專利名稱：肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗的制作方法
根據(jù)細(xì)菌的莢膜多糖(Pn-Ps，作為病原菌的肺炎鏈球菌(Streptoc-occus pneumoniae)(pneumococci，Pn)已經(jīng)分為84種抗原血清型。由這些病原菌引起的疾病包括肺炎、腦膜炎、中耳炎、菌血癥和慢性支氣管炎的急性轉(zhuǎn)劇、竇炎、關(guān)節(jié)炎和結(jié)膜炎。但是這些疾病的優(yōu)勢(shì)卻由84種已知分離物中有限的幾種菌引起的。因此，含有由非常流行的這些病原菌分離物得到的Pn-Ps的多價(jià)疫苗，能夠?qū)@類報(bào)導(dǎo)很多的比例很高的病原體提供保護(hù)。
已經(jīng)生產(chǎn)的多價(jià)疫苗對(duì)成年人中的肺炎球菌能夠有效地產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。例如“PNEUMOVAX 23”(多價(jià)肺炎球菌疫菌MSD;參閱PDR，1990年版第1431頁)是含有23種不同的未結(jié)合的肺炎球菌多糖(每種含量50μg/ml)的液體組合物，這些菌種全部保藏在ATCC，并且為本發(fā)明的原料提供一條可能得到的途徑?！癙NEUMOVAX 23”含有下述各種游離的未結(jié)合的多糖1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19F，19A，20，22F，23F和33F，含量約為90%肺炎球菌血液分離物。但是這些疫苗在很大程度上對(duì)肺炎球菌感染療效很差，仍冒著危險(xiǎn)性，例如B細(xì)胞免疫協(xié)調(diào)的個(gè)體，依賴于T細(xì)胞免疫保護(hù)應(yīng)答的中年以上的人和2歲以下的嬰兒。由于未結(jié)合的多糖是T細(xì)胞免疫應(yīng)答的極差誘導(dǎo)物，所以將Pn-Ps轉(zhuǎn)化為能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的免疫原，在這項(xiàng)任務(wù)中產(chǎn)生充分保護(hù)作用的關(guān)鍵。但是，使用并不限于這類對(duì)象。例如將含有一種或多種新結(jié)合物的疫苗在導(dǎo)致母體中產(chǎn)生抗體的受孕前或懷孕期間施用于雌性哺乳動(dòng)物，從而能被動(dòng)保護(hù)發(fā)育中的胎兒和喂奶期的嬰兒，致使疫苗不直接施用于胎兒或嬰兒。這種結(jié)合物還證明可用于誘導(dǎo)產(chǎn)生最大限度地被動(dòng)保護(hù)受威脅群體(例如受感染的新生嬰兒或同胞)的抗體。
現(xiàn)已證明，本身免疫性很差的多糖一旦與免疫蛋白(PRO)相結(jié)合，就能成為極好的免疫原(參閱Marburg et al.，美國專利4695624;Schneerson et al.，New Dev.，with Hum＆Vet.Vaccines，77-94，1980;Schneerson et al.，J.Exptl.Med.，152，361，1980;Anderson，Infection and Immunity，39，233，1983)。但是，生產(chǎn)這類結(jié)合物的主要問題在于多糖原料的粘必和不均勻性，因此難于在化學(xué)上限定結(jié)合產(chǎn)物。于是需要提供一種方法，其中原料盡可能是已知的，而且每一步合成路線都可測(cè)定所形成的中間體。本申請(qǐng)公開的方法由于提供了對(duì)產(chǎn)生Pn-Ps的同類病源體具有很高免疫性的結(jié)合免疫原，從而滿足了上述要求。該結(jié)合物可用于2歲以下的嬰兒。
Marburg等(J.Am.Chem.Soc.，108，5282，1986)和美國專利4695624、4830852、4882317介紹了一種方法，即通過屬間空間將多糖與免疫蛋白結(jié)合。衍生物的PRO具人親核或親電子基團(tuán)(PRO＊)，而其中的Ps則具有相反的反應(yīng)作用的基團(tuán)(Ps＊)。通過Ps＊與PRO＊的結(jié)合，使Ps與PRO連接在一起(Ps-PRO)形成屬間空間。通過酸水解，屬間空間釋放出異常的氨基酸，經(jīng)氨基酸定量分析，從而提供證明共價(jià)結(jié)合的方法。
本發(fā)明公開了改進(jìn)美國專利4695624、4830852和4882317所介紹的方法，該改進(jìn)包括Pn-Ps原料比Pn-Ps粗制品具有更高的特異性、重現(xiàn)性和處理性的物理性質(zhì)，包括增加溶解度、過濾度、純度(降低族特異性C多糖(C-Ps)的污染)和降低分子量、多分散度和粘度。與美國專利4695624相比，生成本申請(qǐng)所公開的結(jié)合物，在增加稠度、制備難度、增加最終產(chǎn)品抗原力和純度等諸方面都有了改進(jìn)。特別顯著的是與美國專利4695624中的預(yù)結(jié)合Ps制劑相比，本發(fā)明在Pn-Ps預(yù)結(jié)合中，族特異性C多糖和肽聚糖降低3-20倍。雖然C多糖污染的存在并不影響對(duì)類型特異性抗原的免疫應(yīng)答，但是在結(jié)合反應(yīng)中沉淀出的C-Ps使其對(duì)類型特異性Ps的特異性和可控性降低。此外，抗C多糖抗體的產(chǎn)生與在某些尚未解決的肺炎球菌感染中所觀察到的組織分解有關(guān)。
除了新結(jié)合產(chǎn)物外，本發(fā)明還公開了制備部分水解的高度純化的肺炎球菌多糖中間產(chǎn)物的新方法、含有1至10種不同結(jié)合物的新組合物和使用本發(fā)明的方法。具有特殊意義的是包含在“PNEUMOVAX 23”中的莢膜多糖Pneumococcal Vaccine Polyvalent，MSD;參閱PDR，1990 edition，p.1431)。最佳的例子是肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumo-niae)亞型6B、23F、19F、14、18C、4和9V的莢膜多糖，這一小類肺炎球菌亞型都能解決嬰兒和兒童中75-85%肺炎球菌的感染。本發(fā)明提供的方法還可用于廣泛收集各種肺炎球菌和其他細(xì)菌的多糖。
在化學(xué)上能高度限定的肺炎球菌多糖(Pn-Ps)的制備方法是將Pn-Ps制劑粗制品部分水解至預(yù)定的終點(diǎn)，保持Pn-Ps的抗原整體性。將經(jīng)過部分水解的Pn-Ps基本純化后，用于Pn-Ps免疫蛋白(PRO)結(jié)合物(Pn-Ps-PRO)的制備。
本發(fā)明的新的高抗原Pn-Ps-PRO結(jié)合物含有外膜蛋白復(fù)合物(OMPC)或腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)b或其重組的或純化的亞單位，例如MIEP，或與由一般的肺炎鏈球菌分離物產(chǎn)生的經(jīng)部分水解并高度純化的Pn-Ps中間體共價(jià)結(jié)合的其他免疫載體，這種結(jié)合在哺乳運(yùn)動(dòng)體內(nèi)可用于預(yù)防肺炎球菌感染。尤其可在哺乳運(yùn)動(dòng)、特別是B細(xì)胞免疫損害的個(gè)體、中年以上的人和2歲以下的嬰兒中用于刺激抗肺炎球菌免疫應(yīng)的疫苗組合物，這種結(jié)合物還可刺激T細(xì)胞應(yīng)答。制備Pn-Ps-OMPC和Pn-Ps-MIEP結(jié)合物的方法包括下述步驟由肺炎鏈球菌的培養(yǎng)物中分離出莢膜Ps，部分水解或物理切變Pn-Ps，分離所述的Pn-Ps，得到分子大度、多分散度、粘度都減低的Pn-Ps產(chǎn)物，然后將Pn-Ps與OMPC或MIEP共價(jià)結(jié)合。
本發(fā)明的目的之一在于提供新的、經(jīng)部分水解并高度純化的具有抗原類型特異性的肺炎球菌莢膜多糖(Pn-Ps)，該多糖可作為中間體用于制備Pn-Ps和免疫原蛋白的T細(xì)胞依賴的結(jié)合物。本發(fā)明的目的之二在于提供Pn-Ps和免疫原蛋白的T細(xì)胞依賴的結(jié)合物，將其用于疫苗組合物，以預(yù)防肺炎球菌的感染，尤其是2歲以下的嬰兒和B細(xì)胞免疫損傷的人。本發(fā)明的目的之三在于提供優(yōu)于美國專利4695624介紹的制備肺炎球菌多糖-免疫原蛋白共價(jià)結(jié)合(Pn-Ps-PRO)的方法，其中所述的改進(jìn)包括原料Pn-Ps、中間體、最終產(chǎn)物的具有更高的化學(xué)限定、稠度提高，并且方法又易于實(shí)施。本發(fā)明的目的之四在于根據(jù)本發(fā)明的改進(jìn)方法，提供在化學(xué)上予以限定的Pn-Ps-PRO結(jié)合物，顯示T細(xì)胞的依賴性，將這種結(jié)合物用于誘導(dǎo)抗病原體肺炎球菌的保護(hù)性血清抗體，尤其是用于2歲以下的嬰兒和免疫損害者。本發(fā)明的目的之五在于提供一種治療方法，即在疫苗配制劑中使用免疫有效量的這些結(jié)合物，以預(yù)防肺炎球菌誘發(fā)的名種疾病，例如中耳炎、腦膜炎、肺炎、菌血癥和慢性關(guān)節(jié)炎的急性轉(zhuǎn)劇、竇炎、支氣管炎和結(jié)膜炎。
本發(fā)明的詳細(xì)說明A.新的Pn-Ps-PRO結(jié)合物和多糖中間體本發(fā)明的Pn-Ps-PRO結(jié)合產(chǎn)物的Pn-Ps與PRO的比為0.05-0.5mg糖/mg蛋白，其具有高度的共價(jià)性，由游離的Pn-Ps構(gòu)成的結(jié)合物。雜質(zhì)含量極低，新的多糖組份使該結(jié)合物具有均一的物理化學(xué)性質(zhì)。
該結(jié)合物含有通過間隔基與新的部分水解并高度純化的肺炎球菌莢膜多糖(Pn-Ps)共價(jià)結(jié)合的免疫蛋白(PRO)。所述免疫蛋白最好是由腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)b的培養(yǎng)物衍生的外膜蛋白復(fù)合物(OMPC)。制備OMPC的一個(gè)方法基本上如美國專利4271147和實(shí)施例1所介紹的方法。此外，也可優(yōu)先使用由能離OMPC或其重組表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生的OMPC的亞單位，例如MIEP。制備該產(chǎn)物的一個(gè)方法可參閱USSN專利555978，555329和555204(Merck Case?！鋝 18110，18159和18160，均于1990年7月19日申請(qǐng))和實(shí)施例2，16-23。
新的經(jīng)部分水解和高度純化的肺炎球菌莢膜多糖(Pn-Ps)是由一種肺炎球菌亞型培養(yǎng)物衍生的抗原多糖的制劑(將在新的結(jié)合方法和實(shí)施例3-10部分詳述)。Pn-Ps的平均分子量約為1×105-1×106道爾頓，平均每個(gè)分子約低于1000重復(fù)單位，C-多糖雜質(zhì)量約低于3%，抗原性指數(shù)為0.4-1.1，優(yōu)選0.7-1.1。最后一個(gè)參數(shù)是與保藏在ATCC的Pn-Ps粗制品相比，每單位新Pn-Ps結(jié)合抗肺炎球菌類型特異性抗體的相對(duì)量。此外，新的Pn-Ps適合于與免疫蛋白結(jié)合，產(chǎn)生本發(fā)明的Pn-Ps-PRO產(chǎn)物。2種不同的Pn6B-Ps制劑和2種不同的Pn23F-Ps制劑的一些物理化學(xué)性質(zhì)在表1中給出，同時(shí)說明了如何測(cè)定這些性質(zhì)。以下所公開的方法提供了制備Pn-Ps中間體和Pn-Ps-PRO與各種肺炎球菌亞型的結(jié)合物的方法，所述肺炎球菌亞型包括選自亞型1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19F，19A，20，22F，23F和33F，但并不限于上述亞型。為上所述，較佳的一組肺炎球菌多糖是由肺炎球菌亞型4，6B，9V，14，18C，19F和23F衍生的多糖。本領(lǐng)域的專業(yè)人員顯然知道，除了上述多糖或可代替的多糖外，其他多糖也可取代，但需要冒些風(fēng)險(xiǎn)。因此，Pn1-Ps和Pn5-Ps可像Pn4-Ps或Pn9V-Ps一樣處理，如同腦膜炎雙球菌B，C或B族鏈球菌多糖;而Pn7F-Ps可像Pn14-Ps一樣處理，下面將詳細(xì)說明，并且包含在多價(jià)疫苗中。本領(lǐng)域的專業(yè)人員還清楚地知道，由于包括了Pn6B-Ps，所述交叉反應(yīng)的抗體可以保護(hù)Pn6A。實(shí)際上還有大量其他肺炎球菌亞型。
多價(jià)疫苗是含有各種分別制備的不同的Pn-Ps-PRO結(jié)合物與所給出的Pn-Ps亞型的混合物。另外，多價(jià)疫苗是其中若干不同的Pn-Ps亞型一次或連續(xù)與給出的PRO結(jié)合的那些疫苗。
1.新多糖中間體的特征經(jīng)過部分水解、純化的肺炎球菌莢膜多糖中間體的物理化學(xué)性質(zhì)決定于衍生該多糖中間體的肺炎球菌亞型和近本發(fā)明方法的操作。一般說來，與粗制品細(xì)菌培養(yǎng)物衍生的多糖相比，Pn-Ps中間體的分子量和多分散度低2-10倍。考慮到經(jīng)改進(jìn)的多糖的處理，在結(jié)合時(shí)和結(jié)合后對(duì)比大小可以除去游離Pn-Ps，較高的Pn-Ps純度/均一性、較低的Pn-Ps分子量的多分散度和基本未改變的抗原性。這些新的Pn-Ps特征主要由于在組分上形成了高度限定的具有高度類型特異性的抗原Pn-Ps-PRO產(chǎn)物。
ⅰ.Pn-Ps分子量和多分散度采用擴(kuò)散、沉積或色譜方法測(cè)定重量均分子量MW，采取依數(shù)性(例如粘度、冰點(diǎn)降低或沸點(diǎn)升高)測(cè)定數(shù)均分子量MN，從而得到Pn-Ps制劑的多分散度(用MW/MN表示)，這個(gè)值越趨近一致，多糖制劑的均一性越高。本文給出了許多Pn-Ps制劑的多分散度，并且還提供了獲得高均一性的方法。
根據(jù)本領(lǐng)域已知方法，通過等份多糖的粒度排阻色譜法(SEC)或高效粒度排阻色譜法(HPSEC)，測(cè)定各個(gè)粗工和部分水解的Pn-Ps制劑的分配系數(shù)。分配系數(shù)Kd＝(Ve-Vo)/(Vi-Vo)其中Vo＝柱空體積，Vi＝總滲透體積，Ve＝樣品的洗脫容積，Kd＝樣品的分配系數(shù)。
由此得到的Kd用于測(cè)定多糖制劑的平均流體動(dòng)力學(xué)體積。根據(jù)所公開的方法，通過物理切變或通過熱水解或超聲水解，推導(dǎo)出Pn-Ps的分子大小，Pn-Ps的洗脫窖Ve增加，因此KD也隨之增加。
為上述目的所用的較佳柱基質(zhì)是SEPHAROSE CL2凝膠(Pharmacia№17-0120-01)。柱空體積(VO)用蘭色葡聚糖2000(Pharmacia№17-0360-01)測(cè)定，而總參透體積(Vi)則由氯化鈉鹽峰值測(cè)定。根據(jù)另一方法，Pn-Ps樣品在2.5mg/ml蒸餾水條件下制備，采用1ml注射體積。Vo/Vi比為0.32-0.37。葡聚糖T500(Pharmacia №17-0320-01)的Kd值為0.37-0.49。較佳的HPSEC系統(tǒng)包括加熱至50℃的7.5×600mm TSK G600 PW柱。另一個(gè)更佳的方法是將SEC或HPSEC與能檢測(cè)分析物相對(duì)濃度(用洗脫窖的函數(shù)表示)的差示折光計(jì)和能檢測(cè)分析物特異性粘度(用洗脫容積的函數(shù)表示)的差示粘度計(jì)結(jié)合使用。通用的標(biāo)定曲線〔10g(特性粘度×分子量)與保留體積的關(guān)系〕是經(jīng)一系列標(biāo)準(zhǔn)單分散聚環(huán)氧乙烷的分析中確定的。濃度和特異性粘度構(gòu)型可用于計(jì)算樣品的分子量與洗脫容積構(gòu)型的關(guān)系，并可用于計(jì)算MN和MW的值，由此計(jì)算多分散度指數(shù)(MW/MN)(參閱Yau，W.W.and Rementer，S.W.，J.Liq.Chromatog.，13，627-675，1990;Nagy，J.Liq.Chrom.，13，677-691，1990;Benoit，et al.，J.Ch.Phys.Tome.，63，1507-1514，1966)。本發(fā)明中的特性粘度是用pH7.2的0.1M磷酸鈉緩沖液測(cè)定的。
當(dāng)Pn-Ps制劑的平均分子量測(cè)定后，每個(gè)分子重復(fù)單位的平均數(shù)可將聚合物分子量除以重復(fù)單位分子量即能很容易測(cè)定(見表Ⅱ)。
ⅱ.Pn-Ps類型特異性抗原性的保留對(duì)經(jīng)過物理切變或化學(xué)、熱、超聲或酶水解的所有Pn-Ps粗制品來說，重要的是確定抗原整體性開始分散的終點(diǎn)，該終點(diǎn)通過與本領(lǐng)域已知的大量免疫測(cè)定中任何一種測(cè)定相關(guān)的粘度即能很容易確定。采用一種較佳的方法，即使用肺炎球菌亞型特異性抗體，通過平板雙向免疫擴(kuò)散測(cè)定法測(cè)量等份多糖溶液。在經(jīng)過一定時(shí)間的擴(kuò)散后，瓊脂中與相鄰穴中的Pn-Ps粗制品樣品的沉淀素帶相連接的白色沉淀素帶的出現(xiàn)即可定性測(cè)定各反應(yīng)物，并且證明多糖抗原整體性仍保持完整無損。定量免疫測(cè)定可采用速率散射濁度分析法或RIA測(cè)定法測(cè)定。
速率散射濁度分析法可測(cè)定抗原-抗體復(fù)合物形成時(shí)散射光強(qiáng)度的變化及其變化速率。反應(yīng)是在一個(gè)能通過光束的反應(yīng)杯中進(jìn)行的。在本發(fā)明中，復(fù)合物是在特異性抗體(Ab)與其特異性抗原(Ag)(即Pn-Ps)反應(yīng)時(shí)，通過在溶液中發(fā)生的免疫沉淀素反應(yīng)形成的。由于Ag-Ab復(fù)合物的形成決定于是否存在最佳比例的Ag和Ab分子，所以當(dāng)Ab為恒定量時(shí)，復(fù)合物形成的程度隨著Ag量增至最高水平;Ag量越大，導(dǎo)致形成的復(fù)合物越少。因此，通過保持Ab的恒定量和測(cè)定光散射隨著Ag濃度的增高，就能形成一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)樣品在與用于獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的相同條件下與其特異性Ab反應(yīng)進(jìn)，就能計(jì)算Ps(或衍生的Ps)的Ag濃度。
將由速率散射濁度計(jì)經(jīng)免疫學(xué)方法計(jì)算的濃度與由化學(xué)或物理方法(比色法，折光指數(shù)或單糖的全水解和定性分析，下面將要詳述)得到的濃度相比較，就能得到Ps樣品的抗原性指數(shù)。多糖的干重分析法僅僅適能于粉末制劑中的揮發(fā)性成份是已知的。公眾已知多糖具有吸濕性質(zhì)，并且可含5-30%(重量)揮發(fā)性物質(zhì)。對(duì)多糖中或多糖本身進(jìn)行干重測(cè)量并不特別可靠。用于高精度測(cè)定多糖濃度的一個(gè)可采用的方法是比色法，該方法是有意義的標(biāo)準(zhǔn)多糖溶液進(jìn)行標(biāo)定。例如Pn6B-Ps、Pn18C-Ps、Pn19F-Ps和Pn23F-Ps都可采用Sische和Shettles的甲基戊糖測(cè)定法(參閱J.Biol.Chem.，175，595-603，1948)進(jìn)行定量測(cè)定。Pn4-Ps、Pn9V-Ps、Pn14-Ps和Pn19F-Ps可采用己糖胺含量測(cè)定法進(jìn)行定量測(cè)定，而Pn9V可采用糖醛酸含量測(cè)定法進(jìn)行定量測(cè)定。酚-硫酸測(cè)定法(參閱Dubois et al.，Anal.Chem.，28，350-356，1956)可作為結(jié)合物制備時(shí)的部分測(cè)定方法用于定量測(cè)定所有Pn-Ps制劑。另一個(gè)可用的方法是用折光指數(shù)信號(hào)測(cè)定分析物，也可用有意義的標(biāo)準(zhǔn)多糖溶液標(biāo)定。雖然比色法可在衍生和結(jié)合過程中用于檢測(cè)樣品中的多糖含量，但是在多糖制劑物理特征的形成過程中，通過HPSEC通用標(biāo)定分析，仍然可采用后者所述方法，并用于計(jì)算抗原性指數(shù)。從Pn-Ps粗制品開始，確定抗原性指數(shù)值為1.0。計(jì)算試驗(yàn)樣品的相對(duì)抗原性指數(shù)，并且可肯定地認(rèn)為該值為0.4-1.1。如果在水解和分離步驟中對(duì)多糖進(jìn)行高度純化，則得到的抗原性指數(shù)可能大于1.0。通過提高多糖分子的撓性，從而減少抗原決定部位周圍的空間干涉，則僅僅減小大度也能提高制劑的抗原性指數(shù)，這從理論上說是可能的。完成這些測(cè)定也可作為檢查水解、分離和衍生Ps樣品的一種方法。相對(duì)抗原性＜0.4的樣品則會(huì)被排斥，即不能被結(jié)合。所得到的抗Pn-Ps抗體制劑可用于具有特性的肺炎球菌多糖?？筆n-Ps抗體源來自Health Research，Inc.，Albany，NY.和Staten Serum Institute。此外，類型特異性抗Pn-Ps抗體可以根據(jù)本領(lǐng)域已知方法用市售Pn-Ps粗制品作為抗原進(jìn)行制備(參閱[Ba-ker et al.，Immunology 20，469(1971);Brooke，M.S.，J.Immunol.，95，358(1966);Kearney，R.and Halladay，W.J.，Aust.J.Exp.Biol.Med.Sci.，48，227(1970);Schneerson，R.et al.，Prog.Allergy，33，144(1983);Robbins，J.B.，Infect.Immun.，26 1116(1979)]。
保持抗原整體性的另一方面就是保持Pn-Ps制劑的正確的化學(xué)組分。例如Pn6B-Ps具有重復(fù)單位〔α-Gal(1-3)-α-Glu(1-3)-α這-L-鼠李糖(1-4)-D-核糖醇-5-PO4(2)〕，使碳水化合物組分核糖醇∶鼠李糖∶半乳糖∶葡萄糖的摩爾比約為1∶1∶1∶1。這個(gè)摩爾比的測(cè)定可以通過用36%氫氟酸在45-65℃下水解多糖的2小時(shí)，然后用2M三氟乙酸在100℃下水解大約10-20小時(shí)，再用裝有脈沖電流檢測(cè)裝置的高效陰離子交換色譜依測(cè)定。因此，代替碳水化合物各組分大致相等摩爾量的四個(gè)峰值表示保持抗原的完整性。本發(fā)明所有新的Pn-Ps化合物都保持碳水化合物的理論比在大約20%之內(nèi)，偏離理論值的原因主要由于不同方法的局限性。因此，通過完全的水解，各化合物的比值約為Pn23F-Ps丙三醇∶鼠李糖∶半乳糖∶葡萄糖＝1∶2∶1∶1;
Pn14-PsN-乙酰基-葡萄胺∶半乳糖∶葡萄糖＝1∶2∶1;
Pn19F-Ps鼠李糖∶N-乙?；?甘露糖胺∶葡萄糖＝1∶1∶1;
Pn18C-Ps葡萄糖∶半乳糖∶鼠李糖∶丙三醇∶乙酸酯＝3∶1∶1∶1∶1;
Pn9V-Ps葡萄糖∶半乳糖∶N-乙酰基-甘露糖胺∶葡萄醛酸∶半乳糖醛酸∶乙酰酯＝2∶1∶1∶1∶1∶1∶7;
Pn4-PsN-乙?；?甘露糖胺∶N-乙酰基-巖藻糖胺∶半乳糖胺∶半乳糖∶丙酮酸酯＝1∶1∶1∶1∶1。
此外，最近已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Pn4-P4如同Pn5-Ps一樣，還含有另一組份，通過HPLC分析證明該組份為2-aminopneumosamine(2-氨基-2，6-脫氧塔羅糖)(參閱Barker et al.，Carbohydrate Res.，224-233，1966)。Pn19F-Ps也有另一個(gè)組分，或許是己糖胺，還未見文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，因此尚特證明。上述和其他理論上的多糖重復(fù)組分在下列文獻(xiàn)中已見報(bào)導(dǎo)J.E.G.van Dam et a.，Carbohyd.Res.187，267，1988;H.J.Jennings，Adv.Carbohyd.Chem.，41，155，1983及其中的參考文獻(xiàn);J.C.Richards and M.Perry，Biochem.Cell.Biol.，66，758，1988。除了碳水化合物的組份外，在若干有意義的具有某些免疫顯性特征的Pn-Ps中還有磷酸酯、乙酸酯和丙酮酸酯的亞類。這些級(jí)分也可進(jìn)行檢測(cè)(參見實(shí)施例30)。單糖的定量測(cè)定也是對(duì)樣品中多糖濃度的定量測(cè)定的可采用的方法。
保持本發(fā)明多糖抗原性的另一方面是保持多糖中的所謂“構(gòu)象決定部位”(例如見Wessels，M.R.and Kasper，D.L.，J.Exp.Med.，169，2121-2131，1989)?？乖缘倪@一方面似乎僅表面在高分子量形式的糖中，本申請(qǐng)所述各種方法也是針對(duì)保持多糖免疫性的問題。
ⅲ.最低的C-多糖雜質(zhì)另一個(gè)重要參數(shù)就是C-多糖雜質(zhì)，這個(gè)值可通過多糖制劑的全酸水解、水解產(chǎn)物的色譜分析和膽堿的電導(dǎo)檢測(cè)等方法得到(參閱Hermans，et al.，Reci.Trav.Chim.Pays-Bas，107，600，1988)。另外，未水解的多糖可采用膽堿的NMR進(jìn)行分析。NMR技術(shù)將膽堿信息與甲基鼠李糖信息(含鼠李糖Pn-Ps;與其他Pn-Ps的不同信息)之比用于計(jì)算C-Ps含量。色譜法將膽堿信息與由電導(dǎo)測(cè)定法測(cè)得的多糖含量或一個(gè)Pn-Ps組份峰值之比用于計(jì)算C-Ps含量。還有一種方法，即用C-Ps的理論重復(fù)結(jié)構(gòu)，以已知膽堿濃度為標(biāo)準(zhǔn)直接計(jì)算多糖制劑中膽堿的含量(Herman et al.，引文同上)，測(cè)定多糖制劑中的COPs濃度。根據(jù)本領(lǐng)域已知方法，測(cè)定Pn-Ps樣品中的多糖濃度。例如，多糖的總濃度可通過多糖的完全水解和具體單糖濃度的測(cè)量予以測(cè)定。將C-Ps濃度與多糖總濃度作對(duì)比，即可測(cè)定C-多糖雜質(zhì)量(W/W)。C-多糖低于多糖總量的3%(W/W)則可接受，但以低于1%為佳。
兩組Pn6B-Ps和兩組Pn23F-Ps的化學(xué)物理性質(zhì)匯總于表1。這些數(shù)據(jù)說明，采用本發(fā)明的新方法得出的各組參數(shù)都具有可現(xiàn)性。
表Ⅰ經(jīng)水解和分離的Pn-Ps的特征Pn-Ps制劑 6B-1 6B-2 23F-1 23F-2粘度終點(diǎn) 1.094 1.147 1.350 1.376Kd(HPSEC) 0.62 0.62 0.49 0.49Kd(CL-2B) 0.64 0.60 0.41 N.D.
