專利名稱：與生長激素釋放抑制因子有關(guān)的肽類及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的說來涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，更專業(yè)化地說來涉及生長激素釋放抑制因子(Somatostatin)，與生長激素釋放抑制因子有關(guān)的肽類及其應(yīng)用。
生長激素釋放抑制因子(Somatostatn或SRIF)是抑制某些內(nèi)源性激素，如生長激素，胰島素和促甲狀腺素釋放的一種小肽激素。這些激素進(jìn)而調(diào)節(jié)其他物質(zhì)的釋放。例如，現(xiàn)已揭示，只有在胰島素到達(dá)適當(dāng)水平時(shí)，介導(dǎo)垂體生長激素的促蛋白合成作用的胰島素樣生長因子-1(IGF-1)，以前被稱作生長調(diào)節(jié)素(Somatomedin)，才被肝臟釋放出來。此外IGF-1刺激生長的能力可依賴于甲狀腺素，因此，血循環(huán)中的SRIF水平完全影響到IGF-1水平。
SRIF還可影響營養(yǎng)物的消化吸收。餐后血漿中具有SRIF樣活性的分子增多。SRIF還抑制胃酸分泌，膽囊排空以及甘油三酯和葡萄糖的吸收。因此，SRIF參與調(diào)節(jié)營養(yǎng)物從胃腸道的攝取。
SRIF可能通過幾種機(jī)制影響生殖過程。有關(guān)文獻(xiàn)已證實(shí)，SRIF對垂體分泌促黃體激素(LH)或促卵泡激素(F SH)無直接刺激或抑制作用。對一些飼養(yǎng)動(dòng)物的研究確證了這點(diǎn)。給公牛體內(nèi)注射SRIF不能改變血液中LH的水平。給母羊注射SRIF不能改變血清LH水平和生殖功能。SRIF可能通過其他直接或間接作用影響生殖過程。例如，SRIF存在于豬卵巢，未成熟人胎盤細(xì)胞滋養(yǎng)層以及豬子宮中的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞。SRIF還抑制培養(yǎng)的豬卵泡卵子的成熟分裂。并非與某一特定理論有關(guān)，作為對SRIF的免疫作用的結(jié)果，很可能出現(xiàn)垂體生長激素分泌的增加和/或不依賴生長激素而直接依賴于SRIF的營養(yǎng)物吸收的增加。這兩種情況都可導(dǎo)致IGF-1水平提高和生殖行為改變。還有證據(jù)表明，給豬注射可引起IGF-1增加的生長激素導(dǎo)致處于動(dòng)情期的小母豬的排卵率增加。同樣，IGF-1刺激培養(yǎng)的豬卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞產(chǎn)生類固醇。此外，SRIF可通過影響表皮生長因子(E GF)受體、組蛋白和血管緊張肽的磷酸化程度，來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長。對顆粒細(xì)胞上的EGF變體反應(yīng)性的調(diào)節(jié)可控制細(xì)胞的生長與分化。
對SRIF的免疫作用還可通過影響環(huán)一磷酸腺苷(cAMP)水平來提高生殖效應(yīng)。已知SRIF抑制cAMP活性，但就發(fā)明者所知，cAMP在生殖細(xì)胞和組織中的作用及對排卵的作用尚無報(bào)導(dǎo)。然而，已知cAMP是多種生理機(jī)制的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，cAMP在控制激素活性上的功能已被描述過。并非與某一特定理論有關(guān)，cAMP可按以下方式調(diào)節(jié)生殖效率。cAMP與血漿酶原激活劑的功能有關(guān)，后者是一種催化血漿酶原轉(zhuǎn)化為血漿酶的中性絲氨酸蛋白酶。尤其是，cAMP水平的提高顯示出可誘導(dǎo)在母雞卵巢中最大的排卵前卵泡的膜層上血漿酶原激活劑的活性。血漿酶原激活劑可進(jìn)一步影響卵巢內(nèi)的一些生理過程，包括細(xì)胞分化、卵泡成熟和排卵。SRIF通過抑制cAMP，可減弱促cAMP因子、促黃體激素和前列腺素E的作用，從而減弱這些因子對生殖行為的作用。
由于cAMP的調(diào)節(jié)功能有一個(gè)可追溯到包括細(xì)菌在內(nèi)的漫長的進(jìn)化史，影響cAMP水平的物質(zhì)很可能在很大范圍的有機(jī)體內(nèi)將是有用的。
SRIF還可能對免疫功能有影響。尤其是，有人假設(shè)，SRIF可能通過阻斷核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)合成而抑制淋巴細(xì)胞的增殖。SRIF對單核細(xì)胞也具有抑制作用，并抑制從脾臟和Peyer's斑分離的漿細(xì)胞釋放免疫球蛋白A(IgA)。但是，發(fā)明者尚未見到表明SRIF直接或間接抑制或刺激骨髓來源的細(xì)胞，如多形核中性粒細(xì)胞(PMN)的任何報(bào)告。
有人報(bào)告，淋巴細(xì)胞，PMN和單核細(xì)胞能合成和分泌少量SRIF。單核細(xì)胞分泌的SRIF的確切作用尚未被描述過。而Blalock等于1985年提出，這一SRIF可作為免疫系統(tǒng)細(xì)胞間的信號(hào)遞質(zhì)而起作用。
有關(guān)抗SRIF抗體能增強(qiáng)PMN活性的機(jī)制尚不清楚。但對SRIF的免疫作用可減弱SRIF對免疫系統(tǒng)細(xì)胞所具有的潛在的抑制作用。抑制作用可有兩種類型。其一可能涉及SRIF和PMN之間的直接相互作用;其二SRIF可能引起對T淋巴細(xì)胞釋放淋巴因子的抑制。淋巴因子是由激活的淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生，能增強(qiáng)白細(xì)胞功能。例如，干擾素α、干擾素γ和白細(xì)胞介素-2等均是淋巴因子。SRIF引起的淋巴因子分泌的減少或許可降低PMN的活性。因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)的很多細(xì)胞受淋巴因子的調(diào)節(jié)，如PMN，B淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，因此對SRIF的免疫作用可增強(qiáng)免疫功能。
細(xì)菌被PMN的吞噬攝取是清除細(xì)菌的第一步。結(jié)果，PMN在預(yù)防動(dòng)物細(xì)菌感染，如乳腺炎和小牛呼吸系疾病等方面起了一個(gè)關(guān)鍵性的作用。動(dòng)物在應(yīng)激狀態(tài)，和/或在產(chǎn)期前后，和/或在初次病毒感染后，特別易發(fā)生細(xì)菌感染。因此在許多情況下PMN的活性是預(yù)防細(xì)菌感染和感染后康復(fù)的關(guān)鍵因素。
