專利名稱：應(yīng)用bdnf/nt-3/ngf分子族成員治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的治療方法，包括給需要這種治療的患者服用有效劑量的神經(jīng)營養(yǎng)因子，這種神經(jīng)營養(yǎng)因子是BDNF/NT-3/NGF分子族成員，并且支持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活、生長、和/或分化，尤選BDNF或NT-3。本發(fā)明也提供了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的培養(yǎng)方法，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的診斷方法，用于鑒別對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有益或有害的因素的鑒別系統(tǒng)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的動(dòng)物模型。
運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和肌肉細(xì)胞之間的相互作用決定肌肉的緊張度，并引起肌肉有效地收縮，因此是所有自主性和非自主性運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ)。
運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元傳統(tǒng)分類為上位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元或下位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。上位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元位于大腦中央前回，并傳出長突往下到下位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元上的突觸，下位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元位于脊髓灰質(zhì)體的腹側(cè)灰質(zhì)區(qū)。脊髓的前側(cè)灰質(zhì)區(qū)，下位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的軸突連合形成腹側(cè)根。這些軸突最后終止于一條或多條肌肉纖維。通過下位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的纖維末端的樹枝狀分枝，每條下位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與少則幾條多則100-200或更多肌肉纖維相連接形成一個(gè)“運(yùn)動(dòng)單元”。(Adams and Victor，1985，in“Principles of Neurology”Mc Graw-Hill，Inc，New York，P.37.)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病導(dǎo)致不同程度的肌肉無力，引起功能喪失，輕則難于完成繁重任務(wù)，重則到完全癱瘓。下位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病一般與弛緩癱瘓和肌肉張力下降相關(guān)。受單個(gè)神經(jīng)或脊髓中與其鄰近的該運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元支配的相鄰肌肉會(huì)受到影響，引起程度很深的萎縮，整個(gè)肌肉組織的70-80%會(huì)受到影響。病態(tài)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變得過敏，它控制的肌肉纖維與其它單元離散間隙放電，產(chǎn)生一種可見的顫搐或自發(fā)性收縮。相反，當(dāng)上位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受損，一般結(jié)果是伴隨肌肉張力增加和腱反射亢進(jìn)的痙攣癱瘓。通常是人體的整個(gè)肢體或半側(cè)軀體受到影響，而不是單個(gè)肌群受影響。萎縮是輕微的，典型的起因是廢用性痿縮，不出現(xiàn)自發(fā)性收縮。對(duì)代表上位或下位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)受損的臨床癥狀進(jìn)行鑒別有利于進(jìn)行診斷和治療。
相當(dāng)多的各種神經(jīng)機(jī)能障礙影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。例如，上位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元主要受腦血管意外，腫瘤、感染和創(chuàng)傷影響。然后，下位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元或前灰質(zhì)角細(xì)胞才受這些因素影響，但除此之外它還易患許多機(jī)能失調(diào)，其中前灰質(zhì)角細(xì)胞受損是最初癥狀，包括肌萎縮性外側(cè)硬化，嬰兒或幼年脊柱肌肉萎縮，脊髓灰質(zhì)炎和脊髓灰質(zhì)炎后綜合癥，遺傳性運(yùn)動(dòng)和感覺神經(jīng)病變，和中毒性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病變(如，長春花新堿)。
在這些主要的前側(cè)灰質(zhì)角細(xì)胞(AHC)機(jī)能失調(diào)中，肌萎縮性外側(cè)硬化(ALS或Lou Gehrig′s病)是最常見的(見Williams和Win-debank，1991，Mayoclin.Proc.6654-82 for yeview)。
ALS多數(shù)患者最初的不適是無力，上肢更為常見(Gubbay et al.，1985，J.Neurol.232295-300;Vejjajiva et al.，1967，J.Heurol.Sci.4299-314;Li et al.，1988，J.Neurol.Neuro-surg.Psychiatry 51778-784)。一般無力、萎縮、和其它神經(jīng)病證狀是不對(duì)稱性的，并且經(jīng)常是局部性的(Munsat et al.，1988，Neurol.38409-413)。肌肉痛性痙攣，感覺異常(刺麻感)和疼痛是常見的不適癥狀(Williams and Windebank，supra)。分布廣的自發(fā)性收縮經(jīng)常出現(xiàn)(id.)。這種疾病的發(fā)展快慢每個(gè)患者都不相同(Gubbay et al.，1985，J.Neurol，232295-300)，但實(shí)際上這種病所有情況的最終結(jié)果是完全功能喪失，廣泛性癱瘓(包括呼吸癱瘓)和死亡。
解剖學(xué)上，最顯著的改變是脊髓和相連的前側(cè)根萎縮和外側(cè)體的硬化(因此叫肌萎縮性外側(cè)硬化;Williams and Windebank，supra)。在ALS病中上位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元也受到牽涉和變性。盡管由于受上位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的影響而經(jīng)常出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)和前運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)萎縮，但在顯微鏡下，大腦卻是正常的。中樞前皮質(zhì)中的貝茨氏細(xì)胞和其他錐體細(xì)胞廣泛性的受損，伴隨發(fā)生反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生(Hammar et al.，1979，Exp，Neurol 63336-346)。
流行病學(xué)的研究表明環(huán)境因素和遺傳因素在疾病發(fā)展過程中起重要作用(Williams and Windebank，supra)。有人曾認(rèn)為ALS是一種中年疾病，近來更傾向于認(rèn)為它是一種老年疾病(id.)。
目前的療法包括對(duì)癥治療，減輕肌肉痛性痙攣、疼痛、易疲性。假體裝置用于補(bǔ)償肌肉無力，盡管如此，改變疾病進(jìn)程的藥物療法還是極不成功的。促甲狀腺激素釋放激素的公認(rèn)治療優(yōu)點(diǎn)也已遇到矛盾性的結(jié)果(Brooks，1989，Ann，N.Y.Acad.Sci.553431-461)。服用神經(jīng)節(jié)甙脂已經(jīng)無效(Lacomblez.et al.，1989，Neurol.391635-1637)。血漿取出法無論單用還是與免疫抑制療法結(jié)合應(yīng)用都已沒有治療上的優(yōu)點(diǎn)(Olarte et al.，1980，Ann.Neurol，8644-645;kelemen et al.，1983，Arch，Neurol.40752-753。已報(bào)道抗病毒劑胍具有潛在的短期效果，但這種效果不能重現(xiàn)(Munsat et al.，1981，Neurol.311054-1055)在一個(gè)簡短的研究中報(bào)道服用支鏈氨基酸激活谷氨酸脫氫酶可降低患者衰退的速度(Platitakis et al.，1988，Lancet 11015-1018)。近來許多治療試驗(yàn)，有些在進(jìn)行之中，包括全身淋巴系統(tǒng)擴(kuò)散，使用氨基酸N-乙酰半胖氨酸，N-乙酰蛋氨酸，L-蘇氨酸和長期鞘內(nèi)輸入促甲狀腺激素釋放激素(Williams and Windeband，supra)。
與ALS監(jiān)床和病理上相似的動(dòng)物模型包括Mnd小鼠，它是一種常染色體支配的突變體，其表現(xiàn)是后加上的上位和下位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元累進(jìn)性變質(zhì)(Messer and Flaherty，1986，J，Neurogen.3345-355);Wobble小鼠，由于肌肉失去神經(jīng)支配而表現(xiàn)出早年前肢軟弱和萎縮，以及在Brittany獚中表現(xiàn)出犬遺傳性脊柱肌肉萎縮(Sack et al.，1984，Ann Neurol.15369-373;Sillevis et al.，1989，J.Neurol，Sci，91231-258;Bird et al.，1971，Acta Neuropathol 1939-50)。
