專利名稱:酵母生產(chǎn)乙型肝炎表面抗原的制作方法
本發(fā)明涉及用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)乙型肝炎表面抗原。一方面，本發(fā)明涉及用酵母生產(chǎn)乙型肝炎表面抗原，另一方面，本發(fā)明涉及編碼乙型肝炎表面抗原的新DNA構(gòu)建，在又一方面，本發(fā)明還涉及用上述DNA構(gòu)建轉(zhuǎn)化的新生物。
隨著重組DNA技術(shù)在近來的發(fā)展，用微生物控制生產(chǎn)各種有用的多肽類已成為可能。許多真核多肽，例如人生長激素，白細(xì)胞干擾素，人胰島素和人胰島素原早已可用微生物生產(chǎn)了。繼續(xù)使用現(xiàn)有的技術(shù)已被期望在將來能用微生物生產(chǎn)其他有用的肽類產(chǎn)物。這種有用的肽類產(chǎn)物之一就是乙型肝炎表面抗原。
乙型肝炎(血清肝炎)病毒在人類中傳播，并且證明它是慢性致虛弱疾病，該病逐漸導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷，早期癌，而最后至死亡。在大多數(shù)情況下，可以期望從乙型肝炎病中完全恢復(fù)。但是，在人類中的一大部分，特別是在許多非洲和亞洲國家的人群中，很多人都是慢性攜帶者，具有傳播傳染病的潛在危險(xiǎn)。
有效地預(yù)防乙型肝炎，要施用乙型肝炎病毒疫苗，而疫苗通常是高度純化的乙型肝炎表面抗原。這類乙型肝炎病毒疫苗對防止病毒的傳染是有效的。特別危險(xiǎn)的是需要輸血或透析治療的人們。從事這些工作的醫(yī)務(wù)人員等待。此外，這類疫苗對防止產(chǎn)生新的帶病者也是有效的，而且它還可以進(jìn)而從地球上徹底消滅乙型肝炎病毒。
乙型肝炎病毒還不能在細(xì)胞培養(yǎng)中傳播，因而只能從人類或高級靈長類中獲得。因此，還沒有可以獲得和保持充足的乙型肝炎病毒用以生產(chǎn)免疫乙型肝炎病毒的抗原。
乙型肝炎病毒的疫苗通常是從乙型肝炎病毒攜帶者的血漿中分離或提純乙型肝炎表面抗原而制備。由于在被提純的血漿中只有很少量的所需抗原，所以就要求這種提純方法是非常高效的。因此，迄今為止，以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)所需的乙型肝炎病毒疫苗是很困難的。
本發(fā)明的目的之一是乙型肝炎表面抗原的高產(chǎn)方法。
本發(fā)明的又一目的是制備能以高水平表達(dá)乙型肝炎表面抗原的新DNA構(gòu)建。
本發(fā)明的這些目的及其他目的在本發(fā)明的說明書和權(quán)項(xiàng)中將會(huì)清楚地表明。
根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了用培養(yǎng)酵母細(xì)胞來高水平的生產(chǎn)乙型肝炎表面抗原的方法，酵母細(xì)胞用包括乙型肝炎表面抗原編碼序列的DNA構(gòu)建所轉(zhuǎn)化，該序列受與甲醇，非分解代謝產(chǎn)物抑制性碳源和碳源缺乏起反應(yīng)的調(diào)節(jié)區(qū)控制。
圖1是畢赤(Pichia)二羥丙酮合成酶基因(DAS)調(diào)節(jié)區(qū)的限制圖譜。
圖2是初級畢赤醇氧化酶(AOX1)調(diào)節(jié)區(qū)的限制性圖譜。
圖3是畢赤p40基因調(diào)節(jié)區(qū)的限制圖譜。
圖4是質(zhì)粒pAOP2的限制性圖譜。
圖5是質(zhì)粒pBSAG5和pBSAG5Ⅰ的構(gòu)建圖。
圖6是質(zhì)粒pHBS-5的限制性圖譜。
圖7是質(zhì)粒pAOT-1的限制性圖譜。
圖8是質(zhì)粒pYJ33的限制性圖譜。
圖9表示由質(zhì)粒pSAOH5和pTHBS3建造質(zhì)粒pYM39。
圖10表示由質(zhì)粒pYM39和pPG3.2建造質(zhì)粒pYMⅠ6。
圖11表示由質(zhì)粒pYMⅠ6和pBSAG5Ⅰ建造質(zhì)粒pBSAGⅠ5Ⅰ。
圖12表示將質(zhì)粒pBSAGI5Ⅰ的一部分插入到畢赤染色體的初級醇氧化酶(AOX1)位置。
圖13是質(zhì)粒pTHBS3的建造過程。
以下的縮寫是用在附圖中代表所用的限制性酶。
縮寫 限制性酶As AsuⅡB BamHⅠB2BglⅡBc BclⅠC ClaⅠH2HincⅡH3HindⅢK KpnⅡNd1NdeⅠNr NruⅠPs PstⅠPv1PvuⅠPv2PvuⅠⅡR1EcoRⅠR5EcoRVS SalⅠSp SphⅠSs SstⅠSt StuⅠXb XbaⅠXh XhoⅠ
在附圖中，對用于操作DNA片段但在連接時(shí)被去掉的限制性位點(diǎn)，用將縮寫符號(hào)包圍在括號(hào)中的形式來指明去掉的位點(diǎn)。
本發(fā)明提供了一種新的DNA片段，該片段包括一個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)和一個(gè)多肽編碼區(qū)，其中的多肽編碼區(qū)編碼乙型肝炎表面抗原或其一部分，而調(diào)節(jié)區(qū)一旦處于多肽編碼基因的5′末端時(shí)，它就能控制信使RNA的轉(zhuǎn)錄。調(diào)節(jié)區(qū)，乙型肝炎表面抗原(HBs Ag)基因，以及轉(zhuǎn)錄終止片段的組合，在此后被作為一種表達(dá)盒或表達(dá)單位。本發(fā)明中所用的調(diào)節(jié)區(qū)是對至少一種以下條件有反應(yīng)的調(diào)節(jié)區(qū)，這些條件是培養(yǎng)基中存在著甲醇，而且含有表達(dá)盒的生物與培養(yǎng)基相接觸，培養(yǎng)基中存在著非分解代謝產(chǎn)物的抑制性碳源而不是甲醇，含有表達(dá)盒的生物與該培養(yǎng)基相接觸。
培養(yǎng)基中缺乏碳怨，含有表達(dá)盒的宿主生物在經(jīng)分解代謝產(chǎn)物抑制性碳源和能量的條件下生長之后，再與缺乏碳源的培養(yǎng)基相接觸。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了新的含有上述表達(dá)盒的線形或環(huán)形的質(zhì)粒。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了用上述線形或環(huán)形質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母菌株的基本純凈的培養(yǎng)物。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，還描述了制備乙型肝炎表面抗原的方法，該方法包括，將用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的酵母菌株在能表達(dá)所需蛋白產(chǎn)物的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
本發(fā)明實(shí)踐中所用的調(diào)節(jié)區(qū)的特征在于與以下培養(yǎng)基的反應(yīng)能力，這些培養(yǎng)基含有(1)甲醇，(2)非分解代謝產(chǎn)物抑制碳源，例如甘油，半乳糖，乙酸鹽等，(3)分解代謝產(chǎn)物抑制碳源，如葡萄糖，乙醇，果糖等，然后接碳源缺乏。
滿足上述條件的示范性調(diào)節(jié)區(qū)由圖1，2，3中的限制性圖譜描繪出。圖1中所給出的調(diào)節(jié)區(qū)是由巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)二羥丙酮合成酶(DAS)基因中衍生出來的。圖2中閣出的調(diào)節(jié)區(qū)是從巴斯德畢赤酵母初級醇氧化酶(AOX1)基因中衍生出來的(Pichia有兩個(gè)醇氧化酶基因，在此稱作AOX1和AOX2)。圖3中給出的調(diào)節(jié)區(qū)是從巴斯德畢赤酵母的p40基因衍生出來的。本專業(yè)領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)知道，具有上述性質(zhì)的其它調(diào)節(jié)區(qū)可以從甲基營養(yǎng)酵母如巴斯德畢赤酵母中分離出來。這些具有與上述調(diào)節(jié)區(qū)相似性質(zhì)的調(diào)節(jié)區(qū)均屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
乙型肝炎表面抗原(HBs Ag)基因已經(jīng)被分離出(Valenzuela etal.
