專(zhuān)利名稱(chēng)：無(wú)細(xì)胞馬立克氏病病毒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗家禽馬立克氏病的疫苗及制備這種疫苗的方法。
馬立克氏病(Marek′s Disease，MD)是由一種皰疹病毒-馬立克氏病病毒(Marek′s Disease virus，MDV)引起的家禽的惡性淋巴增殖性疾病。MD是一種普通發(fā)生于全世界家禽生產(chǎn)國(guó)家的家禽疾病。于集約化生產(chǎn)體系下飼養(yǎng)的雞將不可避免地遭受MD帶來(lái)的損失。MD影響大約6周令的雞，12-24周令最易感染。
臨床上已識(shí)別了三種形式的MD典型MD、急性型MD和短暫麻痹型MD。
典型MD的特征是由淋巴樣浸潤(rùn)和脫髓鞘引起末梢神經(jīng)腫大，且以麻痹為主要臨床癥狀。死亡率可有所不同，但一般為10-15%。
對(duì)于急性型MD，家禽內(nèi)臟器官可見(jiàn)有多發(fā)和散在的淋巴瘤，這種類(lèi)型MD的死亡率一般比典型MD高。在未免疫的群體中，普遍發(fā)病率為10-30%，但也可見(jiàn)有高達(dá)70%者。典型和急性MD的病理學(xué)改變基本上是相似的，包括惡性轉(zhuǎn)化之T淋巴細(xì)胞增殖并浸潤(rùn)到正常組織內(nèi)，其中典型MD侵害末梢神經(jīng)，而急性MD則侵害內(nèi)臟器官。
另外，已表明MDV是小雞腦炎的致病因子，其臨床表現(xiàn)是小雞突發(fā)麻痹。
MD相關(guān)病毒的血清學(xué)分類(lèi)可分成三種血清型Ⅰ型對(duì)雞有致病性和致瘤性的馬立克氏病病毒的強(qiáng)毒性病毒株，以及由之衍生的減毒非致病病毒株，
Ⅱ型天然出現(xiàn)的馬立克氏病病毒的非致病病毒株。
Ⅲ型對(duì)雞無(wú)致病性的火雞皰疹病毒(“HVT”)。
目前使用的有幾種類(lèi)型的馬立克氏病疫苗，包括從MD病毒的致病性血清型Ⅰ病毒株衍生的疫苗。這些病毒株經(jīng)過(guò)系列傳代后，發(fā)現(xiàn)失去了致病性和致癌性，但仍保留其免疫原性。從病毒株HPRS-16衍生的減毒病毒，即原生型MD疫苗(Churchill，A.E.et al.，J.Gen.Virol.4，557，1969)和CVI-988毒株已被獲準(zhǔn)作為活血清型Ⅰ MD疫苗在商業(yè)上使用。
血清型2MD病毒是天然非致癌的，因此在接種后的雞體內(nèi)不致于引起腫瘤。為此，這些病毒不需要通過(guò)系列傳代來(lái)人工減毒，而且因?yàn)樗鼈兲幱谄涮烊粻顟B(tài)，故也不可能回復(fù)為其毒性形式。除了從1983年就已在美國(guó)獲取許可的SB-1病毒株(美國(guó)專(zhuān)利No.4，160，024)外，已證明HN-1也可成功地用于疫苗接種。迄今為止，血清型1和2疫苗必須作為與細(xì)胞結(jié)合的制品來(lái)使用(Powell，P.C.，World′s Poultry Science Journal 42，205，1986;Witter，R.L.et al.，Avian Diseases 31，829，1987;Schat，K.A.，Internews 3，13，1989)。在實(shí)際使用時(shí)，意味著該疫苗不得不在液氮中大約-196℃條件下貯存和運(yùn)輸。
因貯存和處理疫苗過(guò)程中的差錯(cuò)，會(huì)引起MD病毒的存活性降低并導(dǎo)致接種失敗。特別是在不可能以液氮貯存的鄉(xiāng)村，細(xì)胞結(jié)合形式的MD疫苗便不能使用。而且，MDV懸浮于細(xì)胞結(jié)合疫苗沉淀物中，在給藥前須將懸浮液混合均勻。如果混合不夠均勻，則可造成疫苗劑量不準(zhǔn)，而導(dǎo)致接種失敗。另外，所說(shuō)疫苗的嚴(yán)格細(xì)胞結(jié)合性質(zhì)致使疫苗易于引起身體對(duì)濫用疫苗的敏感性。由于在次最佳條件下收獲及冷凍過(guò)程對(duì)被感染細(xì)胞的損傷，以及因不正確的安瓶解凍及在孵化器中對(duì)疫苗進(jìn)行處理而引起細(xì)胞損傷和死亡，結(jié)果致使疫苗丟失滴定。