在近來1991年4月4日公開的WO91/04316PCT申請(qǐng)中(本文引用了該參考文獻(xiàn))已經(jīng)表明睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)能夠促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在體內(nèi)和體外存活，含CNTF明膠海綿植入物易使在分離出的新生小鼠面神經(jīng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活。CNTF是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，它顯示的生物活性與包括BDNF，NT-3，和NGF在內(nèi)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)營養(yǎng)族因子所顯示的生物活性有很大差別。
本發(fā)明涉及肌萎縮性外側(cè)硬化(Lou Gehrig′s)等運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的治療方法，包括給需要這種治療的患者服用有效劑量的神經(jīng)營養(yǎng)因子，這種神經(jīng)營養(yǎng)因子是BDNF/NT-3/NGF分子族成員，并且支持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活、生長和/或分化。據(jù)不完全發(fā)現(xiàn)BDNF和NT-3兩者都能增加培養(yǎng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶的活性，并且由坐骨神經(jīng)向脊髓逆向轉(zhuǎn)運(yùn)。在本發(fā)明優(yōu)選的特定實(shí)施例中，BDNF或NT-3和第二種因子如CNTF一起用于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病治療。
本發(fā)明也提供了促進(jìn)體外運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活，生長和/或分化的方法，這種方法是給運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元培養(yǎng)物加入有效濃度的BDNF/NT-3/NGF基因族成員。
在另外的實(shí)施例中，本經(jīng)明提供了一種鑒別體系，這種體系可以用來鑒別有BDNF或NT-3樣活性的因子，并且可應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的治療。
本發(fā)明還提供了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的動(dòng)物模型，制備這些模型方法是給動(dòng)物免疫接種BDNF/NT-3/NGF族成員或其衍生物，還可給動(dòng)物服用抗BDNF/NT-3/NGF族成員的抗體或BDNF/NT-3/NGF的反義寡聚核苷酸。
BDNF 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子bFGF 基本纖維生長因子CAT 膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶NGF 神經(jīng)生長因子NT-3 神經(jīng)營養(yǎng)素-3

圖1.富含動(dòng)物神經(jīng)元的培養(yǎng)物在無血清，化學(xué)定義的培養(yǎng)基中生長兩天，測(cè)定膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性(cpm/hr/well+/-SEM)。用磷酸鹽緩沖液(PBS)/0.5mg/ml BSA作稀釋劑平皿接種時(shí)以10pg/ml到100ng/ml濃度范圍加入BDNF。對(duì)照組只加入PBS/0.5mg/mlBSA。
圖2.富含運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的培養(yǎng)物在無血清、化學(xué)定義的培養(yǎng)基中生長兩天，測(cè)定膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性(cpm/hr/well+/-SEM)。在平皿接種時(shí)加入用PBS/0.5mg/ml BSA稀釋的GNTF，BDNF，bFGF，NGF和CNTF/BDNF濃度均為50mg/ml。對(duì)照組培養(yǎng)物加入PBS/0.5mg/ml BSA。
圖3.富含運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的培養(yǎng)物在無血清，化學(xué)定義的培養(yǎng)基中生長兩天，測(cè)定膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性(cpm/hr/well+/-SEM)。以10pg/ml到100ng/ml的濃度范圍在平皿接種時(shí)加入NT-3。
圖4.按第8部分描述的方法純化的重組體BDNF在背側(cè)根神經(jīng)節(jié)移出物生物測(cè)定中的劑量-反應(yīng)曲線。
圖5.出生時(shí)單側(cè)面神經(jīng)損害后7天齡小鼠腦干面運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)。a)BDNF治療后的損害一側(cè);b)NT-3治療后的損害一側(cè);c)NGF治療后的損害一側(cè);d)作為對(duì)照BSA治療后的損害一側(cè);e)a)中相同動(dòng)物的未損害側(cè)作為對(duì)照;f)損害且用CNTF治療后作為對(duì)照。放大×400。
為了使公開更清楚，且不作為限定，本發(fā)明的詳細(xì)描述分為以下幾部分(ⅰ)根據(jù)本發(fā)明所使用的BDNF/NT-3/NGF分子族成員;
(ⅱ)治療應(yīng)用;
(ⅲ)體內(nèi)應(yīng)用;
(ⅳ)診斷應(yīng)用;
(ⅴ)檢測(cè)系統(tǒng);和(ⅵ)動(dòng)物模型。
5.1 本發(fā)明所使用的BDNF/NT-3/NGF分子族成員已發(fā)現(xiàn)BDNF或NT-3?？烧T發(fā)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元培養(yǎng)物中膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶活性增加，這表明神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中特定成分可用來促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活，生長和/或分化(見后面的第6、7部分中例子)。觀察到的BDNF和NT-3逆向轉(zhuǎn)運(yùn)到運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的位置腹側(cè)脊髓，支持神經(jīng)營養(yǎng)因子對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元直接作用的觀點(diǎn)(見下面的第9部分舉例)。
本發(fā)明提供了促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活、生長和/或分化的方法，這種方法是使用BDNF/NT-3/NGF分子族成員。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例中，使用BDNF/NT-3/NGF族成分，相對(duì)于未處理的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元而言，可導(dǎo)致用藥的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶活性增加。
在本發(fā)明的最佳實(shí)施例中，BDNF或NT-3用于促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活和/或分化，其中BDNF或NT-3已在1991年3月21日公開的WO91/03568PCT申請(qǐng)中和1991年3月21日公開的WO91/03569PCT申請(qǐng)中描述，本發(fā)明引用這兩篇文獻(xiàn)。如在下面第6和7部分舉例中所示，BDNF或NT-3可用來增加培養(yǎng)基中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性。另外，BDNF/NT-3/NGF分子族的其他成員可按PCT申請(qǐng)中所提出的方法分辨。
只要確定能夠支持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生長和/或分化本文所參考引用的WO91/03568和WO91/03569參考文獻(xiàn)可以用于本發(fā)明。而且，合成的分子，盡管它不同于任何已知BDNF/NT-3/NGF分子族成員的基本結(jié)構(gòu)，它能支持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生長和/或分化，即可用于本發(fā)明。因?yàn)锽DNF和NT-3比NGF更能增加運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性，這種合成分子最好更類似于BDNF和NT-3而不是NGF。
本發(fā)明中所用的BDNF/NT-3/NGF族成分，可用本領(lǐng)域中任何已知方法制得。它們可從天然組織中純提，化學(xué)合成，或重組DNA表達(dá)體系如在原核和真核生物表達(dá)體系中生成。例如，象COS細(xì)胞體系。生成這些分子的方法包括PCT申請(qǐng)WO91/03568和WO91/03569中所描述的方法。
