專利名稱：結(jié)合去唾液酸糖蛋白的藥劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過將去唾液酸糖蛋白(ASGP)與一種專門作用于肝的醫(yī)藥成分結(jié)合制得的新的結(jié)合藥劑，并包括一種通過將去唾液酸糖蛋白與重組體干擾素(INF)結(jié)合而制得的新的結(jié)合干擾素抗病毒劑。更具體地，本發(fā)明涉及一種對治療病毒性肝炎是有效的新的結(jié)合干擾素。本發(fā)明的結(jié)合干擾素是有選擇地分布并僅在肝中，肝炎病毒的主要復(fù)制部位被吸收，并且顯示了其作為治療B型和C型肝炎治療劑的潛在用途。本發(fā)明還涉及一種制備該結(jié)合藥劑、藥用組合物的方法及其用途。
慢性病毒肝炎是世界上很普通的病。據(jù)估計約世界人口的5%和朝鮮人口的10%患有慢性病毒肝炎。此外，由于該病對生命，特別是對生命的質(zhì)量及生產(chǎn)力方面有害，所以慢性病毒肝炎引起了醫(yī)學(xué)界和社會的注意。慢性肝炎通常會發(fā)展至肝硬變，并有可能發(fā)展至導(dǎo)致死亡的原發(fā)性肝癌。慢性肝炎病毒是肝癌的主要原因并被認(rèn)為是高發(fā)病的疾病。因此，開發(fā)一種有效的抗病毒劑是迫切需要的。當(dāng)前，已經(jīng)發(fā)展了對慢性病毒肝炎的可靠的抗病毒治療。盡管已證明某些藥劑在治療慢性病毒肝炎中是部分有效的，但它們尚有許多缺點，包括尚待解決的有害副作用。
作為過去通常采用的一種抗病毒劑的腺苷阿糖苷單磷酸酯(Ara-AMP)是一種嘌呤為基的制劑，該制劑通過抑制DNA聚合酶的活性而發(fā)揮了強(qiáng)的抗病毒活性。在80年代早期，據(jù)報導(dǎo)，Ara-AMP在治療慢性肝炎B時有10-17%的治療響應(yīng)。然而在1987年，Garcia等人(Garcia G，Smith CL，Weissberg JI.et alAdenine arabinoside monophosphate in combination with human leukocyte interferon in the treatment of chronic hepatitis B∶A randomized，double-blind，Placebo-controlled trial Ann Intern Med 107∶278-285，1987)報導(dǎo)了與對照組比較，Ara-AMP治療組未顯示出任何顯著的更大作用。此外，施用Ara-AMP有時卻發(fā)展成極嚴(yán)重的有害副作用，如骨髓抑制和不可逆的神經(jīng)肌肉痛。因此，Ara-AMP不再用來治療慢性病毒肝炎B。
通常知道，由動物細(xì)胞產(chǎn)生的，即天然存在的干擾素對治療慢性病毒性肝炎B是有效的。天然干擾素是一種糖蛋白，即一種結(jié)合蛋白質(zhì)，其中的非蛋白質(zhì)基團(tuán)是低分子量碳水化合物。在1957年它被描述為一種具有抗病毒活性的物質(zhì)。由于對干擾素作為一種抗病毒劑和抗癌劑的興趣，在工業(yè)界和研究領(lǐng)域已進(jìn)行了大量的有關(guān)其作用，效果、作用機(jī)理、分離成純化狀態(tài)的方法，大規(guī)模制備等方面的研究。目前，以下種類的干擾素是已知的1.α-干擾素，它是通過白細(xì)胞病毒感染誘發(fā)和產(chǎn)生的，具有抗病毒活性和細(xì)胞活性的天然殺傷者的作用;
2.β-干擾素，它是通過成纖維細(xì)胞的病毒感染，特別是雙鏈RNA病毒感染誘發(fā)和產(chǎn)生的，具有抗病毒活性;以及3.γ-干擾素，它是通過用分裂素或抗原免疫刺激淋巴細(xì)胞誘發(fā)和產(chǎn)生的，具有免疫調(diào)整活性。
據(jù)報導(dǎo)，與α-和β-干擾素相比γ-干擾素有優(yōu)良的抗癌和抗病毒活性。
目前，基因重組法以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)重組體干擾素，致使因其抗病毒和免疫調(diào)整劑的作用而被廣為采用。
已有報導(dǎo)，重組體干擾素治療慢性肝炎的效果在慢性肝炎B較少流行的西方為30-40%。然而，當(dāng)與未經(jīng)治療組中的15-25%的自發(fā)好轉(zhuǎn)率相比，則該重組體干擾素被認(rèn)為僅在約10-15%的慢性肝炎B的病人中有臨床效果。
據(jù)估計，在世界人口中，約3億人是肝炎B表面抗原攜帶者，其中亞洲人口占80%。當(dāng)用重組體干擾素治療這些亞洲人時，緩解率僅為10-15%，類似于每年肝炎e抗原的16-17%的自發(fā)清除率。因此在亞洲人口，包括朝鮮人口中重組體干擾素的有益效果可能還得不到公認(rèn)。
已知盡管干擾素可以消除或減少慢性肝炎病人血清中的肝炎B病毒(HBV)的存在，但HBV DNA可留在某些慢性肝炎病人的肝細(xì)胞中。因此，當(dāng)用干擾素間斷治療時是可預(yù)料到高的復(fù)發(fā)率的。
同時已有報導(dǎo)，盡管在劑量和療程方面有少量差別，但當(dāng)用自生化肝功能試驗得到的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶值的降低作為臨床治療效果的判斷標(biāo)準(zhǔn)時，使用重組體干擾素顯示出對慢性C型肝炎的治療效果為28-71%。然而，由于約一半的病人在用重組體干擾素治療后又臨床復(fù)發(fā)，所以重組體干擾素對C型肝炎的治療效果被認(rèn)為是暫時的。因此，目前市售的重組體干擾素在某些B型和C型慢性肝炎病人中僅具有暫時的效果。
對某些B型和C型慢性肝炎病人顯示出暫時效果的重組體干擾素與天然存在的干擾素不同，是一種沒有糖基的多肽干擾素。由于重組體干擾素在施用后立即經(jīng)腎排入尿中，因此已注意到，重組體干擾素進(jìn)入肝細(xì)胞的吸收率低于天然干擾素的此吸收率，因此重組體干擾素的效果是十分有限的。在實踐中已確定，重組體干擾素對B和C型慢性肝炎的臨床效果在某些病人中僅是暫時的，治療無效率和治療終止后的復(fù)發(fā)率兩者都很高。此外，為增強(qiáng)治療效果，則應(yīng)施用大量干擾素。然而，大劑量地使用不可避免伴隨有副作用，如發(fā)燒、肌痛、關(guān)節(jié)痛和骨髓抑制。如上所述，由于現(xiàn)有技術(shù)的重組體干擾素作為慢性肝炎的治療劑未能顯出高效力，因此急需開發(fā)一種有高治療效果和最低有害影響的治療慢性肝炎的新藥劑。
為何干擾素的效果是暫時的這一原因是，盡管干擾素可以降低血清中病毒DNA的含量，但它不能有效地作用于存在于肝細(xì)胞中的病毒。這樣就使得肝炎病毒在肝細(xì)胞中可持續(xù)復(fù)制。因而，病人在終止用重組體干擾素治療后，又可能復(fù)發(fā)肝炎。