目前，通常使用從HVT衍生的MD疫苗。HVT最初是從火雞中分離出來(lái)的，其對(duì)火雞和雞鴨無(wú)致病性，而且在免疫原性上與血清型1和2MD病毒是相關(guān)的。HVT被廣泛用作抗MD的疫苗，且其中使用最多的是FC126病毒株。HVT一般均作為細(xì)胞結(jié)合制劑使用，但因?yàn)閷?shí)質(zhì)上幾乎所有游離于細(xì)胞的病毒都可從被感染之細(xì)胞中提取出來(lái)，所以也可作為凍干的無(wú)細(xì)胞疫苗使用。
因?yàn)椴粩嗥惹幸髮D的經(jīng)濟(jì)損失降到最低限度，故要求不斷改善MD疫苗的效力。特別是在美國(guó)和歐洲已有有關(guān)由于出現(xiàn)強(qiáng)毒力MD病毒株，而使得家禽飼養(yǎng)業(yè)蒙受過(guò)多損失的報(bào)導(dǎo)。迄今為止，HVT疫苗接種并未能產(chǎn)生對(duì)抗這些分離物的足夠保護(hù)作用，即使提高劑量或延長(zhǎng)接種與攻擊之間的間隔期仍不能收到明顯效果。由于單獨(dú)以HVT疫苗接種的相對(duì)無(wú)效，將有利于這些很強(qiáng)毒力之MD病毒野生株的傳播。
目前一種控制由很強(qiáng)毒力MD病毒感染所引起之疾病的有用方法是使用含有屬于不同MD病毒族之不同血清型疫苗病毒混合物的二價(jià)和多價(jià)疫苗。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，使用二價(jià)疫苗可比單獨(dú)使用任何一種組份獲得更好的保護(hù)效果。這種現(xiàn)象稱(chēng)為“保護(hù)性協(xié)同作用”，其機(jī)理是，由一種MD疫苗病毒產(chǎn)生的保護(hù)作用幅度可因加入第二種疫苗病毒而得以增強(qiáng)(Witter，R.L.，Avian Pathology 11，49，1982;Witter，R.L.and Lee，L.F.，Avian Pathology 13，75，1984;，Witter，R.L.，Avian Pathology 13，75，1984;Witter R.L.，Avian Diseases 31，752，1987;Schat，K.A.et al.，Avian Pathology 11，593，1982)。不利的是，為了有利于這種協(xié)同作用，不得不將這種二價(jià)疫苗制成細(xì)胞結(jié)合型制劑，迄今還得不到無(wú)細(xì)胞血清型2MD病毒疫苗。
由于種禽天然暴露于MD病毒和/或由于種禽接種血清型1、2、和3病毒，所以在商品雞體內(nèi)普遍存在抗所有MD病毒血清型的MDA(母體衍生的抗體)。同源MDA對(duì)免疫接種的不利影響是眾所周知的。MDV抗體僅在低水平上干擾(無(wú)細(xì)胞)HVT疫苗。因此，為使其后代更好地得到HVT賦予的保護(hù)，如能用無(wú)HVT的MD病毒疫苗接種種禽群體將是很有利的。這種所謂的世代交替接種法有其潛在的優(yōu)點(diǎn)，即使是它們的后代用含有HVT的二價(jià)或多價(jià)疫苗接種也是如此。然而，應(yīng)用這種接種策略時(shí)要求能獲得滿(mǎn)意的無(wú)HVT疫苗(Witter，R.L.and Lee，L.F.，Avian Pathology 13，75，1984)。如能得到含無(wú)細(xì)胞血清型2MD病毒(例如SB-1)的疫苗，在這種世代交替中將是極為有利的。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種對(duì)抗MD以保護(hù)家禽的疫苗，其特征在于這種疫苗含有無(wú)細(xì)胞MD血清型2病毒以及藥物學(xué)上可接受的載體。