在本發(fā)明的特定優(yōu)選實(shí)施例中，BDNF或NT-3可從表達(dá)BDNF的真核細(xì)胞(如BDNF轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO))的條件培養(yǎng)基中分離。采用兩個(gè)步驟陽離子交換和凝膠過濾色譜法。以BDNF為例，用表達(dá)BDNF的細(xì)胞接種從Opticell生物反應(yīng)器中(Charles River)收集到的條件培養(yǎng)基，并用蒸餾水以1.25∶1比率稀釋，然后連續(xù)裝在S-Sepharose Fast Flow(pharmacia)柱上。例如，稀釋總?cè)萘繛?0.6L經(jīng)大約5天時(shí)間過15ml(1.6cm內(nèi)徑)柱子。柱子用50ml 20mM MES緩沖液pH5.8洗滌，接著用含250mMNaCl的50ml相同緩沖液，再用不含NaCl的相同MES緩沖液洗滌直到在280nm處吸收值達(dá)到基線水平。然后用25ml 20mM N-二(羥乙基)甘氨酸緩沖液pH8.5洗滌，再用含100mM NaCl的15ml相同緩沖液洗滌。柱子依次用150ml，100mM到750mM NaCl梯度的20mM N-二(羥乙基)甘氨酸緩沖液pH8.5洗脫。流速大約為2.5ml/分鐘，洗脫液吸收值在280nm處單位滿刻度0.20吸收率的靈敏度下進(jìn)行測(cè)定。含重組體BDNF的餾分可用DRG移出物生物測(cè)定法來鑒別。具有最高特定活性的餾分與NaCl濃度在500至750nm相對(duì)應(yīng)。合并這些餾分，并用3KDa Omega(Ω)型膜或一個(gè)可使BDNF低程度非特異性結(jié)合的等同膜進(jìn)行高壓超濾濃縮。濃縮樣品然后上到例如一種120ml(1.6cm內(nèi)徑)Sephacryl S-100HR凝膠過濾柱上(pharmacia)。填充柱子并用含400mM NaCl的20mM HEPES緩沖液pH7.6平衡。以0.25ml/分鐘速度洗脫柱子。收集餾分并用DRG移出物生物鑒定法測(cè)定BDNF的活性。在80和90ml之間的洗脫餾分含有生物活性的大腦源性重組生長因子。合并這些餾分并用還原性SDS聚丙烯酰胺電泳分析，進(jìn)行N-末端序列測(cè)定和氨基酸的定量分析。在適當(dāng)處調(diào)節(jié)容量。
BDNF/NT-3/NGF分子族包括由具有與BDNF，NT-3和NGF基本同源的區(qū)域的基因編碼的分子。本發(fā)明所用的BDNF/NT-3/NGF族成員可通過測(cè)試促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存或分化的生物活性來選擇。舉例說明但不作為限定，表現(xiàn)出下列任何一作用的BDNF/NT-3/NGF族成員均可用于本發(fā)明(ⅰ)增加培養(yǎng)基中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活時(shí)間;
(ⅱ)增加在培養(yǎng)基或體內(nèi)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的軸突生長;
(ⅲ)增加在培養(yǎng)基或體內(nèi)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元相關(guān)分子的生成如，膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶或乙酰膽堿酯酶(見下面第6和7部分測(cè)定技術(shù)的舉例);
(ⅳ)減少體內(nèi)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元機(jī)能失調(diào)癥狀。
以上這些作用可用本領(lǐng)域中任何已知方法測(cè)定。優(yōu)選的非限定性實(shí)施方案，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活時(shí)間的增加可用Arakawa等人提到的方法測(cè)定(1990，J，Neurosci，103507-3515);運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突生長增加可用Pestronk等人(1980，Exp.Neurol，7065-82)或Brown等人(1981，Ann，Rev.Neurosci，419-42)提到的方法測(cè)定;運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元相關(guān)分子的生成增加可用生物測(cè)定法，酶測(cè)定法，抗體結(jié)合，Nor-thern印跡分析測(cè)定法，等來測(cè)定，選用什么方法取決于所測(cè)定的分子;運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元機(jī)能失調(diào)可通過分析運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元功能紊亂的內(nèi)科表現(xiàn)例如無力，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元傳導(dǎo)速率，或功能喪失來確定。
在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，本發(fā)明的BDNF/NT-3/NGF族成員可與第二種因子聯(lián)合使用來支持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活和/或分化。第二種因子最好也能有效地促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活和/或分化。例如，在本發(fā)明中的較好實(shí)施例中，BDNF/NT-3/NGF族成員可與CNTF結(jié)合使用以促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活和/或分化。正如在下面第6部分討論的，BDNF與CNTF結(jié)合使用可觀察到對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元CAT活性具有至少一種疊加作用。
5.2治療應(yīng)用本發(fā)明提供了治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病方法，包括給需要這種治療的患者服用有效量的神經(jīng)營養(yǎng)因子，這種神經(jīng)營養(yǎng)因子是BDNF/NT-3/NGF分子族成員并能支持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活，生長或分化。
如本文所用的，所定義的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂指任何能影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元正常功能的狀況。這種失調(diào)可能或不能特異性地或甚至選擇性地影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。例如，本發(fā)明可治療的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂包括但不局限于下面這些功能紊亂。如梗塞、感染、中毒、創(chuàng)傷、外科損傷、退化性疾病或惡性病，這些可影響到運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及神經(jīng)系統(tǒng)的其他成分。本發(fā)明方法也直接用于選擇性影響神經(jīng)元的疾病，如肌萎縮性外側(cè)硬化，并且包括但不局限于此，進(jìn)行性脊柱肌肉萎縮，進(jìn)行性延髓麻痹，初級(jí)外側(cè)僵化，嬰兒和幼年肌肉萎縮，童年進(jìn)行性延髓麻痹(Fazia-Londe綜合癥)，脊髓灰質(zhì)炎和脊髓灰質(zhì)炎后綜合征和遺傳性運(yùn)動(dòng)感覺神經(jīng)病變(進(jìn)行性神經(jīng)性腓骨肌萎縮)。
可用于本發(fā)明的BDNF/NT-3/NGF族成員在上文第5.1部分中已作描述。有效劑量可由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的方法測(cè)得。可以對(duì)有效劑量和毒性劑量(如果有毒性的話)進(jìn)行測(cè)定，任何一已知BDNF/NT-3/NGF族成分都沒有測(cè)定出毒付作用。最好在活體內(nèi)測(cè)得，以分辨出最佳劑量范圍。(參見下文第5.3部分)在本發(fā)明各種特定的實(shí)施例中BDNF/NT-3/NGF族的神經(jīng)營養(yǎng)因子可與至少一種有效劑量的其它藥劑一起使用，所說的這種其它藥劑本身也能促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活、生長和/或分化。例如BDNF/NT-3/NGF族成員可與CNTF一起給藥。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中BDNF和CNTF可一起給藥用于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的治療。
在提及BDNF/NT-3/NGF家族成員的同時(shí)，本發(fā)明也包括使用BDNF/NT-3/NGF族神經(jīng)營養(yǎng)分子的片斷，衍生物、促效藥或拮抗藥。
本發(fā)明神經(jīng)營養(yǎng)因子可用任何藥學(xué)上可接受的載體形式給藥。給藥途徑可以是本領(lǐng)域中任何已知的給藥方式，包括，但不局限于，靜脈給藥，鞘內(nèi)給藥，皮下給藥，向相關(guān)組織內(nèi)注射，動(dòng)脈內(nèi)，鼻內(nèi)，口服給藥或使用一種植入物。本發(fā)明提供藥物組合物，它包含BDNF/NT-3/NGF族的成員如BDNF或NT-3，并含有CNTF，和某種藥學(xué)上可接受的載體。
給藥后可導(dǎo)致本發(fā)明的神經(jīng)營養(yǎng)因子分散于整個(gè)人體或局部區(qū)域中。如在涉及到神經(jīng)系統(tǒng)的相離區(qū)域情況下，適合采用靜脈內(nèi)或鞘內(nèi)給以神經(jīng)營養(yǎng)因子。另外的情況下，但不限制本發(fā)明，當(dāng)涉及到神經(jīng)系統(tǒng)的局部區(qū)域時(shí)，如因創(chuàng)傷或外科手術(shù)引起的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病，適合采用局部給藥。在這種情況下，可以將一個(gè)含有神經(jīng)營養(yǎng)因子的植入物理入損傷區(qū)或其附近。合適的植入物包括但不局限于，凝膠、海綿、蠟、或微小顆粒型植入物。