因而，可預(yù)見到的最理想的治療方法是藥-靶治療，其中將最有效的抗病毒劑直接引入目標(biāo)肝細(xì)胞。
現(xiàn)有技術(shù)中已嘗試了將抗病毒劑經(jīng)由僅在肝細(xì)胞中特定存在的受體施用，以抑制肝細(xì)胞中存在的病毒復(fù)制的方法。Fiume等人(Biochem.Pharm.35∶967，1986)通過將一種抗病毒劑，9-β-D-阿糖呋喃糖基-腺嘌呤基-5′-單磷酸酯(ara-AMP)與乳糖胺化的(lactosaminated)血清清蛋白(L-SA)結(jié)合而合成L-SA-ara-AMP，這是一種通過血清清蛋白與乳糖結(jié)合而合成的新蛋白質(zhì)。據(jù)悉，L-SA-ara-AMP可以高含量吸收于肝細(xì)胞中。然而，由于制備乳糖胺化的血清清蛋白的方法非常復(fù)雜并需使用昂貴的清蛋白，所以L-SA-ara-AMP對治療肝炎尚無很大意義。此外，L-SA-ara-AMP是通過使用不是在人體中天然存在的合成糖蛋白以及通過結(jié)合了被鑒定為對治療慢性肝炎B無效的ara-AMP而制得的。
除清蛋白外，血液中存在的所有血漿蛋白質(zhì)都是一種含有以唾液酸基終止的碳水化合物鏈的糖蛋白。通過一系列以各種酶解理該唾液酸基的過程將這些血漿蛋白質(zhì)從循環(huán)血流中清除掉。作為一種由糖蛋白中去除唾液酸基的酶的神經(jīng)氨酸苷酶在哺乳動物血清中顯示出其活性(Rosenberg A，Schengrund CLSialidases. In Rosenberg A.Schengrund CL(Eds)Biological roles of sialic acid.New York，Plenum，1976)。
可溶于并在血液中循環(huán)的血漿蛋白質(zhì)在一段一定的時間后失去其溶解度及固有生理活性。這一作用的機(jī)制存在于肝中。已知，去除糖蛋白是肝的一種功能，鑒于當(dāng)病人患有肝硬變或肝炎并因而使得從肝細(xì)胞中去除糖蛋白的機(jī)制無序的事實，這些病人的血清中就有在正常血清中檢測不到的循環(huán)的去唾液酸糖蛋白。在實踐中，當(dāng)將去唾液酸的血漿銅藍(lán)蛋白注入家兔中時，該去唾液酸的血漿銅藍(lán)蛋白的半存留期為2分鐘，這大大地短于天然血漿銅藍(lán)蛋白的55小時的這一半存留期。這一現(xiàn)象在其它的血漿蛋白質(zhì)的情況下也顯示出來。尤其是，通過自糖蛋白的終端脫除唾液酸基顯露出半乳糖基并被肝細(xì)胞膜中存在的受體所識別，從而導(dǎo)致其中借助受體間的內(nèi)噬作用(RME)而迅速運(yùn)動至肝細(xì)胞中于是從循環(huán)血流中消失。
在60年代，Morell和Ashwell等人確定，當(dāng)血漿銅藍(lán)蛋白的唾液酸基被神經(jīng)氨酸苷酶去除時，這種血漿蛋白質(zhì)就迅速地從血清中消失。他們公開了，這一現(xiàn)象是由于被肝細(xì)胞中存在的ASGP受體吸收而造成的(J.Biol Chem.，243∶155，1968)。而后據(jù)報導(dǎo)，ASGP受體僅存在于肝細(xì)胞中(Adv.Enzymol，41∶99，1974)。這種通過肝細(xì)胞的特殊吸收已由以下事實證明當(dāng)將用氙試驗標(biāo)記的去唾液酸血漿銅藍(lán)蛋白或去唾液酸血清類粘蛋白注入活體時，該同位素僅被選擇性地在肝細(xì)胞中測得(Scheingberg IH，Morall AG，Stockert RJHepatic removal of circulating proteins.Davidson CS.ed.Problems in liver Piseases，pp279-285，New York，Stratton Company，1979)。此外還公開了，這一受體特定地識別和吸收具有D-半乳糖或N-乙酸半乳糖胺作為末端糖基的糖蛋白(Ann.Rev.Biochem.，51;531，1982)。肝細(xì)胞的細(xì)胞膜包含有與以半乳糖終止的去唾液酸糖蛋白結(jié)合的細(xì)胞組織。這一細(xì)胞組織最初被命名為肝結(jié)合蛋白質(zhì)(HBP)，而現(xiàn)在則被稱為去唾液酸糖蛋白受體。此外已觀察到，在各種去唾液酸糖蛋白中間，去唾液酸的α(1)酸糖蛋白，去唾液酸血清類粘蛋白在注入后從血清中消失得最快。因此確定，去唾液酸-α(1)-酸糖蛋白被肝細(xì)胞特定地并良好地吸收(

圖1)(J.Biol.Chem.，245;4397，1970)。
具有顯著抗病毒活性的天然干擾素也是一種在碳水化合物的末端含有唾液酸的糖蛋白，而且在靜脈注射后被迅速地從血流中清除。如在包括血漿銅藍(lán)蛋白在內(nèi)的其它糖蛋白的情況下也被證實的那樣，通過用一種酶處理天然存在的干擾素以去除末端的唾液酸基而制得的以半乳糖終止的去唾液酸干擾素，與天然存在的干擾素相比，迅速地從血流中清除。
然而，已有這樣的報導(dǎo)，為了僅保留多肽部分，通過用糖苷酶處理而自干擾素分子中去除85%以上的碳水化合物部分則不能改變干擾素的抗病毒活性。但能減少肝細(xì)胞的吸收，這使得血液中干擾素的半存在期提高(Bose S，Hickman JRole of Carbohydrate moiety in determining the Surival of interferon in the circulation，J.Biol.Chem.，252∶8336，1977;圖2)。因而已建議，象其它去唾液酸血漿糖蛋白一樣使去唾液酸-干擾素也借助去唾液酸糖蛋白受體通過選擇吸收的途徑進(jìn)入肝細(xì)胞，這樣的吸收是使之從循環(huán)血流中消失的原因。
在1980年Weissman等人通過將人白細(xì)胞的INF-
基因巧妙地處理進(jìn)大腸桿菌中而制得了重組體干擾素。由于重組體干擾素僅由165個氨基酸組成，而且沒有碳水化合物鏈，所以象用糖苷酶處理的天然存在的干擾素所形成的多肽干擾素一樣，重組體干擾素被吸收入肝細(xì)胞很差。
因而，本發(fā)明的一個目的是，將重組體干擾素處理成特定地在肝細(xì)胞中的去唾液酸糖蛋白(ASGP)受體的目標(biāo)，以增強(qiáng)該重組體干擾素抵抗幾乎唯一地在肝細(xì)胞中復(fù)制的肝炎病毒的抗病毒活性。
本發(fā)明的另一目的是提供一種可被引入顯示出肝炎的臨床、血清和分子生物學(xué)證據(jù)的哺乳動物，包括人類體中的干擾素-結(jié)合物，以治療肝炎病毒感染，包括肝炎B、C和D型的感染。
本發(fā)明再一個目的是提供一種治療病毒性肝炎的方法，該方法是通過給病人施用其量足以抑制病人肝細(xì)胞中存在的肝炎病毒的復(fù)制的下述式(1)的干擾素。
本發(fā)明又一目的是提供一種治療病毒肝炎的組合物，該組合物含有一定量的下述對抑制肝細(xì)胞中存在的肝炎病毒的復(fù)制是有效的式(1)的結(jié)合干擾素，及其可藥用的載體、佐劑或賦形劑。
