專利名稱：從金黃色葡萄球菌代謝產(chǎn)物中提取治療惡性腫瘤用藥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑即用金黃色葡萄球菌代謝產(chǎn)物提取預(yù)防和治療惡性腫瘤用藥的方法。該方法的產(chǎn)品對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞有直接殺傷作用，還能大幅度提高機(jī)體的免疫功能，間接抑制和殺滅腫瘤細(xì)胞，明顯的修復(fù)正常組織細(xì)胞，增加白細(xì)胞、血小板的數(shù)量和功能。所述的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑是指能顯著增強(qiáng)、促進(jìn)或恢復(fù)人體防御能力(免疫力)的物質(zhì)，這些物質(zhì)統(tǒng)稱生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，所述的該方法的產(chǎn)品簡(jiǎn)稱為“BM828”。
委托國(guó)家專利局審查四部的審查員(委托編號(hào)91019)通過(guò)聯(lián)機(jī)檢索提出以下相應(yīng)文獻(xiàn)。JP55-8730公開(kāi)了一種用于支氣管氣喘的藥劑，方法分別是培養(yǎng)每一桿菌屬收集起細(xì)胞體，并用加熱來(lái)殺死細(xì)胞，再用“福爾馬林”消毒，然后，懸浮在生理鹽水溶液中，這樣就制得死細(xì)胞基礎(chǔ)溶液，將所得的基礎(chǔ)溶液混合做成注射針劑，它就可以用作一種抗病毒制劑，其不足之處，這種方法制得的產(chǎn)品質(zhì)量欠佳、穩(wěn)定性差，有一定副作用。
另一篇是JP5445161公開(kāi)了一種用于防治惡性腫瘤的免疫性增強(qiáng)劑，其方法是將葡萄球菌屬金色細(xì)胞或細(xì)菌體粉碎、過(guò)濾掉固體組分后，所得的組分是一種免疫性增強(qiáng)劑?？捎糜谟行У胤乐渭?xì)胞的免疫性功能被降低的癥狀，主要治療病毒性感染。
不足之外細(xì)菌先粉碎再過(guò)濾，濾液成份復(fù)雜，過(guò)濾掉固體，液體中含有粉碎的細(xì)物質(zhì)，不難想到副作用大，雖然有免疫增強(qiáng)作用，但對(duì)腫瘤治療作用和增白細(xì)胞作用沒(méi)有效果。
本發(fā)明的目的為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處公開(kāi)了一種工藝簡(jiǎn)單、質(zhì)量可靠、毒副作用極小用金黃色葡萄球菌的代謝產(chǎn)物提取治療惡性腫瘤用藥的方法。
本發(fā)明的目的通過(guò)如下方案來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法按工藝流程描述可分三部分第一部分·菌種的制備;第二部分·培養(yǎng)基制備;第三部分·合并接種培養(yǎng)、發(fā)酵、提取、制劑的制備。
第一部分菌種的制備1、復(fù)蘇培養(yǎng)將金黃色葡萄球菌接種于用豬心浸出液配制的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面35℃培養(yǎng)18小時(shí);
2、分裝取斜面培養(yǎng)適量，均勻磨于1ml脫脂牛奶制成懸液分裝入無(wú)菌菌種管，每管0.3ml;
3、凍結(jié)將裝有菌懸液的菌種管置-30℃低溫酒精中速凍一小時(shí);
4、低壓抽干將凍結(jié)后的菌種管置含干燥CaCl2真空干燥器中接上真空泵，真空抽干(約需七小時(shí));
5、密封將上述抽干的菌種管接在橡皮多岐管上真空抽氣約10-20分鐘，在真空條件下火焰封閉管口。
