體復(fù)合物溶液(0.25mg/kgTPA+1.2mg/kgFT2-14)。結(jié)果示于圖10。
在4小時內(nèi)持續(xù)注射0.25mg/kgTPA時，對照組中的血栓濕重由61.5±7.2mg(n＝4)降至31.7±10.1mg(n＝6)。在接受0.25mg/kgTPA和1.2mg/kgFT2-14(二者以TPA為1、雙特異性抗體為2的摩爾比結(jié)合)的實驗組中，濕重變?yōu)?9.6±6.5mg(n＝7)，也就是說，血栓溶解能力被增強到幾乎與1.0mg/kgTPA實驗組的血栓濕重(15.5±5.0mg，n＝3)相等的程度。在1.2mg/kgFT2-14實驗組中，血栓濕重為41.5mg(n＝1)。
實例12產(chǎn)生小鼠抗低分子量UK單克隆抗體的雜交瘤的制備①免疫按與實例2-①完全相同的方法進行小鼠免疫，但用市售雙鏈低分子量UK(可得自JCRCo.)代替實例2-①所述的TPA。
②細胞融合根據(jù)實例1-③所述方法進行細胞融合。
③雜交瘤的選擇和克隆用參考實例10所述的EIA法用結(jié)合有低分子量UK的微量滴定板篩選雜交瘤，并進行與實例1-④相同的操作，得到產(chǎn)生抗低分子量UKMoAb的雜交瘤。從這些雜交瘤中選出小鼠雜交瘤UK1-6，它產(chǎn)生的抗低分子量UK的MoAb與UK特異結(jié)合而不損害UK的纖維蛋白溶解能力。用Ouchterlony的方法鑒定出，由這樣得到的雜交瘤產(chǎn)生的抗體UK1-6的免疫球蛋白的類和亞類是IgG1(k鏈)。
實例13具有抗UK-抗人纖維蛋白雙特異性的雜種單克隆抗體的生產(chǎn)②①細胞融合根據(jù)實例4-①所述的方法，將實例1得到的產(chǎn)生抗人纖維蛋白抗體的雜交瘤FIB1-11和實例12得到的產(chǎn)生抗低分子量UK抗體的雜交瘤UK1-6，分別用FITC和TRITC進行熒光染色，然后用PEG6000進行細胞融合。然后將細胞加到FACS中，選擇出雙染色細胞進行培養(yǎng)。
②雜種雜交瘤的選擇和克隆從融合1-2周后發(fā)生細胞增殖的小孔中取培養(yǎng)上清液分別進行參考實例1、9和10所述的EIA法，測定其抗體活性。
通過有限稀釋分析，對表現(xiàn)出最大雜種抗體活性的小孔進行克隆，得到所需的產(chǎn)生雙特異性抗體的小鼠雜種雜交瘤FU2-16。
用參考實例5所述的EIA法檢測雜種雜交瘤FU2-16的培養(yǎng)上清液。結(jié)果示于圖11。
③雜種抗體的純化用實例4-③所述的方法收集腹水液，用硫酸銨進行鹽析，用纖維蛋白偶聯(lián)柱和UK偶聯(lián)柱進行免疫親和層析，從大約20ml腹水液中得到大約23mg本發(fā)明的抗UK-抗人纖維蛋白雙特異性抗體FU2-6。
實例14抗UK單克隆抗體的性質(zhì)①分別使用結(jié)合有UK的微量滴定板和結(jié)合有低分子量UK的微量滴定板(分別敘述于參考實例3和10)，對實例3和12得到的抗UK單克隆抗體UK1-3、1-87和1-6進行EIA法，并將其親合力與UK(圖12(A))和低分子量UK(圖12(B))作比較。結(jié)果示于圖12。
UK1-3抗體不與低分子量UK結(jié)合，而UK1-87和UK1-6兩種抗體都對UK和低分子量UK表現(xiàn)出相等的反應(yīng)性。
實例15抗UK單克隆抗體的性質(zhì)②用參考實例11所述的合成肽底物S-2444對實例3和12得到的抗UK單克隆抗體UK1-3、1-87和1-6進行UK酶活中和測試。結(jié)果示于圖13。
這些抗UK單克隆抗體中沒有一個抑制UK的酶活性。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生雙特異性雜種單克隆抗體的多雜交瘤，該抗體的兩種特異性分別針對纖維蛋白和血栓溶解物質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的多雜交瘤，其特征在于，所述血栓溶解物質(zhì)是蛋白酶。
3.如權(quán)利要求2所述的多雜交瘤，其特征在于，所述蛋白酶是組織血纖維蛋白溶酶原活化因子。
4.如權(quán)利要求2所述的多雜交瘤，其特征在于，所述蛋白酶是尿激酶。
5.一種通過由產(chǎn)生抗纖維蛋白抗體的雜交瘤與產(chǎn)生抗組織血纖維蛋白溶酶原活化因子抗體的雜交瘤融合而得到的四雜交瘤，它產(chǎn)生一種雙特異性的雜種單克隆抗體，該抗體能在同一分子上與纖維蛋白和組織血纖維蛋白溶酶原活化因子二者相結(jié)合。