本發(fā)明再一個目的是通過將去唾液酸糖蛋白(ASGP)與重組體干擾素(INF)結(jié)合而制出新的抗病毒劑的方法，這種結(jié)合使得干擾素結(jié)合物在給病人進(jìn)行腸胃外施用時結(jié)合到特定地存在于肝細(xì)胞中的ASGP受體上。
本發(fā)明的一個優(yōu)點是提供了一種干擾素結(jié)合物，該結(jié)合物減少了與單獨(dú)的重組體干擾素有害反應(yīng)現(xiàn)象有關(guān)的有害反應(yīng)現(xiàn)象。
上面已概括了本發(fā)明的某些適當(dāng)?shù)哪康?。這些目的應(yīng)被認(rèn)為僅是說明本發(fā)明某些較確切的特色和用途。通過以不同的方式應(yīng)用這公開的發(fā)明，或在所公開的范圍內(nèi)改變本發(fā)明都可得到許多有益的結(jié)果。因此，除由權(quán)利要求書連同附圖所定義的本發(fā)明的范圍外，通過參考本發(fā)明的摘要和描述較佳實施方案的詳細(xì)說明可以得知本發(fā)明的其它目的以及對本發(fā)明有更充分的理解。
一方面，本發(fā)明涉及一種有如下通式(1)的新的結(jié)合藥劑
其中P是人的血清糖蛋白的一種肽基;S是人血清糖蛋白的一種糖基;Gal是一種半乳糖基;GA是戊二醛基;x是一個等于或大于1的整數(shù);R是下面將述及的醫(yī)藥成分。
適于通過與去唾液酸糖蛋白結(jié)合而制備上述式(1)的結(jié)合藥劑的醫(yī)藥成分基本上全是特定地作用于肝的藥物。所推薦的該醫(yī)藥成分為一種治療B和C型慢性病毒肝炎的抗病毒劑，如干擾素、無環(huán)鳥苷鈉、三唑核苷、阿糖腺苷(腺苷阿糖酐)、疊氮胸苷(AZT)、蘇拉明、反義低核苷酸和核糖酶(rebozyme)(催化RNAs);防止因抗癌化學(xué)治療術(shù)所誘發(fā)的毒性的生物調(diào)節(jié)劑，如防止氨甲喋呤毒性的甲酰四氫葉酸鈣;鑒別肝臟圖象的放射性對比物，如泛影葡胺鈉和釓-DTPA;肝細(xì)胞保護(hù)劑，如谷胱甘肽(GSH)和前列腺素;以及用于肝掃描的放射性同位素，如99mTC(锝)和131I。本發(fā)明式(1)的結(jié)合劑的醫(yī)藥成分是治療慢性病毒肝炎最有效的干擾素(INF)則更好。這樣，在下文中本發(fā)明將對通過將去唾液酸糖蛋白與干擾素結(jié)合而制得的結(jié)合干擾素作專門解釋。
本發(fā)明以某些結(jié)合干擾素為目標(biāo)，這些干擾素是在患有病毒肝炎的人顯示出抗病毒效果的，并且是旨在通過肝從血流中選擇性地為肝細(xì)胞所吸收的。本發(fā)明的結(jié)合干擾素包括式(1)的結(jié)合干擾素，
其中P是人血清糖蛋白的一種肽基;S是人血清糖蛋白的一種糖基;Gal是一種半乳糖基;GA是戊二醛基，x是一個等于或大于1的整數(shù);INF是干擾素，較佳的是INF為重組體干擾素。
干擾素是α-干擾素、β-干擾素或γ-干擾素，最好是α-干擾素。
α(1)-酸糖蛋白(血清類粘蛋白)、胎球蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、結(jié)合珠蛋白、甲狀腺球蛋白、巨球蛋白是較佳的人血清糖蛋白。
式(1)的P-(S)x-Gal一部分較佳地是選自由去唾液酸血清類粘蛋白、去唾液酸胎球蛋白、去唾液酸血漿銅藍(lán)蛋白、去唾液結(jié)合珠蛋白、去唾液酸甲狀腺蛋白以及去唾液酸巨球蛋白構(gòu)成的物組中的去唾液酸的人血清糖蛋白。
本發(fā)明的另一個方面是一種治療肝炎的藥用組合物。該組合物含有其量足以抑制存在于患病毒肝炎的病人肝細(xì)胞中的肝炎病毒復(fù)制的式(1)的結(jié)合干擾素和可藥用的載體、佐劑或其賦形劑。較佳的是該藥用組合物是一種適于靜脈用藥的組合物。
本發(fā)明的又一方面是一種治療患病毒肝炎病人的病毒肝炎的方法，該方法是通過施用其量足以抑制患肝炎病人的肝細(xì)胞中存在的肝炎病毒復(fù)制的式(1)結(jié)合干擾素。較好的是，該結(jié)合干擾素通過靜脈給藥的方式用藥。
本發(fā)明再一個方面是一種制備式(1)結(jié)合干擾素的方法，
其中P是人血清糖蛋白的一種肽基;
S是人血清糖蛋白的一種糖基;
Gal是一種半乳糖基;
GA是戊二醛基;
x是一個等于或大于1的整數(shù);而INF是干擾素，較佳的是重組體干擾素。
本方法包括提供含有通式為蛋白質(zhì)-(糖)x-Gal-NANA糖蛋白的人血清的步驟，其特征在于距糖基末端的第二個基是D-半乳糖(Gal)，而最后的基是N-乙酰神經(jīng)氨酸(NANA)或(唾液酸)。然后處理人血清，從此人血清中分離蛋白質(zhì)-(糖)x-Gal-NANA并回收此P-(S)x-Gal-NANA。然后用神經(jīng)氨酸苷酶處理此P-(S)x-Gal-NANA以去掉NANA而得到去唾液酸糖蛋白(ASGP)，即是一種去掉唾液酸的人血清糖蛋白殘余，即P-(S)x-Gal部分。然后借助戊二醛交聯(lián)法將去唾液酸糖蛋白，P-(S)x-Gal與該干擾素連接(Reichlin MUse of glutaradehyde as a coupling agent for protein and peptide.Methods Enzymol70∶159-165，1980)。然后回收化學(xué)式為P-(S)x-Gal-GA-INF(1)的結(jié)合干擾素。
較佳的是，人血血清是一種人血清的Cohn餾分V上清液，并且它用常規(guī)的公知方式用DEAE-Sephadex或CM-Cellulose色譜法處理是可從Cohn餾分V上清液中分離的蛋白質(zhì)-(糖)x-Gal-NANA，一種制備式(1)干擾素其中
P是人血清糖蛋白的一種肽基;
S是人血清糖蛋白的一種糖基;
Gal是人血清糖蛋白的一種半乳糖基;
x是一個等于或大于1的整數(shù);而INF是干擾素的更為具體的方法，該方法包括提供人血清的Cohn餾分V上清液。處理此人血清的Cohn餾分V上清液以分離并從中回收蛋白質(zhì)-(糖)x-Gal-NANA糖蛋白，用神經(jīng)氨酸苷酶處理該糖蛋白以使之脫去唾液酸，從而得到結(jié)構(gòu)為蛋白質(zhì)-(糖)x-Gal的糖蛋白殘余部，即去唾液酸糖蛋白(ASGP)。借助戊二醛交聯(lián)法將該去唾液酸糖蛋白與干擾素連接。然后回收結(jié)構(gòu)為蛋白質(zhì)-(糖)x-Gal-GA-INF的結(jié)合干擾素。
較佳的是用DEAE-Sephadex或CM-Cellulose色譜法以常規(guī)方式處理人血清的Cohn餾分V上清液以從此Cohn餾分中分離出結(jié)構(gòu)為蛋白質(zhì)-(糖)x-Gal-NANA的α(1)-酸糖蛋白。