單糖 S S S S抗原性平板雙向擴(kuò)散法 S S S S散射濁度法 S S S S(苯酚硫酸) S S S S
＊S表示良好。
表Ⅱ給出了若干肺炎球菌多糖粗制品和相應(yīng)的經(jīng)過水解和分離(Hyd+frac)的本發(fā)明的新化合物的化學(xué)物理參數(shù)。表中數(shù)值表示近似在試驗(yàn)誤差和檢測(cè)所制備的復(fù)合多糖化合物的限度范圍內(nèi)。
表中Crude表示粗制品，hyd-frac表示經(jīng)水解和分離。
2.新的Pn-Ps-PRO結(jié)合物的特征ⅰ.Pn-Ps的相同性和含量的分析通過獨(dú)立技術(shù)檢查最終結(jié)合物中Pn-Ps的含量和化學(xué)完整性，以證明抗原性(完整性)和計(jì)算Pn-Ps/PRO之比則是一項(xiàng)十分可用的方法。一個(gè)方法是根據(jù)各具體的Pn-Ps的最佳水解時(shí)間，在100℃下用2M TFA進(jìn)行5-16小時(shí)的完全水解。采用裝有脈沖電流檢測(cè)裝置的高效陰離子交換色譜方法，分析等量的Pn-Ps-PRO結(jié)合物和PRO水解產(chǎn)物(以羅氏蛋白計(jì))，得到單糖構(gòu)型。為了校準(zhǔn)由OMPC中脂多糖(LPS)產(chǎn)生的PRO對(duì)單糖造成的影響，采用適當(dāng)?shù)挠?jì)算機(jī)軟件(例如Nelson程序)從Pn-Ps-PRO結(jié)合物中“除去”PRO構(gòu)型。然后將已知量的衍生的Pn-Ps水解產(chǎn)物和修正的Pn-Ps-PRO結(jié)合物的構(gòu)型作對(duì)比，計(jì)算結(jié)合物中Pn-Ps的含量。使用該方法還能測(cè)定Pn-Ps/PRO之比例。
ⅱ.顯示結(jié)合和載帽的新的氨基酸的分析在Pn-Ps與PRO結(jié)合后，將結(jié)合物樣品置于6N HCl中水解并進(jìn)行氨基酸分析。該方法可檢測(cè)單一氨基酸(例如S-羧基甲基-高半氨酸(S-CMHC)和S-羧基甲基-半胱胺(S-CMCA))的存在和存在量。前者的氨基酸是作為通過衍生的Pn-Ps和PRO之間的化學(xué)反應(yīng)形成的化學(xué)連接的一部分(詳見以下方法部分所述)并被認(rèn)為是衍生的Pn-Ps與PRO共價(jià)連接的明確證據(jù)。這種共價(jià)連接的形成對(duì)結(jié)合物疫苗的T細(xì)胞免疫性是必需的。在緊接著完成結(jié)合反應(yīng)后，未反應(yīng)的溴乙酰胺部分用N-乙酰半胱胺戴帽。該環(huán)的連的水解導(dǎo)致S-羧基甲基半胱胺(S-CMCA)的釋放，并且還在氨基酸分析中被檢測(cè)到。該氨基酸的檢測(cè)肯定了溴乙酰胺反應(yīng)基團(tuán)已成功地形成了戴帽，因此使它們不能為不需要的化學(xué)反應(yīng)所利用?？山邮艿墓矁r(jià)和戴帽的量約為1-15%(S-CMHC/Lys和0-5%(S-CMCA/Lys)之間。
ⅲ.氫氧化鋁吸附疫苗的分析在一個(gè)較佳實(shí)施例中，將Pn-Ps-PRO結(jié)合物吸附到氫氧化鋁(Al(OH)3)凝膠上(見以下C部分所述)，形成對(duì)疫苗免疫應(yīng)答的勢(shì)差現(xiàn)象。另一個(gè)可能的疫苗配制含有生理上可接受的稀釋劑、其他助劑、免疫調(diào)節(jié)劑或除氫氧化鋁以外的惰性賦形劑。該氫氧化鋁吸附物質(zhì)的分析方法如下分析吸附氫氧化鋁的Pn-Ps-PRO中的組分和穩(wěn)定性，然后將結(jié)合物解吸附除去氫氧化鋁。能吸附可在室溫下將吸附氫氧化鋁的Pn-Ps-PRO對(duì)3%檸檬酸鈉溶液透析16小時(shí)后完成。生成可溶解的檸檬酸鋁鹽從透析膜流出，留下Pn-Ps-PRO。為了肯定吸附氫氧化鋁的配制劑中Pn-Ps-PRO的修正量，該方法具有重要的意義。但是，某些配制劑(例如Pn6B-Ps-OMPC和Pn23F-Ps-OMPC)含有10，5，2和1mcg Pn-Ps/ml(詳見下述C部分)，濃度低于化學(xué)檢測(cè)法很多。因此，為了進(jìn)行碳水化合物的組分分析，首先將吸附的Pn-Ps-OMPC疫苗粉碎，除去液體水，再將碎片懸浮于在檸檬酸鹽溶解前1/5原體積中。透析后，溶解的Pn-Ps-OMPC的濃度為50，25，10和5mcg Pn-Ps/ml。這些濃度適合于進(jìn)Pn-Ps和蛋白分析，以肯定劑量水平。
檸檬酸鹽吸附樣品還可用于分析是否存在游離的Pn-Ps，這個(gè)問題對(duì)于產(chǎn)物的免疫性和稠并具有重要意義。這個(gè)分析右在將Pn-Ps-OMPC與Pn-Ps分離的SEPHAROSE L-2或SEPHACRYL S1000SF裝料柱上經(jīng)色譜分析完成。通過速率散射濁度測(cè)定法，從抗原角度上測(cè)定游離Pn-Ps的存在及其含量。Pn-Ps-OMPC中游離Pn-Ps雜質(zhì)的含量低于Pn-Ps總量的15%。
ⅳ.熱原測(cè)定不存在明顯的熱原本發(fā)明的結(jié)合產(chǎn)物經(jīng)測(cè)定，不存在溫升反向效應(yīng)。按本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒ㄒ呀?jīng)生產(chǎn)了結(jié)合產(chǎn)物，并且發(fā)現(xiàn)具有可接受的熱原質(zhì)的量。
方法(I.V.)按21CFR 610.13(b)部分所述方法測(cè)定Pn-Ps結(jié)合物疫苗。
1)方法(I.M.)另一個(gè)測(cè)定熱原質(zhì)的方法是免IM測(cè)定法。該測(cè)定非常近似于將產(chǎn)物用于臨床，并且還更精確地反應(yīng)產(chǎn)物的表觀內(nèi)毒素負(fù)荷。
將每個(gè)兔子肌內(nèi)注射1.0ml疫苗，測(cè)定至少用3只兔子，注射后控制溫度5小時(shí)。其他的測(cè)定方法參閱21 CFR 610.13(b)的介紹。(測(cè)定量以多糖濃度計(jì))。
ⅴ.共價(jià)環(huán)連的性質(zhì)Pn-Ps-PRO(例如Pn-Ps-OMPC或Pn-Ps-MIEP)結(jié)合物可通過含硫醚基團(tuán)和伯胺的屬間間隔的結(jié)合，與多糖和PRO(例如OMPC或MIEP)形成水解不穩(wěn)定的共價(jià)鍵。本發(fā)明較佳的結(jié)合物是由式Pn-Ps-A-E-S-B-PRO或Pn-Ps-A′-S′-E′-B′-PRO表示的結(jié)合物。A-E-S-B和A′-S′-E′-B′構(gòu)成屬間間隔物，其含有水解穩(wěn)定的共價(jià)硫醚鍵并與大分子PRO和Pn-Ps形成共價(jià)鍵(例如水解不穩(wěn)定的酯或酰胺鍵)。在間隔物A-E-S-B中，S表示硫，E表示已與硫醇基反應(yīng)的親硫基的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，由下式表示
式中R是H或CH3，P等于1-3，A是
，其中W是O或NH，m等于0-4，n等于0-3，Y是CH2，O，S，NR′或CHCO2H(R′是H或C1-烷基或C2-烷基)，如果Y是CH2，m和n不能都等于0;如果Y是O或S，m和n都大于1，B是-(CH2)PCH(CH2)gD-，其中q等于0-2，Z是NH2，
，COOH或H(R′和p的含義同上)，D是
，NR′，或
。在間隔物A′-S-E′-B′中，S是硫，A′是
(其中a等于1-4，R″是CH2或
，式中Y′是NH2或NHCOR′)，W，P和R′定義同上，E′是已與硫醇基反應(yīng)的親硫基的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，由式
表示，式中R定義同上，B′是
，或E′是下式
B′是
，式中P等于1-3。此外，屬間間隔物A-E-S-B和A′-S-E′-B′中，E-S-B和A′-S-E′組分是可以測(cè)定的并且可以定量測(cè)定，這些測(cè)定反映了由共價(jià)修飾的多糖產(chǎn)生的硫醚硫側(cè)面與由功能蛋白產(chǎn)生的間隔物側(cè)面環(huán)連的結(jié)合鍵的共價(jià)性。
本發(fā)明的結(jié)合物Pn-Ps-A-E-S-B-PRO可含有間隔物，其組分包括以下的衍生物二氧化碳，1，4-丁二胺和S-羧基甲基-N-乙酰高半胱氨酸;二氧化碳，1，5-戊二胺和S-羧基甲基-N-乙酰高半胱氨酸;二氧化碳，3-氧雜-1，5-戊二胺和S-羧基甲基-N-乙酰高半胱氨酸;二氧化碳，1，4-丁二胺和S-羧基甲基-N-乙酰半胱氨酸;二氧化碳，1，3-丙二胺和S-羧基甲基-N-苯甲酰高半胱氨酸;二氧化碳，3-氮雜-1，5-戊二胺和S-羧基甲基-N-乙酰半胱氨酸;二氧化碳，1，2-乙二胺，甘氨酸和S-(琥珀-2-酰基)-N-乙酰高半胱氨酸。本發(fā)明的結(jié)合物Pn-Ps-A′-S-E′-B′-PRO可含有間隔物，其組分包括以下所述的衍生物;二氧化碳和S-羧基甲基胱胺;二氧化碳和S-(α-羧基乙基)胱胺;二氧化碳和S-羧基甲基高胱胺;二氧化碳，S-(琥珀-2-?；?胱胺和甘氨酸;二氧化碳和S-羧基甲基半胱氨酸。
B.制備新的Pn-Ps中間體和Pn-Ps-PRO結(jié)合物的方法在提供的制備方法中，分若干階段介紹。
Ⅰ.多糖的制備(a)分離肺炎球菌多糖Pn-Ps粗制品;
(b)部分水解或機(jī)械切變Pn-Ps粗制品;
(c)按粒度和純度分離經(jīng)部分水解的Pn-Ps;
Ⅱ.結(jié)合(a)將已經(jīng)分離的Pn-Ps形成親電或親核反應(yīng)物Pn-Ps＊，最好使每100個(gè)Pn-Ps低聚糖重復(fù)單位具有大約21個(gè)溴乙酰反應(yīng)基團(tuán);
(b)分離免疫原蛋白(PRO)，優(yōu)選腦膜炎雙球菌B OMPC或其亞單位;
(c)使PRO產(chǎn)生親核或親電子反應(yīng)物PRO＊，優(yōu)選OMPC或其亞單位，例如MIEP，使其具有可反應(yīng)的硫氫基部分;
(d)將步驟(a)的多糖(Pn-Ps＊)與步驟(c)的蛋白(PRO＊)結(jié)合;
(e)使Pn-Ps-PRO結(jié)合物形成戴帽，去除殘余的官能團(tuán);
(f)分離結(jié)合產(chǎn)物。
Ⅰa.分離肺炎球菌多糖Pn-Ps粗制品由于一定的莢膜多糖血清型的低聚糖重復(fù)單位的組份和環(huán)連的不同，所以肺炎球菌莢膜多糖在化學(xué)上和抗原性上也各不相同。根據(jù)一定的多糖的物理特征，多糖的分離也必須有所不同。但是，一般說來，都按已知方法(實(shí)施例3和Williams，C.A.and Chase，M.W.，Methods in Immunology and Immunochemistry，Vol.I，Academic Press，1967)，培養(yǎng)細(xì)菌和回收Pn-Ps，而病原體本身則可從ATCC得到。簡言之，先在本領(lǐng)域已知的適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)培基中大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)菌，使肺炎球菌生長，然后加殺菌劑(例如苯酚或甲苯)殺菌(實(shí)施例3)。
接著分兩步進(jìn)行多糖的醇分餾。每一步用低濃度醇沉淀出細(xì)胞碎屑和其他不需要的雜質(zhì)，同時(shí)在溶液中保留著Pn-Ps粗制品。然后將水混溶醇加到預(yù)定濃度，沉淀出莢膜多糖，而在上清液中還有其他雜質(zhì)。采用已知方法，例如核酸酶或蛋白水解消化或溶劑提取，將其再懸浮在水介質(zhì)中，除去雜質(zhì)蛋白核酸。用醇沉淀法回收多糖，干燥后得到Pn-Ps粉末粗制品(實(shí)施例3)。
Ⅰb.部分水解或機(jī)械切變Pn-Ps粗制品基本上按上述方法(并參閱實(shí)施例3)制取的多糖粗制品，以未結(jié)合狀態(tài)用于配制成年人和2歲以上兒童用的肺炎球菌疫苗。然后經(jīng)過一系步驟，得到具有獨(dú)特和限定的化學(xué)物理性質(zhì)的新的經(jīng)部分水解和純化的Pn-Ps產(chǎn)物(見表Ⅱ)，可用于制備結(jié)合物疫苗。Pn-Ps粗制品大度的減小是由于純化步驟的成功，從而得到高純度Pn-Ps產(chǎn)物。此外，當(dāng)用于制備結(jié)合物時(shí)，使用本發(fā)明的新的Pn-Ps，則可使結(jié)合更為有效。這是由于粗制品多糖物質(zhì)的水溶液很粘，溶解性差，所以其結(jié)合物的溶解性和過濾性也很差。結(jié)合方法本身不會(huì)導(dǎo)致結(jié)合物的產(chǎn)率降低。另外，當(dāng)預(yù)結(jié)合的Pn-Ps的粒度和粘度都降低，并且溶解度得到提高時(shí)，也能從最終結(jié)合物中除去未結(jié)合的Pn-Ps。這說明在結(jié)合物制劑中游離Pn-Ps的存在，就很難確定施用Pn-Ps結(jié)合物的實(shí)際劑量，由于經(jīng)過結(jié)合的Pn-Ps具有顯著的T細(xì)胞刺激作用，所以未結(jié)合的Pn-Ps的存在則表示與免疫有關(guān)的Pn-Ps的減少。
按上述方法制備的干燥的莢膜多糖粗制品也可以進(jìn)行純化，例如實(shí)施例6中所述的Pn14-Ps，這是在部分水解前后，采用陰離子交換色譜方法或其他色譜方法都能進(jìn)行純化。色譜吸附-解吸附可采用主動(dòng)和被動(dòng)兩種方法。采用主動(dòng)式時(shí)，在Pn-Ps能吸附前，先洗去留在溶液中的雜質(zhì)，然后將Pn-Ps吸附在樹脂上。采用被動(dòng)方式時(shí)，將Pn-Ps溶液中的雜質(zhì)先進(jìn)行吸附后除去，使留在溶液中的Pn-Ps處于純化狀態(tài)。此外，還可以將Pn-Ps直接進(jìn)行部分熱水解(如實(shí)施例4中的Pn6B-Ps)或超聲水解(如實(shí)施例6中的Pn14-Ps)。其他的水解方法，例如化學(xué)方法，醇方法或物理方法(如高壓池)也都是已知方法。
通過在水介質(zhì)中進(jìn)行有限度的熱處理，優(yōu)先在50-110℃下進(jìn)行大約1-48小時(shí)的有限度的熱處理，也能完成部分水解。此外，在冷卻過程中達(dá)到所需粘度或Kd終點(diǎn)需要許多時(shí)間時(shí)，則可用有限度的高能超聲處理5秒至5分鐘。對(duì)具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的多糖，超聲水解法優(yōu)于熱水解法(詳述如后)。本領(lǐng)域中已知能有效地部分水解多糖的其他各種適宜方法也都可使用。例如用酸進(jìn)行有限度的化學(xué)水解，內(nèi)溶酶處理或在搗碎機(jī)、碾磨機(jī)中進(jìn)行物理剪切，都可用于降低Pn-Ps鏈的平均長度。
在一個(gè)較佳實(shí)施例中，在溫度約為0℃-30℃和壓力約為2000PSI-15000PSI條件下，將Pn-Ps經(jīng)過均化器進(jìn)行物理剪切，預(yù)計(jì)可得到具有所需鏈長、多分散度和抗原性的特征的Pn-Ps產(chǎn)物(見實(shí)施例10)。
對(duì)實(shí)驗(yàn)性規(guī)模的多糖，通過溶液粘度或高效篩析色譜法即能很容易測(cè)定的水解目標(biāo)終點(diǎn)是可以預(yù)計(jì)的，從而使多糖的抗原性不致消失。如上所述，結(jié)合抗肺炎球菌類型特異性抗體的標(biāo)準(zhǔn)能力，即對(duì)等濃度的Pn-Ps原料粗制品所具有的的結(jié)合能力不低于70%被認(rèn)為令人滿意。這并不是說，MN，MW或每個(gè)分子重復(fù)單位數(shù)非常低的Pn-Ps(表Ⅱ)不能由該方法生產(chǎn)。這也并不是說，用速率散射濁度測(cè)定法測(cè)定的可以未與70%以上進(jìn)行反應(yīng)的Pn-Ps通過結(jié)合就可以動(dòng)物體內(nèi)具有免疫性。應(yīng)該說，由于缺乏適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合類型特異性抗Pn-Ps抗體的能力，呈結(jié)合狀態(tài)的低分子量Pn-Ps可被哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)所識(shí)別，并且可以產(chǎn)生良好的類型特異性抗肺炎球菌應(yīng)答。在這種情況下，作為接受或排斥特定Pn-Ps制劑的操作根據(jù)“抗原”一詞應(yīng)被“免疫原”代之。但是，實(shí)際上作為一種控制方法，利用體外抗原性參數(shù)比利用全內(nèi)免疫性參數(shù)方便得多。
一般說來，減低鏈長的同一個(gè)方法可用于大多數(shù)多糖。但是，Pn6B-Ps通過處長加熱降低鏈長還能保持其抗原性，而Pn23F-Ps則由于經(jīng)過超聲方法或物理剪切方法鏈長降低不多而可失去其結(jié)構(gòu)的完整性(去除了丙三醇-磷酸側(cè)鏈)。由于某些原因，在Gaulin均化器中進(jìn)行物理剪切則是一種較佳方法。首先，該方法適合于按比例擴(kuò)大。其次，超聲和加溫水解法一般都要求對(duì)經(jīng)水解過的Pn-Ps繼續(xù)進(jìn)行分離，以達(dá)到多分散度為1.0-1.5。
但是用物理剪切法所得到的Pn-Ps產(chǎn)物無需進(jìn)一步分離，分散度也在這個(gè)范圍內(nèi)，雖然需要時(shí)可進(jìn)行分離，使純度進(jìn)一步提C-多糖雜質(zhì)降低。第三，與加溫或超聲水解方法相比，物理剪切法對(duì)任何給定的Pn-Ps具有較大再現(xiàn)性的優(yōu)點(diǎn)。第四，物理剪切法在生產(chǎn)Pn-Ps產(chǎn)品方面具有某些優(yōu)點(diǎn)，即與由超聲或加溫水解方法生產(chǎn)的具有相同鏈長的Pn-Ps相比，對(duì)一定鏈長的Pn-Ps而言，具有更高的抗原性。
與Pn-Ps平均分子量有關(guān)的粘度是一項(xiàng)在加工處理過程中非常容易檢測(cè)的參數(shù)，并且在以后的水解過程中對(duì)鏈長降低的程度很容易限制和控制。大量在化學(xué)和物理上沒有區(qū)別的Pn6B-Ps和Pn23F-Ps可通過將多糖的鏈長降低到協(xié)調(diào)的目標(biāo)終點(diǎn)粘度(見表Ⅰ)而可很簡單地制取。在處理過程中采用這種粘度測(cè)量方法也可應(yīng)用于各種多粗制品，使它們無需改變形成的Pn-Ps抗原特性，就能通過水解降低鏈的長度。如上所述，通過平板雙向擴(kuò)散法、速率散射濁度法或本領(lǐng)域已知的其他方法，很容易確定抗原性的保持情況。
表Ⅲ給出了1mg/ml的若干Pn-Ps制劑的0.9%氯化鈉(鹽)溶液的目標(biāo)終點(diǎn)粘度。這些數(shù)值同樣也可用于由其他肺炎球菌亞衍生的Pn-Ps。
表Ⅲ粗制的和經(jīng)水解的Pn-Ps的溶液粘度Pn-Ps亞型 Pn-Ps粗制品的粘度(厚沲) 目標(biāo)終點(diǎn)粘度(厘沲)Pn4-Ps 1.8 1.5-1.00Pn6B-Ps 1.4 1.3-1.00Pn9V-Ps 1.4 1.3-1.00Pn14-Ps 1.2 1.1-0.95Pn18C-Ps 2.0 1.5-1.00
Pn19F-Ps 1.4 1.3-1.00Pn23F-Ps 1.6 1.5-1.00在某些肺炎球菌多糖的情況下，在部分水解前后，再進(jìn)行附加的純化步驟，例如離子交換步驟，則更為有利。在Pn14-Ps的情況下，在部分超聲水解前，用WHATMAN DE52樹脂分次吸附陰離子雜質(zhì)，即可完成該步驟。多糖經(jīng)微酸性pH處理后呈中性，在水解完畢后回收其上清液部分。
Pn6B-Ps制劑的分子量在降低鏈長和分離前約為900千道爾頓(KD)，在其后約為300KD。Pn23F-Ps的分子量，在其前后分別約為1000KD或高于1000KD和400-500KD。因此，將Pn-Ps鏈長降至大約500±300KD時(shí)，則是對(duì)各個(gè)Pn-Ps亞型在這個(gè)處理階段的適宜目標(biāo)。如IC部分中所述，用預(yù)定濃度的醇將已部分水解的材料再進(jìn)行沉淀，則可回收并進(jìn)一步純化已經(jīng)部分水解過的Pn-Ps。
Ⅰc.按鏈長和純度分離經(jīng)部分水解的Pn-PsPn-Ps制劑的多分散度不僅說明各種亞型特異性Pn-Ps鏈的長度，而且還可說明族特異性C多糖以及其他雜質(zhì)仍保留在Pn-Ps制劑中。如上所述，殘留的C多糖雜質(zhì)毫無用處，其可能與有害的免疫應(yīng)答有關(guān)。
選擇窄范圍的多糖平均分子量(多分散度降低)可通過使用低級(jí)醇(例如乙醇，優(yōu)選異丙醇(IPA)以及分子量降低后的溶解度即可很容易完成。該選擇的基礎(chǔ)在于對(duì)一定的Pn-Ps制劑而言，醇的溶解度與鏈長成反比，而與分子量成正比。因此，以均勻性顯著高于開始減小的Pn-Ps，將該方法成功地應(yīng)用于定量分離經(jīng)過分級(jí)的分子集居體。在處理過程中，可進(jìn)行預(yù)示用于沉淀Pn-Ps的異丙醇的用量范圍的小型試驗(yàn)，控制異丙醇的分級(jí)分離。將抗體散射濁度法用于檢測(cè)該分離，以確保定量回收Pn-Ps。通過上述改進(jìn)，由許多不同肺炎球菌分離物所共有的C多糖即族特異性多糖造成的雜質(zhì)比Pn-Ps制劑粗制品降低3-20倍。另外，Pn-Ps制劑的分子大小多分散度也隨之降低到大約1.0-1.4。
對(duì)已經(jīng)減小的Pn-Ps的異丙醇分離的另一項(xiàng)研究就是已經(jīng)減小的Pn-Ps通過適當(dāng)?shù)暮Y析樹脂，例如用CL-2B樹脂或任何其他能夠包含并分離分子量為200-1000KD的多糖的樹脂進(jìn)行色譜分離。使用剛度大的篩析基質(zhì)的HPSEC適宜用于這一方面，以降低延遲和提高分解。以預(yù)定粘度或保留時(shí)間或直接檢測(cè)的方法，選擇由分離柱上洗脫下來的各部分，得到具有如上介紹的所需大小、粘度和純度的特片的Pn-Ps分子的集居數(shù)。
在化學(xué)結(jié)合過程中，要始終貫穿異丙醇或色譜分離的其他步驟，因此能產(chǎn)生具有再現(xiàn)性特征的結(jié)合物。得到的Pn-Ps純度顯著增加，特別是C多糖明顯降低。
由于采用上述的操作和測(cè)定方法，得到Pn-Ps中間體較佳和特征，見于表Ⅱ。
Ⅱa.使經(jīng)分離的Pn-Ps形成親電子或親核子反應(yīng)物Pn-Ps＊，最好使其每100個(gè)Pn-Ps單體單位具有大約10-40個(gè)可反應(yīng)的溴乙?；缮鲜霾襟EⅠc得到的Pn-Ps非常均勻，并且具有若干特征，例如溶解度提高，沾度降低，使Pn-Ps適宜于結(jié)合。許多不同的方案都可使本領(lǐng)域的專業(yè)人員用于制備多糖和其他部分的結(jié)合物。本申請(qǐng)所述方法僅僅中利用本發(fā)明新的經(jīng)過部分水解和分離的Pn-Ps中間體構(gòu)成結(jié)合物的一種可能的路線，而不應(yīng)將其視為利用Pn-Ps中間體的唯一方法。
