專利名稱：生物應答修飾因子的新穎抗體傳遞系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及免疫結合物領域，特別是用免疫結合物將生物應答修飾因子傳遞到靶組織細胞。本發(fā)明還涉及用單克隆抗體(MoAbs)與生物應答修飾因子如腫瘤壞死因子(TNF)的結合物治療癌。
生物應答修飾因子對許多細胞類型表現(xiàn)各種效應。哺乳動物的細胞產生成群的淋巴因子和細胞激活素以在細胞水平上維持體內平衡。此外，為應答各種刺激，哺乳動物細胞能產生及分泌許多蛋白產物。達生物學或藥理學濃度的生物應答修飾因子如IFN-α，IFN-β，IFN-γ，IL-1-IL-7，TNF-α及TNF-β均具有潛在的細胞毒效應。腫瘤壞死因子(TNF)是具多趨性效應的許多生物應答修飾因子中的一個。TNF的稱謂來自起初觀察到TNF引起MethA鼠肉瘤壞死。TNF的抗腫瘤作用已在為體內和體外的許多動物和人體的腫瘤細胞實驗所證。重組人體TNF已顯示能引起肉瘤、腺癌、黑素瘤壞死。TNF對細胞生長具不同的作用，對某些細胞系能引起抗生長效應，對其它細胞系無效應(即細胞抑制或細胞毒作用少于5%)，而可促進另一些細胞的生長。TNF還可能增加骨吸收及增強內皮細胞促凝血活性。還不完全知道這些多營養(yǎng)效應的機制。而另一個生物應答修飾因子IL-1，雖有一些生物學特性與TNF相同，但還有許多特性與TNF的不同。
但是，為了使生物應答修飾因子能對細胞產生作用，該生物應答修飾因子在到達靶細胞時必須具足夠的濃度，以引起所需的效應。
在最近發(fā)現(xiàn)了生物應答修飾因子和對它們的多種效應作解釋后，引起人們很高的期望，認為很難治之癥如癌癥的治愈已迫近。但是，迄今尚未證實。障礙之一可能是因為不能提供足量的生物應答修飾因子給靶組織或細胞以產生作用。當個體用藥物或其它細胞活性劑時，許多，即便不是全部，在宿主體內被稀釋，而且，在一定程度上被宿主組織所代謝。因此，在許多情況下，為了補償稀桿及非靶組織的吸收與代謝，這些細胞活性劑須以大于必需的劑量使用，以達到所需效應。
癌癥是西方死亡率和發(fā)病率中的主要原因之一。有許多不同類型的癌，每種均具有自身的特性。但是，癌至少有一特點是共同的，它們均在細胞生長調節(jié)過程中具有缺陷。乳腺癌和頸癌是引起西方婦女死于惡性腫瘤的二個主要原因。黑素瘤是影響兩性的高度轉移瘤，幾乎在診斷后五年內均能致死。已證實僅當病變未超過初級損害時，手術切除局部的癌是有效的。一旦疾病擴散，手術治療須輔以其它全身療法，以去除此病或癌細胞。最常更替用的物理療法如放射性治療或化學療法并不局限于只對腫瘤細胞的作用，雖然他們相對地對癌細胞具更大的損害作用，但也在一定程度上影響正常細胞。
許多腫瘤細胞表達膜結合的或細胞質抗原或抗原決定簇，對之正常細胞或表達微弱或根本不表達。有些腫瘤細胞表達的抗原在胚胎細胞類型中也能發(fā)現(xiàn)，但成熟動物的正常細胞不表達這些抗原。這些反常表達的抗原已知為腫瘤相關抗原(TAA)。TAA是特異的，在于雖然一種以上腫瘤可表達此特定抗原，但表達它的特定腫瘤的所有或大多數(shù)細胞往往均可表達它。一個腫瘤細胞可能表達一種或更多的TAA。這些腫瘤相關抗原可能在細胞表面表達(細胞表面抗原)，可能由腫瘤細胞分泌(分泌抗原)，或可能停留在細胞內(細胞內抗原)。人們相信細胞膜結合的或細胞表面抗原在腫瘤細胞及宿主免疫系統(tǒng)的相互作用中起主要作用，而細胞質抗原在調節(jié)腫瘤生成中起作用，因為腫瘤細胞常常大量排出這些抗原。
這些腫瘤相關抗原的存在被用來檢測、診斷和定位動物及人體的腫瘤。在有些情況下，腫瘤相關抗原的存在使特定藥物的定靶及對腫瘤細胞特異性的治療方法成為可能。
抗體通常是由動物的免疫系統(tǒng)產生的蛋白質，用以應答外來抗原或抗原決定簇?？贵w與它們所針對的特異性抗原結合。針對特異性抗原或抗原決定簇的單克隆抗體(MoAbs)可以大量制備。給癌癥患者全身使用腫瘤相關抗原的單克隆抗體后，它們局限在腫瘤中。此強有力的特性已被成功地用來攜帶直達腫瘤的藥物、毒素、或放射性同位素。
隨著抗體的發(fā)展，更可取的是隨著瞄準腫瘤細胞上抗原的MoAbs的發(fā)展，這些抗原在正常細胞上無，因而一種將化學治療劑瞄準腫瘤細胞以減少它們在正常細胞上的作用的方法已成為可能。
藥物偶聯(lián)的抗體已被用作傳遞系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)藥物瞄準抗體所針對的特定腫瘤細胞類型?？贵w也可與毒素偶聯(lián)成為傳遞系統(tǒng)，將毒素導向特異的腫瘤細胞。用抗體與藥物或毒素偶聯(lián)作為傳遞系統(tǒng)將藥物或毒素瞄準特定腫瘤的一個特別的優(yōu)點在于它能使藥物或化合物濃集在所需的位點。沒有特定的有目標的傳遞系統(tǒng)，給個體使用的化合物將分散于宿主全身，這樣，到達所需靶位點的濃度將大為稀釋。用抗體定靶系統(tǒng)將使服用的化合物與抗體附著或聯(lián)結，并結合于靶位點處的細胞，或帶至近處。由于抗體聯(lián)結所使用的化合物與靶細胞的結合率高于其它細胞，(即正常細胞)，化合物被濃集在靶位點。