SRIF是以直鏈和環(huán)狀兩種形式存在的十四肽。環(huán)SRIF-14的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下
具有SRIF樣活性的分子也可能有從氨基端(N端)和/或羧基端(C-端)延伸的順序，及在SRIF-14序列內(nèi)含有添加、缺失或取代基。SRIF的天然形成有如下這些SRIF-14，脯-SRIF，脯-脯-SRIF，SRIF-28，SRIF-25和SRIF-20。
一個(gè)熟為人知的SRIF的類似物是(SRIF)SM S201-995。這類結(jié)構(gòu)已由Moreau等(1987)綜述。SRIF的其他類似物為RC-121和RC-160。
在迄今研究過的所有脊椎動(dòng)物中均發(fā)現(xiàn)了SRIF，并且整個(gè)機(jī)體均合成SRIF。因此，SRIF的水平是不易被降低的，有關(guān)SRIF濃度調(diào)節(jié)方面的研究也受到限制。但是，免疫調(diào)節(jié)提供了一個(gè)能檢測抗SRIF活性作用的方法。這一技術(shù)利用抗SRIF抗體調(diào)節(jié)SRIF樣活性。抗SRIF抗體既可直接給予受試者(被動(dòng)免疫)，也可用SRIF和佐劑和/或載體一起給予，使體內(nèi)產(chǎn)生可調(diào)節(jié)SRIF樣活性的抗體(主動(dòng)免疫)。
SRIF最初以其對生長激素分泌的抑制作用而被認(rèn)識(shí)。在大鼠，SRIF由于被動(dòng)免疫而從血液循環(huán)中的除去，提高了血漿中生長激素的濃度，并防止了由于應(yīng)激和饑餓而出現(xiàn)的生長激素濃度的降低。然而用主動(dòng)免疫來進(jìn)行SRIF的免疫調(diào)節(jié)作用的較早期試驗(yàn)產(chǎn)生了混合的結(jié)果。例如，據(jù)報(bào)導(dǎo)，用主動(dòng)免疫除去SRIF，在羊中導(dǎo)致較高的血漿生長激素水平，但這對于生長無確定的作用。Spencer等在已經(jīng)過抗SRIF免疫的羊中觀察到伴喂飼效率提高，生長加速，而Varner等報(bào)告了明顯降低的生長速度。此外，對SRIF的主動(dòng)免疫在綿羊中既未見產(chǎn)奶量增加，也未見到生長速度增加。上述文獻(xiàn)中報(bào)告的時(shí)常矛盾的發(fā)現(xiàn)可能是由于難于獲得一致的和可測量的對SRIF的免疫反應(yīng)。
至今尚無關(guān)于與動(dòng)物的生殖效應(yīng)有關(guān)的SRIF樣免疫調(diào)節(jié)作用(主動(dòng)或被動(dòng))的研究。美國專利第3，863，008號(hào)揭示，SRIF水平的提高，在體外刺激促黃體激素分泌，但這一效應(yīng)與免疫學(xué)現(xiàn)象無關(guān)。脊椎動(dòng)物生殖效率的提高，從經(jīng)濟(jì)角度講是可行的。
本發(fā)明在于發(fā)現(xiàn)SRIF樣活性的免疫調(diào)節(jié)可以增強(qiáng)試驗(yàn)的脊椎動(dòng)物的生殖效應(yīng)和免疫學(xué)功能。本發(fā)明也基于，調(diào)節(jié)內(nèi)源性SRIF水平的高效、新穎的疫苗制劑的發(fā)現(xiàn)。這一制劑不但在促進(jìn)生殖效率上，而且在調(diào)節(jié)各種與SRIF有關(guān)的其他生理功能上得到應(yīng)用，如背景部分所述。SRIF的免疫調(diào)節(jié)可通過主動(dòng)或被動(dòng)免疫來實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例是針對通過引起免疫反應(yīng)而促進(jìn)試驗(yàn)的脊椎動(dòng)物生殖效率的制劑的，該制劑包括一種在藥理學(xué)上可行的載體和一種與SRIF有關(guān)的肽。
在其他實(shí)例中，本發(fā)明是針對通過調(diào)節(jié)SRIF活性而增強(qiáng)試驗(yàn)的，脊椎動(dòng)物免疫功能的一種制劑，以及促進(jìn)巨噬細(xì)胞功能的一種制劑。這些制劑包括一種藥理學(xué)上可行的載體和與SRIF有關(guān)的肽類。
在更進(jìn)一步的實(shí)例中，揭示了一些制劑，這些制劑在藥理學(xué)上可行的賦形劑中包裹著具有抗SRIF樣活性分子的抗體。
在另外一些實(shí)例中，本發(fā)明針對一些方法通過免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)試驗(yàn)的脊椎動(dòng)物的SRIF活性，提高試驗(yàn)的脊椎動(dòng)物的生殖效率，促進(jìn)試驗(yàn)的脊椎動(dòng)物的巨噬細(xì)胞功能。這些方法系給予脊椎動(dòng)物一種由藥理學(xué)上可行的載體和治療上有效量的與SRIF有關(guān)的肽組成的制劑。在特佳實(shí)例中，與SRIF有關(guān)的肽是連接于一種載體上的SRIF-14。
在其它一些實(shí)例中，本發(fā)明通過引起一種免疫反應(yīng)，即給予脊椎動(dòng)物一些包括一種藥理學(xué)上可行的載體和足以在脊椎動(dòng)物中調(diào)節(jié)SRIF樣活性的數(shù)量的抗SRIF樣活性抗體，來提高脊椎動(dòng)物生殖效率和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活性。有鑒于此，本發(fā)明的這些或其他實(shí)例將易被對本技術(shù)熟練的人員所理解。
附

圖1描述在第1228號(hào)羊上產(chǎn)生的抗SRIF-14抗血清與SRIF相關(guān)肽類的交叉反應(yīng)概況。
附圖2顯示在第1277號(hào)羊上產(chǎn)生的抗SRIF-14抗血清與SRIF相關(guān)肽類的交叉反應(yīng)。
附圖3顯示從成熟的卵巢卵泡中分離出來的顆粒細(xì)胞中SRIF和cAMP水平的抑制關(guān)系。試驗(yàn)細(xì)胞在含有促黃體激素(LH)或Forskolin(FK)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
附圖4描述從成熟卵巢卵泡中分離出的顆粒細(xì)胞中的cAMP水平。試驗(yàn)細(xì)胞在存在或缺乏SRIF，同樣也在存在或缺乏抗SRIF抗體的情況下，和FK一起培養(yǎng)。
附圖5顯示SRIF對豬黃體細(xì)胞基礎(chǔ)cAMP水平的抑制效應(yīng)。
附圖6顯示SRIF對從免疫羊身上采得的標(biāo)本中PMN活性的效應(yīng)。