Nature280，815)，而且用適宜的限制性內(nèi)切酶處理載體就可獲得，這些載體舉例有pHBS-5(見圖6和Valenzuela etal，
，Nature298，347)，pHBV-T-1A(Genetech，EPA 73657)，pHBS-56(ATCC accession No40047;見EPT 12055)等。
乙型肝炎表面抗原基因用Bal31核酸外切酶處理，從該基因的5′末端去除病毒性非編碼序列而被修飾。HBs Ag基因的3′末端用核酸內(nèi)切酶酶解并加入連接子去除病毒性非編碼序列而得到修飾。乙型肝炎表面抗原基因經(jīng)進(jìn)一步修飾，以摻入易于操作DNA片段的限制性位點(diǎn)，所獲的DNA片段是EcoRⅠ-StuⅠ插入體，并具有以下的核苷序列
5′-GAATTCATGG AGAACATCAC ATCAGGATTC CTAGGACCCCTGCTCGTGTT ACAGGCGGGG TTTTTCTTGT TGACAAGAATCCTCACAATA CCGCAGAGTC TAGACTCGTG GTGGACTTCTCTCAATTTTC TAGGGGGATC TCCCGTGTGT CTTGGCCAAAATTCGCAGTC CCCAACCTCC AATCACTCAC CAACCTCCTGTCCTCCAATT TGTCCTGGTT ATCGCTGGAT GTGTCTGCGGCGTTTTATCA TATTCCTCTT CATCCTGCTG CTATGCCTCATCTTCTTATT GGTTCTTCTG GATTATCAAG GTATGTTGCCCGTTTGTCCT CTAATTCCAG GATCAACAAC AACCAGTACGGGACCATGCA AAACCTGCAC GACTCCTGCT CAAGGCAACTCTATGTTTCC CTCATGTTGC TGTACAAAAC CTACGGATGGAAATTGCACC TGTATTCCCA TCCCATCGTC CTGGGCTTTCGCAAAATACC TATGGGAGTG GGCCTCAGTC CGTTTCTCTTGGCTCAGTTT ACTAGTGCCA TTTGTTCAGT GGTTCGTAGGGCTTTCCCCC ACTGTTTGGC TTTCAGCTAT ATGGATGATGTGGTATTGGG GGCCAAGTCT GTACAGCATC GTGAGTCCCTTTATACCGCT GTTACCAATT TTCTTTTGTC TCTGGGTATACATTTAAGGC CT-3′本發(fā)明的調(diào)節(jié)區(qū)-結(jié)構(gòu)基因構(gòu)建可以提供給生物并以各種方式進(jìn)行放大，再生產(chǎn)和表達(dá)。對在酵母中自動(dòng)復(fù)制，自動(dòng)復(fù)制序列(ARS)成分是有用的。例如從巴斯德畢赤酵母中衍生出來的PARS1和PARS2(參見copending U.S.Application SN 666577，Gregginventor and assigned to Phillips Petroleum Co.)。當(dāng)需要整合性轉(zhuǎn)化宿主的時(shí)候，則就不用ARS成份。獲得整合性轉(zhuǎn)化的優(yōu)選方法已經(jīng)在序列號(hào)791013，發(fā)明人為Cregg，轉(zhuǎn)讓給菲利浦石油公司的共懸未決申請中描述了，并且包括使用定向整合載體的位點(diǎn)，其包括第一個(gè)可插入DNA片段，可選擇的識(shí)別基因，第二個(gè)可插入DNA片段。
第一和第二可插入的DNA片段各自至少長為200個(gè)核苷酸，并且具有與畢赤屬各種類的基因組DNA的某部分同源的核苷酸序列。整合性載體的各成份順序排列形成線性DNA片段，這樣，表達(dá)盒和可選擇識(shí)別基因就位于第一可插入DNA片段的3′端與第二可插入DNA片段的5′端之間。第一和第二可插入DNA片段相互按順序排列為線性片段，其定向與在畢赤基因組中相同。
在用于轉(zhuǎn)化宿主菌株的DNA中必須包括至少一種可選擇性識(shí)別基因。這就能在生物中選擇和分離出哪個(gè)生物已經(jīng)摻入了轉(zhuǎn)化性DNA。識(shí)別基因給被轉(zhuǎn)化的宿主一種它原來不具有的表型特征，例如恢復(fù)生產(chǎn)某特殊氨基酸的能力，而未轉(zhuǎn)化的宿主缺乏該特殊氨基酸的生物合成途徑。
本專業(yè)領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，其他的DNA序列也可以摻入到本發(fā)明所用的載體中去，例如細(xì)菌性質(zhì)粒DNA，噬菌體DNA等待。這些序列可以在細(xì)菌宿主中放大和保持這些載體。
本發(fā)明的上述質(zhì)粒具有在可被轉(zhuǎn)化的酵母株中的實(shí)用性。用本發(fā)明的新DNA片段對在酵母中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)可以通過將轉(zhuǎn)化的生物放在缺乏碳源的條件下來達(dá)到。在經(jīng)過分解代謝產(chǎn)物抑制性和非分解代謝產(chǎn)物抑制性碳源的生長后的碳源缺乏，誘導(dǎo)維持在本發(fā)明調(diào)節(jié)區(qū)控制之下的表達(dá)基因產(chǎn)物。另一種獲得在適宜的轉(zhuǎn)化酵母中表達(dá)所需基因產(chǎn)物的方法是讓轉(zhuǎn)化的酵母在有甲醇的條件下生長。而又一種誘導(dǎo)表達(dá)所需要基因產(chǎn)物的方法是讓轉(zhuǎn)化的酵母在含有非分解代謝產(chǎn)物抑制性碳源的培養(yǎng)基中生長。
本發(fā)明的調(diào)節(jié)區(qū)對在各種酵母中的表達(dá)是有用的，因?yàn)樵撜{(diào)節(jié)區(qū)已經(jīng)表現(xiàn)出可在各種條件下被誘導(dǎo)。因此，能在甲醇或在非分解代謝產(chǎn)物抑制性碳源中生長的酵母可被引起直接生產(chǎn)外源，即異源多肽;而能在分解代謝產(chǎn)物抑制性碳源中生長的酵母，可通過將這樣生長的酵母放在缺乏碳源的條件下而引起生產(chǎn)外源多肽。
本發(fā)明方法中優(yōu)選的轉(zhuǎn)化酵母株包括以下各屬假絲酵母 Candida克勒克酵母 Kloeckera
釀酒酵母 Saccharomyces裂殖酵母 Schizosaccharomyces紅酵母 Rhodotorula漢遜酵母 Hansenula球擬酵母 Torulopis畢赤酵母 Pichia克魯維酵母 Kluyveromyces優(yōu)選這些屬的酵母是因?yàn)樗鼈兊牟僮靼踩?，生長條件等已經(jīng)建立，并且是本專業(yè)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中所特別優(yōu)選的酵母，是那些能以甲醇為碳源和能源而生長的酵母，已知的這類酵母屬于以下各屬假絲酵母 Candida克勒克酵母 Kloeckera釀酒酵母 Saccharomyces紅酵母 Rhodotorula漢遜酵母 Hansenula球擬酵母 Torulopis畢赤酵母 Pichia由于本發(fā)明的調(diào)節(jié)區(qū)還可通過在非分解代謝產(chǎn)物抑制性碳源以及碳源缺乏條件下的生長來誘導(dǎo)，所以，能在這類非甲醇性底物，如葡萄糖乙酸鹽甘油乙醇乳糖半乳糖果糖蔗糖以及類似的底物和它們其中的任意兩種或兩種以上的混合物中生長的酵母，在本發(fā)明的實(shí)踐中也是有用的。通過將宿主生物在適宜的可抑制性非代謝分解產(chǎn)物，非甲醇性碳源，如甘油或半乳糖上生長，或通過將宿主生物在可抑制性分解代謝產(chǎn)物碳源如乙醇，葡萄糖和果糖中的生長，然后將宿主生物放在缺乏碳源的條件下，就可獲得本發(fā)明調(diào)節(jié)區(qū)控制下的基因產(chǎn)物的表達(dá)。