已有報道將細胞毒劑與抗體連接形成免疫毒素。尤使人感興趣的是單克隆抗體與細菌或植物源性的毒素的酶活性部分(A鏈)結合形成的免疫毒素，如蓖麻蛋白或Abrin。(NevelleandYork，Immunol.Rev.(1982)62∶75-91;Rossetal.，EuropeanJ.Biochem.(1980)104;Vittetaetal.，Immunol.Rev.(1982)62∶158-183);Rossetal.，CancerRes.(1982)42∶457-464;TrowbridgeandDomingoNature(Cond.)(1981)294∶171-173)。通過將MoAbs與從植物源性毒素或毒素片段聯(lián)結制備免疫毒素。Gelonin和蓖麻蛋白是最具活性的抑制蛋白合成的植物毒素。
在美國專利申請?zhí)柕?16，595中已描述了gelonin與抗體的結合物，已報道將該結合gelonin的免疫毒素用于治療幾種類型的癌。
雖然抗體已被用作植物毒素和其它細胞毒藥物的毒性部分的傳遞系統(tǒng)，但是抗體與生物應答修飾因子如腫瘤壞死因子的結合物及將該結合物作為特定傳遞系統(tǒng)用至靶組織或靶細胞在以前未有可能。
本發(fā)明涉及生物應答修飾因子的新穎抗體傳遞系統(tǒng)。本發(fā)明還提供一種組合物，它是針對細胞相關抗原的抗體與生物應答修飾因子共價結合的免疫結合物。該抗體優(yōu)選導向一種腫瘤細胞特異的細胞相關抗原。在一實施例中，此結合物包括一抗體，優(yōu)先為單克隆抗體，與一生物應答修飾因子共價偶聯(lián)。另一方式，該結合物可為用本技術領域的人員所熟知的基因工程方法制備的融合蛋白。此種融合蛋白將包含抗體分子的抗原識別位點，及生物應答修飾因子的細胞毒的組分。
因為正常的細胞和腫瘤細胞均有生物應答修飾因子如TNF的表面受體，將TNF傳遞到特異性靶腫瘤細胞系統(tǒng)將增強用TNF治療的效果。此外，還提供了一種選擇性地將生物應答修飾因子傳送到細胞的傳遞系統(tǒng)，其間它們具非細胞毒的效應。
因為化合物在靶位點處濃集，所以，用于實現(xiàn)生物應答如殺死細胞，促進生長，或酶誘導使用的抗體結合化合物的量，要比服用非結合化合物的量低。
用化學或生物化合物的抗體結合傳遞系統(tǒng)的又一個優(yōu)點為能延長該化合物在宿主系統(tǒng)中的停留時間，因為宿主對結合化合物的代謝被降低，及/或對它的清除速率被降低。因為降低了代謝速率及/或清除速率，延長了宿主受細胞活性化合物影響的時間，因此，可服用較低劑量的細胞活性化合物以達到以前僅在用較高劑量才能達到的同樣的生物效應。生物活性化合物的代謝和清除機制一般是化合物特異性的，并且還不完全清楚。當生物活性化合物與抗體偶聯(lián)時，它的代謝及/或清除速率幾乎全部，即使不是全部是降低的。
在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種能選擇性地結合和殺死腫瘤細胞的細胞毒組合物。這些靶腫瘤細胞可為具有或產生大于正常細胞內或上的抗原標記量的任何腫瘤。雖然此抗原標記或TAA主要為細胞表面抗原，但本發(fā)明也可用于產生比正常細胞產量大的細胞內抗原的腫瘤細胞。已知許多腫瘤產生細胞內抗原，當腫瘤壞死時，或者分泌或者釋放這些抗原。本發(fā)明的免疫結合物還可定位于細胞內抗原比正常組織中濃度高的腫瘤位點處。
可以理解，本發(fā)明的免疫結合物可用于定向傳遞，不僅可將細胞毒性的生物應答修飾因子傳遞到選擇的靶細胞上，而且可選擇性地傳遞任何生物效應子到選擇的靶位點處，只要該靶位點含比其它非靶位點處濃度高的抗原標記。
在另一個實施例中，本發(fā)明提供細胞毒組合物，它們能選擇性地結合到人類乳腺癌細胞、頸癌細胞和黑素瘤細胞上，并對這些細胞有細胞毒或細胞抑制作用。
在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種殺死能表達腫瘤相關抗原的人類乳腺癌細胞、頸癌細胞，黑素瘤細胞或其它腫瘤細胞。它是通過將本發(fā)明殺死細胞有效量的免疫毒素組合物與細胞接觸完成的。
在一個實施例中，本發(fā)明的免疫結合物將細胞毒免疫結合物傳遞到表達15A8抗原的乳腺腫瘤細胞(該抗原由美國專利申請?zhí)柕?9.373，申請日為1987年3月23日所公開及保護的單克隆抗體所識別)。
在另一個實施例中，本發(fā)明提供了一種免疫結合物，它能與黑素瘤細胞結合，對其有細胞毒或細胞抑制作用。黑素瘤細胞也表達幾種TAA。Wilson等人在1981年Int.J.Cancer28∶293中描述了兩種黑素瘤抗原，及制備針對的單克隆抗體。Wilson所討論的一個抗體(225，28S)能識別黑素瘤膜抗原。此抗原命名為ZME-018。
在另一個實施例中，本發(fā)明提供了一種免疫結合物，它與表達ZME-018抗原或其功能性同等物的細胞結合，并對該細胞有細胞毒或細胞抑制作用。本發(fā)明的免疫結合物還可包含一種能識別細胞質抗原的抗體，包括但不局限于與黑素瘤細胞質抗原反應的Wilson的465.12抗體。
本發(fā)明的一個目的是提供抗體與生物應答修飾因子的結合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種組合物，它包括針對腫瘤相關抗原的抗體與生物應答修飾因子組分的結合物。
