專利名稱：鈣受體活性分子的制作方法
本申請是Nemeth等人于1992年2月11日提出的題為鈣受體活性分子申請案的部分后續(xù)申請，后者是Nemeth等人于1991年8月23日提出的題為鈣受體活化劑的美國07/749451號申請的部分后續(xù)申請，二者均被全文(包括附圖)引入本文作為參改。
本發(fā)明涉及能以類似于細(xì)胞上胞外鈣離子方式作用的新模擬鈣分子(Calcimimetic)的設(shè)計(jì)、研制、組成和應(yīng)用，還涉及阻斷細(xì)胞上胞外鈣離子活性的溶解鈣分子(Calcilytic)，及其使用和鑒定方法。
下面說明提供了與本發(fā)明相關(guān)的資料的摘要。這不是承認(rèn)本文所提供的任何資料為現(xiàn)請求保護(hù)發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)，也不能認(rèn)為任何具體或非具體引用的公開出版物是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
體內(nèi)的某些細(xì)胞不僅對化學(xué)信號響應(yīng)，而且也對離子如胞外鈣離子(Ca2+)響應(yīng)。胞外Ca2+(本文稱為“[Ca2+]”)濃度的變化會改變這些細(xì)胞的功能響應(yīng)。該特定細(xì)胞之一種是能分泌甲狀旁腺激素(PTH)的甲狀旁腺細(xì)胞。PTH是調(diào)節(jié)血液和胞外流體中Ca2+體內(nèi)平衡的主要內(nèi)分泌因子。
PTH通過在骨和腎細(xì)胞中起作用，從而增加血液中Ca2+濃度。然后[Ca2+]的這種增加可用作負(fù)反饋信號，抑制PTH分泌。[Ca2+]和PTH分泌之間的相互關(guān)系形成了保持體內(nèi)Ca2+體內(nèi)平衡的主要機(jī)制。
胞外Ca2+直接作用于甲狀旁腺以調(diào)節(jié)PTH的分泌。有人提出存在甲狀旁腺細(xì)胞表面蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)能測定[Ca2+]的變化。該蛋白質(zhì)用作胞外Ca2+的受體(Ca2+受體)，并認(rèn)為它可測定[Ca2+]的變化，并可啟動功能性細(xì)胞響應(yīng)，PTH分泌。例如，Ca2+受體和胞外Ca2+對于調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+和細(xì)胞功能方面的作用在Nemeth等人，11 Cell Calcium319，1990中作了述評。Ca2+受體在類卵泡和甲狀旁腺細(xì)胞中的作用在Nemeth，11 Cell Calcium323，1990中進(jìn)行了討論;Ca2+受體在骨的破骨細(xì)胞上的作用的討論可參見Zaidi，10 Bioscien ce Reports493，1990。
體內(nèi)其它細(xì)胞，特別是骨中破骨細(xì)胞，腎中的近腎小球細(xì)胞和近管腎細(xì)胞，表皮中的角化細(xì)胞，甲狀腺中的類卵泡細(xì)胞，胎盤中的滋養(yǎng)層均具有感覺[Ca2+]變化的能力。現(xiàn)已提出這些細(xì)胞上也存在細(xì)胞表面Ca2+受體，這使它們能測定、啟動或能響應(yīng)[Ca2+]變化。
在甲狀旁腺細(xì)胞、破骨細(xì)胞、類卵泡細(xì)胞(C-細(xì)胞)、角化細(xì)胞、近腎小球細(xì)胞和滋養(yǎng)層中，[Ca2+]的增加能引起胞內(nèi)游離Ca2+濃度(“[Ca2+]i”)的增加。這種增加可由胞外Ca2+流入或來自胞內(nèi)的細(xì)胞器的Ca2+遷移引起。用熒光分析指示如fura-2或indo-1(分子探針，Eugene，OR)容易監(jiān)測和定量[Ca2+]i的變化。[Ca2+]i的測定為確定分子在Ca2+受體上用作拮抗劑或?qū)箘┑哪芰μ峁┝髓b定方法。
在甲狀旁腺細(xì)胞中，胞外Ca2+濃度增加能引起[Ca2+]i的快速和瞬時(shí)增加，隨后[Ca2+]i慢慢而持續(xù)地增加。[Ca2+]i的瞬時(shí)增加是由胞內(nèi)Ca2+的遷移引起的，而其緩慢而持續(xù)增加是由胞外Ca2+的流動引起的。胞內(nèi)Ca2+的遷移伴隨生成的肌醇-1，4，5-三磷酸酯(IP3)和二酰基丙三醇增加，這兩種生化指示劑與各種其它細(xì)胞中受體依賴性胞內(nèi)Ca2+遷稱有關(guān)。
除Ca2+外，其它各種二價(jià)和三價(jià)陽離子，如Mg2+、Sr2+、Ba3+、La3+和Gd3+也能使甲狀旁腺細(xì)胞中的胞內(nèi)Ca2+遷移。Mg2+和La3+也能增加IP3的生成;所有這些無機(jī)陽離子均能抑制PTH的分泌。因此在甲狀旁腺細(xì)胞上假設(shè)的Ca2+受體是混雜的，因?yàn)樗軠y定各種各樣的胞外二價(jià)和三價(jià)陽離子。
各種化合物對體外模擬胞外Ca2+的能力在下列文獻(xiàn)中進(jìn)行了討論，即Nemeth等人，(Spermine and Spermidine)的“Calcium-Binding Proteins in Health and Disease”，1987，Academic Press，Inc.，PP.33-35;Brown等人.，(e.g.，neomycin)128 Endocrinology 3047，1991;Chen等人.，(diltiazem and its analog，TA-3090)5 J.Bone and Mineral Res.581，1990;和Zaidi等人.，(Verapamil)167 Boichem Biophys Res Comm 807，1990。
Brown等人，在6 J.Bone and Mineral Res.11，1991中對有關(guān)Ca2+在甲狀旁腺細(xì)胞上的作用的現(xiàn)有理論進(jìn)行了討論，并提出該結(jié)果可用如下二種機(jī)制即類受體機(jī)制和受體非依賴性機(jī)制進(jìn)行解釋多價(jià)陽離子(如，二價(jià)和三價(jià)陽離子)對甲狀旁腺功能(如抑制甲狀旁腺激素(PTH)的分泌和CAMP積聚，刺激磷酸肌醇酯的積聚，細(xì)胞溶質(zhì)鈣濃度提高)有各種影響。這些作用被認(rèn)為是通過“類受體”機(jī)制間價(jià)的。例如，二價(jià)和三價(jià)陽離子對主動肌刺激的CAMP積聚的抑制作用，在用百日咳毒素預(yù)培養(yǎng)后可以被阻斷。因此，這種推想的多價(jià)陽離子受體可以被偶合通過抑制烏嘌呤核苷酸調(diào)節(jié)的(G)蛋白質(zhì)，Gi抑制腺苷酸環(huán)化酶。
近來我們已證明聚陽離子的抗菌素，新霉素在甲狀旁腺功能的多方面能模擬二價(jià)和三價(jià)陽離子的作用。為確定這些作用是否對這些試劑具有特異性或代表聚陽離子和更一般的作用，我們測試了強(qiáng)堿性肽、聚精氨酸和聚賴氨酸以及精蛋白在相同參數(shù)的分散牛甲狀旁腺細(xì)胞中的作用。結(jié)果表明，甲狀旁腺細(xì)胞可能通過類似的生化途徑對各種聚陽離子以及多價(jià)陽離子響應(yīng)。根據(jù)近來假設(shè)的在其它體系中用聚陽離子對G蛋白質(zhì)進(jìn)行“受體非依賴性”調(diào)節(jié)，對這些結(jié)果進(jìn)行討論。
已推測Ca2+受體類似其它G蛋白質(zhì)偶合的受體(如，糖蛋白)，但是對于其它類型細(xì)胞的近來研究提出聚陽離子可能通過另外的或附加的機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。在乳突細(xì)胞中，例如，各種兩親陽離子，包括mastoparan，來自黃蜂毒液的肽，48/80，合成的聚陽離子和聚賴氨酸均通過百日咳毒素敏感機(jī)制增加其分泌，并提出它們包含G蛋白質(zhì)。還未發(fā)現(xiàn)能夠間介這些不同試劑的典型細(xì)胞表面受體。而且，已證明這些相同的化合物能在溶液或在人造磷脂小泡中直接活化已純化的G蛋白質(zhì)。基于這些觀察結(jié)果，已提出兩親陽離子活化G蛋白質(zhì)，并且依次通過“受體非依賴性”機(jī)制分泌乳突細(xì)胞。
也已證明聚陽離子能與酸性磷脂強(qiáng)烈相互作用。改變鏈長的聚賴氨酸(20-1000氨基酸)能與人造磷脂小泡結(jié)合，其離解常數(shù)為0.5nM-1.5μM。這種結(jié)合的親合性直接與聚賴氨酸鏈的長度有關(guān)，對于1000氨基酸聚合物而言，Ka為0.5nM，較短的聚合物具有更高的Ka值，賴氨酸的相互作用程度不明顯。能力與鏈長之間的關(guān)系與已測得的聚賴氨酸10200、聚賴氨酸3800以及賴氨酸對于甲狀旁腺功能的影響相類似。
聚陽離子與生物膜的結(jié)合可能產(chǎn)生某些生物作用。假設(shè)在某些類型細(xì)胞中用各種成孔試劑，包括聚陽離子誘導(dǎo)的血漿膜滲透可通過其與一種類磷脂酰絲氨酸結(jié)構(gòu)相互作用而間介。另外，若將這些蛋白質(zhì)加入到磷脂小泡中，用兩親陽離子使純化的G蛋白質(zhì)“受體非依賴性”活化更有效。
