專利名稱：使用il-4增強對疫苗中免疫原的免疫反應的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含有白細胞介素4作為活性成分，以提高哺乳動物對疫苗中免疫原的初級免疫反應的醫(yī)藥組合物。本發(fā)明還涉及使用白細胞介素4制造醫(yī)藥，用于提高哺乳動物對存在于疫苗中的免疫原的初級免疫反應，以及與所說的疫苗一起給所述的哺乳動物使用有效量的白細胞介素4，用以提高哺乳動物對存在于疫苗中免疫原的有效初級免疫反應的方法。
白細胞介素4[下文簡稱“IL-4”，也有時稱為B細胞刺激因子1，(BSF-1)]最初是由M.Howard等人(J.Exp.Med.(1982)，Vol.155，pp.914-23)作為T細胞衍生的生長因子描述的，不同于IL-2，它可使正常小鼠B淋巴細胞進行長期組織培養(yǎng)，并可與激活的B淋巴細胞相互作用，以維持其增殖長達4個月。雖然混合的B淋巴細胞移植物已被用于初始培養(yǎng)，但似乎具有未成熟表型的B淋巴細胞可因組織培養(yǎng)物中IL-4的存在而特異地增加。如參見Perchel等人，(J.Immunol.(1989)，Vol.142，1558-1568)，另外，G.Trenn等人(J.Immunol.(1988).Vol.140，1101-1106)報導IL-4可刺激來自靜止小鼠T淋巴細胞中之Lyt-2+亞群的細胞毒性T細胞的發(fā)育;H.Spits等人(J.Immunol.(1987).Vol.139，1142-47)述及，不同于IL-2，IL-4可以作為體外人細胞的T細胞生長因子。
已克隆并在COS-7細胞中表達了小鼠IL-4基因(參見T.Otsuka等，Nuc.Acids Res.(1987)，Vol.15，333-334)。在組織培養(yǎng)物中該克隆的因子具有見于從T細胞培養(yǎng)上清液中純化之因子的所有活性。N.Arai等人(J.Immunol.(1989).Vol.142，274-282)和T.Yokota等人(Proc.Natl.Acad.Sci.(1986)，Vol 83，5844-5848)已描述人IL-4基因的克隆和表達，且在COS-7細胞中產生的這種因子與組織培養(yǎng)中研究過的天然分子具有相似的活性。隨著在人和小鼠細胞系統(tǒng)中對IL-4的研究，進而發(fā)現(xiàn)了該分子的其他一些體外活性(ⅰ)IL-4在誘導和調節(jié)IgE合成中起著重要作用，一個伴隨B淋巴細胞亞群發(fā)生的過程被誘導成為增殖過程(參見Pene，J.Proc.Nat′l.Acad.Sci.(1988)，Vol 85，6880-6884);(ⅱ)在組織培養(yǎng)物中，IL-4誘導了正常人B淋巴細胞上的低親和性Fcε受體(CD23)(參見T.DeFrance等人，J.Exp.Med.(1987).Vol.165，1459-1457);(ⅲ)IL-4與其他淋巴細胞活素，特別是γ干擾素(參見R.L.Coffman等人，Immunol.Res.(1988).Vol.102，5-27和S.Romagnani等人，文獻同上)，和T細胞(參見R.L.Coffman等人，文獻同上，S.Romagnani等人，文獻同上，和M.D.Widmer等人，Nature，(1987)，Vol.326，795-98)相互作用，引起B(yǎng)細胞增殖和改變;(ⅳ)IL-4增加特異性抗體類如人B細胞之Ig的分泌(參見J.B.Splawski等人J.Immunol(1989).Vol 142，1569-1572)。(ⅴ)IL-4對T細胞肥大細胞和巨噬細胞具有刺激效應(參見K.H.Grabstein等人J.Immunol.(1987)Vol.139，1148-1153;F.Lee等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1986)，Vol 83.2061;和A.Zlotnik等人J.Immunol(1987)，Vol.138，4275-4279);和(ⅵ)IL-4增加MHC Ⅱ類抗原在靜止B細胞上的表達(R.Noelle等人，PNAS 81.6149-6153，1984)，T.R.Mosmann等人(J.Immunol.Vol.138，1813-1816)公開了在氨基酸序列1-90和129-149有50%同源性的人和小鼠IL-4為種特異的。