本發(fā)明的另一個目的在于提供含重組產生的化合物的組合物，該化合物包括抗體組分與生物應答修飾因子，此生物應答修飾因子可為其細胞活性部分。當所需作用是破壞靶細胞時，該部分是細胞毒部分或是當需另一種細胞活性效應時，則可能為非細胞毒的。
本發(fā)明的另一個目的是提供抗體與生物應答修飾因子或其組分的免疫結合物，所述組分選自由腫瘤壞死因子組成的一組細胞活性位點IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，TNF-α，TNF-β，IFN-α，IFN-β，IFN-λ。
本發(fā)明的另一個目的是提供治療增殖性細胞疾病例如癌的治療方法，包括在需此治療方法時，給個體使用殺死細胞有效劑量的免疫結合物，該免疫結合物包括針對靶細胞上TAA的抗體或抗體組分，與生物應答修飾因子或其細胞活性部分結合。
本發(fā)明的另一個目的是提供防止腫瘤復發(fā)的方法，它包括給需用此治療方法的個體使用TNF-結合的TAA單克隆抗體。
另一目的在于提供一種免疫結合物，該結合物是將單克隆抗體的抗原識別位點編碼的基因與為生物應答修飾因子或其細胞活性部分，如細胞激活素或淋巴因子，優(yōu)先為TNF編碼的基因融合而重組產生的一種基因融合產物。
另一個目的是提供抑制繼發(fā)性白內障形成的方法，它包括在眼球晶體手術復位后，對個體使用本發(fā)明的免疫結合物。
本發(fā)明的一個目的是提供將生物應答修飾因子選擇性傳遞到特異性靶位點的系統(tǒng)。
本發(fā)明的另一目的是防止帶腫瘤相關抗原的腫瘤復發(fā)，它是通過對需此治療方案的個體使用殺細胞的免疫結合物，該結合物包括生物應答修飾因子和抗體。該抗體優(yōu)先為單克隆抗體，該生物應答修飾因子優(yōu)先為TNF。
本發(fā)明的一個目的是提供一種能選擇性地結合和殺死腫瘤細胞的細胞毒組合物。
本發(fā)明的另一目的是提供一種對腫瘤細胞有毒，但對正常組織損害極小的組合物。
本發(fā)明的另一目的是提供一種組合物，它由針對如乳房腫瘤相關抗原或黑素瘤等的腫瘤相關抗原為目標的抗體，與生物應答修飾因子如TNF相結合。
本發(fā)明的另一目的是提供一種藥物組合物，它包括如TNF的生物應答修飾因子的位于藥學上合格的載體中的免疫結合物。


圖1顯示了ZMF-TNF反應混合物的S-300凝膠滲透層析。
圖2說明經S-300層析收集的集中組分通過親和層析后的層析圖。
圖3說明ZME-018-TNF結合物與自由的TNF與靶抗原陽性A-375細胞的結合及與抗原陰性T-24細胞結合的比較。
圖4說明ZMF-TNF免疫結合物和單TNF對抗原陽性人體黑素瘤細胞(AAB-527)的細胞毒性。
圖5說明ZMF-TNF免疫結合物對抗原陽性A-375細胞的生長抑制作用。
圖6說明MoAb15A8-TNF免疫結合物對抗原陽性ME-180細胞的生長抑制作用。
本發(fā)明的免疫化學衍生物包括針對腫瘤相關抗原的抗體與生物應答修飾因子的結合物。
可與針對腫瘤相關抗原的抗體偶聯(lián)并用于本發(fā)明的生物應答修飾因子包括，但不局限于，淋巴因子和細胞激活素如TNF(alpha或beta)，RIF，IL-2，干擾素(α，β或γ)，及IL-6。這些生物應答修飾因子對腫瘤細胞有各種作用。在這些作用中有增強對腫瘤細胞殺傷力的直接作用，也有通過增強宿主防御調節(jié)過程而增強對腫瘤細胞的殺傷力。針對腫瘤相關抗原的抗體與這些生物應答修飾因子結合將使之選擇性地定位在腫瘤中，從而在抑制對非靶細胞產生毒性的非特異性作用的同時，增進抗增殖效應。
用特異性抗體將細胞毒素傳遞到腫瘤，將保護敏感部位如肝、腎和骨髓不受天然毒劑的有害作用。用與生物應答修飾因子結合的抗體作為傳遞系統(tǒng)將允許使用較低劑量的藥物本身，因為所有毒性組分與濃集在腫瘤或其它靶位點處的抗體結合。
可用多種雙重功能蛋白偶聯(lián)劑制成單克隆抗體結合物。這些試劑例如SPDP，IT，亞氨酸酯的雙重功能衍生物，如二甲基adipimidate·HCl活性酯的二琥珀酰亞氨辛二酸酯，醛類如戊二醛，雙疊氮化合物如二(P-疊氮苯甲?；?己二胺，雙重氮衍生物如二(P-重氮苯甲酰基)-1，2-乙二胺，二異氰酸酯如亞芐基2，6-二異氰酸酯，及二-活性氟化合物如1，5-二氟-2，4-二硝基苯。
用于免疫結合物中的抗體優(yōu)先為單克隆抗體，最優(yōu)先的是針對特定病理狀態(tài)的抗體，所指病理狀態(tài)包括，但不局限于，如乳腺癌、頸癌，黑素瘤等癌癥。本發(fā)明所用的抗體也可針對非宿主源性的非細胞抗原如病毒或病毒膜抗原。當本發(fā)明的免疫結合物由非宿主抗原組成時，它提供了一種將其細胞毒或細胞抑制作用的生物應答修飾因子傳遞到感染病原體的宿主細胞的選擇性傳遞工具。
這里所說的“單克隆抗體”，是指具有同源抗體群的抗體組合物。對于抗體的來源及其制備方法不加以限制。
舉例來說，乳腺癌細胞在其細胞表面表達22/kD抗原。已制備了針對這種抗原的抗體。已融合成分泌與IgG1，IgG2a和IgG2b同型的特異性單克隆抗體的雜交瘤，此類單克隆抗體能識別此22/kD抗原的一種抗原決定簇。為了在以后的實施例中進一步描述本發(fā)明，此抗原決定簇被命名為15A8抗原決定簇。因此，所有這些抗體是在功能上是等同的。此外，在實施本發(fā)明時，與同一個抗原上不同抗原決定簇結合的抗體，即識別不同抗原決定簇的抗體也是在功能上等同的。