有關(guān)血清型1和2MD病毒的早期工作證明，無(wú)細(xì)胞病毒的量(以初級(jí)空斑形成單位pfu表示)不足以具有免疫接種所需的滴度(美國(guó)專(zhuān)利4，895，718;Witter，R.L.et al.，Avian Diseases 31，829，1987;Powell，P.C.，World′s Poultry Science Journal 42，205，1986;Schat，K.A.，Internews 3，13，1989)。具體地說(shuō)，其中已證明SB-1病毒不能產(chǎn)生相當(dāng)大量的無(wú)細(xì)胞病毒。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，經(jīng)進(jìn)一步將血清型MD病毒傳代，可使游離于細(xì)胞的病毒量大大增加，并且如此得到的無(wú)細(xì)胞病毒仍保留其保護(hù)性特性。
因?yàn)閃itter(Avian Diseases 31，752，1987)已清楚地證明，系列傳代將對(duì)與細(xì)胞結(jié)合的血清型2MD病毒之保護(hù)效力有不利影響，故上述發(fā)現(xiàn)便尤為令人驚異。
另外，Witter(文獻(xiàn)同上，1987)曾證明，當(dāng)傳代數(shù)增加時(shí)協(xié)同作用將相應(yīng)降低，與低傳代數(shù)之細(xì)胞結(jié)合形式血清型2MD病毒相比，進(jìn)一步傳代的細(xì)胞結(jié)合形式血清型2MD病毒不會(huì)增加HVT病毒株FC126的保護(hù)效力。
令人驚異的是，已發(fā)現(xiàn)由無(wú)細(xì)胞HVT賦予的保護(hù)作用程度，將會(huì)因無(wú)細(xì)胞血清型2MD病毒的加入而提高。
可按下述步驟制得本發(fā)明的疫苗首先，對(duì)低傳代數(shù)的血清型2MD病毒，即在適當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)后可用作疫苗，但不能產(chǎn)生足夠量游離于細(xì)胞之病毒的血清型2MD病毒進(jìn)行系列傳代，然后培養(yǎng)如此得到的病毒，最后加工可從該培養(yǎng)物獲得的無(wú)細(xì)胞病毒，以得到有免疫特性的制劑。
可從任何血清型2MD病毒株衍生出本發(fā)明的無(wú)細(xì)胞疫苗，例如可衍生于HPRS-B-21病毒株、SB-1病毒株(見(jiàn)Schat et al.，美國(guó)專(zhuān)利4，160，024;可從Intervet公司購(gòu)得)、NH-1病毒株(Cho，B.R.and Kenzy，S.G.，Appl，Microbiol.24，299，1972)或者由Witter介紹的分離物，如31/B/1病毒株(美國(guó)專(zhuān)利4，895，718;Avian Diseases 31，752，1987)，其中最優(yōu)選的是SB-1病毒株。
可使用本領(lǐng)域已知的方法對(duì)血清型2MD病毒進(jìn)行連續(xù)傳代。簡(jiǎn)單地說(shuō)，使病毒生長(zhǎng)在適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)物中，將由此收獲的病毒接種到含新鮮細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基上。使血清型2MD病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物中經(jīng)過(guò)幾次連續(xù)傳代，直到由此收獲到適用量的無(wú)細(xì)胞病毒，然后將其加工成疫苗。
特別適宜的連續(xù)傳代細(xì)胞培養(yǎng)物是雞腎細(xì)胞(CK)、雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)及鴨胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物(DEF)。