由Marburg等介紹的屬間間隔物方法(參閱Marburg，S.et al.，U.S.Patent 4695624;J.Am Chem.Soc.108，5282，1986)是將經(jīng)過分離的并且減小的Pn-Ps與免疫原蛋白結(jié)合的一種較佳方法。應(yīng)使Pn-Ps具有親電子或親核的基團(tuán)。然后使Pn-Ps＊能夠與作用相反的蛋白PRO＊反應(yīng)。本發(fā)明的方法還包括親核或雙親核基團(tuán)的選擇，所述基團(tuán)與活化的多糖反應(yīng)后，與親電子側(cè)位或硫醇側(cè)基形成共價(jià)修飾的蛋白反應(yīng)前，避免需要進(jìn)一步使雙親核修改飾的多糖發(fā)生作用。在上述步驟中，根據(jù)選擇的反應(yīng)物，用幾個(gè)步驟使蛋白與任一部分發(fā)生作用。
不管所需的Pn-Ps＊的官能度如何，經(jīng)過減小和分離的Pn-Ps首先必須在不受方法干擾的溶劑中溶液。由于Pn-Ps的羥基非常適宜于官能化，所以由水中除去Pn-Ps，可使初始官能化非常嚴(yán)格。用諸如四丁基銨或叔丁基銨的疏水陽離子取代酸性Pn-Ps氫，能使Pn-Ps溶于非水溶劑(例如DMSO或DMF中。當(dāng)然在中性的Pn-Ps中(例如Pn14-Ps或Pn7F-Ps)不需要進(jìn)行這種取代。當(dāng)在非水溶液中，Pn-Ps可與雙親電子試劑(例如羰二酰亞胺吡咯)反應(yīng)，形成咪唑基二尿烷。與Pn-Ps總單體相比，加入有限量約為1/5羰二酰亞胺吡咯試劑以摩爾計(jì)，使100個(gè)Pn-Ps單體單位中平均僅產(chǎn)生10-40個(gè)官能團(tuán)，從而將每100個(gè)Pn-Ps單體單位的官能團(tuán)數(shù)控制在這個(gè)范圍內(nèi)。這類物質(zhì)由于使用下述試劑，對(duì)親核取代很敏感，即使用(ⅰ)能形成親核Pn-Ps＊衍生物的胱胺二鹽酸鹽;或(ⅱ)使用能形成親電子Pn-Ps＊衍生物的1，4-丁二胺(參閱美國專利4695624和Marburg，et al.，J.Am.Chem.Soc.，108，5282，1986)。
最近已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由于某些酸性肺炎球菌多糖，例如Pn9V-Ps，Pn9V-Ps，Pn4-Ps，Pn1-Ps，Pn5-Ps和腦膜炎雙球菌B或C多糖具有游離羧酸基和游離羥基，所以這些多糖的結(jié)合化學(xué)的略為不同于中性多糖或因存磷二酯鍵(如在多核糖基核糖醇磷酸中)的方式進(jìn)行處理。一般說來，無羧酸多糖的結(jié)合化學(xué)是通過將游離多糖羥基轉(zhuǎn)化為尿烷環(huán)連，即由Pn-Ps-OH轉(zhuǎn)化為
(式中Ra表示連接多糖與蛋白的原子鏈的殘余部分)。但是在含羧酸的多糖中，例如含葡糖醛酸的Pn9V-Ps或含丙酮酸基的Pn4-Ps，化學(xué)處理上是將
轉(zhuǎn)化為
(式中Ra表示連接多糖與蛋白的原子鏈的殘余部分)。因此可以看到，或在含羧酸的多糖中不形成尿烷的酯官能度，或在這些部位形成簡單的酰胺鍵。由于羧酸官能度的存在，結(jié)合化學(xué)可以較快的速率處理。
由于羧酸官能度被認(rèn)為是這類陰離子多糖的抗原性和免疫原性的重要組分，結(jié)合化學(xué)必須謹(jǐn)慎控制這些多糖。在最終結(jié)合物中，對(duì)多糖與蛋白的高比例的要求必須與保留抗原完整性的要求相平衡。這種平衡可通過限制介導(dǎo)激活的起始羰基二亞酰胺吡咯的用量予以解決。當(dāng)酰胺形成時(shí)，就可如上所述和以下所作的討論，進(jìn)行下一步的處理，包括用胱胺二鹽酸鹽或1，4-丁二胺處理。
此外，羧基可被逆向保護(hù)后，再用三甲基硅烷基或類似保護(hù)基團(tuán)(其中后者可用溫和的堿性條件除去)去保護(hù)，或用對(duì)酸不穩(wěn)定的2，4-二甲氧基芐酯去保護(hù)。在這種情況下，結(jié)合化學(xué)可按常規(guī)方法通過多糖羥基進(jìn)行處理。
1.親核Pn-Ps＊的制備以上得到的經(jīng)羰基二亞酰胺吡咯激活、減小和分離過的Ps可在水或其他溶劑中與美國專利4695624中介紹的試劑反應(yīng)，較佳的試劑是胱胺二鹽酸鹽，然后去除多余的胱胺，并用二硫蘇糖醇或二硫赤蘚糖醇還原，得到親核硫氫基官能化的Pn-Ps。該P(yáng)n-Ps＊衍生物能與親電子PRO＊反應(yīng)，例如其中的蛋白修飾成具有溴乙酰側(cè)基。
2.親電子Pn-Ps＊的制備以上得到的經(jīng)羰基二亞酰胺吡咯激活、減小和分離過的Pn-Ps可在水或其他溶劑中與美國專利4695624介紹的試劑反應(yīng)，優(yōu)先與1，4-丁二胺(BuA2)。然后用溴乙酸硝基苯酯或類似試劑將Pn-Ps-BuA2酰化，產(chǎn)生能與親核PRO＊(例如經(jīng)硫氫基修飾的蛋白)反應(yīng)的親電子Pn-Ps-BuA2-BrAc衍生物。衍生的程度可用NMR和1，4-丁二胺與常規(guī)單糖倍號(hào)(例如鼠李糖的甲基信號(hào))的對(duì)比進(jìn)行測(cè)量。較佳的衍生量為10-40%，最佳的衍生量維為20%。
ⅡB.分離免疫原蛋白(PRO)，優(yōu)選腦膜炎雙球菌B、OMPC或其亞單位蛋白質(zhì)部分應(yīng)是一種免疫增強(qiáng)劑。在選擇蛋白質(zhì)時(shí)，最好避免選用導(dǎo)致非特異性激活受體免疫應(yīng)答(活化性)的蛋白質(zhì)。在美國專利4695624中，Marburg等將由腦膜炎雙球菌衍生的外膜蛋白復(fù)合物(OMPC)用于制備多糖-蛋白結(jié)合物?，F(xiàn)已證明，OMPC適宜用于本發(fā)明，盡管其他免疫原蛋白也可使用，例如破傷風(fēng)或白喉類毒素或非日毒素。
純化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的OMPC的各種方法已由文獻(xiàn)作了介紹[Frasch et al.，J.Exp.Med.140，87(1974)Frasch et al.，J.Exp.Med.147，629(1978);Zollinger et al.，US patent 4，707，543(1987);Helting et al.，Acta Path.Microbiol.Scand.Sect.C89，69(1981);Helting et al.，US Patent 4，271，147]。本發(fā)明所用的OMPC按實(shí)施例1所述方法制備。此外，由分解OMPC或重組表達(dá)編碼OMPC組成蛋白，特別是主膜蛋白(亦稱促細(xì)胞分裂誘導(dǎo)蛋白-MIP或主免疫增強(qiáng)-MIEP_的材料分離到的蛋白質(zhì)亞單位也屬于優(yōu)選蛋白質(zhì)。獲得亞單位蛋白的一種方法已經(jīng)公開在實(shí)施例2，16-23和美國專利USSN 555978，555329，555204和639457(Merck案號(hào)18110，18159和18160，于1990年7月19日申請(qǐng);以及181601A，于1991年1月10日申請(qǐng))。
ⅡC.使PRO產(chǎn)生親核或親電子反應(yīng)物PRO＊，優(yōu)先使OMPC或其亞單位具有可反應(yīng)的硫氫基部分將按上述Ⅱb分離到的PRO進(jìn)一步功能化，使其具有親電子或親核基團(tuán)，使PRO＊能夠與按上述Ⅱa方法制備的相反作用的Pn-Ps反應(yīng)。
1.親電子PRO＊衍生物的形成經(jīng)過分離的PRO，例如奈瑟氏菌屬的OMPC或由OMPC衍生的MIEP，優(yōu)先與能夠PRO上賴氫酸的ε-氨基反應(yīng)的試劑進(jìn)行反應(yīng)，所述試劑例如有N-(溴乙?；?-6-氨基己酸硝基苯酯。生成的溴乙?；腜RO＊能與按以上Ⅱa1所述方法制備的Pn-Ps＊親核衍生物反應(yīng)。
2.親核PRO＊衍生物的形成經(jīng)過分離的PRO，例如奈瑟氏菌屬的OMPC或MIEP，與諸如試劑N-乙?；甙腚装彼崃蚧瘍?nèi)酯反應(yīng)，產(chǎn)生蛋白質(zhì)的硫氫基衍生物。該親核衍生物能與按以上Ⅱa2所述方法制備的親電子Pn-Ps＊反應(yīng)。該方法在此階段得到的硫氫基滴定度約為0.1-0.3μm/mg蛋白。
Ⅱd.步驟Ⅱa的多糖(Pn-Ps＊)與步驟Ⅱc的蛋白(PRO＊)的結(jié)合通過以上步驟Ⅱa和Ⅱc反應(yīng)物Pn-Ps＊和PRO＊的組成，將逆向激活的反應(yīng)組分以1∶1質(zhì)量比互相接觸。反應(yīng)混合物應(yīng)用氮?dú)馇逑慈?，密封，并在室?17°-40℃)下反應(yīng)約4天。這些反應(yīng)的實(shí)例包括
其中已與4-溴乙酰氨基丁胺反應(yīng)過的激活多糖與已與N-乙?；甙腚装彼崃虼鷥?nèi)酯反應(yīng)過的蛋白質(zhì)反應(yīng)，形成結(jié)合物，以及
(其中Y″表示C2-C8烷基)，其中已與激活的馬來亞氨酸反應(yīng)過的氨基衍生的多糖與已用氨基硫醇胺化的羧基激活的蛋白反應(yīng)，形成結(jié)合物。
同樣，經(jīng)硫醇側(cè)基共價(jià)修飾過的多糖可與具有親電子中心的細(xì)菌蛋白OMPC或MIEP反應(yīng)，生成共價(jià)結(jié)合物。該反應(yīng)的一個(gè)實(shí)例是
其中已與氨基硫醇反應(yīng)過的激活多糖與已與二胺的一囪代乙酰基衍生物反應(yīng)過的羧基激活的蛋白反應(yīng)，形成共價(jià)物。按本發(fā)明的更佳環(huán)連是下式的間隔物
通過多糖羥基進(jìn)行環(huán)連，或在具有羧酸基的多糖的情況下，是下式的間隔物
如果需要除去多余的囪代乙酰基的親電子活性，則結(jié)合物與低分子量硫醇(例如N-乙酰胱胺)反應(yīng)，即可達(dá)到該目的。使用N-乙酰胱胺還可確定所用囪代乙?；糠值挠昧?，因?yàn)椴捎肧packman，Moore和Stein方法完全能檢測(cè)到已形成的S-羧甲基胱胺。
Ⅱe.將Pn-Ps-PRO結(jié)合物戴帽，除去殘余物的官能團(tuán)在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，加入多于結(jié)合物上殘余反應(yīng)基團(tuán)紡約2倍至10倍摩爾的低分子量的親核試劑(例如N-乙基馬來酰亞胺(NEM))，使PRO＊或Pn-Ps＊上的殘余親電子基團(tuán)驟冷，使殘余的游離硫氫基戴帽;或加入親電子試劑(例如N-乙酰胱胺)，使殘余的溴乙?；糠执髅薄?br> Ⅱf.分離結(jié)合產(chǎn)物采用超速離心或過濾方法，將戴帽的結(jié)合物與未結(jié)合的PRO，Pn-Ps和其他反應(yīng)物分離。將結(jié)合物碎片懸浮在緩沖液中洗滌，可包括洗滌劑處理(例如0.5%脫氧膽堿)，鹽處理(例如0.1M Tris，pH7-9)以及約10mM EDTA，除去殘余的熱原。結(jié)合物在室溫下靜置1-25小時(shí)。再將結(jié)合物粉成碎片，懸浮在不含洗滌劑的緩沖液中。在大約1°-20℃下，超速離心(約100000Xg，固定角轉(zhuǎn)子)約2小時(shí)，也可采用任何一種其他的純化方法進(jìn)行純化，包括過濾凝膠滲透法，離子交換色譜法，梯度離心法或其他差示吸附色譜法。為了除去非共價(jià)鍵合的多糖和蛋白質(zhì)，可使用Ps，PRO和速率散射濁度測(cè)定法，以及屬間間隔物共價(jià)測(cè)定法(詳述如后)和按所需生物活性的離體方法。
反應(yīng)物的進(jìn)一步分離可采用柱篩析色譜法，或在非常大的不溶蛋白的情況下，可采用超速離心法。將結(jié)合物懸浮在無菌水中，于4℃下熟化約1天，使完全溶解，然后低速離心，除去不溶顆粒。上清液含有最終產(chǎn)物，可經(jīng)無菌過濾后，配制成免疫有效劑量的疫苗組合物，無菌裝入瓶中。
為了證實(shí)結(jié)合物的共價(jià)性和穩(wěn)定性，先將結(jié)合物水解(優(yōu)先在110℃下用6N HCl水解20小時(shí))，然后定量分析含硫醚鍵的對(duì)水解穩(wěn)定的間隔物中各氨基酸和組成蛋白質(zhì)的各基酸。根據(jù)需要，通過與有關(guān)蛋白質(zhì)的適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)氨基酸對(duì)比，與反映結(jié)合物共價(jià)性的氨基酸值對(duì)比，去除蛋白氨基酸的組分，或?qū)⒌鞍踪|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸排除在外，將間隔物中的氨基酸用于分析。為了提高生物活性成份的濃度，共價(jià)測(cè)定法也可用于檢測(cè)純化處理。在上述實(shí)施例中，通過裂解肽連鎖和其他水解不穩(wěn)定鍵上的Ps-A-E-S-B-PRO分子，水解
釋放出S-羧甲基高半胱氨酸
水解
釋放出氨基二羧酸
以及水解
釋放出S-羧甲基胱胺H2NCH2CH2SCH2CO2H。色譜法，例如Spackman，Moore和Stein所介紹的方法，很容易應(yīng)用和測(cè)定各組成氨基酸之比。
IgG抗體的最佳生產(chǎn)需要B和T淋巴細(xì)胞與有意義抗原的特異性相結(jié)合。T淋巴細(xì)胞不能識(shí)別多糖，但是如果多糖與能夠識(shí)別T細(xì)胞的蛋白共價(jià)連接，則T淋巴細(xì)胞有且于抗多糖IgG抗體應(yīng)答。
C.疫苗配制劑和藥效在一個(gè)較佳實(shí)施例中，將結(jié)合產(chǎn)物吸附在氫氧化鋁凝膠上，通過制備相當(dāng)于20μg/ml Pn-Ps濃度的結(jié)合物貯備溶液即可完成此項(xiàng)工作。用無菌水按1∶1，1∶5和1∶10稀釋成若干份，每份樣品都含有20μg/ml貯備溶液，然后按1∶1比例用含有0.85mg/ml Al+3，1.7%NaCl(W/V)和100μg/ml乙基汞硫代水楊酸鈉的氫氧化鋁稀釋液進(jìn)行稀釋。用含有Pn-Ps濃度為10，5，2和1μg/ml的1N NaOH溶液將上述溶液的pH調(diào)至7.5左右。這些配制劑分別含有大約0.1ml至0.75ml的劑量，適用于不同年齡和體重范圍的受體。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，按所述方法配制的疫苗在2-3個(gè)月嬰猴中，對(duì)Pn6B-Ps-OMPC，Pn14-Ps-OMPC，Pn19F-Ps-OMPC和Pn23F-Ps-OMPC顯著提高了亞型特異性抗肺炎球菌多糖的免疫應(yīng)答。此外，還發(fā)現(xiàn)，Pn-Ps-OMPC結(jié)合物疫苗在無胸腺鼠中與T細(xì)胞有關(guān)。
從以上所述可清楚地看到，具有本文所限定的特征的其他多糖和制備具有這些特征的Ps的方法可以用于制備各種結(jié)合物，正是這些結(jié)合物含有經(jīng)過部分水解和分離的肺炎球菌多糖。這些結(jié)合物可用于防止由其他病原菌引起的種種疾病。例如引起新生兒腦脊膜炎的B族鏈球菌，引起幼兒腦脊膜炎的腦膜炎雙球菌B或C，主要引起尿道和其他堿染的大腸桿菌都可用途多糖源。這些多糖和Pn-Ps及其共價(jià)結(jié)合物也都可為疫苗配制劑組合物提供高種重要的級(jí)份。這種組合物可以含有免疫有些量的佐劑，例如弗羅因德氏佐劑，Ribi佐劑或免疫調(diào)節(jié)化合物，例如白介素，干擾素(例見列于Market Letter(Nov.30，1987，p.26-27)中的化合物或其他免疫原。在一個(gè)較佳實(shí)施例中，含有免疫有效量的本發(fā)明結(jié)合物的組合物包含一種或多種抗下列病原體的疫苗乙型肝炎，甲型肝炎，非甲非乙型肝炎，愛滋病，白喉，百日咳，破傷風(fēng)，麻疹，流行性腮腺炎，風(fēng)疹，水痘，脊髓灰質(zhì)炎，流感嗜血桿菌b，從以上所述的其他較佳疫苗則是選自Pevax HIBR，Recombivax HBR，M-M-RR和三價(jià)DTP疫苗。
以下的實(shí)施例是為了進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)視為限制本發(fā)明。
實(shí)施例1腦膜炎雙球菌B11血清型2 OMPC的制備1.腦膜炎雙球菌B11族將裝有冰凍干燥的腦膜炎雙球菌培養(yǎng)物(由M.Artenstein博士處得到Walter Reed Army Institute of Research-WRAIR，Washington，D.C.)的試管打開，加入Eugonbroth(BBL)。培養(yǎng)物條鋪在Mueller Hinton瓊脂斜面上，在37℃和5%CO2條件下溫育36小時(shí)，即將培養(yǎng)物收集到10%脫脂乳培養(yǎng)基(Difco)中。整份培養(yǎng)物在-70℃冰凍。通過與由WRAIR提供的特異性抗血清和由Difco提供的典型血清的凝聚作用證明細(xì)菌的同一性。
將一小瓶第二代培養(yǎng)物解凍后，條鋪在10塊哥倫比亞關(guān)血瓊酯板(CBAB-BBL)上，在37℃和5%CO2條件下溫育18小時(shí)，然后將培養(yǎng)物收集到100ml的10%脫脂乳培養(yǎng)基中，取0.5ml為一整份，全部整分培養(yǎng)物冰凍在-70℃下。通過與特異性抗血清的凝集、糖發(fā)醇和革蘭氏染色，證明細(xì)菌為陽性反應(yīng)。
將一小瓶該代細(xì)菌培養(yǎng)物解凍，用Mueller-Hinton培養(yǎng)基稀釋，條鋪在40個(gè)Mueller-Hinton瓊脂板上，在37℃和6%CO2條件下溫育18小時(shí)，然后將生長培養(yǎng)物收集到17ml的10%脫脂乳培養(yǎng)基中，以0.3ml為一份，在-70℃下冰凍。經(jīng)革蘭氏染色，與特異性抗血清凝集和氧化酶測(cè)定，證明該細(xì)菌呈陽性反應(yīng)。
2.細(xì)胞糊狀物的發(fā)酵和收集a.接種物的展開從上述一小瓶冰凍的腦膜炎雙球菌B，B-11族(第4代)取出已經(jīng)生長的接種物，接種在10個(gè)Mueller-Hinton瓊脂斜面上，約18小時(shí)后收集6個(gè)斜面的培養(yǎng)物，用作3×250ml裝有Gotschilic酵母透析液培養(yǎng)基的燒瓶中，pH6.35。將OD660調(diào)至0.18，溫育至OD660為1-1.8。取1ml該培養(yǎng)物，接種到5×2L三角燒瓶中，每瓶含有1升培養(yǎng)基(詳述于后)，在37℃下于200rpm搖床中溫育。接種后每隔1小時(shí)檢查OD變化情況。結(jié)束時(shí)，OD660為1.28，營養(yǎng)培養(yǎng)物達(dá)到4升。
70升種子發(fā)酵罐將大約4升種子培養(yǎng)物接種到裝有大約40升完全生產(chǎn)培養(yǎng)基(詳述于后)的70升無菌發(fā)酵罐中。70升發(fā)酵條件37℃，185rpm，每分鐘10升通氣量，pH恒定控制在大約7.0約2小時(shí)。2小時(shí)后，這批培養(yǎng)物的最終OD660為0.732。
800升生產(chǎn)發(fā)酵罐將大約40升種子培養(yǎng)物接種到裝有568.2升完全生產(chǎn)培養(yǎng)基(見后)的800升無菌發(fā)酵罐中。在37℃下溫育，100rpm，每分鐘60升通氣量，pH恒定控制在7.0。接種后13小時(shí)，這批培養(yǎng)物的最終OD為5.58。
3.三角燒瓶、70升和800升發(fā)酵罐的完全培養(yǎng)基A部分L-谷氨酸 1.5g/lNaCl 6.0g/lNa2HOP4(無水) 2.5g/lNH4Cl 1.25g/lKCl 0.09g/lL-半胱氨酸HCl 0.02g/lB部分(Gotschlich酵母透析液)將1280g的Difco酵母膏溶解于6.4升蒸餾水中，該溶液在2個(gè)Amicon DC-30中空纖維透析裝置(有3個(gè)H10SM筒)中進(jìn)行透析。將384g MgSO4·7H2O和3200g葡萄糖溶解于透析液中，加蒸餾水使總?cè)莘e達(dá)到15升。用NaOH將pH調(diào)至7.4，通過0.22μ漏斗滅菌，然后轉(zhuǎn)移到裝有A部分的發(fā)酵罐。
三角燒瓶加入1升A部分和25ml B部分，用NaOH將pH調(diào)整至7.0-7.2。
70升發(fā)酵罐加入41.8升A部分和900ml B部分，用NaOH將pH調(diào)至7.0-7.2。
800升發(fā)酵罐加入553升A部分和15.0升B部分，用NaOH將pH調(diào)至7.1-7.2。
b.收集和減活發(fā)酵結(jié)束后，將苯酚加到分離器中，然后將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到該分離器中，得到的最終苯酚濃度約為0.5%。在室溫下緩慢攪拌，將材料保持到使培養(yǎng)物失活(約24小時(shí))。
c.離心在4℃下大約24小時(shí)后，將614.4升滅活培養(yǎng)液通過Sharples連續(xù)流動(dòng)離心機(jī)離心。經(jīng)苯酚處理后，細(xì)胞糊狀物的重量達(dá)到3，875kg。此外，按以下所述，過濾收集苯酚致死發(fā)酵培養(yǎng)液。
B.OMPC的分離步驟1離心和過濾將苯酚滅活的培養(yǎng)物離心至大約30升，在無菌蒸餾水中用0.2μm中空纖維漏斗(ENKA)過濾。
步驟2提取將等體積的2X TED緩沖液(0.1M TRIS，0.01M EDTA緩沖液，用0.5%脫氧氯酸鈉將pH調(diào)至8.5加到經(jīng)過離心過濾的細(xì)胞中，然后將懸浮液轉(zhuǎn)移到控溫罐中，在56℃下攪拌30分鐘提取OMPC。
在大約18000rpm的Sharples連續(xù)流動(dòng)離心機(jī)中，于4℃下，離心提取液，流速約為80ml/分鐘。然后收集粘筒的上清液，貯藏在4℃下。將提取過的細(xì)胞碎片按上述方法，再在TED緩沖液中提取，收集上清液，貯藏在4℃下。
步驟3超濾濃縮將收集到的提取液轉(zhuǎn)移到控溫罐(裝有AG-Tech 0.1μm聚硯漏斗)。在整個(gè)濃縮過程中，罐中提取液的溫度保持在25℃下。在跨膜平均壓力為11-24psi下，樣品濃縮到1/10。
步驟4OMPC的收集和洗滌在大約70℃下將步驟3的殘留物置于大約160000xg(35000rpm)的連續(xù)流動(dòng)離心機(jī)中離心，流速300-500ml/分鐘，倒出上清液。
將OMPC碎片懸浮在TED緩沖液(190ml緩沖液，20ml/g碎片)，重復(fù)2次步驟2和步驟4(省略步驟3)。
步驟5OMPC產(chǎn)物的回收用玻璃棒和Dounce均化器將步驟4經(jīng)過洗滌的碎片懸浮在100ml蒸餾水中，確保完全懸浮。然后通過0.22μm漏半將OMPC懸浮液無菌過濾。用0.1μm中空纖維漏斗過濾無菌蒸餾水，并用該蒸餾水取代TED緩沖液。
實(shí)施例2OMPC亞單位的純化，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳由OMPC或重組細(xì)胞制備純化的MIEP使用丙烯酰胺/BIS(37.5∶1)凝膠，18×14cm，3mm厚。積層凝膠是4%聚丙烯酰胺，分離凝膠是12%聚丙烯酰胺。每種凝膠使用大約5μgOMPC蛋白或重組宿主細(xì)胞蛋白。將0.5ml試樣緩沖液(4%丙三醇，300mMDTT，100mM TRIS 0.001%溴苯配酚蘭，pH7.0)加到1ml OMPC中。該混合物在20分鐘內(nèi)加熱到105℃，冷卻至室溫，然后裝載到凝膠上。凝膠在200-400毫安和冷卻條件下流動(dòng)，直至溴苯酚蘭到達(dá)凝膠的底部。垂直切下凝膠帶(約1-2cm寬)，用考馬斯/乙酸銅(0.1%)染色。然后將凝膠帶脫色至肉眼可看到MIEP(約38KD)。再將該凝膠帶置于其原來的位置，用曲能剖刀從凝膠的殘余部分切下MIEP部分。