用本領域技術人員熟知的方法來制備單克隆抗體。制備產生例如15A8MoAb的雜交瘤細胞培養(yǎng)物的方法在美國專利申請第29，273號中作了詳細描述，該申請申請日是1987年3月23日，是美國專利申請第678，264號的部分繼續(xù)，申請日為1984年12月5日及歐洲專利申請公開號0-184-369(于1986年6月11日發(fā)表)的繼續(xù)。簡言之，將乳腺腫瘤細胞注入BALB/c小鼠的腹膜內;在三周內共注射三到四次。在最后一次注射三天后取出脾臟，制備脾細胞懸浮液，與107-PAI骨髓瘤細胞融合。在次黃嘌呤-氨基蝶呤胸腺嘧啶(HAT)培養(yǎng)基上選擇雜交細胞，對雜交瘤的制備及這些單無隆抗體的特性的進一步評述將在以下實例中提供。但是，以本技術領域熟知的任何方法制備的抗任何TAA的單克隆抗體均可在本發(fā)明的免疫結合物中使用。
“腫瘤相關抗原”是指任何在腫瘤細胞中或上的濃度顯著高于正常細胞上的抗原。雖然“腫瘤相關抗原”一般不包括病毒的或其它非宿主細胞抗原，這對本技術領域的技術人員而言，是很明了的，本發(fā)明的免疫結合物也可以將BMRS瞄準抗原濃度與普通細胞顯著不同的任何細胞。因此，本發(fā)明還可用于將生物應答修飾因子傳遞到病毒感染的細胞，到生物應答修飾因子對之有益，而不起毒性作用和其類似情況的細胞;靶細胞并不一定需是腫瘤細胞，但靶細胞需具同非靶細胞不同性質或不同量的特異性抗原決定簇。
生物應答修飾因子如TNF可從取自正常動物的血清或經已知能刺激免疫細胞增殖(誘導物)即物質、處理動物或細胞后的淋巴細胞或細胞素的培養(yǎng)上清液，或由重組技術獲得生物應答修飾因子如TNF?？梢匀魏尾溉閯游飦碓矗?，小鼠、兔、大鼠、靈長類、豬及人體中獲得生物應答修飾因子。優(yōu)先考慮從人體中獲得這些蛋白質，更優(yōu)先考慮的重組的人體蛋白。然后，獲得血清、上清液或細胞糊狀物，并分析其對靶腫瘤細胞素的生物活性。
所說的“重組蛋白質”，是指通過本技術領域所熟知的重組DNA技術制備的，具有與天然蛋白質類似的生物活性。
在本技術領域中，重組DNA技術是熟知的。一般來講，把為特定蛋白，例如干擾素或TNF編碼的基因，從它的原來質粒上切下來，插入要克隆的克隆載體中，然后插入表達載體中，用以轉化宿主生物體，優(yōu)先為微生物，最優(yōu)先為大腸桿菌，宿主生物體在一定條件下表達外源基因，以產生特定的蛋白質，如TNF或干擾素。在本發(fā)明中所用的重組產生的生物應答修飾因子不一定需要在結構上與天然蛋白一致，也不必需表達與天然蛋白生物活性一致的范圍，只要它保持傳遞到靶位點所需的活性。
生物應答修飾因子及免疫結合的生物應答修飾因子的生物活性可用本領域中的方法所測量。例如，可用在下面實例2中所述的L-929成纖維細胞分析系統(tǒng)測定TNF細胞毒活性。
抗體如15A8G2或ZMF-018用SPDP修飾，如以下實施例5所述，然后與TNF修飾的亞氨基硫羥烷(iminothiolane)結合，如以下實例3和6所述。結合TNF的抗體如以下實例7所述，在SephadexS-300柱上用柱層析法純化。
結合TNF的抗體的毒性由L-929成纖維細胞測定法測定，它的抗增殖活性由體外試驗測定。
本發(fā)明的免疫化學物能用以殺死體內和體外的腫瘤細胞。例如，在臨床情況下，當發(fā)生骨髓轉移時，可以在體外去除骨髓中的腫瘤細胞。當腫瘤對放射敏感及全身放射性治療是必需時，此舉常常是必要的。如果能去除了病人本身骨髓所有的腫瘤細胞，那么在給病人放射治療前先抽出骨髓，在體外去除腫瘤細胞，然后再輸回病人以置換被放射線所損壞的骨髓細胞。當用于在體外殺死人體乳腺癌細胞時，典型的方法是將結合物以至少約10nM的濃度加入細胞培養(yǎng)基中。體外用藥的制劑和方式均不是嚴格的。通常用的是培養(yǎng)物或灌注培養(yǎng)基相適合的水制劑。用常規(guī)技術測細胞毒性，以測定剩余的乳腺癌細胞的存在情況或程度。
對已診斷患有具特異性抗原決定簇的腫瘤的患者使用本發(fā)明的免疫結合物，將使得細胞毒劑瞄準并濃集需殺死腫瘤細胞的位點。通過細胞毒劑如此定靶，可以消除或減少對其它器官、組織和細胞的非特異性毒性。
當用于體內治療時，對病人使用有效治療量的免疫毒素(即能消除或減少病人腫瘤的量)的免疫毒素。它們通常是以非腸道的方式給藥的，或者是靜脈給藥或者是腹腔內給藥。根據(jù)癌的性質(原發(fā)性或擴散的)及它的數(shù)量，特定的免疫結合物的特性如治療指數(shù)，病人及病史來決定所用的劑量與劑量療法。使用免疫毒素的典型量在0.1到約10毫克/病人千克體重的范圍內。當非腸道使用時，免疫結合物將與藥學上合格的賦形劑配制成單位劑量注射型(溶液、懸浮液、乳劑)。這類賦形劑本來是無毒及非治療性的。舉例說這些賦形劑可以是水，鹽水，林格溶液，葡萄糖溶液，及5%人血清白蛋白。還可用非水賦形劑如不易揮發(fā)的油及油酸乙酯。脂質體也可用作載體。賦形劑還可含少量添加劑，如增強等滲性和化學穩(wěn)定性的物質，如緩沖劑及防腐劑。配于這類賦形劑中的免疫結合物的典型濃度在約0.1至10毫克/毫升間。