更具體地說(shuō)，可將血清型2MD病毒接種到CK、CEF或DEF培養(yǎng)物24-48小時(shí)細(xì)胞單層中，然后于37℃保溫幾天，并定期更換生長(zhǎng)培養(yǎng)基。適宜的生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以是Eagles基本培養(yǎng)基(BME)、Tryptose磷酸鹽培養(yǎng)液、碳酸氫鈉、胎牛血清及抗生素。當(dāng)有75%或更多的細(xì)胞單層遭受細(xì)胞病理影響時(shí)即進(jìn)行細(xì)胞傳代。保溫期結(jié)束時(shí)，用磷酸鹽緩沖鹽水洗整體細(xì)胞團(tuán)，用胰蛋白酶分散之并重新懸浮于少許培養(yǎng)基中。再次鋪敷并使之在上述新鮮單層細(xì)胞培養(yǎng)物上生長(zhǎng)。連續(xù)傳代次數(shù)取決于可從培養(yǎng)物中獲得的無(wú)細(xì)胞病毒量，以及傳代病毒之免疫原性和感染特性保留情況。洗滌最后一代細(xì)胞、用胰蛋白酶處理、離心并分散到含二甲基亞砜(DMSO)的少量培養(yǎng)基中?？蓪⒋酥苽湮锫鋬鲋烈旱獪囟?-70℃)，以備作為種子病毒培養(yǎng)物使用。
一般說(shuō)來(lái)，按上述方法制得的本發(fā)明之無(wú)細(xì)胞制品的滴度范圍為104-107pfu/ml。
為獲得可產(chǎn)生足夠量無(wú)細(xì)胞病毒的血清型2MD病毒所必須的傳代數(shù)，特別取決于特定的血清型2MD病毒株及無(wú)細(xì)胞病毒的所需量或滴度。
根據(jù)本發(fā)明，為制備疫苗所需的血清型2MD病毒的總傳代數(shù)一般在25-40次之間，更好是28-35次。
為繁殖用CEF細(xì)胞接種的血清型2MD病毒之旋皿培養(yǎng)物，可在保溫24小時(shí)后接種按上述方法獲得的與細(xì)胞結(jié)合的或游離于細(xì)胞的病毒。繼續(xù)保溫幾天后，棄去培養(yǎng)基上清，用胰蛋白酶依地烯(versene)混合物除去細(xì)胞，然后將細(xì)胞離心沉淀出來(lái)并傾去上清液。
為了配制無(wú)細(xì)胞制品，可將沉淀的細(xì)胞懸浮在緩沖液例如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中或優(yōu)選含穩(wěn)定劑的培養(yǎng)基中，SPGA(Bovarnik et al.，J.Bacteriology 59，509，1950)是最優(yōu)選的穩(wěn)定劑。
可用幾種方法破碎細(xì)胞，例如利用超聲或凍融方法。在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中檢查以確定是否存在未破碎的細(xì)胞?？蓪⒔?jīng)過(guò)超聲處理或快速冷凍的制品分裝到小瓶?jī)?nèi)，并根據(jù)需要在EDTA存在下凍干之?？扇我獾赜趦龈芍敖?jīng)過(guò)濾或離心除去細(xì)胞碎片。
按上述方法得到的無(wú)細(xì)胞血清型2MD病毒可作為活病毒或滅活病毒摻入疫苗中。
含活病毒的疫苗可以以懸浮液或凍干品形式制成并投放市場(chǎng)。
凍干疫苗最好含有一種或多種穩(wěn)定劑。適用的穩(wěn)定劑可以是SPGA(Bovarnik et al.，J.Bacteriology 59，509，1950)，碳水化合物(如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、右旋糖酐或葡萄糖)、蛋白質(zhì)(如白蛋白或酪蛋白)或者它們的降解產(chǎn)物，含蛋白質(zhì)物質(zhì)及緩沖劑(如堿金屬磷酸鹽)。必要時(shí)還可加入一種或多種具有佐劑活性的化合物。用于這一目的的適當(dāng)化合物可以是維生素E醋酸酯(O/W乳劑)、氫氧化鋁、磷酸鹽或氧化物、礦物油(如Bayol F(R)、Marcol 52(R))及皂甙。