鈣離子(毫克分子濃度范圍)在膜結(jié)構(gòu)中也產(chǎn)生明顯變化。在某些情況下，鈣既能抵消又能增強(qiáng)聚陽離子與膜脂的相互作用。這些研究提出多價(jià)陽離子和聚陽離子在甲狀旁腺細(xì)胞中的作用可能包括無需典型的細(xì)胞表面G蛋白質(zhì)偶合受體存在的一種受體非依賴性機(jī)制。然而，還需進(jìn)一步研究以解釋對于這類和其它類細(xì)胞Ca2+敏感的分子基礎(chǔ)(引用文略)。
Shoback和Chen在(6(supplement 1)，J.Bone and Mineral Res.1991，S 135)和Racke等人在(6(suppleMent 1)，J.Bone and Mineral Res.1991，S 118)敘述的試驗(yàn)，表明在甲狀旁腺細(xì)胞中存在Ca2+受體或Ca2+感受器。從這些細(xì)胞中分離的信使RNA能在卵母細(xì)胞中表達(dá)，并導(dǎo)致具有表現(xiàn)型的那些卵母細(xì)胞產(chǎn)生，這說明存在Ca2+受體蛋白質(zhì)。
申請人已說明Ca2+受體蛋白質(zhì)使某些特定的身體Ca2+代謝細(xì)胞能測定和響應(yīng)胞外Ca2+濃度的變化。雖然這些受體具有某些一般特征，它們能選擇性受不同藥劑影響。如下所述，用甲狀旁腺細(xì)胞，破骨細(xì)胞和C-細(xì)胞中Ca2+受體的選擇活性可鑒定某些分子。
Ca2+受體構(gòu)成用于一類新分子的分離分子靶，該分子能模擬(“模擬鈣”)或?qū)?“溶解鈣”)胞外Ca2+的作用。這種受體存在于細(xì)胞表面，對胞外Ca2+的親合力低(通常Kd約大于0.5mM)。該受體包括自由或結(jié)合的效應(yīng)基團(tuán)機(jī)理，如Cooper Bloom和Roth，“The Biochemical Basis of Neuropharmacology”，ch.4，所定義的。因此該受體性質(zhì)不同于胞內(nèi)Ca2+受體，如調(diào)鈣蛋白和肌鈣蛋白。例如，模擬鈣，選擇性作用于Ca2+受體以直接或間接抑制甲狀旁腺細(xì)胞或破骨細(xì)胞功能，或刺激C-細(xì)胞功能。本發(fā)明的模擬鈣和溶解鈣為甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)、骨質(zhì)疏松及其它與鈣有關(guān)的疾病提供了新的療法。本申請涉及這三種細(xì)胞之每一種和其它類型細(xì)胞上的靶Ca2+受體，該受體測定和響應(yīng)[Ca2+]變化。
申請人是第一個(gè)證明甲狀旁腺細(xì)胞中的Ca2+受體蛋白質(zhì)，并從藥理學(xué)上區(qū)分在其它細(xì)胞，如C-細(xì)胞和破骨細(xì)胞中的Ca2+受體。申請人也是第一個(gè)敘述了方法，通過該方法可以識別在這些Ca2+受體上有活性的分子，而且這些分子可用作發(fā)現(xiàn)、研究、設(shè)計(jì)、改性和/或構(gòu)建在Ca2+受體上具有活性的有用的模擬鈣或溶解鈣的引導(dǎo)分子。該模擬鈣或溶解鈣在以一種或多種成分，如多肽，如激素、酶或生長因子含量異常為特征的各種病態(tài)治療中是有用的，其表達(dá)和/或分泌受到一種或多種Ca2+受體活性調(diào)節(jié)或影響。而且，不同類型細(xì)胞中不同Ca2+受體的鑒定，及該受體對不同引導(dǎo)分子的特定響應(yīng)能設(shè)計(jì)和構(gòu)建對治療特定疾病有活性的特定分子，該分子能受該特定Ca2+受體作用影響。例如，該特定分子能影響甲狀旁腺激素的異常分泌量，但不會改變其它Ca2+調(diào)節(jié)激素及類似物的分泌量。
由可以前沒有高產(chǎn)率的篩選系統(tǒng)以發(fā)現(xiàn)活性分子，也沒有基于設(shè)計(jì)有效藥劑候選物的結(jié)構(gòu)資料，阻礙了該引導(dǎo)分子的鑒定。通過克隆甲狀旁腺細(xì)胞Ca2+受體和功能性相關(guān)受體，并系統(tǒng)研究活化已克隆Ca2+受體和功能性相關(guān)受體的某些引導(dǎo)分子的結(jié)構(gòu)特征，現(xiàn)在已消除這些障礙。Ca2+受體的克隆也能研制轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，該細(xì)胞系適用于天然產(chǎn)物或分子庫和合成分子的高產(chǎn)率篩選。這與下面討論的結(jié)構(gòu)一活性研究一起，提供了研制新模擬鈣和溶解鈣所需的技術(shù)。
在本申請中申請人使該方法得以實(shí)現(xiàn)。例如，通過對非洲蟾蜍屬(Xenopus)卵母細(xì)胞中的功能表達(dá)進(jìn)行篩選可以克隆人甲狀旁腺細(xì)胞Ca2+受體cDNA，通過所選天然產(chǎn)物或其它分子庫的試驗(yàn)，及后來的結(jié)構(gòu)一活性研究可測定對Ca2+受體具有活性的有機(jī)分子的結(jié)構(gòu)特征。
因此，第一方面，本發(fā)明特征為一種藥物組合物，該組合物含有一種分子，該分子或者引起細(xì)胞中[Ca2+]i增加模擬胞外Ca2+活性，或者阻斷由胞外Ca2+引起的[Ca2+]i增加。該分子具有的EC50小于或等于5μM，它不是魚精蛋白。
所謂“模擬”意思是指該分子在胞外Ca2+響應(yīng)細(xì)胞上具有一種或多種特定的胞外Ca2+的作用。該術(shù)語并不要求模擬胞外Ca2+的所有生物功能，而只要模擬該功能中的至少一種。此外，不要求該分子結(jié)合于受體(如同胞外Ca2+受體一樣)的相同位點(diǎn)(參見如，新化合物NPS467及其在下列實(shí)例20中的作用)。所謂“阻斷”意思是指用該分子能減弱或阻止Ca2+的某一作用。EC50能用下述分析方法進(jìn)行測定，該分析測量了模擬活性，并且最大模擬作用的一半時(shí)模擬分子的濃度是EC50。相反，溶解鈣的IC50是阻斷最大活性之一半的量。最好，該分析測量Ca2+]i增加，并用下述方法或其等效方法證實(shí)該方法對Ca2+受體具有特異性。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本文所述的生物檢定法證明細(xì)胞中[Ca2+]i增加是暫時(shí)的，其持續(xù)時(shí)間少于一分鐘，而且[Ca2+]i增加是快速的，在30秒內(nèi)發(fā)生;該分子還能(a)引起[Ca2+]i持續(xù)增加(大于30秒)，(b)引起肌醇-1，4，5-三磷酸酯和/或二酰基丙三醇濃度增加，例如在少于60秒時(shí)間內(nèi)。(c)抑制多巴胺或異丙基腎上腺素刺激的環(huán)狀A(yù)MP生成。此外，用10mM氟化鈉使該細(xì)胞預(yù)處理10分鐘，能消除[Ca2+]i暫時(shí)增加，或用蛋白激酶C的一種活化劑，如佛波醇肉豆蔻酸鹽乙酸酯(Phorbol myristate acetate)(PMA)，瑞香(mezerein)或吲哚肉酰胺(一)indolactam V短暫處理該細(xì)胞(不多于10分鐘)可減少其暫時(shí)增加。
在甲狀旁腺細(xì)胞中，上述所有檢定中起作用的那些分子在本發(fā)明中是特別有用的，因?yàn)樗鼈儗τ谶@種細(xì)胞的Ca2+受體的作用具有特異性。上述PMA預(yù)處理效果特別理想。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該細(xì)胞是甲狀旁腺細(xì)胞，該分子能抑制由該細(xì)胞分泌的甲狀旁腺激素;該分子導(dǎo)致用mRNA注入的非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞中的Cl-傳導(dǎo)增加，該mRNA來自甲狀旁腺細(xì)胞、骨破骨細(xì)胞、近腎小球腎細(xì)胞、近管腎細(xì)胞、角化細(xì)胞、類卵泡甲狀腺細(xì)胞或胎盤滋養(yǎng)層。
在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，該分子能引起胞內(nèi)Ca2+遷移，以導(dǎo)致[Ca2+]i增加;該細(xì)胞是C-細(xì)胞或破骨細(xì)胞，該分子抑制骨體內(nèi)再吸收;該細(xì)胞是一種破骨細(xì)胞，該分子抑制骨體外重新吸收;或該細(xì)胞是C-細(xì)胞，該分子刺激降鈣素(Calcitonin)在體外或在體內(nèi)分泌;最好該分子是模擬鈣或溶解鈣，它們在Ca2+受體中具有的EC50或IC50小于或等于5μM，更優(yōu)選為小于或等于1μM，100 n molar，10 n molar或1 n molar。這種低EC50或IC50值是有利的，因?yàn)樗鼈兛墒贵w內(nèi)或體外用于治療或診斷的分子濃度降低。這種低EC50或IC50分子的發(fā)現(xiàn)使設(shè)計(jì)和合成類似的有效和效力大的分子成為可能。