然后將本發(fā)明的免疫結合物置無毒的、惰性的藥學上合格的載體介質中配成制劑，優(yōu)先的pH為約3至8，更優(yōu)先的是6至8。
根據(jù)臨床前測試獲得的體內療效的數(shù)據(jù)，而主要根據(jù)所用的特定生物應答修飾因子，以及它是單獨使用的，還是與其它藥物或生物應答修飾因子結合起來使用的來決定免疫結合物的劑量水平。
上面所述的藥學制劑適于以治療上有效量(即，能消除或減少病人病理狀況的量)經非腸道途徑給予人體或其它哺乳動物來提供治療，根據(jù)結合于抗體傳遞系統(tǒng)的特異性生物應答修飾因子來決定療法的類型。
與抗體結合的生物應答修飾因子如TNF可與干擾素合并使用，優(yōu)先為人β-干擾素(IFN-β)。IFN-β指具類似天然干擾素生物活性的免疫干擾素。該干擾素以重組技術制備的為優(yōu)先。
以下實施例提供對本發(fā)明的免疫結合物的制備、鑒定和用途的詳細說明。這些實施例不是以任何方式限制本發(fā)明的。
實施例1TNF的純化可用本技術領域熟知的方法純化TNF。例如，Aggarwal等人描述了各種來源包括幾個單細胞源性的細胞系的TNF的純化方法。在這里列入Aggarwal(1986)MethodsofEnzymology116∶448作為參考。
這種方法還可用于純化其它來源的TNF。
TNF是優(yōu)先通過本技術領域熟練技術人員所熟知的重組技術而獲得的。這種制備方法，舉例來說，在美國專利申請第4，677，063號和歐洲出版的EP186，214中詳細地作了描述。從加利福尼亞州舊金山的基因技術公司(GencntechCorp.)中獲得以下實施例中的數(shù)據(jù)。
從大腸桿菌的提取物中將人類重組DNA衍生的物質純化至具均一性。
TNF以大約18，000道爾頓的分子量的單鏈形式轉移。
實施例2TNF細胞毒活性的測試在L-929細胞上用以下測試方法進行TNF細胞毒活性測定。在含10%FCS的MEM培養(yǎng)基中的四萬鼠L-929成纖維細胞加在96井平板上的每個井中，在37℃孵育24小時(5%CO2)。然后將細胞置含0.5克/毫升放線菌素-D的培養(yǎng)基中，用不同量的TNF或TNF-抗體結合物在37℃處理24小時(5%CO2)。用磷酸緩沖鹽(pH7.2)(PBS)洗滌細胞，用結晶紫染色活細胞。在590nm處讀平板以決定活細胞數(shù)。
將具有特異活性不低于1×107U/mg的TNF與抗體結合。一單位TNF活性是指對L-929細胞生長具50%抑制作用的TNF蛋白的量。
實施例3用亞氨基硫羥烷修飾TNF在Centricon10微濃縮器中將TNF的磷酸緩沖鹽溶液濃縮至約2毫克/毫升。將三乙醇胺鹽酸化物(TEA/HCl)，pH8.0及EDTA加入，至最終濃度為60mMTEA/HCl，及1mMEDTA，pH8.0。加2-亞氨基硫羥烷儲液(20mM)至最終濃度為1mM。在氮氣流下，樣品在4℃孵育90分鐘。
在SephadexG-25(1×24cm)柱上進行凝膠過濾以去除過量的亞氨基硫羥烷，用含50mMNaCl.及1mMEDTA的5mM二-三/乙酸鹽緩沖液，pH5.8預平衡。在微滴板上用Bradford染色結合測試分析組份中的蛋白質成分。簡要地說，每個井中加四十微升樣品，100微升磷酸緩沖鹽液(PBS)及40微升染料濃縮物。在DynatechMicroelisaAutoreader上讀出600nM處的吸收。在空隙容積(約組分14-20)收集TNF洗脫液。用Centricon-10微濃縮器集中和濃縮這些組分。
實施例4對15A8乳腺癌抗原及對黑素瘤抗體ZME-018的單克隆抗體的制備及其特性可用本技術領域熟練技術人員知道的方法制備這些單克隆抗體。產生15A8抗體的雜交瘤細胞培養(yǎng)物的制備方法已在美國專利申請第29，373號，申請日為1987年3月23日，歐洲專利公告WO-184-369(出版日為1986年6月11日)中詳盡描述，該申請是美國專利申請第678，264號，申請日為1984年12月5日的繼續(xù)。簡要地說，將哺乳類腫瘤細胞(Soule，etal，JNCI，51∶1409-1413(1973)ATCC保存號TB-22)每三周注入BALB/c小鼠腹膜內，總共注射3至4次。在最后一次注射3天后收集脾細胞，制備脾細胞懸浮液，并置Dulbecco′smodifiedEagles培養(yǎng)基中通過二次離心(800xg)洗滌。將從Dr.TheoStaehlin，Basal，瑞士，J.Stocker，ResearchDisclosure，21713，155-157(1982)處獲得的108免疫小鼠脾細胞及107PAI黑素瘤細胞在45%(V/V)聚乙烯乙二醇1500中懸浮以進行融合，在次黃嘌呤-氨基喋呤胸腺嘧啶(HAT)培養(yǎng)基上選擇雜交細胞。
根據(jù)已知組織培養(yǎng)技術例如Cotton等人.，Eur.J.Immol，3∶136(1973)中所述，在體外使雜交瘤克隆生長。對產生能與MCF-7及/或MDA-157細胞反應，但不與人包皮成纖維細胞反應的抗體的雜交瘤進一步定性。用15A8細胞系產生的抗體及由雜交瘤產生的功能等同抗體同MCF-7細胞上的15A8抗原反應。它們還與31例所測試的隨機獲得的人體乳腺癌中的28個反應，并顯示與正常人乳腺、鄰近側腎小管、膀胱、皮膚、食管和唾液腺的上皮細胞產生弱反應，但與其它正常組織細胞不反應，與所測試的18種其它惡性組織中的14種不反應。15A8抗體與所有的纖維囊性疾病、正常乳腺上皮細胞及一些腺癌反應。它不與間皮瘤反應。15A8抗體還與頸、結腸和前列腺癌交叉反應。