在共有美國專利申請序號07/496，832(申請日90年3月21日)和相應于PCT申請的US-91/01733(申請日1991年3月19日)中，公開了使用IL-4增強對感染性抗原攻擊，如病毒、細菌、真菌或原生動物衍生的慢性感染的免疫反應。
本發(fā)明提供了IL-4在制造藥劑方面的應用，經與疫苗合用，給予所述哺乳動物以有效量的IL-4，用以提高所說的哺乳動物對存在于所說疫苗中的免疫原的初級免疫反應。
本發(fā)明還提供了一種用于提高哺乳動物對存在于疫苗中的免疫原的初級免疫反應的醫(yī)藥組合物，所述的組合物包含具有這種提高作用的有效量的IL-4及一種醫(yī)藥上可接受的載體。
本發(fā)明還提供了一種提高哺乳動物對存在于疫苗中之免疫原的初級免疫反應的方法，其包括與所述的疫苗一起對所述的動物使用對這種提高為有效量的IL-4。
本發(fā)明還提供了一種提高哺乳動物對存在于病毒疫苗中免疫原的初級免疫反應的方法，其包括與所述的疫苗一起給所述的哺乳動物使用誘導有效量的IL-4。
本發(fā)明進一步提供了提高哺乳動物對存在于抗破傷風類毒素疫苗中免疫原的初級免疫反應的方法，其包括為上述目的，與破傷風類毒素疫苗一起給所述的哺乳動物使用有效量的IL-4。
本發(fā)明還提供了提高哺乳動物對存在于疫苗中免疫原的初級免疫反應的方法，其中由所說的哺乳動物產生的初級免疫反應在沒有IL-4存在的情況下，不能足夠強或快地預防疾病，該方法包括為此目的，與所說的疫苗一起，給所說的哺乳動物使用有效量的IL-4。
本發(fā)明還提供了用于提高哺乳動物對存在于疫苗中免疫原的初級免疫反應的藥盒，其包含(1)IL-4醫(yī)藥組合物和其藥用載體的容器，以及(2)疫苗的醫(yī)藥組合物和其藥用載體的容器。


圖1圖群顯示按照本發(fā)明方法，對犬猴投予重組人IL-4和破傷風類毒素疫苗所達到的免疫反應的依時間次序的變化表。
圖2-5圖群顯示，按本發(fā)明方法對犬猴模型投予0.5mcg/kg和20mcg/kg的重組人IL-4和破傷風類毒素疫苗后，作為時間的函數(shù)出現(xiàn)抗破傷風類毒素疫苗的破傷風抗體的情況。
我們已令人驚異地發(fā)現(xiàn)，給犬猴使用重組人IL-4(下稱“rh IL-4”)同時合用破傷風類毒素疫苗，可提高猴的初級免疫反應。這一結果是特別令人驚異的，因為在給予重組乙型肝炎病毒疫苗(rHBVax)后約兩個月用rHBVax作加強接種期間對犬猴投予rhIL-4時，以及在使用Salk失活的脊髓灰白質類病毒疫苗后約一個月，用Salk失活的脊髓灰白質類病毒疫苗作加強接種期間對犬猴投予rh IL-4時，沒有抗體再生反應，即沒有觀察到次級或記憶反應。本發(fā)明提供的聯(lián)合給予IL-4和疫苗的方法具有下列優(yōu)點。因為在IL-4存在下，較少抗原即引發(fā)至少相當于單用疫苗即可達到的免疫學反應，故可減少上述待用疫苗的總抗原量。因為按照本發(fā)明給予IL-4時，每次疫苗接種只需要較少抗原，故可減產出現(xiàn)與目前使用的某些疫苗有關的不良付作用的可能性。再者，因為只須用較少免疫原即可達到有效的保護作用，故可降低用于每個病人之疫苗的總費用。對于某些對疫苗接種反應差的個體，可按照本發(fā)明給予IL-4以提高其免疫反應?？蓮谋景l(fā)明方法中得到好處者包括下列類型的個體(1)具有受損傷的免疫反應性的各類型個體，如有某些免疫缺陷的新生兒，(2)對某些疫苗無反應的假定為正常的個體，以及(3)經受免疫抑制治療如經受照射和皮質類固醇類治療的個體。