特別優(yōu)選的宿主酵母株是突變體巴斯得畢赤酵母GS115，它是缺失生產(chǎn)組氨酸能力的突變體。由于具有突變基團(tuán)his4，即影響組氨醇脫氫酶-編碼基因的組氨酸途徑缺失的結(jié)果而被稱為GS115。GS115是從巴斯得畢赤酵母NRRL Y-11430衍生來的，而且已儲(chǔ)存于美國研究培養(yǎng)物收集中心(Peoria，Illinois)，儲(chǔ)存號(hào)為NRRL Y-15851。這種特殊宿主的有用性在于它是在組氨酸途徑中缺失的營養(yǎng)突變體。這種宿主與含有編碼HIS4基因功能的序列(包括其它DNA序列)的載體的轉(zhuǎn)化，可以很容易地選擇出被轉(zhuǎn)化的宿主。
本發(fā)明實(shí)踐中優(yōu)選的另一酵母株是突變體巴斯得畢赤酵母GS190，這是一種缺失影響精氨琥珀酸裂解酶編碼基因的精氨酸途徑的突變體。GS190是由巴斯得畢赤酵母NRRL Y-11430中衍生出來的，并且已儲(chǔ)存在美國研究培養(yǎng)物收集中心(Peoria Illinois)，儲(chǔ)存號(hào)為NRRLY-18014。
另外一種優(yōu)選的宿主酵母是雙營養(yǎng)突變體PPF1，它是組氨酸和精氨酸途徑都缺失的突變體。PPF1在影響組氨醇脫氫酶編碼基因的組氨酸途徑和影響精氨琥珀酸裂解酶編碼基因的精氨酸途徑中雙炔失。PPF1已經(jīng)儲(chǔ)存在美國研究培養(yǎng)物收集中心(Peoria Illinois)，儲(chǔ)存號(hào)為NRRL Y-18017。
大腸桿菌(Eschenichia coli)也是本發(fā)明質(zhì)粒的適宜宿主。本專液領(lǐng)域中的技術(shù)人員知道，許多大腸桿菌菌株都是適宜的宿主。本發(fā)明中所用的幾種大腸桿菌菌株總結(jié)于下菌株名稱 儲(chǔ)存號(hào)MC1061 未知LE392 ATCC33572MM294 ATCC33626巴斯得畢赤酵母的轉(zhuǎn)化過程轉(zhuǎn)化巴斯得畢赤酵母的實(shí)驗(yàn)過程前面已經(jīng)描述了，而且以后(在實(shí)施例1中)將更為詳細(xì)地給以描述。
巴斯得畢赤酵母的轉(zhuǎn)化，可通過酶解細(xì)胞壁給出原生質(zhì)球，然后將原生質(zhì)球與轉(zhuǎn)化DNA混合，在有鈣離子和聚乙二醇存在下溫育，再于缺乏組氨酸的選擇性生長培養(yǎng)基中再生而完成。轉(zhuǎn)化DNA包括宿主菌株缺乏的HIS4基因，因而，在所用的選擇性生長培養(yǎng)基中只有轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞存活。
提取乙型肝炎表面抗原本專業(yè)領(lǐng)域中的技術(shù)人員知道有很多方法可以從單細(xì)胞轉(zhuǎn)化宿主中提取出異源蛋白質(zhì)。本專業(yè)領(lǐng)域人員所知道的任何細(xì)胞破裂和蛋白質(zhì)濃縮和(或)從破裂細(xì)胞中提取的技術(shù)都適用于回收本發(fā)明生產(chǎn)的HBs Ag。
乙型肝炎表面抗原的測定按如上所述，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在適宜的條件下生長以進(jìn)行表達(dá)。然后，破裂細(xì)胞，測定可溶性組份和不溶性組份中的HBs Ag。對可溶性組份用市售“AUSRIA
Ⅱ”分析藥盒(Abbott Laboratories)分析22納米的顆粒。對可溶性和不溶性組份都用吸印方法(Western blotting)分析單體，該方法使用抗單體形式HBs Ag的抗血清和125碘標(biāo)記的蛋白質(zhì)A。
以下參照非限定性實(shí)施例對本發(fā)明給以更為詳細(xì)的描述。
以下的縮寫用在實(shí)施例中，其含義如下SDS 十二烷磺酸鈉EDTA 乙二胺四乙酸TEMED 四甲基乙二胺DTT 二硫蘇糖醇BSA 牛血清球蛋白Et Br 溴乙烷PMSFCi 居里酶60000 來源Miles Laboratories以下實(shí)施例中所用的緩沖液和溶液的組份如下1M Tris緩沖液 121.1克Tris堿于800毫升水中;
加濃度為35%的HCl水液將PH值調(diào)節(jié)到所期望的數(shù)值;在最后調(diào)定PH值之前讓溶液冷卻至室溫，稀釋溶液至終體積為1升。
TE緩沖液 1.0毫摩爾EDTA于0.01摩爾(PH7.4)Tris緩沖液中PBS(磷酸鹽緩沖鹽水) 10毫摩爾磷酸鈉(PH7.0)0.15摩爾NaClSDS凝膠裝柱緩沖液 62.5毫摩爾Tris-HCl(PH6.8)2% SDS10%甘油100毫摩爾二硫蘇糖醇0.001%溴酚蘭
YPD培養(yǎng)基 1%細(xì)菌-酵母膏2%細(xì)菌-胨2%右旋糖SD培養(yǎng)基 6.75克不含氨基酸的酵母氮堿(DIECO)2%右旋糖于1升水中SED 1摩爾山梨醇25毫摩爾EDTA50毫摩爾DTTSCE緩沖液 9.1克山梨醇1.47克檸檬酸鈉0.168克EDTA50毫升HO用HCl調(diào)PH至5.8CaS 1摩爾山梨醇10毫摩爾CaCl2消毒過濾PEG溶液 20%聚乙二醇-335010毫摩爾CaCl210毫摩爾Tris-HCl(PH7.4)消毒過濾SOS 1摩爾山梨醇0.3xYPD培養(yǎng)基10毫摩爾CaCl2基礎(chǔ)鹽份(用于轉(zhuǎn)化的畢赤酵母的發(fā)酵生長)
基礎(chǔ)鹽 每升含量H3PO4，85% 4.2毫升CaSO4·2H2O 0.18克K2SO42.86克MgSO4·7H2O 2.34克KOH 0.65克畢赤酵母飼養(yǎng)培養(yǎng)基(用于GS115/p BSAG5的發(fā)酵生長)克/升水H3PO4(85%) 3.5毫升CaSO4·2H2O 0.15K2SO42.38Mg SO4·7H2O 1.95KOH 0.65FeSO4·7H2O 0.065CuSO4·5H2O 0.006ZnSO4·7H2O 0.020MnSO4·H2O 0.003生物素 0.000041碳源 20-100克微量鹽溶液[用于GS115(pBSAGI5Ⅰ)的生長]克/升水CuSO4·5H2O 0.06KI 0.08
Mn SO4·H2O 0.3Na2MoO4·2H2O 0.2H3BO30.02ZnSO4·7H2O 2.0FeCl3·6H2O 4.8H2SO43-5毫升/升(用于去除cloudiness)Ausria稀釋緩沖液 4.3毫摩爾Na2HPO41.5毫摩爾KH2PO42.7毫摩爾KCl0.15摩爾NaCl1%牛血清白蛋白0.02%迭氮化鈉最終PH7.4溶解性緩沖液 10mM磷酸鈉緩沖液(PH7.5)0.5M NaCl0.1% Triton X-1002mM PMSF除非另有說明，上述溶液代表所用的基本濃度(1倍)。在實(shí)施例中，如果使用的是不同的濃度，那么就以基本濃度(1倍)乘以其倍數(shù)而指出。
實(shí)施例1巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化過程A.細(xì)胞生長1.將巴斯德畢赤酵母GS115菌落(NRRL Y-15851)接種到約10mM YPD培養(yǎng)基中，在30℃下?lián)u振培養(yǎng)12-20小時(shí)。
2.過了約12-20小時(shí)后，健細(xì)胞稀釋到大約OD600值為0.01-0.1，并在YPD培養(yǎng)基中以30℃保持細(xì)胞處于對數(shù)生長期約6-8小時(shí)。
3.約6-8小時(shí)后，對100ml YPD培養(yǎng)基接種OD600為約0.1的0.5ml種子培養(yǎng)物(或相等量)。在30℃搖振12-20小時(shí)。
4.當(dāng)OD600達(dá)到約0.2-0.3(大約過16-20小時(shí))后，以1500g離心5分鐘收獲培養(yǎng)物。
B.制備原生質(zhì)球1.以10ml無菌水洗細(xì)胞一次。(在1-5步中的所有離心均是以1500g離心5分鐘)2.以10ml新制備的SED洗細(xì)胞一次。
3.以10ml 1M無菌山梨醇洗細(xì)胞二次。
4.將細(xì)胞再懸浮于10ml SCE緩沖液中。