其細胞分泌同樣基因型抗體，即均識別15A8抗原決定簇的代表性雜交瘤培養(yǎng)物在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)保藏(12301ParklawnDrive，Rockville，Maryland20852)，保藏號為HB-8655(識別15A8)，HB-9344(識別15A8G2a)及HB-9345(識別15A8G2b)。
在這兒所用的有關鼠單克隆抗人乳腺癌抗體，“功能等同物”這個稱號是指單克隆抗體具以下性質(a)交叉阻斷例示的單克隆抗體;(b)選擇性地同表達15A8抗原的細胞如人乳腺癌細胞結合;(c)具G或M基因型;(d)與通過免疫沉淀或夾心法免疫分析測定的15A8抗原結合;(e)與TNF結合時，當用量為50到100單位每毫升時，至少對MCE-7，ME-180，BT-20，或A431細胞系中的一個表現(xiàn)出至少50%組織培養(yǎng)抑制量(TCID)。
用類似的方法制備與黑素瘤細胞結合的單克隆抗體。針對細胞表面和細胞質黑素瘤抗原的單克隆抗體制備的詳情由Wilson等人，在Int.J.Cancer(1981)28∶293中作了詳細描述，在此列入作為參考。
實施例5用SPDP修飾單克隆抗體15A8或ZME-018N-琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫)(丙酸鹽)(SPDP)在干燥的二甲基甲酰胺中制備成3毫克/毫升原液儲備。因為結晶SPDP可以水解，所以用分光光度方法測量化學活性交聯(lián)劑的實際濃度。在雙束分光光度計中通過分析260nM處的吸收。用以下公式計算SPDP原液的濃度(改變的吸收值(260n M))/(0.02×103ml/mmol) × 3.01/0.01 ＝mmolcs/ml/SPDP一毫克單克隆抗體，如在0.5毫升PBS中的MoAb15A8或MoAbZME-018加到玻璃管中，慢慢地將5倍摩爾過量的SPDP原液加入管中，不斷攪拌。在室溫將混合物孵育30分鐘，在孵育時每隔5分鐘攪拌一下。
在用PBS預平衡的SephadexG-25柱(1×24cm)上通過凝膠過濾色譜法去除過量未反應的SPDP。在PBS洗脫時收集組份(0.5毫升)，用Bradford染色方法分析其蛋白質成份?？贵w在空隙體積中洗脫(約組份14-20)。收集組份在Centricon-30濃縮器中濃縮蛋白質，用100mM磷酸鈉緩沖液，pH7.0含EDTA(0.5mM)洗滌Centricon濃縮液?？贵w濃縮至最后體積為約0.5-0.75毫升。
實施例6亞氨基硫羥烷修飾的TNF與SPDP修飾的單克隆抗體結合抗體15A8與抗體ZME-018與TNF結合，用N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二硫)丙酸鹽(SPDP)及/或亞氨基硫羥烷(IT)作為偶聯(lián)劑。在72小時組織培養(yǎng)測試中測試抗Me-018和AAB-527細胞的結合物。對這二種細胞系，抗體結合物均表現(xiàn)合格的抗增殖活性(50%TCID，少于10單位/毫升)。
如實施例4所述修飾的單克隆抗體15A8和ZME-018與等重量的如實施例3所述修飾的TNF混合。這比例即對應于比抗體多5倍摩爾量的TNF。通過加0.05M/TEA/HCl緩沖液pH8.0，將混合物的pH調節(jié)到7.0，混合物在氮氣下在4℃孵育20小時。加碘乙酰胺(0.1M)至最終濃度為2mM，以阻斷所有剩余的自由巰基，在約25℃繼續(xù)孵育1小時。反應混合物在4℃保存，直至被凝膠過濾純化。
實施例7TNF-單克隆抗體復合物的純化在SephadexS-300柱(2.5×50cm)上通過凝膠過濾去除實施例6中反應混合物中非結合TNF，該柱用PBS預平衡。
在置于Sephadex柱上前，用Centricon30微濃縮器將實施例6含MoAbZME和TNF結合物的反應混合物濃縮至約1毫升。柱用PBS洗滌。收集1毫升組份，用Bradford染色結合測試法分析50微升等分中的蛋白質。M.Bradford，Anal.Biochem72∶248(1976)。
游離的和結合TNF的抗體約在組份17-40洗脫，非結合TNF在約組份46-50洗脫。圖1表明S-300柱的洗脫圖。用箭頭表示游離TNF標準的洗脫(在組份46-48)。非結合ZME抗體洗脫約在組份28。反應混合物經層析后，收集組份20-40。PAGE分析表明這些組份不包含游離的TNF。通過在5-20%梯度非還原SDS聚丙烯酰胺凝膠上對50微升等分電泳試驗確證此洗脫圖。此分析證實結合物含每一分子抗體偶合一到三個分子TNF，無游離TNF。
用偶聯(lián)鼠抗TNF抗體的CNBrsepharose通過親和層析將非結合抗體從TNF抗體結合物中去除。樹脂倒入一小柱中(1×4cm)中，先用pH7.21含0.1MNaCl的10mM磷酸鹽緩沖液預平衡。在樣品裝入S-300集中后，用30毫升同樣的緩沖液洗柱，以完全洗脫非結合抗體。結合TNF的抗體吸附在柱上。