第二部分培養(yǎng)基的制備主要成分蛋白胨0.5-2g%、氯化鈉0.3-0.9g%、硫胺0.0-0.05g%、豬心浸液5-20ml%、羊肝浸液5-30ml%。
1、豬心浸液制備取新鮮豬血、去除血塊、脂肪、筋膜用自來(lái)水、新鮮重蒸餾水洗凈、鉸碎、稱重、加二倍量的針劑用新鮮重蒸餾水置冰箱(4℃)14小時(shí)，煮沸二小時(shí)趁熱用八層沙布粗濾，再用布氏漏斗定量濾紙抽濾，得澄清黃色液體備用。
2、羊肝浸液用同樣方法制備;
3、按需配藥量，稱取蛋白胨、氯化鈉，用新鮮重蒸餾水加熱溶液;
4、按需配藥量量取(吸取)豬心浸出液，羊肝浸出液和硫胺;
5、將3.4溶液混合，加針劑用新鮮重蒸餾水至所需量;
6、調(diào)PH至3-4加入0.5g%針劑用粉末狀優(yōu)質(zhì)活性碳，煮沸(不停攪拌)半小時(shí);
7、用布氏漏斗定量濾紙抽濾脫碳;
8、調(diào)PH至7-9加0.5g%針劑用粉末狀優(yōu)質(zhì)活性碳再次煮沸半小時(shí);
9、抽濾脫碳;
10、調(diào)PH至6.0-7.5分裝500ml(已經(jīng)清潔液處理，重蒸餾水洗凈180℃干烤二小時(shí)除熱源的)鹽水瓶加鋁蓋軋口;
11、高壓15磅30分鐘滅菌備用。
第三部分接種采用濃度10000-20億/ml，比例0.5-5ml%，培養(yǎng)在30℃-38℃，18-72/小時(shí)，調(diào)整PH6-7.6，除菌過(guò)濾微孔濾膜0.22μ。
本菌株可命名為高聚金葡萄(HAS)是一種高效低毒的新菌株，在申請(qǐng)日之前已送往中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心提供微生物樣品。
1、提供微生物樣品的請(qǐng)求人是沈陽(yáng)協(xié)合生物制劑技術(shù)有限公司法人代表陳巨余，地址沈陽(yáng)市和平區(qū)三好街9甲8號(hào)，時(shí)間1991年3月，保藏號(hào)待查，簡(jiǎn)要說(shuō)明如下高聚金葡菌是從醫(yī)院臨床各科送細(xì)菌室檢驗(yàn)的各種病理標(biāo)本中分離得到的105株葡萄球菌中篩選出來(lái)的，菌株的保存方法-真空冷凍干燥法，保護(hù)劑、脫脂牛奶，為了達(dá)到既要長(zhǎng)期保存又要保持菌株遺傳學(xué)性質(zhì)不變的目的，除了選擇有效穩(wěn)定的方法和每次對(duì)冷凍干燥的效果進(jìn)行檢測(cè)外，還要對(duì)復(fù)蘇的菌株進(jìn)行全面鑒定。
毒理試驗(yàn)供試藥液為臨床用“BM828”注射液的20倍濃配液，小白鼠體重17-20克/只，雌、雄各半健康無(wú)孕，取20只按性別體重隨機(jī)分為兩組，每組10只，正常對(duì)照組不給任何藥物，試驗(yàn)組每只小白鼠腹腔注射上述供試液0.5ml給藥后，小白鼠無(wú)任何立發(fā)反應(yīng)，觀察七天，小白鼠健存，稱取體重，斷頸處死，解剖肉眼觀察，各主要臟器未見(jiàn)明顯病理改變，摘取心、肝、脾、雙腎分別稱重，計(jì)算各動(dòng)物的心-體比、肝-體比、脾-體比、腎-體比，對(duì)正常對(duì)照組與給藥組的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性測(cè)驗(yàn)，將上述臟器按常規(guī)固定制成組織切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察，對(duì)照組與給藥組的各主要臟器(心、肝、脾、腎)均未見(jiàn)明顯的組織學(xué)改變。