5.3 體外應(yīng)用本發(fā)明提供了一種提高運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活、生長和/或分化能力的方法，包括露置運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在有效濃度的一種神經(jīng)營養(yǎng)性因子中，該因子是BDNF/NT-3/NGF分子家族的一個(gè)成員，這種方法可用于體內(nèi)(見上)或體外，優(yōu)選方案是，BDNF/NT-3/NGF家族成員是BDNF或NT-3。
在體外試驗(yàn)的情況下，神經(jīng)營養(yǎng)性因子的有效量可根據(jù)具體情況按需要而定，因從不同的組織或不同種類得到的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元對(duì)神經(jīng)營養(yǎng)性因子顯示不同的敏感性。對(duì)任何特定的培養(yǎng)，最好建立一條神經(jīng)營養(yǎng)性因子濃度和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元反應(yīng)性相關(guān)的劑量反應(yīng)曲線，為估價(jià)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活、生長和/或分化，使用例如活體染色估價(jià)存活。相對(duì)照顯微鏡和/或神經(jīng)纖維染色測(cè)定軸突生長或測(cè)定運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元相關(guān)化合物如膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)活性的技術(shù)，來比較露置在BDNF/NT-3/NGF家族成員神經(jīng)營養(yǎng)性因子中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與未露置在該因子中的神經(jīng)元是很有用的。測(cè)定CAT活性可用下述方法，例如，通過收集和溶解處理過或未處理過的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在20mM Tris-鹽酸(pH8.6)溶液中，該溶液含有約0.1% Triton X-100，取出幾微升的等分試樣，用含有0.2ml[1-rC]乙酰輔酶A，300mM NaCl，8mM溴化膽堿、20mMEDTA和0.1mM新斯的明的50mM NaH2(pH7.4)緩沖液作為底物，運(yùn)用micro-Fonnum方法測(cè)定CAT活性，該方法描述在Fonnum，1975，J.Neurochem.24407-409中，其完整的方法在此一并作為參考(也可參見下面的7.1.5節(jié))。
在一個(gè)非限制本發(fā)明的具體實(shí)施例中，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元可通過以下方法在體外制備和培養(yǎng)。從球狀物，感覺神經(jīng)節(jié)和粘性的腦膜無菌獲得和分離至少一部分脊髓，特別是從胚胎生物例如小鼠獲得的脊髓。然后分離腹側(cè)的脊髓，因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)神經(jīng)元座落在脊髓的腹側(cè)(前側(cè))角上。將腹側(cè)脊髓分成小塊和在37℃下接種在含約0.1%胰蛋白酶和0.01%I型脫氧核糖核酸酶的無鈣和鎂的磷酸鹽緩沖液鹽水(PBS)中20分鐘，然后移去胰蛋白酶溶液，漂洗細(xì)胞并將其置于新鮮的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基如45%的Eagle′s最小基本培養(yǎng)基(MEM)，45% Ham′s營養(yǎng)混合培養(yǎng)基F12，5%加熱失活的胎牛血清，5%加熱失活的馬血清，谷氨酰胺(2mM)，青霉素G(0.5U/ml)和鏈霉素(0.5μg/ml)。組織可通過巴斯德玻璃管輕輕搗碎機(jī)械地分解，收集上清液并用尼龍濾器(始Nitex，Tetko;40m)過濾，過濾細(xì)胞懸浮物可使用Schnaar and Schaffer(1981，J，Neurosc.L204-217)的修改方法進(jìn)行分級(jí)。新有步驟在4℃進(jìn)行合適。將甲泛影酰胺溶解在F12MEM培養(yǎng)基(1∶1)中，建立下列不連續(xù)梯度溶液包括18%甲泛影酰胺基液(如0.5ml)，3ml 17%甲泛影酰胺;3ml 12%甲泛影酰胺和3ml 8%甲泛影酰胺過濾細(xì)胞懸浮物(即2.5ml)，通過逐級(jí)梯度溶液分層，試管在2500g下用離心機(jī)(如Sorvall HB4)離心15分鐘，離心液將使細(xì)胞分為三層第一部分(在0-8%界面)，第二部分(在8-12%界面)和第三部分(在12-17%界面)。第一部分富集運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，可取出小量(如約1ml)以無血清的定義培養(yǎng)基沖洗兩次，所說培養(yǎng)基可以是50% F12和50% MEM，加上谷酰胺(2mM)，胰島素(5μg/ml)，轉(zhuǎn)鐵蛋白(100μg/ml)，黃體酮(20nM)，腐胺(100μM)，亞硒酸鈉(30nM，參見Bottenstein and Sato，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76514-517)。可靠的細(xì)胞數(shù)量可通過在錐蟲蘭存在下以血球計(jì)計(jì)數(shù)獲得。富集運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的懸浮物可以100，000細(xì)胞/cm2的密度接種在予先覆蓋有聚L-鳥氨酸(如10μg/ml)和昆布氨酸(Laminin如10μg/ml)的組織培養(yǎng)孔板(優(yōu)選的是6mm)上。然后加入神經(jīng)營養(yǎng)性因子，如在具體實(shí)施例中，BDNF的加入可達(dá)到最終濃度約0.01-100ng/ml，較好是約50nm/ml，或NT-3的加入可達(dá)到最終濃度約.01-100ng/ml，較好是約50ng/ml，或上述濃度的BDNF與濃度至少1ng/ml，較好是10ng/ml的CNTF合用。然后，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元培養(yǎng)物在95%空氣/5%CO2氣和相對(duì)濕度為100%37℃條件下保存在無血清的定義培養(yǎng)基中。
5.4 診斷應(yīng)用本發(fā)明也提供了一種診斷病人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂的方法，包括比較取自病人和取自正常人的樣品中，是BDNF/NT-3/NGF家族成員的神經(jīng)營養(yǎng)性因子水平，以測(cè)定出在病人中與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂正性相關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)性因子的異常水平?？捎杀痉椒ㄔ\斷的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂包括但不限于如上5.2節(jié)列出的那些。
神經(jīng)營養(yǎng)性因子水平可由本領(lǐng)域的任何已知方法進(jìn)行測(cè)定，這些方法包括但不限于酶聯(lián)免疫吸附“夾層”試驗(yàn)或其它任何應(yīng)用抗神經(jīng)營養(yǎng)性因子抗體的試驗(yàn)，包括Western印跡分析和原位雜交，生物活性研究，Northern印跡分析等。
病人樣品可取自任何正常組織或體液，包括但不限于神經(jīng)和腦組織或腦脊髓液或血。
神經(jīng)營養(yǎng)性因子水平異?？山忉尀椴∪撕驼Ｈ松窠?jīng)營養(yǎng)性因子水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。異常可以是比正常水平增加或減少，病人可以是全身性的也可以僅是局部性的。使用神經(jīng)營養(yǎng)性因子會(huì)特別有益于表現(xiàn)出這種因子減少的病人(參見上5.2節(jié))。表現(xiàn)出神經(jīng)營養(yǎng)性因子增加的病人可表達(dá)出非正常因子或可能患因子受體缺乏病。具有少量，或非正常因子受體的病人可通過檢測(cè)取自病人的細(xì)胞以檢查正常神經(jīng)營養(yǎng)性因子受體來辨別，例如，通過比較這種細(xì)胞結(jié)合可測(cè)的標(biāo)記的神經(jīng)營養(yǎng)性因子的能力和正常細(xì)胞的結(jié)合能力。具有少數(shù)受體或非正常受體的病人可能會(huì)也可能不會(huì)得益于補(bǔ)充神經(jīng)營養(yǎng)性因子治療，特別是得益于用神經(jīng)營養(yǎng)性因子拮抗劑類似物治療。
此外，BDNF或NT-3顯示出被運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元逆行轉(zhuǎn)移的發(fā)現(xiàn)提供了一種診斷BDNF或NT-3相關(guān)性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂的方法。包括用某種方式將可測(cè)標(biāo)記的BDNF或NT-3注入，使得標(biāo)記的BDNF進(jìn)入一種運(yùn)動(dòng)神經(jīng)，并測(cè)定標(biāo)記的BDNF或NT-3是否逆向轉(zhuǎn)移，其中逆向轉(zhuǎn)移的失敗與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元機(jī)能失調(diào)相關(guān)。這種方法可用于但不限于診斷肌萎縮性測(cè)索硬化，進(jìn)行性脊柱肌肉萎縮，嬰兒肌肉萎縮，脊髓灰質(zhì)炎，后灰質(zhì)綜合癥，進(jìn)行性神經(jīng)性腓骨肌萎縮和神經(jīng)創(chuàng)傷或損傷。