附圖7描述單獨(dú)的卵清蛋白載體(實(shí)線)和與SRIF結(jié)合的卵清蛋白載體(虛線)的反相高壓液相(HPLC)色譜。
本發(fā)明的實(shí)施，除非另外指出，將應(yīng)用免疫學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)全部在這一領(lǐng)域的技術(shù)范圍之內(nèi)，這樣一些技術(shù)在文獻(xiàn)中已作了完全的闡述。例如見《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊》第Ⅰ-Ⅳ卷(DM.Weir，C.C.Blackwell主編，1986，Blackwell科學(xué)出版物);叢書《酶學(xué)方法》(S.Colowick，N.Kaplan主編，學(xué)術(shù)出版公司)。
在描述本發(fā)明時(shí)，將使用下列術(shù)語，并打算給出如下定義所謂“脊椎動(dòng)物”指的是具有功能性免疫系統(tǒng)的任何動(dòng)物，沒有限制地包括鳥類，如雞、火雞、鵪鶉、觀賞雞、鸚鵡等、魚類，和哺乳動(dòng)物，如人類、牛、豬、馬、狗、貓、羊、象和其他家畜或野生動(dòng)物。
“提高生殖效率”定義為脊椎動(dòng)物生殖或繁殖行為的任何提高。這種提高包括，但并不限于，排卵率、懷胎率的提高，動(dòng)情期發(fā)生率的增加，雌雄動(dòng)物生育力的提高，同窩仔的大小的增加，卵或胚胎存活率的提高，以及后代數(shù)目的增加。這一定義中還包括由于抑動(dòng)情期、多產(chǎn)、不育和流產(chǎn)等因素引起的生殖不能的治療。
“增強(qiáng)免疫功能”定義為脊椎動(dòng)物免疫學(xué)行為的任何提高。這些提高包括，但并不限于，白細(xì)胞活性的增加，抗體分泌的增加，淋巴因子分泌的增加，細(xì)胞因子(Cytokine)分泌的增加和抗病能力的提高。
所謂“增強(qiáng)巨噬細(xì)胞功能”指的是脊椎動(dòng)物免疫學(xué)行為，特別是與PMN功能有關(guān)的免疫行為的提高。PMN功能的這種提高包括，但不限于，超氧化物產(chǎn)生的增加，化學(xué)趨向素的增加和移動(dòng)的減弱。PMN功能的提高為脊椎動(dòng)物提供了對大量生物體的抵御作用。這些生物體包括，但不限于，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，無乳鏈球菌，增殖鏈球菌(Streptococcus oberis)，牛棒狀桿菌，溶血性巴斯德化菌。在應(yīng)激狀態(tài)下，病毒感染后和產(chǎn)期前后時(shí)，脊椎動(dòng)物對這些生物體特別敏感。例如乳腺炎就是這樣的細(xì)菌感染的疾病之一。
所謂“生長激素釋放抑制因子”即SRIF，指的是具有SRIF樣活性的任何分子，包括有從SRIF-14的N端和/或C端延伸序列的分子，及在SRIF-14序列上有添加、缺失或取代基的分子。任何上述分子可以是直鏈的或環(huán)狀的。這些肽類的實(shí)例包括，但不限于，環(huán)狀或直鏈的SRIF-14，[酪′]-SRIF-14，[酪″]-SRIF-14，SRIF-25和SRIF-28(環(huán)狀或直鏈)。
所謂“SRIF相關(guān)肽”指的是，有SRIF免疫活性的任何蛋白質(zhì)，多肽或肽。此術(shù)語所包括的還有，具有SRIF受體結(jié)合活性，并阻止其他SRIF相關(guān)肽結(jié)合SRIF受體的SRIF結(jié)構(gòu)類似物。這種物質(zhì)與抗直鏈或環(huán)狀的SRIF的抗體有交叉反應(yīng)。
“輪狀病毒VP6蛋白”指的是呼腸弧病毒屬(Reoviridae)由任何種或株的可經(jīng)人工識(shí)別的主要內(nèi)殼病毒蛋白。例如見Kapikian等，1985。從中可分離得VP6蛋白并應(yīng)用于本發(fā)明的輪狀病毒實(shí)例包括，但不限于，猿猴SA-11，人D輪狀病毒，牛UK輪狀病毒，人Wa或W輪狀病毒，人DS-1輪狀病毒，獼猴輪狀病毒，“0”型劑，牛NCDV輪狀病毒，人S2輪狀病毒，人KUN輪狀病毒，人390輪狀病毒，人P輪狀病毒，人M輪狀病毒，人Walk57/14輪狀病毒，人Mo輪狀病毒，人Ito輪狀病毒，人Nemoto輪狀病毒，人YO輪狀病毒，人MCM2輪狀病毒，獼猴MMU18006輪狀病毒，犬Cu-1輪狀病毒，貓Taka輪狀病毒，馬H-2輪狀病毒，人St.Thomas3號(hào)、4號(hào)輪狀病毒，人Hosokawa輪狀病毒，人Hochi輪狀病毒，豬SB-2輪狀病毒，豬Gottfried輪狀病毒，豬SB-1A輪狀病毒，豬OSU輪狀病毒，馬H-1輪狀病毒，雞chz輪狀病毒，火雞Ty.l輪狀病毒，牛C486輪狀病毒，以及從這些病毒派生出來的株。因此本發(fā)明包括從任何輪狀病毒株得到的VP6的應(yīng)用。這些輪狀病毒株可以來自不論亞群Ⅰ、亞群Ⅱ或至今未確定的亞群以及血清型1-7的任何一種，和至今未定血清型的任何一種。這樣的VP6蛋白可被用作多肽的免疫載體。這些載體分子由輪狀病毒VP6的氨基酸序列所構(gòu)成。這種氨基酸序列對于該類VP6多肽或其中任何一種是獨(dú)特的。這種VP6蛋白獨(dú)特的序列被稱為“輪狀病毒VP內(nèi)殼蛋白氨基酸序列”。
載體實(shí)質(zhì)上與輪狀病毒VP6內(nèi)殼蛋白或其功能性片斷是同源的，其中至少85%氨基酸，更可取的是至少90%，最好至少95%氨基酸在一個(gè)限定的分子長度上是相配的。輪狀病毒VP內(nèi)殼蛋白的“功能性片斷”是具有充當(dāng)上面定義的SRIF相關(guān)肽的載體分子能力的一個(gè)片斷。
所謂“調(diào)節(jié)SRIF或SRIF樣活性”是指改變SRIF或SRIF相關(guān)肽的內(nèi)源性水平，以獲得所期望的效應(yīng)。如提高生殖效率或促進(jìn)非特異免疫。給受試體使用肽類及其抗體后，出現(xiàn)內(nèi)源性SRIF水平的改變。正常情況下，這些肽類和抗體會(huì)降低內(nèi)源性SRIF水平。
術(shù)語“治療有效量”是指當(dāng)給予受試者本發(fā)明的制劑時(shí)，給予在受試者中是以調(diào)節(jié)內(nèi)源性SRIF樣活性的SRIF相關(guān)肽或抗SRIF抗體的量。
所謂“免疫學(xué)反應(yīng)”是指在脊椎動(dòng)物內(nèi)發(fā)展由細(xì)胞或抗體介導(dǎo)的針對重要的肽的免疫反應(yīng)。通常，這樣的反應(yīng)是指由脊椎動(dòng)物產(chǎn)生對重要的肽直接特異的抗體和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