將切下的部分切成立方體(約5mm)，并用0.01M TRIS緩沖液(pH8.1)洗脫，洗脫2個(gè)循環(huán)后，用SDS-PAGE測(cè)定洗脫液的純度。將該洗脫液與一般收集的洗脫液合并，用60mM氨水-甲酸(pH10)透析48小時(shí)。另外，用50%乙酸水溶液透析洗脫蛋白。滲析后將洗脫的蛋白蒸發(fā)至干。材料通過PD10篩析柱(Pharmacia，Piscataioay，NJ)得到進(jìn)一步純化，然后在室溫下貯藏。
實(shí)施例3培養(yǎng)肺炎球菌亞型和分離Pn-Ps粗制品Ⅰ培養(yǎng)肺炎球菌培養(yǎng)肺炎球菌的方法已為本領(lǐng)域所公知(Chase，M.W.，Methods of Immunology and Immunochemistry 1，52，1967)。肺炎球菌亞型的分離物可從ATCC得到。細(xì)菌經(jīng)鑒定確認(rèn)為是包膜不活動(dòng)的革蘭氏陽性和矢狀的雙球菌，其在血-瓊酯上為α-溶血雙球菌。根據(jù)用特異性抗血清和莢膜膨脹反應(yīng)，其亞型各不相同。原種培養(yǎng)物最好保持在冰凍狀態(tài)或8℃以下。在一個(gè)優(yōu)選培養(yǎng)方法中，培養(yǎng)用心浸劑培養(yǎng)基，將培養(yǎng)物鋪在含有10%脫纖兔血液的心浸劑瓊脂上，可以增加培養(yǎng)物。在37℃±2℃下大概需要培養(yǎng)18小時(shí)。
將在平板上生長的培養(yǎng)物再懸浮在心浸劑培養(yǎng)基上，然后將其以整分部分接種到100ml含10%脫纖免血液的心浸劑培養(yǎng)基中，在37℃±2℃固定溫育培養(yǎng)約18小時(shí)。取100ml液體培養(yǎng)物(工作用種子)通過顯微鏡檢查革蘭氏染色的涂片和在心浸劑血瓊脂板上生長的培養(yǎng)物檢查其純度。工作用種子在2-8℃下可貯藏最多至14天，也可立即使用。在2升的三角燒瓶或其他適當(dāng)容器中，裝有含葡萄糖(25g/l)的肺炎球菌接種培養(yǎng)基(YUF)，并用工作種子接種，在37℃±2℃下固定溫育約8-24小時(shí)。溫育時(shí)間可根據(jù)所培養(yǎng)的肺炎鏈球菌的類型而可改變。用過磺酸加成的12%碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵的pH值，使其保持在6.0-7.2，至光密度達(dá)到1.5-4.0。在660mm處監(jiān)測(cè)光密度。培養(yǎng)物的樣品可用顯微鏡檢查，進(jìn)行血清聚集反應(yīng)可以檢查純度。將此階段的生長培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到裝有40升肺炎球菌發(fā)酵培養(yǎng)基的種子發(fā)酵罐中，該培養(yǎng)基由蒸餾水、肺炎球菌種子培養(yǎng)基(YUF)干組分、酵母膏超濾液、UCON和葡萄糖(約25g/l)組成。培養(yǎng)物在37℃±2℃和緩慢攪拌下溫育約2-12小時(shí)。加入過磺酸加成的氫氧化鈉溶液，將pH控制在6.0-7.2。裝有525升肺炎球菌發(fā)酵培養(yǎng)基(由蒸餾水、肺炎球菌生產(chǎn)培養(yǎng)基-YUF、酵母膏超濾液、UCON和每升約25g的葡萄糖組成)發(fā)酵罐用約50升2-12小時(shí)的種子培養(yǎng)物接種。在37℃±2℃和溫和攪拌下，根據(jù)生長培養(yǎng)物的類型，溫育6-30小時(shí)。加入過磺酸加成的氫氧化鈉溶液，將pH控制在6.0-7.2。發(fā)酵后檢查光密度。pH不再改變時(shí)，表示葡萄糖完全被利用，發(fā)酵終止。
在發(fā)酵終止后可直接將病原體致死，可用的方法是將苯酸加到大約1%的濃縮物中，在室溫下殺菌可進(jìn)行2-12小時(shí)。
Ⅱ.Pn-Ps粗制品的分離將足夠量的變性乙醇加到已殺死的培養(yǎng)物中，沉淀出的細(xì)胞碎屑和核酸通過離心除去，然后加入更多的變性醇，從上清液中沉淀出多糖粗制品。離心收集固體，倒去上清液。
將多糖溶解在中性水溶液中(例如1-5%乙酸鈉)，或?qū)⒑怂崦负图s0.01M氯化鎂加到0.05M磷酸鹽緩沖液中，從而可以減少核酸雜質(zhì)。在36℃下，經(jīng)過大約60-120分鐘后，將pH調(diào)至8.0左右，并加入蛋白酶(例如胰蛋白酶)，可消化蛋白質(zhì)雜質(zhì)。
去除其他雜質(zhì)的方法是在乙酸鈉中，用變性乙醇或異丙醇沉淀多糖，然后再溶于蒸餾水中。在約8℃下，加入十六烷基三甲基溴化銨，沉淀出的雜質(zhì)用離心除去。加入乙酸鈉和整份變性乙醇或異丙醇，可以除去其他雜質(zhì)。加入或多加乙醇并且離心，可回收多糖。沉淀物用無水乙醇洗滌至得到白色粉末。通過過濾、無水乙醇和丙酮洗滌和真空干燥，得到Pn-Ps粉末粗制品。
實(shí)施例4制備部分水解、純化的Pn6B-Ps
(1)加熱水解在室溫下，將每份3.0g的Pn6N-Ps粉末粗制品溶解于1200ml鹽水(0.9%NaCl)，攪拌約4小時(shí)，在4℃下放置過液。在100℃下該溶液在指形回流冷凝管中水解24小時(shí)，冷卻至室溫。將乙酸鈉試劑(59.7g)加到最終濃度為3%(W/V)。
(2)血清學(xué)測(cè)定以每份10ml樣品進(jìn)行異丙醇(IPA)分離示范研究和抗體終點(diǎn)散射濁度測(cè)定，結(jié)果證明Pn6B-Ps在40-50%IPA時(shí)沉淀。
(3)每一次加入IPA已經(jīng)水解的樣品(體積1210ml，取自上述步驟1)通過加入932ml IPA(室溫下攪拌滴加)，使其IPA增至43.5%。將樣品攪拌15-30分鐘，然后以11000xg離心30分鐘(Backman JA-10轉(zhuǎn)子，800rpm，20℃)。糊狀碎片在250ml Ominimix缸中用無水EtOH研制，然后在60ml燒結(jié)玻璃漏斗上收集。在漏斗上先后直接用無水EtOH和丙酮洗滌沉淀物，在室溫下經(jīng)氯化鈣真空干燥，準(zhǔn)備用于分析。
(4)第二次加入IPA和產(chǎn)品回收在室溫下攪拌滴加93.5ml的IPA，使43.5%的IPA上清液(體積2020ml，取自上述步驟3)增至46.0%IPA。按步驟3所述方法，將樣品熟化，離心。按上述步驟3的方法，研制、收集、洗滌和干燥碎片。得到的Pn6B-Ps重1650mg，Kd 0.62，磷含量3.3%。
實(shí)施例5肺炎球菌6B-OMPC結(jié)合物Pn6B-Ps-OMPCA.Dowex 50×2四丁銨樹脂(Dowex 50(Bu4N±)1)的制備將Dowex 50×2(200-400目)H+形(72g)置于水中制漿狀。裝載到柱上后依次用水、6N Hcl和水洗滌，至pH試紙測(cè)定為中性。用10%氫氧化四丁銨水溶液流經(jīng)該柱，至測(cè)試呈強(qiáng)堿為止。最后用水流經(jīng)該柱，至測(cè)定再呈中性止。
B.Pn6B(Bu4N+)將經(jīng)減小和分離過的Pn6B-Ps(600mg)(參見表ⅠPn6B-Ps第一組的物理性質(zhì))溶解于無菌蒸餾水(60ml)中，該溶液經(jīng)磁攪拌至所有固體都轉(zhuǎn)化為液體(1.5小時(shí))。將多糖溶液涂在經(jīng)過漂洗的樹脂上，由于重力作用流過柱床(4.5小時(shí))。柱用水洗滌(10-12ml)，然后將流出物合并，冰凍干燥，得到640mg干的Pn6B-Ps四丁鋟鹽Pn6B(n-Bu4N+)。
C.Pn6B-BuA2將Pn6B(n-Bu4N+)(640mg)溶解于二甲亞砜(DMSO)(24ml)，磁攪拌30分鐘后，所用固體都轉(zhuǎn)化為溶液。將1，1′-羰基二酰亞胺吡咯(44.2mg)加到該混合物中，反應(yīng)在室溫下攪拌60分鐘。在分離燒瓶中加入10N NaOH，使丁二胺二鹽酸鹽(BuA2·2HCl，1.002g)的水(16ml)溶液呈戌性(pH10.2)。用0.2μm無菌漏斗過濾溶液，在冰浴中冷卻。將熟化的含有激活多糖的DMSO混合物緩慢穩(wěn)定地連續(xù)加到冷卻的BuA2·2HCl溶液中，生成的溶液在0℃下攪拌15分鐘。將反應(yīng)混合物加熱至室溫，再攪拌1小時(shí)。然后轉(zhuǎn)移到滲析管中，在4℃下用以下所述進(jìn)行滲析，即(1)15升0.1M磷酸鈉緩沖液，pH7.0，6小時(shí);(2)15升0.01M磷酸鈉緩沖液，pH7.0，12小時(shí);(3)15升0.01M磷酸鈉緩沖液，pH7.0，9小時(shí);(4)15升蒸餾水，1.75小時(shí)。將滲析管中的材料冰凍干燥，得到222g Pn6B-1，4-丁二胺(Pn6B-BuA2)。通過將Pn6B-Ps的丁二胺上的亞甲基和鼠李糖上的甲基質(zhì)子的核磁共振作對(duì)比，則大約5mg這種材料的NMR(300MHz，D2O)顯示每100個(gè)Pn6B-Ps重復(fù)單體單位裝載22個(gè)二胺殘基。
Pn6B-BuA2-BrAc將Pn6B-BuA2(210mg)溶解在pH9.04的0.1M Kolthoff硼酸鹽-磷酸鹽緩沖液(21ml)中，混合物經(jīng)磁攪拌30分分鐘后形成溶液。將由溴乙酸硝基苯酯(210ml)的乙腈(2.6ml)溶液組成的混合物加到上述水溶液中，反應(yīng)攪拌過液(20小時(shí)，4℃)。將溶液轉(zhuǎn)移到滲析管中對(duì)以下所述進(jìn)行滲析(4℃);(1)15升無菌蒸餾水(12.3小時(shí));(2)15升無菌蒸餾水(8.25小時(shí));(3)15升無菌蒸餾水(5.5小時(shí))。為了進(jìn)行測(cè)定(NMR和HPSEC-一般檔定或分子大小的分析)，從滲析袋中去除1.7ml，然后加入0.449g干燥的pH為8的磷酸緩沖鹽(由將0.1M和pH為8的磷酸鈉溶液冰凍干燥制取)。完全溶解后(30分鐘)，通過0.2μm無菌漏斗過濾溶液，得到pH8的Pn6B-BuA2-BrAc溶液。
Pn6B-OMPC將4個(gè)10ml離心管中的無菌OMPC(40ml，4.5mg/ml)通過超過速離心(4℃，43K rpm，2小時(shí))粉碎成碎片。將每片碎片再懸浮在3ml經(jīng)過無菌過濾的(0.22μm)硫醇化混合物中，該混合物由以下組成N-乙酰高半胱氨酸硫代內(nèi)酯鹽酸鹽(164mg)、乙烯-二胺-四乙酸二鈉鹽(255mg)和二硫蘇糖醇(53mg)于Na2B4O緩沖液(30ml，pH11.09)。在室溫下將懸浮的碎片均勻化(Dounce)后，合并，容器排氣和用氮?dú)鈴?fù)蓋，熟化過液(19小時(shí))。將溶液分成3個(gè)超速離心管，用1M KH2PO4和粉碎蛋白(4℃，43K rpm，2小時(shí))拔頂。然后將碎片懸浮在0.1M磷酸鈉和pH為8的緩沖液(30ml)中，均勻化(Dounce)和再粉碎(4℃，43K rpm，2小時(shí))。將無菌蛋白碎片懸浮在經(jīng)過過濾的Pn6B-BuA-BrAc溶液中。直接進(jìn)行Ellman測(cè)定后，得到SH滴定為34μmol。在室溫下將反應(yīng)混合物排氣，用氮?dú)鈴?fù)蓋，熟化91小時(shí)。
加入1ml由N-乙基馬來酰亞胺(75mg)和5ml 0.1M磷酸鈉緩沖液(pH8.0)組成的溶液(經(jīng)0.22μm無菌漏斗過濾)，從而將蛋白質(zhì)戴帽。在室溫下，將該混合物熟化4小時(shí)，然后加入300μl N-乙酰胱胺(經(jīng)0.22μm無菌漏斗過濾)，溶液再經(jīng)19.5小時(shí)熟化。
將無菌戴帽的結(jié)合物分成4個(gè)離心管，用0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7)拔頂，超速離心粉碎(4℃，43K rpm，2小時(shí))，然后懸浮和均勻化(Dounce)于無菌0.1M NaPO4緩沖液(pH7，42ml)中。按如前所述，再進(jìn)行離心，將碎片再懸浮在Dounce均勻器中，總量為50ml無菌蒸餾水。在4℃下熟化17小時(shí)后，用TJ-6離心機(jī)(TH4轉(zhuǎn)子，1000rpm)離心結(jié)合物制劑3.5分鐘，除去少量沉淀。測(cè)定最終結(jié)合產(chǎn)物懸浮液中的蛋白質(zhì)(Lowry)，Pn6B-多糖(苯酚/硫酸)，未結(jié)合的多糖(篩析色譜法-速率散射濁度測(cè)定)和氨基酸(氨基酸分析)。測(cè)定結(jié)果如下Pn6B-多糖 0.33mg/ml蛋白 2.2mg/mlPn6B-Ps/OMPC 0.15游離Pn6B-Ps ＜5面積%S-羧甲基高半胱氨酸/賴氨酸 7.7%S-羧甲基胱胺/賴氨酸 1.6%實(shí)施例6制備部分水解、純化的Pn14-Ps(1)用陰離子交換樹脂處理在室溫下將每份2.81g的Pn14-Ps粉末攪拌溶解于1124ml蒸餾水中，約4小時(shí)后，在4℃貯藏過液。將該溶液加到60g DE52(Whatman，二乙基氨工-乙基纖維素)中，該DE52在pH約5-6的蒸餾水中約經(jīng)15小時(shí)的預(yù)溶脹。在室溫下，漿料在臺(tái)式搖動(dòng)器上緩和搖動(dòng)約15小時(shí)，然后于20℃下，在Beckman JA-10離心機(jī)(5000rpm)中離心15分鐘。通過燒結(jié)玻璃漏斗(150ml，中等孔徑)進(jìn)一步澄清上清液，并將其收集到2升支臂燒瓶中。
(2)超聲水解將經(jīng)DE52處理過的Pn14-Ps(容積1100ml，取自上述步驟1)置于塑料杯中，在冰浴上用Branson超聲發(fā)生器(1/2英寸探頭，8個(gè)裝置)進(jìn)行超聲處理2分鐘。將樣品冷卻約15分鐘，同時(shí)測(cè)定粘度，然后每隔1分鐘處理1次。在最一次超聲處理后，粘度終點(diǎn)達(dá)到1.096厘沲。將經(jīng)過水解的樣品升溫至室溫，加入乙酸鈉試劑(18.0g)，使最終濃度達(dá)到1%(W/V)。
(3)血清學(xué)測(cè)定用10ml一份的樣品進(jìn)行異丙醇(IPA)分離小型研究和抗體終點(diǎn)的散射濁度測(cè)定，結(jié)果Pn14-Ps在35-45%IPA之間沉淀。
(4)第一次加入IPA加入706ml IPA(室溫下攪拌滴加)，使經(jīng)水解過的樣品(容積1090ml，得自上述步驟2)達(dá)到39.3%IPA。將樣品攪拌15-30分鐘，然后在11000xg離心30分鐘(Beckman JA-10離心機(jī)9000rpm，20℃)，倒去上清液。在250ml Omnimixjar中用無水EtOH研制留下的碎片，再用60ml燒結(jié)玻璃漏斗收集。在漏斗上先后用無水EtOH和丙醇直接洗滌沉淀物，在室溫下用CaCl2真空干燥，可用于分析。
(5)第二次加入IPA和回收產(chǎn)物在室溫和攪拌下，滴加73.5ml IPA，使原39.3%IPA上清液(容積1712ml，得自上述步驟4)達(dá)到41.8%IPA。按上述步驟4的方法，研制、收集、洗滌和干燥碎片。Pn14-Ps產(chǎn)品的重量為1.399mg。
(6)滲析和冰凍干燥在室溫下將由步驟5得到的1385.6mg一份的樣品溶解于554ml蒸餾水中2-3小時(shí)。將溶液(2.5mg/ml)轉(zhuǎn)移到滲析管中(1200MW斷流45mm)，用蒸餾水滲析27小時(shí)，再用蒸餾水更換2次。然后將經(jīng)過滲析的樣品凍凍干燥并中，在干冰-甲醇浴中密閉冰凍，并用Virtis(Freezemobil)冰凍干燥器冰凍干燥2-1/2天至干?；厥?326.8mg最終產(chǎn)物Pn14-Ps，Kd為0.56。
由以上介紹，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員顯然知道，其他中性的Pn-Ps亞型，例如Pn7F-Ps，可按本申請(qǐng)公開的方法制備和結(jié)合，因?yàn)镻n14-Ps也屬于中性多糖。
實(shí)施例7外膜蛋白復(fù)合物與肺炎球菌14多糖的結(jié)合，Pn14-Ps-OMPCa.Pn14-Ps的1，4-丁二胺衍生物的制備(14-BuA2)410mg的Pn14-Ps在用P2O5真空貯藏3小時(shí)后，加26ml二甲亞砜(DMSO)攪拌0.75小時(shí)，溶解，加入62mg羰二亞酰胺吡咯，生成的溶液在室溫下攪拌80分鐘。
制備含有1.067g 1，4-丁二胺二鹽酸鹽(BuA2·2HCl)的水(38.5ml)溶液，并用2.5N NaOH將其pH調(diào)至10.20。該溶液經(jīng)Millex 0.2μm GV漏斗過濾，在冰浴中冷卻。
將熟化的MDSO溶液加到冷卻的BuA2溶液中，在冰浴中再攪拌10分鐘，在室溫下熟化50分鐘，然后將溶液裝到2個(gè)12″長的Spectrapor 2滲析管上，從液體頂部切下1cm與以下所述滲析(1)15升0.1M磷酸鈉緩沖液(ph7.0，16.5小時(shí));(2)15升0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.0，8小時(shí));(3)15升0.1M磷酸鈉緩沖液(ph7.0，8小時(shí));(4)15升水(17.5小時(shí))。然后冰凍干燥，得到Pn14-Ps的1，4-丁二胺衍生物(Pn14-BuA2)。
將丁二胺亞甲基和(Pn14-Ps)N-乙酰甲基核磁共振作對(duì)比，大約5mg樣品的NMR能譜證明每100個(gè)所限定的多糖的重復(fù)單位“裝載”大約31個(gè)丁二胺殘基。
b.Pn14-Ps的溴乙?；《费苌锏闹苽?Pn14-BuA2-BrAc)210mg的Pn14-BuA2加36ml 0.1M硼酸-磷酸鹽緩沖液(pH9.0)，攪拌2.5小時(shí)，生成溶液。然后加入195mg溴乙酸硝基苯酯溶解于4ml乙腈的溶液。生成的混合物在4℃下攪拌21小時(shí)，在Spectrapor的2個(gè)滲析管中對(duì)以下所述進(jìn)行滲析(1)15升蒸餾水(6小時(shí));(2)15升蒸餾水(14.5小時(shí));(3)15升水(6小時(shí))。從滲析袋的滲析物中取出2.0ml進(jìn)行測(cè)定，然后加入492mg干的磷酸緩沖鹽(ph8.0)(由0.1M磷酸鈉經(jīng)冰凍干燥制取，pH8.0溶液)。溶液經(jīng)2個(gè)0.2μm Corning濾斗過濾，生成Pn14-BuA2-BrAc的水溶液(pH8.0，43ml)。
c.OMPC與Pn14-BuA2-BrAc-Ps的結(jié)合將50ml的OMPC(濃度3.2mg/ml)裝到5個(gè)10ml的離心管中，在4℃下于Beckman 80Ti離心機(jī)(4300rpm，43K)離心2小時(shí)。通過將350mg EDTA(乙烯二胺四乙酸二鈉鹽)和64mg/二硫蘇糖醇(DTT)溶解于30ml的Na2B4O7緩沖液(pH11.0)制備)硫醇化混合物。然后加入346mg N-乙酰高半胱氨酸硫代內(nèi)酯，該溶液經(jīng)0.2μm Corning漏斗(杯形)過濾。
由上述離心得到的碎片各用3ml經(jīng)過濾過的硫醇混合物(總量15ml)沉淀后，轉(zhuǎn)移到Dounce均勻器中再懸浮，管子用5ml硫醇化溶液連續(xù)轉(zhuǎn)移進(jìn)行漂洗，再用5ml硫醇化溶液重復(fù)漂洗過程，將漂洗液合并后在Dounce均勻器中均勻化，然后將全部懸浮材料(25ml)轉(zhuǎn)移到100ml圓底燒瓶中。
在采用Firestone閥進(jìn)行隔膜密封和氮?dú)馊〈諝夂螅磻?yīng)混合物熟化21小時(shí)，然后將25ml反應(yīng)混合物分裝3個(gè)離心管，每個(gè)都用1M KH2PO4(水)拔頂，在43K rpm和4℃下離心2小時(shí)。除去上清液，將碎片懸浮在0.1M磷酸鈉緩沖液(pH8.0)中(最終懸浮液的總?cè)莘e為30ml)。
然后進(jìn)行另一個(gè)超速離心(2小時(shí)，4℃，43K rpm)。除去上清液后，按Dounce方法將碎片懸浮在如上所制備的經(jīng)過過濾的Pn14-BuA2-ArAc溶液中，經(jīng)Ellman方法測(cè)定，硫醇的總量約為23微摩爾。
需要注意Pn14-BuA2-BrAc溶液的過濾是在懸浮硫醇蛋白之前。生成的反應(yīng)(即Pn14-BuA2-BrAc與硫醇OMPC反應(yīng))在氮?dú)庀渲械牡獨(dú)?排氣)和室溫下熟化114小時(shí)。
反應(yīng)按如下所述方法戴帽(即使Pn14-Ps和OMPC的反應(yīng)部分失活)加入含75mg N-馬來酰亞胺(NEM)的磷酸鈉緩沖液(5ml，pH8.0，0.1M)的溶液，混合物再熟化22.5小時(shí)。
將戴帽的反應(yīng)混合物(35ml)分裝在4個(gè)離心管中進(jìn)行離心(43K，小時(shí)，4℃)，碎片懸浮在40ml TED緩沖液(0.1M Tris，0.01M EDTA，0.5%DOC，pH8.5)，于室溫下熟化19小時(shí)。然后將溶液離心(43K，2小時(shí)，4℃。碎片懸浮在40ml 0.1M4磷酸鈉緩沖液(pH8)中，然后再離心(43K，2小時(shí)，4℃)。將這些碎片再懸浮在44ml水中，于4℃下熟化17小時(shí)。倒去少量碎片后進(jìn)行低速離心(1000rpm，3.5小時(shí))。除去上清液，生成43ml的大量結(jié)合物，其分析特征如下
測(cè)定 結(jié)果a.Ps含量 387mcg/mlb.蛋白 1300mcg/mlPs/蛋白比(理論值) 0.30c.游離Ps ＜5面積%d.氨基酸分析SCMHC/賴氨酸 9.8%SCMC/賴氨酸 3.5%實(shí)施例8Pn23F-Ps中間體的制備(1)超聲水解在室溫下將3.0g Pn23F-Ps粉末攪拌溶解于1200ml鹽水(0.9% NaCl)中約4小時(shí)。在塑料杯和冰浴中，用Branson超聲發(fā)生器(1/2英寸探頭，8個(gè)裝置)超聲處理溶液，每隔3分鐘處理1次，總的處理時(shí)間為15分鐘)，每個(gè)間隔后檢查粘度。15分鐘后，再超聲處理5分鐘，得到的粘度終點(diǎn)為1，206厘沲。將水解過的樣品升至室溫，加入乙酸鈉試劑(58.4g)，使最終濃度達(dá)3%(W/V)。
(2)血清學(xué)測(cè)定用每份10ml樣品進(jìn)行異丙醇(IPA)分離的小型研究和對(duì)抗體終點(diǎn)的散射濁度測(cè)定，結(jié)果證明Pn23F-Ps在35-45%IPA沉淀。
(3)第一次加入IPA加入810ml IPA(室溫下攪拌滴加)，使水解樣品(溶積1165ml，取自上述步驟1)增至41.0%IPA。將樣品攪拌15-30分鐘，然后在11000xg離心30分鐘(Beckman JA-10離心機(jī)，8000rpm，20℃)。廢碎片在250ml Omnimix jar中用無水EtOH研制，然后在60ml燒結(jié)玻璃漏斗上收集。先后用無水EtOH和丙酮直接在漏斗上洗滌沉淀物，在室溫下用CaCl真空干燥，準(zhǔn)備用于分析。
(4)第二次加入IPA和回收產(chǎn)物室溫下攪拌滴加85.0ml IPA，使41.0% IPA上清液(容積1925ml，取自上述步驟3)增至43.5% IPA。按上述步驟3，進(jìn)行樣品熟化和離心。按上述步驟3，研制、收集、洗滌和干燥碎片。Pn23F-Ps產(chǎn)物的重量為1.795mg。