5.5檢測(cè)系統(tǒng)本發(fā)明提供了辨別那些可用于治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂的化合物的檢測(cè)系統(tǒng)，此試驗(yàn)系統(tǒng)評(píng)價(jià)某種被測(cè)試劑阻礙BDNF或NT-3與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元結(jié)合的能力。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)某試劑提高運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活、生長或分化能力的方法，包括在標(biāo)記的BDNF或NT-3能與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元結(jié)合的條件下，露置的培養(yǎng)物中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元于可測(cè)標(biāo)記的BDNF或NT-3(或任何合適的BDNF/NT-3/NGF家族成員)。同時(shí)露置運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在測(cè)試試劑中，其中測(cè)試試劑對(duì)標(biāo)記BDNF或NT-3結(jié)合的抑制表明試驗(yàn)試劑可應(yīng)用于治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂。在這種試驗(yàn)系統(tǒng)中為陽性的那些試驗(yàn)試劑需要在體外或體內(nèi)進(jìn)一步估價(jià)其提高培養(yǎng)中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活生長或分化的能力。為陰性的試劑有些情況下可以是BDNF或NT-3樣活性的拮抗劑。
BDNF或NT-3可以用任何方法進(jìn)行可測(cè)性標(biāo)記，包括結(jié)合上放射性標(biāo)記的氨基酸，和連接一個(gè)可測(cè)的“末端”到神經(jīng)營養(yǎng)性因子分子上，這樣一個(gè)末端可以是熒光性的，可以有酶活性，可以是一個(gè)與神經(jīng)營養(yǎng)性因子結(jié)合的抗體，可以是抗原性的，并能夠結(jié)合抗體(例如，部分myc抗原能與抗-myc抗體結(jié)合)。
按照本發(fā)明，可應(yīng)用的試驗(yàn)試劑包括，但不限于，是BDNF/NT-3/NGF家庭成員的神經(jīng)營養(yǎng)性因子或其片斷的衍生物，其它肽類化合物、肽衍生物，和非肽類化合物。
在具體的，但非限定本發(fā)明的實(shí)施例中給出了一個(gè)例子，在允許BDNF結(jié)合的條件下，將放射性標(biāo)記的BDNF與非標(biāo)記的試驗(yàn)試劑和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在培養(yǎng)基中培養(yǎng)。作為比較，將相同的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元培養(yǎng)物露置于放射性標(biāo)記的BDNF中(無試驗(yàn)試劑)，如果試驗(yàn)試劑能結(jié)合BDNF受體，它便可競爭性抑制標(biāo)記BDNF的結(jié)合。當(dāng)后來清洗細(xì)胞以除去未結(jié)合的BDNF時(shí)，包含試驗(yàn)試劑的培養(yǎng)物可望較對(duì)照培養(yǎng)物具有較小的放射性。
5.6動(dòng)物模型系統(tǒng)本發(fā)明進(jìn)一步提供了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元系亂的動(dòng)物模型系統(tǒng)，包括那些系統(tǒng)或全部缺失BDNF或NT-3的動(dòng)物。BDNF或NT-3的全部缺失可以通過產(chǎn)生一種能表達(dá)抗BDNF或NT-3抗體的動(dòng)物而完成，這類動(dòng)物可以是用取自其它動(dòng)物種類的BDNF或NT-3或那些被化學(xué)修飾成有較強(qiáng)免疫性的BDNF或NT-3免疫動(dòng)物產(chǎn)生的。局部缺失可通過在局部引入抗BDNF或抗NT-3抗體產(chǎn)生，例如，通過在中央前回附近植入雜交瘤產(chǎn)生。更進(jìn)一步，可制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，這種動(dòng)物的內(nèi)源性BDNF或NT-3基因通過同源重組而且被“缺失”。
6實(shí)施例BDNF增加腹側(cè)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元培養(yǎng)物中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性6.1材料和方法6.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所有試驗(yàn)采用sprague-Dawleg小鼠(HSD或Zivic-Miller)胚胎(E14)，孕鼠用CO2窒息處死，然后迅速取出胚胎，置入冰凍的培養(yǎng)基中以備解剖用。
6.1.2.組織培養(yǎng)技術(shù)在無菌條件下，從孕14天的鼠胚胎中移出脊髓，脊髓從尾部和延髓(在第一脊神經(jīng)節(jié)處)切斷，去除感覺神經(jīng)節(jié)和粘性腦脊膜，然后將脊髓索部分分成腹側(cè)和中背部分分別培養(yǎng)。將腹側(cè)脊髓組織切成小塊，在0.1%胰蛋白酶(GIBCO)，0.01% I型脫氧核糖核酸酶(sigma)的無鈣鎂磷酸緩沖鹽液(PBS)中37℃培養(yǎng)20分鐘，然后去除胰蛋白溶液，沖洗細(xì)胞，然后加入到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基由45% Eagle′s最小必須培養(yǎng)基(MEM)，45% Ham′s營養(yǎng)混合物F12(F12)，5%熱失活胎牛血清(GIBCO)，5%熱失活馬血清(GIBCO)，谷氨酸(2mM)，青霉素G(0.5μ/ml)和鏈霉素(0.5μg/ml)組成。然后將組織用巴斯德管輕輕研磨機(jī)械分離，收集上清液，用尼龍過濾器(Nitex，Tetko;40μm)過濾。然后將過濾細(xì)胞懸浮液用于下述6.13部分所述的分餾步驟。
6.1.3對(duì)腹側(cè)脊髓細(xì)胞進(jìn)行甲泛影酰胺密度梯度分級(jí)分離本分級(jí)分離的方法是Schnaar和Schaffner所述的方法(1981，J.Neurosci，1204-217)的改進(jìn)方法。所有的步驟都在4℃溫度下進(jìn)行。將甲泛影酰胺溶于F12MEM(1∶1)的培養(yǎng)基，建立一個(gè)不連續(xù)梯度液，包括18%甲泛影酰胺緩沖液(0.5ml)，3ml 17%甲泛影酰胺，3ml 12%甲泛影酰胺和3ml 8%甲泛影酰胺。由上述方法獲得的2.5ml過濾的腹側(cè)脊髓細(xì)胞懸浮液在梯度液中分層，試管用離心機(jī)(Sorvall HB4)2500g離心15分鐘，離心液分為三層細(xì)胞液第一部分(在0-8界面)，第二部分(在8-12%界面)，第三部分(在12-17%界面)，第一部分富含運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。在這0-8%的界面移出一小部分體積(大約1ml)，用含有50%F12和50% MEM谷氨酸(2mM)，胰島素(5μg/ml)轉(zhuǎn)鐵蛋白(100μg/ml)，孕酮(20nM)，腐胺(100μM)和亞硒酸鈉(30mM)的無血清定義培養(yǎng)基洗滌兩次(Bottenstein and Sato，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76514-517)。在錐蟲藍(lán)存在的條件下用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)活細(xì)胞。然后將第一部分的細(xì)胞懸浮液(富含運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)以密度為100，0000細(xì)胞/cm2接種到預(yù)先裝涂聚-L-鳥氨酸(Sigma，10μg/ml)和昆布氨酸(Laminin)(GIBCO;10μg/ml)的6mm培養(yǎng)孔中。接種的當(dāng)天用生長因子(CNTF和BDNF)處理，在相對(duì)濕度近100%，溫度為37℃的95%空氣/5% CO2氣中將培養(yǎng)物保持在無血清定義培養(yǎng)基中。兩天后(48小時(shí))采收細(xì)胞，測(cè)量膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT;Fonnum，1975，J，Neurochem.24407-409)和參見下述7.1.5節(jié)。
6.1.4 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)BDNF用CHO細(xì)胞產(chǎn)生和從CHO細(xì)胞條件培養(yǎng)基中純化，均質(zhì)度用丙烯酰胺凝膠和氨基酸序列分析評(píng)價(jià)(見下述8節(jié))。
6.1.5.睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)所有試驗(yàn)所用的CNTF為在大腸桿菌中表達(dá)并純化的重組鼠CNTF。用Masiakowski et al.WO 91/04316中描述的方法。
6.1.6 其它因子研究中采用的NGF(2.55)用Mobley等，1976，Biochemistry 155543-5551)所述的方法從小鼠唾液腺中純化，基本的FGF從協(xié)作研究者獲得。
6.2 結(jié)果6.2.1 BDNF對(duì)膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶活性的效果與未處理的對(duì)照相比，用BDNF處理的富含運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元培養(yǎng)物48小時(shí)后CAT活性顯示出有4-5倍的最大激發(fā)。如圖1所示，CAT活性的增長似乎取決于BDNF劑量，其最大反應(yīng)劑量為大約10ng/ml。
6.2.2.BDNF和CNTF合用對(duì)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的影響。
由于睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)顯示出提高小鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在體外的存活能力(Wong等，1990，Soc.Neurosci.Abst.)。我們尋求確定這兩種因子(BDNF和CNTF)所引起的CAT活性增加是有疊加作用。結(jié)果表明，飽和濃度的BDNF(50ng/ml)和CNTF 50ng/ml共同使用對(duì)培養(yǎng)物中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的CAT活性不只是疊加增加(圖2)，表明兩種因子是協(xié)同作用并具有不同的調(diào)節(jié)通路。BDNF和CNTF的共同加入所得的最大相加效果比對(duì)照高出15倍。與對(duì)照培養(yǎng)物相比NGF或bFGF對(duì)CAT活性都不具顯著的影響(圖2B)。
