專利名稱：含蛋白質(zhì)的水質(zhì)溶液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有蛋白質(zhì)的水溶液、增高蛋白質(zhì)濃度的方法以及一種蛋白質(zhì)配制劑，還涉及應(yīng)用生理活性蛋白質(zhì)制備臨床用藥物所用的技術(shù)。
在應(yīng)用蛋白質(zhì)作為均質(zhì)組分的場合中，將蛋白質(zhì)溶解于一種溶劑中是十分重要的。例如，在把一定量的蛋白質(zhì)從含有該蛋白質(zhì)的組合物中分離的場合，或在分析所制造的蛋白質(zhì)的場合，必須保證含有該蛋白質(zhì)的組合物是均質(zhì)的。此外，當(dāng)把蛋白質(zhì)溶解在水中并作為例如注射液來給藥時(shí)，該蛋白質(zhì)必須是完全溶解的。
一般，蛋白質(zhì)在水質(zhì)溶劑中的溶解度受該蛋白質(zhì)表面存在的親水或疏水性殘基的很大影響，也受蛋白質(zhì)上的電荷很大影響。
當(dāng)由于在蛋白質(zhì)表面存在疏水性殘基而使該蛋白質(zhì)只是微溶之時(shí)，借助于加入表面活性劑是不可能增高其溶解度的。
另方面，當(dāng)水質(zhì)溶劑的pH值接近于要溶解的蛋白質(zhì)的容易發(fā)生等電沉淀作用的等電點(diǎn)時(shí)，則借助增高該水質(zhì)溶劑中鹽的濃度和離子強(qiáng)度而增高該蛋白質(zhì)的溶解度。在此情況下，表面活性劑并不能使該蛋白質(zhì)的溶解度增高。此外，當(dāng)水質(zhì)溶劑的pH值接近于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)并且鹽的濃度很低時(shí)，所溶解的蛋白質(zhì)只能達(dá)到較低濃度。因此，為了使溶解的蛋白質(zhì)達(dá)到較高濃度，通常采用的方法可以是使所用的pH值遠(yuǎn)離其等電點(diǎn)，或者是增高鹽的濃度。
但是，在某些情況下，要求不增高鹽的濃度并在在靠近等電點(diǎn)的條件下使溶解的蛋白質(zhì)達(dá)到足夠高的濃度。實(shí)例之一是在患者需要保持鹽的攝取量盡可能低的條件下、以近于中性pH的溶液形式將等電點(diǎn)接近中性pH的生理活性蛋白質(zhì)為患者給藥。在此情況下，唯一可行的辦法是使用低濃度的蛋白質(zhì)，或者不可避免地使患者攝取鹽，這是在藥物活性蛋白質(zhì)制劑方面亟需解決的重要實(shí)際問題。
本發(fā)明的目的是提供一種高濃度的蛋白質(zhì)水質(zhì)溶液。另一目的是提供一種將蛋白質(zhì)溶解在水質(zhì)溶液中達(dá)到高濃度的方法。另一目的是提供一種具優(yōu)良溶解性的蛋白質(zhì)制劑。
在配制含蛋白質(zhì)的濃溶液方面，本發(fā)明者首次發(fā)現(xiàn)當(dāng)一種蛋白質(zhì)在適當(dāng)?shù)膒H結(jié)合于一種離子交換物質(zhì)時(shí)，該蛋白質(zhì)與該離子交換物質(zhì)的結(jié)合在鹽濃度低時(shí)即易發(fā)生，還發(fā)現(xiàn)因此而可借助于用陰離子殘基未取代用于溶解疏水性蛋白質(zhì)的表面活性劑的疏水性殘基而使蛋白質(zhì)溶解，所依據(jù)的是與使用表面活性劑時(shí)相同的作用機(jī)制。
基于上述的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明者在進(jìn)一步的深入研究中，還確定了陰離子聚合物或陰離子聚合物的鹽類能產(chǎn)生有利的如上述的效應(yīng)，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供一種含蛋白質(zhì)的水質(zhì)溶液，其中共存有一種陰離子聚合物或它的鹽，提供一種方法使含蛋白質(zhì)和陰離子聚合物或其鹽的水質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)濃度增高，以及提供含有蛋白質(zhì)和一種陰離子聚合物或其鹽的制劑。