本發(fā)明主要的是，發(fā)現(xiàn)SRIF相關(guān)肽可改變正常脊椎動(dòng)物和生殖畸形的無脊椎動(dòng)物的生殖行為。這些物質(zhì)可單獨(dú)或聯(lián)合用藥給予脊椎動(dòng)物，得到有利的結(jié)果。同樣重要的是，發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)SRIF水平和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞功能的高效、新穎制劑。
在所附方法和配方中，具有SRIF樣活性的分子及其類似物是有用的。這些分子在商業(yè)上是可利用的?？梢詭追N形式中的任何一種獲得。這些分子包括，而不限于SRIF-14，SRIF-28，SRIF-15，SRIF-20，RC-121，RC-160和SM S-201-995，既可是環(huán)狀的，也可是直鏈形式。
因?yàn)镾RIF及相關(guān)化合物相當(dāng)少，故可按已知的氨基酸序列經(jīng)化學(xué)合成，如固相肽合成而容易地被生產(chǎn)。這些方法已為技術(shù)熟練的人所了解。用于本發(fā)明的物質(zhì)由Bachem公司合成。SRIF相關(guān)肽類也可用本領(lǐng)域已知的重組DNA方法來制備。
SRIF或其他顯示SRIF免疫活性的物質(zhì)可用于脊椎動(dòng)物以刺激免疫反應(yīng)的活性。它們也可用于生產(chǎn)多克隆和單克隆抗體。這些抗體繼而可用于脊椎動(dòng)物以調(diào)節(jié)內(nèi)源性SRIF，從而提高受試者的生殖能力和非特異免疫。
如果需要多克隆抗體，可用SRIF，更佳地是用SRIF-14或它的一個(gè)免疫原片段，或一種突變的形式。來免疫選定的哺乳動(dòng)物(如小鼠、家兔、山羊、馬等)。收集免疫動(dòng)物的血清，按已知的順序進(jìn)行處理。如果在含有對決定性蛋白質(zhì)的多克隆抗體的血清中含有對其他抗原的抗體，可用已知的方法通過免疫親和層析加以純化。
抗本發(fā)明的蛋白質(zhì)及其片段的單克隆抗體也可容易地由技術(shù)熟練者生產(chǎn)。雜交瘤制備單克隆抗體的一般方法學(xué)已被熟知。產(chǎn)生永久性抗體的細(xì)胞系可通過細(xì)胞融合形成，也可采用其他技術(shù)，如用腫瘤DNA直接轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞，或用EB病毒轉(zhuǎn)染。見M.Schreier等，雜交瘤技術(shù)(1980);Hammerling等，單克隆抗體和T細(xì)胞雜交瘤(1981);Kennett等，單克隆抗體(1980);亦見于美國專利號(hào)4341761，4399121，4427783，4444887，4452570，4466917，4472500，4491632和4493890。產(chǎn)生的抗SRIF或其片斷的單克隆抗體可因其不同性質(zhì)，如同型、表型、親和性等而進(jìn)行篩選。
動(dòng)物可按本發(fā)明的配方，用決定性蛋白質(zhì)或其片斷或其類似物或抗體進(jìn)行免疫。若用片段或類似物，它應(yīng)包括表位的氨基酸系列，該表位可與免疫系統(tǒng)互相作用，以使該動(dòng)物對其和結(jié)構(gòu)上相類似的表位產(chǎn)生免疫。
在免疫前先連接到載體上可增強(qiáng)SRIF相關(guān)肽的免疫原性。典型的載體是大的，緩慢代謝的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、如瓊脂糖珠，瓊脂糖，纖維素，纖維素珠等等;氨基酸聚合體，如聚谷氨酸，聚賴氨酸等;氨基酸縮聚物，胞壁酰二肽和其他細(xì)菌細(xì)胞壁成份，以及滅活的病毒顆粒。特別有用的蛋白質(zhì)底物是血清白蛋白、如牛血清的蛋白(BSA)或卵清蛋白，鎖服帽貝血籃蛋白，免疫球蛋白分子，甲狀腺球蛋白和其他該領(lǐng)域中熟知的蛋白質(zhì)。
蛋白質(zhì)底物可以其天然形式被使用，也可以在功能基團(tuán)上被修飾。例如賴氨酸殘基的琥珀酰化，或與半胱氨酸硫代內(nèi)酯起反應(yīng)。例如巰基也可借助氨基與2-亞氨基硫醇(2-iminothiolane)反應(yīng)或與3-(4-二硫代吡啶)丙酸鹽的N-羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)結(jié)合到載體(或抗原)上。合適的載體還可被修飾，結(jié)合到間隔臂(例如六甲烯二胺或其他類似大小的雙功能團(tuán)分子)上來連接肽類。
本發(fā)明中所用的尤其合適的載體是輪狀病毒的VP6多肽，或其功能性片段，如公眾已知的美國專利申請?zhí)枮?92，120，申請日為1987年9月2日中所公開的，在這兒結(jié)合作為參考。用如美國專利申請?zhí)?，722，840所公開的方法做的病毒蛋白和決定性表位的融合產(chǎn)物也同樣有用。另外其它合適的載體包括一種特別的抗原顯示系統(tǒng)，如PCT申請?zhí)朑B87/00764所公開，也包括細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞。這種形式的顯示模擬在受試者體內(nèi)的自然的顯示形式，它能導(dǎo)致免疫狀態(tài)的產(chǎn)生。或者，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以偶合到紅細(xì)胞上，較佳的是受試者自己的紅細(xì)胞。將肽偶合到蛋白質(zhì)或細(xì)胞上的方法對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是已知的。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)和抗體在使用前最好先用藥理學(xué)上可行的載體或賦形劑混合。典型地，將制劑制成可注射劑，最好是肌內(nèi)和/或皮下注射，可以是溶液或懸浮液。也可制成適當(dāng)?shù)墓腆w形式，在注射前用液體載體制成溶液或懸浮液。制劑也可乳化，或?qū)⒏』钚越M分包裹在脂質(zhì)體載體中，或通過固定在脂質(zhì)體膜上而在脂質(zhì)體載體的外部表達(dá)?；钚悦庖咴M分常與載體混合，該載體含藥理學(xué)上可行的及與活性組份相容的賦形劑，合適的載體例如有水，鹽水，葡萄糖，甘油，乙醇，或其類似物，及其結(jié)合物。另外，如需要的話，載體可含輔助成分，例如濕劑或乳化劑，pH緩沖劑，或能增強(qiáng)疫苗效果的佐劑。佐劑可包括，例如胞壁酰二肽，avridine，氫氧化鋁，油，皂角苷及本領(lǐng)域已知的其它物質(zhì)。制備這種劑型的實(shí)際方法對本領(lǐng)域的熟練人員是已知的，或?qū)⑹秋@然的。參考，如Rcmington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，15 edition，1975。