結(jié)論給藥七天后剖析小鼠各主要內(nèi)臟無(wú)異常所見(jiàn)與正常對(duì)照組相比較，小白鼠生長(zhǎng)速度、心-體比、肝-體比、脾-體比、腎一體比均無(wú)顯著差異(P770.05)心肝脾腎的組織學(xué)檢查亦未見(jiàn)異常改變。
本實(shí)驗(yàn)每只小鼠均注射0.5ml，若按20克體重計(jì)算，相當(dāng)小白鼠腹腔注射20倍濃配液25ml/kg，換算成注射液500ml/kg，此劑量按公斤體重計(jì)算為人臨床劑量的50000倍。
臨床試驗(yàn)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所、軍科院307醫(yī)院、鞍山市中心醫(yī)院腫瘤部、遼寧省武警醫(yī)院腫瘤科等單位分別作了臨床應(yīng)用。
舉例鞍山市中心醫(yī)院腫瘤住院部應(yīng)用“BM828”對(duì)原發(fā)性肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、腦瘤、癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)等患者進(jìn)行免疫治療、追蹤監(jiān)測(cè)獲得滿意結(jié)果，如治療1個(gè)月后，NK細(xì)胞(提高免疫功能一個(gè)指標(biāo))，增加162-312%實(shí)體瘤縮小50%-75%。
1)病例選擇李明 男 31歲患腦膜瘤，于1989年10月在沈陽(yáng)陸軍總院手術(shù)，取出二個(gè)2×3公分的腫瘤，1990年8月病情復(fù)發(fā)二次手術(shù)，又取出一個(gè)3×4公分腫瘤，術(shù)后不到4個(gè)月，第三次復(fù)發(fā)癱瘓，不得已再進(jìn)行第三次手術(shù)，此時(shí)癌細(xì)胞已廣泛轉(zhuǎn)移只取掉了一部分癌瘤，當(dāng)病人接受BM828一個(gè)療程后，病情就得到了控制，癥狀明顯減輕精神日益好轉(zhuǎn)，現(xiàn)在已經(jīng)和正常人一樣進(jìn)食，可以下床走路，甚至干一些輕便勞動(dòng)。
鞍山20例惡性腫瘤患者進(jìn)行免疫治療均獲得滿意效果。
2)治療方案
BM828為微黃色，澄清的滅菌生物制劑，不含防腐劑，無(wú)任何毒副作用，注射液2ml/支，含1000單位肌肉注射，1-2天注射一次，30次為一個(gè)療程。
3)療效標(biāo)準(zhǔn)顯效對(duì)惡性腫瘤有直接殺傷作用，還能大幅度，提高機(jī)體的免疫功能間接抑制和殺滅腫瘤細(xì)胞，增加白細(xì)胞、血小板的作用。
鞍山中心醫(yī)院提供的數(shù)據(jù)，有效率90%，無(wú)毒副作用。
中國(guó)人民解放軍軍事科學(xué)院腫瘤醫(yī)院提供證明，經(jīng)動(dòng)物藥效試驗(yàn)，結(jié)果局部用藥1500單位/一次，抑瘤率達(dá)91%。
4)治療結(jié)果徐洪英左乳腺癌，左腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫塊4×3公斤用藥一個(gè)療程，NK細(xì)胞明顯增多達(dá)413%，淋巴結(jié)縮小2/3，二個(gè)療程后，腫塊基本消失。
王桂生原發(fā)性肝癌，門靜脈癌栓、高壓、大量腹水、下肢浮腫，用藥二個(gè)療程，均恢復(fù)正常腹水明顯減少雙下肢浮腫消失。
羅長(zhǎng)滿食道癌，胸椎轉(zhuǎn)移，用藥二個(gè)療程后，NK細(xì)胞明顯增多，欽透食道粘膜粗糙病灶消失。
李恩權(quán)鼻咽癌復(fù)發(fā)，骨轉(zhuǎn)移，經(jīng)治療二個(gè)療程以后，NK細(xì)胞增多，左肋腫塊消退，疼痛減輕，頸部活動(dòng)增大。