以上概括了本發(fā)明的較確切和重要的特色以便使本發(fā)明的詳細(xì)描
被更好地理解，及充分評價本發(fā)明對現(xiàn)有技術(shù)的貢獻(xiàn)。在下文中所述及的附加的特征構(gòu)成了本發(fā)明各權(quán)利要求的主題。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解到的是，本文所公開的構(gòu)思及特定的實施方案可以方便被用作改變或設(shè)計為實現(xiàn)本發(fā)明相同目的的其它結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。此外，本技術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員都可意識到這些等價的構(gòu)成不超出權(quán)利要求所列出的本發(fā)明的精神和范圍。
為充分理解本發(fā)明的實質(zhì)和目的需參閱與附圖結(jié)合的如下詳細(xì)說明，其中
圖1代表靜脈注射的去唾液酸的血漿蛋白在血漿中的存留期的曲線。
圖2表示天然存在的干擾素，用神經(jīng)氨酸苷酶處理過的干擾素及用糖苷酶處理過的干擾素在靜脈給藥后的清除率。
圖3是經(jīng)分離和純化后的α(1)-酸糖蛋白和去唾液酸糖蛋白的電泳圖。
圖4是去唾液酸糖蛋白和干擾素結(jié)合后所得到的電泳圖。
圖5是比較肝中牛血清清蛋白和去唾液酸糖蛋白吸收的γ攝影圖象和放射性曲線圖。
圖6是γ攝影圖象和放射性曲線圖，在其中比較了在肝中的干擾素的吸收和新的結(jié)合干擾素的吸收。
圖7是代表用藥3小時后活體中干擾素和新的結(jié)合干擾素的生物分布的圖。
圖8是代表一段時期的肝中干擾素和新的結(jié)合干擾素的相對生物分布的圖。
為減少現(xiàn)有技術(shù)重組體干擾素的上述缺點，則必須使干擾素進(jìn)入肝細(xì)胞。因此，本發(fā)明可有選擇地將重組體干擾素載入肝細(xì)胞，以使之直接得到重組體干擾素。因此，用神經(jīng)氨酸苷酶處理血漿-糖蛋白，通過去除唾液酸部分而暴露出半乳糖基，即形成去唾液酸糖蛋白(ASGP)。然后將抗病毒劑、重組體干擾素與糖蛋白(ASGP)的暴露的半乳糖基結(jié)合，以使該結(jié)合了的藥劑結(jié)合到特定地存在于肝細(xì)胞中的ASGP受體上。欲被結(jié)合的抗病毒劑包括重組體α-、β-、γ-INF、這些都是目前所知的治療B和C型慢性肝炎最有效的藥劑。
重要的是要注意一個特別令人驚異的事實當(dāng)單獨(dú)用α、β或γ干擾素治療肝炎時，只有α干擾素是有效的。而根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)將α、β或γ干擾素與去唾液酸糖蛋白(ASGP)結(jié)合時，每種干擾素，即α、β或γ干擾素在治療肝炎時都有效。
此外，由于本發(fā)明的新的結(jié)合干擾素僅特定地為肝細(xì)胞所吸收，并而后在肝細(xì)胞中長時期地存留，因而最佳劑量可得以減小。
因此，因頻繁劑量地或大劑量地施用干擾素而帶來的有害作用經(jīng)?？傻靡詼p少。盡管欲被用于制備結(jié)合干擾素的糖蛋白不限于任何特定的種類，但如圖1所示，易于被吸收入肝的α(1)-酸糖蛋白，即血清類粘蛋白，以及胎球蛋白，血漿銅藍(lán)蛋白，結(jié)合珠蛋白，甲狀腺蛋白和巨球蛋白都是優(yōu)選的。
可用以下方法制備本發(fā)明的結(jié)合干擾素。首先用DEAE-Sephadex或CM-Cellulose色譜法以常規(guī)方式處理人血清Cohn餾分V上清液以分離出結(jié)構(gòu)為蛋白質(zhì)-(糖)x-Gal-NANA的α(1)-酸糖蛋白(NANA是唾液酸)(Hao Y-L，Wickerhauser M∶Aglycoprotein，Biochem.Biophys.Acta 322;99，1973)，然后用神經(jīng)氨酸苷酶處理該糖蛋白而得到因去掉了唾液酸結(jié)構(gòu)為蛋白質(zhì)-(糖)x-Gal的去唾液酸糖蛋白(ASGP)。然后借助戊二醛交聯(lián)法將該去唾液酸糖蛋白與干擾素連接而合成結(jié)構(gòu)為蛋白質(zhì)-(糖)x-Gal-GA-INF的結(jié)合物。
上述的本發(fā)明的方法概括如下
表 1
上述方法所用的糖蛋白是存在于人血清中的糖蛋白。就本發(fā)明的目的而言，只要距糖蛋白糖部分末端的第二個基是D-半乳糖、糖蛋白的最后的基是N-乙酰神經(jīng)氨酸(唾液酸)，任何的糖蛋白，如α(1)-酸糖蛋白(血清類粘蛋白)，都可使用。這也包括可被采用的諸如胎球蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、結(jié)合珠蛋白等之類的糖蛋白。
因此，血清類粘蛋白、胎球蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、結(jié)合珠蛋白、甲狀腺蛋白和巨球蛋白等糖蛋白在去掉唾液酸后則分別被稱為去唾液酸血清類粘蛋白，去唾液酸胎球蛋白、去唾液酸血漿銅藍(lán)蛋白、去唾液酸結(jié)合珠蛋白、去唾液酸甲狀腺蛋白和去唾液酸巨球蛋白，并且它們可用于本發(fā)明的結(jié)合干擾素。這些去唾液酸糖蛋白可與將α(1)-酸糖蛋白脫去唾液酸(即去唾液酸血清類粘蛋白)相同的程序制得。
然而參看圖1，由于在注射后血漿中保持的去唾液酸血清類粘蛋白的百分比為約0.18%/ml血漿，所以α(1)-酸糖蛋白(去唾液酸血清類粘蛋白)是最好的一種。為測定靜脈注射的去唾液酸血漿蛋白質(zhì)的存留期，在約200g重的雄白鼠的尾靜脈注入注射液(1ml)，每1ml的注射液應(yīng)答如下3H-去唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白，0.3mg，6.6×106dpm;64cu-血漿銅藍(lán)蛋白，0.3mg;3H-去唾液酸甲狀腺球蛋白，0.3mg，12.6×106dpm;3H-去唾液酸-α2-巨球蛋白，0.19mg，11.2×106dpm;3H-去唾液酸結(jié)合珠蛋白，0.12mg，9.5×106dpm;3H-去唾液酸血漿銅藍(lán)蛋白，0.3mg，6.7×106dpm;3H-去唾液酸胎球蛋白，0.11mg，2×106dpm;3H-去唾液酸血清類粘蛋白，0.13mg，14.4×106dpm。以不同的時間間隔從尾靜脈中將血液試樣取在肝素管中并離心分離，測定該血漿的放射性。將動物殺死，并按指定的時間取出其肝、將20mg濕組織等分試樣用于測定放射性。結(jié)果示于圖1。