脊髓腹側(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的退化和壞死是肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS;LouGehrig′s disease)，脊髓損傷和其它運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病病理生理過程的主要方面。上述結(jié)果表明，BDNF單獨(dú)或與CNTF一塊使用治療上述疾病時(shí)可以促進(jìn)膽堿能表達(dá)。
7實(shí)施例NT-3處理增加脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元培養(yǎng)物中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性7.1 材料和方法7.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Sprague-Dawley鼠(HSD或Zivic-Miller)的胚胎(階段E14)用于所有的實(shí)驗(yàn)，通過CO2窒息處死懷孕鼠迅速摘取胚胎并放置在冰冷的培養(yǎng)基中，以備進(jìn)一步分離。
7.1.2 組織培養(yǎng)方法將脊髓從妊娠14天的小鼠胚胎中無菌地摘取并按在上面的6.1.2節(jié)中敘述的已有技術(shù)制備。
7.1.3.用甲泛影酰胺密度梯度分級(jí)分離腹側(cè)脊髓細(xì)胞分級(jí)分離方法是按在6.1.3節(jié)中所述進(jìn)行，不同的是在接種當(dāng)天用NT-3處理細(xì)胞。如圖3所示，與未處理的對(duì)照組相比，以NT-3處理能引起運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元CAT活性的3-4倍的最大激發(fā)。CAT活性的增長依賴于劑量，最大增長可達(dá)1ng/ml。
7.1.4 神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3)如下面第8節(jié)所述制備BDNF的方法，NT-3是由CHO細(xì)胞產(chǎn)生的，并是從CHO細(xì)胞條件培養(yǎng)基中純化得到的同種純化物。并由銀染色聚丙酰胺凝膠和氨基酸序列分析進(jìn)行評(píng)價(jià)。
7.1.5.膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的分析通過溶解細(xì)胞于含有0.1% Triton X-100的20mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris-HCl)(pH8.6)溶液中得到培養(yǎng)物。取2微升的細(xì)胞溶解物按micro-Fonnum方法(Fonnum，1975，J.Neurochem.24407-409)進(jìn)行膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性分析。最后的底物組合物由0.2mM[1-14C]乙酰輔酶A(NEN，54.4mCi/mmol)，300mM氯化鈉，8mM溴化膽堿，20mM EDTA和0.1mM新斯地明的50mM磷酸二氫鈉(pH7.4)緩沖液組成。在這種酶和底物濃度下，使酶反應(yīng)連續(xù)進(jìn)行90-120分鐘。膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)的特異性可通過在測(cè)定過程中加入一種特定的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性抑制劑來進(jìn)行檢查。該抑制劑為N-羥乙基-4-(1-萘基乙烯基)苯基偶氮二氫基吡啶(HNP)(White and Cavallito 1970，J，Neurochem.171579-1589)。
7.2 結(jié)果如上述所討論的，在脊髓腹側(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的衰退和死亡是肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化(ALS，Lou Gehrig′s病)，脊髓損傷和其他運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病病生理過程的主要因素。目前的結(jié)果表示NT-3處理的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中增強(qiáng)了膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性，這表明NT-3可用于治療這些疾病而促進(jìn)膽堿能的表達(dá)。
8實(shí)施例從中國倉鼠卵巢細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中純化重組腦源性生長因子的步驟8.1 材料和方法通過由陽離子交換和凝膠過濾色譜法組成的兩個(gè)步驟，將重組BDNF從CHO細(xì)胞條件培養(yǎng)基中分離出來。
對(duì)從Opticell生物器(Charles River)中收集到的接種了可表達(dá)BDNF的CHO細(xì)胞的條件培養(yǎng)基 用蒸餾水稀釋(比例1.25∶1)。4℃下連續(xù)裝入15ml(1.6cm內(nèi)徑)S-瓊脂糖快速S-Sepharose Fast Flow(pharmacia)柱中。10.6升(稀釋過的)總體積過柱五天。該柱用pH5.8和50ml的20mM MES緩沖液(4-嗎啉乙烷-磺酸溶液，用氫氧化鈉調(diào)pH到5.8)洗滌，再經(jīng)50ml含有250mM氯化鈉的同樣的緩沖液洗滌，再經(jīng)不含氯化鈉同樣的MES緩沖液洗滌直到在250nm處的吸收率達(dá)到基線水平。然后該柱用25ml pH8.5的20mM N-二(羥乙基)甘氨酸緩沖液洗滌。再經(jīng)15ml含有100mM氯化鈉的同樣緩沖液洗滌。接著，該柱用150毫升，100mM到750mM梯度氯化鈉的20mM N-二(羥乙基)甘氨酸緩沖液(pH8.8)進(jìn)行洗脫，流速為2.5ml/分鐘，洗脫的吸收率在280nm，單位滿刻度0.2吸收率的靈敏度下進(jìn)行檢測(cè)。含有重組BDNF的餾分經(jīng)脊神經(jīng)節(jié)(DRG)移出生物檢定進(jìn)行鑒別。最高特異性活性的餾分與氫氧化鈉濃度在500和750mM之間相對(duì)應(yīng)。這些餾分合并(45ml)并使用KDa Omega型膜高壓膜超濾出濃縮至2ml，選擇可使BDNF低非特異結(jié)合的膜。濃縮的樣品再置于120ml(1.6cm內(nèi)徑)Sephaeryl S-100 HR凝膠過濾柱上(Pharmacia)。該柱填充后以pH7.6含有400mM氯化鈉的20mM HEPES緩沖劑平衡。該柱以0.25ml/分鐘的速度洗脫，收集2ml量的餾分并以DRG移植生物檢定法對(duì)BDNF活性進(jìn)行檢定，發(fā)現(xiàn)在80到90毫升之間洗脫的流分含有生物活性重組BDNF，合并這些餾分并采用還原性SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，N-末端序列測(cè)定和氨基酸定量分析法進(jìn)行分析。凝膠電泳(18%聚丙烯酰胺)顯示兩條與細(xì)胞素C同時(shí)遷移的相近分離譜帶。N-末端分析和氨基酸定量分析使用標(biāo)準(zhǔn)的步驟來進(jìn)行。
N-末端序列分析表明，分離出的物質(zhì)由全長度BDNF(約66%)和缺少前6個(gè)氨基酸殘基的截?cái)郆DNF組成。樣品的氨基酸定量分析顯示蛋白質(zhì)濃度大約平均值為0.043mg/ml，根據(jù)這個(gè)值的計(jì)算，最終純生物活性BDNF的產(chǎn)量為0.430毫克，DRG移植生物檢定要求該材料半飽和量大約為1.2ng/ml。
8.2結(jié)果BDNF的氨基酸定量分析純化的BDNF的氨基酸定量分析在貝克曼(Beckman)6300氨基酸分析儀上完成，結(jié)果(表Ⅰ)表明，蛋白質(zhì)的平均濃度約為0.043Mg/ml，圖4描繪了通過標(biāo)準(zhǔn)DRG移植生物檢定所得出的BDNF量數(shù)曲線。
表Ⅰ BDNF序列分析樣品1腦來源的神經(jīng)營養(yǎng)性因子餾分＃23，BDNF＃2，100μl，20mM HEPES和400mM NaCl。
樣品用75%丙酮冰凍(-20℃)過夜沉淀，在13000rpm下離心10分鐘收集蛋白沉淀物，溶解在70%三氟乙酸中的蛋白質(zhì)被測(cè)定序列周期 序列Ⅰ 序列Ⅱ 參照1 His 17.5pmol Arg 18.6pmol His2 Ser 14.1 Gly 8.5 Ser3 Asp 26.2 Glu 8.8 Asp4 Pro 25.0 Leu 10.8 Pro5 Ala 36.0 Ser 12.3 Ala6 Arg 54.6 Val 19.0 Arg7 Arg 44.1 - Arg8 Gly 16.9 Asp 8.2 Gly9 Glu 13.6 Glu10 Leu 10.7 Leu11 Ser 7.4 Ser12 Val 15.7 Val13 - Cys14 Asp 8.1 Asp15 Ser 4.0 Ser16 Ile 5.0 Ile估計(jì)量蛋白Ⅰ36.0×2.5＝90.1pmol(ALa-5)蛋白Ⅱ19.0×2.5＝47.7pmol(Val-6)蛋白Ⅰ和蛋白Ⅱ的比率為2.1。
9 實(shí)施例125I-BDNF和125I-NT-3向鼠腹側(cè)脊髓的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)。
9.1 材料和方法9.1.1 神經(jīng)營養(yǎng)因子用前面第8節(jié)所述方法，在條件培養(yǎng)基中制備重組體。BDNF和NT-3用乳過氧化物酶方法對(duì)BDNF和NT-3進(jìn)行放射性碘標(biāo)記(Yipet al;1983，J.Neurosci.32172-2182)至3000-7800cpm/fmol的特定活性。在轉(zhuǎn)移研究前除去游離125I。
9.1.2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性Sprague-Dawley鼠(250-300g)從Zivic Miller獲得，用于所有的逆向轉(zhuǎn)移研究。