(6)滲析和冰凍干燥在室溫下將由步驟4得到的1779mg一份的Pn-Ps樣品溶解于712ml蒸餾水中3-4小時(shí)。將溶液(2.5mg/ml)轉(zhuǎn)移到滲析管中(1200MW斷流45mm)，于4℃下用蒸餾水滲析27小時(shí)，再用蒸餾水更換2次。然后將經(jīng)過滲析的樣品冰凍干燥并中，在干冰-甲醇浴中密閉冰凍，并用Virtis(Freezemobil)冰凍干燥器冰凍干燥2-3天?；厥?703mg最終產(chǎn)物Ps，Kd為0.60。
實(shí)施例9外膜蛋白復(fù)合物與Pn23F-Ps中間體的結(jié)合a.Dowex 50X2(200-400目)四丁銨型樹脂(Dowex 50(Bu4N+))的制備Dowex 50X2(200-400目)H+型(72g)在水中制成漿料(這些過程所用的水全部是無熱原的無菌蒸餾水)后，裝到柱上，并按下述步驟洗滌(1)800ml水;(2)400ml 6N HCl;(3)300ml水，洗至流出物在pH試紙上呈中性;(4)250g的10%氫氧化四丁銨水溶液，洗至流出物在pH試紙上呈強(qiáng)檢性;(5)750ml水。
b.Pn23F-Ps四丁銨型(Pn23F(BU4N+))的制備用70ml水洗滌34ml的Dowex 50X2(BU4N+)柱。450mg經(jīng)篩過的Pn23F-Ps+50ml水，攪拌0.5小時(shí)。將該溶液施用于柱上，由于重力作用進(jìn)行滲析(約2小時(shí))，柱底呈真空，在真空下再繼續(xù)洗脫1小時(shí)。用25ml水洗柱，將流出液合并后冰凍干燥，得到0.5g Pn23F(Bu4N+)鹽。在真空干燥器中用P2O5貯藏約17小時(shí)。
c.Pn23F-Ps的1，4-丁二胺衍生物(Pn23F-BuA)的制備取自上述步驟b的0.5g Pn23F(Bu4N+)加25ml二甲亞砜(DMSO)，攪拌15分鐘后溶解。加入22mg羰二亞酰胺吡咯(CDI)，生成的溶液在室溫下攪拌0.5小時(shí)。
制備含507mg 1，4-丁二胺二鹽酸鹽(BuA·2HCl)的水(32ml)溶液，用2.5N NaOH將其pH調(diào)至10.23。該溶液經(jīng)Millex 0.2μm GV漏斗過濾，在冰浴中冷卻。
將熟化的DMSO溶液加到冷BuA溶液中，再在冰浴中攪拌1小時(shí)，在室溫下熟化1小時(shí)。然后將該溶液裝到2×12″Spectrapor滲析管中，從液體頂部切下1cm進(jìn)行下述滲析(1)15升0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.0，16小時(shí));(2)15升0.01M磷酸鈉緩沖液(pH7.0，10.5小時(shí));(3)15升0.01M磷酸鈉緩沖液(pH7.0，12.5小時(shí));(4)15升水(10.5小時(shí))。然后冰凍干燥，得到220mg Pn23F-Ps的1，4-丁二胺衍生物(Pn23F-BuA)。
將丁二胺亞甲基與Pn23F的鼠李糖甲基的核磁共振對(duì)比，每100個(gè)限定的多糖的重復(fù)單位“裝載”大約23.5丁二胺殘基。
d.Pn23F-Ps的溴乙?；《费苌锏闹苽?Pn23F-BuA2-BrAc)214mg的Pn23F-BuA2加23ml 0.1M硼酸-磷酸鹽緩沖液(pH9.0)，攪拌30分鐘，生成溶液。然后加入230mg溴乙酸硝基苯酯溶解于6ml乙腈的溶液。生成的混合物在4℃下攪拌23小時(shí)，在Spectrapor 2滲析管中對(duì)以下所述進(jìn)行滲析(1)15升水(8小時(shí));(2)15升水(12小時(shí));(3)15升水(6小時(shí))。從滲析袋的滲析物中取出1.5ml進(jìn)行測(cè)定，然后加入490mg干的磷酸緩沖鹽(pH8.0)(由0.1M磷酸鈉經(jīng)冰凍干燥制取，pH8.0溶液)。大約需要15分鐘溶解，然后溶液經(jīng)0.2μm Corning濾斗過濾，生成Pn23F-BuA2-BrAc的水溶液(pH8.0)。
e.OMPC與Pn23F-BuA2-BrAc-Ps的結(jié)合將60ml的OMPC(3.1mg/ml)裝到6個(gè)10ml的離心管中，在4℃下于Beckman 80Ti離心機(jī)(43000rpm，43K)離心2小時(shí)。通過將260mg EDTA(乙烯二胺四乙酸二鈉鹽)和52mg/二硫蘇糖醇(DTT)溶解于30ml的Na2B4O7硫代內(nèi)酯制備)硫醇化混合物。然后加入346mg N-乙酰高半胱氨酸硫代內(nèi)酯，該溶液經(jīng)0.2μm Corning漏斗(杯形)過濾。
由上述離心得到的碎片各用3ml經(jīng)過濾過的硫醇混合物(總量20ml)，轉(zhuǎn)移到Dounce均勻器中再懸浮，管子用6ml硫醇化溶液連續(xù)轉(zhuǎn)移進(jìn)行漂洗，再用4ml硫醇化溶液重復(fù)漂洗過程，將漂洗液合并后在Dounce均勻器中均勻化，然后將全部懸浮材料(28ml)轉(zhuǎn)移到100ml圓底燒瓶中。
在采用Firestone閥進(jìn)行隔膜密封和氮?dú)馊〈諝夂?，反?yīng)混合物熟化19小時(shí)，然后將28ml反應(yīng)混合物分裝3個(gè)離心管，每個(gè)都用1M KH2PO4(水)拔頂，在43K rpm和4℃下用Beckman 80Ti離心機(jī)離心2小時(shí)。除去上清液，將碎片懸浮在0.1M磷酸鈉緩沖液(pH8.0)中(最終懸浮液的總?cè)莘e為30ml)。
然后進(jìn)行另一個(gè)超速離心(2小時(shí)，4℃，43K rpm)。除去上清液后，按Dounce方法將碎片懸浮在7.I.C.3d部分制備的經(jīng)過過濾的Pn23F-BuA2-ArAc溶液中，經(jīng)Ellman方法測(cè)定，在生成的溶液中，硫醇的總量約為28微摩爾。
需要注意Pn23F-BuA2-BrAc溶液的過濾是在懸浮硫醇蛋白之前。生成的反應(yīng)(即Pn23F-BuA2-BrAc與硫醇OMPC反應(yīng))在氮?dú)庀渲械牡獨(dú)?排氣)和室溫下熟化117小時(shí)。
反應(yīng)按如下所述方法戴帽(即使Pn23F-Ps和OMPC的反應(yīng)部分失活)將含75mg N-馬來酰亞胺(NEM)的磷酸鈉緩沖液(5ml，pH8.0，0.1M)的溶液，(經(jīng)0.22μm漏斗過濾)加到反應(yīng)物中，再熟化18小時(shí)。
戴帽的結(jié)合混合物(35ml)分裝在4個(gè)離心管中進(jìn)行離心(43K，小時(shí)，4℃)，碎片懸浮在40ml TED緩沖液(0.1M Tris，0.01M EDTA，0.5%DOC，pH8.5)，于室溫下熟化19小時(shí)。然后將溶液離心(43K，2小時(shí)，4℃。碎片懸浮在40ml 0.1M4磷酸鈉緩沖液(pH8)中，然后再離心(43K，2小時(shí)，4℃)。將這些碎片再懸浮在44ml水中，于4℃下熟化17小時(shí)。倒去少量碎片后進(jìn)行低速離心(1000rpm，3.5小時(shí))。除去上清液，生成43ml的大量結(jié)合物，其分析特征如下測(cè)定 結(jié)果a.Ps含量 387mcg/mlb.蛋白 1300mcg/mlPs/蛋白比(理論值) 0.30c.游離Ps ＜5面積%d.氨基酸分析SCMHC/賴氨酸 9.8%SCMC/賴氨酸 3.5%載帽結(jié)合混合物的總體積是38.5ml，加入1.5ml pH8.0的0.1M磷酸鈉緩沖液，使其總體積增至40ml。將35ml該溶液等量地加到4個(gè)10ml離心管中，每個(gè)都用0.1M的磷酸鈉緩沖液(pH8)拔頂，然后離心(43Krpm，2小時(shí)，4℃)。除去上清液，各個(gè)離心管中的碎片都用8ml TED緩沖液(1M Tris，pH8.5，0.01M EDTA，0.5%脫氧膽酸鈉)沉積，并且轉(zhuǎn)移到Dounce均勻器中。離心管再8ml TED緩沖液連續(xù)漂洗，再將碎片懸浮(總體積40ml)，并在室溫下熟化20小時(shí)。熟化的材料按如上所述，在4個(gè)10ml離心管中離心(43K，2小時(shí)，4℃)，每管中的碎片用8ml TED緩沖液沉積，離心管用8ml TED緩沖液連續(xù)漂洗，再按如上所述，進(jìn)行再懸浮和離心。然后將這些碎片懸浮在總量為40ml的0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7)中，并按如上所述，再進(jìn)行離心，將碎片懸浮在總量為44ml水中，在4℃下熟化17小時(shí)。通過低速離心(1000rpm，3.5分鐘)，除去少量不溶物，使產(chǎn)物在上清液中。
生成的上清液是一種藥物即堆積結(jié)合疫苗。結(jié)合物具有下列分析特征測(cè)定 結(jié)果a.Ps含量 284mcg/ml
b.蛋白質(zhì) 2025mcg/mlPs/蛋白比(理論值) 0.14c.游離Ps ＜5面積%d.氨基酸分析SCMHC/賴氨酸 6.7%SCMC/賴氨酸 1.6%實(shí)施例10由Gaulin均勻化方法制備Pn-Ps在4℃下將肺炎球菌粉末粗制品通過混合過液，溶解于水中，濃度為1.5mg/ml，也可制備10mg/ml濃度較高的Pn-Ps溶液。加入50mM CaCl2可使粘度為10mg/ml的溶液降低到粘度為1.5mg/ml的溶液。將已經(jīng)溶解的Pn-Ps通過Gaulin均化器中的一個(gè)壓力裝置(該均化器共有2000，5000，10000和15000Psi四個(gè)壓力裝置)。加入60%異丙醇(由2M原料制成50mM的CaCl2溶液)，收集切變的Pn-Ps。碎片在綜合混合器中用100%乙醇洗滌，過濾回收沉淀的Pn-Ps。在漏斗上用丙酮洗滌Pn-Ps，然后用硫酸鈣(燥石膏)干燥。整份切變Pn-Ps的大約1mg/ml懸浮，用HPSEC通用標(biāo)定分析分子大小和多分散度，用速率散射濁度測(cè)定分析抗原性指數(shù)Pn-Ps亞型 抗原性開始降低時(shí)的分子量 多分散度6B 500000 1.1914 300000 1.1519F 350000 1.0923F 250000 1.15實(shí)施例11小鼠T細(xì)胞刺激進(jìn)行此項(xiàng)測(cè)定是為了確定Pn-Ps結(jié)合物疫苗在小鼠中的T細(xì)胞依賴性和免疫性。由于2歲以下兒童通常對(duì)T依賴抗原的應(yīng)答通常都很好，所以此模型非常適用。無胸腺小鼠具有不正常胸腺表皮，因此其對(duì)T依賴抗原的應(yīng)答顯著低于其正常的同類小鼠。
以0.5μg多糖劑量稀釋的疫苗腹膜內(nèi)注射到成年無胸腺小鼠(nu/nu)和同類對(duì)照小鼠(nu/+)，注射時(shí)間在0，7和28天。一周后小鼠出血，用放射性免疫測(cè)定法(RIA)測(cè)定其血清的抗體應(yīng)答。
在放射性免疫測(cè)定中，將每個(gè)小鼠血清與C標(biāo)記Pn-Ps混合。加入飽和硫酸銨，沉淀出所形成的抗原-抗體復(fù)合物。用β計(jì)數(shù)管計(jì)算各已處理過的樣品(1分鐘)。按這種方法測(cè)定本發(fā)明的Pn6B-Ps-OMPC，Pn14-Ps-OMPC，Pn19F-Ps-OMPC，Pn23F-Ps-OMPC，Pn18C-Ps和Pn4-Ps結(jié)合物，發(fā)現(xiàn)在Nu/+小鼠可非常好地誘導(dǎo)T細(xì)胞刺激。
實(shí)施例12嬰獼猴中Pn-Ps結(jié)合物的免疫原性此項(xiàng)測(cè)定是為了確定本體結(jié)合物或裝滿Pn-Ps-OMPC的容器或Pn-Ps-MIEP結(jié)合物疫苗在嬰猴中的免疫原性。業(yè)已證明，嬰猴模型對(duì)Pedvax HIB結(jié)合物疫苗來說是一個(gè)極佳預(yù)測(cè)者(參閱Vella et a.，Pediatrics，April 5 Suppl.，pp.668-675，1990)，因此，被選作評(píng)估Pn-Ps結(jié)合物疫苗的模型。
將疫苗劑量肌內(nèi)注射(0.25ml注射兩個(gè)部位)2-3目令嬰猴，注射時(shí)間0天和28天。在0、28和42天時(shí)，嬰猴出血。通常放射性免疫測(cè)定法(RIA)測(cè)定各血清的抗體應(yīng)答。
在放射性免疫測(cè)定中，將各獼猴血清與C標(biāo)記Pn-Ps混合，加入飽和硫酸銨，沉淀出所形成的抗原-抗體復(fù)合物。各處理過的樣品用β計(jì)數(shù)管計(jì)數(shù)(1分鐘)。在獲得2個(gè)劑量疫苗后，結(jié)果至少50%試驗(yàn)動(dòng)物具有至少1μg抗體應(yīng)答，則對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答是令人滿意的。
業(yè)已證明，Pn6B-Ps-OMPC，Pn23F-Ps-OMPC，Pn19F-Ps-OMPC，Pn18C-Ps-OMPC，Pn4-Ps-OMPC和Pn14-Ps-OMPC能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗類型特異性抗體應(yīng)答。此外，包括Pn6B-Ps-OMPC，Pn23F-Ps-OMPC，Pn19F-PS-OMPC和Pn14-Ps-OMPC的四價(jià)組合物對(duì)4個(gè)血清型都具有良好的抗-Pn-Ps-抗體應(yīng)答。
實(shí)施例13肺炎球菌結(jié)合物在絨鼠體內(nèi)的保護(hù)效果將吸附在Al(OH)上的0，0.25，1.0，或4.0μg的Pn6B-Ps-OMPC通過皮下或肌內(nèi)注射到各絨鼠內(nèi)。在0，2，4，6和8周時(shí)，絨鼠出血。注射后8周，用肺炎鏈球菌6B攻擊絨鼠，每隔1-3天用耳鏡和鼓膜測(cè)定法檢測(cè)。吸出中耳滲出液進(jìn)行培養(yǎng)，攻擊2周后殺死動(dòng)物，將殺死的動(dòng)物分析其中耳組織病理學(xué)。未施用結(jié)合物的動(dòng)物，其死亡率達(dá)60%，施用最低劑時(shí)的動(dòng)物，死亡率為0%。對(duì)化膿性中耳類的動(dòng)物，未施用結(jié)合物的動(dòng)物，其死亡率達(dá)60%，施用量低劑量的動(dòng)物，死亡率為0%。對(duì)化膿性中耳炎的動(dòng)物，未施用結(jié)合物沒有保護(hù)作用，而施用結(jié)合物的，則所有劑量都獲得60-100%的保護(hù)。
實(shí)施例142-5歲兒童的抗肺炎球菌的免疫應(yīng)答采用RIA和ELISA方法，對(duì)2-5歲兒童施用0.5或5μg Pn6B-Ps后，測(cè)定其所產(chǎn)生的抗Pn6B-Ps抗體。結(jié)果證明，抗Pn6B-Ps抗體顯著增加。
實(shí)施例15肺炎球菌多糖的速率散射濁度測(cè)定此項(xiàng)測(cè)定的目的在于采用速率散射濁度測(cè)定方法測(cè)定多糖含量和游離Pn-Ps和結(jié)合物制劑的抗原性指數(shù)。
由于每單位Pn-Ps質(zhì)量的應(yīng)答不同，不同Pn-Ps的速率散射濁度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍也各有差異，而且對(duì)Pn-Ps抗原濃度構(gòu)型的線性部分在不同的Pn-Ps中也各有不同。本文所給出的實(shí)施例特指Pn6B結(jié)合物，并未一定用于其他Pn-Ps類型的結(jié)合物。此外，吸附鋁的樣品及其各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線都用3%檸檬酸鈉而不是用0.9% NaCl(詳述于后)。結(jié)合物水制劑樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線(即非吸附在鋁上)則0.9% NaCl稀釋，并且稀釋到標(biāo)準(zhǔn)曲線的限定范圍內(nèi)所期望的標(biāo)準(zhǔn)濃度。
(A)試劑
鹽溶液0.9% NaCl水溶液抗Pn-Ps血清抗血清(Health Research，Inc.，Albang，NY)經(jīng)鹽溶液稀釋30倍。
標(biāo)準(zhǔn)由387μg/ml貯血溶液制備1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和4.0mcg/ml Pn-Ps結(jié)合物標(biāo)準(zhǔn)樣品，采用多糖的苯酚硫酸測(cè)定法測(cè)定其濃度。
試樣將檸檬酸鈉制備制備成最終濃度為3%檸檬酸鈉，并將試樣稀釋到1.0，2.0和3.0mcg Pn-Ps/ml的理論濃度。
(B)方法使用Beckman ICS速度散射濁度測(cè)定儀測(cè)定全部樣品和標(biāo)準(zhǔn)，每份樣品測(cè)定兩份。由標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定樣品濃度。計(jì)算方法是樣品濃度稀釋倍數(shù)，然后平均各試樣的值。
應(yīng)該注意的是采用此方法得到的樣品，結(jié)合的抗原性指數(shù)低于70%均被剔除，以保證所用Pn-Ps具有所需要的免疫特征。
實(shí)施例16克隆編碼MIEP的基因組DNA將大約0.1g苯酚失活的腦膜炎雙球菌細(xì)胞(見實(shí)施例1)置于干凈試管中，然后將該細(xì)胞懸浮在567μl TE緩沖液(10mM TRIS-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中，將30μl 10% SDS和3μl 20mg/ml蛋白酶K(Sigma)加到該懸浮細(xì)胞中。細(xì)胞混合后，在37℃下溫育約1小時(shí)。然后加入100μl 5M Na·Cl，充分混合。再加入80μl 1%十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)的0.7M NaCl溶液，充分混合后在65℃下溫育10分鐘。加入等體積(約0.7至0.8ml)的氯仿/異戊醇(24∶1)，充分混合后在約10000xg離心5分鐘左右。將上部的水相轉(zhuǎn)移到新的試管中，倒去有機(jī)相。將等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)加到水相中，充分混合，在10000xg離心約5分鐘，將上層的水相轉(zhuǎn)移到新的試管，加入0.6體積(約420μl)異丙醇，充分混合，沉淀出的DNA在1000xg離心10分鐘，倒去上清液，碎片用70%乙醇洗滌。將DNA碎片干燥后懸浮在100μl TE緩沖液中，得到腦膜炎雙球菌基團(tuán)組DNA。
合成2個(gè)DAN寡核苷酸，相當(dāng)于MIPE基因的5′端和MIEP基因的3′端(Murakami，E.C.et al.，1989，Infection and Immunity，57，pp.2318-23)。對(duì)MIPE基因的5′端和3′端具有特異性的DNA寡核苷酸的順序分別是5′-ACTAGTGCAATGAAAAAATCCCTG-3′和5′-GAATTCAGATTAGGAATTTGTT-3′。用10ng腦膜炎雙球菌基因組DNA，使這些DNA寡核苷酸用作聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增MIEP基因的引物。PCR擴(kuò)增步驟可按制備商(Perkin Elmer)提供的方法進(jìn)行。經(jīng)過擴(kuò)增的MIEP DNA用核酶內(nèi)切限制酶SpeⅠ和EcoRⅠ消化，用1.5%瓊脂凝膠電滬法分離和到含有完整的MIEP編碼區(qū)的1.3仟鹼基對(duì)(Kb)DNA片段，經(jīng)電洗脫后從凝膠上回收該DNA片段(參閱Current Protocols in Molecular Biology，1989，Ausubel，R.M.，Brent，R.，Kingstion，R.E.，Moore，D.D.，Smith，J.A.，Seidman，J.G.and Struhl，K.，eds.，Greene Publishing Assoc.)。
用SpeⅠ和EcoRⅠ消化質(zhì)粒載體pUC-19。將經(jīng)凝膠純化的SpeI-EcoRI MIEP DNA連接到SpeI-EcoRI pUC-19載體，并勝于轉(zhuǎn)大腸桿菌DH5。含有1.3Kbp MIEP DNA的pUC-19載體的轉(zhuǎn)化株經(jīng)核酸內(nèi)切限制酶圖譜鑒定。MIEP DNA編碼順序具有同一性。
實(shí)施例17pCl/lGallop(B)ADHlt載體的構(gòu)建通過凝膠純化經(jīng)Sau3A和HindⅢ裂解后得到的0.5Kbp片段的方法，由質(zhì)粒YEp52分離出Gal 10啟動(dòng)子(參閱Broach，et al.，1983，in Experimental Manipulation of Gene Expression，Inouye，M(Ed)Academic Press pp.83-117)。通過凝膠純化由HindⅢ和SpeⅠ裂解得到的0.35Kbp片段，由載體pGAP·tADH2分離出AMH1終止區(qū)(參閱Kniskern，et al.，1986，Gene，46，pp.135-141)。用T4 DNA連接酶將上述2個(gè)片段連接為凝膠純化的pUC18△HingⅢ載體(通過用HindⅢ消化pUC18，用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的克諾夫片段使其成為鈍端和用T4 DNA連接酶連接，除去了HindⅢ位點(diǎn))，該載體已用BamHⅠ和SphⅠ消化，制成親代載體pG110-tADHI。在Gallop·ADHlt的連接處具有單-HindⅢ克隆位點(diǎn)。
通過用HindⅢ消化pGA110·tADHl，凝膠純化切割DNA和用T4 DNA連接酶連接到下列HindⅢ-BamHⅠ聯(lián)結(jié)子5′-AGCTCGGATCCG-3′，3′-GCCTAGGCTCGA-5′，將pGA110·tADH1的HindⅢ克隆位點(diǎn)改變?yōu)閱我籅amHⅠ克隆位點(diǎn)。
形成的質(zhì)粒pGa110(B)tADH1已經(jīng)缺失HindⅢ位點(diǎn)，形成了單一BamHⅠ克隆位點(diǎn)。
通過用SmaⅠ和SphⅠ消化，用T4 DNA聚合酶形成鈍端和凝膠純化，由pGa110(B)tADH1分離出Ga110p·tAHD1片段。用SphⅠ消化酶母往復(fù)性載體pC1/1聚合酶使之成為鈍端和純化(參閱Brake et al.，1984，Proc.Nat′l，Acad.Sci.USA，81，pp.4642-4646)。用T4 DNA連接酶將該片段與載體連接。連接反應(yīng)混合物用于將大腸桿菌HB101細(xì)胞轉(zhuǎn)化為氨芐西林抗性，通過與32P-標(biāo)記的HindⅢ-BamHⅠ聯(lián)結(jié)子的單鏈雜交篩選轉(zhuǎn)化株。新載體的構(gòu)建體pC1/1·Ga110p(B)ADHlt經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ消化予以確證。
實(shí)施例18用MIEP+前導(dǎo)DNA順序構(gòu)建酶母MIEP表達(dá)載體通過用SpeⅠ和EcoRⅠ消化pUC19·MIEP＃7，凝膠純化MIEP DNA和用T4 DNA連接酶使之成為鈍端，得到含有MIEP完整編碼區(qū)的DNA片段。
