專利名稱：一種乳豬肝臟刺激生長因子的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生化制劑的提取方法，更具體地說是對(duì)乳豬肝臟刺激生長因子的制備工藝。
近年來，國內(nèi)利用人胎肝細(xì)胞懸液在治療病毒性肝炎和重癥肝炎方面取得了突破性進(jìn)展，目前已探明其治愈肝炎的有效成份是人胎肝細(xì)胞懸液中含有一種生物活性較高的肝臟刺激生長因子(HSS)，它能促進(jìn)受損肝臟細(xì)胞DNA合成，刺激肝臟細(xì)胞再生，使肝病損傷得到修復(fù)。但是，由于人胎肝來源困難，儲(chǔ)存不便和未經(jīng)純化諸原因，人胎肝的應(yīng)用受到很大限制。而且，肝臟刺激生長因子(HSS)的制備也十分復(fù)雜和困難，70年代，美國有科學(xué)家從乳豬肝中純化提制出肝臟刺激生長因子(HSS)，他的工藝流程是選用健康乳豬經(jīng)照光24小時(shí)后第二天處死取肝，將肝搗碎加入0.9%氯化鈉液放置95℃水浴箱15分鐘后取出，經(jīng)27000g/分(高速)離心20分鐘后，在4℃環(huán)境下收集上清液再加入6倍的冷酒精沉淀，經(jīng)4℃下微振蕩2小時(shí)，再高速離心20分鐘，此時(shí)加入緩液稀釋，即得到乳豬肝臟刺激生長因子的粗制品經(jīng)Dye Ligand層析再由DEAE離子交換葡聚糖凝膠G-75過柱，再選用Sephcose 4B親和層析，即得到純肝臟刺激生長因子的精品。這和提制方法需用大量高精儀器和大型設(shè)備、工藝流程十分復(fù)雜，尤其是在葡聚糖凝膠層析、親和層析過程中，需用昂貴的化學(xué)試劑才能提制精品，整個(gè)提制過程中周期長，而且得到肝臟刺激因子精品活性較低。造成肝臟刺激生長因子精品昂貴，嚴(yán)重阻礙肝臟刺激生長因子臨床的廣泛應(yīng)用，因此，肝臟刺激生長因子的制備工藝改進(jìn)，是促進(jìn)這一生化制劑廣泛應(yīng)用于臨床亟待解決的問題。
本發(fā)明的目的是利用現(xiàn)有國產(chǎn)儀器設(shè)備，采用改進(jìn)和自行設(shè)計(jì)的工藝方法，從乳豬肝臟提取肝臟刺激生長因子，簡化制備工藝，降低生產(chǎn)成本，提高肝臟刺激生長因子的活性度和產(chǎn)量，促進(jìn)這一生化制劑的廣泛應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的取健康乳豬(5公斤重)的肝臟，加入蒸餾水搗成勻漿，加入緩沖劑，常溫下攪拌一小時(shí)提取，將提取物放置水浴箱內(nèi)加熱至95℃，15分鐘后過濾，取出濾液，加入95%乙醇沉淀，在4℃下靜置5小時(shí)后過濾，再將沉淀溶于0.02MPH7.2的磷酸鹽緩沖液中，加入離子交換劑(DEAE)，在常溫下攪拌2小時(shí)過濾，用磷酸鹽緩沖液洗滌離子交換劑至沒有乳白色后進(jìn)行裝柱，分別用0.36～0.38%氯化鈉液(A液)和0.68～0.7%氯化鈉液(B液)兩種不同濃度的溶液洗柱，收集B液洗脫的組分，按其所獲得的體積計(jì)算加入5倍磷酸鹽緩沖液(C液)，即得到肝臟刺激生長因子的精品。
本發(fā)明制備工藝方法的具體步驟如下
選用上述改進(jìn)的制備工藝，其方法簡便，不需高精復(fù)雜的儀器設(shè)備，省去低溫高速離心、省去葡聚糖過柱和親和層析兩種復(fù)雜的方法，對(duì)所獲得的乳豬肝臟刺激生長因子，經(jīng)蛋白質(zhì)和生物活性測(cè)定，都優(yōu)于國外制備工藝產(chǎn)品，而且可獲得的產(chǎn)量多，經(jīng)藥理急性毒性試驗(yàn)證示無毒付反應(yīng)，同時(shí)，臨床應(yīng)用證明，該肝臟刺激生長因子具有穩(wěn)定、純凈、療效明顯的特點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種乳豬肝臟刺激生長因子的制備工藝，包括選擇健康乳豬進(jìn)行光照后處死取出肝臟，用蒸餾水搗成勻漿，加入緩沖劑加熱、離心，加入6倍冷酒精沉淀、振蕩、高速離心，再加緩沖液稀釋得到粗制品，粗制品經(jīng)DyeLigand層析、DEAE離子交換、葡萄糖凝膠G-75過柱、Sephcose4B親和層析的工藝，其特征在于加熱后是采用直接過濾并加入95%乙醇沉淀，然后對(duì)沉淀物加入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行離子交換劑(DEAE)攪拌過濾，用蒸餾水再洗滌離子交換劑后進(jìn)行裝柱，分別用A液和B液洗柱，收集B液洗脫的組分加入C液沉淀，獲得肝臟刺激生長因子的精品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝臟刺激生長因子制備工藝，其特征在于對(duì)沉淀物內(nèi)加入的是0.2M磷酸鹽緩沖液(PH 7.2)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝臟刺激生長因子制備工藝，其特征在于洗滌離子交換劑時(shí)，是用磷酸鹽緩沖液需洗滌至沒有乳白色后，才能將沉淀物進(jìn)行裝柱。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝臟刺激生長因子制備工藝，其特征在于對(duì)沉淀物進(jìn)行裝柱后，需分別用A液和B液進(jìn)行洗柱，A液是0.36～0.38%氯化鈉溶液，B液是0.68～0.7%氯化鈉溶液，洗柱后，收集B液洗脫的組分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝臟刺激生長因子制備工藝，其特征在于收集B液洗柱的組分是按其洗得的體積計(jì)算加入5倍的C液進(jìn)行沉淀，C液是磷酸鹽緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乳豬肝臟刺激生長因子(HSS)的制備工藝。該工藝包括下列步驟選擇健康乳豬光照24小時(shí)處死取出肝臟加蒸餾水搗成勻漿，加入緩沖劑加熱過濾，加乙醇沉淀再過濾，對(duì)沉淀物加入磷酸鹽緩沖液和離子交換攪拌過濾，再用蒸餾水洗滌裝柱，對(duì)裝柱內(nèi)容物分別用A液、B液洗滌，收集B液洗柱加入磷酸鹽緩沖液得即到肝臟刺激生長因子。
文檔編號(hào)A61K35/407GK1068036SQ9110422
公開日1993年1月20日 申請(qǐng)日期1991年7月1日 優(yōu)先權(quán)日1991年7月1日
發(fā)明者蘇先獅 申請(qǐng)人:湖南醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院