以上足以證明BM828具有顯著的療效，與化療相比，具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)越性。
根據(jù)本發(fā)明所描述的用金黃色葡萄球菌制備生物調(diào)節(jié)劑的方法是一種經(jīng)濟(jì)、合理的方法，因?yàn)樵摲椒ǖ某煞志?yōu)質(zhì)的品種，不加任何防腐劑，又是滅菌制劑，無(wú)任何副作用，其安全可靠程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)一般生物制劑，特別是采用本法制備的BM828制劑注射液，質(zhì)量和療效穩(wěn)定，避光涼暗處保存二年不沉淀澄清度好。經(jīng)毒理檢查證明完全無(wú)任何毒副作用，藥理檢驗(yàn)不僅證實(shí)有顯著增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，如正常小鼠注射BM828(650單位/鼠)，自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的活性較給藥前增加232%，在患有肺癌小鼠中注射，此藥后NK活性較對(duì)照組，增加304%，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率增加158%等，對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的殺傷也非常理想，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)對(duì)肺癌、宮頸癌、消化道惡性腫瘤抑瘤率在30%-40%之間，達(dá)到或超過(guò)了國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例結(jié)合附

圖1描述，附圖1是本發(fā)明的工藝流程圖。舉例來(lái)說(shuō)明步驟實(shí)施例1 第一部分菌種的制備1、復(fù)蘇培養(yǎng)將金黃色葡萄球菌接種于用豬心浸出液配制的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面35℃培養(yǎng)18小時(shí);
2、分裝取斜面培養(yǎng)適量，均勻磨于1ml脫脂牛奶制成懸液分裝入無(wú)菌菌種管，每0.3ml;
3、凍結(jié)將裝有菌懸液的菌種管置-30℃低溫酒精中速凍一小時(shí);
4、低壓抽干將凍結(jié)后的菌種管置含干燥CaCl2真空干燥器中接上真空泵，真空抽干(約需七小時(shí));
5、密封將上述抽干的菌種管接在橡皮多岐管上真空抽氣約10-20分鐘，在真空條件下火焰封閉管口。
第二部分培養(yǎng)基的制備主要成分蛋白胨0.5g%、氯化鈉0.3g%、硫胺0.0g%、豬心浸液5ml%、羊肝浸液5ml%。
1、豬心浸液制備取新鮮豬血、去除血塊、脂肪、筋膜用自來(lái)水、新鮮重蒸餾水洗凈、鉸碎、稱重、加二倍量的針劑用新鮮重蒸餾水置冰箱(4℃)14小時(shí)，煮沸二小時(shí)趁熱用入層沙布粗濾，再用布氏漏斗定量濾紙抽濾，得澄清黃色液備用。
2、羊肝浸液用同樣方法做;
3、按需配藥量，稱取蛋白胨、氯化鈉，用新鮮重蒸餾水加熱溶液;
4、按需配藥量量取(吸取)豬心浸出液，羊肝浸出液和硫胺;
5、將3.4溶液混合，加針劑用新鮮重蒸餾水至所需量;
6、調(diào)PH至3-4加入0.5g%針劑用粉末狀優(yōu)質(zhì)活性碳，煮沸(不停攪拌)半小時(shí);
7、用布氏漏斗定量濾紙抽濾脫碳;
8、調(diào)PH至7-9加0.5g%針劑用粉末狀優(yōu)質(zhì)活性碳再次煮沸半小時(shí);