5.加入5-10微升4mg/ml酶60000(Miles Laboratories)≡30℃培養(yǎng)細(xì)胞約30-60分鐘。
由于原生質(zhì)球的制備是轉(zhuǎn)化過程的關(guān)鍵性步驟，因此，應(yīng)按下述監(jiān)測原生質(zhì)球的形成在加入酶之前或剛剛加入之后以及在培養(yǎng)期間的不同時(shí)間，將100微升細(xì)胞等分試樣加到900微升5% SDS和900微升1M山梨醇中。當(dāng)細(xì)胞在SDS中溶胞而在山梨醇中沒溶胞的時(shí)刻(通常為培養(yǎng)的30-60分鐘)停止培養(yǎng)。
6.用1000g離心5-10分鐘將原生質(zhì)球在10ml 1M無菌山梨醇中洗兩次。(離心時(shí)間和速度可以變化;離心到足以形成原省質(zhì)球?yàn)V餅，但不能過份，以致使其受力而破裂。)7.用10ml無菌Ca S洗細(xì)胞一次。
8.將細(xì)胞再懸浮于總量為0.6ml的Ca S中。
C.轉(zhuǎn)化1.加DNA樣品(最多20微升)到12×75mm無菌聚丙烯管中。(DNA應(yīng)處在水或TE緩沖液中;為了用少量DNA獲得最大轉(zhuǎn)化率，建議將1微升5mg/ml聲破碎的大腸肝菌DNA加到每份樣品中)。
2.加100微升原生質(zhì)球到每份DNA樣品中，并在室溫條件下溫育約20分鐘。
3.加1毫升PEG溶液到每份樣品中，并在室溫條件下溫育約15分鐘。
4.以1000g離心樣品5-10分鐘，并傾析PEG溶液。
5.將樣品重新懸浮于150微升SOS中，并在室溫條件下溫育20分鐘。
6.加入850微升無菌1M山梨醇，并按如下所述將樣品等分于平板上。
D.原生質(zhì)球的再生1.再生瓊脂培養(yǎng)基的制法a.瓊脂-KCl-9克細(xì)菌-瓊脂，13.4克KCl，240毫升水，高壓消毒。
b.10X葡萄糖-20克右旋糖，100毫升水，高壓消毒。
c.10XSC-6.75克不含氨基酸的酵母氮堿，100毫升水，高壓消毒。(在高壓消毒之前或之后，加所需的氨基酸或核酸最多至200μg/ml的濃度。)d.加30毫升10X葡萄糖和30毫升10XSC到300毫升融化的瓊脂-KCl溶液中。加0.6毫升0.2mg/ml生物素和任何其它所需氨基酸或核酸至20μg.ml的濃度。將融化的再生瓊脂保存于55～60℃。
2.平板培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的樣品在轉(zhuǎn)化樣品備好前至少30分鐘，每塊平板用10毫升再生瓊脂打底層。當(dāng)轉(zhuǎn)化樣品處在SOS中的時(shí)期，將10毫升再生瓊脂的等分試樣分散到處于45-50℃水浴中的管中。將一定量的每種樣品加到處于45-50℃的10毫升融化態(tài)再生瓊脂等分試樣中，并且將它們各自傾倒在含有以10毫升固態(tài)再生瓊脂作底層瓊脂的平板上。
3.測定原生質(zhì)球制劑的質(zhì)量
取出一種樣品10微升加入990微升1M山梨醇稀釋100倍。取出稀釋液10微升再加入990微升1M山梨醇稀釋100倍。將兩種稀釋液各100微升分布在YPD瓊脂培養(yǎng)基平板上，測定存留在該制劑中的尚未形成原生質(zhì)球的全部細(xì)胞濃度。向補(bǔ)充有40微克/毫升組氨酸的10毫升再生瓊脂加入每種稀釋液各100微升以確定全部可再生的原生質(zhì)球。轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的良好值是1-3×107總可再生原生質(zhì)球/毫升以及1×103總細(xì)胞/毫升。
4.在30℃溫育平板3-5天。
實(shí)施例2載體pAOP2族的建造1.質(zhì)粒p PG2.5用BamHⅠ酶解(pPG2.5質(zhì)粒是以pBR322為基礎(chǔ)的一種質(zhì)粒，它含有約2.5kbp的取自質(zhì)粒p PG4.0的EcoRⅠ-SaLI片段，該質(zhì)粒含有初級醇氧化酶基因(AOX1)和調(diào)節(jié)區(qū)，其可以自美國研究培養(yǎng)物收集中心NRRL-15868大腸桿菌宿主中獲得);
2.線性化的質(zhì)粒用BAL31酶解;
3.所獲DNA用Klenow片段處理以增加平整末端，并與EcoRⅠ連接子連接;
4.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MM294品系中;
5.轉(zhuǎn)化體用群落雜交技術(shù)篩選，該技術(shù)使用了具有以下序列5′TTATTCGAAACGGGAATTCC的合成性寡核苷酸。該寡核苷酸含有AOX1啟動(dòng)子直至(但不包括)ATG起始密碼子的序列，將其與EcoRⅠ連接子序列相融合;
6.用Maxam-Gilbert技術(shù)對陽性菌落測定其順序。全部三個(gè)陽性菌落均具有以下序列;
5′…TTATTCGAAACGAGGAATTCC…3′。
它們均保留有ATG中的“A”(在上邊的序列中下邊有橫線者)。據(jù)認(rèn)為，這個(gè)A不是有害性的;因此，所有的亞菌落都是從這些陽性菌落衍生出的。這些菌落分別定名為pAOP1，pAOP2和pAOP3。
7.用BAL31/連接子-酶聯(lián)產(chǎn)物篩選而鑒定了另外兩個(gè)菌落。它們具有如下的序列5′…TAATTATTCGGAATTCC…3′pAOX1 EcoRⅠ這些菌落被定名為pAOP5和pAOP6。
在上述方法的一個(gè)改型中，用AsuⅡ取代BamHⅠ來切開質(zhì)粒pPG2.5，線性化的片段用Klenow片段處理(不需上述的BAL31處理)，然后與EcoRⅠ連接子相連接。所獲的質(zhì)粒含有AOX1啟動(dòng)子序列，而沒有ATG起始密碼子。這樣制備的質(zhì)粒已被定名為pAOP4，它含有以下序列5′…TAATTATGGAATTC…3′pAOX1 EcoRⅠAOX1啟動(dòng)子(pAOX1)對碳代謝抑制的反應(yīng)是酶合成的嚴(yán)重中止。此外，AO啟動(dòng)子對碳缺乏起反應(yīng)。在甲醇上的生長導(dǎo)致進(jìn)一步誘導(dǎo)AOX1啟動(dòng)子。然而，正如Ellis，Brust，Kortz，Waters，Harpold和Gingeras在1985年5月的《分子和細(xì)胞生物學(xué)》第1111-1121頁中所揭示，更廣泛的研究已清楚地表明，本發(fā)明中所用的AOX1啟動(dòng)子片段所受的調(diào)控方式與染色體中AOX1啟動(dòng)子的相同。在本實(shí)施例中所述的被制備的和被分離的菌落顯示出了如AOX1啟動(dòng)子本身那樣的對代謝抑制，碳缺乏和甲醇誘導(dǎo)的反應(yīng)。
AO終止子用作AO終止子的StuⅠ-HindⅢ片段含有為了AOX1mRNA轉(zhuǎn)錄本聚腺苷化提供模板的序列。該序列包括有
TATGTATAGGATTTTTTTTGTC-聚腺苷當(dāng)StuⅠ-HindⅢ片段位于質(zhì)粒3′上與多肽編碼區(qū)相接時(shí)，它就促進(jìn)RNA終止。AOX1終止序列已經(jīng)被分離出，而且可以從質(zhì)粒pPG3.2中收回，該質(zhì)粒是以質(zhì)粒pBR322為基礎(chǔ)的含有AOX1終止序列的質(zhì)粒。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主中，并已按專利申請程序儲(chǔ)存于美國研究培養(yǎng)物收集中心，儲(chǔ)存號(hào)為NRRL B-15999，從而向公眾公開了。
實(shí)施例3本實(shí)施例的主題是制備質(zhì)粒，其中各步驟中所用的序列總結(jié)于附圖5中。
pBSAG5和pBSAG5Ⅰ的建造1.pCFL2的建造載體pAOP2含有3′端缺失了ATG中的TG的AOX1啟動(dòng)子，用HincⅡ切該載體。含有啟動(dòng)子的DNA片段被分離出來，并將其連接到pBR322中，該pBR322已預(yù)先用HindⅢ酶切過并填補(bǔ)了Klenow片段。這一反應(yīng)制造出了pCFL2載體。