圖1說明了自靜脈注射12分鐘后血液中存留的去唾液酸的-α(1)-酸糖蛋白(去唾液酸血清類粘蛋白)、去唾液酸胎球蛋白、去唾液酸血漿銅藍(lán)蛋白和去唾液酸結(jié)合珠蛋白的百分比分別為0.18、0.37、0.6和1.20。從而可看出，去唾液酸的-α(1)-酸糖蛋白(去唾液酸血清類粘蛋白)從血液中消失得最快，這表明，與其它糖蛋白相比，它被肝細(xì)胞以最快的速率吸收。
在制備本發(fā)明的結(jié)合干擾素的第一步驟中，可按已知的常規(guī)方法，如制備清蛋白的方法從人血清中分離及得到Cohn餾分V上清液(Cohn E.J.et al，J.Am.Chem Soc.68∶459，1946)。按概括于下的已知方法(Hao Y-L，Wicherhauser M.;A Simple Method for the large-Scale Preparation of Alpha(1)-acid glycoprotein，Biochem.Biophys.Acta，322;99，1973)進(jìn)行自Cohn餾分V上清液中分離α(1)-酸糖蛋白及其大規(guī)模提純。
表 2
然后按如下反應(yīng)流程使被分離及純化的α(1)-酸糖蛋白經(jīng)去唾液酸反應(yīng)而得到去唾液酸糖蛋白。
回收的去唾液酸糖蛋白的電泳圖示于圖3，C列。圖3、A列說明蛋白質(zhì)的分子量標(biāo)記，B列表示帶有被分離的唾液酸基的α(1)-酸糖蛋白的43kd(“kd”意指千道爾頓)單帶，而C列表示去除了1.7kd唾液酸基的41kd去唾液α(1)-酸糖蛋白的單帶。
用干擾素制備去唾液酸糖蛋白的結(jié)合物的最后步驟采用了戊二醛(GA)交聯(lián)反應(yīng)，該反應(yīng)是最溫和的交聯(lián)反應(yīng)中的一種。在中性的pH值范圍(6.0-8.0)內(nèi)，在4-40℃的溫度下，使用緩沖范圍很寬的緩沖液使戊二醛與暴露的胺基結(jié)合。此反應(yīng)包括在蛋白質(zhì)的氨基和醛基間形成一種席夫堿。在此反應(yīng)中，由于戊二醛含有兩個醛基，所以如下所示，它們直接與兩個氨基結(jié)合(Pozmanski M.J.and Juliano R.L.∶Biological approaches to the controlled dilivery of drugs∶a critical review.Pharmacological Reviews 36∶277-336，1984)。
這種結(jié)合物可用放射性自顯影裝置鑒別出來首先用合成I(131)-干擾素-去唾液酸糖蛋白結(jié)合物的Iodogen法標(biāo)出在干擾素部分有I(131)的此結(jié)合物，然后使之經(jīng)電泳再用考馬斯蘭著色(圖4，B和C)。在圖4中，C柱代表該蛋白分子量的標(biāo)記，而B柱代表67kd譜帶的此結(jié)合物及41kd譜帶的在結(jié)合合成后未反應(yīng)的去唾液酸糖蛋白。此外，柱A系得自柱B的電泳膠的放射性自顯影并示出67kd譜帶，該帶與I(131)-干擾素-去唾液酸糖蛋白結(jié)合物相適應(yīng)。
為證明在本發(fā)明中被用作干擾素載體的去唾液酸糖蛋白特定地被吸收在肝臟中，進(jìn)行了以下的動物試驗。按下面所示的目的將該實驗分成兩組，每組都包括一個對照組。
去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白組織特性實驗
將得自注射了I(131)-標(biāo)記的去唾液酸糖蛋白的家兔的γ攝影圖象及整個時間內(nèi)的放射性的變化都與得自I(131)-牛血清清蛋白(BSA)的此圖象及變化進(jìn)行比較。經(jīng)鑒定結(jié)果是此種從人血清分離出來的經(jīng)提純的去唾液酸糖蛋白特定地為肝臟所吸收(圖5)。在圖5中，上部的γ攝影圖像是處于仰臥位置的家兔的各器官所發(fā)出的放射性圖形。從此圖形，可有比較地鑒定出存在于家兔器官中的整個時間內(nèi)去唾液酸糖蛋白的量。這樣，通過與I(131)-牛血清清蛋白比較可以確定I(131)-去唾液酸糖蛋白更特定地為該肝臟所吸收，并在其中存在更長的時間。在下部的照片中，橫座標(biāo)代表時間(X軸)，縱座標(biāo)(Y軸)分別代表在肝臟及心臟，即血流中測出的放射性。從圖5的圖象中可以看到，相對于清蛋白而言，去唾液酸糖蛋白則更明顯并更特定地被吸收于肝臟中。
a.γ攝影圖象b.放射性的時間過程c.生物學(xué)分布得自一只注射了I(131)-標(biāo)記的干擾素的家兔的γ攝影圖象及整個時間中的肝、心臟及膀胱中的放射性都與得自本發(fā)明的I(131)-標(biāo)記的結(jié)合干擾素的這種圖象和放射性相比較。其結(jié)果示于圖6。
從圖6的γ攝影圖象可知，在注射后干擾素主要存留在肝中，時間最多為30分鐘，但已開始排泄入膀胱。3小時后，肝中已基本沒有干擾素，它主要存在于膀胱之中。而與此同時，本發(fā)明的去唾液酸糖蛋白干擾素結(jié)合物則在注射后大部分持續(xù)地存留于肝中長達(dá)30分鐘，2小時和3小時，而進(jìn)入膀胱的排泄則未觀察到。這也符合下部照片中所示的整個時間內(nèi)的放射性的變化。于是，在干擾素的情況下，在上部線中的肝放射性及中部線中的血液放射性在30分鐘內(nèi)逐漸下降而后下部線中的膀胱放射性則升高。相反，注射去唾液酸糖蛋白的組中，肝放射性則持續(xù)保持不變，并且未發(fā)現(xiàn)膀胱放射性的升高。
為了將此新的結(jié)合干擾素與干擾素進(jìn)行組織特性對比，在分別給家兔注射干擾素及去唾液酸糖蛋白-干擾素結(jié)合物3小時后，將其殺死。測定每個器官中的放射性，然后對比家兔組織中的分布(見圖7)。
結(jié)果，根據(jù)觀察每種器官中的相對殘存率，如果在6個器官，即肝、腎、肺、脾、心和甲狀腺中存留的放射性為100，在去唾液酸糖蛋白-干擾素結(jié)合物的情況下，肝殘存量為全部器官殘存量的85%左右，而在腎、肺和心中此殘存率僅分別為7%、5%及1%。相反，在干擾素的情況下，腎、肝和心中的此殘存量相當(dāng)高，分別為32%、11%和2%，而在肝中的這種殘存率僅為53%。
圖8是顯示在整段時間中干擾素及該新的結(jié)合干擾素在肝中的殘存率。從該圖可知，去唾液酸糖蛋白-干擾素結(jié)合物在肝中的殘存比干擾素的殘存要高得多和長得多。也就是說，去唾液酸糖蛋白-干擾素結(jié)合物在注射后30分鐘、3小時和12小時后的殘存量比干擾素分別高1.5、4.3和6倍。
本發(fā)明的干擾素結(jié)合物可與常規(guī)用于干擾素制劑的醫(yī)學(xué)上可接受的載體，如助劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑等結(jié)合被配制成治療肝炎的可注射的組合物。適用于此目的的緩沖劑最好是磷酸鈉、磷酸鉀等。本發(fā)明的組合物還可包括防腐劑，如酚、穩(wěn)定劑，如清蛋白、L-半胱氨酸氫氯化物、麥芽糖、氯化鈉或氯化鉀等。