所謂“模擬鈣”分子意思是指一種任意的分子，該分子具有一種或多種胞外Ca2+活性，并且最好在Ca2+受體上模擬Ca2+活性。例如，當(dāng)用于甲狀旁腺細(xì)胞時(shí)，它是一種分子，若在體外對甲狀旁腺細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，該分子具有下列一種或多種，最好全部按現(xiàn)有技術(shù)中眾所周知方法測定的特性1、該分子能導(dǎo)致難以用1μM La3+或Gd3+抑制的[Ca2+]i快速(到峰時(shí)間＜5秒)和暫時(shí)增加。在缺少胞外Ca2+的情況下，[Ca2+]i的增加持續(xù)進(jìn)行，但用伊屋諾霉素(在缺少胞外Ca2+情況下)預(yù)處理則該增加消除;
2、由胞外Ca2+引起的[Ca2+]i增加不能用二氫吡啶抑制。
3、該分子引起的[Ca2+]i暫時(shí)增加可通過用10mM氟化鈉預(yù)處理10分鐘而消除;
4、該分子引起的[Ca2+]i暫時(shí)增加，通過用蛋白激酶C的活化劑(PKC)，如佛波醇肉豆蔻酸鹽乙酸酯(PMA)、瑞香或(一)-吲哚內(nèi)酰胺V預(yù)處理而減少。該蛋白激酶C活化劑的綜合作用是使該分子的濃度響應(yīng)曲線移向右邊不會影響最高響應(yīng);
5、該分子導(dǎo)致快速增加(＜30秒)肌醇-1，4，5-三磷酸酯二?；嫉纳?。
6、該分子抑制多巴胺或異丙基腎上腺素刺激環(huán)狀A(yù)MP的生成;
7、該分子抑制PTH分泌;
8、用百日咳毒素預(yù)處理(100ng/ml，＞4小時(shí))可阻斷該分子對環(huán)狀A(yù)MP生成的抑制作用，但不會影響[Ca2+]i、肌醇-1，4，5-三磷酸酯、或二?；嫉脑黾?，也不會使PTH分泌減少;
9、該分子引起用富集多聚腺苷酸(Poly(A)+)mRNA注入的非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞中Cl-傳導(dǎo)增加，該mRNA來自?；蛉思谞钆韵偌?xì)胞，但它不會影響用水或鼠腦或肝mRNA注入的非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞;和10、同樣，采用得自甲狀旁腺細(xì)胞的已克隆受體，該分子將在用編碼該受體的特定CDNA或mRNA注入的非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞中引起響應(yīng)。
所謂“溶解鈣”分子意思是指任意一種分子，該分子在胞外Ca2+敏感細(xì)胞上能阻斷該胞外Ca2+一種或多種活性，最好在Ca2+受體中起拮抗劑作用。例如，當(dāng)用于甲狀旁腺細(xì)胞時(shí)，它是一種分子，該分子在體外對甲狀旁腺細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)具有下列一種或多種，最好全部按現(xiàn)有技術(shù)中眾所周知方法測定的特性1、該分子部分或完全阻斷胞外Ca2+濃度增加的能力以(a)增加[Ca2+]i;
(b)使胞內(nèi)Ca2+遷移;
(c)增加肌醇-1，4，5-三磷酸酯的生成，(d)減少多巴胺或異丙基腎上腺素刺激環(huán)狀A(yù)MP的生成，和(e)抑制PTH的分泌;
2、在低[Ca2+]，即0.5mM時(shí)，該分子本身不會改變[Ca2+]i;
3、該分子阻斷用多聚腺苷酸-mRNA注入的非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞中的Cl-傳導(dǎo)增加，該mRNA來自由胞外Ca2+或模擬鈣化合物引起的牛或人甲狀旁腺細(xì)胞，但它不影響用水或鼠腦或肝mRNA注入的非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞;
4、同樣，采用來自甲狀旁腺細(xì)胞的克隆受體，該分子將阻斷注入了編碼該Ca2+受體的特定cDNA或mRNA的非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞中由胞外Ca2+或模擬鈣化合物引發(fā)的響應(yīng)。
在其它類型細(xì)胞上的Ca2+受體中有用的模擬鈣和溶解鈣的類似定義從下列實(shí)施例中可清楚知道。
Ca2+受體能檢測和響應(yīng)某種無機(jī)聚陽離子和聚陽離子的有機(jī)分子。例如，甲狀旁腺細(xì)胞不會由于這些有機(jī)聚陽離子的加入而明顯增加胞外Ca2+濃度，大概是因?yàn)檫@些有機(jī)分子作用與Ca2+受體上的胞外Ca2+完全一樣。本發(fā)明的模擬鈣分子是Ca2+受體的特別好的拮抗劑，可用作藥劑，該藥劑能改變選定細(xì)胞的功能，如甲狀旁腺細(xì)胞的PTH分泌。與Ca2+不同，這些分子中大多僅作用于一個(gè)或多個(gè)，而不是所有Ca2+受體，因此具有專門以一種Ca2+受體為目標(biāo)的能力。
在[Ca2+]i和[Ca2+]起作用的各種疾病，如甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)、骨質(zhì)疏松癥、佩吉特病、高血壓、腎病和癌的治療中，這些分子還提供了更新治療效果研究的引導(dǎo)結(jié)構(gòu)。
該模擬鈣和溶解鈣可配制成藥物組合物，將該藥物組合物給予病人后，可用于調(diào)節(jié)病人的胞外游離Ca2+含量、在選自上述的細(xì)胞中模擬胞外Ca2+的作用。在本發(fā)明之前，申請人還未見到任何這類分子，它能作用于Ca2+受體，能用于治療由Ca2+受體的使用或調(diào)節(jié)失常而引起的疾病或具有正常Ca2+受體的動物疾病(它能通過該Ca2+受體的活化或去活化而治療)。
在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該分子在選自下列的一個(gè)或多個(gè)但不是所有細(xì)胞中具有的EC50小于或等于5μM，這些細(xì)胞為甲狀旁腺細(xì)胞、骨破骨細(xì)胞、近腎小球腎細(xì)胞、近管腎細(xì)胞、角化細(xì)胞、類卵泡甲狀腺細(xì)胞(C-細(xì)胞)和胎盤滋養(yǎng)層。
在本發(fā)明中該分子的特殊作用是特別有用的，因?yàn)樗阌谠隗w內(nèi)和體外進(jìn)行特定的治療和診斷，和發(fā)現(xiàn)附加的模擬鈣或溶解鈣分子。
在特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，該分子在生理PH中是帶正電的，它選自分枝或環(huán)狀聚胺、帶正電的聚氨基酸、和芳烷基胺，例如，分枝的聚胺化學(xué)式為H2N-(CH2)j-(NRj-(CH2)j)K-NH2，其中k是1-10的整數(shù)，每個(gè)j可相同或不同，它是2-20的整數(shù)。每個(gè)Rj可相同或不同，它選自氫和-(CH2)j-NH2，其中j限定如上，至少一個(gè)Rj不是氫。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，該分子具有如下化學(xué)式
其中每個(gè)X任意選自H、CH3、CH3O、CH3CH2O、Br、Cl、F、CF3、CHF2、CH2F、CF3O、CH3S、OH、CH2OH、CONH2、CN、NO2和CH3CH2;Ar是一種疏水本體;每個(gè)R任意選自氫、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、茚基、2，3-二氫化茚基、二氫吲哚基、硫代二氫吲哚基、2-，3-，或4-哌啶基;Y是選自CH、氮和不飽和碳;Z選自氧、氮、硫，
其中n各分別為1-4(包括1和4)的數(shù)，m各分別為0-5(包括0和5)的數(shù)。最好該分子為模擬鈣或溶解鈣。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，疏水本體選自苯基、2-，3-，或4-吡啶基、1-或2-萘基、1-或2-喹啉基、2-或3-吲哚基、芐基和苯氧基;該分子是R-二苯基丙基-α-苯乙胺衍生物，該分子具有如下化學(xué)式
其中每個(gè)X最好獨(dú)立選自Cl、F、CF3、CH3和CH3O。
按本發(fā)明優(yōu)選方式，提供的新苯基-α-苯乙胺類似物和衍生物具有如下化學(xué)式
其中alk是具有1-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈亞烷基;R1是1-3個(gè)碳原子的低級烷基或?yàn)?-3個(gè)碳原子(用1-7個(gè)鹵素原子取代的)低級鹵代烷基;R2和R3獨(dú)立選自碳環(huán)芳基或環(huán)烷基，可以是單環(huán)或雙環(huán)，具有用1-5個(gè)取代基任意取代的5-或6-節(jié)環(huán)，該取代基獨(dú)立地選自1-3個(gè)碳原子的低級烷基，1-3個(gè)碳原子(用1-7個(gè)鹵素原子取代的)低級鹵烷基，1-3個(gè)碳原子的低級烷氧基、鹵素、硝基、氨基、烷基氨基、酰氨基、1-3個(gè)碳原子的低級烷酰氨基、氰基、羥基、2-4個(gè)碳原子的酰基、1-3個(gè)碳原子的低級羥烷基或1-3個(gè)碳原子的低級硫代烷基。合適的碳環(huán)芳基具有1或2個(gè)環(huán)，至少一個(gè)環(huán)具有芳香性，它包括碳環(huán)芳基，如苯基，雙環(huán)碳環(huán)芳基如萘基。從上述化學(xué)式顯而易見，本文所包括的化合物可以以外消旋混合物和以獨(dú)立的立體異構(gòu)體形式存在。特別優(yōu)選的是R-苯基丙基α-苯乙胺衍生物，認(rèn)為它們在降低血清電離鈣中具有增強(qiáng)的活性。