已發(fā)現(xiàn)一個(gè)調(diào)節(jié)SRIF活性的特別有用的制劑包括與25%-30%作為佐劑的Al(OH)3結(jié)合的連接卵清蛋白的SRIF，或SRIF有關(guān)肽。
所服用的組合物或制劑將包括一定量的SRIF相關(guān)肽或其抗體，該量足以調(diào)節(jié)受試的脊椎動(dòng)物中的內(nèi)源性SRIF，其確切的量可由本領(lǐng)域熟練人員容易地決定?；钚越M分一般在占制劑約1%到約95%(w/w)之間，如合適的話可能更高或更低，所服用的量取決于所處理的動(dòng)物，及動(dòng)物免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)SRIF樣活性的能力。已發(fā)現(xiàn)在現(xiàn)有制劑中，每毫升注射溶液中125微克活性組分，每個(gè)動(dòng)物服用2到4毫升劑量時(shí)已足夠引起免疫應(yīng)答。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通過常規(guī)試驗(yàn)得出劑量應(yīng)答曲線，可以容易得出其它有效劑量。通過服用SRIF相關(guān)肽或其的一個(gè)免疫原性片段，或其類似物，至少一劑，最好多于一劑，而使動(dòng)物免疫，動(dòng)物可以服用所需要的劑量，以維持一種狀態(tài)，在該狀態(tài)下SRIF樣活性可被調(diào)節(jié)到一個(gè)足夠的量而產(chǎn)生生物作用。另外適宜于其它服用形式的制劑包括栓劑，在有些情況下是氣溶膠，鼻內(nèi)及口服制劑。對栓劑來說，載體成份包括傳統(tǒng)性結(jié)合物和載體，如聚堿性1，2-乙二醇，或甘油三酯。這些栓劑可以從含約0.5%到約10%(w/w)，最好是約1%到約2%的活性組分的混合物中形成?？诜d體包括通常使用的賦形劑如藥用級(jí)的甘露醇，乳糖，淀粉，鎂，硬脂酸鹽，糖精鈉纖維素，碳酸鎂等。這些口服制劑可以是溶液，懸浮液，片劑，丸劑，膠囊，緩釋劑，或粉未形式，含約10%到約95%的活性組分，最好是含約25%到70%。
鼻內(nèi)制劑通常包括既不引起的對鼻粘膜的刺激又不顯著干擾鼻毛功能的載體。在本發(fā)明中稀釋劑可用水，鹽水或其它已知材料。鼻內(nèi)制劑也可含有防腐劑，例如，但不局限于，氯丁醇和氯化芐烷銨，可加入一表面活性劑促進(jìn)鼻粘膜吸收主要蛋白。
另外，主要的SRIF肽可以中性或鹽的形式存在于主要的制劑中。藥理學(xué)上可行的鹽包括酸加成鹽(與活性多肽的游離氨基形成)，它們是與無機(jī)酸例如鹽酸或磷酸，或有機(jī)酸如乙酸，草酸，酒石酸，扁桃酸等形成的。通過游離酸基形成的鹽也可以與無機(jī)堿或有機(jī)堿而產(chǎn)生，這些無機(jī)堿有氫氧化鈉，氫氧化鉀，氫氧化銨，氫氧化鈣，或氫氧化鐵，有機(jī)堿有異丙胺，三甲胺，2-乙氨基乙醇，組氨酸普魯卡因等。
以下是實(shí)行本發(fā)明的特定實(shí)施例，它們僅用于說明，而不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
C.實(shí)驗(yàn)材料和方法SRIF14(環(huán)狀)(SS-14)，[Tyr′]-SRIF，[Tyr″]-SRIF，SRIF 28(環(huán)狀)(SS-28)及SRIF28(1-14)[SS-28(1-14)]是從Bachem Inc.，Torrance，CA.購買的。碳化二亞胺(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺HCl;Pierce)和卵清蛋白(99%純;Sigma)分別用作結(jié)合劑和載體。弗氏完全和不完全佐劑來源于商業(yè)渠道(Sigma或Difco)。Al(OH)3-鋁膠來自Superfos(丹麥)。
在Saskatchewan大學(xué)綿羊研究單位的雜種綿羊根據(jù)一般商業(yè)性管理方法飼養(yǎng)。綿羊群得到細(xì)致的管理，以研究其繁殖。母羊每8個(gè)月繁殖一次，每二年得3頭小羊。這導(dǎo)致在繁殖季節(jié)處有一次繁殖(5-6月)，其余的在1月或9月。用浸漬醋酸甲羥孕酮(60毫克)的陰道內(nèi)海綿使發(fā)情期同步。對繁殖季節(jié)外的繁殖用光周期操作引起發(fā)情。公羊每兩年測試一次精子，在去除海綿后，按10頭母羊?qū)?頭公羊的比例，留置25天，免疫母羊及它們的同齡的母羊(對照)作為一組飼養(yǎng)。按一般情況下對母羊及公羊進(jìn)行營養(yǎng)管理，包括在繁殖前先沖洗母羊。
所有對豬進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)都是在Saskatchewan大學(xué)Prairie Swine Center進(jìn)行的。根據(jù)一般商業(yè)管理飼養(yǎng)豬群，包括小母豬和大母豬的自然繁殖。
實(shí)施例1免疫原性制劑的制備用碳化二亞胺按以下方式使SRIF結(jié)合到卵清蛋白上。
106毫克SRIF-14溶解于26.5毫升蒸餾水中;
424毫克卵清蛋白溶解于50毫升蒸餾水中，及;
742毫克碳化二亞胺溶解于22毫升蒸餾水中。
碳化二亞胺溶液與卵清蛋白溶液混合。在10分鐘內(nèi)一邊滴加入SRIF溶液，一邊在室溫下不斷攪拌，室溫下在暗處繼續(xù)攪拌，使反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行24小時(shí)。完成后，反應(yīng)混合物在4℃對蒸餾水滲析(1∶20)，共48小時(shí)，每12小時(shí)換水。滲析管隔離分子量為3000。SRIF與卵清蛋白結(jié)合的效率由125I-[Tyr′]-SRIF-14的內(nèi)含物決定。幾個(gè)反應(yīng)的效率在55-60%之間。SRIF與卵清蛋白的摩爾比估計(jì)是3∶1。最終制劑在二倍體積的弗氏完全佐劑中乳化。
使人驚奇的是，當(dāng)SRIF-卵清蛋白制劑用反相高壓液相色譜法分析時(shí)，色譜圖(圖7)表示該結(jié)合物的組成是幾個(gè)分子的SRIF偶聯(lián)到一個(gè)卵清蛋白分子上。沒有觀察到卵清蛋白的高分子量聚合體。這對用化學(xué)聯(lián)接方法，如用碳化二亞胺，產(chǎn)生的制劑來說是不尋常的，因?yàn)橥ǔ?huì)產(chǎn)生載體分子的交聯(lián)聚合體。用所描述的連結(jié)方法可產(chǎn)生非常有效的免疫原性制劑，當(dāng)它接種于脊椎動(dòng)物后，引起中性抗體應(yīng)答，如以下所舉例說明的。