9.1.3.逆向轉(zhuǎn)移研究以每公斤體重3ml的水合氯醛(4%)和戊巴比妥鈉(88%)混合物麻醉鼠。暴露坐骨神經(jīng)并在閉孔內(nèi)肌腱遠(yuǎn)側(cè)0.4cm處弄破10秒鐘，損傷的目地是暴露最大數(shù)量的受體點(diǎn)以使BDNF接近。損傷后，在損傷位置注入2μl含有125I-標(biāo)記的BDNF或NT-3的10mg/ml BSA的液或注入末標(biāo)記的BDNF，NT-3或NGF(超過100倍)PBS/BSA緩沖液。16ng BDNF 14ng NT-3的總量被注入(分別為4×106和2.2×106cpm)。傷口被縫合，讓鼠恢復(fù)18小時(shí)。殺死鼠，取出腰4和腰5脊髓片斷并切成右(同側(cè)的)和左(對(duì)側(cè)的)兩半。樣品放置在4%仲甲醛磷酸鹽(pH7.4)緩沖液中，以gamma計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)以每個(gè)右或左脊髓轉(zhuǎn)移的125I神經(jīng)營養(yǎng)因子的渺摩爾(10-18摩爾)±S.E.M表示。
9.2 結(jié)果表Ⅱ顯示了在損傷坐骨神經(jīng)部位注入125I-BDNF的鼠脊髓中有-BDNF的積累。在注射的一邊觀察到有計(jì)數(shù)(每分鐘300-400計(jì)數(shù)，相當(dāng)于約50渺摩爾)，但是與在對(duì)測(cè)邊積累的背景計(jì)數(shù)相近。對(duì)測(cè)邊出現(xiàn)低的積累計(jì)數(shù)可能起源于通過系統(tǒng)循環(huán)從注射邊泄漏到有意義邊。對(duì)脊髓轉(zhuǎn)移研究來說這種背景計(jì)數(shù)通常是注射邊的15-25%，并在整個(gè)試驗(yàn)中保持相對(duì)不變。超過100倍的BDNF明顯阻礙轉(zhuǎn)移，而NGF和NT-3(＞100倍)僅部分阻礙轉(zhuǎn)移。脊髓組織的乳液自動(dòng)放射照片分析揭示有大的腹側(cè)角神經(jīng)元(在腹側(cè)角的背外側(cè)四分體中)被標(biāo)記，這種神經(jīng)元形態(tài)上表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。在背側(cè)脊髓中，僅可見背景標(biāo)記表Ⅱ125I-BDNF逆向轉(zhuǎn)移至鼠脊髓渺摩爾注射 R L125I-IBDNF+PBS 56±15 10±4125I-BDNF+BDNF 7±3* 3±1125I-BDNF+NT-3 35±1 6±3125I-BDNF+NGF 48±5 8±3所有試驗(yàn)中BDNF注入右邊損傷的座骨神經(jīng)。
結(jié)果用3-4只動(dòng)物的平均數(shù)±S.E.M表示。
R.右脊髓;L.左脊髓＊P.與125I-BDNF+PBS比較＜0.05
表Ⅲ揭示了NT-3也被轉(zhuǎn)移到脊髓中去，超過100倍的同源配位體明顯減少轉(zhuǎn)移，但NGF和BDNF對(duì)NT-3的轉(zhuǎn)移沒有明顯作用。
表Ⅲ125I-NT-3逆向轉(zhuǎn)移至鼠脊髓渺摩爾NT-3注射 R L125I-NT-3+PBS 37±3 14±9125I-NT-3+NT-3 16±7* 11±6125I-NT-3+BDNF 28±5 10±2125I-NT-3+NGF 32±6 18±4結(jié)果用3-4只動(dòng)物的平均數(shù)±S.E.M.表示。
R，右脊髓;L，左脊髓＊P與125I-NT-3+PBS比較＜0.0510.實(shí)施例 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)性因子和神經(jīng)營養(yǎng)物-3支持新生鼠的損傷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活下列數(shù)據(jù)由Max-Planck精神病學(xué)院神經(jīng)化學(xué)和神經(jīng)生物化學(xué)系的M.Sendtner，B.Holtmann，R.Kolbeck，H.Thoenen和Y.-A.Barche的手稿提供。
10.1材料和方法10.1.1 外科學(xué)和組織學(xué)方法按照Sendtner等人(1990，Nature，345440-441)描述的方法進(jìn)行幼鼠右側(cè)面神經(jīng)橫切實(shí)驗(yàn)。概括地說，新生Wistar鼠通過低溫麻醉，直接在右耳后切出約3mm長的口子。面部神經(jīng)在基突乳突處暴露，在距這個(gè)位置約1mm處橫切兩神經(jīng)根。凝膠泡沫(Spongostan，Paesel，F(xiàn)rankfurt，Germany)被切成小塊(1×1×3mm)，浸入含有5μg BSA(Cohn Fraction V，Sigme，Deisenhofen，Germanoy)或營養(yǎng)因子的30μl PBS中。凝膠泡沫插于損傷部位，固定在覆蓋這個(gè)部位的韌帶下。皮膚以絲織物(Ethikon3-0)濕潤，并將該動(dòng)物歸還給它們的母親。出生后七天，通過超劑量乙醚和經(jīng)血管灌注50ml 4%甲醛處死動(dòng)物。解剖腦干，固定1小時(shí)后，以水沖洗，用遞增濃度的乙醇(70-100%)脫水，在石蠟打底后，將全部腦干用系列切片機(jī)(Reichert-Jung 2050 Supercut)制成系列切片(7μm)，切片以羥甲苯基紫羅蘭(Sigma，Deisenhofen，Germany)染色，對(duì)比邊和損傷邊的面部運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元核仁在光學(xué)顯微鏡(放大125×)下計(jì)數(shù)，按Sendtnea等人描述的方法每隔5片計(jì)數(shù)，其計(jì)數(shù)沒有用分裂核進(jìn)行校正。
10.1.2 NGF，BDNF和NT-3的產(chǎn)生和特性從成熟雄性鼠的頜下腺分離神經(jīng)生長因子(2.5S)，重組鼠BDNF和NT-3均可通過重組牛痘病毒轉(zhuǎn)染的兔腎細(xì)胞產(chǎn)生，并可從上清液純化。
10.2 結(jié)果如果面部運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突被切斷和損傷，則80%以上的損傷細(xì)胞可在幾天內(nèi)變化退化。CNTF應(yīng)用于損傷部位顯示出增加這種細(xì)胞的存活率將近100%，在相同的條件下，應(yīng)用5μg NGF不能明顯提高運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活能力。
與用NGF處理的動(dòng)物相反，如果BDNF應(yīng)用于切斷的面部神經(jīng)，可觀察到較高的存活率。平均50%的損傷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)在損傷后一周仍然存活(表Ⅳ)。損傷部位神經(jīng)元的存活率范圍為765至4580。在僅765個(gè)神經(jīng)元可被測(cè)得的動(dòng)物中，包含營養(yǎng)因子的凝膠泡沫已從損傷部位移位，這可能解釋這一個(gè)實(shí)驗(yàn)中觀察到的BDNF的低存活作用。
和用BDNF的結(jié)果一樣，在NT-3處理后也能提高運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活能力(表Ⅳ)。然而其作用小于BDNF的作用，平均27%的損傷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元可在損傷部位被挽救，相比而言BSA可使18%的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元被挽救，NT-3提高存活能力的作用在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著意義(P＜0.05)。
形態(tài)上，以BDNF和NT-3處理動(dòng)物的損傷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞體較小，顯示出典型的反應(yīng)性變化(表5)。BDNF和NT-3處理的動(dòng)物中，細(xì)胞核被移位，染色質(zhì)溶解顯著，然而，當(dāng)與用BSA-凝膠泡沫處理的對(duì)照動(dòng)物比較時(shí)，細(xì)胞核體積顯得較大，(圖5)。
表Ⅳ新生鼠面神經(jīng)損傷后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活能力神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用
10.3討論在本發(fā)明的研究中，我們發(fā)現(xiàn)BDNF能夠支持新生鼠大量面部運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸索切斷后的存活。此外，雖活性較低，NT-3似乎對(duì)這些細(xì)胞也有活性。相反NGF卻不支持這些細(xì)胞軸突切斷后的存活。這些數(shù)據(jù)說明，神經(jīng)營養(yǎng)因子基因家族成員能以類似CNTF的方式在體內(nèi)影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活。
本文引用了幾篇對(duì)比文獻(xiàn)，其中所述內(nèi)容全部一并引用作為參考。
權(quán)利要求
1.一種治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂的方法，包括給需要該治療的病人使用有效量的神經(jīng)營養(yǎng)性因子，該因子(ⅰ)是BDNF/NT-3/NGF分子家族的一個(gè)成員，(ⅱ)支持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活、生長或分化。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中BDNF/NT-3/NGF分子家族的成員是BDNF。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中BDNF/NT-3/NGF分子家族的成員是NT-3。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂是由肌萎縮性側(cè)索硬化引起的
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂是由損傷引起的