優(yōu)選的化合物包括alk為正丙烯的那些化合物。也優(yōu)選的是R1為甲基的化合物。也優(yōu)選的是R2和R3為任意取代的苯基的那些化合物。
特別優(yōu)選的化合物包括R2為單取代苯基的那些化合物，更優(yōu)選為間位取代。特別優(yōu)選的R3基包括未取代的或單取代苯基，尤其是鄰位取代。優(yōu)選的R2取代基包括氫、鹵烷基，最好為三鹵甲基和烷氧基，優(yōu)選為甲氧基。優(yōu)選的R3取代基包括鹵素。
第二相關(guān)方面，本發(fā)明特征為提供對病人的治療方法，該病人患有一種疾病，或其病情以一種或多種細(xì)胞或在血液或血漿或胞外液體中[Ca2+]或[Ca2+]i異常為特征。該方法包括對病人給藥步驟，該藥為治療有效量的一種分子，該分子通過引起細(xì)胞中[Ca2+]i增加模擬胞外Ca2+活性或阻斷胞外Ca2+引起的[Ca2+]i增加。
所謂“異?！币馑际侵概c一般人相比，該病人具有不同的Ca2+代謝，這是由于受血液或胞外體液中一種或多種蛋白質(zhì)(如，激素)的影響，或者是其它分子影響胞內(nèi)和/或胞外Ca2+的含量。因此，該疾病包括甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)、骨質(zhì)疏松癥和其它骨和與礦物質(zhì)有關(guān)的疾病，以及類似的病(如普通醫(yī)學(xué)教課書中所述，如“Harrison的Principles of Internal Medicine”)。在本發(fā)明中用模擬或阻斷一種或多種Ca2+作用的分子來治療該疾病，由此直接或間接地影響病人體內(nèi)蛋白質(zhì)或其它分子的含量。
所謂“治療有效量”意思是指使疾病的一種或多種癥狀或病人的病情減輕到某種程度的量。另外，所謂“治療有效量”意思是指使與疾病或病情起因有關(guān)的生理或生化參數(shù)部分或全部恢復(fù)正常的量。通常，該量約為該分子的1nmole至1μmole之間，這取決于它的EC50，及病人的年齡、身材和有關(guān)疾病。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，該分子具有EC50小于或等于5μM，它不是魚精蛋白;最好在Ca2+受體中的作用如同模擬鈣或溶解鈣。最好該分子選自上述那些分子之一種。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，病人所患疾病特征為一種或多種成分含量異常，該成分含量可用一種或多種Ca2+受體活性調(diào)節(jié)或影響，該分子作用于細(xì)胞的Ca2+受體，而該細(xì)胞選自甲狀旁腺細(xì)胞、骨破骨細(xì)胞、近腎小球腎細(xì)胞、近管腎細(xì)胞、角化細(xì)胞、類卵泡甲狀腺細(xì)胞和胎盤滋養(yǎng)層。
在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該分子降低病人血清中甲狀旁腺激素的含量，如，降到正常人的水平，或降到足以引起血漿中Ca2+減少的程度;所提供的該分子數(shù)量足以對病人有治療作用。
第三方面，本發(fā)明特征是為病人提供疾病或病情診斷方法，即監(jiān)測病人體內(nèi)一種或多種Ca2+受體的數(shù)目和/或位置(和/或功能完整性)，并將數(shù)目和/或位置(和/或功能完整性)與從正常病人測得的相比較，作為疾病和病情存在的指示。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法是免疫分析法，在該方法中用一種Ca2+受體的抗體測定Ca2+受體的數(shù)目和/或位置和/或功能完整性，這種測定包括提供一種與Ca2+受體結(jié)合的標(biāo)記模擬鈣或溶解鈣分子;診斷的疾病是一種癌，如，甲狀旁腺的異位瘤，或一種病情特征為骨中破骨細(xì)胞數(shù)目高于正常水平，或骨中破骨細(xì)胞活性增加。
第四方面，本發(fā)明特征為提供一種鑒定分子的方法，該分子用作治療分子。該方法包括篩選能模擬細(xì)胞中胞外Ca2+活性或阻斷由胞外Ca2+引起的[Ca2+]i增加的潛在的有用分子，并測定該分子具有的EC50或IC50是否小于或等于5μM。
第五方面，本發(fā)明特征是提供重組體Ca2+受體，含有重組體Ca2+受體的細(xì)胞，編碼Ca2+受體的純化的核酸，分子NPS019的生物活性和應(yīng)用，物質(zhì)NPS459、NPS467、NPS551、和NPS568的新化合物或組合物(參見圖36)，以及有用的模擬鈣或溶解鈣分子的鑒定方法，即鑒定分子在第一個(gè)Ca2+受體而不是在第二個(gè)Ca2+受體中模擬或阻斷一種或多種Ca2+活性，例如用一種重組體Ca2+受體。
所謂“重組體”意思是包括用重組DNA方法生產(chǎn)的任何Ca2+受體，因此其位置、純度或結(jié)構(gòu)均不同于天然存在的Ca2+受體。一般來說，這種受體會以不同于通常在自然狀態(tài)下觀察到的量存在于細(xì)胞中。
所謂“純化”意思是指該抗體或核酸不同于天然存在的抗體或核酸，它是從天然存在(如，在載體體系中)的抗體或核酸中分離出來的，因此，它能用于表達(dá)重組體Ca2+受體。最好，該抗體或核酸是用標(biāo)準(zhǔn)方法得到的均勻制劑。
這種克隆受體能在所需的細(xì)胞中表達(dá)，分離并結(jié)晶以測定其結(jié)構(gòu)。這樣一種結(jié)構(gòu)能設(shè)計(jì)本發(fā)明與Ca2+受體結(jié)合的有用分子。此外，用第一個(gè)克隆作其它細(xì)胞、CDNA或基因庫中克隆的探針，可克隆該受體的等同物。
可以分離克隆受體的抗體，并用作本發(fā)明治療劑，或作為診斷工具以測定Ca2+受體數(shù)目和/或位置和/或功能完整性，從而診斷與Ca2+有關(guān)的疾病或病情。通過靜脈給藥，作為模擬鈣或溶解鈣，該抗體也能在體內(nèi)使用。
因此，一般說來，本發(fā)明特征是提供模擬鈣或溶解鈣分子，該分子能在一種或多種但不是所有的細(xì)胞的Ca2+受體上用作選擇性激動劑或相應(yīng)的對抗劑，所述的細(xì)胞選自甲狀旁腺細(xì)胞、骨破骨細(xì)胞、近腎小球腎細(xì)胞、近管腎細(xì)胞、角化細(xì)胞、類卵泡甲狀腺細(xì)胞和胎盤滋養(yǎng)層。這樣一種組合物可以含有現(xiàn)有技術(shù)公知的任何可藥用載體以提供一種藥物組合物。
本發(fā)明特征還在于用標(biāo)準(zhǔn)方法，如抗敏和有關(guān)方法(如ribozymes)調(diào)節(jié)病人的Ca2+受體數(shù)目，作為對病癥的治療。
本發(fā)明提供用于鑒定分子的方法，該分子影響Ca2+受體活性，用如下限定的鑒定方法可測定模擬鈣和/或溶解鈣。而且，通過使用該鑒定方法或抗體或下述其它方法能夠有效地減弱或增強(qiáng)Ca2+受體的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)譯水平上的表達(dá)的分子可以被確定用于治療。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在下面優(yōu)選實(shí)施方案以及權(quán)利要求中得到說明。
首先簡單的描述附圖。


圖1 描述用于本發(fā)明中的有代表性的分子。
圖2 說明在quin-2或fura-2-載帶牛甲狀旁腺細(xì)胞中由胞外Ca2+誘導(dǎo)的[Ca2+]i的增加。初始[Ca2+]為0.5mM(用CaCl2)，在每個(gè)箭頭處，以0.5mM增加量增加。
圖3 說明在牛甲狀旁腺細(xì)胞中[Ca2+]i的遷移。初始[Ca2+]為0.5mM，由于加入EGTA而減少到＜1μM(如圖所示)。(a)在缺少胞外Ca2+情況下，胞外Mg2+(8mM，最終)誘導(dǎo)[Ca2+]i增加。(b)用伊屋諾霉素(1μM)預(yù)處理阻斷對Mg2+的響應(yīng)。(c)用5μM的分子1799(一種線粒體解偶聯(lián)劑)預(yù)處理沒有影響對Mg2+的響應(yīng)。
圖4 說明低濃度Gd3+使[Ca2+]i穩(wěn)態(tài)增加而高濃度Gd3+使[Ca2+]i暫時(shí)增加的優(yōu)先抑制作用。上圖為對照。胞外Ca2+的初始濃度為0.5mM，在各個(gè)箭頭處增加0.5mM。中間圖Gd3+(5μM)阻斷由胞外Ca2+引起的[Ca2+]i穩(wěn)態(tài)而不是暫時(shí)增加。下圖Gd3+(50μM)引起[Ca2+]i暫時(shí)增加，并消除與胞外Ca2+的暫時(shí)和持續(xù)響應(yīng)。在中圖和下圖，只要加入足量EGTA以優(yōu)先螯合Gd3+Ca2+注入的阻斷作用被消除，并使[Ca2+]i迅速增加。