2.pBSAOP2的建造pBR322-BglⅡ是PvuⅡ位點(diǎn)被BglⅡ位點(diǎn)取代了的pBR322，用EcoRⅠ和ClaⅠ酶解之。在連接反應(yīng)中，將該線性化的質(zhì)粒與由pCFL2來的含有5′AOX1的ClaⅠ/EcoRⅠ片段相結(jié)合。所獲的載體定名為pBSAOP2。
3.pBSAG22的建造質(zhì)粒pHBS-5(由Valenzuela等人在《Nature》298，347-350
中揭示，參見圖6)含有插入到pBR322中EcoRⅠ位點(diǎn)上的HBSAg基因，將其用ClaⅠ酶解。用Bal31核酸外切酶在兩個(gè)方向上除去大約60個(gè)堿基對。剩下的DNA片段用BamHⅠ酶解并填補(bǔ)以Klenow片段。連接后，將大約200個(gè)轉(zhuǎn)化體用NcoⅠ酶切。將這些線性化的質(zhì)粒分離出來在連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，大約有全部質(zhì)粒(定名為pBSAG1)的10%具有新創(chuàng)造的NcoⅠ位點(diǎn)。pBSAG1用NcoⅠ酶解，填補(bǔ)以Klenow片段并用BamHⅠ酶解。該質(zhì)粒片段與預(yù)先用EcoRⅠ酶解過的pBSAOP2相連接，填補(bǔ)以Klenow片段并用BamHⅠ酶解。所獲的載體定名為pBSAG22。
4.pBSAG4，pBSAG5，pBSAG5Ⅰ的建造質(zhì)粒pAOT-1(它是以質(zhì)粒pBR322為基礎(chǔ)的，連接有質(zhì)粒pPG3.2的1.6Kbp SalⅠ-HindⅢ片段的質(zhì)粒，質(zhì)粒pPG3.2存在于大腸桿菌宿主中，以儲(chǔ)存號(hào)NRRL B-15999而可獲得)進(jìn)入一個(gè)用SalⅠ-HindⅢ切過的pBR322△EcoRⅠ中(即，去掉了EcoRⅠ位點(diǎn)的質(zhì)粒pBR322，見圖7)，該質(zhì)粒帶有3′-AOX1轉(zhuǎn)錄終止片段，并被XbaⅠ和PstⅠ切過。含有終止子的片段與預(yù)先經(jīng)XbaⅠ和PstⅠ切過的pBSAG22相連接，得到pXP-1。pBSAG22用DraⅠ酶解，然后加上StuⅠ連接子，最后，StuⅠ和EcoRⅠ用于進(jìn)一步的酶解。將HBs Ag基因分離出來，并連接到預(yù)先經(jīng)StuⅠ和EcoRⅠ切過的pXP-1中，得到pBSAG4。
從pBSAG4來的含有HBs Ag的ClaⅠ片段被連接到pYJ33的獨(dú)特的ClaⅠ位點(diǎn)上(見圖8)，得到了pBSAG5和pBSAG5Ⅰ。質(zhì)粒pBSAG5Ⅰ的酶解圖見圖11。質(zhì)粒pBSAG5和pBSAG5Ⅰ的區(qū)別僅在于含有5′-AOX1/HBs Ag/3′-AOXI表達(dá)盒的ClaⅠ片段的定位方向不同。因此，在pBSAG5中，5′-AOXI片段與畢赤HIS4基因相接，而3′-AOX1片段則與自動(dòng)單位PARS2相接。質(zhì)粒pBSAG5轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主中，并已儲(chǔ)存于美國研究培養(yǎng)物收集中心，為的是公眾可以獲得并保證本申請的合法性。大腸桿菌MC1061-pBSAG5的儲(chǔ)存號(hào)是NRRL B-18028。
實(shí)施例4巴斯德畢赤酵母HBSAg表達(dá)宿主GS115(pBSAGI5Ⅰ)的建造本實(shí)施例描述了巴斯德畢赤酵母宿主的制備，該宿主中的初級醇氧化酶基因(AOX1)已被乙型肝炎表面抗原(HBs Ag)基因在畢赤染色體中所取代。
為了生產(chǎn)巴斯德畢赤酵母HBs Ag表達(dá)-AOX1-變突宿主，按圖9-11所述建造質(zhì)粒pBSAGI5Ⅰ。建造的第一步是用限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ酶解按如下所制備并總結(jié)于圖13的AOXI啟動(dòng)子-LacZ基因表達(dá)載體pSAOH5和AOXI啟動(dòng)子-HBs Ag表達(dá)載體pTHBS3。為制備pTHBS3，質(zhì)粒pAOT-1(見圖7)用StuⅠ切，連接EcoRⅠ連接子，然后用PstⅠ酶解。分離出含有3′-AOX1片段的EcoRⅠ片段。含有5′-AOX1序列的載體pAOP3用EcoRⅠ和SstⅠ切;所獲的5′-AOX1片段連接到已預(yù)先被EcoRⅠ和SstⅠ切過的大腸桿菌-釀酒酵母往復(fù)性載體pSEY101中(見Douglas et al
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，3983-3987)。pAOP3與pSEY101片段連接的結(jié)果是質(zhì)粒pTAO20。質(zhì)粒pTAO20含有URA3和氨芐青霉素基因，分別用于在釀酒酵母和細(xì)菌中進(jìn)行選擇，并含有在釀酒酵母中復(fù)制的2微米的環(huán)和5′-AOX1序列。
質(zhì)粒pTAO20用PstⅠ部分酶切。分離出線性化的載體并用EcoRⅠ切。最大的片段(其含有2微米環(huán)狀序列，URA3基因和5′-AOX1片段)與得自pAOT-1的3′-AOX1相連接，產(chǎn)生出載體pTHBS1。
含有HBs Ag的來自pHBS-5的EcoRⅠ片段被用EcoRⅠ酶解分離出來，然后與預(yù)先用EcoRⅠ酶解過并用細(xì)菌性堿性磷酸酶處理過的pTHBS1相連接。所獲的載體定名為pTHBS2，它含有在3′-和5′-AOX1序列之間插入的HBs Ag基因。
質(zhì)粒pYJ30(存在于大腸桿菌中，以儲(chǔ)存號(hào)NRRL B-15890而可獲得)用EcoRⅠ切，填補(bǔ)以Klenow片段，然后用PstⅠ切。分離出含有巴斯德畢赤酵母HIS4/PARS1的片段，并與來自載體pTHBS2(該載體含有側(cè)展是AOX1序列的HBs Ag基因)的PstⅠ-SstⅠ片段相連接。該連接的結(jié)果是質(zhì)粒pTHBS3。
經(jīng)HindⅢ酶解從pTHBS3中獲得的1.4Kbp片段(該片段含有HBs Ag基因，AOX1終止序列和部分的AOX1啟動(dòng)子序列)被回收，并被插入到來自pSAOH5的7.7Kbp片段中，該片段含有畢赤HIS4基因，大部分的AOX1啟動(dòng)子序列，以及來自pBR322的序列。然后，分離出一個(gè)9.1Kbp的重組質(zhì)粒pYM39，它含有復(fù)原的AOX1啟動(dòng)子序列。
對于建造的第二步，質(zhì)粒pPG3.2(存在于大腸桿菌宿主中，以NRRL B-15999可獲得)用PvuⅠⅠ酶解，并且將含有緊挨AOX1基因3′端的序列的1.5Kbp片段插入到pYM39的單個(gè)NruⅠ位點(diǎn)上。分離得到10.6Kbp的重組質(zhì)粒pYMⅠ6，它含有這樣定向的PvuⅡ片段，即3′AOX1基因近端序列朝向載體的HIS4基因部分。質(zhì)粒pYMⅠ6含有從畢赤宿主中缺失AOX1基因和在AOX1啟動(dòng)子控制下表達(dá)出HBs Ag所需的全部成分，但是，它不含pBSAG5的修剪過的HBs Ag基因片段。
因此，建造的最后一步是將所需的HBs Ag基因重組到缺失AOX1基因的載體中。為此，先對pYMⅠ6和pBSAG5Ⅰ(一種除了含有HBs Ag表達(dá)盒的ClaⅠ片段的以相反方向定位外，其余都與pBSAG5相同的質(zhì)粒)用限制性酶PstⅠ和SphⅠ酶解。含有修剪過的HBs Ag基因表達(dá)盒和畢赤HIS4基因的來自pBSAG5Ⅰ的6.3Kbp片段，被插入到來自pYMⅠ6并含有3′AOXⅠ序列和大部分pBR322的4.6Kbp片段中，以生產(chǎn)出最終為10.9Kbp的質(zhì)粒pBSAGⅠ5Ⅰ。質(zhì)粒pBSAGⅠ5Ⅰ攜帶于大腸桿菌宿主中，已儲(chǔ)存于美國研究培養(yǎng)物收集中心，儲(chǔ)存號(hào)為NRRL B-18021。