用BamHⅠ(經(jīng)牛腸鹼性磷酸酶脫磷酸化處理)消化酵母內(nèi)源表達(dá)載體pC1/1·Ga110p(B)ADHlt，并用T4 DNA聚合酶使之成為鈍端，DNA經(jīng)凝膠純化后去除未切割的載體。
將MIEP的1.1Kbp鈍端片段與鈍端pC1/1·Ga110p(B)ADHlt載體連接，并將連接反應(yīng)混合物用于轉(zhuǎn)化對(duì)氨芐西林抗性感受的大腸桿菌DH5細(xì)胞。通過與32P標(biāo)記的DNA寡核苷酸5′…AAGCTCGGATCCTAGTTGCAATG…3′雜交，篩選轉(zhuǎn)化株。所述寡核苷酸的順序與重疊MIEP-載體連接片的順序具有同源性。由正雜交轉(zhuǎn)化株得到DNA制劑，并用KpnⅠ和SalⅠ消化，證實(shí)MIEP是在由Ga110啟動(dòng)子表達(dá)的正確方向上。通過由Ga110啟動(dòng)子至MIEP編碼區(qū)的二脫氧順序，可進(jìn)一步證實(shí)DNA構(gòu)建。
由轉(zhuǎn)化株表達(dá)的MIEP可通過Western印跡分析進(jìn)行檢查。在轉(zhuǎn)化株中產(chǎn)生的重組MIEP在聚丙酰胺凝膠上與由MOPC泡純化的MIEP同時(shí)移動(dòng)，并且與對(duì)MIEP有特異性的抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)。
實(shí)施例19用5′修飾的MIEP DNA順序構(gòu)建酵母MIEP表達(dá)載體采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，制備含HindⅢ位點(diǎn)、保守的酵母5′未轉(zhuǎn)譯前導(dǎo)順序(NTL)、蛋氨酸啟始密碼子(ATG)、成熟的MIEP的前89個(gè)密碼子(在+20位上以Asp開始)和KpnⅠ位點(diǎn)(在+89位上)的DNA寡核苷酸。進(jìn)行PVR可按制造商所述(Perkin Elmer Cetus)。用質(zhì)粒pUC19 MIEP 42＃7作為模板和DNA寡聚體5′-CTAAGCTTAACAAATGGACGTTACCTTGTACGGTACAATT-3′和5′-ACGGTACCGAAGCCGCCTTTCAAG-3′作為引物。
為了去除MIEP克隆的5′區(qū)，用KpnⅠ和HindⅢ消化質(zhì)粒pUC19 MIEP42＃7和用瓊脂凝膠化3.4Kpb載體片段。T280 pb PCR片段用KpnⅠ和HindⅢ消化，瓊脂凝膠純化和用3.4Kbp載體片段連接。通過DNA寡核苷酸雜交，篩選大腸桿菌HB101(BRL)轉(zhuǎn)化株，通過限制性酶消化，分析由正轉(zhuǎn)化株得到的DNA。為了保證在PCR步驟中不導(dǎo)入突變，將280pb PCR產(chǎn)生的正轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)的DNA編排順序。形成的質(zhì)粒含有由酵母NTL、ATG密碼子和在Asp密碼子(氨基酸+20)位上開始的MIEP的整個(gè)開放讀碼(ORF)組成的HindⅢ-EcoRⅠ插入物。
酵母MIEP表達(dá)載體的構(gòu)建如下pGAL10/pC1/1t pGAP/pC1/1載體(參閱Vlasuk，G.P.，et al.，1989，J.B.C.，264，pp.12106-12112)用BamHⅠ消化、DNA聚合酶Ⅰ的克列諾夫片段使之成為平端和用牛腸鹼性磷酸酶脫磷酸化。這些線性載體用經(jīng)克列諾夫處理過的并經(jīng)凝膠純化過的HindⅢ-EcoRⅠ片段(含有酵母NTL)，按以上所述進(jìn)行連接，MIEP的ATG和ORF形成pGa110/pC1/1-MIEP和pGAP/pC1/1-MIEP。
用質(zhì)粒pGa110/pC1/1-MIEP轉(zhuǎn)化釀酒酵母株U9(ga110pga14-)，分離出重組克隆和檢查MIEP的表達(dá)。在37℃下，在含有2%葡萄糖(W/V)的合成培養(yǎng)基(leu-)中將克隆體搖動(dòng)培養(yǎng)到O.D.660約為6.0。然后將半乳糖加到2%(W/V)，誘導(dǎo)由Ga100啟動(dòng)子的MIEP的表達(dá)。再將該細(xì)胞培養(yǎng)45小時(shí)，然后用半乳糖誘導(dǎo)到O.D.600約為9.0。離心收集細(xì)胞，細(xì)胞碎片則用蒸餾水洗滌和冰凍。
重組MIEP的Western印跡分析為了測(cè)定酵母是否表達(dá)了MIEP，進(jìn)行了Western印跡分析。使用了12%、1mm10-15穴Novex Laemmli凝膠。在水中用玻璃珠破碎酵母細(xì)胞(在破碎過程中可用2%的十二烷基磺酸鈉(SDS))。在100000xg離心1分鐘，除去細(xì)胞碎屑。
如對(duì)聚丙酰胺凝膠純化MIEP所述，上清液與樣品移動(dòng)緩沖液混合。用OMPC作對(duì)照樣品在35mA移動(dòng)至溴苯酚蘭染料標(biāo)記物顯示凝膠。
使用NOVEX轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)移到0.45μ孔么徑的硝基纖維紙上，轉(zhuǎn)移后用5%牛血清清蛋白的磷緩沖鹽水終止基纖維紙，然后加入15ml 1∶1000的兔抗MIEP抗血清稀釋液(用標(biāo)準(zhǔn)方法通過與凝膠純化的MIEP免疫反應(yīng)制取)。在室溫溫育過液后，加入15ml 1∶1000的與羊抗兔IgG結(jié)合的鹼性磷酸酶。溫育2小時(shí)后，用FEST RE TR SALT(Sigma)和Nephthol-AS-MX磷酸鹽(Sigma)使印跡顯色。
實(shí)施例20重組MIEP的細(xì)菌表達(dá)含有1.3Kbp MIEP基因插入物的質(zhì)料pUC19-MIEP用核酸內(nèi)切限制酶SpeⅠ和EcoRⅠ消化，分離出1.1Kbp片段，用本領(lǐng)域已知常規(guī)技術(shù)在瓊酯凝膠上純化。含有2個(gè)順反子TAC啟動(dòng)子和1個(gè)單一EcoRⅠ位點(diǎn)的質(zhì)粒pTACSD用EcoRⅠ消化。按制造商的說明，用T4 DNA聚合酶(Boehinger Mannheim)在1.3Kbp MIEP DNA和pTACSA載體上形成鈍端。按制造商的說明，用T4 DNA連接酶(Boehringer Mannheim)將鈍端的1.3Kbp MIEP DNA連接到鈍端的載體。按制造商的說明，將已連接的DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5aⅠQMAX(BRL)，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞置于含25μg卡那酶素/ml和50μg青霉素/ml的瓊脂板上，在37℃下溫育在約15小時(shí)。含有MIEP同源順序折DNA寡核苷酸經(jīng)32P標(biāo)記后，按常規(guī)DNA雜交技術(shù)，用于篩選含有由轉(zhuǎn)化株板上得到的溶解變性菌落的硝基纖維濾紙。經(jīng)雜交得到的陽性菌落用核酸內(nèi)切限制酶繪圖，測(cè)定MIEP基因的取向。
由轉(zhuǎn)化株表達(dá)MIEP用Western印跡分析測(cè)定。在轉(zhuǎn)化株中產(chǎn)生的重組MIEP在聚丙酰胺凝膠上與由OMPC泡純化的MIEP一起移動(dòng)，并且與對(duì)MIEP有特異性的抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)。
實(shí)施例21Pn-Ps與腦膜炎雙球菌MIEP的結(jié)合按美國專利4882317介紹的方法進(jìn)行化學(xué)結(jié)合。
將10mg MIEP溶于3ml 0.1M硼酸緩沖液(pH11.5)，再與10mg乙烯二亞胺四乙酸二鈉鹽(EDTA，Sigma Chemicals)和4mg二硫蘇糖醇(Sigma Chemicals)混合。蛋白溶液用氮充分沖液，將N-乙酰高半胱氨酸硫代內(nèi)酯(Aldrich Chemicals)加以MIEP溶液中，混合物在室溫下溫育16小時(shí)，然后在室溫和氮?dú)庀聦?duì)含有4mM EDTA的2升0.1M硼酸緩沖液(pH9.5)透析2次，24小時(shí)。采用Ellman試劑(Sigma Chemicals)測(cè)定硫醇化蛋白中硫醇含量，并用Bradford試劑(Pierce Chemicals)測(cè)定蛋白濃度。為了使MIEP與Pn-Ps結(jié)合，將1.5倍過量(Wt/Wt)硼乙?；疨n-Ps加到MIEP溶液中，并用1N NaOH將pH調(diào)至9-9.5?；旌衔镌谑覝睾偷?dú)庀聹赜?-8小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，將25μl N-乙酰胱胺(ChemicalDynamics)加到該混合物中，在室溫和氮?dú)庀蚂o置18小時(shí)。用1N HCl將結(jié)合物溶液酸化至pH3-4，在10000xg離心10分鐘。將1ml上清液直接涂在FPLCSuprose 6B(1.6×50cm，Pharmacia)柱上，用PBS洗脫結(jié)合物。含有多糖-蛋白結(jié)合物(Pn-Ps-MIEP)的空體積峰值合并。結(jié)合物溶液經(jīng)0.22μm濾斗無菌過濾。
實(shí)施例22Pn-Ps-MIEP結(jié)合物免疫原性的測(cè)定免疫作用用2.5μg Pn-Ps的0.5ml預(yù)制的明礬溶液使IP含有與MIEP共價(jià)結(jié)合的Pn-Ps，然后將該結(jié)合物使雄小鼠(Charles River，Wilmington，MA)具有免疫力。對(duì)照小鼠用等量Pn-Ps以Pn-Ps-CRM、(Anderson，M.E.et al.，1985，J.Pediatrics，107，pp.346-351)(2.5μg Pn-Ps/6.25μg CRM;人用劑量的1/4)Pn-Ps-DT(2.5μg Pn-Ps/1.8μg DT;人用劑量1/10，使用恒定量Pn-Ps)和Pn-Ps-OMPC(2.5μg Pn-Ps/35μg OMPC;人用劑量的1/4)，使其具有免疫力。
用吸附在明礬上的Pn-Ps-MIEP結(jié)合物使6-13.5周的嬰獼猴免疫。每個(gè)獼猴在2個(gè)不同的注射部位施用0.25ml結(jié)合物，總劑量為0.5ml。在0，28和56天使獼猴免疫，每隔2-4周采集一次血樣。采用ELISA方法測(cè)定抗體應(yīng)答，其不同于免疫球蛋白的應(yīng)答。表示抗Pn-Ps抗體總量的RIA也可用于評(píng)估獼猴的應(yīng)答。
Pn-Ps-MIEP結(jié)合物能在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生由IgG抗Pn-Ps抗體和記憶應(yīng)答組成的免疫應(yīng)答。這與不能誘導(dǎo)可測(cè)量的抗Pn-Ps抗體的Pn-Ps-CRM和Pn-Ps-DT恰恰相反。因此，MIEP起著Pn-Ps免疫載體蛋白的作用，當(dāng)其與Pn-Ps抗原共價(jià)結(jié)合時(shí)就能產(chǎn)生抗Pn-Ps抗體應(yīng)答。于是，在制備細(xì)菌多糖結(jié)合物疫苗中，純化的MIEP是一種能取代異源OMPC的有效的免疫載體蛋白。
實(shí)施例23定量測(cè)定Pn-Ps制劑中C多糖的含量以NMR、酶或色譜方法為基礎(chǔ)，定量表示C多糖的系統(tǒng)已經(jīng)有了發(fā)展。在這個(gè)實(shí)施例中，使用了將膽鹼(C-Ps的組分)與水解Pn-Ps樣品的色譜分離，并可將這些方法與其他方法進(jìn)行對(duì)比。膽鹼在與壓縮導(dǎo)電檢測(cè)相結(jié)合的陽離子交換柱上進(jìn)行分離。
在45-65℃下，用36%氫氧酸處理Pn-Ps樣品2小時(shí)，然后在100℃下，用2M三氟乙酸處理16小時(shí)，即可使Pn-Ps樣品完全水解。水解后，將200-300μg樣品注射到Dionex Bil LC色譜系統(tǒng)中，該系統(tǒng)具有Omnipac PCX-500分析防護(hù)柱、離子Pac CTC-1陽離子分離柱、CMMS-2微膜壓縮器(用50mM四丁基氫氧化銨(10ml/分鐘)產(chǎn)生)和1μ西門子靈敏度的導(dǎo)電檢測(cè)器。用5% 200mM HCl，5%20%乙腈，85% MilliQ水，5%20mM二氨基丙酸同溶劑洗脫樣品。洗脫后膽鹼的頂峰約在10分鐘后。
使用該方法分析純化的C-Ps(由回家血清研究所提供)中的膽鹼含量，結(jié)果得到5.4%膽鹼(重量)，這個(gè)值與公開報(bào)導(dǎo)的C-Ps的膽鹼含量相一致。
通過將nm量的膽鹼(由HPLC得到)轉(zhuǎn)化為質(zhì)量值，即可將上述方法用于計(jì)算各種Pn-Ps樣品中的C-Ps濃度。將5.4%膽鹼(重量)進(jìn)行換算，就能計(jì)算C-Ps質(zhì)量(重量)。剔除C-Ps濃度超過3%的樣品，因?yàn)檫@對(duì)結(jié)合來說是不可接受的。下表給出此方法與NMR和酶方法的關(guān)系以及各種純度的Pn-Ps制劑中典型的C-Ps的C-Ps雜質(zhì)量樣品 NMR 酶方法 HPLCPn6B-Ps 10% 未測(cè) 18.4%Pn6B-Ps 1.6% 0.3-1.0% 1.2%Pn23F-Ps 未測(cè) 2.8% 3.7%Pn14-Ps 2.9% 2.4% 3.2%Pn19F-Ps 2.7% 2.6% 2.6%實(shí)施例24部分水解、純化的Pn18C-Ps的制備
(1)超聲水解在室溫下將3.0g Pn18C-Ps粉末攪拌溶解于1200ml鹽水(0.9%NaCl)中約3-4小時(shí)。在4℃下涂復(fù)和貯藏過液。在塑料杯和冰浴中，用Branson超聲發(fā)生器(1/2英寸探頭，8個(gè)裝置)超聲處理溶液，間隔20分鐘至40分鐘(5分鐘處理時(shí)間)，每個(gè)間隔后檢查粘度。40分鐘后，再超聲處理10分鐘，得到的粘度終點(diǎn)為1，218厘沲。將水解過的樣品(體積1188ml)升至室溫，加入乙酸鈉試劑(59.2g)，使最終濃度達(dá)3%(W/V)。
(2)血清學(xué)測(cè)定用每份10ml樣品進(jìn)行異丙醇(IPA)分離測(cè)定和對(duì)抗體終點(diǎn)的散射濁度測(cè)定，結(jié)果證明Pn18C-Ps在40-50%IPA沉淀。
(3)第一次加入IPA加入894ml IPA(室溫下攪拌滴加)，使水解樣品(溶積1200ml，取自上述步驟1)增至42.7%IPA。將樣品攪拌15-30分鐘，然后在11000xg離心30分鐘(Beckman JA-10離心機(jī)，8000rpm，20℃)。廢碎片在250ml Omnimix jar中用無水EtOH研制，然后在60ml燒結(jié)玻璃漏斗上收集。先后用無水EtOH和丙酮直接在漏斗上洗滌沉淀物，在室溫下用CaSO(干燥石)真空干燥，準(zhǔn)備用于分析。
(4)第二次加入IPA和回收中間產(chǎn)物室溫下攪拌滴加92.0ml IPA，使42.7%IPA上清液(容積2016ml，取自上述步驟3)增至45.2% IPA。按上述步驟3，進(jìn)行樣品熟化和離心。按上述步驟3，研制、收集、洗滌和干燥碎片。Pn18C-Ps中間產(chǎn)物的重量為1.609mg。
(5)滲析和冰凍干燥在室溫下將由步驟4得到的1612.5mg一份的Pn-Ps樣品溶解于645ml蒸餾水中2小時(shí)。將溶液(2.5mg/ml)轉(zhuǎn)移到滲析管中(1200MW斷流45mm)，于4℃下用蒸餾水滲析30小時(shí)，再用蒸餾水更換2次。然后將樣品轉(zhuǎn)移到冰凍干燥并中，在干冰-甲醇浴中密閉冰凍，并用Virtis(Freezemobil)冰凍干燥器冰凍干燥2-3天?；厥?703mg最終產(chǎn)物Ps，1487mg。
實(shí)施例25肺炎鏈球菌18C-OMPC結(jié)合物Pn18C-Ps-OMPC中間體的結(jié)合a.Dowex 50X2(200-400目)四丁銨型樹脂(Dowex 50(Bu4N+))的制備Dowex 50X2(200-400目)H+型(500g)在水中制成漿料后，裝到柱上，并按下述步驟洗滌(1)600ml水;(2)1000ml 6N HCl;(3)400ml水，洗至流出物在pH試紙上呈中性;(4)72g的10%四丁基氫氧化銨水溶液，洗至流出物在pH試紙上呈強(qiáng)檢性;(5)1000ml水至呈中性。
b.肺炎鏈球菌18C型多糖四丁銨型(Pn18C(BU N))的制備用250ml水洗滌60ml的Dowex 50X2(BU N)柱。Pn18C多糖(分子量降低到650mg)與65ml水，攪拌1小時(shí)成為溶液。將該溶液施用于柱上，由于重力作用進(jìn)行滲析(約2小時(shí)，然后在真空下1小時(shí))。用150ml水洗柱，將流出液合并后冰凍干燥，得到655mg18C(Bu N)鹽。NMR分析除去25mg，剩下為所需物質(zhì)。
c.19C(18C-BuA2)的1，4-丁二胺衍生物的制備18C(Bu N)630mg加143ml二甲亞砜(DMSO)，攪拌3.25小時(shí)后固體溶解。取出1ml用于含水量的Karl Fischer滴定，得到28.2mmoles水(總量4mmoles)加入165.1mg羰二亞酰胺吡咯(CDI)，生成的溶液在室溫下攪拌2.0小時(shí)。
制備含1.260g 1，4-丁二胺二鹽酸鹽(BuA·2HCl)的水(40ml)溶液，用2.5N NaOH將其pH調(diào)至10.20。該溶液在冰浴中冷卻。
將熟化的DMSO溶液緩慢加到冷BuA溶液中，再在冰浴中攪拌10小時(shí)，在室溫下攪拌50分鐘。然后將該溶液裝到Spectrapor 2滲析管中，從液體頂部切下1/2″進(jìn)行下述滲析(1)15升0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.0，13.0小時(shí));(2)15升0.01M磷酸鈉緩沖液(pH7.0，11小時(shí));(3)15升0.01M磷酸鈉緩沖液(pH7.0，10.8小時(shí));(4)15升水(9.5小時(shí))。此時(shí)體積為190ml，取出7.5ml整份冰凍干燥用于NMR測(cè)定，殘余182.5ml冰凍干燥至416g 18C(Pn18C-BuA2)的1，4-丁二胺衍生物。
將丁二胺亞甲基與18C的鼠李糖甲基的核磁共振對(duì)比，大約5mg NMR能譜證明，每100個(gè)限定的多糖的重復(fù)單體單位“裝載”大約10個(gè)丁二胺殘基。
d.18C的溴乙酰化丁二胺衍生物的制備(Pn18C-BuA2-BrAc)18C-BuA2(416mg)u加36ml 0.1M硼酸-磷酸鹽緩沖液(pH9.4)，攪拌30分鐘，生成溶液。然后加入256mg溴乙酸硝基苯酯溶解于6ml乙腈的溶液。生成的混合物在4℃下攪拌20小時(shí)，在Spectrapor 2滲析管中對(duì)以下所述進(jìn)行滲析(1)15升水(6小時(shí));(2)15升水(16小時(shí));(3)15升水(6小時(shí))。此時(shí)體積達(dá)60ml，從中取出1.7ml用于測(cè)定(NMR，Ouchterlony and Viscotek)，然后加入2.42g干的磷酸緩沖鹽(pH8.0)(由0.1M磷酸鈉經(jīng)冰凍干燥制取，pH8.0溶液)。溶解后，用0.2μm CORNing漏斗過濾后，使18C-BuA2-BrAc水溶液的pH為8。過濾緩慢進(jìn)行，并要求4個(gè)杯形漏斗。
e.OMPC(腦厝炎雙球菌)與Pn18C-BuA2-BrAc的結(jié)合將80ml的OMPC(腦膜炎雙球菌)(濃度3.1mg/ml)裝到4個(gè)25ml的離心管中，在4℃下于Beckman 60Ti離心機(jī)(43000rpm，43K)離心2小時(shí)。通過將680mg EDTA(乙烯二胺四乙酸二鈉鹽)和120mg/二硫蘇糖醇(DTT)溶解于40ml的Na B O緩沖液(pH11.09)制備)硫醇化混合物。然后加入326mg N-乙酰高半胱氨酸硫代內(nèi)酯，該溶液經(jīng)0.2μm Corning漏斗(杯形)過濾。
由上述離心得到的碎片各用5ml經(jīng)過濾過的硫醇混合物(總量20ml)，轉(zhuǎn)移到Dounce均勻器中再懸浮，管子用2/10ml硫醇化溶液連續(xù)轉(zhuǎn)移進(jìn)行漂洗，將漂洗液合并后在Dounce均勻器中均勻化，然后將全部懸浮材料(40ml)轉(zhuǎn)移到100ml圓底燒瓶中。玻璃容器再用20ml硫醇化溶液漂洗后，加到反應(yīng)瓶中。
在采用Fisestone閥將帶隔膜的并密封和氮?dú)馊〈諝夂?，反?yīng)混合物熟化18.5小時(shí)，然后將60ml反應(yīng)混合物分裝4個(gè)離心管，每個(gè)都用1M KH2PO4(水)拔頂，在43K rpm和4℃下離心2小時(shí)。除去上清液，將碎片懸浮在0.1M磷酸鈉緩沖液(pH8.0)中(最終懸浮液的總?cè)莘e為40ml)。將該溶液轉(zhuǎn)移到2個(gè)25ml離心管(聚碳酸酯)中，玻璃容器(DOUNCE等)用大約10ml磷酸鹽緩沖液(pH8)漂洗，并用于離心管。
然后進(jìn)行另一個(gè)超速離心(2小時(shí)，4℃，43K)。將碎片懸浮在30ml的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH8)中，經(jīng)Ellman方法測(cè)定，SH的總量約為24微摩爾或約100nmoles/mg OMPC。將硫醇蛋白轉(zhuǎn)移到100ml圓底燒瓶，并加經(jīng)過濾過的Pn18C-BuA2-BrAc溶。生成的反應(yīng)(即Pn18C-BuA2-BrAc與硫醇OMPC反應(yīng))在氮?dú)庀渲械牡獨(dú)?排氣)和室溫下熟化89小時(shí)。
反應(yīng)按如下所述方法戴帽用0.22μm漏斗過濾含75mg N-馬來酰亞胺(NEM)的磷酸鈉緩沖液(5ml，pH8.0，0.1M)的溶液，將2ml加到上述反應(yīng)混合物中，熟化4小時(shí)。然后用0.22μm漏斗過濾0.5ml的N-乙酰胱胺的2.5ml鹽酸鹽緩沖液(0.1M，pH8)，并將1.0ml該溶液加到反應(yīng)中，熟化22.5小時(shí)。
將戴帽產(chǎn)生等量分裝到4個(gè)25ml離心管中，用總量為8ml的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH8.0)拔頂，于4℃下，在43K離心2小時(shí)。除去上清液后，將碎片懸浮在總量為40ml TED緩沖液的DOUNCE均化器中。玻璃容器瑞用10ml TED緩沖液漂洗，將溶液轉(zhuǎn)移到2個(gè)25ml離心管中后，在室溫下貯放15.25小時(shí)，然后在24℃下，于43Krpm離心2小時(shí)。將形成的碎片懸浮在總量為30ml TED緩沖液的DOUNCE均化器中，然后轉(zhuǎn)移到2個(gè)25ml離心管中，玻璃容器再用20ml TED緩沖液漂洗。在4℃下，于43K離心2小時(shí)。將碎片懸浮在50ml磷酸鹽緩沖液(pH7)，再在4℃下，在43K第三次離心2小時(shí)。將碎片懸浮在82ml水中，以20.5ml等份轉(zhuǎn)移到2個(gè)50ml無菌塑料(FALCON)離心管中，在4℃下熟化18小時(shí)。結(jié)合物制劑在1000rpm離心3.5分鐘(TJ-6離心機(jī)，TH轉(zhuǎn)子)。測(cè)定最終結(jié)合產(chǎn)物懸浮液中的蛋白(Lowry)，18C多糖(苯酚/硫酸)，未結(jié)合的多糖(篩析色譜法-速率散射濁度測(cè)定法)和氨基酸(SPINCO)多糖＝339μg/ml;