圖5 說明增加胞外Ca2+濃度克服PMA對[Ca2+]i、IP3生成、和PTH分泌的影響。對于各種變化來說，胞外Ca2+的濃度一響應(yīng)曲線均移向右邊。還應(yīng)注意，當(dāng)[Ca2+]線性增加時(shí)，該濃度一響應(yīng)曲線呈S形變化。
圖6 說明由精胺引起的[Ca2+]i增加隨著[Ca2+]的增加而逐漸降低。在箭頭所示時(shí)間加入精胺(200μM)。在本圖及后面所有圖中，曲線所附數(shù)字是以n M為單位的[Ca2+]i。
圖7 說明精胺能使牛甲狀旁腺細(xì)胞中的胞內(nèi)Ca2+遷移。在加入精胺(200μM)以前，加入EGTA以使[Ca2+]減少到＜1μM，如左邊曲線所示。用伊屋諾霉素(1μM)預(yù)處理可阻斷對精胺的響應(yīng)(右邊曲線)。
圖8 A和B說明精胺類似于胞外Ca2+，能使[Ca2+]i增加，并能抑制牛甲狀旁腺細(xì)胞中的PTH分泌。精胺劑量一濃度響應(yīng)曲線的數(shù)據(jù)點(diǎn)是兩次試驗(yàn)的平均值。
圖9 說明PMA在與胞外細(xì)胞Ca2+響應(yīng)中和與牛甲狀旁腺細(xì)胞ATPrS響應(yīng)中的反作用。左圖說明由于PMA(100nM)使胞外Ca2+誘導(dǎo)的抑制環(huán)狀A(yù)MP生成的濃度一響應(yīng)曲線移向右邊。中圖PMA不會影響ATPrS增加[Ca2+]i的能力。還應(yīng)注意，ATRrS濃度一響應(yīng)曲線表明傳統(tǒng)的反曲特性為濃度的對數(shù)函數(shù)，與胞外二價(jià)陽離子相反。
圖10說明由胞外Mg2+引起的人甲狀旁腺細(xì)胞中胞內(nèi)Ca2+的遷移。這些細(xì)胞從腺瘤中得到，并浸在含有0.5mM胞外Ca2+的緩沖液中。(a)由胞外Mg2+(10mM最終)引起的[Ca2+]i暫時(shí)和持續(xù)增加說明，持續(xù)增加不受硝苯吡酯(1μM)影響，但可用La3+(1μM)抑制，并且當(dāng)La3+被低濃度EGTA選擇性螯合時(shí)又快速返回。(b)La3+(1μM)阻斷由胞外Mg2+引起[Ca2+]i;持續(xù)而不是暫時(shí)增加。(c)在缺少胞外Ca2+的情況下，用胞外Mg2+引起細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+暫時(shí)增加可持續(xù)進(jìn)行。
圖11說明用新霉素或魚精蛋白能引起牛甲狀旁腺細(xì)胞中胞內(nèi)Ca2+遷移。在所有曲線中，初始[Ca2+]和[Mg2+]分別為0.5和1mM。在曲線(a)和(b)中，Ca2+和Mg2+濃度分別從0.5和1mM增加到2和8mM。在其它曲線，(c)到(i)中，按指示加入新霉素B(30μM)或魚精蛋白(1μg/ml)按指示加入La3+(1μM)、EGTA(1mM)或伊屋諾霉素(100nM)。各曲線均表示用至少3種不同的細(xì)胞制劑進(jìn)行5或更多次試驗(yàn)所看到的圖形。標(biāo)線＝1分鐘。
圖12說明新霉素B能阻斷胞外Ca2+引起的[Ca2+]i暫時(shí)增加，但不能阻斷其穩(wěn)態(tài)增加。左曲線對照[Ca2+]最初為0.5mM，在加入新霉素B(30μM)以前，在各個(gè)空心箭頭處以0.5mM的增加量增加。右曲線在Ca2+之前加入新霉素B(30μM)。標(biāo)線＝1分鐘。
圖13說明新霉素B或魚精蛋白在能引起[Ca2+]i增加的濃度下抑制PTH分泌。在存在0.5mM胞外Ca2+的情況下。用所示濃度的有機(jī)聚陽離子培養(yǎng)細(xì)胞30分鐘?？招姆栐诖嬖?.5(圓圈)或2mM(菱形)胞外Ca2+的情況下，對PTH分泌的對照響應(yīng)。[Ca2+]i值為菱形符號。將牛細(xì)胞用于魚精蛋白試驗(yàn)中，將人(腺瘤)甲狀旁腺細(xì)胞用于新霉素B的試驗(yàn)中。各點(diǎn)均為3次試驗(yàn)的平均值±SEM。
圖14說明用精胺瞬時(shí)得到的細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+中PMA的優(yōu)先抑制作用，初始[Ca2+]為0.5mM;按指示加入精胺(200μM)或ATP(50μM)。標(biāo)線＝1分鐘。
圖15說明PMA使胞外Ca2+和新霉素誘導(dǎo)的[Ca2+]i增加的濃度一響應(yīng)曲線移向右邊。在增加[Ca2+]之前或加入新霉素B之前，按要求用PMA預(yù)處理細(xì)胞1分鐘。各點(diǎn)是3-5次試驗(yàn)的平均值±SEM。
圖16說明PMA使胞外Ca2+-和精胺-引起的PTH分泌的抑制的濃度一響應(yīng)曲線移向右邊。在有(實(shí)心環(huán))或沒有(空心環(huán))100nM PMA的情況下，用所示的[Ca2+]和精胺培養(yǎng)細(xì)胞30分鐘。各點(diǎn)均為3次試驗(yàn)的平均值±SEM。
圖17說明魚精蛋白增加肌醇磷酸酯的生成。甲狀旁腺細(xì)胞在含4μci/ml3H一肌-肌醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，洗滌，并用所示濃度的魚精蛋白，在37℃培養(yǎng)。30秒鐘以后，加入CH3Cl3∶MeOH∶HCl和用陽離子交換色譜分離得到的IP1(圓形)和IP3(三角)使反應(yīng)終止。各點(diǎn)均為2次試驗(yàn)的平均值，每次試驗(yàn)重復(fù)三次。
圖18說明PMA能抑制由胞外Ca2+或精胺引起的IP1的生成。在反應(yīng)終止和用陰離子交換色譜測定IP1之前，將3H-肌-肌醇標(biāo)記的細(xì)胞暴露于所示[Ca2+]或精胺中30秒鐘。陰影柱在[Ca2+]增加或加入精胺以前，細(xì)胞用PMA(100nM)預(yù)處理5分鐘。各值均為2次試驗(yàn)的平均值，每次試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行三次。
圖19說明在人(腺瘤)甲狀旁腺細(xì)胞中，用新霉素B引起的[Ca2+]i暫時(shí)和持續(xù)增加。[Ca2+]為0.5mM。(a)用La3+抑制由新霉素B引起的[Ca2+]i持續(xù)增加。(b)La3+不影響由新霉素B引起的[Ca2+]i暫時(shí)增加。(c)在缺少胞外Ca2+的情況下，[Ca2+]i暫時(shí)增加持續(xù)進(jìn)行。
圖20說明新霉素B在表達(dá)Ca2+受體的非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞中會引起Cl-傳導(dǎo)波動增加。上部曲線得自注入人(增生)甲狀旁腺細(xì)胞多聚腺苷酸+-mRNA三天后的卵母細(xì)胞。下部曲線得自注入水的卵母細(xì)胞。在5個(gè)注入水的卵母細(xì)胞中新霉素B沒能引起響應(yīng)，而在一個(gè)(如圖所示)細(xì)胞中碳酰膽堿能引起響應(yīng)。在這兩部分曲線中，均保持電壓-76mV。
圖21說明新霉素B不能在C-細(xì)胞中引起基本的或引發(fā)的增加。對照，左曲線在[Ca2+]增加到3mM以前最初將載帶fura-2的rMTC6-23細(xì)胞浸在含1mM Ca2+的緩沖液中。右曲線用5mM新霉素B預(yù)處理。
圖22說明胞外Ca2+引起鼠破骨細(xì)胞中[Ca2+]i增加。微型熒光計(jì)自動記錄用載帶mdo-1單個(gè)鼠破骨細(xì)胞和在此所示時(shí)間(實(shí)心條)用含所示[Ca2+]的緩沖液使其過冷。正常的緩沖液(在實(shí)心條之間過冷)含1mM Ca2+。
圖23說明精胺或新霉素B沒能引起鼠破骨細(xì)胞中[Ca2+]i增加。將載帶mdo-1破骨細(xì)胞用所示濃度的精胺或新霉素B(空白條)(單獨(dú)或與20mMCa2+一起(實(shí)心條))過冷。
圖24說明黃金蛛毒素(如圖中黃金蛛(argiopine)所示，結(jié)構(gòu)也如圖1所示)659和黃金蛛毒素636對牛甲狀旁腺細(xì)胞中[Ca2+]i的不同影響。初始[Ca2+]為0.5mM，后增加到1.5mM，如右曲線所示。按指示加入黃金蛛毒素659(300μM)或黃金蛛毒素636(400μM)。
圖25說明胞外Mg2+或Gd3+能引起注入牛甲狀旁腺細(xì)胞多聚腺苷酸+-mRNA的非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞中Cl-傳導(dǎo)波動增加。在圖(a)中，胞外Ca2+濃度＜1μM，在圖(b)，為0.7mM，圖(c)說明胞外Mg2+不能在僅注入物質(zhì)K受體mRNA的卵母細(xì)胞中響應(yīng)，盡管用物質(zhì)K過冷會引起響應(yīng)。保持電壓-70-80mV。
圖26說明胞外Ca2+能引起注入人(增生)甲狀旁腺組織多聚腺苷酸+-mRNA的非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞中Cl-傳導(dǎo)波動增加。該卵母細(xì)胞注入50ng多聚腺苷酸+-mRNA三天后檢定其與胞外Ca2+的響應(yīng)性。保持電壓-80mV。