雖然劑量可根據(jù)病人的年齡和體重、病情等而變化，但通常本發(fā)明的結(jié)合干擾素作靜脈注射的劑量為每平方米身體表面以干擾素為基數(shù)的20-300萬國際單位，一天或二天一次。然而，給藥時期及給藥量可根據(jù)為本技術(shù)領(lǐng)域中普通技術(shù)人員已知的其他常規(guī)干擾素制劑的給藥方法調(diào)整。
本發(fā)明的結(jié)合干擾素特定地為肝細(xì)胞所吸收，并在肝中存留很長時間。所以，與常規(guī)干擾素配方相比該結(jié)合干擾素的劑量可大為減少。這種減低的劑量可使用藥的肝炎病人免除干擾素本身帶來的副作用，如發(fā)燒、肌痛、骨髓抑制等。因此人體對本發(fā)明的結(jié)合干擾素的容許劑量要比常規(guī)的干擾素大得多。
給顯示出病毒性肝炎的臨床學(xué)、血清學(xué)及分子生物學(xué)癥狀的治療對象用藥。對HBsAg及抗HCV的陽性反應(yīng)分別是慢性肝炎B和C的標(biāo)志。該藥的組分列述于前，而靜脈內(nèi)施藥的結(jié)果示于圖7和8。
以下的實施例旨在更確切地解釋本發(fā)明而決不是限制其范圍。在這些實施例中，除另有說明，干擾素均為重組體α-干擾素。制備去唾液酸糖蛋白(蛋白質(zhì)-(糖)x-半乳糖)實施例1用α(1)-酸糖蛋白制備去唾液酸糖蛋白1.制備2，2，2-三氟乙醇磺酸酯化的(tresylated)載體將10g濕Sepharose 4B(Phamacia)移入一玻璃過濾器中，然后依次用30%、60%、80%(v/v)的丙酮水溶液及無水丙酮各100ml洗滌。將洗過的Sepharose 4B膠引入一個盛有30ml無水丙酮及150μl(μ＝微)2，2，2-三氟乙醇磺酰(tresyl)氯(Fluka AG，Buchs，Switzeland)的干燒杯中，同時用磁棒攪動。使此燒杯在室溫下靜置10分鐘后，將全部上述混合物再移入同一玻璃過濾器中，并用溶在HCl中的70%、50%和30%(v/v)丙酮洗滌，最后用1mM HCl洗滌。所形成的產(chǎn)物在4℃下貯存，或另用丙酮處理、干燥，然后在室溫下貯存。這樣獲得的載體的負(fù)載能力是每克此種干膠可負(fù)載450μmol的酶。
2.將神經(jīng)氨酸苷酶結(jié)合于該2，2，2-三氟乙醇磺酸酯化的載體將1ml(0.4mg/ml)神經(jīng)氨酸苷酶(Sigma Chem)通過一個NAPTM-10柱(Pharmacia)，然后再溶于1.5ml0.2M磷酸鈉-0.5M NaCl緩沖液(pH7.0)(A230＝0.534)中，再將1.0g活化的2，2，2-三氟乙醇磺?；鵖epharose 4B加入其中。在4℃下將此混合物緩緩地振蕩16小時，并向其中添加1.5ml0.5M三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH7.5)。將全部混合物在4℃下放置5小時以使反應(yīng)完全。用0.1M磷酸鈉-0.15M NaCl(pH5.5)洗滌所得的膠，結(jié)果得到神經(jīng)氨酸苷酶-Sepharose 4B，隨后將該產(chǎn)物在4℃下貯存(A230＝0.45)(在該緩沖液中的神經(jīng)氨酸苷酶的產(chǎn)率OD0.084/OD0.534＝0.064mg/0.4mg＝16%)。
3.制備去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白將250mgα(1)-酸糖蛋白溶于25ml0.15M NaCl-0.1M乙酸鈉緩沖液(pH5.5)中，然后將所得的溶液與一種溶在2ml同樣的緩沖液中的200mg神經(jīng)氨酸苷酶-Sepharose 4B的溶液相混合。在37℃下使該混合物反應(yīng)過夜。得到洗脫物，然后按硫代巴比土酸分析法(Warren LThe thiobarbituric acid assay of sialic acids.J Biol Chem 234∶1971-1975，1959)，測定去唾液酸效率。這樣，用神經(jīng)氨酸苷酶-Sepharose 4B處理過的1.0mlα(1)-酸糖蛋白再用NAPTM-10柱處理而去除鹽。然后，將50μl1N H2SO4加到1ml該洗脫物中，然后搖動此混合物，在80℃下保溫1小時再冷卻下來而從神經(jīng)氨酸苷酶處理后仍含有唾液酸基團(tuán)的α(1)-酸糖蛋白中去除唾液酸基團(tuán)。將0.2ml的此樣品與0.1ml高碘酸鹽充分混合，再將該混合物靜置20分鐘，在添加1.0ml亞砷酸鹽后，搖動此混合物直到淡黃-褐色消失。向所得的溶液加3ml硫代巴比土酸，再將此混合物沸騰15分鐘，然后在冰水中冷卻5分鐘。將一份2.0ml的此混合物等分試樣與2ml環(huán)己酮混合。在將此混合物離心分離3分鐘后，在549nm波長上測量紅色上清液的吸收度。對照的α(1)-酸糖蛋白的吸收度為0.008，而試樣去唾液酸α(1)-酸糖蛋白的吸收度則為0.118。
因此，純唾液酸的吸收度為0.110(0.118-0.008)OaD。去唾液酸的分子吸收度指數(shù)為5700而唾液酸的釋放量(μmol)可用以下等式算出
V 是硫代巴比土酸的量，1000是將ml換成升，而
用硫酸從去唾液酸糖蛋白中釋放出唾液酸的量是0.00825μmol(＝0.075×0.110)。1mlα(1)-酸糖蛋白(1mg/ml)含0.369μmol唾液酸。那么，由于在實驗中所用的α(1)-酸糖蛋白的量是2mg，所以唾液酸的總量是0.728μmol(＝0.369μmol×2)，而用神經(jīng)氨酸苷酶釋放出的唾液酸的量是0.7298μmol(＝0.738-0.0082)。因此算出該效率為0.7298/0.738×100＝99%。
實施例2按實施例1中所述的步驟，用胎球蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、結(jié)合珠蛋白和甲狀腺球蛋白替代α(1)-酸糖蛋白分別制備去唾液酸胎球蛋白、去唾液酸血漿銅藍(lán)蛋白、去唾液酸結(jié)合珠蛋白、及唾液酸甲狀腺球蛋白。