為了轉(zhuǎn)化巴斯得畢赤酵母his4突變系GS115(NRRLY-15851)，首先用限制酶BglⅡ酶解pBSAGⅠ5Ⅰ，得到7.2Kbp的線性載體，它的一端含有來自AOX1基因5′端的0.85Kbp序列，而另一端含有來自于AOX1基因3′端的1.1Kbp序列(見圖12)。將大約2微克經(jīng)BglⅡ切過的pBSAGⅠ5Ⅰ用選擇組氨酸原養(yǎng)型的方法轉(zhuǎn)化到GS115中。轉(zhuǎn)化產(chǎn)生大約5×103His+克隆。
將pBSAGⅠ5Ⅰ作為線性分子插入到AOX1染色體位置的轉(zhuǎn)化，結(jié)果是AOX1基因缺失。因此，發(fā)生了所需線性插入的His+-轉(zhuǎn)化系可以根據(jù)它們在甲醇中生產(chǎn)非常緩慢而鑒定出來。巴斯德畢赤酵母具有第二個(gè)“較弱”醇氧化酶基因AOX2，該基因產(chǎn)生的醇氧化酶對在缺失初級醇氧化酶基因的品系中以低速率增長的甲醇是足夠的。)鑒定不能在甲醇中良好生長的His+轉(zhuǎn)化體過程的第一步是回收處于選擇性瓊脂中的His+細(xì)胞。這一步回收是將瓊脂轉(zhuǎn)移到含有20毫升無菌水的50ml的管中，用Brin Kman攪勻器以30秒低速破碎瓊脂。將混合物通過網(wǎng)紗過濾分開細(xì)胞和瓊脂碎塊，并用30ml無菌水洗滌瓊脂。然后將酵母細(xì)胞稀釋到光密度A600＝0.1，使用Branson聲處理儀第4檔進(jìn)行聲處理10秒種以打碎酵母細(xì)胞團(tuán)，再用無菌水稀釋100倍。將10微升和100微升的等分試樣分布在瓊脂平板上，該瓊脂平板含有無氨基酸的酵母氮堿0.67%和葡萄糖0.1%。在30℃溫育3天后，對平板上出現(xiàn)的菌落根據(jù)在甲醇上的生長能力而進(jìn)行篩選，篩選方法是將這些菌落重復(fù)涂板于一下列的瓊脂板上，這些瓊脂板含有無氨基酸酵母氮堿0.67%以及下述碳源1)無碳原，2)0.5%甲醇，3)2%葡萄糖。在2%葡萄糖上能生長的菌落中有32%不能在甲醇中生長良好。
為了證實(shí)pBSAGⅠ5Ⅰ序列如圖12所示地被插入，從一種甲醇利用缺乏的巴斯德畢赤品系中提取出全部的DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶酶解，并用32磷標(biāo)記的探針以Southern blot方法雜化。在一套Southern blot中，從AOX1-品系-GS115(pBSAGⅠ5Ⅰ)，和AOX1+品系-GS115中來的DNA，被用HindⅢ酶解，并與標(biāo)記過的pPG4.0雜化，pPG4.0是一種包括AOX1基因和從大腸桿菌宿主中的pBS322質(zhì)粒中來的序列，該宿主的儲(chǔ)存號(hào)是NRRL B-15868。在含有GS115的DNA的帶上可見到編碼AOX1的2.3kbp片段。然而，在含有GS115(pBSAGⅠ5Ⅰ)DNA的帶上，該2.3kbp片斷卻不存在，而且沒有新的片段出現(xiàn)。這個(gè)結(jié)果證實(shí)，AOX1基因已從GS115(pBSAGⅠ5Ⅰ)品系中缺失了。
實(shí)施例5用HBs Ag編碼載體轉(zhuǎn)化的畢赤酵母的生長1.在發(fā)酵器中繁殖GS115(pBSAG5)10%的種菌在30℃含有酵母氮堿(YNB)+2%葡萄糖的搖瓶中過夜培養(yǎng)。該種菌加到發(fā)酵器中的無菌基礎(chǔ)鹽中(調(diào)pH為4)。葡萄糖是以0.05-0.1/小時(shí)的稀釋率加入的。當(dāng)細(xì)菌密度達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)的水平并且葡萄糖的水平低于100ppm時(shí)，將加入的碳源換為甲醇或50%葡萄糖和50%甲醇的混合物來誘導(dǎo)HBs Ag的生產(chǎn)。
2.在發(fā)酵器中生產(chǎn)GS115(pBSAGⅠ5Ⅰ)(AOX1-)將AOX1生物在甘油并接著給以含甲醇的養(yǎng)料，以批量式生產(chǎn)的方式生長，已經(jīng)得到了可溶性HBs Ag Ausria活性(3-4%可溶蛋白)的最佳表達(dá)。種菌可以在YNB+甘油上生長?；A(chǔ)鹽加甘油(1%和4%甘油)和生物素可在發(fā)酵器中高壓滅菌。冷卻后，調(diào)pH至3.5～6，在接種前加入微量鹽(2.5ml/L)。在甘油被消耗前和消耗后，可加入100%甲醇。高達(dá)2%的甲醇不影響HBs Ag的積聚，積聚時(shí)間可長達(dá)200小時(shí)。然而，發(fā)酵器中含5%的甲醇則將終止HBs Ag顆粒的積聚。
提高所加鹽分的濃度可獲得更高密度的細(xì)胞生產(chǎn)。當(dāng)在甲醇上生長時(shí)，提高鋅的水平對提高細(xì)胞密度尤為重要。當(dāng)生長不受鋅的限制時(shí)，就獲得更高水平的可被提取的Ausria活性，然而，可被提取的蛋白也更高，結(jié)果是隨可溶蛋白的百分比使凈Ausria活性值降低。
3.搖瓶培養(yǎng)GS115(pBSAG5)和GS115(pBSAGⅠ5Ⅰ)的細(xì)胞培養(yǎng)物挑出轉(zhuǎn)化的均落并劃線在SD平板上。將劃線的細(xì)胞接種于250ml搖瓶中的50mlYNB肉汁(1x YNB，5μg/ml生物素)及5%葡萄糖，在空氣搖振器上以每分鐘250周于30℃搖振過夜。早晨的OD600讀數(shù)在2-3。從搖瓶中取出約100OD600單位的細(xì)胞(約109個(gè)細(xì)胞)，放在室溫下的IEC離心機(jī)中以2000Xg離心7分鐘。細(xì)胞團(tuán)重新懸浮于在2升搖瓶的500ml肉汁+2%甘油中(OD600＝0.2)。該培養(yǎng)物在空氣搖振器中以250rpm于30℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到2-3。如果是AOX1-宿主，則從培養(yǎng)物中取出500OD600單位的細(xì)胞。該細(xì)胞懸浮液在IEC離心機(jī)上以2000Xg離心7分鐘。細(xì)胞團(tuán)重新懸浮于500ml YNB肉汁+0.5%甲醇(1.0OD600)。如果是AOX1+宿主，則取出170OD600單位的培養(yǎng)物，以相同條件離心，重新懸浮于500ml YNB肉汁+0.5%甲醇(0.3OD600)。這兩種培養(yǎng)物都放在2升的搖瓶中以250rpm于30℃搖振。每當(dāng)OD≥2時(shí)，用同樣的培養(yǎng)基稀釋兩倍。定期取出100OD600樣品，以2000Xg離心7分鐘。所獲的細(xì)胞團(tuán)可在-70℃冷凍儲(chǔ)存1-2周。
實(shí)施例6分析HBs Ag∶22nm顆粒和HBs Ag單體1.提取物的制備和蛋白確定以下的所有操作均在0-4℃進(jìn)行。將冷凍細(xì)胞團(tuán)融凍，然后用2ml冰冷溶解性緩沖液洗兩次。將細(xì)胞(100OD600單位)轉(zhuǎn)移到玻璃處置管(13×100mm)中。向細(xì)胞團(tuán)加入0.35ml溶解性緩沖液和0.5克酸洗過的玻璃珠(直徑0.45mm)。將懸浮液放在冰上的渦旋混合器中，以最高檔次搖振4次，每次一分鐘，每次之間有一分鐘間隔。移出全部細(xì)胞漿液，玻璃珠用0.35ml溶解性緩沖液洗。將洗過的緩沖液與細(xì)胞漿液合并，轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中。在Eppendorf離心機(jī)上離心15分鐘獲得提取物。將上清液(可溶性部分，0.7ml)與濾餅分開。為從濾餅中提取出HBs Ag蛋白，要將0.7ml2倍濃度的SDS溶解性緩沖液加到濾餅中，將該混合物在渦旋混合器上攪動(dòng)并煮開15分鐘?；旌衔镫x心15分鐘，然后將上清(可溶性部分)與細(xì)胞破碎物分開。用TCA沉淀和Lowry方法對可溶部分和不溶部分的等分試樣分析蛋白質(zhì)。以BSA作為蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)?？扇懿糠峙c不溶部分通常具有的蛋白濃度范圍是3-5mg/ml。