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂是由進(jìn)行性脊柱肌肉萎縮引起的。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂是由嬰兒或幼年性肌肉萎縮引起的。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂是由脊髓灰質(zhì)炎或脊髓灰質(zhì)炎后綜合癥引起的。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂是由進(jìn)行性神經(jīng)性腓骨肌萎縮引起的。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的BDNF/NT-3/NGF家族的成員與有效量的至少一種能提高運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活，生長或分化能力的其它試劑共同使用。
11.如權(quán)利要求10的方法，其中的其它試劑是睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子。
12.一種可用于治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂的藥物組合物，包括一種支持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活、生長或分化的BDNF/NT-3/NGF家族成員與一種藥理上可接受的載體。
13.如權(quán)利要求12的藥物組合物，其中的BDNF/NT-3/NGF家族成員是BDNF。
14.如權(quán)利要求12的藥物組合物，其中的BDNF/NT-3/NGF家族成員是NT-3。
15.一種提高運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活、生長和/或分化能力的方法，包括將運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元暴露在有效濃度的神經(jīng)營養(yǎng)性因子中，該營養(yǎng)因子是BDNF/NT-3/NGF分子家族的一種成員，它們能提高運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活、生長或分化能力。
16.如權(quán)利要求15的方法，它是在體外進(jìn)行的。
17.如權(quán)利要求15的方法，它是在體內(nèi)進(jìn)行的。
18.如權(quán)利要求15的方法，其中的BDNF/NT-3/NGF家族成員是BDNF。
19.如權(quán)利要求15的方法，其中的BDNF/NT-3/NGF家族成員是NT-3。
20.一種診斷病人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂的方法，包括比較取自病人和取自正常人的樣品中的是BDNF/NT-3/NGF家族成員的神經(jīng)營養(yǎng)性因子水平含量，以測(cè)定在病人中與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂正性相關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)性因子的異常水平。
21.如權(quán)利要求20的方法，其中的BDNF/NT-3/NGF家族成員是BDNF。
22.如權(quán)利要求20的方法，其中的BDNF/NT-3/NGF家族成員是NT-3。
23.如權(quán)利要求20的方法，其中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂是肌萎縮性側(cè)索硬化。
24.一種測(cè)試能提高運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活、生長或分化能力的試驗(yàn)試劑的檢測(cè)方法，包括(a)在標(biāo)記的BDNF能同運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元結(jié)合的條件下暴露運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在可測(cè)的標(biāo)記BDNF中，(b)同時(shí)暴露所說運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在試驗(yàn)試劑中，其中試驗(yàn)試劑對(duì)標(biāo)記BDNF結(jié)合的抑制作用表明該試驗(yàn)試劑可用于治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂。
25.一種測(cè)試能提高運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活、生長或分化能力的試驗(yàn)試劑的檢測(cè)方法，包括(a)在標(biāo)記的NT-3能同運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元結(jié)合的條件下暴露運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在可測(cè)的標(biāo)記的NT-3中，(b)同時(shí)暴露所說運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在試驗(yàn)試劑中，其中試驗(yàn)試劑對(duì)標(biāo)記的NT-3結(jié)合的抑制作用標(biāo)志著試驗(yàn)試劑用于治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂的實(shí)用性。
26.一種制備基本上純化的重組BDNF的方法，包括(ⅰ)在一種真核細(xì)胞中表達(dá)重組BDNF;(ⅱ)收集由步驟(ⅰ)的真核細(xì)胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基;(ⅲ)用蒸餾水稀釋培養(yǎng)基;(ⅳ)將稀釋的培養(yǎng)基上S-瓊脂糖(凝膠)柱(Sepharose)以約100-750mM的鹽梯度洗脫;(ⅴ)收集洗脫餾分;(ⅵ)合并具有BDNF活性的組分;(ⅶ)濃縮步驟(ⅵ)的組分，(ⅷ)將步驟(ⅶ)的濃縮組分上Sephacryl S-100HR凝膠過濾柱;和(ⅸ)以含有400mM NaCl(PH7.6)的溶液洗脫步驟(ⅷ)的柱子。
27.一種制備基本上純化的重組NT-3的方法，包括(ⅰ)在一種真核細(xì)胞中表達(dá)重組NT-3;(ⅱ)收集由步驟(ⅰ)的真核細(xì)胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基;(ⅲ)用蒸餾水稀釋培養(yǎng)基;(ⅵ)將稀釋的培養(yǎng)基上S-瓊脂糖(凝膠)柱，以約100-750mM的鹽梯度洗脫，(ⅴ)收集洗脫物流出組分，(ⅵ)合并具有NT-3活性的組分，(ⅶ)濃縮步驟(ⅵ)的組分，(ⅷ)將步驟(ⅶ)的濃縮組分上Sephacryl S-100HR凝膠過濾柱，(ⅸ)以含有約400NaCl(PH7.6)的溶液洗脫步驟(ⅷ)的柱子。
28.一種診斷BDNF相關(guān)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂的方法，包括注射可測(cè)的標(biāo)記的BDNF，以使得標(biāo)記的BDNF進(jìn)入一種運(yùn)動(dòng)神經(jīng)，測(cè)定標(biāo)記的BDNF是否逆向轉(zhuǎn)移，如果逆向轉(zhuǎn)移失敗，說明運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元功能喪失。
29.如權(quán)利要求28的方法，其中的紊亂屬于下列一組疾病中的一種肌萎縮性側(cè)索硬化，進(jìn)行性脊柱肌肉萎縮，嬰兒肌肉萎縮，脊髓灰質(zhì)炎，脊髓灰質(zhì)炎后綜合癥，進(jìn)行性神經(jīng)性腓骨肌萎縮，神經(jīng)創(chuàng)傷或損傷。
30.一種診斷NT-3相關(guān)性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂的方法，包括用某種方式將可測(cè)的標(biāo)記的NT-3注入，使標(biāo)記的NT-3進(jìn)入一種運(yùn)動(dòng)神經(jīng)，測(cè)定標(biāo)記的NT-3是否逆向轉(zhuǎn)移，其中，逆向轉(zhuǎn)移的失敗與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元機(jī)能失調(diào)相關(guān)。
31.如權(quán)利要求30的方法，其中的紊亂屬于下列一組疾病中的一種肌萎縮性側(cè)索硬化，進(jìn)行性脊柱肌肉萎縮，嬰兒肌肉萎縮，脊髓灰質(zhì)炎，脊髓灰質(zhì)炎后綜合癥，進(jìn)行性神經(jīng)性腓骨肌萎縮，神經(jīng)創(chuàng)傷或損傷。
全文摘要
本發(fā)明涉及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂例如肌萎縮性側(cè)索硬化(Lou Gehriy氏病)的治療方法，包括給需要該治療的病人使用有效量的神經(jīng)營養(yǎng)性因子，該因子是BDNF/NT-3/NGF分子家族的一個(gè)成員。本發(fā)明部分地基于BDNF和NT-3均能增加運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元培養(yǎng)物中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的發(fā)現(xiàn)。在本發(fā)明特定優(yōu)選實(shí)施例中BDNF或NT-3和一種第二試劑如CNTF的聯(lián)合使用，可用于治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病。本發(fā)明也提供提高運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在體外存活，生長和/或分化能力的方法，診斷方法和檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可被用于辨別具有BDNF或NT-3樣活性。
文檔編號(hào)A61KGK1071585SQ92105070
公開日1993年5月5日 申請(qǐng)日期1992年5月19日 優(yōu)先權(quán)日1991年7月10日
發(fā)明者V·王, C·拉濟(jì)祖斯基, P·迪施特凡諾 申請(qǐng)人:里珍納龍藥品有限公司, 馬克斯普朗克科學(xué)促進(jìn)協(xié)會(huì)