專(zhuān)利名稱(chēng)：豬旋毛蟲(chóng)病疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制劑-疫苗的制備方法，涉及寄生蟲(chóng)病的疫苗制備，即對(duì)豬有免疫預(yù)防作用的旋毛蟲(chóng)病疫苗的制備方法。
旋毛蟲(chóng)病是人畜共患危害嚴(yán)重的寄生蟲(chóng)病，侵襲100多種動(dòng)物，發(fā)病廣泛，我國(guó)多地區(qū)發(fā)生本病。人常因食用旋毛蟲(chóng)病豬肉、犬肉等而發(fā)病，西藏六十年代人旋毛蟲(chóng)病有死亡率6.8%的報(bào)導(dǎo)。它還給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，國(guó)家已把此病列入必須控制消滅的疾病之一。由于藥物治療不能解決重復(fù)感染的問(wèn)題，為徹底控制消滅本病，只有通過(guò)研制疫苗的方法，使豬、犬獲得被動(dòng)免疫，從而逐漸消滅病原，則人旋毛蟲(chóng)病可望滅跡。
國(guó)外對(duì)豬旋毛蟲(chóng)病疫苗的研究，主要是應(yīng)用成蟲(chóng)抗原或新生幼蟲(chóng)抗原。WangC.H.etalParasiteImmunol9465，1987;MartiH.P.etal;Vet.Parasitol20237，1986;均采用高速離心法制出三日齡旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)粗抗原與弗氏完全佐劑乳化后免疫小鼠，可誘導(dǎo)89%的減蟲(chóng)率。成蟲(chóng)抗原據(jù)報(bào)導(dǎo)對(duì)雌蟲(chóng)生殖能力的抑制不理想;新生幼蟲(chóng)抗原免疫原性較成蟲(chóng)為優(yōu)，但在收集上比較困難。成蟲(chóng)在體外培養(yǎng)中的活力及繁殖率均不甚強(qiáng)，因此利用體外培養(yǎng)獲取新生幼蟲(chóng)的方法亦未見(jiàn)成功的報(bào)導(dǎo)。
為了增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)旋毛蟲(chóng)病的免疫機(jī)能，本發(fā)明研制了成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)的混合抗原疫苗，以誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生抗成蟲(chóng)和抗幼蟲(chóng)的抗體成分，并結(jié)合體外培養(yǎng)觀察成蟲(chóng)，在雌蟲(chóng)產(chǎn)幼蟲(chóng)之際集取成蟲(chóng)和極少量剛產(chǎn)出的新生幼蟲(chóng)，解決了收集大量新生幼蟲(chóng)的困難。經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)，成蟲(chóng)和肌幼蟲(chóng)減蟲(chóng)率可達(dá)90%左右，雌蟲(chóng)生殖能力下降90%左右。
本發(fā)明方案為以1000～1200條旋毛蟲(chóng)接種于300克左右的健康大白鼠，接種后第七天撲殺取蟲(chóng)，將蟲(chóng)反復(fù)洗滌后放入培養(yǎng)皿。培養(yǎng)液組成為1640培養(yǎng)液中加入ATP、腸粘膜組織浸出液，多種氨基酸以及經(jīng)過(guò)處理的豬血清。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24小時(shí)，觀察雌蟲(chóng)子官中孕育了大量幼蟲(chóng)，在即將產(chǎn)蟲(chóng)之際，即收集培養(yǎng)液中全部蟲(chóng)體(正在產(chǎn)蟲(chóng)的雌蟲(chóng)，剛產(chǎn)出的少許新生幼蟲(chóng)和雄蟲(chóng))。多次洗滌后計(jì)數(shù)蟲(chóng)體壓積，按1∶100(V/V)比例加入PH7.2PBS液，置-30℃保存。將收集的蟲(chóng)體反復(fù)凍融十次后，再用超聲波粉碎裂解蟲(chóng)體三次，置4℃過(guò)夜，以10000rpm低溫離心30分鐘，上清液即為可溶性抗原。按1∶4.5(V/V)的比例將可溶性抗原用PH7.2PBS稀釋?zhuān)浞终袷幓旌虾螅?00ml抗原稀釋液加入甲醛0.2ml，充分混合，加入吐溫-802ml充分混合，然后按100∶1(V/V)的比例加入硫柳汞溶液，充分混合，制成抗原稀釋液備用。膠體磨經(jīng)消毒預(yù)處理后，將白油-司潘佐劑一份傾入膠體磨濾斗內(nèi)，低速研磨數(shù)分鐘后，緩慢滴加抗原稀釋液一份，滴加完畢后高速膠磨數(shù)分鐘使其充分乳化，制成油包水苗;再將油包水苗置膠體磨中低速研磨數(shù)分鐘，緩緩加入含有2%吐溫-80的PBS，高速膠磨數(shù)分鐘，即制成水包油旋毛蟲(chóng)苗，4℃冰箱保存。
由于本發(fā)明利用旋毛蟲(chóng)雌蟲(chóng)子宮內(nèi)孕育大量成熟幼蟲(chóng)即將產(chǎn)蟲(chóng)之際，集取成蟲(chóng)和新生幼蟲(chóng)制苗，使蟲(chóng)苗能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗成蟲(chóng)抗體也能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗幼蟲(chóng)抗體，集蟲(chóng)方法簡(jiǎn)單，收效快，節(jié)約時(shí)間。所制備的蟲(chóng)苗經(jīng)動(dòng)物免疫試驗(yàn)，成蟲(chóng)和肌幼蟲(chóng)減蟲(chóng)率可達(dá)90%左右，雌蟲(chóng)的生殖能力下降90%左右，在旋毛蟲(chóng)疫區(qū)使用該蟲(chóng)苗定期接種動(dòng)物，大大降低了動(dòng)物對(duì)旋毛蟲(chóng)病的感染率。