蛋白＝2.75mg/ml;
游離多糖＜5%(經(jīng)驗(yàn)誤差的限制)S-羧甲基高半胱氨酸/賴氨酸＝0.025;
S-羧甲基胱胺/賴氨酸＝0.005。
實(shí)施例26Pn4-Ps中間體的制備(1)超聲水解在室溫下將1.0g Pn4-Ps粉末攪拌溶解于400ml鹽水(0.9% NaCl)中約4小時(shí)。在塑料杯和冰浴中，用Branson超聲發(fā)生器(1/2英寸探頭，8個(gè)裝置)超聲處理溶液，每隔10分鐘處理1次，至總的處理時(shí)間為20分鐘)，每個(gè)間隔后檢查粘度。20分鐘后，得到的粘度終點(diǎn)為1，267厘沲。將水解過的樣品升至室溫，加入乙酸鈉試劑(18.7g)，使最終濃度達(dá)3%(W/V)。
(2)血清學(xué)測(cè)定用每份10ml樣品進(jìn)行異丙醇(IPA)分離的小型研究和對(duì)抗體終點(diǎn)的散射濁度測(cè)定，結(jié)果證明Pn4-Ps在45-55%IPA沉淀。
(3)第一次加入IPA加入379ml IPA(室溫下攪拌滴加)，使水解樣品(溶積385ml，取自上述步驟1)增至49.7%IPA。將樣品攪拌15-30分鐘，然后在11000xg離心30分鐘(Beckman JA-10離心機(jī)，8000rpm，20℃)。廢碎片在250ml Omnimix jar中用無水EtOH研制，然后在60ml燒結(jié)玻璃漏斗上收集。先后用無水EtOH和丙酮直接在漏斗上洗滌沉淀物，在室溫下用CaCl真空干燥，準(zhǔn)備用于分析。
(4)第二次加入IPA和回收產(chǎn)物室溫下攪拌滴加38ml IPA，使49.7%IPA上清液(容積727ml，取自上述步驟3)增至52.2%IPA。按上述步驟3，進(jìn)行樣品熟化和離心。按上述步驟3，研制、收集、洗滌和干燥碎片。Pn4-Ps產(chǎn)物的重量為5116g。
(5)滲析和冰凍干燥在室溫下將由步驟4得到的500mg一份的Pn-Ps樣品溶解于200ml蒸餾水中2-3小時(shí)。將溶液(2.5mg/ml)轉(zhuǎn)移到滲析管中(1200MW斷流45mm)，于4℃下用蒸餾水滲析27小時(shí)，再用蒸餾水更換2次。然后將經(jīng)過滲析的樣品冰凍干燥并中，在干冰-甲醇浴中密閉冰凍，并用Virtis(Freezemobil)冰凍干燥器冰凍干燥2-3天?；厥?91mg最終產(chǎn)物的Kd為0.69。
從以上所述，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員顯然按本發(fā)明公開的方法，可制備含Pn-Ps，并且結(jié)合Pn4-Ps或Pn9V-Ps，它們也屬于酸性多糖。
實(shí)施例27肺炎雙球菌4-OMP4型結(jié)合物Pn4-Ps-OMPCa.Dowex 50X2(200-400目)四丁銨型樹脂(Dowex 50(Bu4N+))的制備Dowex 50X2(200-400目)H+型(500g)在水中制成漿料(CM-66)，裝到柱上，并按下述步驟洗滌(1)600ml水;(2)1000ml 6N HCl;(3)400ml水，洗至流出物在pH試紙上呈中性;(4)72g的10%四丁基氫氧化銨水溶液，洗至流出物在pH試紙上呈強(qiáng)檢性;(5)1000ml，洗至中性。
b.肺炎雙球菌4型多糖四丁銨型(Pn4(BU4N+))的制備用520ml水洗滌65ml的Dowex 50X2(BU N)柱。pN4多糖(分子量降低(400mg)和35ml水，攪拌20分鐘，此時(shí)形成溶液(繼續(xù)攪拌過液)。將該溶液施用于柱上，由于重力作用進(jìn)行滲析用150ml水洗柱，將流出液合并后冰凍干燥，得到504g Pn4(Bu N)鹽。
c.Pn4-Ps的1，4-丁二胺衍生物(Pn4-BuA)的制備97mg Pn4(Bu N)加16ml二甲亞砜(DMSO)，在52℃下攪拌15分鐘后所有固體全部溶解。并將溶液冷卻至室溫。
將2mg羰基二亞酰胺吡咯(CDI)溶解于160μl DMSO中的溶液加到上述溶液保，生成的溶液在室溫下攪拌1.0小時(shí)。制備含0.500g 1，4-丁二胺二鹽酸鹽(BuA·2HCl)的水(5ml)溶液，用5.0N NaOH將其pH調(diào)至10.20。該溶液在冰浴中冷卻。
將熟化的DMSO溶液緩慢加到冷BuA溶液中，再在冰浴中攪拌5分鐘，在冰浴中攪拌5分鐘。然后在室濁罡攪拌1小時(shí)。溶液裝到Spectrapor 2滲析管中，從液體頂部切下1/2″進(jìn)行下述滲析(1)4升0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.0，15.0小時(shí));(2)4升0.01M磷酸鈉緩沖液(pH7.0，9小時(shí));(3)4升0.01M磷酸鈉緩沖液(pH7.0，21小時(shí));(4)4升水(20小時(shí))。然后冰凍干燥，至70mg Pn4(Pn4-BuA2)的1，4-丁二胺衍生物(Pn23F-BuA)。
將丁二胺亞甲基與N-乙酰甲基的核磁共振對(duì)比，每100個(gè)限定的多糖的重復(fù)單體單位“裝載”大約22丁二胺殘基。
d.Pn4溴乙?；《费苌?Pn4-BuA2-BrAc)的制備Pn4-BuA2(54g)加5.5ml的1M緩沖液(pH9.04，Kolthoff硼酸-磷酸鹽)，攪拌形成溶液。加入55mg硼乙酸硝基苯酯的乙腈(1.0ml)溶液，生成的混合物在4℃下攪拌17小時(shí)。按如下所述在SPECTRAPOR 2滲析管中進(jìn)行滲析(1)16升水，24小時(shí);(2)16升水，8小時(shí);(3)16升水，23小時(shí)。此時(shí)總體積為12.5ml，從中取出1.0ml用于測(cè)量(NMR，Oucht-erlony和Viscothek)。然后加入275mg干的磷酸緩沖鹽(pH8，通過將0.1M的pH8的磷酸鈉溶液冰凍干燥制取)。溶解后，用0.2μm CORNING漏斗過濾，使之成為ph8的Pn4-A2-BrAc的溶液。
e.OMPC(肺炎雙球菌)與Pn4-BuA2-BrAc的結(jié)合在4℃下，外膜蛋白復(fù)合物(肺炎雙球菌，OMPC，4.34mg/ml)(5ml)在80Ti離心機(jī)(43000rpm，43K)中離心2小時(shí)。將85mg的EDTA(乙烯二胺四乙酸二鈉鹽)和15mg二硫蘇糖醇(DTT)溶解于10ml的Na2B4O7緩沖液(pH11.09)中，制取硫醇化混合物。加入50mg N-乙酰高半胱氨酸硫代內(nèi)酯，溶液經(jīng)0.2μm漏斗過濾。由上述離心得到的碎片用5ml經(jīng)過濾的硫醇化混合物沉積，然后轉(zhuǎn)移到DOUNCE均化器中并懸浮。將懸浮液轉(zhuǎn)移到離心管中，采用FIRESTONE閥將帶隔膜的并密封和用氮?dú)馊〈諝夂螅匣旌衔锸旎?9小時(shí)，并轉(zhuǎn)移到離心管中，用1M KH2PO4(水)拔頂，在4℃下，在54K離心2小時(shí)，除去上清液，碎片懸浮在10ml的0.1M磷酸鈉緩沖液(pH8)中。將該溶液轉(zhuǎn)移到離心管中，進(jìn)行第二次超超離心(2小時(shí)，4℃，43K)。碎片懸浮在11.5ml的按D部分制備的Pn4-BuA2-BrAc溶液中。根據(jù)Ellman測(cè)定方法，總量為3.44μmoles S或約158nmoles SH/mg OMPC。在4℃下，生成的反應(yīng)物(即Pn4-BuA2-BrAc與硫醇化OMPC反應(yīng))在氮?dú)庀涞牡獨(dú)?放氣)下熟化66小時(shí)。
反應(yīng)按如下所述戴帽含5mg N-乙基馬來酰亞胺(NEM)的磷酸鈉緩沖液(1ml，pH8，0.1M)的溶液經(jīng)0.22μm漏斗過濾后，加到上述反應(yīng)混合物中，溶液熟化5小時(shí)。將0.1ml的N-乙酰胱胺溶解于0.4ml的1M磷酸鹽緩沖液(pH8)中，經(jīng)0.22μm漏斗過濾后，將該溶液加到反應(yīng)中，熟化14.5小時(shí)。
在4℃下，反應(yīng)混合物在43K離心2小時(shí)，碎片懸浮在8ml 1×TED緩沖液中，該溶液在室溫下熟化過液，在4℃下和43K上離心2小時(shí)。將碎片再懸浮在8ml TED緩沖液中，在4℃下和43K上離心2小時(shí)。然后將碎片懸浮在10ml的0.1M磷酸鹽緩沖溶液(pH7)中，在4℃下和43K上再離心2小時(shí)。在4℃下再將這最終碎片懸浮在7.5ml水中。在4℃熟化過液后，懸浮液在1000rpm離心3分鐘，移去作為最終結(jié)合物的上清液。
測(cè)定結(jié)果Lowry蛋白0.920mg/ml;
苯酚硫酸0.122mg/ml;
Ps/Pro＝0.23;
SCMHC/LYS0.031;
SCMC/lys＝0.022。
給小鼠或非洲綠猴施用上述結(jié)合物時(shí)，經(jīng)Pn4-Ps特異性的測(cè)定，由其產(chǎn)生的抗-Pn4-Ps抗體的滴定度較高。
實(shí)施例28Pn9V-Ps中間體的制備(1)超聲水解在室溫下將1.0g Pn9V-Ps粉末攪拌溶解于400ml鹽水(0.9% NaCl)中約4小時(shí)。在塑料杯和冰浴中，用Branson超聲發(fā)生器(1/2英寸探頭，8個(gè)裝置)超聲處理溶液，每隔3分鐘處理1次，每個(gè)間隔后檢查粘度。13分鐘后，再超聲處理1分鐘，得到的粘度終點(diǎn)為1117厘沲。將水解過的樣品升至室溫，加入乙酸鈉試劑(19.5g)，使最終濃度達(dá)3%(W/V)。
(2)血清學(xué)測(cè)定用每份10ml樣品進(jìn)行異丙醇(IPA)分離的小型研究和對(duì)抗體終點(diǎn)的散射濁度測(cè)定，結(jié)果證明Pn9V-Ps在40-45%IPA沉淀。
(3)第一次加入IPA加入281ml IPA(室溫下攪拌滴加)，使水解樣品(溶積391ml，取自上述步驟1)增至41.8% IPA。將樣品攪拌15-30分鐘，然后在11000xg離心30分鐘(Beckman JA-10離心機(jī)，8000rpm，20℃)。廢碎片在250ml Omnimix jar中用無水EtOH研制，然后在60ml燒結(jié)玻璃漏斗上收集。先后用無水EtOH和丙酮直接在漏斗上洗滌沉淀物，在室溫下用CaCl真空干燥，準(zhǔn)備用于分析。
(4)第二次加入IPA和回收產(chǎn)物室溫下攪拌滴加28.6ml IPA，使41.8% IPA上清液(容積637ml，取自上述步驟3)增至44.3% IPA。按上述步驟3，進(jìn)行樣品熟化和離心。按上述步驟3，研制、收集、洗滌和干燥碎片。Pn9V-Ps產(chǎn)物的重量為342.2mg。
(5)滲析和冰凍干燥在室溫下將由步驟4得到的347mg一份的Pn-Ps樣品溶解于139ml蒸餾水中4-5小時(shí)。將溶液(2.5mg/ml)轉(zhuǎn)移到滲析管中(1200MW斷流45mm)，于4℃下用蒸餾水滲析25小時(shí)，再用蒸餾水更換2次。然后將經(jīng)過滲析的樣品冰凍干燥并中，在干冰-甲醇浴中密閉冰凍，并用Virtis(Freezemobil)冰凍干燥器冰凍干燥2-3天?；厥?03.5mg最終產(chǎn)物Ps，Kd為0.60。
(6)第三次加入IPA和回收產(chǎn)物室溫下攪拌滴加30.8ml IPA，使44.3% IPA上清液(容積655ml，取自上述步驟4)增至46.8% IPA。按上述步驟3，進(jìn)行樣品熟化和離心。按上述步驟3，研制、收集、洗滌和干燥碎片。Pn9V-Ps產(chǎn)物的重量為410.8mg。
(7)滲析和冰凍干燥在室溫下將由步驟4得到的420.4mg一份的Pn-Ps樣品溶解于168ml蒸餾水中4-5小時(shí)。將溶液(2.5mg/ml)轉(zhuǎn)移到滲析管中(1200MW斷流45mm)，于4℃下用蒸餾水滲析25小時(shí)，再用蒸餾水更換2次。然后將經(jīng)過滲析的樣品冰凍干燥并中，在干冰-甲醇浴中密閉冰凍，并用Virtis(Freezemobil)冰凍干燥器冰凍干燥2-3天?；厥?42.5mg最終產(chǎn)物Ps，Kd為0.65。
(8)本領(lǐng)域的專業(yè)人員顯然很清楚，步驟4和6的產(chǎn)物由于IPA的加入量較大，所以可以一起收集，然后作為單個(gè)產(chǎn)物進(jìn)行滲析和冰凍干燥，作為單個(gè)產(chǎn)物，它具有各個(gè)部分特征的加權(quán)平均的分析特征。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員還可以很明顯地知道，Pn1-Ps或Pn5-Ps可以與本文公開的Pn9V-Ps或Pn4-Ps相同的方法處理。
實(shí)施例29Pn9V-Ps與OMPC的結(jié)合按實(shí)施例28制備的Pn9V-Ps可與實(shí)施例27所述Pn4-Ps相同方法結(jié)合。
實(shí)施例30乙酸鹽在Pn9V/18C-Ps和丙酮酸在Pn4-Ps中的定量測(cè)定在處理肺炎球菌莢膜多糖過程中，定量地分析0-丙酮酸鹽在Pn4-Ps和0-乙酸鹽在Pn9V-Ps和Pn18C-Ps的方法在已發(fā)展。0-乙酰基或0-丙酮酸鹽首先是通過水解釋放的，然后用與壓縮導(dǎo)電率結(jié)合的高效陰離子交換色譜方法鑒別和定量分析Pn-Ps水解產(chǎn)物中的乙酸鹽和丙酮酸鹽。
采用該方法分析未處理過的和處理過的Pn4、Pn9V和Pn18C的樣品。初步結(jié)果證明丙酮酸鹽與未處理過的和篩析過的Pn4的每個(gè)Ps重復(fù)單位的摩爾比分別約為1∶1和0.8∶1。未處理過的或篩選過的乙酸鹽與Pn18C-Ps中每個(gè)Ps重復(fù)單位的摩爾比分別為1.7∶和1.5∶1。還分析了Pn18C-Ps-OMPC結(jié)合物含水量樣品的0-乙酸鹽與每個(gè)Ps重復(fù)單位的摩爾比約為0.5∶1。
根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，丙酮酸鹽是4型莢膜多糖中重要的免疫決定因素，將其去除會(huì)使免疫特異性發(fā)生顯著變化[Heidelberger，M.，Dudman，W.F.，and Nimmich，W.，′Immunochemical relationships of certain capsular polysaccharides of Klebsiella，pneumococci，and Rhizobia.′J.Immunol.，1041321-1328，(1970);Higginbotham，J.D.，Heidelberger，M.，and Gotschlich，E.，′Degradation of a pneumococcal type-specific polysaccharide with exposure of group-specificity.′Proc.Natl.Acad.Sci.USA，67138-142，(1970)].如果去除pn18C-Ps型多糖中的0-乙酸鹽，則會(huì)使其失去免疫特異性[Estrada-Parra，S.，and Heidelberger，M.，′The specific polysaccharide of type ⅩⅧ pneumococcus.′Biochemistry，21288-1294，(1963)].因此必須發(fā)展定量分析方法，測(cè)定Pn18C-Ps和Pn4中的乙酸鹽和丙酮酸鹽。由于經(jīng)速率散射濁率法已經(jīng)測(cè)定脫-0-乙酰化Pn9V沒有抗原反應(yīng)性，所以在Pn9V的免疫結(jié)構(gòu)中，Pn9V中0-乙酰基也可以超重要作用。
我們發(fā)現(xiàn)，在4℃和堿性條件下(pH11)，0-乙酸鹽很容易從Pn9V中釋放出來，而0-丙酮酸鹽在65℃下加熱則很容易從Pn4中釋放出來。我們發(fā)現(xiàn)，流速1ml/分鐘，以0.98mM NaOH和2% MeOH作為流動(dòng)相，用OmniPac PAX 500柱，則乙酸鹽和丙酮酸鹽能夠從水解的Pn-Ps樣品中分離出來。在流速為10ml/分鐘，用25mM H2SO4作為再生劑，通過壓縮導(dǎo)電率的檢測(cè)則也可以檢測(cè)。在這個(gè)實(shí)施例中，介紹了HPLC定量分析Pn18C-Ps中0-乙酸鹽和0-丙酮酸鹽的最佳水解條件。
儀器設(shè)備Dionex Bio LC配置有OmniPac PAX-500防護(hù)和分析柱(4.6×250mm)。用25mN硫酸作為再生劑，則可進(jìn)行壓縮導(dǎo)電率的檢測(cè)。Dionex自動(dòng)裝置的流速為10ml/分鐘。分離水解Pn-Ps樣品中的乙酸鹽和丙酮酸鹽的移動(dòng)相和梯度程序。詳列于下表緩沖液11mM氫氧化鈉緩沖液2100%甲醛緩沖液3200mM氫氧化鈉緩沖液4水時(shí)間 %緩沖液1 %緩沖液2 %緩沖液3 %緩沖液4 流速0 98 2 0 0 112.5 98 2 0 0 112.6 58 2 0 40 1.520.0 58 2 0 40 1.520.1 98 2 0 0 1.530.0 98 2 0 0 1.530.1 98 2 0 0 150.0 98 2 0 0 1使用上述條和3μ西門子的檢測(cè)儀的靈敏度在保留時(shí)間約為5.2-9.3分鐘時(shí)洗脫，則4nmoles的乙酸鹽和丙酮酸鹽很容易被檢測(cè)。
樣品的制備由Merck制造部提供的純化的Pn-Ps樣品，采用Aquaster V3000體積濕度滴定儀和Karl-Fisher滴定方法，可測(cè)定殘余水的含量，然后濃度以每ml 1.0mg干重溶解于Milli-Q水中。樣品(100μg/ml)在室溫下用2Mn NaOH處理16小時(shí)，從Pn9V-Ps和Pn18C-Ps樣品中除去0-乙酸鹽。在65℃下和在1mM HCl中，水解Pn4-Ps樣品16小時(shí)，可除Pn4去中的0-丙酮酸鹽。經(jīng)過篩析的Pn9V和Pn18C-Ps和Pn18C-Ps-OMPC結(jié)合物含水量也可使用高pH陰離子交換色譜法和脈沖電流檢測(cè)儀進(jìn)行單糖組份分析。進(jìn)行單糖組份分析可得到Pn-Ps在經(jīng)過篩析和液體結(jié)合物樣品中的準(zhǔn)確濃度。
乙酸鹽、丙酮酸鹽和N-乙酰甘露糖胺以200nmole/ml濃度溶解于Milli-Q水中。
樣品的水解和標(biāo)準(zhǔn)通過處理Pn18C-Ps發(fā)現(xiàn)了Pn18C-Ps的脫-0-乙?；饔冒l(fā)生在4個(gè)NaOH濃度(1，2，5和50mM)、不同的溫度(4，25，45和65℃)和不同的時(shí)間(3，5和16小時(shí))。乙酸鹽、丙酮酸鹽和N-乙酰甘露糖胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液也包括測(cè)定的研究，如果脫-0-乙?；饔盟匦璧臈l件還會(huì)導(dǎo)致乙酸鹽/丙酮酸鹽的降解或N-乙?；膯适?。
關(guān)于從Pn4去除丙酮酸鹽還研究了以下處理對(duì)不同濃度(1，10，100mM)、時(shí)間(3，5和16小時(shí))和溫度(65，85和100℃)情況下，或用氫氧化鈉(50mM/100℃/16小時(shí))處理，或用鹽酸處理。
速率散射濁度測(cè)定在脫-0-乙酰化作用或脫-0-丙酮酸化作用前和后測(cè)定Pn9V-Ps，Pn18C-Ps和Pn4-Ps的速率散射濁度的活性。樣品稀釋至1，1.5，2和2.5μg/ml。高效篩析色譜測(cè)定(HPSEC)在脫-0-乙?；饔没蛎?0-丙酮酸化作用前和后，測(cè)定Pn9V-Ps，Pn18C-Ps和Pn4的HPSEC。裝有流速限制器的7.5×600mm TSK G6000PV柱在800-1000psi下加熱至50℃，在0.3ml/分鐘下用0.2M乙酸鈉平衡。將60μg樣品(1mg/ml)注射到柱上，在0.3ml/分鐘用流動(dòng)相流脫。柱洗脫劑在流速為0.5ml/分鐘與柱后加的0.5M NaOH混合，用Dionex脈沖電流檢測(cè)器檢測(cè)和測(cè)量Kd。
靈敏度和線性度的測(cè)定確定在3μ西門子為丙酮酸鹽和乙酸鹽的檢測(cè)器的線性度和靈敏度。瑞酮酸鹽和乙酸鹽在0.125nmol的下限可被檢測(cè)到。2個(gè)組份的檢測(cè)反應(yīng)的線性度為2nmole，丙酮酸鹽和乙酸鹽的相關(guān)系數(shù)分別為0.9999和0.9992。
從Pn18C-Ps去除0-乙酸鹽的最佳條件關(guān)于水解Pn18C-Ps時(shí)間的初步研究證明，0-乙酰基在低溫時(shí)對(duì)鹼性水解不穩(wěn)定。在4℃時(shí)，溫育16小時(shí)后，2mM氫氧化鈉足以對(duì)Pn18C-Ps完成脫-0-乙化。較高溫度時(shí)(＞25℃)，處理可從N-乙酰甘露糖醇中釋放N-乙酸鹽，前者則會(huì)干擾Pn9V0-乙酸鹽的測(cè)量。為了得到從Pn-Ps去除0-乙酸鹽的最佳水解條件，則為4℃下16小時(shí)。在室溫下，用2mM NaOH處理N-乙酰甘露糖醇16小時(shí)，則乙酸鹽低于1%。
從Pn4中脫除0-丙酮酸酯的最佳方法最初，Pn4水解研究是用氫氧化鈉水解進(jìn)行的。很快發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用氫氧化鈉時(shí)丙酮酸酯收率很低。起始對(duì)照研究表明，丙酮酸酯在100℃水中從Pn4裂解掉。由此信息便決定實(shí)施例采用高溫HCl解法從Pn4中釋放出0-丙酮酸酯的最佳方法。某些丙酮酸酯的降解是在較高溫度下出現(xiàn)的，這可得到與Pn4相同條件水解了的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)物的樣品的說明。當(dāng)在1mM鹽酸中于65℃水解16小時(shí)時(shí)得到最高收率的丙酮酸酯。
在Pn-Ps樣品中0-乙酸酯和0-丙酮酸酯的分析對(duì)代表著起始Pn-Ps、分級(jí)的Pn-Ps和一個(gè)Pn18C-Ps-OMPC共軛體的不同樣品分析0-乙酸酯/丙酮酸酯，采用上述HPLC法，在室溫2mM NaOH中水解這后釋放出Pn9V-Ps/18C中的0-乙酸酯或在65℃ 1mM HCl中水解之后釋放出0-丙酮酸酯。該項(xiàng)研究結(jié)果歸納如下樣品 丙酮酸酯/乙酸酯與各Ps重復(fù)單元之比Pn4，sample 1 1.0 \\Pn4，sample 2 0.8 \\Pn9V，sample 1 1.7 \\Pn9V，sample 2 1.5 \\Pn18C-Ps，sample 1 1.0 \\Pn18C-Ps，sample 2 0.8 \\Pn18C-Ps-OMPC aqueous bulk 0.5 \\結(jié)果表明，在分級(jí)的Pn-Ps中側(cè)基保留率對(duì)于Pn9V-Ps約90%，對(duì)于Pn4和18C為80%。經(jīng)實(shí)測(cè)，在Pn18C-Ps-OMPC共軛含水整體中0-乙酸酯的保留率約50%。Pn18C-Ps和Pn4的理論值為每摩爾Ps重復(fù)單元1摩爾乙酸酯或丙酮酸酯，而對(duì)于Pn9V，該比值為2∶1。.