在JPLO236730/1986中披露了一種藥物制劑，其中含有一種糖化物即一種類型的陰離子聚合物，例如多硫酸化或多磺化的糖，還含有t-PA(組織型血纖維蛋白溶酶原活化劑)。但其中所披露內(nèi)容與本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是根本不同的，本發(fā)明是要增高蛋白質(zhì)的溶解度。
本發(fā)明提供一種含蛋白質(zhì)的水質(zhì)溶液，其中的蛋白質(zhì)濃度提高到采用常規(guī)技術(shù)從來未能達(dá)到的高濃度，特別是所提供的含蛋白質(zhì)水質(zhì)溶液中鹽的濃度低，pH值接近其等電點(diǎn)。
按常規(guī)方式，為了在接近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的pH條件下溶解蛋白質(zhì)，必須(1)顯著降低蛋白質(zhì)濃度，或(2)顯著增高鹽的濃度。當(dāng)需要將生理活性的蛋白質(zhì)以溶液形式在近于該蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的pH值為限制攝取鹽的患者給藥時(shí)，用如此制備的蛋白質(zhì)溶液是十分不方便的。為了使蛋白質(zhì)溶解同時(shí)不增高鹽的濃度，必須選擇遠(yuǎn)離該蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的pH值，即使所選pH值并不適于藥物用途例如注射或其他非腸道給藥方式，也要那樣作。
按本發(fā)明則與前不同，可在不增高鹽濃度和近于該蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的pH值條件下使蛋白質(zhì)溶解，于是可以提供鹽濃度低和pH接近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的含該蛋白質(zhì)的水質(zhì)溶液。與常規(guī)技術(shù)相比，本發(fā)明提供了具優(yōu)越性的技術(shù)。
本發(fā)明特別適用于制備鹽濃度低和等電點(diǎn)接近中性的生理活性蛋白質(zhì)的注射液。
用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)實(shí)例包括物化簡單的蛋白質(zhì)、結(jié)合蛋白質(zhì)和誘導(dǎo)蛋白質(zhì)，以及具有較多疏水性基團(tuán)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明特別適用于諸如球蛋白或t-PA等蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)在接近其等電點(diǎn)的pH條件下溶解度大大降低，實(shí)例為等電點(diǎn)遠(yuǎn)離極酸條件的蛋白質(zhì)，一般為pH＝4或更高，更多是pH＝5或更高。這些蛋白質(zhì)可以從自然生物體提取而得，利用化學(xué)合成或應(yīng)用基因重組體DNA技術(shù)從各種培養(yǎng)物獲得。如上述所得的蛋白質(zhì)可以在修飾之后應(yīng)用。這些蛋白質(zhì)的實(shí)例包括γ-球蛋白，例如免疫球蛋白A、G和E，乳球蛋白，尿激酶(Urokinase)，前尿激酶(Prourokinaes)以及組織型血纖維蛋白溶酶原活化劑(t-PA)。本發(fā)明特別適用于具生理活性的蛋白質(zhì)。
這些蛋白質(zhì)可以單獨(dú)使用，或使用兩種或多種蛋白質(zhì)的混合物，或不同類型蛋白質(zhì)的混合物。
用于本發(fā)明的陰離子聚合物的陰離子殘基例如有羧基、羧甲基、硫酸根以及磷酸根。該等陰離子聚合物的主鏈例如有糖類如糖醇、纖維素、直鏈淀粉、氨基酸以及核酸的堿，優(yōu)選的是分子量為1000至1000000的陰離子聚合物。具有陰離子殘基和聚合物主鏈的陰離子聚合物例如有羧甲基離子交換物質(zhì)，如羧甲基直鏈淀粉和羧甲基纖維素;酸性多糖如精氨酸;硫酸粘多糖如硫酸葡聚糖、硫酸軟骨素、硫酸軟骨素 A、硫酸軟骨素 B、硫酸軟骨素 C、硫酸軟骨素 D、硫酸軟骨素 E、肝素、硫酸角質(zhì)、硫酸角質(zhì)素以及硫酸類肝素，酸性多氨基酸如多L-谷氨酸以及核酸。這些陰離子聚合物的鹽類可以有鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽等等。
這些陰離子聚合物可以單獨(dú)使用或者兩種或多種組合使用。
陰離子聚合物或其鹽的優(yōu)選用量為準(zhǔn)備要溶解的蛋白質(zhì)的1/40(重量/重量)或更多，更好是1/10(重量/重量)或更多，以及100或少于100。若所用陰離子聚合物的量不足，可能達(dá)不到所要求的蛋白質(zhì)溶解量;若其用量過多，可溶解的蛋白質(zhì)相對量減少，使含蛋白質(zhì)水質(zhì)溶液不能有效應(yīng)用。由于陰離子聚合物及其鹽的陰離子殘基類型、交換陽離子的能力、分子量等等都互不相同，陰離子聚合物及其鹽的用量可以根據(jù)要配制的蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)來決定。
按本發(fā)明的含蛋白質(zhì)水質(zhì)溶液中該蛋白質(zhì)的濃度是根據(jù)要溶解的那種蛋白質(zhì)的溶解度而定，并且每種蛋白質(zhì)各有其獨(dú)特情況，所以不能一般性規(guī)定;但一般可以得到蛋白質(zhì)濃度0.1毫克1/毫升或更高的水質(zhì)溶液，因?yàn)槠淙芙舛?，特別是在近于其等電點(diǎn)的pH值范圍的溶解度，要比常規(guī)的含相同蛋白質(zhì)的水質(zhì)溶液所達(dá)到的溶解度高得多。當(dāng)然，本發(fā)明并不排除蛋白質(zhì)濃度低于此濃度的溶液。實(shí)際上，按本發(fā)明，即使在稀溶液中也不會(huì)發(fā)生蛋白質(zhì)沉淀。按本發(fā)明，通常可以制備蛋白質(zhì)濃度約0.01至10毫克/毫升的蛋白質(zhì)水質(zhì)溶液。
在本發(fā)明中，該水質(zhì)溶液的pH值范圍并無特別限定。但是，本發(fā)明的特征在于在靠近該蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的pH條件下可以在不增高鹽濃度的情況下使蛋白質(zhì)溶解度增高;鑒于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)大多在弱酸至堿性pH范圍，所以當(dāng)該水質(zhì)溶液是在弱酸性、中性、弱堿性或堿性pH時(shí)，本發(fā)明是特別有價(jià)值的。特別是，該水質(zhì)溶液的pH值最好在距離該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)-2至+2范圍內(nèi)，更好是在-1至+1范圍內(nèi)。
在本發(fā)明中，準(zhǔn)備配制用的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)是用電泳法測定的。此外，有一些蛋白質(zhì)在用電泳法測定時(shí)等電點(diǎn)時(shí)常不是集中在一個(gè)點(diǎn)，而是某一pH范圍的帶，在此情況下由此pH范圍代表其等電點(diǎn)。再者，如果是多于兩種的具不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)的混合物，由覆蓋所有蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的pH范圍代表該混合物的等電點(diǎn)。
按本發(fā)明的含蛋白質(zhì)和陰離子聚合物或其鹽的水質(zhì)溶液的離子強(qiáng)度優(yōu)選為0.05摩爾/升或更低，更好是0.02摩爾/升或更低，最好是0.01摩爾/升或更低。若離子強(qiáng)度超過0.05摩爾/升，本發(fā)明的效果顯著下降。這可能是由于該陰離子聚合物的陰離子殘基與該蛋白質(zhì)的相互作用在高離子強(qiáng)度的溶液中被抵消。
另外，除陰離子聚合物或其鹽之外的鹽的含量優(yōu)選為低于每1毫克蛋白質(zhì)0.1摩爾。例如，在NaCl高含量的溶液中，該陰離子聚合物可能被閉鎖。
在實(shí)施本發(fā)明的溶解步驟時(shí)，可采取以下方法。首先，在遠(yuǎn)離該等電點(diǎn)的pH條件下將蛋白質(zhì)溶解，然后向所得蛋白質(zhì)溶液中加入含有陰離子聚合物或其鹽的溶液，并將其pH值調(diào)節(jié)到其等電點(diǎn)附近，于是制成蛋白質(zhì)與陰離子聚合物或其鹽共存的溶液。另一個(gè)可用的方法是在遠(yuǎn)離該蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的pH條件下先制備含蛋白質(zhì)和陰離子聚合物或其鹽的水質(zhì)溶液，然后把該溶液的pH值再調(diào)節(jié)到接近該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。
還有一種方法，先制備含有蛋白質(zhì)和陰離子聚合物的配制劑，然后把該配制劑溶解。制備此配制劑可采用任何常規(guī)方法。例如，在遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的pH條件下將蛋白質(zhì)溶解于稀溶液中，然后向此溶液中加入陰離子聚合物。經(jīng)過調(diào)節(jié)pH之后，向該溶液中加入賦形劑或類似物，將所得溶液過濾并分裝入小瓶，然后將之凍干而制成注射用藥物制劑。另一方式，向蛋白質(zhì)的水質(zhì)溶液中加入陰離子聚合物，形成蛋白質(zhì)與陰離子聚合物的復(fù)合物，將pH值調(diào)節(jié)至該復(fù)合物的等電點(diǎn)使所成復(fù)合物從溶液中沉淀，將之干燥并在加入配制用添加劑之后將之分裝入小瓶，制成制劑。該制劑的蛋白質(zhì)含量一般為0.01至50%(重量)。
若需要，為防止蛋白質(zhì)發(fā)生聚合和粘附到容器上，向蛋白質(zhì)溶液或凍干制劑中除加入陰離子聚合物或其鹽之外，還可以加入一種表面活性劑如吐溫80(Tween80);一種螯合劑如EDTA以避免金屬離子對蛋白質(zhì)的作用;一種穩(wěn)定蛋白質(zhì)生理活性的藥劑;以及賦形劑甘露糖醇和乳糖(當(dāng)采用凍干制劑時(shí)是有用的)。
按本發(fā)明，可以在接近等電點(diǎn)的pH條件下不必增高鹽的濃度或離子強(qiáng)度而可將蛋白質(zhì)有效地溶解。這一點(diǎn)已超出了常規(guī)的溶解蛋白質(zhì)技術(shù)的知識(shí)范圍，是本技術(shù)領(lǐng)域的一項(xiàng)顯著進(jìn)步。溶解效應(yīng)的機(jī)制還未完全明確;但是，可假定當(dāng)把陰離子聚合物或其鹽加入到處于接近其電點(diǎn)的pH的蛋白質(zhì)溶液中，并且該蛋白質(zhì)本身的溶解度又是很低，該蛋白質(zhì)和陰離子聚合物互相作用，特別在低的離子強(qiáng)度條件下，結(jié)果使溶解度大幅度增加。
由以下實(shí)施例對本發(fā)明作更具體說明實(shí)例1所用蛋白質(zhì)是來自人類的組織型血纖維蛋白溶酶原活化劑(t-PA)，它的制得是通過基因重組體技術(shù)將t-PA的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)在細(xì)胞培養(yǎng)物中，然后將之純化并從培養(yǎng)液中濃縮。該t-PA是溶解于60mM的磷酸鈉溶液中，從其pH值(4.2)來看，可以認(rèn)為它是磷酸二氫鈉。在一個(gè)纖維素制的滲析管中放入1毫克t-PA和0至1毫克肝素鈣鹽，然后加入蒸餾水使其總體積達(dá)1.0毫升。用1000毫升1mM的檸檬酸鹽緩沖溶液進(jìn)行滲析3小時(shí)。將滲析管中的液體轉(zhuǎn)移到小的聚丙烯試管中，以15000轉(zhuǎn)/分鐘離心分離10分鐘，然后在280毫微米測量上清液的吸光率來測定t-PA的溶解度。t-PA的等電點(diǎn)約為6.5-7.5。所得結(jié)果示于表1，很明顯，加入肝素鈣之后t-PA的溶解度增高，特別是當(dāng)其pH值接近于等電點(diǎn)時(shí)。
表1加入的肝素鈣鹽量a)，毫克pH 0 0.04 1.04.0 0.95 - 0.104.8 0.33 - 0.435.5 0.03 - 0.566.0 0.02 - 0.997.0b)0.04 - 0.997.5b)0.01 0.89 -8.0 0.03 0.86 -表內(nèi)所示為t-PA溶解度，毫克/毫升a)每1毫克t-PA的加入量b)pH值相當(dāng)于t-PA的等電點(diǎn)。
實(shí)例2按實(shí)例1的相同方式考察t-PA的溶解度，不同之處是使用表2所示的各種陰離子聚合物和陽離子聚合物來替代肝素，其量為0.1-0.2毫克。該溶液的pH值調(diào)節(jié)到7左右。結(jié)果示于表2。
使用陰離子聚合物時(shí)都使t-PA的溶解度大大增高;但是，使用陽離子聚合物時(shí)沒有一次能使溶解度增高。此外，加入氯化鈉甚致達(dá)到高濃度，也不能使之得到足夠高的溶解度。
表2添加劑 溶解度名稱 用量毫克/毫克t-PA 毫克/毫升無 0 0陰離子聚合物多L-谷氨酸(鈉鹽) 0.1 1.02DNA(來源于細(xì)菌) 0.18 0.99硫酸葡聚糖(鈣鹽) 0.1 1.03肝素(鈣鹽) 0.1 1.04硫酸軟骨素A(鈉鹽) 0.1 1.00硫酸軟骨素B(鈉鹽) 0.1 1.01硫酸軟骨素C(鈉鹽) 0.1 1.04精氨酸鈉 0.1 1.03陽離子聚合物硫酸魚精蛋白 0.1 0.00多L-賴氨酸 0.1 0.01鹽氯化鈉 200mM 0.31實(shí)例3按實(shí)例1的相同方式考察t-PA的溶解度，不同之處是在pH約為7的條件下，按表3所示由硫酸軟骨素A和硫酸類肝素替代肝素。結(jié)果示于表3。
試驗(yàn)表明t-PA的溶解度得到增高，特別是當(dāng)硫酸軟骨素A和硫酸類肝素的用量按t-PA重量計(jì)為1/40或更高時(shí)。
表3
添加劑 加入量 溶解度對t-PA的重量比 毫克/毫升硫酸軟骨素A(鈾鹽) 0 0.001/40 0.511/20 1.023/40 1.031/10 1.00硫酸類肝素(鈉鹽) 0 0.001/40 0.201/20 1.063/40 1.051/10 1.05實(shí)例4將水質(zhì)溶液的pH值調(diào)節(jié)到各該蛋白質(zhì)(t-PA和β-乳球蛋白)的等電點(diǎn)，并在加入或不加入硫酸軟骨素鈉鹽(其量為每種蛋白質(zhì)的1/10)的情況下考察蛋白質(zhì)溶解度。結(jié)果示于表4。
表4蛋白質(zhì) t-PA β-乳球蛋白等電點(diǎn) 6.5-7.5 5.1溶解度(毫克/毫升) 5硫酸軟骨素- 0.02 ＜1.06硫酸軟骨素+ 0.8 5.8實(shí)例5t-PA 100毫克硫酸軟骨素鈉 10毫克乳糖 500毫克將上列成分溶解于25毫升5mM磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)。過濾滅菌后，將溶液分裝入小瓶中，分瓶2.5毫升，然后凍干制成t-PA制劑。此t-PA制劑可以溶解于5%葡萄糖輸液溶液或注射用蒸餾水中。
實(shí)例6t-PA 100毫克肝素(鈉鹽) 10毫克乳糖 500毫克將上列成分溶解于25毫升5mM磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)。過濾滅菌后，將溶液分裝入小瓶中，每瓶2.5毫升，然后凍干制成t-PA制劑。此t-PA制劑可以溶解于5%葡萄糖輸液溶液或注射用蒸餾水中。
實(shí)例7t-PA 100毫克硫酸糊精(鈉鹽) 10毫克乳糖 500毫克將上列成分溶解于25毫升5mM磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)。過濾滅菌后，將溶液分裝入小瓶中，每瓶2.5毫升，然后凍干制成t-PA制劑。此t-PA制劑可以溶解于5%葡萄糖輸液溶液或注射用蒸餾水中。
權(quán)利要求
1.一種水質(zhì)溶液，其中包含一種蛋白質(zhì)和一種陰離子聚合物或該聚合物的一種鹽。
2.按權(quán)利要求1的水質(zhì)溶液，其中的陰離子聚合物或其鹽的存在量按與該蛋白質(zhì)的重量比率為1∶40或更多。
3.按權(quán)利要求1的水質(zhì)溶液，該溶液的pH范圍是在該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的-2至+2pH單位的范圍內(nèi)。
4.按權(quán)利要求1的水質(zhì)溶液，該溶液的離子強(qiáng)度為0.05摩爾/升或更低。
5.按權(quán)利要求1的水質(zhì)溶液，其中除所述陰離子聚合物或其鹽之外的其他鹽類的含量為每1毫克蛋白質(zhì)0.1摩爾或更少。
6.按權(quán)利要求1的水質(zhì)溶液，其中所述陰離子聚合物具有至少一種類型的選自羧基、羧甲基、硫酸根和磷酸根的陰離子殘基。
7.一種使蛋白質(zhì)水質(zhì)溶液提高蛋白質(zhì)濃度的方法，該方法包括將一種陰離子聚合物或該聚合物的一種鹽加入到所述溶液中。
8.一種藥物組合物，其中包含一種陰離子聚合物或其鹽以及一種蛋白質(zhì)。
9.按權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的水質(zhì)溶液，其中所述蛋白質(zhì)是一種具生理活性的蛋白質(zhì)。
10.按權(quán)利要求7的提高水質(zhì)溶液中蛋白質(zhì)濃度的方法，其中所述的蛋白質(zhì)是一種具生理活性的蛋白質(zhì)。
11.按權(quán)利要求8的組合物，其中所述蛋白質(zhì)是一種具有生理活性的蛋白質(zhì)。
12.按權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的水質(zhì)溶液，其中所述蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)是pH值為4或更高。
13.按權(quán)利要求7的提高水質(zhì)溶液中蛋白質(zhì)濃度的方法，其中所述蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)是pH值為4或更高。
14.按權(quán)利要求8的組合物，其中所述蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)是pH值為4或更高。
全文摘要
含蛋白質(zhì)的水質(zhì)溶液，其中借助于向該溶液中加入一種陰離子聚合物或其鹽而可在接近該種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的pH條件下將該蛋白質(zhì)溶解并達(dá)到高濃度。應(yīng)用此方法可制備具生理活性蛋白質(zhì)的藥物配制劑。
文檔編號(hào)A61K47/34GK1050327SQ90107990
公開日1991年4月3日 申請日期1990年9月21日 優(yōu)先權(quán)日1989年9月21日
發(fā)明者島崎幸雄, 川伸広, 吉岡美紀(jì), 田中康仁, 田中亮, 酒井喜代志, 石割久博 申請人:三井東壓化學(xué)株式會(huì)社