抗體-TNF復合物從柱上洗脫，如圖2所示，圖2表明了TNF親和柱的洗脫圖。流過的峰只含游離抗體，而組份58-70含抗體-TNF結合物，不含非結合TNF或抗體。在結合抗TNF鼠抗體的親和層析支承柱上分離從S-300層析收集的組份。柱用PBS盡量洗，使游離ZME抗體(組份20峰)從樹脂中洗脫。通過用含0.15MNaCl的0.1M乙酸鈉緩沖液(pH4.5)洗柱以洗脫ZME-TNF結合物。如圖2所示，純化的結合物以蛋白質單峰洗脫。在5-20%丙烯酰胺連續(xù)梯度非還原凝膠的PAGE分析表明結合物含結合到1，2，3TNF分子的ZME。在最終產品中沒有可探測到的游離TNF或游離ZME-018。
由Bradford染色試驗決定洗脫組份中的蛋白質成分。集中含蛋白質的組份，在5到20%梯度非還原聚丙烯酰胺凝膠上電泳以確定洗脫圖。
用實施例2中所述的L-929試驗來測定純TNF-抗體復合物的TNF活性。純15A8-TNF和ZME-TNF抗體結合物在L-929試驗中均表現(xiàn)活性。原來樣品的1∶1000稀釋液引起對L-929細胞生長的50%抑制。因此，原來制備液的活性為1000U/ml。
實施例8TNF結合及非結合ZME-018抗體與靶細胞結合的比較為測試通過TNF修飾后，ZME與靶A-375(抗原陽性)細胞或T-24細胞(抗原陰性)結合特性上是否有變化，將細胞置于96井塑料板上，第井50，000個細胞，并將它們置室溫下空氣中干燥。加入不同濃度的ZME或ZME-TNF，使之在室溫結合3小時。用標準ELISA試驗檢測鼠抗體。
測定TNF結合與非結合的ZME-018抗體與靶細胞結合的能力。在微滴板上為每個井中加入5萬個靶細胞(A-325)或非靶人膀胱癌細胞(T-24細胞)。在37℃細胞在板上干燥過夜。然后用冷PBS洗細胞三次，并在空氣中干燥過夜。如此處理后，細胞表面抗原決定簇仍保持抗原活性。
在細胞附著后，用洗滌緩沖液(9.68克Tris，64.8克氯化鈉，16毫升Tween20，800毫克乙基汞硫代水楊酸鈉，在8升雙蒸水中)洗滌平板。抗體樣品，在含1%牛血清白蛋白(W/V)的洗滌緩沖劑中稀釋(稀釋緩沖液)。在井中加入50微升不同濃度的結合及非結合ZME-018抗體，其濃度在0.002到100微克/毫升之間。在4℃孵育1小時后，去除上清液，用洗滌緩沖液洗滌井二次。
在每個井中加入50微升從Bio-Rad獲得并在稀釋緩沖液中以1∶1000稀釋(V/V)(APGAM)的結合堿性磷酸酯酶的羊抗鼠IgG。將板在4℃孵育1小時，用洗滌緩沖液洗二次井。平板與50微升底物溶液(80mM檸檬酸磷酸酯(pH5.0)，1mMABTS替代物及4微升30%過氧化氫)在室溫置暗處30分鐘后，在每個井中加25微升4N硫酸。在一ELISA板測讀器上測定492nM處的吸收值。
結果在圖3顯示。ZME-TNF復合物與天然ZME抗體及與A-375靶細胞的結合度相同。因為ZME-TNF或非結合ZME抗體與含A-B5抗原的靶細胞在結合上無區(qū)別，因此化學結合步驟不改變抗體對靶抗原的親和性。ZME或ZME-TNF復合物與非靶T-24膀胱癌細胞無可探測的結合。
實施例9TNF和TNF-15A8或ZME-TNF抗體復合物的抗增殖效應在200毫升合適的組織培養(yǎng)基中，將約5，000對數(shù)期細胞/井鋪在微滴板上96井中，估測TNF和15A8-TNF或ZME-TNF結合物的抗增殖效應。在有5%CO2大氣中，使細胞在37℃吸附24小時。非靶的，抗原陰性T-24人膀胱癌細胞，對15A8陽性的Me-180細胞抗原與對ZME-018呈陽性的A-375人黑素瘤細胞抗原在對數(shù)期用不同濃度的單獨培養(yǎng)基(對照)，TNF，15A8-TNF結合物或ZME-TNF結合物處理，在37℃，含5%CO2大氣中孵育72小時。用冷PBS洗板三次。每個井中加入50毫升甲醇，通過冰凍和解凍的重復循環(huán)使細胞溶解。通過Bradford染色試驗測定蛋白質濃度。另一種方法是，用結晶紫染色測定每個井中細胞數(shù)。在一臺ELISA測讀器上讀出每個井的吸收值，并與對照井(不處理)相比較。所用TNF達50，000單位/井時，單獨的TNF不具殺細胞或細胞靜止作用。但是，用ZME-TNF結合物，僅10單位/毫升即可獲得50%抑制作用。
也可通過與鹽溶液處理的對照樣品相比，降低蛋白質濃度或減少已處理細胞的細胞數(shù)，來測定細胞生長的抑制。15A8-TNF結合物或ZME-TNFT-24癌對非靶T-24癌細胞無抑制細胞生長的作用。
15A8-TNF對T-24非靶細胞系無作用。
因為只有在其表面含15A8抗原的細胞才被TNF15A8免疫毒素殺死，此免疫毒素是瞄準并殺死含15A8腫瘤相關抗原細胞的有效手段，同時減少或防止對正常不帶腫瘤相關抗原細胞的損傷或傷害。
當測試培養(yǎng)中的抗原陽性人黑素瘤(AAB-27或A-375)細胞時，ZME-TNF結合物比游離TNF更具活性。如圖4所示，單獨TNF以50，000U/ml的量對AAB-27細胞生長無作用。但是，如圖5所示，約6U/mlZME-TNF結合物便可獲得50%抑制作用。單獨TNF的劑量在約100U/ml時抑制A-375人黑素瘤靶細胞，而ZME-TNF在約0.8U/ml濃度時抑制細胞。Me-180靶細胞對15A8-TNF免疫毒素比對單獨TNF敏感10倍(圖6)。