滅活MD病毒的目的是消除病毒的增殖能力。一般說(shuō)來(lái)，可用化學(xué)和物理學(xué)手段來(lái)完成?；瘜W(xué)滅活例如可以用酶、甲醛、β內(nèi)丙酯、亞乙基-亞胺或其衍生物、有機(jī)溶劑(如鹵代烴)和/或去污劑(如Tween(R)、Triton X(R)、去氧膽酸鈉、磺甜菜堿或十六烷基三甲基銨鹽)處理來(lái)達(dá)到。必要時(shí)，其后可用其他化合物中和滅活物質(zhì);例如用甲醛滅活的材料可以用硫代硫酸鹽來(lái)中和。對(duì)病毒的物理滅活優(yōu)選用高能射線(xiàn)照射來(lái)進(jìn)行;例如可用紫外光、X射線(xiàn)或γ射線(xiàn)。必要時(shí)可在處理后將PH值調(diào)回7左右。
通常也可將一種佐劑(如上所述)，或必要時(shí)將一種或多種乳化劑如Tween(R)和Span(R)加入到滅活的病毒材料中。
疫苗應(yīng)以病毒制劑的有效劑量使用，即所用免疫原性無(wú)細(xì)胞病毒材料的量應(yīng)足以使被免疫雞產(chǎn)生對(duì)抗毒性MD病毒之攻擊的免疫力。免疫力定義為與未接種疫苗組相比，接種后可在雞群體中誘導(dǎo)產(chǎn)生明顯較高水平的保護(hù)作用。
對(duì)活疫苗來(lái)說(shuō)，每只雞的劑量可在1-6logspfu之間。
一般來(lái)說(shuō)，根據(jù)本發(fā)明之活疫苗的給藥劑量為至少2.2logspfu無(wú)細(xì)胞病毒，其中優(yōu)選劑量為至少2.7logs pfu，更好是至少3.2logs pfu。
在經(jīng)自然途經(jīng)給藥的情況下(噴霧、滴眼和滴鼻)、劑量可以為每只雞106-107pfu。
滅活之疫苗可含有相當(dāng)于每只雞3-7logs pfu，更好是4-6logs pfu的抗原量。
根據(jù)本發(fā)明的疫苗，可以以高滴度噴霧、滴眼、滴鼻、口服(如飲水)或通過(guò)肌肉注射、皮下注射途徑給藥，或在雞獲得免疫感受性后的任何日令進(jìn)行OVO注射。正常情況下是在小雞孵出后24-48小時(shí)施用疫苗。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是將無(wú)細(xì)胞MD血清型2病毒與無(wú)細(xì)胞HVT結(jié)合成二價(jià)疫苗。已令人驚異地發(fā)現(xiàn)，盡管增加了傳代次數(shù)，但無(wú)細(xì)胞MD血清型2病毒仍能提高HVT的效力。
具體地說(shuō)，將SB-1毒株的無(wú)細(xì)胞血清型2MD病毒與無(wú)細(xì)胞HVT結(jié)合使用。根據(jù)本發(fā)明，欲摻入到本發(fā)明疫苗中的HVT病毒可以是任何可購(gòu)得的病毒株，如FC126或THVPB1(可從Intervet Inc.購(gòu)得)。HVT病毒還可包含編碼家禽病原體抗原的外來(lái)基因，后者可插入其病毒基因組內(nèi)形成多價(jià)疫苗。
除無(wú)細(xì)胞血清型2MD病毒材料外，本發(fā)明還包括從感染家禽的其他病原體衍生之疫苗的聯(lián)合疫苗。無(wú)細(xì)胞血清型2MD病毒可以同選自下面的一組疫苗病毒者聯(lián)合使用雞瘟病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)及傳染性腔上囊病病毒(IBDV)。
實(shí)施例1A.血清型2MD病毒SB-1和B-24的傳代將與細(xì)胞結(jié)合的SB-1和B-24病毒接種于在6cm直徑Falcon平皿上生長(zhǎng)24小時(shí)的SPF衍生之雞胚細(xì)胞培養(yǎng)物(1.5×106CEF/皿)上，并將至少含100pfu的0.1ml接種物接種到平皿上的5ml組織培養(yǎng)基中，再將與細(xì)胞結(jié)合的病毒加于細(xì)胞單層上以感染之。于38.5℃，在含5%CO2的大氣環(huán)境中保溫5天后，按下述方法從平皿內(nèi)除去細(xì)胞1.傾去培養(yǎng)基;
2.加入胰蛋白酶依地烯PBS溶液，以松解細(xì)胞在平皿上的附著力;
3.在細(xì)胞從平皿中剝落前棄去胰蛋白酶/依地烯PBS混合物。