實施例3制備去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白和重組體干擾素的結(jié)合物(蛋白質(zhì))-(糖)x-半乳糖-戊二醛-干擾素以下列方式用Harlow and Lane(1988)的一步法進(jìn)行該結(jié)合物的合成。用NAPTM-10柱處理1.0mlI(131)-標(biāo)記的干擾素(150μg/ml)以將緩沖溶液0.5M磷酸鈉，pH7.5改變成0.1M磷酸鈉pH6.8。將所得的溶液移入一個盛小磁攪棒的管子中，該管中引入了100μl(0.6mg)去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白。在通風(fēng)櫥中，用1分鐘將100μl1%戊二醛滴加到該管中的混合溶液中，同時攪動。將全部混合物于室溫下保溫3小時，然后加100μl1M的乙醇胺(pH7.2)。而后該混合物再于室溫下保溫1小時，并用Sepharose 12柱作液相色譜分離(FPLC)而得到在214nm的兩種餾分。第一種I(131)-標(biāo)記的干擾素的同位素值為86.1μCi，而第一和第二餾分的同位素值分別為6μCi和6μCi。電泳產(chǎn)生了3條譜帶;淺的和寬的大于70kd代表聚合了的結(jié)合物，67kd的結(jié)合物譜帶及在反應(yīng)后殘存的去唾液酸的41kd譜帶也可鑒別出來。電泳后的膠體經(jīng)放射性自顯影以鑒別兩個譜帶，即密而寬的70kd以上的聚合了的結(jié)合物譜帶及67kd的結(jié)合物譜帶。在使用一只家兔的實驗中所用的去唾液酸糖蛋白和I(131)-標(biāo)記的干擾素的結(jié)合物與經(jīng)FPLC分離的第一餾分相對應(yīng)。
實施例4按實施例3中所述的步驟，用去唾液酸胎球蛋白、去唾液酸血漿銅藍(lán)蛋白、去唾液酸結(jié)合珠蛋白及去唾液酸甲狀腺球蛋白替代去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白以制備上述去唾液酸血漿蛋白質(zhì)及干擾素的結(jié)合物。
實驗例下面的動物實驗旨在鑒定去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白的組織特性，并對比本發(fā)明結(jié)合干擾素的肝細(xì)胞特性。
A.制備對比實驗的樣品按Franker and Speck法(Biochem Biophys Res.Commun.80∶849-857)將干擾素、牛血清清蛋白、和去唾液α(1)-酸糖蛋白碘化以制備有以下比放射性的，并用作動物試驗試樣的，放射性碘化的(131I)天然干擾素、牛血清清蛋白和去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白。
·碘化干擾素的比放射性359μCi/15μg＝23.9μCi/μg·碘化牛血清清蛋白的比放射性400μCi/30μg＝13.3μCi/μg·碘化去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白的比放射性1607μCi/60μg＝26.8μCi/μgB.試驗方法及結(jié)果試驗1去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白的組織特性試驗使稱重1.5-2.0kg的家兔接受通常的麻醉再注射I(131)-標(biāo)記的碘化牛血清清蛋白或碘化α(1)-酸糖蛋白于耳靜脈內(nèi)。此后取得由圖象計算機(jī)確立的有意義部位的圖象，該圖象是用一臺γ-攝影機(jī)在一點上每5秒一次攝取的，這樣以使每個器官中的放射性得以測量。所用的照象機(jī)是一臺裝有視準(zhǔn)儀的，有高分辨能力的Ohio NuclearTM410γ相機(jī)。每5分鐘攝取一張照片，因此用30分鐘獲取6張照片。這樣取得的圖象照片與圖5相對應(yīng)。圖5上段的圖象照片顯示出I(131)-去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白與I(131)-牛血清清蛋白相比更特定地被肝吸收。在圖5下段，橫座標(biāo)代表時間，上面的線代表在肝中測得的放射性，下面的線代表在心臟中測得的放射性，即血流的放射性。從這些照片可見，去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白為肝特定吸收。
試驗2干擾素及本發(fā)明的結(jié)合干擾素的對比試驗按前面于實驗1中所述的相同方式將I(131)-干擾素和I(131)-去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白注射入家兔的耳靜脈。為了比較測量肝中的放射性，每30分鐘攝取一張300000單個尖峰信號的照片，在3小時中得到6張照片。這些圖象照片在圖6中示出。從圖6的γ照相圖象中可知，注射后干擾素大部存在于肝上最長達(dá)30分鐘。此后它經(jīng)腎排入膀胱。另外，注射后3小時，干擾素基本上不存在于肝中而主要存在于膀胱中。然而，在注射去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白-干擾素結(jié)合物的情況下，30分鐘后，2小時后甚至3小時后它仍存留在肝中，而未發(fā)現(xiàn)它在膀胱中的存在。
在比較圖6的下段時，在干擾素的情況下，上部線中所示的肝的放射性和中部線中所示的血液放射性在30分鐘內(nèi)逐漸下降，而示于下部線的血液放射性則升高。而在去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白結(jié)合物的情況下，肝的放射性持續(xù)保持，而且觀察不到膀胱中放射性的增加。上述試驗確定了本發(fā)明的干擾素結(jié)合物在肝中的存留時間比天然干擾素要長得多。
試驗3比較干擾素和本發(fā)明的結(jié)合干擾素在組織中的生物學(xué)分布完成上述試驗2后將家兔殺死并自其中取出肝、腎、肺、脾、心和甲狀腺。測量分布于每個器官中的放射性以計算分布于其中的放射性量。其結(jié)果示于圖7。
從上述各試驗可知，本發(fā)明的干擾素結(jié)合物對肝的透入強(qiáng)于常規(guī)干擾素，而且該結(jié)合物在肝中的存留時間也長得多，因此其醫(yī)學(xué)效應(yīng)可延長一段更長的時間。
組合物實施例配制實施例1去唾液酸血清類粘蛋白-α-干擾素結(jié)合物-500000I.U＊氯化物 -8.0mg磷酸氫二鈉 -1.74mg磷酸二氫鉀 -0.2mg氯化鉀 -0.2mg酚 -3.3mg清蛋白(人的) -1.0mg將上述組分溶于用于注射的，其量足以形成溶液的無菌蒸餾水中，而后將形成的溶液置于一無菌管形瓶(1ml)中并在2-10℃下貯存。
＊干擾素活性國際單位。
配制實施例2-4以去唾液酸胎球蛋白-干擾素結(jié)合物5000000I.U.去唾液酸血漿銅藍(lán)蛋白-干擾素結(jié)合物6000000I.U.，或去唾液酸結(jié)合珠蛋白-干擾素結(jié)合物1000000I.U.替代配制實施例1中所用的去唾液酸血清類粘蛋白-α-干擾素結(jié)合物，并將它們分別與如配制實施例1中的防腐劑、緩沖劑和穩(wěn)定劑相混合。用注射用無菌蒸餾水使該混合物增溶，而后將此溶液置于無菌的1ml管形瓶中以便注射，再將它如配制實施例1中所述的方式貯存。
配制實施例5去唾液酸血清類粘蛋白-β-干擾素結(jié)合物-1000000I.U.
氯化鈉 -9.0mg清蛋白(人的) -5.0mg酚 -3.0mg將上述組分溶于注射用的，其量足以形成溶液的無菌蒸餾水中，而后將形成的溶液置于一個無菌管形瓶(1ml)中，并貯存于2-10℃下。
配制實施例6用去唾液酸血清類粘蛋白-γ-干擾素結(jié)合物500000I.U.取代配制實施例5的去唾液酸血清類粘蛋白-β-干擾素結(jié)合物并以相同的佐劑混合，然后將此溶液置于用于注射的無菌管形管(1ml)中。
按以上的配制實施例制得的制劑是適于靜脈注射的。
本公開包括包含在所附的權(quán)利要求書中的以及前面所述的內(nèi)容。盡管本發(fā)明以其帶有某種程度的特性的較佳形式進(jìn)行描述，但應(yīng)理解的是較佳形式的這種公開僅是通過實施例進(jìn)行的，而各組成部分在結(jié)構(gòu)上，組合上及布置上的細(xì)節(jié)的變更是可以采用而不違背本發(fā)明的精神和范圍的。
權(quán)利要求
1.一種化學(xué)式如下的結(jié)合去唾液酸糖蛋白的藥劑其中P為人血清糖蛋白的肽基；S為人血清糖蛋白的糖基；Gal為半乳糖基；GA為戊二醛基；X為等于或大于1的整數(shù)；而R是選自由干擾素、無環(huán)鳥苷鈉、三唑核苷、阿糖腺苷、疊氮胸苷、蘇拉明、反義低核苷酸、核糖酶(ribozyme)、亞葉酸鈣、洗影葡胺鈉、釓-DTPA、谷胱甘肽、前列腺素、99mTc及131I所構(gòu)成的物組中的一種藥物組分。
2.一種化學(xué)式如下的結(jié)合去唾液酸糖蛋白的藥劑其中P是人血清糖蛋白的肽基;S是人血清糖蛋白的糖基;Gal是半乳糖基;x是等于或大于1的整數(shù);INF是干擾素。
3.權(quán)利要求2的結(jié)合藥劑，其中INF是α干擾素。
4.權(quán)利要求2的結(jié)合藥劑，其中INF是β干擾素。
5.權(quán)利要求2的結(jié)合藥劑，其中INF是γ干擾素。
6.權(quán)利要求2的結(jié)合藥劑，其中所述的P-(S)x-Gal-是去唾液酸的人血清糖蛋白基，其中P是人血清糖蛋白的蛋白質(zhì)基，S是人血清糖蛋白的糖基而Gal是D-半乳糖基。
7.權(quán)利要求6的結(jié)合藥劑，其中所述的去唾液酸人血清糖蛋白系選自由去唾液酸血清類粘蛋白、去唾液酸胎球蛋白、去唾液血漿銅藍(lán)蛋白、去唾液酸結(jié)合珠蛋白、去唾液酸甲狀腺球蛋白和去唾液酸巨球蛋白所構(gòu)成的物組。
8.權(quán)利要求2的結(jié)合藥劑，其中INF是重組體干擾素。
9.一種治療肝炎的藥用組合物，它包含其量足以抑制感染了病毒性肝炎的病人肝細(xì)胞中肝炎病毒復(fù)制的權(quán)利要求2中化學(xué)式(1)的結(jié)合干擾素、一種藥學(xué)上可接受的載體、輔助劑或其賦形劑。
10.權(quán)利要求9適于靜脈給藥的藥用組合物。
11.一種治療染有病毒性肝炎病人的病毒性肝炎的方法，該方法通過施用其量足以抑制感染病毒性肝炎病人肝細(xì)胞中肝炎病毒復(fù)制的權(quán)利要求2中化學(xué)式(1)的結(jié)合干擾素。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述結(jié)合干擾素是通過靜脈給藥而施用的。
13.權(quán)利要求12的方法，其中足以抑制所述感染了病毒性肝炎病人肝細(xì)胞中肝炎病毒復(fù)制的權(quán)利要求2中的化學(xué)式(1)的結(jié)合干擾素的量是一天或兩天一次，每次以每平方米身體表面干擾素為基準(zhǔn)，20-200百萬國際單位。
14.制備化學(xué)式(1)的結(jié)合干擾素的方法，其中P是人血清去唾液酸糖蛋白的肽基;S是人血清去唾液酸糖蛋白的糖基;Gal是半乳糖基;GA是戊二醛基;x是等于或大于1的整數(shù);INF是干擾素，該方法包括提供一種人血清的Cohn餾分V上清液;處理此人血清的Cohn餾分V上清液而從中分離出化學(xué)式為蛋白質(zhì)-(糖)x-Gal-NANA的α(1)-酸糖蛋白，然后回收該α(1)-酸糖蛋白;用神經(jīng)氨酸苷酶處理此α(1)-酸糖蛋白以去除唾液酸并得到去唾液酸糖蛋白(蛋白質(zhì)-(糖)x-Gal);以戊二醛(GA)交聯(lián)法將該去唾液酸糖蛋白與干擾素相聯(lián);而后回收結(jié)構(gòu)式為蛋白質(zhì)-(糖)x-Gal-GA-INF的結(jié)合干擾素。
15.權(quán)利要求14的方法，其中用常規(guī)方式用DEAE-Sephadex或CM-Cellulose色譜分離該人血清Cohn餾分V上清液而從其中分離出結(jié)構(gòu)式為蛋白質(zhì)-(糖)x-Gal-NANA的α(1)-酸糖蛋白。
16.權(quán)利要求14的方法，其中α(1)-酸糖蛋白是血清類粘蛋白。
17.制備化學(xué)式如下的結(jié)合干擾素的方法，其中P是人血清糖蛋白的肽基;S是人血清糖蛋白的糖基;Gal是半乳糖基;GA是戊二醛基;x是等于或大于1的整數(shù);INF是干擾素;該方法包括提供包含化學(xué)式為蛋白質(zhì)-(糖)x-Gal-NANA的人血清糖蛋白的人血血清，其特征是自糖蛋白端的第二個基是D-半乳糖(Gal)，而最后一個基是N-乙酰神經(jīng)氨酸(NANA);處理該人血血清而從中分離出人血清糖蛋白(蛋白質(zhì)-(糖)x-Gal-NANA)，而后回收糖蛋白(蛋白質(zhì)-(糖)x-Gal-NANA);用神經(jīng)氨酸苷酶處理此糖蛋白(蛋白質(zhì)-(糖)x-Gal-NANA)去除NANA而得到去唾液酸糖蛋白(蛋白質(zhì)-(糖)x-Gal);以戊二醛(GA)交聯(lián)法使去唾液酸糖蛋白(蛋白質(zhì)-(糖)x-Gal)與干擾素相聯(lián)，及回收化學(xué)式為P-(S)x-Gal-GA-INF(1)的結(jié)合干擾素。
18.權(quán)利要求17的方法，其中的人血血清是人血清的一種Cohn餾分V上清液，而且它以常規(guī)方式用DEAE-Sephadex或CM-Cellulose色譜分離處理而從Cohn餾分V上清液中分離出化學(xué)式為蛋白質(zhì)-(糖)x-Gal-NANA的人血清糖蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種將去唾液酸糖蛋白與一種對肝有專門作用的藥物結(jié)合而制成的結(jié)合藥劑。本發(fā)明的結(jié)合藥劑的化學(xué)式為，P—(S)其中，在P-(S)
文檔編號A61K45/00GK1068744SQ9210599
公開日1993年2月10日 申請日期1992年6月18日 優(yōu)先權(quán)日1991年6月19日
發(fā)明者金丁龍, 李孝錫 申請人:韓國肝研究財團(tuán), 金丁龍, 李孝錫