6.一種通過由產(chǎn)生抗纖維蛋白抗體的雜交瘤與產(chǎn)生抗尿激酶抗體的雜交瘤融合而得到的四雜交瘤，它產(chǎn)生一種雙特異性的雜種單克隆抗體，該抗體能在同一分子上與纖維蛋白和尿激酶二者相結(jié)合。
7.一種雙特異性的雜種單克隆抗體，它的兩種特異性分別針對纖維蛋白和血栓溶解物質(zhì)。
8.如權(quán)利要求7所述的抗體，其特征在于，所述血栓溶解物質(zhì)是蛋白酶。
9.如權(quán)利要求8所述的抗體，其特征在于，所述蛋白酶是組織血纖維蛋白溶酶原活化因子。
10.如權(quán)利要求8所述的抗體，其特征在于，所述蛋白酶是尿激酶。
11.一種血栓溶解藥劑，它含有如權(quán)利要求7所述的抗體和與其免疫偶聯(lián)的血栓溶解物質(zhì)。
12.如權(quán)利要求11所述的血栓溶解藥劑，其特征在于，所述血栓溶解物質(zhì)是蛋白酶。
13.如權(quán)利要求12所述的血栓溶解藥劑，其特征在于，所述蛋白酶是組織血纖維蛋白溶酶原活化因子。
14.如權(quán)利要求12所述的血栓溶解藥劑，其特征在于，所述蛋白酶是尿激酶。
15.一種生產(chǎn)能產(chǎn)生雙特異性雜種單克隆抗體的多雜交瘤的方法，該抗體的兩種特異性分別針對纖維蛋白和血栓溶解物質(zhì)，該方法包括使產(chǎn)生抗纖維蛋白抗體的雜交瘤或細胞與產(chǎn)生針對血栓溶解物質(zhì)的抗體的雜交瘤或細胞相互融合。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述血栓溶解物質(zhì)是蛋白酶。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶是組織血纖維蛋白溶酶原活化因子。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶是尿激酶。
19.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述的多雜交瘤是一種四雜交瘤，它是通過由產(chǎn)生抗纖維蛋白抗體的雜交瘤與產(chǎn)生抗組織血纖維蛋白溶酶原活化因子抗體的雜交瘤融合而得到的，該四雜交瘤產(chǎn)生一種雙特異性的雜種單克隆抗體，該抗體能在同一分子上與纖維蛋白和組織血纖維蛋白溶酶原活化因子二者相結(jié)合。
20.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述多雜交瘤是一種四雜交瘤，它是通過由產(chǎn)生抗纖維蛋白抗體的雜交瘤與產(chǎn)生抗尿激酶抗體的雜交瘤融合而得到的，該四雜交瘤產(chǎn)生一種雙特異性的雜種單克隆抗體，該抗體能在同一分子上與纖維蛋白和尿激酶二者結(jié)合。
21.一種生產(chǎn)雙特異性雜種單克隆抗體的方法，該抗體的兩種特異性分別針對纖維蛋白和血栓溶解物質(zhì)，該方法包括在液體培養(yǎng)基或動物的腹膜腔內(nèi)培養(yǎng)如權(quán)利要求15所述的多雜交瘤，從培養(yǎng)上清液或腹水液中收集所述抗體。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述血栓溶解物質(zhì)是蛋白酶。
23.如權(quán)利要求22的方法，其特征在于，所述蛋白酶是組織血纖維蛋白溶酶原活化因子。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶是尿激酶。
25.一種溶解或去除哺乳動物體內(nèi)血栓的方法，包括給所述哺乳動物施用有效量的如權(quán)利要求7所述的抗體與血栓溶解物質(zhì)的結(jié)合物。
26.如權(quán)利要求7所述的抗體與血栓溶解物質(zhì)的結(jié)合物在血栓的溶解或去除中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種雙特異性的雜種單克隆抗體，它的兩種特異性分別針對纖維蛋白和血栓溶解物質(zhì)；還提供了一種產(chǎn)生所述抗體的多雜交瘤和一種血栓溶解藥劑，該藥劑含有所述抗體和與其免疫偶聯(lián)的血栓溶解物質(zhì)。所述抗體與血栓溶解物質(zhì)結(jié)合可用于選擇性地和高效率地溶解或去除血栓。
文檔編號A61K39/395GK1041783SQ89107488
公開日1990年5月2日 申請日期1989年9月27日 優(yōu)先權(quán)日1988年9月27日
發(fā)明者巖佐進, 黑川智文, 豐田幸生 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社