9、抽濾脫碳;
10、調(diào)PH至6.0-7.5分裝500ml(已經(jīng)清潔液處理，重蒸餾水洗凈180℃干烤二小時(shí)除熱源的)鹽水瓶加鋁蓋軋口;
11、高壓15磅30分鐘滅菌備用。
第三部分接種采用濃度10000-20億/ml，比例0.5ml%，培養(yǎng)在30℃-38℃，18-72/時(shí)，調(diào)整PH6-7.6，除菌1、除菌2微孔濾膜0.22μ。
實(shí)施例2 第一部分菌種的制備1、復(fù)蘇培養(yǎng)將金黃色葡萄球菌接種于用豬心浸出液配制的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面35℃培養(yǎng)18小時(shí);
2、分裝取斜面培養(yǎng)適量，均勻磨于1ml脫脂牛奶制成懸液分裝入無(wú)菌菌種管，每0.3ml;
3、凍結(jié)將裝有菌懸液的菌種管置-30℃低溫酒精中速凍一小時(shí);
4、低壓抽干將凍結(jié)后的菌種管置含干燥CaCl2真空干燥器中接上真空泵，真空抽干(約需七小時(shí));
5、密封將上述抽干的菌種管接在橡皮多岐管上真空抽氣約10-20分鐘，在真空條件下火焰封閉管口。
第二部分培養(yǎng)基的制備主要成分蛋白胨2g%、氯化鈉0.9g%、硫胺0.05g%、豬心浸液20ml%、羊肝浸液30ml%。
1、豬心浸液制備取新鮮豬血、去除血塊、脂肪、筋膜用自來(lái)水、新鮮重蒸餾水洗凈、鉸碎、稱重、加二倍量的針劑用新鮮重蒸餾水置冰箱(4℃)14小時(shí)，煮沸二小時(shí)趁熱用入層沙布粗濾，再用布氏漏斗定量濾紙抽濾，得澄清黃色液備用。
2、羊肝浸液用同樣方法做;
3、按需配藥量，稱取蛋白胨、氯化鈉，用新鮮重蒸餾水加熱溶液;
4、按需配藥量量取(吸取)豬心浸出液，羊肝浸出液和硫胺;
5、將3.4溶液混合，加針劑用新鮮重蒸餾水至所需量;
6、調(diào)PH至3-4加入0.5g%針劑用粉末狀優(yōu)質(zhì)活性碳，煮沸(不停攪拌)半小時(shí);
7、用布氏漏斗定量濾紙抽濾脫碳;
8、調(diào)PH至7-9加0.5g%針劑用粉末狀優(yōu)質(zhì)活性碳再次煮沸半小時(shí);
9、抽濾脫碳;
10、調(diào)PH至6.0-7.5分裝500ml(已經(jīng)清潔液處理，重蒸餾水洗凈180℃干烤二小時(shí)除熱源的)鹽水瓶加鋁蓋軋口;
11、高壓15磅30分鐘滅菌備用。
第三部分接種采用濃度10000-20億/ml，比例5ml%，培養(yǎng)在30℃-38℃，18-72小時(shí)，調(diào)整PH6-7.6，除菌1、除菌2微孔濾膜0.22μ。
權(quán)利要求
1.一種用于對(duì)惡性腫瘤預(yù)防和治療的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，所述的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑是從金黃色葡萄球菌的代謝產(chǎn)物中提取的，其特征可概括為如下步驟菌株復(fù)蘇培養(yǎng)、培養(yǎng)基的精制，將上述兩種液體合并，在濃度10000-20億/ml，比例0.5-5ml%下接種，在30℃-38℃，18-72/小時(shí)條件下培養(yǎng)，調(diào)PH值6-7.6，用0.22μ，微孔濾膜除二次菌，再通過(guò)流通蒸氣高壓滅菌。所述的復(fù)蘇培養(yǎng)方法是用肉湯注入開(kāi)啟后的冷凍干燥管中，使成懸液，然后接種到血平板上35℃培養(yǎng)24小時(shí)觀察其存活情況。