因此，我們已發(fā)現(xiàn)了(1)提高這些哺乳動物對疫苗中免疫原的有效初級免疫反應的方法;(2)提高接觸疫苗中免疫原之哺乳動物體內有效抗體水平的方法;以及(3)提高哺乳動物對存在于疫苗中的免疫原的初級免疫反應的方法，其中在沒有IL-4存在情況下，所說哺乳動物的免疫反應不能足夠強或快地防止疾病。在沒有IL-4存在時，所說哺乳動物的免疫反應可能不會足夠強或快地防止所說哺乳動物體內的疾病，但我們已發(fā)現(xiàn)了解決這一問題的方法，該方法包括給這樣的哺乳動物使用對各個目的來說為有效量的IL-4，更好是重組人IL-4。
按照本發(fā)明，可考慮使用的疫苗包括用于人體主動免疫的細菌疫苗、類毒素疫苗(滅活的毒素)及病毒疫苗或其混合物(“多抗原”)(如參見名為“Immunizing Agents”75章in Remington′s Pharmaceutical Sciences 14th Edition，1990 Mack Publishing Co.P 1426-1441)以及由FDA批準并列于Physician′s Desk Reference，44th Ed.1990的210頁(產品目錄索引)上的抗毒素、類毒素、疫苗和活疫苗。適用的疫苗包括抗下列疾病實體或疾病狀態(tài)的細菌疫苗霍亂、百日咳、鼠疫、傷寒、腦膜炎、肺炎球菌性肺炎、乙型溶血性流感病毒感染、麻風病、淋病、B組腦膜炎雙球菌、B組鏈球菌、革蘭氏陰性菌、大腸桿菌及銅綠色極毛桿菌感染。適用的類毒素包括白喉類毒素、肉毒桿菌類毒素及破傷風類毒素。適用的病毒疫苗包括抗下列疾病或疾病狀態(tài)的活的或失活的病毒疫苗脊髓灰質炎、麻疹、黃熱病、流行性腮腺炎及乙型肝炎。
適用的“多抗原”包括白喉和破傷風類毒素、三聯(lián)抗原-白喉、百日咳和破傷風類毒素，如得自connaught Laboratories，Inc.Swiftevater，PA 18370.的三聯(lián)抗原。在D.O.White & F.Fenner，Medical Virology，(1986)3rd Edition Academic Press Inc.Orlando，F(xiàn)la.一書中第10章(題目為“Immunization against viral diseases”)表10-6和10-7(分別在第4頁，第283-301頁27行)中公開了在不同國家和免疫程序中使用的多種病毒株及細胞基質。
術語“與……合用”是指在給予疫苗期間或給疫苗前差不多同時給予IL-4。例如可在給予適當疫苗前或后給予IL-4計10至14天。一般情況下應在使用適當疫苗之前給予IL-4達足夠時間，以便使哺乳動物淋巴組織中有穩(wěn)定的IL-4水平。可使用常規(guī)藥物動力學方法檢測這一水平。在使用疫苗后連續(xù)給予IL-4達一定時間，以使存在于疫苗中的免疫原受到該哺乳動物免疫系統(tǒng)加工，并保證IL-4能提供一個增強的初級免疫反應。可按照對每種疫苗的推薦的途徑和強度使用之。
任何適當?shù)腎L-4均可應用于本發(fā)明。IL-4的互補DNA(cDNA)目前已在許多實驗室被克隆并測定了序列，如參見Yokota等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1986)Vol 835894-5898(人)，Lee.等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1986)Vol.832061～2065(小鼠);Noma等人，Nature(1986)Vol.319640-646(小鼠);及Genzyme Corporation，Boston，Massachusetts(人和小鼠)，此外，也已從各種培養(yǎng)物上清液中純化了非重組的IL-4，如參見Sanderson等人，Proc.Natl.Acad，Sci.USA.(1986)Vol.83437-440(小鼠);Grabstein等人，J.Exp.Med.(1985)Vol.1631405-1413(小鼠);Ohara等人，J.Immunol.(1985)Vol.1352518-2523(小鼠BSF-1);Butler等人，J.Immunol.133(1984).Vol.251-255(人BCGF)，和Farrar等人，J.Immunol，(1983)Vol.1311838-1842(小鼠BCGF)。上述所有涉及DNA和氨基酸序列和得到適用于本發(fā)明的IL-4材料的方法的文章均列入本文參考文獻。