2.制備提取物方法的改型本節(jié)所描述的是從被含有編碼HBs Ag蛋白系列的載體轉(zhuǎn)化了的巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物中提取單體性異源性HBs Ag蛋白或22nm顆粒蛋白復(fù)合物的條件。
巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物生長至細(xì)胞密度為每毫升10-100OD600單位。將100OD600單位的等分試樣轉(zhuǎn)移到13×100mm的硼化硅培養(yǎng)管中，并用20體積的溶解性緩沖液洗兩次。
將細(xì)胞聚集在一起(使用IEC醫(yī)用離心機(jī))，向聚集的細(xì)胞加入0.5克用酸洗過的玻璃珠(0.5mm)，然后加入0.35ml溶解性緩沖液。以溶解性緩沖液中含有0.5MNa Cl和0.1%Triton X-100作為對照，或以含3M碘化鉀或硫氰酸鉀并有或沒有0.1% Triton X-100作為對照。所有的溶液均以10m M磷酸鈉在pH＝7.5緩沖?；旌衔镉脺u旋混合器以最大速度攪拌四次，每次離心1分鐘。在間隔期間，混合物在冰上冷卻不得少于1分鐘。當(dāng)溶胞完成后，移出破碎細(xì)胞溶液，用0.35ml溶解性緩沖液洗玻璃珠，合并兩種溶液，以13000Xg離心15分鐘。移出上清液并檢測免疫反應(yīng)性的HBs Ag顆粒(Ausria檢測)和全部的三氯乙酸(TCA)可沉淀的蛋白(Lowry)。5次試驗(yàn)的結(jié)果列于表1。
表1A B C22nm顆粒 總蛋白 22nm顆粒HBs Ag HBs Ag溶胞條件 (μg/ml) (μg/ml)重量百分比鹽濃度NaCl(0.5M)+Triton 203-249 8.6-11.2 2.1-3.2KI(3M)+Triton 5.1-150 0.85-3.4 0.5-8.1KI(3M)-Triton 71-136 2.5-4.3 2.3-7.2KSCN(3M)+Triton 2.4-50 0.6-1.9 0.8-9.6KSCN(3M)-Triton 80-125 1.6-4.3 3.8-16.7含有碘化鉀和硫氰酸鉀的條件所獲HBs Ag顆粒的結(jié)果均比使用氯化鈉的結(jié)果低(A欄)，很明顯，碘化鉀和硫氰酸鉀抑制總蛋白的釋放(B欄)，從而將顆粒的特異活性提高了2-5倍(C欄)。
3.22nm顆粒檢測(AUSRIATMⅡ藥盒)對可溶性部分用Ausria稀釋緩沖液稀釋1000至10000倍，對其25～100μl的等分試樣按如下進(jìn)行檢測第一次培養(yǎng)1.為建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將含有0.1ng至4ng的稀釋對照系列向反應(yīng)盤上的小孔底部各移液200微升(拌有4個(gè)負(fù)對照)。
對分析試樣，將200微升每種稀釋的可溶性部分移液到反應(yīng)盤上的另外小孔底部。
2.小心地向含樣品和對照的小孔中各加一粒小珠。另外，小珠可以在加入樣品和對照之前先行放入。
3.給反應(yīng)盤蓋上密封蓋，然后輕拍密封蓋，使其蓋住小珠并排除任何空氣小泡。
4.然后在45℃反應(yīng)溫育2小時(shí)。
5.去掉密封蓋。棄去液體，每個(gè)小珠用6ml蒸餾水或去離子水洗兩次。
第二次培養(yǎng)6.向每個(gè)有小珠的孔中移入200微升125I標(biāo)記的抗HBs。
7.蓋上新的密封蓋，輕拍反應(yīng)盤使其蓋住小珠并去除任何空氣小泡。
8.將反應(yīng)盤在45℃溫育1小時(shí)。
9.去除密封蓋。棄去液體，每個(gè)小珠按第5步洗4次。
10.立即將珠粒移到正確識(shí)別的計(jì)數(shù)管中。伽馬(γ)閃爍計(jì)數(shù)器讀數(shù)11.按1分鐘確定計(jì)數(shù)率。
12.在最后洗過的24小時(shí)之內(nèi)計(jì)數(shù)樣品。
使用按步驟1制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算22nm顆粒的水平。
4.單體檢測(Western檢測)等體積的25微克蛋白(溶解性或不溶性部分)，通常約2-5微升，用水補(bǔ)充為10微升。加入10微升2倍濃度的SDS凝膠裝載緩沖液(1倍緩沖液中有100mMDTT)，并將樣品煮開15分鐘。將煮開的樣品裝于12%SDS丙烯酰胺凝膠上(Laemmli)。凝膠電泳后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維紙上(Towbin et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA76，4350-4354
)。用HBs Ag抗血清(由抵抗血漿衍化的HBs Ag而產(chǎn)生)和125I標(biāo)記的蛋白質(zhì)A來測定HBs Ag。硝化纖維紙?jiān)?70℃對Kodak XAR-5底片曝光過夜。用γ計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)硝化纖維紙上的放射性譜帶而得出單體的量。以釀酒酵母(S.cerevisiae)產(chǎn)生的重組HBs Ag(100-500ng/道)作為標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例7HBs Ag在巴斯德畢赤中的表達(dá)水平由幾種轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤菌株生產(chǎn)的HBs Ag用實(shí)施例6中的分析方法，使用實(shí)施例6第一部分所述的溶解方案來檢測。結(jié)果列于表2。
表2轉(zhuǎn)化菌株 GS115(pBSAGI5Ⅰ) GS115(pBSAG5)表型 AOX1-His+AOX1+His+載體狀態(tài) 整合的 自動(dòng)的HBs Ag水平a(搖瓶)細(xì)胞/升 10111011單體(%) 7 1.522nm顆粒(%) 2.5 0.2單體(mg/l)b8.4 1.822nm顆粒(mg/l)b3 0.24HBs Ag水平a(發(fā)酵器生長)
細(xì)胞/升 3.5×10128×1012單體(%) 7 122nm顆粒(%) 2.9 0.1單體(mg/l)b294 9622nm顆粒(mg/l)b122 10a蛋白質(zhì)檢測;用Bradford方法測定。
b每升培養(yǎng)基中HBs Ag含量;OD600＝5×
細(xì)胞/ml＝0.14mg干重/ml＝0.06mg蛋白/ml。
以上的結(jié)果證實(shí)，當(dāng)在從巴斯德畢赤酵母中來的初級醇氧化酶基因(AOX1)調(diào)節(jié)區(qū)的控制下，可以在巴斯德畢赤酵母中生產(chǎn)出高水平的HBs Ag。
所提供的實(shí)施例僅僅是為了說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)被理解為是對本發(fā)明或權(quán)項(xiàng)的限制。不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和精神的變型和改型均在本發(fā)明所需要和所尋求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種DNA片段，該片段包括(a)一種調(diào)節(jié)區(qū)，該調(diào)節(jié)區(qū)當(dāng)位于多肽編碼區(qū)的5′末端時(shí)能控制信息RNA的轉(zhuǎn)錄，其中所說的調(diào)節(jié)區(qū)對以下各條件中的至少一種有反應(yīng)(1)在培養(yǎng)基中存在有甲醇，含有所述DNA片段的宿主生物與其相接觸，(2)培養(yǎng)基中存在有非分解代謝產(chǎn)物抑制性碳源而不是甲醇，含有所述DNA片段的宿主生物與其相接觸，(3)培養(yǎng)基中缺乏碳源，含有所述DNA片段的宿主生物在有分解代謝產(chǎn)物抑制性碳源和能源的條件下生長之后再與該培養(yǎng)基接觸；(b)一種多肽編碼區(qū)，該編碼區(qū)編碼乙型肝炎表面抗原或其蛋白。