4.用生長(zhǎng)培養(yǎng)基洗去平皿內(nèi)的細(xì)胞。
將從步驟4獲得的細(xì)胞結(jié)合之病毒的懸浮液作為下一次在CEF細(xì)胞上傳代的接種物。接受以后，按上述方法將病毒傳代五次。從第6次傳代(加上初始傳代)開(kāi)始，使保溫時(shí)間馴化為4天。
結(jié)果SB-1從康奈爾大學(xué)得到的SB-1病毒，已在接受體細(xì)胞內(nèi)傳代10次(在CEF和CK細(xì)胞中7次組織培養(yǎng)物傳代，接著在SPF雞中傳代2次，再在CEF細(xì)胞上傳代一次)。
對(duì)得自平皿中的嚴(yán)重感染之細(xì)胞(傳代10次)進(jìn)行處理以期得到無(wú)細(xì)胞病毒，并將其懸浮于5mlSPGA中，經(jīng)檢測(cè)，在10-2稀釋度時(shí)未檢出游離于活細(xì)胞的病毒。
如將SB-1病毒株傳代達(dá)總共21次(得自康奈爾大學(xué))，以相似方法處理，則測(cè)得游離于活細(xì)胞之病毒的滴度為104.9pfu/ml。
SB-1病毒傳代達(dá)21次時(shí)，得到滴度為106.0pfu/ml的無(wú)細(xì)胞病毒。
這些游離于細(xì)胞的病毒對(duì)雞仍然是有感染性的，可誘發(fā)病毒血癥，傳播給接觸的家禽，并且能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)。
B-24按上述方法處理用經(jīng)過(guò)第9次傳代之B-24嚴(yán)重感染的細(xì)胞，得到無(wú)細(xì)胞病毒，測(cè)知其滴度小于102pfu/ml。
當(dāng)檢驗(yàn)第35次傳代病毒嚴(yán)重感染的細(xì)胞時(shí)，所得無(wú)細(xì)胞病毒滴度為104.7pfu/ml。
B.制備SB-1無(wú)細(xì)胞血清型2MD疫苗將用200×106個(gè)CEF細(xì)胞接種的兩份旋皿培養(yǎng)物(1750cm2)接種于含1ml按上述方法得到的細(xì)胞結(jié)合之SB-1種子病毒的培養(yǎng)基中，保溫24小時(shí)后測(cè)得滴度為105pfu/ml。
繼續(xù)保溫5天后，棄去上清液并用胰蛋白酶依地烯混合物除去細(xì)胞。離心沉淀細(xì)胞，棄去上清液并在細(xì)胞中混入20mlSPGA穩(wěn)定劑，然后用超聲裝置處理2秒鐘。
將經(jīng)過(guò)超聲處理的制劑按1ml等份分裝入小瓶?jī)?nèi)并凍干。
凍干前滴度 104.8pfu/ml凍干后滴度 105pfu/ml實(shí)施例2無(wú)細(xì)胞血清型2MD疫苗的效力給3組(每組10只)有抗血清型1、2和3之MDA的1日令小雞肌肉注射不同劑量的無(wú)細(xì)胞SB-1。各組所用劑量分別為每只小雞176pfu、460pfu和1520pfu。
經(jīng)檢驗(yàn)是否發(fā)生病毒血癥來(lái)確定疫苗的效力。因?yàn)樵缙趯?shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)，如果未接種疫苗的雞與接種SB-1(高傳代數(shù))的雞接觸，接種(200pfu的細(xì)胞結(jié)合病毒)后2周時(shí)有三分之二接觸的雞受到感染，故決定不檢驗(yàn)2周后有無(wú)病毒血癥。于疫苗接種后1和2周取血沉棕黃層，并用標(biāo)準(zhǔn)方法在CEF細(xì)胞上檢查SB-1病毒的存在。將培養(yǎng)物保溫1周后進(jìn)行定量檢測(cè)。下列表1中記錄的結(jié)果表明，每只雞接受176pfu者病毒血癥發(fā)生率為56%，而每只雞接受460pfu和1520pfu的兩組中所有雞均出現(xiàn)病毒血癥。
表1
疫苗劑量陽(yáng)性雞數(shù)／試驗(yàn)數(shù) (接種后14天)176pfu5/9460pfu 10/101520pfu 7/7