實(shí)施例2測量抗SRIF的抗體滴度在血中抗SRIF的抗體滴度是由采用125I-[Tyr′]-SRIF-14液相直接結(jié)合試驗(yàn)，及通過炭抽提分離結(jié)合/非結(jié)合配體決定(Laarveld et al.，1986)。所報(bào)告的滴度是，為獲得50%結(jié)合的8000cpm單碘化[Tyr′]-SRIF-14(大約1.8pg)所需的血漿最終稀釋。在有些情況下，對滴度加以說明是為獲得35%結(jié)合所需的最終稀釋。
實(shí)施例3制備動(dòng)物體內(nèi)抗SRIF的被動(dòng)免疫的抗血清用實(shí)施例1的免疫原性制劑對綿羊進(jìn)行超免疫。免疫后二周，從頸靜脈處取500毫升血樣。使血液凝結(jié)，然后離心，將細(xì)胞與血清分離。從動(dòng)物中得的血清或直接應(yīng)用，或用傳統(tǒng)技術(shù)，如(NH4)2SO4沉淀法，或蛋白A瓊脂糖凝膠或蛋白G瓊脂糖凝膠親和層析法進(jìn)一步純化血清中的抗體。這些方法對本領(lǐng)域熟練人員是熟悉的，在Harlow和Lane(1988)中得以描述。
實(shí)施例4多克隆抗血清與各種SRIF樣或SRIF相關(guān)肽的交叉反應(yīng)的檢測在一定數(shù)目的綿羊上進(jìn)行由實(shí)施例1的免疫原產(chǎn)生的抗血清的定性分析。在一般放射免疫測試步驟中，抗血清在磷酸緩沖鹽溶液中(PBS)合適稀釋，以與放射性示蹤劑125I-[Tyr′]-SRIF-14(6000-8000cpm)形成一定量結(jié)合，此抗血清與以下肽的系列稀釋液孵育SRIF-14，[Tyr′]-SRIF-14，[Tyr″]-SRIF-14，SRIF-28，SRIF-28(1-14)。不斷測定放射性示蹤劑的置換情況(B/Bo×100;結(jié)合%)。
SRIF-卵清蛋白結(jié)合物誘導(dǎo)產(chǎn)生多克隆抗血法，后者與SRIF-14，SRIF-28和[Tyr′]-SRIF-14產(chǎn)生交叉反應(yīng)。與[Tyr″]-SRIF-14的交叉反應(yīng)很少，與SRIF-28(1-14)無交叉反應(yīng)。可在圖1和2中見到綿羊抗血清的兩個(gè)交叉反應(yīng)試驗(yàn)的例子。結(jié)果表明為常見交叉反應(yīng)模式(Patel 1984)，及SRIF的初級(jí)抗原決定簇在環(huán)上，因?yàn)樵?1位上氨基酸用酪氨酸取代，導(dǎo)致活性大部分喪失。
實(shí)施例5經(jīng)抗SRIF免疫的綿羊的繁殖行為將實(shí)施例1的免疫原性制劑在頸部的二個(gè)地方皮下注入綿羊，及肌內(nèi)注入小母豬。劑量為每頭動(dòng)物0.25到0.50毫克SRIF-14，即給的量為5到15微克/千克。加強(qiáng)免疫用同樣的量，注入頸部區(qū)域，用弗系不完全佐劑給予。在3周后及間隙4周或根據(jù)需要，給予輔助藥劑。動(dòng)物通常在繁殖前10天接受加強(qiáng)疫苗接種。在母羊中，抗SRIF的抗體滴度范圍很寬，從104到3×105(倒數(shù))。
在繁殖季節(jié)中綿羊的繁殖行為由于抗SRIF的免疫而加強(qiáng)(表1)。第一次交配的懷孕率增加(p＜0.05)15%，總的懷孕率增加(p＜0.01)15%。經(jīng)免疫的母羊具100%懷孕率。
表1在秋季和冬季抗SRIF免疫對母羊繁殖行為的影響對照 SRIF-免疫觀察數(shù) 89 48第一次交配懷孕數(shù) 55 37懷孕率 61.8% 77.1%＊第二次交配懷孕數(shù) 21 11懷孕率 23.6% 22.9%未定數(shù) 13 0總的懷孕率 85.4% 100%＊＊每次出生的小羊 2.05 2.06抗-SRIF-14滴度- 10到3×101九月和一月2滴度倒數(shù)的范圍＊平均值有顯著差異(p＜0.05);Fisher's精密試驗(yàn)＊＊平均值(p＜0.01)有顯著差異在繁殖季節(jié)外繁殖常導(dǎo)致不良的繁殖行為(Rawlongs et la.，\1987)。但是，在這一情況下抗SRIF免疫的則可使總的懷孕率從對照的30.8增加到免疫動(dòng)物的70.8%(表2)。
表2在繁殖季節(jié)外的繁殖期間抗SRIF免疫對母羊繁殖行為的作用對照 SRIF-免疫觀察數(shù) 13 24
第一次交配懷孕數(shù) 4 15懷孕率 30.8% 62.5%？總的懷孕率第二次交配后懷孕數(shù) 4 17懷孕率 30.8% 70.85%＊抗-SRIF-14滴度- 10到5×101在6月繁殖2模擬秋天長度的光周期3滴度倒數(shù)的范圍？P-0.066;Fisher's精密試驗(yàn)＊P-0.022實(shí)施例6經(jīng)抗SRIF免疫的羊繁殖季節(jié)外的繁殖行為用25%Al(OH)3水凝膠佐劑代替Fisher's佐劑來制得實(shí)施例1的免疫原性制劑，將該制劑在半腱肌/半膜位置處肌肉內(nèi)注入羊體中。每只動(dòng)物所用的劑量是100μg結(jié)合的SRIF-14。在初次免疫后的第三周和第五周分別注入相同劑量和相同的位置，進(jìn)行加強(qiáng)免疫。在繁殖前約7天進(jìn)行最后一次注射。通過肉眼檢查動(dòng)物及識(shí)別母羊背上的圖案來監(jiān)測繁殖行為，母羊背上的圖案是由于被帶有顏色筆標(biāo)記的挽具的公羊騎了以后得到的。在早晨的第一件事就是進(jìn)行上述觀察，然后在白天間隔一定的時(shí)間進(jìn)行觀察。
抗SRIF的免疫增強(qiáng)了羊的繁殖季節(jié)外繁殖行為增長了(見表3)，該試驗(yàn)的結(jié)果表明，動(dòng)物的發(fā)情次數(shù)增加，證實(shí)了在其它實(shí)施例中所發(fā)現(xiàn)的懷孕率也增加。
表3繁殖季節(jié)處的繁殖行為組 動(dòng)物號(hào) 標(biāo)記動(dòng)物號(hào) 動(dòng)物繁殖%經(jīng)免疫 31 22 71對照 28 13 46實(shí)施例7抗SRIF免疫的豬的繁殖行為小母豬在體重達(dá)35-45kg時(shí)進(jìn)行第一次抗SRIF的免疫，并在21天后進(jìn)行第二次免疫。使用劑量為5-15μg/kg。體重為95kg時(shí)，用PM SG(500IU)(Kirkwood et al.，1988)誘導(dǎo)小母豬發(fā)情，在7天后給予一個(gè)加強(qiáng)免疫。觀察到第一次自然發(fā)情后，小母豬進(jìn)行自然繁殖，如果需要，可在自然繁殖后讓小母豬第二次發(fā)情循環(huán)。將免疫的小母豬與在初次免疫時(shí)選擇的同期小母豬進(jìn)行比較。