預(yù)計(jì)在Pn18C-Ps-OMPC共軛體中發(fā)現(xiàn)的0-乙酸酯有較低的保留率，因?yàn)?-乙?；鈱?duì)低溫堿性條件比較敏感。
測(cè)定Pn4，Pn9V和Pn18C-Ps樣品和脫-0-丙酮酸化和脫-0-乙酰化樣品的比濁度活性。
結(jié)果表明，在這些側(cè)基脫除之后，濁度活性完全喪失掉，即使未處理的樣品的Kd亦如此。通過上述HPSEC方法得到Kd值。但是，弱酸水解脫-0-丙酮酸化后的Pn4的Kd值從0.60提高到0.68，且外觀接近鹽體積。Pn4和Pn18C-Ps的抗原性數(shù)據(jù)支持了其它研究人員有關(guān)這些測(cè)基在肺炎球菌多糖免疫學(xué)活性中的重要性的工作。Pn9V的結(jié)果表明，除了丙酮酸之外，該分子的0-乙?；彩侵匾拿庖邔W(xué)決定因素。
因此按照這上方法，已開發(fā)出定量測(cè)定Pn4的0-丙酮酸縮醛和Pn9V-P中的0-乙酸醌的快速、敏銳的工序。該工序在確定Pn4、Pn9V和Pn18C-Ps的分級(jí)和共軛以便保持這些多糖的抗原結(jié)構(gòu)的校正方法是還有價(jià)值的。
實(shí)施例31Pn6B-Ps-MIEP共軛體的分離1.將兩種共軛的反應(yīng)混合物樣品(一個(gè)代表另一個(gè)的H O滲析樣品)貯存在3-8℃，直至使用。
2.將0.2 MOPS pH7.2的緩沖劑加到樣品中，以得到最終濃度約7mM。將固體GuHCl加到樣品中以得到最終濃度4.2M(注應(yīng)加入1.42g GuHCl/ml樣品，以補(bǔ)償因加入固體GuHCl而造成的體積的增大。類似地，應(yīng)控制緩沖劑的加入以考慮體積的增大，由此使樣品組成接近于柱洗脫劑組成。另外，也可以在層析前將樣品對(duì)層析注進(jìn)行滲析)。
3.以0.6ml/min的流速，將2.8ml樣品(以低級(jí)蛋白質(zhì))注入到一個(gè)平衡在10 mM mops pH7.2，6m GuHCl(中的Sephacryl S-1000的柱(2.6×96mm)中。在280nM連續(xù)監(jiān)測(cè)柱流出物(Perkin Elmer LC 235二極管分析監(jiān)控器)并收集3ml部分。
4.蛋白質(zhì)分布基于A280(以及光譜)，Pn6B-Ps分布基于Pn6B-Ps特異沉降(ria)分析。以單獨(dú)的Pn6B-Ps-Br-Ac和未活化的MIEP物理混合物洗提部位為基準(zhǔn)，制備含PS和蛋白質(zhì)的級(jí)分的池，并把那些與Pn6B-Ps-Br-Ac觀察到的部位明顯不同的洗脫物認(rèn)定為Pn6B-Ps-MIEP共軛體。
5.采用YM-30膜超濾并用Miui-Q H O滲濾來濃縮泄。用定量組成研究的方法估計(jì)蛋白質(zhì)和Pn6B-Ps含量。氨基酸分析檢測(cè)到存存SCMHC。
實(shí)施例32肺炎球菌多糖Pn 18C-PS直接RIA分析法本分析法是用于定量肺炎球菌多糖型18C。它是一種多層夾芯的RIA分析法。將免的抗-Pn-18C-Ps抗體涂布到聚苯乙烯球粒上。將球粒在含有Pn 18C-Ps的樣品液中保溫。保溫后，洗滌球粒，并再于含小鼠抗體Pn18C-OMPC的第二種溶液中保溫。保溫后，洗滌球粒，再在含有Ⅰ-山羊的抗小鼠IgG溶液中第三次保溫。再一次洗滌該板，之后，將珠粒轉(zhuǎn)移到計(jì)數(shù)用塑料管中。使未知樣品Pn180C-Ps與定量用的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。
設(shè)備1.RIA藥盒Abbot Labs，Diagnostic Div.，目錄號(hào)6171-10。
2.Qwik洗系A(chǔ)bbot Labs，Diagnostic Div。
3.可調(diào)節(jié)的吸管和易處理的吸管尖(ex.Eppendorf digital)。
4.γ＝計(jì)數(shù)器(ex.Abbott Autologic)。
5.鏡狀面層的1/4“聚苯乙烯球粒Precision Plastic Ball公司，300N，Cicero Ave.，Chicago，Illinois 60641。
試劑1.紐約州立健康服務(wù)公司的抗-Pn 180C-Ps抗體Lot R18-44或等價(jià)物。
2.小鼠抗-Pn 180C-Ps OMPC抗血清(庫11260-235或等價(jià)物)。
3.山羊的抗-小鼠IgG Ⅰ-標(biāo)記抗血清NEX 159，New England Nulear，549 Albang Street，Boston，MA02118。
4.保溫緩沖劑RCM8，含10%BSA Sigma A21530.1%疊氮化物 Sigma S20025.稀釋劑8份牛胎血清 Sigma F38851份山羊血清 Sigma G67671份兔血清 Sigma R45050.05%TWEEN20 Sigma P13790.1%疊氮化物 Sigma S20023.將試劑1-抗Pn18C-Ps抗體涂布的珠粒加到含樣品或標(biāo)準(zhǔn)物的板的各孔中并將板輕微攪拌以確保所有珠粒完全覆蓋上緩沖劑。
4.用配有RIA藥盒的粘合面板蓋上該板并在室溫下溫育該板6小時(shí)。
5.用Qwik洗滌設(shè)備和去離子水洗滌該板。
6.在稀釋劑中以1∶1000稀釋小鼠的抗-180C抗體。
7.將200/μl該溶液加到含珠粒的各孔中。
8.蓋上該板并在室溫保溫過夜。
9.用Qwik洗滌設(shè)備和去離子水洗滌該板。
10.在稀釋劑中，將Ⅰ-標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體稀釋到15000(pm/10μl(-1∶160稀釋度)。
11.含珠粒的各孔中加入20μl該溶液。
12.蓋上該板并于37℃保溫2小時(shí)。
13.用Qwik洗滌設(shè)備和去離子水洗滌該板。
14.將珠粒轉(zhuǎn)移到配有RIA藥盒的塑料管中并用合適的γ-計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。
計(jì)算1.把兩次測(cè)定值合并，得到各樣品、標(biāo)準(zhǔn)物和保溫緩沖劑對(duì)照的平均值。從所有標(biāo)準(zhǔn)物和樣品中減去保溫緩沖劑對(duì)照。
2.使用統(tǒng)計(jì)計(jì)算用的計(jì)算器，輸入數(shù)據(jù)制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)和曲線的斜率。
3.用合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線(游離的供游離用，共軛的供共軛用)，計(jì)算樣品的響應(yīng)性，并進(jìn)行稀釋校正。
上述同樣工序在替換各類特定試劑之后可應(yīng)用到任何其它Pn-Ps物質(zhì)上。
權(quán)利要求
1.一種含有與由一種或多種肺炎鏈球菌(streptococcus pneumo-niae)亞型產(chǎn)生的多糖共價(jià)連接的免疫蛋白的結(jié)合物，所述多糖的每個(gè)分子均具有大約1200重復(fù)單位，分子量約為1×105至1×106，多分散度為1.0至1.4，由肺炎球菌族特異性C-多糖造成的污染低于3.0%類型特異性多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)合物，其中所述多糖的抗原性指數(shù)為0.7至1.1，特性粘度為0.6至3.0dL/g。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的結(jié)合物，其中所述多糖是由選自肺炎鏈球菌1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19F，19A，20，22F，23F和33F中任何一種亞型產(chǎn)生的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的結(jié)合物，其中所述多糖的粒度多分散度為1.0至1.4，C-多糖的污染量相當(dāng)于低于3%的類型特異性多糖，該多糖產(chǎn)生于(1)肺炎鏈球菌6B，所述多糖具有(a)MN約為3×105至6×105;(b)Kd(峰值)約為0.60±0.05;(c)MW約為3×105至7×106;(d)特性粘度在0.1M磷酸鈉(pH7.2)中為1.0至2.0，(e)平均每個(gè)分子約低于1000重復(fù)單位;(2)肺炎鏈球菌14，所述多糖具有(a)MN約為3×105至8×105;(b)Kd(峰值)約為0.60±0.05;(c)Mw約為4×105至1×106;(d)特性粘度在0.1M磷酸鈉(pH7.2)中為0.6至1.6;(e)平均每個(gè)分子約低于1200重復(fù)單位;(3)肺炎鏈球菌19F，所述多糖具有(a)MN約為2×105至6×105;(b)Kd(峰值)約為0.65±0.05;(c)Mw約為2×105至6×105;(d)特性粘度在0.1M磷酸鈉(pH7.2)中為1.0至2.0，(e)平均每個(gè)分子約低于1000單體重復(fù)單位;(4)肺炎鏈球菌23F，所述多糖具有(a)MN約為2×105至6×105;(b)Kd(峰值)約為0.54±0.05;(c)Mw約為4×105至8×105;(d)特性粘度在0.1M磷酸鈉(pH7.2)中為1.5至3.0;(e)平均每個(gè)分子約低于1000單體重復(fù)單位;(5)肺炎鏈球菌4，所述多糖具有(a)MN約為2×105至4×105;(b)Kd(峰值)約為0.65±0.05;(c)Mw約為2×105至5×105;(d)特性粘度在0.1M磷酸鈉(pH7.2)中為1.0至3.0，(e)平均每個(gè)分子約低于600單體重復(fù)單位;(6)肺炎鏈球菌9V，所述多糖具有(a)MN約為3×105至6×105;(b)Kd(峰值)約為0.65±0.05;(c)Mw約為3×105至7×105;(d)特性粘度在0.1M磷酸鈉(pH7.2)中為1.0至2.0;(e)平均每個(gè)分子約低于800單體重復(fù)單位;(7)肺炎鏈球菌18C，所述多糖具有(a)MN約為2×105至6×105;(b)Kd(峰值)約為0.65±0.05;(c)Mw約為2×105至6×105;(d)特性粘度在0.1M磷酸鈉(pH7.2)中為1.5至3.0，(e)平均每個(gè)分子約低于700單體重復(fù)單位;或上述任何一種多糖的混合物，其中所述多糖與腦膜炎雙球菌(Neisse-ria meningitidis)b的外膜蛋白復(fù)合物(OMPC)或其MIEP亞單位相結(jié)合。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的共價(jià)結(jié)合物，其中OMPC或MIED和Pn-Ps在由多糖水解鍵合時(shí)，通過下式間隔因連接
或在多糖具有羧酸基因時(shí)，通過下式間隔因連接
式中PRO代表OMPC或MIEP，Pn-Ps代表肺炎球菌多糖，該結(jié)合物的Pn-PsOMPCP或Pn-PsMIEP質(zhì)量比約為0.05至0.5，通過水解和氨基酸分析，得到的SCMHC/Lys比為0.01至0.15。
6.由下述方法生產(chǎn)的肺炎球菌多糖-免疫蛋白結(jié)合物(a)培養(yǎng)肺炎球菌，分離Pn-Ps粗制品或加溶肺炎球菌多糖粉末;(b)將步驟(a)的多糖純化和部分水解至預(yù)定的終點(diǎn)，產(chǎn)生適合于結(jié)合的多糖，其與步驟(a)的多糖粗制品相比，還原多糖的類型特異性抗原性不高于30%;(c)將步驟(b)的產(chǎn)物與免疫蛋白結(jié)合，其中在步驟(a)中培養(yǎng)的肺炎球菌選自4、6B、9V、14、18C、19F和23F中一種或多種亞型，其中用抗Pn-Ps類型特異性抗體經(jīng)平板雙向免疫擴(kuò)散法或速度散射濁度測(cè)定法測(cè)定，Pn-Ps仍保持其抗原完整性，所述Pn-Ps在結(jié)合前，在壓力約為2000至15000PSI的Gaulin壓力機(jī)中進(jìn)行物理剪切，或在100℃下加熱水解24小時(shí)或超聲處理時(shí)，下列各Pn-Ps亞型在1mg/ml的0.9M氯化鈉溶液中的粘度或Kd(峰值)終點(diǎn)如下Pn-Ps亞型 目標(biāo)終點(diǎn)粘度(厘沲) 目標(biāo)終點(diǎn)Kd(峰值)Pn4-Ps 1.5-1.00 0.65±0.05Pn6B-Ps 1.3-1.00 0.60±0.05Pn9V-Ps 1.3-1.00 0.65±0.05Pn14-Ps 1.1-0.95 0.60±0.05Pn18C-Ps 1.5-1.00 0.65±0.05Pn19F-Ps 1.3-1.00 0.65±0.05Pn23F-Ps 1.5-1.00 0.54±0.05;需要時(shí)通過色譜分離法或乙醇分離法選擇多分散度1.4以下的物質(zhì)。
7.制造Pn-Ps-PRO結(jié)合物的方法，該方法包括(a)分離肺炎球菌多糖Pn-Ps粗制品;(b)ⅰ.需要時(shí)通過雜質(zhì)的離子交換吸附法純化Pn-Ps粗制品;ⅱ.部分水解或機(jī)械剪切Pn-Ps粗制品;(c)需要時(shí)，根據(jù)粒度和純度分離部分水解的Pn-Ps;(d)衍生由步驟(a)-(c)的一種或多種肺炎球菌亞型產(chǎn)生的經(jīng)過分離的Pn-Ps，顯示親核部分或親電子部分;(e)分離腦膜炎雙球菌b OMPC或其亞單位;(f)歙OMPC或其亞單位具有能反應(yīng)的親電子部分或親核部分;(g)將步驟(d)的多糖與步驟(f)的蛋白結(jié)合;(h)封斷結(jié)合物，除去殘余的官能團(tuán);(i)分離得到結(jié)合產(chǎn)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中步驟(b)和(c)包括(b)ⅰ.需要時(shí)將溶液pH值約為5的陰離子雜質(zhì)吸附在Whatman DE52濾紙上;ⅱ.將Pn-Ps溶液水解到預(yù)定的終點(diǎn)粘度，通過下述步驟使與抗肺炎球菌類型特異性抗體結(jié)合的Pn-Ps減少不高于Pn-Ps粗制度的30%;(1)在50-150℃下加熱1至48小時(shí);或(2)超聲處理，根據(jù)超聲處理樣品的動(dòng)力調(diào)整，超聲處理的時(shí)間5秒至5分鐘，冷卻后繼續(xù)進(jìn)行超聲處理;或(3)在壓力約為2000至15000PSI的Gaulin壓力機(jī)中剪切;步驟(c)包括分離經(jīng)水解的Pn-Ps，通過下述步驟選擇具有1×105至1×106分子量的部分ⅰ.用預(yù)定濃度的異丙醇差示乙醇溶解度，沉淀出所需粒度的Pn-Ps，或ⅱ.在能夠包括和分離5×104和1×106粒度的多糖的粒度排阻液體色譜柱上進(jìn)行分離，用1mg/ml的0.1M磷酸鈉溶液(pH7.2)粘度測(cè)量方法測(cè)定水解或切變的終點(diǎn)，或根據(jù)亞型Pn-Ps終點(diǎn)色譜分離下表所列各多糖Pn-Ps亞型 目標(biāo)終點(diǎn)粘度(厘沲) 目標(biāo)終點(diǎn)Kd(峰值)Pn4-Ps 1.5-1.00 0.65±0.05Pn6B-Ps 1.3-1.00 0.60±0.05Pn9V-Ps 1.3-1.00 0.65±0.05Pn14-Ps 1.1-0.95 0.60±0.05Pn18C-Ps 1.5-1.00 0.65±0.05Pn19F-Ps 1.3-1.00 0.65±0.05Pn23F-Ps 1.5-1.00 0.54±0.05。
9.使用權(quán)利要求1的結(jié)合物的方法，該方法包括給哺乳動(dòng)物施用免疫有效量的所述結(jié)合物。
10.一種疫苗組合物，該組合物含有權(quán)利要求1的結(jié)合和惰性載體，需要時(shí)還可含有免疫有效量的助劑或免疫調(diào)整化合物或其他免疫原，其中所述惰性載體系氫氧化鋁、磷酸鋁和明礬，所述其他免疫原選自抗乙型肺炎、甲型肺炎、非A非B型肝炎、愛滋病、白喉-百日咳-破傷風(fēng)、麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹、水痘、脊髓灰質(zhì)炎和流感嗜血桿(Haemophilus influenzae)b，所述結(jié)合物包括選自Pn4-Ps-OMPC、Pn6B-Ps-OMPC、Pn9V-Ps-OMPC、Pn14-Ps-OMPC、Pn18C-Ps-OMPC、Pn19F-Ps-OMPC、Pn23F-Ps-OMPC、Pn1-Ps-OMPC、Pn5-Ps-OMPC和Pn7F-Ps-OMPC中一種至全部的結(jié)合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了采用新方法生產(chǎn)的一種新的結(jié)合疫苗，其含有經(jīng)過部分水解的高度純化的由與免疫載體蛋白連接的肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)類(Pn)產(chǎn)生的莢膜多糖(Ps)。該結(jié)合蛋白可用于防止肺炎球菌的感染。含有1至10種不同肺炎球菌多糖免疫蛋白(Pn-Ps-PRO)結(jié)合物的疫苗可以廣泛地誘導(dǎo)受體對(duì)產(chǎn)生多糖成分的同類病原體的保護(hù)性免疫應(yīng)答。通常對(duì)Pn-Ps不能產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的兒童和2歲以下的嬰兒通過接種這些Pn-Ps-PRO結(jié)合物能產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1064217SQ92100700
公開日1992年9月9日 申請(qǐng)日期1992年1月27日 優(yōu)先權(quán)日1991年1月28日
發(fā)明者P·J·尼斯肯, A·哈戈皮恩, W·J·米勒, 葉基礎(chǔ), 小J·P·亨尼西, D·J·庫貝克, P·D·伯克, S·馬堡, R·L·托爾曼 申請(qǐng)人:麥克公司