實(shí)施例3對(duì)HVT無(wú)細(xì)胞疫苗和HVT/SB-1疫苗在MDA陽(yáng)性雞中誘導(dǎo)之免疫力的比較病毒使用的病毒株是HVT-其為Intervet PB1 THV病毒株SB-1-此病毒株經(jīng)進(jìn)一步傳代直到病毒變得生長(zhǎng)迅速并釋放了無(wú)細(xì)胞病毒。無(wú)細(xì)胞病毒制劑是在SPGA穩(wěn)定劑中超聲處理被感染的CEF細(xì)胞而制得的。
將帶有母體衍生的抗血清型1、2和3MD病毒之抗體的2-3天令小雞分成3組。
A組37只雞 未接種疫苗B組 42只雞
每只雞接種1000pfu HVT疫苗。
C組 42只雞 每只雞接種1000pfu HVT疫苗和250pfu SB-1病毒。
9天令時(shí)用毒性RBIB病毒攻擊所有各組雞;
在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，須不定時(shí)地殺死一些雞，以免隔離間內(nèi)過(guò)分擁擠。
對(duì)所有死亡或殺死的雞進(jìn)行大體和顯微鏡檢查，以發(fā)現(xiàn)有無(wú)馬立克氏病造成的損傷。
接種疫苗的各組雞中，攻擊后(PC)4天有1只死亡，未接受疫苗組在攻擊后5至9天有5只死亡，組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)淋巴樣組織，特別是腔上囊和胸腺萎縮。這些觀察結(jié)果連同定時(shí)死亡情況提示雞遭受到了MD的溶細(xì)胞性病理改變。


圖1的矩形圖顯示，在攻擊后每次偶然殺死之雞的數(shù)目，以及在死后或組織學(xué)檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)患有馬立克氏病之雞的數(shù)目。
圖2的矩形圖顯示接種和未接種疫苗的雞在攻擊后MD的發(fā)病率。
在未進(jìn)行疫苗接種組觀察到有高M(jìn)D發(fā)病率(圖1和2)。攻擊后11天時(shí)殺死的7只雞中有3只見(jiàn)有MD腫瘤。因MD造成的死亡在攻擊后11天時(shí)開(kāi)始。攻擊后第28天時(shí)有8只患病雞被殺死，在攻擊后第32天時(shí)其余8只雞被殺死，其中2只看起來(lái)病性嚴(yán)重。所有16只雞均在肝臟、腎和其他器官見(jiàn)有腫瘤。總共37只雞中，5只似乎死于“溶細(xì)胞性MD”，27只有MD腫瘤或死于MD。在攻擊后第11天殺死4只沒(méi)有MD損傷的雞，故得以發(fā)生MD的時(shí)間很短(1只雞死于非特定原因)。
接受HVT疫苗的實(shí)驗(yàn)組中，在第21天時(shí)10只被殺死的雞中的2只，以及在此時(shí)間死亡的2只均首先見(jiàn)有MD腫瘤。在32和42天時(shí)，死后檢查5只病死的雞，發(fā)現(xiàn)它們均有MD腫瘤。實(shí)驗(yàn)期間共有7只雞死于MD。攻擊后53天殺死的其余8只雞沒(méi)有MD征象。被殺死或死于MD的共42只雞中，16只有MD腫瘤。在攻擊后11天殺死的10只雞，攻擊后21天殺死的8只雞和攻擊后53天殺死的8只雞均未見(jiàn)有MD損傷。
在雙疫苗接種組中MD的發(fā)病率很低，攻擊后53天被殺死時(shí)，只有1只雞肝臟中有MD腫瘤。總共42只雞中，4只死于非特定病因，其中1只可能死于“溶細(xì)胞性MD”。攻擊后第11天殺死的10只雞、攻擊后第21天殺死的11只雞、攻擊后第42天殺死的3只雞以及攻擊后第53天殺死的14只雞中的13只均未發(fā)現(xiàn)有MD損傷。
結(jié)果證明，在帶有抗血清型2和3病毒MDA的小雞中，無(wú)細(xì)胞雙價(jià)疫苗SB-1/HVT提供了很高水平對(duì)抗RBIB嚴(yán)重攻擊的保護(hù)作用。
雖然HVT疫苗能提供對(duì)抗這種嚴(yán)重攻擊的顯著保護(hù)作用，但仍有大約37%的雞顯示有某些MD癥狀。
應(yīng)說(shuō)明的是，因?yàn)榇蠹s在攻擊后4周時(shí)，大多數(shù)存活的未接種雞顯示有明顯的MD臨床征象，所以都在攻擊后32天時(shí)被殺死了。