用這些小母豬進(jìn)行兩種研究。許多經(jīng)免疫小母豬和對照小母豬在第一次自然發(fā)情后被宰殺以測定其排卵率。在第二種研究中使小母豬如上所述繁殖并讓其產(chǎn)下小豬。
如表4所示，抗SRIF 17免疫提高了小母豬的排卵比率(p＜0.10)。
表4抗SRIF免疫的小母豬和對照小母豬首次自然發(fā)情后的排卵率對照 SRIF-免疫 P觀察數(shù) 17 15
排卵率 10.7±0.4 11.8±0.6 0.096抗SRIF-14滴度 0 38001平均±滴度2Fisher's精密試驗(yàn)3在首次繁殖時(shí)滴度(35%結(jié)合)倒數(shù)的平均值如表5所闡述的那樣，繁殖時(shí)的體重不受該處理的影響。但是，與對照動(dòng)物相比，抗SRIF免疫的動(dòng)物的一窩產(chǎn)仔數(shù)顯著增加。出生時(shí)小豬體重與出生時(shí)窩重?zé)o明顯不同。
表5抗SRIF免疫對小母豬生殖行為的影響對照 SRIF-免疫 可能性觀察數(shù) 11 11繁殖時(shí)體重(kg) 99.0±1.5 97.1±2.5 0.55一窩產(chǎn)仔數(shù) 8.5±0.56 10.4±0.61 0.042出生時(shí)小豬重量 1.47±0.05 1.41±0.04 0.337出生時(shí)的窩重(kg) 11.7±0.75 12.8±0.65 0.285抗SRIF-14滴度 0 38001平均±SRIF;同一種不同的上標(biāo)平均值不同(p＜0.05)2Fisher's精密試驗(yàn)3首次繁殖時(shí)滴度倒數(shù)的平均值(35%結(jié)合)實(shí)施例8SRIF免疫對母雞繁殖作用的研究A.重組VP6的生產(chǎn)為了生產(chǎn)重組VP6，將牛輪狀病毒(rotavirus)C486的基因6首先克隆到pBR322的PstⅠ位點(diǎn)上。所得的克隆用AhaⅢ和HpaⅢ酶切并亞克隆到pAC373的SmaⅠ的位點(diǎn)上。轉(zhuǎn)染入Escherichia coli后，通過用限制性內(nèi)切酶分析在正確轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上的插入而篩選重組氨比西林抗性菌落中的質(zhì)粒。將來自PAC373載體的基因6 cDNA轉(zhuǎn)移到Antographa californica細(xì)胞核多面體病毒(A cNPV)DNA中，用前述的磷酸鈣沉淀方法(Smith et al.，1983)使Spodoptera fruqiperda細(xì)胞與野生型的A cNP VDNA共轉(zhuǎn)染。然后在27℃下孵育7小時(shí)，除去培養(yǎng)基，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞感染的信號(hào)。在感染后第5天收集細(xì)胞外病毒并在Spodoptera frugiperda細(xì)胞單層上形成噬菌區(qū)。用倒置顯微鏡通過識(shí)別堵塞的陰性噬菌區(qū)來篩選重組子。讓陽性的噬菌斑在微量滴定盤中進(jìn)一步生長，對這此盤中的感染細(xì)胞進(jìn)行核酸點(diǎn)印跡，以證實(shí)基因6的存在。對微滴定井中陽性懸浮液的進(jìn)行噬菌斑純化并采用來自這些噬菌斑的病毒來繁殖病毒子。
為了從感染的細(xì)胞中分離VP6，首先用含1%NP40，0.137M Na Cl、1mMCa Cl2，0.5mMMg Cl2和0.1mg/ml抑肽酶的緩沖液細(xì)胞溶解。然后將溶解物在透析袋中于0.01M枸櫞酸鹽緩沖液，pH4.0透析48小時(shí)，在此期間透析袋中形成了沉淀物(重新裝配的VP6)。通過離心收集沉淀，隨后用0.05M EDTA，pH5.0處理1小時(shí)并再次離心，所得的顆含有純化的VP6重新裝配的小球。
在美國保藏中心(ATCC)，12301 Paeklawn Dr.Rockville，MD 20852，USA中可以獲得輪狀病毒C486，它是在1981年4月15日保藏在第VR-917號(hào)中。含有輪狀病毒基因6 cNDA的pAC373載體稱為pAC373BRV6，它在1987年8月31日保藏在ATC C中，登記號(hào)為40362，在那里它將在布達(dá)佩斯條約下進(jìn)行保藏。
B.將VP6接合到SRIF上用下列方法通過碳化二亞胺交聯(lián)使上述產(chǎn)生的重組VP6小球接合到SRIF上，其接合比率為1 SRIF 1VP6單體。將5mg環(huán)SRIF(Bachem)溶于0.5毫升10mM磷酸緩沖液(pH6.5)中。將5mg VP6小球溶于2.5毫升相同的緩沖液中。將2mg EDAC(水溶性碳化二亞胺)加至VP6溶液中并混合2分鐘。然后加入SRIF溶液，充分混勻，在4℃下在攪拌機(jī)平板上持續(xù)振搖，孵育過夜。在室溫下用重蒸水每小時(shí)換水3次來透析樣品，僅在振搖時(shí)沉淀出來的產(chǎn)物能均勻地分散。
C.母雞用SRIF-VP6免疫Hyline CV16白菜克亨(White Leghorn)母雞用于最初實(shí)驗(yàn)中以研究SRIF免疫繁殖的影響。將產(chǎn)蛋母雞分成4組，每組10個(gè)，各自稱重。
1)未注射對照(UC);
2)鹽水注射對照(SC);
3)每毫升25μg SRIF(25 S);
4)每毫升100μg SRIF(100 S)。
用白菜克亨公雞的精液給每組母雞授精。在免疫前觀察母雞和蛋。然后用0.5-2.0毫升，最好用1毫升SRIF-VP6復(fù)合物免疫母雞。觀察母雞并測定SRIF的血漿抗體滴度。用0.5-2.0毫升SRIF-VP6載體復(fù)合物對母雞進(jìn)行加強(qiáng)免疫。測定血漿抗SRIF抗體的滴度并觀察母雞和蛋。然后用收集白菜克亨雞的精液給母雞授精，收集蛋進(jìn)行抗體分析。對蛋進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)并稱出蛋重。對孵出的小雞稱重并監(jiān)測生長率。試驗(yàn)組與對照母雞相比蛋的數(shù)目無明顯差別。但是，在試驗(yàn)組蛋中發(fā)現(xiàn)了明顯多的抗SRIF抗體，這表明免疫是成功的。在新孵出的小雞中也有SRIF免疫存在。觀察得到的結(jié)果表明該母雞繁殖已是非常多產(chǎn)的實(shí)施例9SRIF對顆粒狀細(xì)胞和黃體素細(xì)胞(Luleal)的作用A.如Rajkumar et al.，1989中所述，通過輕刮卵泡內(nèi)膜而從成熟的卵巢的卵泡中分離出顆粒狀細(xì)胞。將細(xì)胞在有或沒有2μg黃體素激素(LH)或25μM(FK)的時(shí)進(jìn)行孵育。在加入LH或FK以前5分鐘將如表3所示滴定量的SRIF加至孵育管中。在磷酸二酯酶抑制劑的存在下于37℃內(nèi)孵育1小時(shí)。將樣品煮沸15分鐘以終止孵育。然后離心樣品，如Brooker et al.，1979所述的用RIA來測定上清液中的cAMP。