用于本發(fā)明的IL-4較好是人IL-4，更好是在大腸桿菌中表達并由其中分離的(美國專利申請079，666號，申請日1987年7月29日和194，799號，申請日1988年7月12日)，具有Yokoto等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)vOL.835894-5898和PCT專利申請87/02990號，1987年5月21日公開)所述序列的人變體。在共有美國專利申請SN386，937(1989年7月28日申請)中描述了從CHO細胞生產IL-4的方法。共有美國專利申請SN429，588(申請日1989年10月31日)中描述了從大腸桿菌產生IL-4的方法。上述文章，PCT申請和美國專利申請均列為本文參考文獻。
本文中所用的術語“有效量”即按照本發(fā)明給予有效量的IL-4，意思是指所給IL-4的量引起抗體水平提高，足以增加抗感染因子的保護作用?？贵w水平的精確增加可被看作是相當小的。所給予的IL-4的有效量一般較好是每天每公斤體重0.25至15微克，且較好是由大腸桿菌或CHO細胞重組產生的人IL-4。更好是哺乳動物每天每公斤體重使用0.25至5微克rhIL-4，且最好是每天每公斤體重0.25至1微克rhIL-4。
給藥量，頻率及期間可依據特定抗體的濃度水平、被誘導之抗體的類別、疫苗類型及病人年令、營養(yǎng)條件等因素而異。一般最初是每天給藥，并可在病人終生周期性連續(xù)使用。可在最初檢查特定抗體濃度期間確定給藥劑量和頻率，并在抗體濃度增加的基礎上放大IL-4的效應。
可選用靜脈內、鼻內、胃腸道外、口服、皮下、肌肉內、局部、透皮或任何其他可接受的方法給藥。IL-4可按任何數(shù)目的常規(guī)劑量形式給藥，胃腸道外給藥制劑包括無菌溶液劑或懸浮劑?？梢员莾然蚩趦葒婌F劑的形式進行吸入或吹入給藥、局部用藥的劑型包括乳劑、軟膏、洗劑、透皮植入劑(如帶常用儲藥池或基質貼片者)等。
可使用常規(guī)技術，用常規(guī)藥用賦形劑及添加劑制備包含于上述劑型中的藥物組合物。
目前，優(yōu)選通過靜脈內途徑使用IL-4?？蓪L-4的凍干粉末重新配成溶液劑并可另外含有防腐劑、緩沖劑、分散劑等。
可用10微摩爾有適當pH的檸檬酸緩沖劑和無防腐劑無菌水重新配制IL-4，使其最大濃度不超過每毫升100微克，并經連續(xù)靜脈內輸注或靜脈注射給藥。連續(xù)輸注時，可將每日劑量加到5ml生理鹽水中并借助蠕動泵或重力進行輸注。
材料和方法下述實驗中使用的人重組IL-4是由CHO產生的，有關其制備方法已在美國專利申請SN386，937(申請日1989年7月29日)中述及。
實驗設計猴由東南亞得到的成年雄性犬猴(Cynomolgus monkeys)購自商業(yè)來源，如Hazelton and Charles River Laboratories。使用前所有猴最少隔離90天。
破傷風類毒素和動物接種用于本實驗中的破傷風類毒素疫苗是注冊登記的得自Lederle Laboratories，Pearl River，NY 10965的破傷風類毒素流體tetanus toxoid purgonated
。
在開始進行該項研究之前，用靈長動物細胞巨大病毒(PCMV)感染15只成年雄性犬猴。此時，所有動物均表現(xiàn)有可檢測濃度的PCMV抗體。設置這一內部對照組的目的是試驗IL-4治療是否會非特異地影響抗體水平。因為沒有給予PCMV疫苗，所以我們期望IL-4不會引起抗PCMV抗體水平的提高。用于檢測抗體反應的標準方法是針對PCMV的放射免疫檢測法及針對rHBVax和Salk滅活之脊髓灰質炎病毒疫苗的固相放射免疫檢測法(參見Berzofasky，J.A.等人，“Antigen-Antibody Interactions and Monoclonal Antibodies”“In Fundamental Immunology”，(1989)2nd Edition(W.E.Paul ed.)的P315-356 Raven Press N.Y.，N.Y.)。