在攻擊后53天完成實(shí)驗(yàn)時(shí)，觀察到接受雙價(jià)疫苗的雞要比單獨(dú)接種HVT的雞體重較重。這一現(xiàn)象是令人驚異的，因?yàn)楫?dāng)殺死時(shí)，8只接種HVT的雞都沒(méi)有明顯的MD損傷。
實(shí)施例4對(duì)無(wú)細(xì)胞SB-1病毒和HVT/SB-1疫苗在無(wú)MDA雞中誘導(dǎo)之免疫力的比較用在SPGA中配制的200pfu凍干之無(wú)細(xì)胞SB-1病毒皮下接種20天令的SPF雞(每只雞0.1ml)。第二組雞接受200pfu SB-1疫苗和1000pfu HVT疫苗病毒。
1周后，經(jīng)肌肉注射用毒性RBIB病毒株攻擊這些雞連同20只同樣來(lái)源和日令之未經(jīng)疫苗接種的雞。記錄6周后每組死于馬立克氏病之雞的數(shù)目。
表2
疫苗死亡的雞數(shù)／檢驗(yàn)數(shù)對(duì)照組 20／20SB-16/20HVT/SB-10/20
權(quán)利要求
1.一種保護(hù)家禽對(duì)抗馬立克氏病的疫苗，特征在于它含有無(wú)細(xì)胞馬立克氏病血清型2病毒及藥理上可接受的載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗，特征在于它含有無(wú)細(xì)胞SB-1病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗，特征在于它含有無(wú)細(xì)胞B-24病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗，特征在于無(wú)細(xì)胞馬立克氏病血清型2病毒的劑量至少為每只雞2.2pfu。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的疫苗，特征在于所說(shuō)的劑量為至少每只雞2.7pfu。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的疫苗，特征在于所說(shuō)的劑量為至少每只雞3.2pfu。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6的疫苗，特征在于它還含有無(wú)細(xì)胞HVT。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7的疫苗，特征在于它是被凍干的。
9.制備一種保護(hù)家禽對(duì)抗馬立克氏病之疫苗的方法，其包括a).在細(xì)胞培養(yǎng)物中繁殖血清型2馬立克氏病病毒，以從中得到制備有效免疫劑量所必需的足夠量無(wú)細(xì)胞病毒，b).破碎細(xì)胞，c).然后收集無(wú)細(xì)胞病毒，以及d).使步驟c得到的材料至少經(jīng)受下列的一種處理ⅰ).經(jīng)離心和/或過(guò)濾澄清之;ⅱ).加入緩沖液;ⅲ).加入穩(wěn)定劑;ⅳ).將該材料裝入小瓶?jī)?nèi);ⅴ).冷凍干燥。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，特征在于經(jīng)步驟b后無(wú)細(xì)胞病毒的滴度至少為104pfu/ml。
11.控制家禽馬立克氏病的方法，其包括給家禽接種根據(jù)權(quán)利要求1-7的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及保護(hù)家禽以對(duì)抗馬立克氏病的疫苗。本發(fā)明的無(wú)細(xì)胞疫苗便于處理并可減少濫用疫苗的機(jī)會(huì)。本發(fā)明還涉及另外包含有其他馬立克氏病病毒即HVT的二價(jià)或多價(jià)疫苗。
文檔編號(hào)A61P31/22GK1064409SQ91112829
公開(kāi)日1992年9月16日 申請(qǐng)日期1991年12月23日 優(yōu)先權(quán)日1990年12月24日
發(fā)明者W·巴克斯恩達(dá)萊 申請(qǐng)人:阿克佐公司