圖27說明用budmunchiamine引起的牛甲狀旁腺細(xì)胞中胞內(nèi)Ca2+的遷移。在指示處，加入budmunchiamine(結(jié)構(gòu)也已圖示，300μM)。
圖28說明甲狀旁腺細(xì)胞中胞內(nèi)Ca2+的遷移能力是立體特異的。在加入指示濃度的各種分子之前，最初將用載帶fura-2的甲狀旁腺細(xì)胞懸浮在含0.5mM胞外Ca2+的緩沖液中。
圖29說明La3+對破骨細(xì)胞中[Ca2+]i的影響。所示的有代表性的圖形得自用載帶mdo-1的單個(gè)鼠破骨細(xì)胞。在低濃度情況下，La3+部分阻斷由胞外Ca2+引起的[Ca2+]i增加。
圖30A和B說明在鼠破骨細(xì)胞中，由胞外Mn2+引起的胞內(nèi)Ca2+的遷移。胞外Mn2+引起[Ca2+]i濃度依賴性增加(圖30A)，而這種增加在缺少胞外Ca2+的情況下能持續(xù)。(圖30B)。
圖31A和31B說明由稱為NPS449(見圖38)的分子引起的鼠破骨細(xì)胞中[Ca2+]i的遷移，將載帶indo-1的已分離的鼠破骨細(xì)胞用指示濃度的NPS449[在有(圖31A)或沒有(圖31B)1mM胞外CaCl2的情況下]過冷。
圖32說明由NPS019(參見圖1)引起的C-細(xì)胞中胞內(nèi)Ca2+的遷移。將rMTC6-23細(xì)胞用載帶fura-2，并浸在含0.5mM[Ca2+]i的緩沖液中。按指示，加入NPS019使其最終濃度為10μM。有代表性的圖形說明由NPS019引起[Ca2+]i暫時(shí)增加是難以用La3+抑制的(中間曲線)并且在缺少胞外Ca2+的情況下能持續(xù)進(jìn)行(右曲線)。
圖33說明NPS456(圖36)能引起已注入牛甲狀旁腺細(xì)胞多聚腺苷酸+-mRNA的非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞中Cl-電流波動增加。
圖34說明胞外Ca2+引起已注入人破骨細(xì)胞mRNA的非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞中Cl-電流波動增加。注入總量為50ng的多聚腺苷酸+mRNA三天后檢測該卵母細(xì)胞與胞外Ca2+的響應(yīng)性。
圖35說明用2.5-3.5Kb的mRNA編碼甲狀旁腺細(xì)胞Ca2+受體。在變性甘油梯度液中使牛甲狀旁腺細(xì)胞多聚腺苷酸+-mRNA按大小分級，并分成10份。每份分別注入非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞(50ng/份)。三天后，檢測該卵母細(xì)胞與胞外Ca2+的響應(yīng)及Cl-傳導(dǎo)的波動增加。
圖36表示由二苯基丙基-α-苯乙胺衍生的分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，該圖說明了這類分子，這類分子被制備和篩選以得到本發(fā)明有用的分子。
圖37說明NPS021是一種溶解鈣化合物，它能阻斷胞外Ca2+對牛甲狀旁腺細(xì)胞中[Ca2+]i的影響。最初將細(xì)胞浸在含0.5mM CaCl2的緩沖液中，如圖所示，[Ca2+]增加到最終為2mM(左曲線)。加入NPS021(200μM)不會引起[Ca2+]i變化，但能抑制由胞外Ca2+引起的[Ca2+]i增加(右曲線)。
圖38說明在體內(nèi)Ca2+對NPS467響應(yīng)。
圖39說明在體內(nèi)PTH對NPS467響應(yīng)。
圖40說明在體內(nèi)Ca2+對25mg/kgNPS467響應(yīng)。
圖41和42說明在體內(nèi)Ca2+對NPS467的不同對映異構(gòu)物響應(yīng)。
圖43a描述用于制備苯乙二苯丙胺或圖36所述的苯乙二苯丙胺類似物或衍生物的反應(yīng)流程圖。圖43b描述用于合成NPS467的反應(yīng)流程圖。
圖44描述劑量響應(yīng)曲線，它說明當(dāng)口服給藥時(shí)，NPS能降低血清離子化鈣。
模擬鈣和溶解鈣分子用于本發(fā)明的模擬鈣和溶解鈣分子一般如上所述。用篩選方法以確定這些分子模擬或?qū)笴a2+受體中Ca2+的活性容易鑒定這些分子。下面例舉了這些方法的例子。這些例子不是為了限制本發(fā)明，而僅僅為了說明這些本領(lǐng)域技術(shù)人員易于使用或適應(yīng)的方法。
通常，通過篩選仿照下面所述的分子(所謂引導(dǎo)分子)仿制的分子確定模擬鈣和溶解鈣分子。如下所見，有幾種用于各種Ca2+受體的特定的模擬鈣和溶解鈣。用標(biāo)準(zhǔn)方法容易設(shè)計(jì)衍生的分子，并以本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的許多方案之一種進(jìn)行試驗(yàn)。許多分子很容易被篩選以鑒定本發(fā)明中最有用的分子。
模擬或?qū)蛊渌w系中Ca2+作用的有機(jī)陽離子分子具有對Ca2+受體有活性的所要求的結(jié)構(gòu)。其它有用分子的合理設(shè)計(jì)包括已知是模擬鈣或溶解鈣的一種分子的研究，然后改變這種已知分子的結(jié)構(gòu)。例如，聚胺可能是模擬鈣，因?yàn)榫吩隗w外幾種體系中模擬Ca2+作用。結(jié)果表明精胺確實(shí)能引起[Ca2+]i和PTH分泌變化，使人回想起由胞外二價(jià)和三價(jià)陽離子所能引起的那些變化(如下所見)。因此下面概述的試驗(yàn)?zāi)康脑谟谡f明這種現(xiàn)象(由精胺得到的)，包括胞外Ca2+所用的相同機(jī)理。為此，測定精胺對于以活化Ca2+受體為特征的各種生理和生化參數(shù)的影響。具有相同作用的那些分子在本發(fā)明中是有用的，并且通過選擇或使這些分子具有類似精胺的結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)它們。一旦發(fā)現(xiàn)另一種有用的分子，該選擇方法便容易重復(fù)。
為清楚起見，下面提供一系列具體篩選方案以確定這些有用的分子，該分子在甲狀旁腺細(xì)胞Ca2+受體上具有活性，或可用作響應(yīng)[Ca2+]變化的細(xì)胞拮抗劑或?qū)箘?。用等效的分析方法可用于在其它Ca2+受體上的分子活性，或換句話說，該分子能模擬或?qū)褂蒣Ca2+]調(diào)節(jié)的細(xì)胞功能。這些分析舉例表明了用于發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的模擬鈣分子的方法?？梢杂玫刃У姆椒òl(fā)現(xiàn)溶解鈣分子，即通過篩選最能對抗胞外Ca2+作用的那些分子。通過標(biāo)準(zhǔn)方法用體外分析表征這些模擬鈣和溶解鈣的選擇性、飽和度和可逆性。
篩選方法通常，開始將載帶fura-2的牛甲狀旁腺細(xì)胞懸浮在含0.5mM CaCl2的緩沖液中，將試驗(yàn)物質(zhì)加到小體積試管(5-15μl)中，注意熒光信號的任何變化。使試管中試驗(yàn)物質(zhì)濃度逐漸增加，直到達(dá)到預(yù)定濃度，或看到熒光變化。若未見熒光變化，則認(rèn)為該分子是無活性的，不必再進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)開始時(shí)，例如，用聚胺型分子，測試的分子濃度高達(dá)5或10mM。按照目前公知的更有效的分子(如下所見)，該濃度上限降低。例如更新的分子在至多為500μM或更低的濃度下進(jìn)行試驗(yàn)。若在此濃度未見熒光變化，則認(rèn)為該分子是無活性的。
對引起[Ca2+]i增加的分子進(jìn)行另外的試驗(yàn)。能被看作模擬鈣分子的分子的兩個(gè)基本特征是胞內(nèi)Ca2+的遷移及對PKC活化劑的靈敏性?，F(xiàn)已明確發(fā)現(xiàn)，以PMA敏感方式引起胞內(nèi)Ca2+遷移的分子必定是模擬鈣分子，并且它能抑制PTH分泌。若需要的話，可進(jìn)行另外的試驗(yàn)以鞏固這種信念。通常，有關(guān)模擬鈣或溶解鈣活性的所有種種試驗(yàn)(如上所見)均未進(jìn)行。當(dāng)然，若一種分子以PMA-敏感方式引起胞內(nèi)Ca2+遷移，則最好篩選人甲狀旁腺細(xì)胞。例如，進(jìn)行[Ca2+]i的測定以確定EC50，并測定該分子抑制人甲狀旁腺細(xì)胞中PTH分泌的能力，而該甲狀旁腺細(xì)胞得自進(jìn)行厚發(fā)性或繼發(fā)性甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)外科手術(shù)的病人。EC50或IC50越低，該分子作為模擬鈣或溶解鈣就更有力。