放血得到用于檢測PCMV和破傷風類毒素抗體的血液，在給予IL-4之前每周檢測1次共9周(圖1中的2-7)，且在本研究中每周檢測2次共22周(8至30)。靜脈注射給予rhIL-4給藥量為每天劑量水平的兩倍(5.0和20.0μg/Kg/天，B.I.D.)。在第8周中期和第12周中期開始給予安慰劑并共連續(xù)25天。在給予rhIL-4后的第11天，對15只猴各肌肉注射破傷風類毒素疫苗(0.5ml含有5Lf單位破傷風類毒素)。對三組所作破傷風類毒素抗體濃度檢測結果(組平均值)示于圖2和表1中。圖2圖群顯示，與對照組和20μg/Kg/天組相比，5μg/Kg/天組提高了抗體生成反應。5μg/Kg組的反應(示于圖2和4)實質上比圖2和3中所示的對照組的反應更顯著。
表1顯示(1)在破傷風類毒素疫苗接種后4-6周，接受5μg/Kg IL-4的實驗組比使用安慰劑的對照組有實質上更高的抗體濃度(2)在疫苗接種后7-9周，所有接受IL-4(5.0μg/Kg和20μg/Kg)的兩組比安慰劑對照組有更高的破傷風抗體濃度。
表1對初級破傷風疫苗的抗體反應IL-4的效應組 IL-4劑量水平(1)11周 12－13周 14－16周 17－19周Ⅰ 0 37±21(2)2127±606 2456±488 1223±139Ⅱ5 49±30 2178±529 5333±697 3973±631Ⅲ 20 46±20 1560±228 2355±152 1677±227(1)-μg/Kg動物體重(2)-數(shù)值代表不同時間后的平均抗體濃度;
N＝每組5只猴(±＝S.E.M.)綜觀上述實驗結果可期望IL-4，特別是rhIL-4能在哺乳動物初次接觸疫苗后，使該免疫反應不能足夠強或快地阻止疾病的哺乳動物提高免疫反應。
同時可望對于細菌和病毒疫苗及它們與類毒素的混合物也能獲得相似結果。
權利要求
1.IL-4在制造藥物上的應用，與疫苗一起給哺乳動物使用有效量的IL-4，用以提高所說的哺乳動物對存在于所說疫苗中的免疫原的初級免疫反應。
2.用于提高哺乳動物對存在于疫苗中免疫原的初級免疫反應的醫(yī)藥組合物，所說的組合物包含對于這種提高為有效量的IL-4及醫(yī)藥上可接受的載體。
3.提高哺乳動物對存在于疫苗中的免疫原的初級免疫反應的方法，其包括與所說的疫苗一起給所說的哺乳動物使用有效量的IL-4。
4.根據前述任一權利要求的醫(yī)藥組合物的應用或方法，其中是將IL-4與所說的疫苗同時給予所說的哺乳動物的。
5.根據前述任一權利要求的醫(yī)藥組合物的應用或方法，其中IL-4是經胃腸道外途徑給藥的。
6.根據前述任一權利要求的醫(yī)藥組合物的應用或方法，其中投予的是人IL-4，更好是大腸桿菌衍生的重組人IL-4。
7.根據前述任一權利要求的醫(yī)藥組合物的應用或方法，其中IL-4的給藥量范圍為每天每公斤體重0.25至15微克。
8.根據前述任一權利要求的醫(yī)藥組合物的應用或方法，其中疫苗是病毒疫苗或細菌疫苗或類毒素疫苗。
9.根據前述任一權利要求的醫(yī)藥組合物的應用或方法，其中類毒素疫苗是破傷風類毒素疫苗。
10.用于提高哺乳動物對疫苗中免疫原之初級免疫反應的藥盒，其包含(1)IL-4和其醫(yī)藥上可接受的載體的醫(yī)藥組合物的容器及(2)疫苗和其醫(yī)藥上可接受的載體的醫(yī)藥組合物的容器。
全文摘要
公開了IL-4制造藥物的應用，含有IL-4和其適于藥用載體的醫(yī)藥組合物，以及與疫苗一起給哺乳動物使用有效量的IL-4，更好是重組人或大腸桿菌衍生的IL-4，以提高所說的哺乳動物對存在于所說疫苗如破傷風類毒素疫苗中的免疫原的初級免疫反應的方法。
文檔編號A61K38/00GK1063227SQ91112738
公開日1992年8月5日 申請日期1991年12月18日 優(yōu)先權日1990年12月19日
發(fā)明者E·J·羅茲洪, J·F·奧康內爾, S·A·考克斯, M·D·海勒, J·施瓦茨 申請人:先靈公司