(1)培養(yǎng)將金黃色葡萄球菌Z2菌株接種于用豬心浸出液配制的營(yíng)養(yǎng)珠脂斜面35℃培養(yǎng)18小時(shí)；(2)分裝取斜面培養(yǎng)適量，均勻磨于1ml脫脂牛奶制成懸液分裝入無(wú)菌菌種管，每管0.3ml；(3)凍結(jié)將裝有菌懸液的菌種管置-30℃低溫酒精中速凍一小時(shí)；(4)低壓抽干將凍結(jié)后的菌種管置含干燥CaCl2的真空干燥器中，接上真空泵，真空抽干(約需七小時(shí))；(5)密封將上述抽干的菌種管接在橡皮多岐管上，真空抽氣約10-20分鐘，在真空條件下火焰封閉管口；所述的培養(yǎng)基精制方法是精制培養(yǎng)基蛋白胨0.5-2%氯化鈉0.3-0.9%硫胺 0.01-0.05%豬心浸液 5-20ml%羊肝浸液 5-30ml%PGH培養(yǎng)基的精制(1)豬心浸液制備取新鮮豬血，去除血塊、脂及筋膜，用自來(lái)水、新鮮重蒸餾水洗凈，鉸碎，稱重，加兩倍量的針劑用新鮮重蒸餾水置冰箱(4℃)14小時(shí)，煮沸二小時(shí)趁熱用八層紗布粗濾，再用布氏漏斗定量濾紙抽濾，得澄清黃色濾液備用；(2)羊肝浸液制備去除血塊、脂及筋膜，用自來(lái)水、新鮮重蒸餾水洗凈，鉸碎，稱重，加兩倍量的針劑用新鮮重蒸餾水置冰箱(4℃)14小時(shí)，煮沸二小時(shí)趁熱用八層紗布粗濾，再用布氏漏斗定量濾紙抽濾，得澄清黃色濾液備用；(3)按需配藥量，稱取蛋白胨、氯化鈉，用新鮮重蒸餾水加熱溶解；(4)按需配藥量，(吸取)豬心浸出液、新肝浸出液和硫胺；(5)將3、4溶液混合，加針劑用新鮮重蒸餾水至所需量；(6)調(diào)PH至3.5加入3.5g%針劑用粉末狀優(yōu)質(zhì)活性碳煮沸(不停攪拌)半小時(shí)；(7)用布氏漏斗定量濾紙抽濾、脫碳；(8)調(diào)PH至8.5加入0.5g%針劑用粉末狀優(yōu)質(zhì)活性碳再次煮沸(不停攪拌)半小時(shí)；(9)先后用布氏漏斗定量濾紙、G4玻璃濾器抽濾脫碳；(10)調(diào)PH至6.2分裝500ml(已經(jīng)清潔液處理，重蒸餾水洗凈180℃干烤二小時(shí)除熱源的)鹽水瓶加鋁蓋軋口；(11)高壓15磅30分鐘滅菌備用。
2.按照權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌代謝產(chǎn)物中提出治療惡性腫瘤用藥的方法，其特征在于菌株保存-真空冷凍干燥法，保護(hù)劑脫脂牛奶蛋白胨以牛奶為基質(zhì)，豬心、羊肝限離體四個(gè)小時(shí)內(nèi)的健康原料，氫氧化鈉，鹽酸硫胺、活性碳、氯化鈉、蒸餾水。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用金黃色葡萄球菌的代謝產(chǎn)物提取治療惡性腫瘤用藥的方法，該方法的產(chǎn)品簡(jiǎn)稱“BM828”對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞有直接和間接的殺傷作用，培養(yǎng)基主要成分采用蛋白胨、豬心浸液、羊肝浸液制備。用肉湯復(fù)蘇培養(yǎng)菌種，用脫脂牛奶作菌株的保護(hù)劑，高壓滅菌不加任何防腐劑，經(jīng)熱處理、冷浸出、活性炭處理、除菌過(guò)濾等方式制得注射液，具有顯著的大幅度地增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用。
文檔編號(hào)A61K35/74GK1054190SQ9110606
公開(kāi)日1991年9月4日 申請(qǐng)日期1991年4月1日 優(yōu)先權(quán)日1991年4月1日
發(fā)明者朱正中, 陳互余, 吳珺, 藏英年, 張育琴 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)協(xié)合生物制劑技術(shù)有限公司