從圖3中可見SRIF抑制FK刺激cAMP以在某種程度上LH刺激cAMP。
與其它關(guān)于垂體細(xì)胞的文獻(xiàn)報(bào)告一致，SRIF不抑制基礎(chǔ)cAMP活性。只有當(dāng)cAMP水平被刺激后超出基礎(chǔ)水平20-30%時(shí)才有作用。
B.在有或沒有SRIF抗-SRIF存在時(shí)也將顆粒狀細(xì)胞與FK一起孵育。在加入FK前將SRIF加入孵育5分鐘，對與抗SRIF一起孵育的樣品來說將SRIF與足以中和SRIF活性的預(yù)定抗體預(yù)卵育1小時(shí)。抗體如實(shí)施例3所述進(jìn)行制備。
如圖4所示，在某些情況下，例如，單獨(dú)有SRIF存在時(shí)，或當(dāng)用SRIF特異性抗血清處理時(shí)有SRIF加上FK存在時(shí)，可以解除對cAMP的活性的抑制，使受抑制的cAMP回復(fù)至對照水平。
C.黃體素細(xì)胞用上述對顆粒狀細(xì)胞所述的方法進(jìn)行分離，用實(shí)施例9A所述的方法測定滴度。
如圖5所示，在黃體素細(xì)胞中基礎(chǔ)cAMP活性也受極低劑量的SRIF影響。
這些結(jié)果提示用SRIF免疫得到一種免疫應(yīng)答，它進(jìn)而阻止對cAMP活性的抑制從而增加生殖效率。
實(shí)施例10由于抗生長激素抑制因子樣或生長激素抑制因子相關(guān)的肽的多克隆抗血清引起的PMN活性的增加在羊頸部兩點(diǎn)處皮下注射實(shí)施例1中制得的免疫制劑。劑量為每個(gè)動(dòng)物0.24mg-0.50mg SRIF-14。在第3周時(shí)用實(shí)施例6制得的免疫制劑以與初次注射相同的劑量進(jìn)行加強(qiáng)免疫，然后如果需要的話間隔4周再加強(qiáng)一次。在繁殖前10天及在產(chǎn)小羊前兩周(估計(jì))通常動(dòng)物再接受加強(qiáng)疫苗接種，測定母羊中的SRIF的滴度，其范圍為104-3×105。
為了達(dá)到該實(shí)施例的目的，在產(chǎn)小羊前21天、-14天和-7天、在產(chǎn)小羊時(shí)以及產(chǎn)小羊后+3天、+7天和+14天從SRIF-14免疫組或從只給予載體蛋白而沒有SRIF-14的安慰組中取血樣。從頸靜脈中收集周圍血放入枸櫞酸鈉中。將枸櫞酸鹽化的血進(jìn)行離心并除去淡黃色覆蓋層。通過用如Chmann et al.，1984中所述的紅細(xì)胞高張力溶血使PMN組分從紅血球中分離出來。
在Johnson et al.，1978中所述的方法通過產(chǎn)生超氧化物陰離子來測量細(xì)胞的功能性活性，并用Ohmann et al.，1984中所述的方法修飾。簡言之，通過使氮藍(lán)四唑(NBT)還原來測定過氧化物陰離子的產(chǎn)生及釋放。將約10°細(xì)胞置于0.05% NBT與酵母多糖(2.52毫克)一起在37℃下孵化30分鐘使其活化。終止反應(yīng)，細(xì)胞集結(jié)，NBT的還原則在572nm處用分光光度法測定。
SRIF免疫動(dòng)物的PMN活性顯著高于對照組中觀察到的水平(見圖6)。分娩后7天增長的活性減少，這與平時(shí)觀察到的動(dòng)物分娩時(shí)的免疫抑制一致。
這樣，我們已經(jīng)闡述了在脊椎動(dòng)物中用來增強(qiáng)生殖行為及免疫功能的制劑和方法。雖然已較詳盡地描述了本發(fā)明的較好實(shí)例，但應(yīng)當(dāng)明白可以作一些顯而易見的變化而不違背本發(fā)明權(quán)利要求所定義的精神及范圍。
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權(quán)利要求
1.一種組合物，其特征在于它包含一種藥理學(xué)上可行的載體及一種SRIF相關(guān)肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于所述的SRIF相關(guān)肽為SRIF-14。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制劑，其特征在于所述的SRIF相關(guān)肽與一個(gè)載體相連結(jié)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制劑，其特征在于所述的載體實(shí)質(zhì)上同源于輪狀病毒VP6的內(nèi)殼蛋白，或其功能性片段。
5.一種制劑，其特征在于它包括藥理學(xué)上可行的載體，與卵白蛋白相連的SRIF相關(guān)肽及一種包含Al(OH)3的佐劑。
6.一種制劑，其特征在于它含藥理學(xué)上可行的載體及抗SRIF抗體。
7.一種通過誘導(dǎo)免疫反應(yīng)而增強(qiáng)脊椎動(dòng)物生殖效率的方法，其特征在于該方法包括給所述的脊椎動(dòng)物服用有效治療劑量的根據(jù)權(quán)利要求1，5或6的制劑。
8.一種通過誘導(dǎo)免疫反應(yīng)而增強(qiáng)脊椎動(dòng)物免疫功能的方法，其特征在于該方法包括給所述的脊椎動(dòng)物服用有效治療劑量的根據(jù)權(quán)利要求1，5或6的制劑。
9.一種通過誘導(dǎo)免疫反應(yīng)增強(qiáng)脊椎動(dòng)物體內(nèi)SRIF活性的方法，其特征在于該方法包括給所述的脊椎動(dòng)物服用有效治療劑量的根據(jù)權(quán)利要求1，5或6的制劑。
10.一種通過誘導(dǎo)免疫反應(yīng)增強(qiáng)脊椎動(dòng)物吞噬細(xì)胞功能的方法，其特征在于該方法包括給所述的脊椎動(dòng)物服用有效治療劑量的根據(jù)權(quán)利要求1，5或的制劑。
全文摘要
本發(fā)明揭示了調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物體內(nèi)SRIF活性，及增強(qiáng)脊椎動(dòng)物生殖行為和免疫功能的制劑及方法。可以給動(dòng)物服用含SRIF相關(guān)肽或抗體的制劑以調(diào)節(jié)內(nèi)源性SRIF樣活性。SRIF相關(guān)肽能與載體例如卵清蛋白連結(jié)，及在Al(OH)
文檔編號(hào)A61P15/00GK1048328SQ9010316
公開日1991年1月9日 申請日期1990年6月22日 優(yōu)先權(quán)日1989年6月22日
發(fā)明者伯納德·拉維爾德, 羅伊·內(nèi)維爾·科克沃德, 菲利普·阿爾弗雷德·撒克, 洛蘭·M·索爾迪洛, 馬克·雷德蒙 申請人:薩斯喀徹溫大學(xué)