實(shí)施例1、撲殺繼代保存云南、河南旋毛蟲(chóng)的大白鼠，取腸、腰、咬、腿和肋間肌各一克，鏡檢含蟲(chóng)數(shù)，以1000～1200條接種于體重300克左右的健康大白鼠。接種后第七天，撲殺接種鼠，取其小腸，縱向剖開(kāi)，橫切成2-3em腸段，置于特制的裝有150目尼龍網(wǎng)篩的不銹鋼過(guò)濾裝置的上方，放在盛有37℃溫生理鹽水連有收集玻管的玻璃濾斗內(nèi)，進(jìn)入37℃恒溫箱中過(guò)濾收集成蟲(chóng)4小時(shí)。
2、收集玻管底部的成蟲(chóng)，反復(fù)以溫生理鹽水洗滌，將潔凈不含雜質(zhì)的成蟲(chóng)放入1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中含有經(jīng)過(guò)處理的豬血清，ATP、腸粘膜組織浸出液、多種氨基酸。培養(yǎng)皿置CO2培養(yǎng)箱，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24小時(shí)，鏡檢培養(yǎng)液中的雌蟲(chóng)子宮內(nèi)孕育大量的幼蟲(chóng)，且已產(chǎn)出第一條新生幼蟲(chóng)，立即以吸管收集培養(yǎng)液中全部蟲(chóng)體(雌蟲(chóng)、雄蟲(chóng)、少許新生幼蟲(chóng))，經(jīng)多次用溫生理鹽水洗滌，離心后傾去上清液，計(jì)數(shù)蟲(chóng)體壓積為0.1ml，加入10mlPH7.2的PBS液，-30℃低溫保存。經(jīng)多次集蟲(chóng)獲得100ml蟲(chóng)體PBS液。
3、將保存于-30℃的蟲(chóng)體PBS液反復(fù)凍融10次，再用超聲波粉碎裂解蟲(chóng)體三次，置4℃冰箱過(guò)夜，然后以10000rpm低溫離心30分鐘。收集上清液，測(cè)定其蛋白含量及抗原效價(jià)后低溫保存?zhèn)溆谩?br> 4、取出低溫保存的抗原100ml，按每1ml抗原加入4.5mlPBS的比例(V/V)，加入PH7.2PBS液，充分振蕩混合;將稀釋為550ml的抗原中加入1.1ml甲醛，充分振蕩混合;再加入吐溫-8011ml，充分振蕩，最后加入1%硫柳汞5.62ml，充分振蕩混合，制成經(jīng)防腐處理的抗原稀釋液。
5、依次用70%灑精，5%福爾馬林，無(wú)菌三蒸水消毒處理膠體磨。白油-司潘佐劑與上述經(jīng)防腐處理的抗原稀釋液按1∶1(V/V)的比例用膠體磨膠磨，制成油包水蟲(chóng)苗;再將制得的油包水蟲(chóng)苗與含2%吐溫-80的PH7.2PBS液膠磨，制得水包油蟲(chóng)苗，用疫苗瓶分裝后置4℃保存。即完成豬旋毛蟲(chóng)病疫苗的制備。
權(quán)利要求
1.豬旋毛蟲(chóng)病疫苗的制備方法，其特征在于用旋毛蟲(chóng)接種大白鼠，七日后撲殺取成蟲(chóng)，將成蟲(chóng)在體外培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)，觀察雌蟲(chóng)即將產(chǎn)出幼蟲(chóng)之際，集蟲(chóng)，制作成蟲(chóng)幼蟲(chóng)混合抗原疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述豬旋毛蟲(chóng)疫苗的制備方法，其特征在于，所述體外培養(yǎng)液的組成為1640培養(yǎng)液中加入ATP、多種氨基酸、腸粘膜組織浸出液和經(jīng)過(guò)處理的豬血清。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述豬旋毛蟲(chóng)疫苗的制備方法，其特征在于所述撲殺取成蟲(chóng)的方法中采用了150目尼龍網(wǎng)篩和不銹鋼過(guò)濾裝置，在37℃條件下恒溫收集成蟲(chóng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述豬旋毛蟲(chóng)疫苗的制備方法，其特征在于所述成蟲(chóng)幼蟲(chóng)混合抗原疫苗的制備過(guò)程中采用了10次凍融和三次超聲波裂解的方法。
全文摘要
豬旋毛蟲(chóng)病疫苗的制備方法，在旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)子宮內(nèi)孕育大量成熟幼蟲(chóng)的時(shí)期收集蟲(chóng)體，制備成蟲(chóng)、幼蟲(chóng)混合性抗原。成蟲(chóng)體外培養(yǎng)系用1640培養(yǎng)液中加入ATP、多種氨基酸、經(jīng)過(guò)處理的豬血清。該疫苗誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生抗旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)抗體和幼蟲(chóng)抗體，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)表明，疫區(qū)的免疫豬減蟲(chóng)率可達(dá)90％左右。
文檔編號(hào)A61K39/002GK1081621SQ9210578
公開(kāi)日1994年2月9日 申請(qǐng)日期1992年7月25日 優(yōu)先權(quán)日1992年7月25日
發(fā)明者郭振剛, 何秀珠, 楊中梁 申請(qǐng)人:杭州商學(xué)院, 大理市康復(fù)醫(yī)院