用fura-2測定[Ca2+]i提供了一種快速篩選新有機(jī)分子活性的方法。一個(gè)下午可分析10-15個(gè)分子，并且評估它們使胞內(nèi)Ca2+遷移或不遷移的能力。還能測定任何觀測到[Ca2+]i增加對PMA抑制的靈敏性。此外單細(xì)胞制劑能提供關(guān)于[Ca2+]i、環(huán)狀A(yù)MP含量、IP3和PTH分泌的數(shù)據(jù)。常用的方法是給細(xì)胞載帶fura-2，然后將該細(xì)胞懸浮液分成兩份，該細(xì)胞大部分用于測定[Ca2+]，其余部分進(jìn)行培養(yǎng)以測定其對環(huán)狀A(yù)MP和PTH分泌中的影響。由于對環(huán)狀A(yù)MP和PTH放射免疫測定的靈敏性，在含有0.3ml細(xì)胞懸浮液(約500000個(gè)細(xì)胞)的單個(gè)培養(yǎng)管中，兩種變化均能測到。測定的肌醇磷酸酯是篩選的時(shí)間一消耗項(xiàng)目。然而，用氯化物(而不是用甲酸鹽)洗提離子交換柱提供了一種篩選IP3生成的快速方法，因?yàn)闊o需旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(約花費(fèi)30小時(shí))。該方法可在一個(gè)下午處理大約100個(gè)樣品。然后，將通過[Ca2+]i、環(huán)狀A(yù)MP、IP3和PTH測定證明是有用的那些分子，再進(jìn)行更精確的分析，測定生成的各種肌醇磷酸酯，并用HPLC測定其同分異構(gòu)形式。
然后，對用這些方法檢定的有用分子進(jìn)行特性測定如，用例如鼠MTC6-23細(xì)胞系測定其在分泌降鈣素的C-細(xì)胞中對[Ca2+]i的影響。
下面是用于這些篩選過程的方法的說明。各種模擬鈣或溶解鈣分子試驗(yàn)的典型結(jié)果的實(shí)例如圖2-34所示。
甲狀旁腺細(xì)胞的制備甲狀旁腺得自當(dāng)?shù)赝涝讏鲂峦涝椎男∨?12-15周)，并將冰冷的甲狀旁腺細(xì)胞緩沖液(PCB)轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室，該緩沖液含有(mM)NaCl，126;KCl，4;MgCl2，1;Na-HEPES，20;PH7.4;葡萄糖，5.6及可變量的CaCl2，如，1.25mM。人甲狀旁腺得自進(jìn)行甲狀旁腺組織外科切除手術(shù)的患原發(fā)性尿毒癥級甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)(HPT)的病人，其處理方法類似牛組織。切除腺的多余脂肪和結(jié)締組織，然后用小剪刀切成約為2-3mm的立方體。通過膠原酶消化制得已溶解的甲狀旁腺細(xì)胞。然后通過在percoll緩沖液中離心以純化溶解的細(xì)胞。得到的甲狀旁腺細(xì)胞制劑基本上沒有血紅細(xì)胞、脂質(zhì)細(xì)胞(adipocytes)和毛細(xì)組織(用反相顯微鏡和Sudan B染色測定)。已溶解和純化的甲狀旁腺細(xì)胞以含有5-20個(gè)細(xì)胞的小團(tuán)存在。如不相容的錐蟲藍(lán)或菲啶溴紅所示，細(xì)胞存活率通常為95%。
雖然該細(xì)胞此時(shí)能用于試驗(yàn)?zāi)康?，但生理反?yīng)(PTH分泌的抑制率和剩余(resting)[Ca2+]i含量)在該細(xì)胞培養(yǎng)過夜后更好。一級培養(yǎng)物還具有如下優(yōu)點(diǎn)，即能用同位素標(biāo)記細(xì)胞以接近同位素平衡;因?yàn)檫@是涉及肌醇磷酸酯代謝測定的研究(如下所見)所必須的。在Percoll梯度液中純化后，將細(xì)胞在添加50μg/ml鏈霉素、100U/ml青霉素、5μg/ml慶大霉素和ITS+的Ham'sF12-Dulbecco's改性的Eagles培養(yǎng)基(GIBCO)的1∶1混合物中洗滌幾次。ITS+是一種含有胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒和牛血清白蛋白(BSA)-亞麻酸(Collaborative Research，Bedford，MA)的預(yù)混合溶液。然后將該細(xì)胞移到塑料瓶(75或150cm2，F(xiàn)alcon)中，在含5%CO2的潮濕氣氛中，在37℃下培養(yǎng)。對這些過夜培養(yǎng)物不添加血清，因?yàn)樗拇嬖跁乖摷?xì)胞粘附于塑料上，迅速擴(kuò)大并難以分開。在上述條件下培養(yǎng)的細(xì)胞通過傾瀉很容易以瓶中取出，其存活率與新制備的細(xì)胞相同。
細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+的測定將純化的甲狀旁腺細(xì)胞再懸浮在含1uM fura-2-乙酸基甲基酯的1.25mM CaCl2-2%BSA-PCB中，在37℃下培養(yǎng)20分鐘。然后將該細(xì)胞制成丸狀，懸浮在缺少酯的相同緩沖液中，在37℃下再培養(yǎng)15分鐘。接著用含0.5mM CaCl2和0.5%BSA的PCB洗滌該細(xì)胞兩次，并在室溫保存(約20℃)。使用前將該細(xì)胞用預(yù)熱的0.5mM CaCl2-PCB稀釋5倍以得到最終BSA濃度為0.1%。在熒光記錄小容器中的細(xì)胞濃度為1-2×106/ml。
在37℃下，在分光熒光計(jì)(Biomedical Instrumentation Group，University of Pennsylvania，Philadelphia，PA)(裝有耐熱小容器架和磁性攪拌器)中分別用340和510nm的激發(fā)波長和發(fā)射波長測定指示劑載帶細(xì)胞的熒光。該熒光表示細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+的含量。用洋地黃皂甙(50μg/ml，最終)校準(zhǔn)熒光信號，得到最大熒光(Fmax)，用EGTA(10mM，PH8.3，最終)可得到最小熒光(Fmin)以及224nM的解離常數(shù)。染料的漏損取決于溫度，大多發(fā)生在該細(xì)胞在小容器中加熱的最初2分鐘，此后染料漏損只是很慢地增加。為核對標(biāo)定的染料漏損，將細(xì)胞放在試管中，在37℃下攪拌2-3分鐘。然后取出細(xì)胞懸浮液，將細(xì)胞制成丸狀，將上層液再放入一個(gè)干凈試管中。然后與上述得到染料漏損估計(jì)值同樣的方法用洋地黃皂甙和EGTA處理上清液，該估計(jì)值通常為總Ca2+依賴性的熒光信號的10-15%。從表現(xiàn)Fmin中減去該估計(jì)值。
PTH分泌的測定在多數(shù)試驗(yàn)中，將載帶fura-2的細(xì)胞用于PTH分泌研究中。載帶fura-2的甲狀旁腺細(xì)胞不改變其對胞外Ca2+的分泌響應(yīng)。將細(xì)胞懸浮在含0.5mM CaCl2和0.1%BSA和PCB中。在含有0.3ml細(xì)胞懸浮液(含或不含少量CaCl2和/或有機(jī)聚陽離子)的塑料管(Falcon 2058)中進(jìn)行培養(yǎng)。在37℃下培養(yǎng)不同時(shí)間(一般為30分鐘)，然后將該管放在冰上，在2℃使該細(xì)胞成丸狀。用醋酸使上清液樣品的PH為4.5，在-70℃下貯存。本方案適用于牛和人的甲狀旁腺細(xì)胞。
對牛細(xì)胞來說，用最終稀釋1/45000的GW-1抗體或其等同物，通過類似的放射免疫分析法測定上清液樣品中PTH的量。用125I-PTH(65-84;INCSTAR，Stillwater，MN)作示蹤劑，用葡聚糖活化的活性炭分離各餾份。在Packard Cobra 5005r計(jì)數(shù)器上進(jìn)行樣品的計(jì)數(shù)和數(shù)據(jù)處理。
對人細(xì)胞來說，因?yàn)镚W-1抗體難以識別人PTH，所以使用從市場上買到的放射免疫盒(INS-PTH;Nichols Institute，Los Angeles，CA)，該盒能認(rèn)別完整的和N-末湍人PTH。
環(huán)狀A(yù)MP的測定按上述方法培養(yǎng)細(xì)胞以用于PTH分泌研究，在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，取0.15ml樣品，移入0.85ml熱(70℃)水中，并在此溫度加熱5-10分鐘。接著使該管冷凍和解凍幾次，通過離心沉淀細(xì)胞碎片。使上清液部分乙?；梅派涿庖叻治龇y定環(huán)狀A(yù)MP的濃度。
肌醇磷酸酯生成的測定用4μci/ml3H-myo-肌醇培養(yǎng)甲狀旁腺細(xì)胞20-24小時(shí)以標(biāo)記磷脂膜。然后洗滌細(xì)胞，并再懸浮在含0.5mM CaCl2和0.1%BSA和PCB中。在缺少或存在不同濃度有機(jī)聚陽離子的情況下，在microfuge管中培養(yǎng)不同時(shí)間。加入1ml氯仿/甲醇/12N HCl(200∶100∶1;V/V/V)以終止反應(yīng)。然后加入肌醇六磷酸水解產(chǎn)物(200μl;25μg磷酸酯/管)水。使該管離心，將600μl的水相稀釋到10ml水中。