圖6表明在約15U/ml時，結合TNF的15A8，抗體抑制50%Me-180細胞，而未結合TNF達到同樣的效應所需濃度為200U/ml。TNF或ZME-TNF結合物對抗原陰性T-24細胞均無作用。
因此，與TNF結合的ZME及15A8免疫結合物能極大地增加TNF對抗原陽性細胞的細胞毒性，而不影響抗原陰性細胞。此外，在一對單獨TNF的生長-抑制作用有完全抗性的細胞系中(圖4)，可通過抗體定靶以克服細胞抗性。
本技術領域的熟練技術人員將會一致認為本發(fā)明優(yōu)越性顯著，易于應用并達到日的，能獲得相應的結果。其中所述的化合物、方法、步驟及技術是目前先進實施例的代表并正擬推廣，但它們并不是作為本發(fā)明范圍的限制。在本發(fā)明的宗旨范圍內，本技術領域的熟練技術人員可對其作為改動及作為他用，這些由所附的權項所限制。
權利要求
1.一種組合物，其特征在于它包含針對腫瘤相關抗原的抗體與生物應答修飾因子組分的結合物。
2.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其特征在于它是重組產生的化合物，包含抗體組分及生物應答修飾因子。
3.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其特征在于其組分是具細胞毒性的。
4.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其特征在于該組分是從組成腫瘤壞死因子，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，TNF-α，TNF-β，IFN-α，IFN-β，IFN-λ的組中選出的。
5.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其特征在于所述組分是腫瘤壞死因子。
6.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其特征在于所述抗體是針對一種乳腺癌抗原的。
7.根據(jù)權利要求6所述的抗體，其特征在于該抗體具15A8抗體的特性。
8.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其特征在于該抗體是針對一種黑素瘤抗原的。
9.根據(jù)權利要求8所述的組合物，其特征在于該抗體具有ZME-018抗體的特性。
10.一種治療增殖性細胞疾病的方法，其特征在于對需此種治療的個體使用權利要求1所述組合物的殺死細胞的有效劑量。
11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其特征在于此增殖細胞性疾病為癌。
12.根據(jù)權利要求10所述的方法，其特征在于所述癌是從乳腺癌、頸癌、及黑素瘤的組中選出的。
13.一種治療乳腺癌的方法，其特征在于它包括對需此治療的個體以針對15A8抗原的與TNF結合的單克隆抗體。
14.一種治療頸癌的方法，其特征在于它包括對需此治療的個體使用細胞毒或細胞抑制劑量的抗15A8腫瘤相關抗原的TNF-結合抗體。
15.一種治療人類乳腺癌的方法，其特征在于它包括對診斷為帶15A8腫瘤相關抗原的腫瘤的個體使用細胞毒或細胞抑制劑量的TNF-結合的單克隆抗體15A8。
16.一種防止腫瘤復發(fā)的方法，其特征在于它包括對需此治療的個體使用TNF-結合的單克隆抗體15A8。
17.一種治療黑素瘤的方法，其特征在于它包括對需此治療的個體使用TNF-結合的單克隆抗體ZME-018。
18.一種組合物，其特征在于它包括針對腫瘤相關抗原的抗體與生物應答修飾因子組分及人體干擾素的結合物。
19.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其特征在于該結合物是通過將為單克隆抗體的抗原識別位點編碼的基因與為生物應答修飾因子編碼的基因融合而重組產生的基因融合產物。
20.根據(jù)權利要求19所述的組合物，其特征在于該生物應答修飾因子是從淋巴因子和細胞激活素組成的組中選出的。
21.根據(jù)權利要求19所述的組合物，其特征在于所述的生物應答修飾因子是腫瘤壞死因子。
22.一種抑制繼發(fā)性白內障形成的方法，其特征在于它包括對施行眼球晶體復位手術后的個體使用權利要求1所述的免疫結合物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新穎的抗體與生物應答修飾因子的結合物，傳遞生物應答修飾因子到靶組織和細胞的傳遞系統(tǒng)。本發(fā)明還提供了一種通過使用抗體-生物應答修飾因子結合物來治療疾病的方法。例如，一種單克隆抗體與淋巴因子或細胞激活素如腫瘤壞死因子(TNF)結合。
文檔編號A61P35/00GK1047035SQ90102690
公開日1990年11月21日 申請日期1990年5月5日 優(yōu)先權日1989年5月5日
發(fā)明者米切爾·C·羅森布拉姆, 克萊德·威廉·韋倫 申請人:研究發(fā)展基金會