2.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所說的DNA片段，其中所說的調(diào)節(jié)區(qū)的特征如圖2的限制性圖譜所示。
3.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所說的DNA片段，其進(jìn)一步包括位于多肽編碼區(qū)下游方的DNA3′序列;其中所說的DNA3′序列能控制由所述多肽編碼區(qū)編碼之信息RNA的多腺苷化和其轉(zhuǎn)錄的終止。
4.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所說的DNA片段，其進(jìn)一步包括一種或更多種另外的DNA序列，這些DNA序列來自下組細(xì)菌質(zhì)粒DNA，噬菌體DNA，酵母質(zhì)粒DNA，和酵母染色體DNA。
5.根據(jù)權(quán)項(xiàng)4所說的DNA片段，其中所說的酵母染色體DNA包括自動(dòng)復(fù)制DNA序列和識(shí)別基團(tuán)。
6.根據(jù)權(quán)項(xiàng)3所說的DNA片段，其中所說的DNA片段進(jìn)一步包括一個(gè)或更多個(gè)另外的DNA序列，這些DNA序列來自下組細(xì)菌質(zhì)粒DNA，噬菌體DNA，酵母質(zhì)粒DNA，和酵母染色體DNA。
7.根據(jù)權(quán)項(xiàng)6所述的DNA片段，其中所述的酵母染色體DNA包括自動(dòng)復(fù)制DNA序列和識(shí)別基團(tuán)。
8.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的DNA片段，其進(jìn)一步包括一系列排列的DNA，這些DNA包括第一可插入DNA片段，選擇識(shí)別基因，第二可插入DNA片段;其中所說的第一和第二可插入DNA片段各自長度至少為200個(gè)核苷酸并且具有與畢赤屬基因組DNA的蛋白同源的核苷酸序列;其中所說的DNA片段和所說識(shí)別基因位于所述第一可插入DNA片段的3′末端與所述第二可插入DNA片段5′末端之間，其中所說第一和第二可插入DNA片段相互之間的定向與它們在畢赤基因組中的定向相同。
9.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的DNA片段，其中所說的多肽編碼區(qū)基本上有700個(gè)堿基對的EcoRⅠ-StuⅠ片段組成，該片段如下5′-GAATTCATGG AGAACATCAC ATCAGGATTC CTAGGACCCCTGCTCGTGTT ACAGGCGGGG TTTTTCTTGT TGACAAGAATCCTCACAATA CCGCAGAGTC TAGACTCGTG GTGGACTTCTCTCAATTTTC TAGGGGGATC TCCCGTGTGT CTTGGCCAAAATTCGCAGTC CCCAACCTCC AATCACTCAC CAACCTCCTGTCCTCCAATT TGTCCTGGTT ATCGCTGGAT GTGTCTGCGGCGTTTTATCA TATTCCTCTT CATCCTGCTG CTATGCCTCATCTTCTTATT GGTTCTTCTG GATTATCAAG GTATGTTGCCCGTTTGTCCT CTAATTCCAG GATCAACAAC AACCAGTACGGGACCATGCA AAACCTGCAC GACTCCTGCT CAAGGCAACTCTATGTTTCC CTCATGTTGC TGTACAAAAC CTACGGATGGAAATTGCACC TGTATTCCCA TCCCATCGTC CTGGGCTTTCGCAAAATACC TATGGGAGTG GGCCTCAGTC CGTTTCTCTTGGCTCAGTTT ACTAGTGCCA TTTGTTCAGT GGTTCGTAGGGCTTTCCCCC ACTGTTTGGC TTTCAGCTAT ATGGATGATGTGGTATTGGG GGCCAAGTCT GTACAGCATC GTGAGTCCCTTTATACCGCT GTTACCAATT TTCTTTTGTC TCTGGGTATACATTTAAGGC CT-3′
10.一種質(zhì)粒，它包括權(quán)項(xiàng)1所述的DNA片段，細(xì)菌質(zhì)粒DNA，選擇性酵母識(shí)別基因，和酵母自動(dòng)復(fù)制序列。
11.根據(jù)權(quán)項(xiàng)10所說的質(zhì)粒，其中所說的質(zhì)粒是pBSAG5。
12.根據(jù)權(quán)項(xiàng)10所說的質(zhì)粒，其中所說的質(zhì)粒是pBSAG5Ⅰ，如圖11所示。
13.根據(jù)權(quán)項(xiàng)10所說的質(zhì)粒，其中所說的質(zhì)粒是pBSAGI5Ⅰ，如圖11所示。
14.一種基本純凈的畢赤屬品系培養(yǎng)物，該品系被選自以下的質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化pBSAG5，pBSAG5Ⅰ，和pBSAGI5Ⅰ。
15.一種基本純凈的被權(quán)項(xiàng)3所述DNA片段轉(zhuǎn)化的畢赤屬品系培養(yǎng)物。
16.一種制備乙型肝炎表面抗原的方法，該方法包括培養(yǎng)用權(quán)項(xiàng)10所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母，培養(yǎng)是在含有至少一種碳源子和能源的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行，碳源和能源選自甲醇，和分解代謝產(chǎn)物非抑制性碳源。
17.根據(jù)權(quán)項(xiàng)16所說的方法，它進(jìn)一步包括分離和提純所述的乙型肝炎表面抗原。
18.一種制備乙型肝炎表面抗原的方法，它包括(a)在含有至少一種分解代謝產(chǎn)物抑制性碳源和能源的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)用權(quán)項(xiàng)10所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母，(b)將(a)步的產(chǎn)物放在缺乏碳源的條件下。
19.根據(jù)權(quán)項(xiàng)18所述的方法，它進(jìn)一步包括分離和提純乙型肝炎表面抗原。
20.一種對建造表達(dá)載體有用的質(zhì)粒，該表達(dá)載體用于在畢赤AOX1調(diào)節(jié)區(qū)控制下生產(chǎn)異源蛋白，其中所述的質(zhì)粒是質(zhì)粒pAOP2，如圖4所示。
專利摘要
揭示了包括調(diào)節(jié)區(qū)和編碼乙型肝炎抗原(H Bs Ag)的結(jié)構(gòu)編碼的新DNA建造。所用調(diào)節(jié)區(qū)對甲醇，非分解代謝產(chǎn)物抑制性碳源以及分解代謝產(chǎn)物抑制性碳源并后接缺乏碳源有反應(yīng)。該新建造被摻入到各種線形和環(huán)狀質(zhì)粒中。這樣的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化適宜的宿主并最終用于高水平地生產(chǎn)和分離出乙型肝炎表面抗原。
文檔編號(hào)C12N1/16GK86107885SQ86107885
公開日1987年9月23日 申請日期1986年11月24日
發(fā)明者米格·弗里德里克·斯少普, 邁克爾·米勒·哈波爾德, 詹姆斯·邁克爾·克里格, 理查德·格登·布克霍茨 申請人:菲利普石油公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan