專利名稱：N-(吡咯并《2，3-d》嘧啶-3-基?；?-谷氨酸衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所涉及的是一種谷氨酸衍生物，其結(jié)構(gòu)式如下
式中R1是-OH或-NH2;
R2是氫或藥物上可接受的陽(yáng)離子;
R3是未取代的或被氯基、氟基、甲基、甲氧基或三氟甲基所取代的1，4-亞苯基或1，3-亞苯基;噻吩二基或呋喃二基，它們中每種均可是未取代的或?yàn)槁然?、氟基、甲基、甲氧基或三氟甲基所取代?環(huán)己基二基;或烷烴二基;
R4是氫、甲基或羥甲基;
R5是氫、1-6個(gè)碳原子的烷基、或氨基，而且以＊標(biāo)識(shí)的碳原子是S-構(gòu)型，本發(fā)明的化合物被描述為包括吡咯并[2，3-d]嘧啶雜環(huán)環(huán)狀系統(tǒng)，所說(shuō)雜環(huán)環(huán)狀系統(tǒng)按如下編碼
可以理解的是，Ⅰ式所描述的這類吡咯并[2，3-d]嘧啶是相應(yīng)的5-H-6-OXO或5-H-6-亞氨基結(jié)構(gòu)的異構(gòu)等同物。除另有說(shuō)明，為簡(jiǎn)化起見(jiàn)在本文中該化合物用6-羥基和6-氨基的慣例來(lái)描述和命名，而5-H-6-OXO和5-H-6-亞氨基結(jié)構(gòu)是完全相當(dāng)?shù)膭t是可以理解的。
Ⅰ式的化合物對(duì)一種或多種使用葉酸、特別是使用葉酸的代謝衍生物作為作用物的酶有抑制作用。這些化合物作為胸苷酸合成酶的抑制劑顯得是特別有效的，而該合成酶使用N5，N10-甲基亞基-四氫葉酸作為輔酶能促使脫氧尿苷酸甲基化而成為脫氧胸苷酸。這樣，該化合物可單獨(dú)或聯(lián)合使用以抑制那些另外還依賴于被抑制的酶的瘤的生長(zhǎng)。
本發(fā)明還涉及Ⅰ式化合物的可藥用的鹽、這些化合物及其鹽的制備方法、制備這些化合物時(shí)使用的化學(xué)中間體、與哺乳動(dòng)物中的瘤進(jìn)行斗爭(zhēng)的方法及含有這些化合物或其鹽的藥用組合物。
可通過(guò)去掉保護(hù)基而直接轉(zhuǎn)變成所需的最終化合物(Ⅰ式)的第一組有用的化學(xué)中間體是結(jié)構(gòu)式如下的化合物
式中R3定義如上;
R2′是氫或羧基保護(hù)基;
R4′是氫、甲基、羥甲基或帶有羥基保護(hù)基的羥甲基;
R5′是氫、烷基、氨基或帶有保護(hù)基的氨基;
R6是氫或烷酰氧基;
至少R2′、R4′和R5′中之一分別是羧基保護(hù)基、羥基保護(hù)基或氨基保護(hù)基。
Ⅰ式的化合物可以游離二羧酸的形式使用，在此情況下兩個(gè)R2基團(tuán)都是氫。另一方面，該化合物通常可以以其醫(yī)學(xué)上可接受的鹽的形式被使用，后一種用法更為可取，在此情況下，兩個(gè)R2基團(tuán)中之一或二者是醫(yī)藥上可接受的陽(yáng)離子。這種鹽的形式(包括其水合物)通常是晶態(tài)的，有利于形成溶液或配制藥用組合物。與堿的醫(yī)藥上可接受的鹽包括由堿金屬、堿土金屬、非毒性金屬、銨和單基取代的、雙取代的及三取代的胺所形成的鹽，形成這類鹽的物質(zhì)例如有鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、鋁、鋅、銨、三甲基銨、三乙醇銨、吡啶鎓及被取代的吡啶鎓鹽。優(yōu)先選用一鈉和二鈉鹽，特別是二鈉鹽。
R3基團(tuán)是具有至少兩個(gè)處在帶有自由價(jià)鍵的碳原子之間的碳原子的二價(jià)基團(tuán)。比如R3可以是1，4-亞苯基環(huán)或1，3-亞苯基環(huán)，該環(huán)是未取代的或任選地被氯基、氟基、甲基、甲氧基或三氟甲基所取代的。
另一方面，R3可以是一個(gè)噻吩二基或呋喃二基，也就是說(shuō)，可以是一個(gè)噻吩環(huán)或呋喃環(huán)，其中兩個(gè)氫原子已從兩個(gè)環(huán)碳原子上被去掉，例如噻吩-2，5-二基、噻吩-3，5-二基、噻吩-2，4-二基、及噻吩-3，4-二基環(huán)狀系統(tǒng)，及呋喃-2，5-二基-二基、呋喃-3，5-二基、呋喃-2，4-二基、呋喃-3，4-二基環(huán)狀系統(tǒng)，這些環(huán)狀系統(tǒng)可以是未取代的或是被氯基、氟基、甲基、甲氧基或三氟甲基所取代的。盡管從理論上說(shuō)噻吩-3，5-二基系統(tǒng)是噻吩-2，4-二基系統(tǒng)的同等物，但在本文中這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)用來(lái)表示由該噻吩環(huán)在分子的其余部分中的取向而產(chǎn)生的二種異構(gòu)形式，例如，所述的靠近R3的羧基是在該噻吩環(huán)的2位上的結(jié)構(gòu)，以及所述靠近R3的羧基是在噻吩環(huán)的3位上的結(jié)構(gòu)。同樣的慣例也適用于呋喃環(huán)。
另一方面，R3可以是一個(gè)環(huán)己烷二基基團(tuán)，即6個(gè)碳原子的二價(jià)環(huán)烷基團(tuán)，如環(huán)己烷-1，3-二基及環(huán)己烷-1，4-二基。
另外，R3可以是一種烷烴二基，即直鏈或枝鏈的、2-4個(gè)碳原子的二價(jià)脂族基團(tuán)，如橋亞乙基、三亞甲基、四亞甲基、丙烷-1，2-二基、丙烷-2，3-二基、丁烷-2，3-二基、丁烷-1，3-二基及丁烷-2，4-二基。還可理解的是，盡管從理論上講丙烷-1，2-二基是丙烷2，3-二基的等同物，丁烷-1，3-二基是丁烷-2，4-二基的等同物，但在本文中使用這二個(gè)術(shù)語(yǔ)旨在表示由相對(duì)于該分子的其余部分的不對(duì)稱烷烴二基鏈取向而產(chǎn)生的二種異構(gòu)形式。
在本文中所使用的以R2′、R4′及R5′標(biāo)識(shí)的保護(hù)基指的是這樣一些基團(tuán)它們通常不出現(xiàn)于最終的用于治療的化合物中，但它們是有意地在合成的某一階段被引入以便保護(hù)那些在化學(xué)操作過(guò)程中可能反應(yīng)的基團(tuán)，然后這些保護(hù)基在合成的較后的階段中被除去。由于帶有這類保護(hù)基的化合物主要是作為化學(xué)中間體來(lái)說(shuō)具有重要意義(雖然某些衍生物也顯示出生物活性)，所以其精確的結(jié)構(gòu)并不是關(guān)鍵的。各種形成及去除這類保護(hù)基的反應(yīng)在許多著作中都有敘述，例如“Protective Groups in Organic Chemistry”，Plenum Press，London and New York，1973;Greene.Th.W.“Protective Groups in Organic Synthesis”，Wiley，New York，1981;“The Peptides”，Vol.I.Schroeder and Lubke.Academic Press，London and New York，1965;“Methoden der organischen Chemie”，Houben-Weyl，4th Edition，Vol.15/I，Georg Thieme Verlag，Stuttgart 1974;引證上述公開(kāi)內(nèi)容僅供參考。
就R2′而言，羧基可以以酯基的形式得到保護(hù)，所述酯基在充分緩和的條件下可以有選擇地被除去，從而不會(huì)破壞所需要的分子結(jié)構(gòu)，所說(shuō)的酯特別是指1-12個(gè)碳原子的低級(jí)烷基酯，例如甲基或乙基酯，尤其是在1位上枝連的低烷基酯，例如叔丁基酯;這些低烷基酯在1-或2-位上被下列基團(tuán)所取代(ⅰ)低級(jí)烷氧基，如甲氧甲基、1-甲氧乙基及乙氧甲基;(ⅱ)低級(jí)烷硫基，如甲硫基甲基及1-乙硫基乙基;(ⅲ)鹵素，如2，2，2-三氯乙基、2-溴乙基及2-碘乙氧羧基;(ⅳ)一或兩種苯基，它們每種可以是未經(jīng)取代的或是被下列基團(tuán)單基取代、雙取代或三取代低級(jí)烷基例如叔丁基，低級(jí)烷氧基例如甲氧基，羥基，鹵基例如氯基，硝基例如芐基、4-硝基芐基、二苯甲基、二-(4-甲氧苯基)甲基;或(ⅴ)芳?；绫锦；?。羧基還可以以有機(jī)甲硅烷基的形式受到保護(hù)，這類甲硅烷基例如是三甲基甲硅烷基乙基或三-低級(jí)烷基甲硅烷基，例如是三甲基甲硅烷氧基羰基。
對(duì)于R4′，羥基基團(tuán)可通過(guò)形成乙縮醛和縮酮而被保護(hù)，例如形成四氫吡咯-2-基氧基(THP)衍生物。
就R5′而言，氨基基團(tuán)可以利用?；鶊F(tuán)以酰胺的形式被保護(hù)，該?；鶊F(tuán)在緩和的條件下可有選擇地被除去，在這類?；幸貏e指出的是甲酰;在羰基基團(tuán)的α位上枝連的低級(jí)烷?；?，尤其是諸如新戊酰之類的叔烷酰基;或是一個(gè)在羰基的α位被取代的低級(jí)烷?；?，比如是三氟乙酰。
優(yōu)先選用的Ⅰ式化合物是其中的R5為氨基或氫的那些化合物。在這類化合物中，R1最好是羥基、R3是1，4-亞苯基而R4是氫或羥甲基。在此類別中優(yōu)先選用的還有下述化合物，其中的R1為羥基、R3是噻吩二基而R4是氫或羥甲基。
本發(fā)明的化合物可按第一工藝通過(guò)使Ⅲ式化合物催化加氫而制成
式中Z1是氫，或與R4′結(jié)合在一起的Z1為碳-碳鍵;
R2′是氫或羧基保護(hù)基團(tuán);
R3和R6定義如上;
當(dāng)所取R4′與Z1無(wú)關(guān)時(shí)，則R4′是氫、甲基、羥甲基或被羥基保護(hù)基團(tuán)所取代的羥甲基;
R5′是氫、1-6個(gè)碳原子的烷基，氨基或氨基保護(hù)基團(tuán)。
適用的加氫催化劑包括貴金屬及其氧化物，例如鈀或氧化鉑、氧化銠及附于載體(如碳或氧化鈣)上的上述催化劑。
當(dāng)Ⅲ式中與R4′連在一起的Z1是一個(gè)碳-碳鍵，即在Z1和R4′結(jié)合到其上面的兩個(gè)碳原子之間存在著一個(gè)三鍵時(shí)，則該加氫產(chǎn)物中的R4′將是氫。若在R3(或任何為R2′、R4′和/或R5′所包含的保護(hù)基)中不存在任何手性，則加氫產(chǎn)物將是在標(biāo)有＊的碳原子周圍具有S-構(gòu)形的單對(duì)映體。當(dāng)Z1和R4′每個(gè)都是氫，也就是說(shuō)，當(dāng)Z1和R4′結(jié)合到其上面的兩個(gè)碳原子之間存在雙鍵時(shí)也是如此。
另一方面，當(dāng)R4′不是氫時(shí)，得到一種R，S和S，S非對(duì)映體的混合物。該非對(duì)映體混合物本身可在治療上使用(在去除保護(hù)基之后)，或可用諸如色譜法進(jìn)行機(jī)械分離。作為替代方法，各個(gè)非對(duì)映體可通過(guò)下述方法進(jìn)行化學(xué)分離與手性酸形成鹽，例如10-樟腦磺酸、樟腦酸、α-溴樟腦酸、甲氧基乙酸、酒石酸、二乙酰酒石酸、蘋(píng)果酸、吡咯烷酮-5-羧酸等的各對(duì)映體，然后分離出一個(gè)或這兩個(gè)單獨(dú)的非對(duì)映體的堿，任選地重復(fù)此工藝從而獲得基本上不含其它成分的任一個(gè)非對(duì)映體或獲得兩者，它們的光學(xué)純度＞95%。
R2′、R4′、R5′和/或R6所包含的保護(hù)基可在加氫之后通過(guò)酸性或堿性水解而除去，比如用氯化氫使R4′保護(hù)基裂開(kāi)或用氫氧化鈉使R2′或R5′保護(hù)基裂開(kāi)，借此產(chǎn)生Ⅰ式的化合物。除去各種保護(hù)基的方法在上文所述的參考文獻(xiàn)中已有敘述，引用這些文獻(xiàn)作為參考。
采用與美國(guó)專利No.4，818，819中所述相似的方法可制備出Ⅲ式的化合物，但是要使用相應(yīng)的鹵代吡咯并[2，3-d]嘧啶。例如，使下列Ⅳ式的吡咯并[2，3-d]嘧啶與Ⅴ式的不飽和化合物進(jìn)行反應(yīng)
式中X是溴基或碘基，R5′和R6定義如前;
式中Z1、R3及R4′定義如前，而R7是
式中R2′定義如前。在進(jìn)行上述反應(yīng)時(shí)有美國(guó)專利No.4818819中所述類型的鈀/三取代的磷化氫催化劑存在，引證該專利的這一公開(kāi)內(nèi)容供參考。
當(dāng)R7是-CONHCH(COOR2′)CH2CH2COOR2′時(shí)，這一偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行前述的氫化并去除任何的保護(hù)基。
作為替代方法，也可使Ⅳ式的化合物，在有美國(guó)專利No.4818819中所述類型的鈀/三取代的磷化氫催化劑存在的情況下，與Ⅵ式的化合物進(jìn)行反應(yīng)從而得到Ⅶ式的中間體。
式中，Z1、R2′R3及R4′定義如前，
Ⅶ式的產(chǎn)物可經(jīng)氫化、水解而去除R2′和R6保護(hù)基，任選地在R5′所包含的氨基基團(tuán)的中間體保護(hù)下按美國(guó)專利No.4684653中所述的方式采用常規(guī)的形成肽鍵(如DCC或氯代膦酸二苯酯)的縮合技術(shù)與被保護(hù)的谷氨酸衍生物偶合，然后除去這些保護(hù)基。
在進(jìn)一步的變化中，采用美國(guó)專利No.4818819中所述的方法可制成Ⅲ式的化合物。例如使Ⅷ式的化合物在有美國(guó)專利No.4818819中所述類型的鈀/三取代磷化氫催化劑存在下與Ⅸ式的化合物反應(yīng)，
式中，Z1、R4′、R5′及R6定義如前，
式中，X、R3及R7也定義如前，該工藝的這種改型特別適用于(但不限于)制備那些其中R4是羥甲基的化合物，在這種情況下Ⅵ式中的R4′是一個(gè)被保護(hù)的羥甲基基團(tuán)，例如是四氫吡喃-2-基氧基甲基。
Ⅷ式的化合物也可用美國(guó)專利No.4818819的方法、通過(guò)用Ⅹ式的不飽和化合物處理Ⅳ式的化合物而得到，
式中，R4″是甲基、被保護(hù)的羥甲基或三取代的甲硅烷基，上述處理是在有前述類型的鈀/三取代磷化氫催化劑存在下進(jìn)行的。這方法特別適用于(但不限于)制備那些其中的R4是羥甲基的化合物。
雖然不總是這種情況，但Ⅳ式中R6是氫的化合物可能趨向于有些不溶解于用來(lái)進(jìn)行U.S4818819中所述反應(yīng)的溶劑。在這種情況下，Ⅳ式中R6為氫的化合物可首先用氫化鈉及一種適宜的鏈烷酸烷基酯(如新戊酸氯甲酯)處理，以便將一個(gè)烷酰氧基基團(tuán)引入5-位中從而提高溶解度。
適于作為中間體并因其對(duì)酶的作用而十分有用的化合物小類是缺少谷氨酸側(cè)鏈的Ⅺ和Ⅻ式的衍生物及其在醫(yī)藥上可接受的鹽
和
式中，R1是-OH或-NH2;
R4是氫、甲基或羥甲基;
R5是氫、1-6個(gè)碳原子的烷基、或氨基;
R8是氫、氯基、氟基、甲基、甲氧基、三氟甲基或羧基;
Y是-S-或-O-。
按下述方法獲得Ⅺ式和Ⅻ式的化合物按美國(guó)專利No.4818819中所述的方法，即在有一種鈀/三取代磷化氫催化劑存在的情況下，使Ⅶ式的化合物與下式的化合物反應(yīng)
式中的X、Y及R8定義如前，使所得的偶聯(lián)產(chǎn)物氫化、水解從而除去R2′保護(hù)基。典型的Ⅺ式和Ⅻ化合物有3(2-苯基-3-羥丙基)-4-羥基-6-氨基-吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-[2-(噻吩-2-基)乙基]-4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-[2-(噻吩-2-基)乙基]-4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-[2-(噻吩-2-基)乙基]-4-羥基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-[2-(噻吩-3-基)乙基]-4-羥基-6-氟基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-[2-(噻吩-3-基)乙基]-4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-[2-(噻吩-3-基)乙基-4-羥基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-[2(呋喃-2-基)乙基]-4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-[2-(呋喃-2-基)乙基]-4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-[2-(呋喃-2-基)乙基]-4-羥基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-[2-(呋喃-3-基)乙基]-4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶，3-[2-(呋喃-3-基)乙基-4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶及3-[2-(呋喃-3-基)乙基]-4-羥基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶。
如上所述，利用美國(guó)專利No.4818819中所述的不飽和化合物的鈀催化偶聯(lián)及美國(guó)專利No.4684653中所述的谷氨酸偶聯(lián)反應(yīng)、用合適的吡咯并[2，3-d]嘧啶取代其中所公開(kāi)的吡咯并[2，3-d]嘧啶可以制備本發(fā)明的化合物，上述Ⅳ式的吡咯并[2，3-d]嘧啶中間體可采用下述方法得到用N-碘琥珀酰亞胺處理ⅩⅢ式的化合物
式中R5′和R6定義如本文，產(chǎn)生相應(yīng)的2，3-二碘吡咯并[2，3-d]嘧啶，該2，3-二碘吡咯并[2，3-d]嘧啶隨后用鋅和乙酸處理以便選擇性地除去2-位上的碘原子，結(jié)果得到相應(yīng)的Ⅳ式的3-碘吡咯并[2，3-d]嘧啶。
按前述工藝得到Ⅱ式中R1為-OH的化合物。如果需要R1是-NH2的Ⅰ式化合物，可用1，2，4-三唑及(4-氯苯基)二氯磷酸酯處理R1是-OH的化合物，然后用濃氨處理該反應(yīng)的產(chǎn)物。
前已述及，本發(fā)明的化合物對(duì)一種或多種用葉酸、尤其是用葉酸的代謝衍生物作為被用物的酶具有作用。例如，N-｛4-[2-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲?；?L-谷氨酸顯示出對(duì)人的T-細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴母細(xì)胞的白血病細(xì)胞(CCRF-CEM)的生長(zhǎng)具有很強(qiáng)的抑制作用，顯示出0.004μ/ml的IC50。加入嘌呤(如次黃嘌呤)或加入氨基咪唑甲酰胺不會(huì)使細(xì)胞毒性反轉(zhuǎn)，但加入在胸苷酸循環(huán)中而不是在重新嘌呤合成中顯示出特殊的抑制性的胸苷則可使之反轉(zhuǎn)。這些化合物可在取得資格的專業(yè)人員的指導(dǎo)下用來(lái)抑制瘤的生長(zhǎng)，包括絨膜癌、白血病、婦女乳腺癌、頭和頸的表皮癌、被鱗的或小細(xì)胞肺癌及各種淋巴肉瘤。這些化合物還可用于治療蕈樣真菌病和牛皮癬。
這些化合物可以口服，但最好單獨(dú)地或與其它治療劑一起對(duì)患有瘤的和需治療的哺乳動(dòng)物不經(jīng)腸道給藥，上述的其它治療劑包括抗瘤劑、類固醇等。不經(jīng)腸用藥途經(jīng)包括肌肉、鞘內(nèi)、靜脈內(nèi)、及動(dòng)脈內(nèi)用藥。劑量制度必須是按特定的瘤、病人狀況及反應(yīng)滴定，常用劑量為約10-約100mg/日，持續(xù)5-10天，或每天給藥250-500mg，周期性(例如每14天)重復(fù)。雖然與現(xiàn)在使用的其它抗代謝物相比該化合物具有低毒性，但通過(guò)降低日劑量抑或隔日或間隔更長(zhǎng)時(shí)間(例如每三天)用這化合物給藥或者二種方法兼用，可以消除毒性反應(yīng)?？诜绞桨ㄆ瑒┖秃?-10mg藥劑/單位劑量的膠囊。含20-100mg/ml的等滲壓鹽水可用于不經(jīng)腸給藥。
下列實(shí)施例將用來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明。在核磁共振數(shù)據(jù)中，“S”代表單峰、“d”代表雙峰、“t”代表三重峰、“q”代表四重峰、“m”代表多重峰、而“br”代表寬峰。
實(shí)施例13-碘-4-羥基-6-新戊酰氨基-吡咯并[2，3-d]嘧啶將3.0g(0.02摩爾)的4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶和8.4g(0.07摩爾)的新戊酰氯在40ml吡啶中的溶液組成的混合物在80-90℃下攪拌30分鐘，然后將此混合物蒸干，再把殘留物溶于30ml甲醇中。添加10%的氨水，產(chǎn)生4.2g(89%)4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶，該化合物可用通過(guò)硅膠的色譜法、用8%的甲醇在二氯甲烷中的溶液洗脫而進(jìn)一步純化，溶點(diǎn)295℃，1NMR(d6-DMSO)δ 1.20(s，9H)，6.37(d，J＝3.4Hz，1H)，6.92(d，J＝3.4Hz，1H)，10.78(s，1H)，11.56(s，1H)，11.82(s，1H).對(duì)C11H14N4O2的分析計(jì)算值C，56.40;H，6.02;N，23.92。實(shí)測(cè)值C，56.16;H，6.01;N，23.67。
將9.9g(44毫摩爾)的N-碘丁二酰胺加到4.7g(20毫摩爾)4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶在200ml二甲基甲酰胺中的混合物里。于室溫下在黑暗中攪該混合物18小時(shí)。通過(guò)蒸發(fā)除去大部分二甲基甲酰胺，再將殘留的漿液注入300ml水中。經(jīng)過(guò)濾收集所產(chǎn)生的固體，在真空中置于五氧化二磷上方使之干燥，得到2，3-二碘-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶，該化合物可采用色譜法在硅膠上、用2.5%的甲醇在二氯甲烷中的溶液洗脫而進(jìn)一步純化。熔點(diǎn)＞290℃，1NMR(d6-DMSO)δ 1.18(s，9H)，10.85(s，1H)，11.85(s，1H)，12.42(s，1H)。對(duì)C11H12N4O2I2的分析計(jì)算值C，27.18;H，2.49;N，11.53;I，52.22;
實(shí)測(cè)值C，27.51;H，2.51;N，11.27;I，52.02。
按類似的制法，但從4-羥基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶和4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶(7-二氮次黃嘌呤)開(kāi)始，結(jié)果分別獲得2，3-二碘-4-羥基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶及2，3-二碘-4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶，熔點(diǎn)＞205℃(化合物失去碘)。1NMR(d6-DMSO)δ 7.79(s，1H)，11.93(s，1H)，12.74(s，1H)。
將1.3g(20毫摩爾)鋅粉加到4.86g 2，3-二碘-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶在100ml冰醋酸及25ml水中的混合物中。在室溫下將該混合物攪拌18小時(shí)，用500ml水稀釋，然后冷卻。經(jīng)過(guò)濾收集此固體并在真空下置于五氧化二磷上方干燥，得到3-碘-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶，該化合物可進(jìn)一步經(jīng)色譜法在硅膠上用2.5%的甲醇在二氯甲烷中的溶液洗脫而提純。熔點(diǎn)＞240℃。1NMR(d6-DMSO)δ 1.20(s，9H)，7.12(d，J＝1.8Hz，1H)，10.82(s，1H)，11.79(s，1H)，11.89(s，1H)。對(duì)C11H13N4O2I的分析計(jì)算值為C，36.69;H，3.64;N，15.56;I，35.24。實(shí)測(cè)值為C，36.91;H，3.58;N，15.65;I，35.56。
以類似的制法從2，3-二碘-4-羥基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶和2，3-二碘-4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶開(kāi)始，分別獲得3-碘-4-羥基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶和3-碘-4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶，熔點(diǎn)＞245℃(化合物失去碘)。1NMR(d6-DMSO)δ 7.20(d，J＝2.2Hz1H)，7.82(d，J＝2.8Hz，1H)，11.85(d，J＝1.1Hz，1H)，12.17(s，1H)實(shí)施例2N-[4-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙炔基)苯甲?；鵠-L-谷氨酸二甲酯往3.6g(10毫摩爾)充分干燥的3-碘-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶在40ml二甲基甲酰胺中的混合物里添加4.0g(13.19毫摩爾)的N-(4-乙炔基苯甲酰)-L-谷氨酸二甲酯、0.38g碘化銅(Ⅰ)、3ml三乙胺和1.0g四個(gè)一(三苯膦)鈀。在室溫下將此混合物攪拌2小時(shí)，然后傾入500ml水中。過(guò)濾收集此固體、空氣干燥、然后在200ml甲醇中回流。冷卻此混合物，過(guò)濾收集固體，再將該固體溶于21 10%的甲醇在二氯甲烷中的溶液里，在硅膠上用色層法分離。初始的黑帶再次用色層法分離，將第一次與第二次所得到的無(wú)色帶合在一起進(jìn)行蒸發(fā)，得到結(jié)果3.5g N-[4-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙炔基)苯甲?；鵠-L-谷氨酸二甲酯，它可以通過(guò)從50%的甲醇在二氯甲烷中的溶液中重結(jié)晶而進(jìn)一步純化。熔點(diǎn)280-285℃，1NMR(d6-DMSO)δ 1.21(s，9H)，1.96-2.15(m，2H)，2.44(t，J＝7.5Hz，2H)，3.56(s，3H)，3.62(s，3H)，4.40-4.45(m，1H)，7.43(s，1H)，7.53(d，J＝8.4Hz，2H)，7.87(d，J＝8.4Hz，2H)，8.82(d，J＝7.4Hz，1H)，10.95(s，1H)，11.95(s，1H)。
對(duì)C27H29N5C7的分析計(jì)算值為C，60.56;H，5.46;N，13.08。實(shí)測(cè)值C，60.55;H，5.46;N，12.89。
以類似的制法，用等量的N-(戊-4-炔?；?-L-谷氨酸二甲酯、N-(庚-6-烯?；?-L-谷氨酸二甲酯及N-(己-5-炔?；?-L-谷氨酸二甲酯代替上述方法中的N-(4-乙炔基苯甲?；?谷氨酸二甲酯，結(jié)果獲得N-[5-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)戊-4-炔?；鵠-L-谷氨酸二甲酯、N[7-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)庚-6-烯?；鵠-L-谷氨酸二甲酯及N-[6-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)己-5-炔?；鵠-L-谷氨酸二甲酯。
按美國(guó)專利No.4882334中所述的方法(此專利于1989.11.21頒發(fā)，此處引證該專利以供參考)通過(guò)使己-5-炔酸氯化物(用亞硫酰氯處理己-5-炔酸而得到)與L-谷氨酸二甲酯在有一種酸性接受體如三乙胺存在的情況下進(jìn)行反應(yīng)可得到N-(己-5-炔?；?-L-谷氨酸二甲酯。隨后，可通過(guò)例如5-氰基戊-1-炔的加堿水解而制備己-5-炔酸。
實(shí)施例3N-[4-｛1-羥基-3-(4-羥基-6-氨基-吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)丙-2-基｝苯甲酰]-谷氨酸二甲酯將14.6g 3-碘-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、7.6g 2-(2-丙炔氧基)-四氫吡喃、798mg(10%)氯化鈀、2.36g(20%)三苯膦、428mg(5%)碘化亞銅、45ml三乙胺及700ml乙腈的混合物在氮?dú)夥障禄亓骷訜?2小時(shí)。然后向該熱的反應(yīng)混合物添加3.2g 2-(2-丙炔氧基)-四氫吡喃，再繼續(xù)回流12小時(shí)?？偣不亓骷訜?4小時(shí)后，在減壓下除去溶劑，殘留物經(jīng)過(guò)硅膠使用2%的溶在二氯甲烷中的甲醇溶液過(guò)濾。濃縮該濾液并在硅膠上用20∶1的乙酸乙酯∶己烷混合物洗脫進(jìn)行色層分離，結(jié)果得到3-(3-四氫吡咯-2-基氧基丙-1-炔-1-基)-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶，它可用乙酸乙酯進(jìn)行重結(jié)晶而被進(jìn)一步提純。
將2g 3-(3-四氫吡咯-2-基氧基丙-1-炔-1-基)-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、40ml甲醇、20ml氯仿、40mg載于硫酸鋇上的鈀(5%)及40mg合成喹啉的混合物在1大氣壓氫氣氛下攪拌40分鐘。然后經(jīng)蒸發(fā)除去溶劑，再用二氯甲烷稀釋殘留物。二氯甲烷溶液經(jīng)過(guò)硅膠用2%的甲醇在二氯甲烷中的溶液過(guò)濾以去除催化劑、濾液經(jīng)濃縮得到一種油狀物，通過(guò)對(duì)其加醚而產(chǎn)生3-(3-四氫吡咯-2-基氧基丙-1-烯-1-基)-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、它可通過(guò)柱色譜法用乙酸乙酯洗脫、再用乙酸乙酯進(jìn)行重結(jié)晶而進(jìn)一步提純。
含3.48g 3-(3-四氫吡咯-2-基氧基丙-1-烯-1-基-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3.12g(1.2當(dāng)量)N-(4-碘苯甲?；?谷氨酸二乙酯、546mg(20%)三-(2-甲苯基)膦、201mg(10%)乙酸鈀及85.8mg(5%)碘化亞銅在15ml三乙胺及240ml乙腈中的溶液的混合物在氮?dú)夥罩谢亓骷訜帷?2小時(shí)后，加入1.17g N-(4-碘苯甲?；?谷氨酸二乙酯，再將該反應(yīng)混合物在氮?dú)夥罩谢亓骷訜?2小時(shí)。在減壓下濃縮該反應(yīng)混合物，將殘留物在硅膠上用20∶1的乙酸乙酯∶己烷混合液洗脫、進(jìn)行色層分離。(任何被回收的原料可經(jīng)上述步驟再循環(huán))。該濃縮物料被溶于1∶5的乙酸乙酯∶乙醚的溶液中，再將此溶液冷凍15小時(shí)。過(guò)濾收集所產(chǎn)生的固體，用冷的乙酸乙酯洗滌，再經(jīng)干燥得到N-[4-｛1-(四氫吡咯-2-基氧基)-3-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)丙-2-烯-2-基]谷氨酸二乙酯。
實(shí)施例4N-[5-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基｝乙炔基)-噻吩-2-基羰基]-L-谷氨酸二甲酯將2.0g 3-碘-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、1.2g三甲基甲硅烷基乙炔、0.1g氯化鈀、0.23g三苯膦、0.06g碘化亞銅及2.6g三乙胺在100ml乙腈中的混合物于50℃在密封管中加熱1.5小時(shí)，然后回流3小時(shí)。在減壓下去除溶劑，殘留物用1∶1的乙酸乙酯∶己烷磨碎，然后過(guò)濾。將所收集到的固體溶于二氯甲烷中，然后使該溶液通過(guò)硅膠板，用1%的甲醇在二氯甲烷中的溶液洗脫。濃縮該洗脫液、得到3-三甲基甲硅烷基乙炔基-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶。
在氮?dú)夥障?，?.5g 3-三甲基甲硅烷基乙炔基-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶在100ml冷卻至0℃的無(wú)水四氫呋喃中的溶液里添加4.75ml 1M的氟化四丁銨在無(wú)水四氫呋喃中的溶液。5分鐘后使該反應(yīng)混合物達(dá)到室溫，然后攪拌2小時(shí)。在減壓下除去溶劑，再用色譜法在硅膠上提純殘留物，得到3-乙炔基-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶。
將1.70g 3-乙炔基-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、2.30g N-(5-溴基噻吩-2-基羰基)-L-谷氨酸二甲酯(按1989.11.21頒發(fā)的美國(guó)專利No.4882334中所述方法制備，引證該專利僅供參考)、44mg氯化鈀、130mg三苯膦、25mg碘化亞銅、以及1.13ml三乙胺在30ml乙腈中的溶液的混合物回流加熱3小時(shí)，然后冷至室溫。減壓下去除溶劑，采用柱色譜法(Waters 500)用1∶19的甲醇∶二氯甲烷洗脫、分離該殘留物，得到N-[5-(4羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基｝乙炔基)噻吩-2-基羰基]-L-谷氨酸二甲酯。
在上述方法中，取代等量的N-(4-溴基噻吩-2-基羰基)-L-谷氨酸二乙酯及N-(5-溴基噻吩-3-基羰基)-L-谷氨酸二乙酯，分別獲得N-[4-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙炔基)噻吩-2-基羰基]-L-谷氨酸二乙酯和N-[5-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙炔基)噻吩-3-基羰基]-6-谷氨酸二乙酯。
N-[4-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙炔基)呋喃-2-基羰基]-L-谷氨酸二乙酯和N-[5-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙炔基)呋喃-3-基羰基]-L谷氨酸二乙酯，同樣可分別由N-(4-溴代呋喃-2-基羰基)-L-谷氨酸二乙酯和N-(5-溴代呋喃-3-基羰基)-L-谷氨酸二乙酯制得。
同樣，由N-(2-氟-4-碘苯甲?；?-L-谷氨酸二甲酯和N-(3-氟-4-碘苯甲?；?-L-谷氨酸二甲酯(按1989年11月21日公告批準(zhǔn)的美國(guó)專利US4，882，334中所述來(lái)制備，其公開(kāi)的內(nèi)容在此一并供作參考)，可分別制得N-[2-氟-4-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙炔基)苯甲?；鵠-L-谷氨酸二甲酯和N-[3-氟-4-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙炔基)苯甲?；鵠-L-谷氨酸二甲酯。
實(shí)施例5N-[4-(4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基-乙炔基)苯甲酰基]-L-谷氨酸二甲酯使3-碘-4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶按實(shí)施例2中所述的方法，同N-(4-乙炔基苯甲?；?-L-谷氨酸二甲酯反應(yīng)，相應(yīng)制得N-[4-(4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙炔基)苯甲酰基]-L-谷氨酸二甲酯，將其在硅膠上用色譜法提純，熔點(diǎn)為160℃(分解)。
1NMR(d6-DMSO)δ 1.98-2.15(m，2H)，2.45(t，J＝7.5 Hz，2H)3.57(s，3H)，3.64(s，3H)，4.40-4.45(m，1H)，7.51((d，J＝2.5Hz，1H)，7.55(d，J＝8.2Hz，2H)，7.87(s，1H)，7.90(d，J＝8.2Hz，1H)，11.97(d，J＝3.7Hz，1H)，12.31(s，1H)。
另一種方法是，按實(shí)施例2的方法用等當(dāng)量4-乙炔基苯甲酸甲酯、4-乙炔基甲苯、4-乙炔基苯、4-乙烯基氯苯、4-乙炔基氟苯、3-乙炔基氟苯和1-甲氧基-4-乙炔基苯取而代之，制得4-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙炔基)苯甲酸甲酯、3-(4-甲基苯基)乙炔基-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-苯基乙炔基-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-(4-氯苯基)乙炔基-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-(4-氟苯基)乙炔基-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-(3-氟苯基)乙炔基-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶和3-(4-甲氧苯基)乙烯基-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶。
用3-碘-4-羥基吡咯并〔2，3-d〕嘧啶代替3-碘-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶，同4-乙炔基苯甲酸甲酯、4-乙炔基甲苯、4-乙炔基氯苯、4-乙炔基氟苯、3-乙炔基氟苯及1-甲氧基-4-乙炔基苯反應(yīng)，則分別生成4-(4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙炔基)苯甲酸甲酯、3-(4-甲基苯基)乙烯基-4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-苯基乙炔基-4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-(4-氯苯基)乙炔基-4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-(4-氟苯基)乙炔基-4-羥基吡咯并〔2，3-d〕嘧啶、3-(4-甲氧基苯基)乙炔基-4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶。
使10g 3-碘-4-羥基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶同2.19g 80%的氫化鈉油懸浮液和75ml脫水二甲基甲酰胺反應(yīng)。30分鐘后，添加6.02g新戊酸氯甲酯。將反應(yīng)混合物攪拌3小時(shí)，傾入水中，并用乙酸中和。固體物用丙酮二氯甲烷在硅膠上進(jìn)行色層分離，起初產(chǎn)生3-碘-4-羥基-1，5-雙(新戊酰氧基)-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶(熔點(diǎn)155℃)，接著產(chǎn)生3-碘-4-羥基-5-新戊酰氧基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶(熔點(diǎn)236℃)。
按實(shí)施例2的方法，使用3-碘-4-羥基-5-新戊酰氧基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶，則產(chǎn)生N-[4-(4-羥基-5-新戊酰氧基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙炔基)苯甲?；鵠-L-谷氨酸二甲酯，熔點(diǎn)196℃。按C29H32N4O8分析計(jì)算C，61.70;H，5.71;N，9.92。實(shí)測(cè)C，61.90;H，5.71;N，9.95。
用3-碘-4-羥基-5-新戊酰氧基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶代替3-碘-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶，同4-乙炔基苯甲酸甲酯、4-乙炔基甲苯、4-乙炔基苯、3-乙炔基氟苯及1-甲氧基-4-乙烯基苯反應(yīng)，產(chǎn)生4-(4-羥基-5-新戊酰氧基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙炔基苯甲酸甲酯、3-(4-甲基苯基)-乙炔基-4-羥基-5-新戊酰氧基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-苯基乙炔基-4-羥基-5-新戊酰氧基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-(4-氯苯基)-乙炔基-4-羥基-5-新戊酰氧基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-(4-氟苯基)-乙炔基-4-羥基-5-新戊酰氧基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶和3-(4-甲氧苯基)-乙炔基-4-羥基-5-新戊酰氧基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶。
實(shí)施例6N-｛4-[2-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲?；?L-谷氨酸二甲酯將1.0g N-[4-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙炔基)苯甲酰基]-L-谷氨酸二甲酯溶于250ml 50%甲醇二氯甲烷溶液，并添加0.8g 3%的披鈀炭，使所成的混合物在50p.s.i下氫化3小時(shí)，過(guò)濾并減壓濃縮。固體物經(jīng)過(guò)濾收集并干燥，產(chǎn)生0.72g N-｛4-[2-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲?；?L-谷氨酸二甲酯。溶點(diǎn)247℃。
1MNR(d6-DMSO)δ 1.21(s，9H)，1.90-2.12(m，2H)，2.42(t，J＝7.4Hz，2H)，2.92(t，J＝4Hz，2H)，2.97(t，J＝4Hz，2H)，3.55(s，3H)，3.61(s，3H)，4.38-4.45(m，1H)，6.61(s，1H)，7.27(d，J＝8.2Hz，2H)，7.75(d，J＝8.2Hz，2H)，8.64(d，J＝7.4Hz，1H)，10.75(s，1H)，11.22(s，1H)。按C27H33N5O7分析計(jì)算C，60.10;H，6.17;N，12.98。實(shí)測(cè)C，59.94;H，6.15;N，12.72。
實(shí)施例7N-｛5-[2-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]噻吩-2-基羰基｝-L-谷氨酸二甲酯對(duì)N-[5-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基｝乙炔基)噻吩-2-基羰基]-L-谷氨酸二甲酯，進(jìn)行實(shí)施例6的氫化處理，制得N-｛5-[2-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]噻吩-2-基羰基｝-L-谷氨酸二甲酯。
同樣，對(duì)下列化合物進(jìn)行實(shí)施例6中的氫化處理(a)N-[2-氟-4-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙炔基)苯甲?；鵠-L-谷氨酸二甲酯、(b)N-[3-氟-4-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙炔基)-苯甲?；鵠-L-谷氨酸二甲酯、(c)N-[4-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙炔基)噻吩-2-基羰基]-L-谷氨酸二乙酯、(d)N-[5-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙炔基)噻吩-3-基羰基]-L-谷氨酸二乙酯、(e)N-[5-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)戊-4-炔基]-L-谷氨酸二甲酯、(f)N-[7-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)庚-6-炔基]-L-谷氨酸二甲酯、(g)N-[6-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)己-5-炔基]-L-谷氨酸二甲酯、(h)4-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙炔基)苯甲酸甲酯、(i)3-(4-甲基苯基)乙炔基-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(j)3-苯基乙炔基-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(k)3-(4-氯苯基)乙炔基-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(l)3-(4-氟苯基)乙炔基-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(m)3-(3-氟苯基)乙炔基-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(n)3-(4-甲氧基苯基)乙炔基-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(o)4-(4-羥基-5-新戊酰氧基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙炔基)苯甲酸甲酯、
(p)3-(4-甲基苯基)乙炔基-4-羥基-5-新戊酰氧基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(q)3-苯基乙炔基-4-羥基-5-新戊酰氧基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(r)3-(4-氯苯基)乙炔基-4-羥基-5-新戊酰氧基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(s)3-(4-氟苯基)乙炔基-4-羥基-5-新戊酰氧基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(t)3-(4-甲氧基苯基)乙炔基-4-羥基-5-新戊酰氧基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(u)4-(4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙炔基)苯甲酸甲酯、(v)3-(4-甲基苯基)乙炔基-4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(w)3-苯基乙炔基-4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(x)3-(4-氯苯基)乙炔基-4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(y)3-(4-氟苯基)乙炔基-4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶、和(z)3-(4-甲氧基苯基)乙炔基-4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶。
分別制得(a)N-[2-氟-4-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙基)苯甲酰基]-L-谷氨酸二甲酯、
(b)N-[3-氟-4-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙基)苯甲?；鵠-L-谷氨酸二甲酯、(c)N-[4-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙炔基)噻吩-2-基羰基]-L-谷氨酸二乙酯、(d)N-[5-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙基)噻吩-3-基羰基]-L-谷氨酸二乙酯、(e)N-[5-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)戊基]-L-谷氨酸二甲酯、(f)N-[7-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)庚基]-L-谷氨酸二甲酯、(g)N-[6-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)己基]-L-谷氨酸二甲酯、(h)4-[2-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲酸甲酯、(i)3-[2-(4-甲基苯基)乙基]-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(j)3-(2-苯基乙基)-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(k)3-[2-(4-氯苯基)乙基]-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(l)3-[2-(4-氟苯基)乙基]-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(m)3-[2-(3-氟苯基)乙基]-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、
(n)3-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(o)4-[2-(4-羥基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲酸甲酯、(p)3-[2-(4-甲基苯基)乙基]-4-羥基-5-新戊酰氧基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(q)3-[2-(4-氯苯基)乙基]-4-羥基-5-新戊酰氧基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(r)3-[2-(4-氟苯基)乙基]-4-羥基-5-新戊酰氧基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(s)3-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]-4-羥基-5-新戊酰氧基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(t)4-[2-(4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲酸甲酯、(u)3-[2-(4-甲基苯基)乙基]-4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(v)3-(2-苯基乙基)-4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(w)3-[2-(4-氯苯基)乙基]-4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(x)3-[2-(4-氟苯基)乙基]-4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶、(y)3-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]-4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶、和
(z)3-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]-4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶。
實(shí)施例8N-[4-｛1-(四氫吡喃-2-基氧基)-3-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)丙-2-基｝苯甲?；鵠谷氨酸二乙酯將1.16g N-[4-｛1-(四氫吡喃-2-基氧基)-3-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)丙-2-烯-2-基｝苯甲酰]谷氨酸二乙酯和174mg(20%)非晶態(tài)二氧化鉑(Ⅳ)溶于150ml冰醋酸所成的溶液，在50psi下氫化10小時(shí)。反應(yīng)混合物用50ml甲醇稀釋，并經(jīng)硅藻土過(guò)濾。濃縮濾液并用乙酸乙酯稀釋。經(jīng)冷卻15小時(shí)后所形成的固體物，用過(guò)濾法收集，用冷乙酸乙酯洗滌，并干燥之，得N-[4-｛1-(四氫吡喃-2-基氧基)-3-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)丙-2-基｝苯甲?；鵠谷氨酸二乙酯。
實(shí)施例9N-｛4-[2-(4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲酰基｝-L-谷氨酸二甲酯將1.1g N-[4-(4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙炔基)苯甲?；鵠-L谷氨酸二甲酯溶于100ml 50%甲醇二氯甲烷溶液，并添加08g 3%的披鈀炭，將所成的混合物在50p.s.i.下氫化24小時(shí)，過(guò)濾，并減壓濃縮濾液。殘留物中加入乙醚，并用過(guò)濾法收集固體物，然后使之干燥，得0.67g N-｛4-[2-(4-羥基氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲?；?L-谷氨酸二甲酯。熔點(diǎn)170-172℃。
1NMR(d6-DMSO)δ 1.94-2.14(m，2H)，2.44(t，J＝7.4Hz，2H)，2.93-3.02(m，2H)，3.57(s，3H)，3.63(s，3H)，4.40-4.70(m，1H)，6.71(s，1H)，7.29(d，J＝8.2Hz，2H)，7.77(m，3H)，8.66(d，J＝7.4Hz，1H)，11.52(s，1H)，11.71(s，1H)。
以相似方法，由N-[4-(4-羥基-5-新戊酰氧基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基乙炔基)苯甲?；鵠-L-谷氨酸二甲酯，按上述步驟制得N-4-〔2-(4-羥基-5-新戊酰氧基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲酰基｝-L-谷氨酸二甲酯。
實(shí)施例10N-｛4-[2-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲酰基｝-L-谷氨酸將1.5g N-｛4-[2-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲酰基｝-L-谷氨酸二甲酯與10ml 1N氫氧化鈉所組成的混合物，在室溫下攪拌3天，生成N-｛4-[2-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲?；?L-谷氨酸的鈉鹽。用冰醋酸中和之。過(guò)濾收集所形成的固體物，并在50%甲醇二氯甲烷溶液中再結(jié)晶，得0.8g(67%)N-｛4-[2-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲酰基｝-L-谷氨酸。1NMR(d6-DMSO)δ 1.80-2.00(m，2H)，2.10-2.30(m，2H)，2.77-2.820(m，2H)，2.89-2.93(m，2H)，4.13-4.19(m，2H)，6.25(d，J＝1.3Hz，1H)，7.23(d，J＝8.1Hz，2H)，7.69(d，J＝8.1Hz，2H)，8.13(d，J＝6.7Hz，1H)，10.55(s，1H)。
實(shí)施例11N-[4-｛1-羥基-3-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)丙-2-基｝苯甲酰基]谷氨酸二乙酯將由0.94g N-[4-｛1-(四氫吡喃-2-基氧基)-3-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)丙-2-基｝苯甲酰基]谷氨酸二乙酯溶于40ml 0.1N甲醇氯化氫(methanolic hydrogen chloride)所成的溶液，在室溫下攪拌2小時(shí)。反應(yīng)混合物用205mg碳酸鈉溶于10ml水所成的溶液加以中和，并減壓蒸除大部分甲醇。加入100ml二氯甲烷，所成的溶液用20ml水洗滌二次，用無(wú)水硫酸鎂干燥并濃縮之。殘留物用1∶2的乙酸乙酯和乙醚研碎，過(guò)濾并干燥之，制得N-[4-｛1-羥基-3-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)丙-2-基｝苯甲?；鵠谷氨酸二乙酯。
實(shí)施例12N-[4-｛1-羥基-3-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)丙-2-基｝苯甲?；鵠谷氨酸將0.3g N-[4-｛1-羥基-3-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)丙-2-基｝苯甲酰基]谷氨酸二乙酯溶于9ml 1N氫氧化鈉水溶液所成的溶液，在室溫和氮?dú)夥障聰嚢?2小時(shí)。用1N鹽酸使反應(yīng)混合物略為酸化(pH＝～4)，并過(guò)濾之。將如此收集到的固體物用水(5ml)和冷乙醇(5ml)洗滌并干燥之，制得N-[4-｛1-羥基-3-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)丙-2-基｝苯甲?；鵠谷氨酸。
同樣，由N-｛2-氟-4-[2-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲?；?L-谷氨酸二甲酯和N-｛3-氟-4-[2-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲?；?L-谷氨酸二甲酯，按上述步驟分別制得N-｛2-氟-4-[2-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲酰基｝-L-谷氨酸[熔點(diǎn)230℃(產(chǎn)生泡沫)，＞300℃(分解)]和N-｛3-氟-4-[2-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲?；?L-谷氨酸[熔點(diǎn)＞300℃(分解)]。
按與上述步驟相似的方式，由N-｛4-[2-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]噻吩二基羰基｝-L-谷氨酸二乙酯、N-｛5-[2-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]噻吩-3-基羰基｝-L-谷氨酸二乙酯、N-｛5-[2-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]呋喃-2-基羰基｝-L-谷氨酸二甲酯和N-｛5-[2-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]噻吩-2-基羰基｝-L-谷氨酸二甲酯，分別制得化合物N-｛4-[2-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙]噻吩-2-基羰基｝-L-谷氨酸、N-｛5-[2-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基噻吩-3-基羰基｝-L-谷氨酸、N-｛5-[2-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]呋喃-2-基羰基｝-L-谷氨酸(熔點(diǎn)200-203℃)和N-｛5-[2-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]噻吩-2-基羰基｝-L-谷氨酸(熔點(diǎn)241-243℃)。
同樣，由N-[5-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)戊酰基]-L-谷氨酸二甲酯、N-[7-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)庚?；鵠-L-谷氨酸二甲酯和N-[6-(4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)己酰基]-L-谷氨酸二甲酯，分別制得N-[5-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)戊?；鵠-L-谷氨酸、N-[7-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)庚?；鵠-L-谷氨酸和N-[6-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)己?；鵠-L-谷氨酸。
實(shí)施例13N-｛4-[2-(4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲?；?L-谷氨酸將0.5g N-｛4-[2-(4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲?；?L-谷氨酸二甲酯加入3ml 1N氫氧化鈉所成的混合物，在室溫下攪拌3天，生成N-｛4-[2-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲?；?L-谷氨酸的鈉鹽。反應(yīng)混合物用鹽酸中和。過(guò)濾收集所生成的固體物，經(jīng)加水使之在甲醇中再結(jié)晶，得0.35g(75%)N-｛4-[2-(4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲?；?L-谷氨酸。1NMR(d6-DMSO)δ 1.88-2.12(m，2H)，2.33(t，J＝7.3Hz，2H)，2.97(m，4H)，4.33-4.40(m，1H)，6.70(d，J＝1.2Hz，1H)，7.28(d，J-7.0Hz，2H)，7.76(m，3H)，8.50(d，J＝7.6Hz，1H)，11.48(s，1H)，11.67(s，1H)，12.40(br，1H)。
以相似的方式，由N-｛4-[2-(4-羥基-5-新戊酰氧基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲?；?L-谷氨酸二甲酯，以上述步驟先制得N-｛4-[2-(4-羥基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲?；?L-谷氨酸的鈉鹽，經(jīng)用冰醋酸中和后，制得N-｛4-[2-(4-羥基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲?；?L-谷氨酸。
使4-[2-(4-羥基-5-新戊酰氧基-6-甲基氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲酰甲酯、3-[2-(4-甲基苯基)乙基]-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-(2-苯基乙基)-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-[2-(4-氯苯基)乙基]-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-[2-(4-氟苯基)乙基]-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-[2-(3-氟苯基)乙基]-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]-4-羥基-6-新戊酰氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶和4-[2-(4-羥基-6-新戊酰甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲酸甲酯進(jìn)行上述步驟，分別制得4-[2-(4-羥基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲酸、3-[2-(4-甲基苯基)乙基]-4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-(2-苯基乙基)-4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-[2-(4-氯苯基)乙基]-4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-(2-(4-氟苯基)乙基]-4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶、3-[2(3-氟苯基)乙基]-4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶(熔點(diǎn)295-298℃)、3-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]-4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶(熔點(diǎn)280-284℃)和4-[2-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲酸(熔點(diǎn)＞300℃)。
實(shí)施例14抗代謝物活性比較試驗(yàn)采用下列化合物進(jìn)行抗代謝物試驗(yàn)
化合物A
化合物C
將上列各化合物溶于100%的二甲亞砜中，制備各化合物的稀釋液，使其濃度在下面指出的試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)。
各化合物的抑制活性，按下列步驟測(cè)試原細(xì)胞的預(yù)備使人體淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞(cem human lymphoblastic leu-kemia cells)，在添加10%透析胎牛血清(Gibco)的RPMI 1640培養(yǎng)基(MABiO)中，在37℃及由95%空氣與5%CO2組成的加濕氣氛下生長(zhǎng)。該細(xì)胞在保持log相濃度為3～7×105細(xì)胞/ml的靜態(tài)懸浮液(T型曲頸瓶，Corning公司產(chǎn))中生長(zhǎng)。
步驟(ⅰ)將10μl待試化合物置于微滴板井眼中(Costar 24微滴板)。該步驟對(duì)各試驗(yàn)濃度的化合物均重復(fù)進(jìn)行。
(ⅱ)將50μl的無(wú)血清培養(yǎng)基加到各井眼中。
(ⅲ)將添加10%透析胎牛血清、16mM hepes及8mM mop緩沖劑的RPMI 1640培養(yǎng)基和3×104細(xì)胞/ml裝入無(wú)菌瓶中，并將該瓶置于磁攪拌器上。用Wheaton蠕動(dòng)泵將1.5ml細(xì)胞懸浮液分送到各井眼中。分送到各井眼中產(chǎn)生的最終體積是2.0ml，細(xì)胞濃度為4.8×104細(xì)胞/井眼。
(ⅳ)將微滴板置于加濕恒溫箱(95%空氣、5%CO2)中，在37℃下培育72小時(shí)。
(ⅴ)經(jīng)培育后，用ZB 1 Coulter Counter粒子計(jì)數(shù)器測(cè)量各井眼，確定IC50(抑制50%細(xì)胞生長(zhǎng)的濃度)。
(ⅵ)該試驗(yàn)的結(jié)果如下表 Ⅰ濃度 細(xì)胞生長(zhǎng)(%)(μg/ml) A B C100.0 13.1 - 1433.3 15.5 10.8 1211.1 16.2 9.6 123.7 15.3 10.4 131.23 16.1 11.3 140.411 21.5 13.0 130.137 63.9 17.7 140.045 100.0 33.5 140.015 - 76.9 250.005 - - 96
化合物A、B和C各都呈現(xiàn)對(duì)人體淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞的活體外抑制活性。這些化合物在活體外的一般相對(duì)抑制濃度(IC50)如下化合物A0.2μg/ml，化合物B0.03μg/ml，化合物C0.007μg/ml。
所有化合物都顯示抑制活性。在活體外進(jìn)行比較時(shí)，化合物C在三者中活性最大。
逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)各化合物的作用機(jī)制，均用所謂“逆轉(zhuǎn)”試驗(yàn)的進(jìn)一步測(cè)試來(lái)確定。向這些試驗(yàn)提供能單獨(dú)或共同辨別酶抑制作用特定點(diǎn)的各種化合物或先質(zhì)。
(a)次黃嘌呤-如果化合物起嘌呤再合成抑制劑的作用，則次黃嘌呤會(huì)使化合物的抑制作用逆轉(zhuǎn)。這樣，次黃嘌呤的存在，可使細(xì)胞不進(jìn)行嘌呤再合成。
(b)胸苷-如果化合物起胸苷酸合成酶的特殊抑制作用，則胸苷會(huì)單獨(dú)使化合物的抑制作用逆轉(zhuǎn)。
(c)次黃嘌呤和胸苷-如果一種化合物在(a)中確不是嘌呤再合成的抑制劑，而且在(b)中確定不是胸苷酸(thymidilate)合成酶的抑制劑，則結(jié)合使用次黃嘌呤和胸苷的逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)，可確定該化合物是否可以同時(shí)抑制這兩種合成途徑。這樣，如果這兩者的結(jié)合使用可使一種化合物的抑制作用逆轉(zhuǎn)，則該化合物很可能起抑制二氫葉酸還原酶的劑作用(與嘌呤和嘧啶的生物合成都有關(guān))。
步驟在各種情況下，都采用上面概述的基本步驟，變動(dòng)在于，將250μl的逆轉(zhuǎn)化合物[或者(b)中的各逆轉(zhuǎn)化合物]加到測(cè)試井眼中，將加到各個(gè)測(cè)試井眼中的無(wú)血清培養(yǎng)基量減少同樣的量[或者在(b)中完全不加]。將逆轉(zhuǎn)化合物在磷酸鹽緩沖的鹽水(無(wú)菌濾過(guò)0.2μ頂隔膜(acrodisc)過(guò)濾器-Gelman)中配制成8X原液。使250μl原液的最終濃度為100μM次黃嘌呤及/或5μM胸苷。
逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)的結(jié)果如下(a)次黃嘌呤(100μM)表Ⅱ濃度 細(xì)胞生長(zhǎng)(%)μg/ml) 化合物 + 化合物 + 化合物 +A＊次黃嘌呤 B＊次黃嘌呤 C＊次黃嘌呤100.0 13.1 15.3 - - 14 1333.3 15.5 16.7 10.8 16.2 12 1411.1 16.2 17.6 9.6 15.9 12 133.7 15.3 16.4 10.4 14.4 13 131.23 16.1 15.5 11.3 15.6 14 130.411 21.5 19.0 13.0 20.4 13 120.137 63.9 73.8 17.7 43.2 14 150.045 100.0 100.0 33.5 83.9 14 120.015 - - 76.9 99.5 25 240.005 - - - - 96 100＊數(shù)據(jù)取自表Ⅰ。
(b)次黃嘌呤(100μM)加胸苷(5μM)進(jìn)一步測(cè)試化合物B，以確定抑制活性的第二部分。
表Ⅲ濃度 細(xì)胞生長(zhǎng)(%)(μg/ml) 對(duì)比值 B＊+次黃嘌呤和胸苷33.3 10.8 69.911.1 9.6 74.73.7 10.4 79.41.23 11.3 89.40.411 13.0 92.70.137 17.7 92.90.045 33.5 92.8＊數(shù)據(jù)取自表Ⅰ。
(c)胸苷(5μM)表Ⅳ濃度 細(xì)胞生長(zhǎng)(%)μg/ml) 化合物 + 化合物 + 化合物 +A＊胸苷 B＊胸苷 C＊胸苷100.0 13.1 48.8 - - 14 4433.3 15.5 49.4 10.8 11.6 12 5711.1 16.2 49.4 9.6 11.6 12 523.7 15.3 52.6 10.4 12.1 13 561.23 16.1 62.1 11.3 12.3 14 580.411 21.5 73.9 13.0 14.9 13 550.137 63.9 98.1 17.7 18.0 14 640.045 100.0 100.0 33.5 32.5 14 81
0.015 - - 76.9 81.1 25 1000.005 - - - - 96 100＊數(shù)據(jù)取自表Ⅰ。
活體內(nèi)活性分析測(cè)試化合物A和C，以進(jìn)一步比較其活體內(nèi)抗腫瘤活性。
給雌性小鼠(Strain DBA/2)接種腫瘤細(xì)胞。接種后當(dāng)天，開(kāi)始用待試化合物治療。治療包括連續(xù)8天腹膜內(nèi)給8個(gè)日劑量的化合物A或C。最后一天治療的次日，測(cè)量腫瘤大小，以確定待試化合物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。
結(jié)果如下表Ⅴ化合物A劑量 動(dòng)物數(shù) 腫瘤重量 %(mg/kg) (mg)1抑制0(Control)＊8 2050±774 -0(Control)＊8 2753±790 -200 8 2525±694 0100 8 3447±747 050 8 1935±498 1925 8 2121±410 1212.5 8 3360±703 06.25 8 2719±413 03.125 8 2825±822 0
＊所有對(duì)比組測(cè)定數(shù)據(jù)的平均腫瘤重量(mg)＝2402±839。
1.平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。
表Ⅵ化合物C劑量 動(dòng)物數(shù) 腫瘤重量 %(mg/kg) (mg)1抑制試驗(yàn)10.0(對(duì)比組) 6 3606±2099 00.0(對(duì)比組) 6 5533±1234 0200.00 7 0±0 100100.00 7 0±0 10050.00 6 0±0 10025.00 7 0±0 10012.50 7 102±166 98試驗(yàn)20(對(duì)比組)＊10 6776±1328 -0(對(duì)比組)＊10 5533±2645 -40 9 0±0 10020 10 18±57 10010 10 196±152 975 10 1034±657 832.5 10 2908±1948 531.25 10 6682±2300 0
0.6256 10 7381±2397 0＊所有對(duì)比組該數(shù)據(jù)的平均腫瘤重量(mg)＝6155±2134。
1.平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。
化合物A在活體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)基本上毫無(wú)抑制作用。盡管在劑量為25和50mg/Kg時(shí)，觀察到腫瘤重量稍有減少，但不能視為有效，因?yàn)樵趧┝繛?00或200mg/Kg時(shí)，腫瘤重量毫無(wú)減少。
化合物C呈現(xiàn)顯著的活體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，在劑量低如20mg/Kg時(shí)，100%抑制;在劑量至少為2.5mg/kg時(shí)，抑制大于50%。
化合物B同化合物A或C的作用機(jī)制不一樣，即DHFR抑制，而不是TS抑制。盡管在活體外，化合物A和C看來(lái)是TS抑制，但在活體外，化合物C的活性比化合物A至少大25倍。在活體內(nèi)，化合物A無(wú)抗腫瘤劑活性。化合物C在活體內(nèi)具很高的抗腫瘤活性。
典型化合物抗CCRF-CEM細(xì)胞培養(yǎng)物的代表性抑制值如下化合物 IC50(μg/ml)4-[2-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲酸……＞20.00N-｛4-[2-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲?；?L-谷氨酸……0.0043-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]-4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶……＞20.00
N-｛2-氟-4-[2-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲?；?L-谷氨酸……0.008N-｛3-氟-4-[2-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲?；?L-谷氨酸……0.0193-[2-(3-氟苯基)乙基]-4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶……＞20.00N-｛5-[2-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]噻吩-2-基羰基｝-L-谷氨酸……0.025N-｛5-[2-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]呋喃-2-基羰基｝-L-谷氨酸……＞20.00N-｛4-[2-(4-羥基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲?；?L-谷氨酸……0.0084N-｛4-[2-(4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)乙基]苯甲?；?L-谷氨酸……1.20添加次黃嘌呤或AICA并不逆轉(zhuǎn)這些化合物的細(xì)胞毒性，這可假定它們并不抑制嘌呤再生物合成的途徑，但其細(xì)胞毒性可被胸苷逆轉(zhuǎn)，這表明胸苷酸合成酶是主靶。添加甲酰四氫葉酸也逆轉(zhuǎn)細(xì)胞毒性，這表明細(xì)胞毒性是由于葉酸相關(guān)機(jī)制的拮抗作用所致。
權(quán)利要求
1.一種制備以下式表示的化合物的方法
式中R1為-OH或-NH2；R2為氫或一個(gè)可在藥物中應(yīng)用的陽(yáng)離子；R3為未取代的或被氯、氟、甲基、甲氧基或三氟甲基取代的1，4-亞苯基或1，3-亞苯基；各是未被取代的或被氯、氟、甲基、甲氧基或三氟甲基取代的噻吩二基或呋喃二基；環(huán)己二基或鏈烷二基；R4為氫、甲基或羥甲基；以及R5為氫、含1-6個(gè)碳原子的烷基、氨基或含1至12個(gè)碳原子的烷酰氨基，標(biāo)有＊的碳原子的構(gòu)型為S型。該方法包括催化氫化以下式表示的化合物
式中
Z1是氫、或Z1與R4′一起共同為一個(gè)碳一碳鍵；R1是-OH或-NH2；R2′是氫或羧基保護(hù)基團(tuán)；R3的定義如上所述；R4′在與Z1無(wú)關(guān)時(shí)為氫、甲基、羥甲基或以羥基保護(hù)基團(tuán)以代的羥甲基；R5′是氫、含1-6個(gè)碳原子的烷基、氨基、含1至12個(gè)碳原子的烷酰氨基或氨基保護(hù)基團(tuán)；以制得用下式表示的化合物；
式中X、R1、R2′、R3、R4′、R5′的定義如上所述；而且當(dāng)X=COOR2′時(shí)，使之與一種被保護(hù)的谷氨酸耦合，以形成一種化合物其中
再除去所有保護(hù)基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在原料化合物中R1是-OH;R3是1，4-亞苯基;R4′是氫和R5′是氫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在原料化合物中R1是-OH;R3是1，4-亞苯基;R4′是氫和R5′是甲基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在原料化合物中R1是-OH;R3是噻吩二基;R4′是氫和R5′是氫。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在原料化合物中R1是-OH;R3是噻吩二基;R4′是氫和R5′是甲基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中原料化合物為N-｛4-[2-(4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)-1，2-亞乙烯基]苯甲酰基｝-L-谷氨酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中原料化合物為N-｛4-[2-(4-羥基-6-甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)-1，2-亞乙烯基]苯甲?；?L-谷氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在原料化合物中R5′是氨基或含1至12個(gè)碳原子的烷酰氨基。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中原料化合物為N-｛4-[2-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)-1，2-亞乙烯基]苯甲?；?L-谷氨酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在原料化合物中R3是未被取代的或被氯、氟、甲基、甲氧基或三氟甲基取代的噻吩二基或呋喃二基;環(huán)己二基和鏈烷二基;R4′是氫、甲基或羥甲基;而R5′是氨基。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中在原料化合物中R3是噻吩二基而R4′是氫。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中原料化合物為N-｛5-[2-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)-1，2-亞乙烯基]噻吩-2-基羰基｝-L-谷氨酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中原料化合物為N-｛4-[2-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)-1，2-亞乙烯基]噻吩-2-基羰基｝-L-谷氨酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中原料化合物為N-｛5-[2-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)-1，2-亞乙烯基]噻吩-2-基羰基｝-L-谷氨酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中原料化合物為N-｛4-[2-(4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基)-1，2-亞乙烯基]苯甲?；?L-谷氨酸。
全文摘要
N-(?；?谷氨酸衍生物中酰基為4-羥基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基取代者，是抗腫瘤劑。典型的具體衍生物是N-[4-(2-{4-羥基-6-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基}乙基)苯甲酰基]-L-谷氨酸。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1055182SQ9011012
公開(kāi)日1991年10月9日 申請(qǐng)日期1990年12月11日 優(yōu)先權(quán)日1989年12月11日
發(fā)明者愛(ài)德華·C·泰勒, 石全, 迪特馬爾·G·庫(kù)恩特, 杰拉爾德·B·格林代 申請(qǐng)人:普林斯頓大學(xué)托管委員會(huì)