使用氯化物或甲酸鹽形式的AG1-X8通過離子交換色譜分離肌醇磷酸酯。當(dāng)僅測定IP3濃度時(shí)，用氯化物形式，而甲酸鹽形式用于分析主要的肌醇磷酸酯(IP3、IP2、和IP1)。若只測定IP3，將經(jīng)稀釋的樣品加到氯化物形式柱中，用10ml 30mM HCl，再用6ml 90mM HCl洗滌柱子，用3ml500mM HCl洗提IP3。將最后的洗提液稀釋并計(jì)數(shù)。為測定所有的肌醇磷酸酯，將已稀釋的樣品加到甲酸鹽形式柱中，接著用增加濃度的甲酸鹽緩沖液洗提IP1、IP2、和IP3。以甲酸鹽柱中洗提的樣品旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，殘?jiān)陔u尾酒中培養(yǎng)并計(jì)數(shù)。
用HPLC測定IP3的同分異構(gòu)形式。加入1ml 0.45M高氯酸使反應(yīng)終止，在冰上貯存10分鐘。離心后，用NaHCO3調(diào)節(jié)上清液的PH為7-8。然后將提出物加到Partisil SAX陰離子交換柱中，用線性梯度的甲酸銨洗提。然后用Dowex使各種鎦分脫鹽，接著在Packard Tri-Carb 1500LSC中進(jìn)行液體閃爍計(jì)數(shù)前旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。
對于所有肌醇磷酸酯分離方法來說，若有機(jī)聚陽離子干擾分離，用可信標(biāo)準(zhǔn)作合適對照以用于測定。如果是這樣的話，在分離肌醇磷酸酯之前，要用陽離子交換樹脂處理樣品以去除這種討厭的分子。
在C-細(xì)胞中細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+的測定將得自American Type Culture Collection(ATCC NO.1607)鼠髓甲狀腺癌(rMTC 6-23)的贅生性C-細(xì)胞在缺少抗體的情況下，在Dulbecco's改性的Eagle's培養(yǎng)基(DMEM)加15%馬血清中單層培養(yǎng)。為測定[Ca2+]i，用0.02%EDTA/0.05%胰蛋白酶收獲該細(xì)胞，用含1.25mM CaCl2和0.5%BSA的PCB洗滌二次，并且按上述對甲狀旁腺細(xì)胞所用方法載帶fura-2。按上述適當(dāng)校正染料漏損的方法進(jìn)行[Ca2+]i的測定。
在鼠破骨細(xì)胞中[Ca2+]i的測定破骨細(xì)胞是采用無菌條件得自1-2天的Sprague-Dawley鼠。用斷頭術(shù)殺死小鼠，切除后腿，快速取出股骨軟組織，放在預(yù)熱的F-12/DMEM培養(yǎng)基中(DMEM含有10%牛胎兒血清和抗生素(青霉素-鏈霉素-慶大霉素;100U/ml-100μg/ml-100μg/ml)。將得自兩只小鼠的骨沿長度方向切斷，放在1ml培養(yǎng)基中。用塑料吸管將骨斷片慢慢搗碎得到骨細(xì)胞，并用培養(yǎng)基稀釋。使骨碎片沉降，將等量(約1ml)的培養(yǎng)基移到帶有25mm玻璃蓋片的6孔培養(yǎng)板上。在潮濕的5%CO2空氣氣氛中，在37℃下使該細(xì)胞沉降1小時(shí)。然后用新鮮介質(zhì)洗玻璃蓋片三次以去除非粘附細(xì)胞。在去除非粘附細(xì)胞6-8小時(shí)內(nèi)進(jìn)行破骨細(xì)胞中[Ca2+]i的測定。
通過在F-12/DMEM缺少血清而含有0.5%BSA中用5uMindo-1乙酸基甲基酯/0.01%普盧蘭尼克(Pluronic)F 28在37℃下培養(yǎng)30分鐘，使粘于蓋玻片的細(xì)胞載帶indo-1。接著洗滌該蓋玻片，在37℃，在F-12/DMEM缺少酯條件下再培養(yǎng)15分鐘，然后移到過冷容器中，該容器安裝在顯微熒光計(jì)的Nikon Diaphot倒象顯微鏡的載物臺中。由于破骨細(xì)胞體積大且存在多個(gè)核，所以容易鑒定。用緩沖液(通常PCB含有0.1%BSA和1mM Ca2+)，以1ml/分有或沒有試驗(yàn)物質(zhì)情況下使該細(xì)胞過冷。在340nm激發(fā)發(fā)射的熒光直接通過顯微鏡影象部射到440nm分色鏡上，用光電倍增管收集強(qiáng)度為495和405nm的熒光。使光電倍增管的輸出放大，計(jì)數(shù)化，并貯存在80386 PC中。用熒光強(qiáng)度的比率測定[Ca2+]i。
卵母細(xì)胞表達(dá)在另外的分析中，在篩選方案中，采用注入來自?；蛉思谞钆韵偌?xì)胞mRNA的非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞，Cl-傳導(dǎo)測定作為監(jiān)測[Ca2+]i增加的一種間接方法。下面是測試新霉素影響的一個(gè)例子。
用富多聚腺苷酸+的mRNA注入卵母細(xì)胞，該mRNA得自人甲狀旁腺組織(來自繼發(fā)性HPT病例的增生腺)。三天后，測試該卵母細(xì)胞對新霉素的響應(yīng)。新霉素B引起Cl-傳導(dǎo)波動增加，用無藥鹽水過冷可使波動增加中止(見圖20)。在100μM-10mM濃度下觀測對新霉素B的響應(yīng)。為確信由新霉素B引起的響應(yīng)是隨甲狀旁腺mRNA的注入而定的，測定了注入水的卵母細(xì)胞中新霉素B對電流的影響。在5次卵母細(xì)胞試驗(yàn)中，新霉素B(10mM)均不使電流發(fā)生任何變化。已知約40%的卵母細(xì)胞對碳酰膽堿響應(yīng)，一種由內(nèi)源蕈毒受體間介的作用。在5次試驗(yàn)的卵母細(xì)胞中，有一次表明在對碳酰膽堿響應(yīng)中產(chǎn)生電流，如圖20的下部曲線所示。因此，在表達(dá)能增加[Ca2+]i和Cl-傳導(dǎo)的蕈毒受體的細(xì)胞中，新霉素B不會引起響應(yīng)。這說明對新霉素B的響應(yīng)取決于用甲狀旁腺細(xì)胞mRNA編碼的特定蛋白質(zhì)的表達(dá)。應(yīng)強(qiáng)調(diào)指出，在完整的細(xì)胞中，新霉素B直接作用于Ca2+受體以改變甲狀旁腺細(xì)胞功能。
由引導(dǎo)分子設(shè)計(jì)藥物某些有機(jī)分子通過在Ca2+受體中的作用模擬或?qū)拱釩a2+的作用(如本文所述)。然而，已試驗(yàn)的分子未必都適合作藥物候選物，但它們能用來證明基于Ca2+受體的治療設(shè)想是正確的。這些分子可用于測定能使它們作用于Ca2+受體的結(jié)構(gòu)特性，因此還能用于選擇本發(fā)明的有用分子。
該分析方法的一個(gè)例子如下在下面實(shí)施例中詳細(xì)描述了這例子，這里用它來說明由本文所討論的引導(dǎo)分子設(shè)計(jì)本發(fā)明有用分子的理論基礎(chǔ)。在該實(shí)施例中所規(guī)定的分析步驟是本技術(shù)人員公認(rèn)的，在其它引導(dǎo)分子中能進(jìn)行類似的分析直到大多數(shù)所要的模擬鈣或溶解鈣被確定。
下面還提供了其它實(shí)例，現(xiàn)有數(shù)據(jù)均說明有用的引導(dǎo)分子將含有芳基，最好在一個(gè)或多個(gè)位置取代，并可按需要含有分支或線性取代或未取代的烷基。此外，重要的是選擇合適的立體有擇分子以確保所要Ca2+受體的高親合力。因此，這些資料給本領(lǐng)域普通專業(yè)人員指明了合適的引導(dǎo)分子，這些分子可以被衍生(derivatised)以發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所要的最佳分子，正如下面所述。
雖然試驗(yàn)的這些分子結(jié)構(gòu)各不相同，但研究表明它們具有共同特性。在本例中，測定了凈正電荷與胞內(nèi)Ca2+遷移效能之間的相互關(guān)系。在引起甲狀旁腺細(xì)胞[Ca2+]i遷移中，魚精蛋白(+21;EC50＝40nM)比新霉素B(+6;EC50＝20μM，在人甲狀旁腺細(xì)胞上和40μM在牛甲狀旁腺細(xì)胞上)更有效，后者又比精胺(+4;EC50＝150μM)更有效。這些結(jié)果產(chǎn)生下列問題，即是否僅由正電荷決定效能的問題，或是否有其它結(jié)構(gòu)特性影響Ca2+受體中的活性問題。在最初進(jìn)行確定是重要的，因?yàn)樗钌钣绊慍a2+受體是具有有效和特定治療分子的目標(biāo)的觀點(diǎn)。因此，可研究與新霉素B和精胺有關(guān)的種種其它有機(jī)聚陽離子以確定分子的凈正電荷和其使胞內(nèi)Ca2+遷移效能之間的關(guān)系。
研究的第一組分子是氨基糖甙類。在牛甲狀旁腺細(xì)胞中檢定該分子。并測定其對于胞內(nèi)Ca2+遷移的EC50。對氨基糖甙類而言，促使細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+暫時(shí)遷移的效能排列次序?yàn)樾旅顾谺(EC50＝20或40μM)＞慶大霉素(150μM)＞卡那霉素B(200μM)＞鏈霉素(600μM)。當(dāng)在500μM濃度下試驗(yàn)時(shí)，卡那霉素和林可霉素沒有作用。在PH為7.3，在這些氨基糖甙類上的凈正電荷為新霉素B(+6)＞慶大霉素(+5)＝卡那霉素B(+5)＞卡那霉素(平均+4.5)＞鏈霉素(+3)＞林可霉素(+1)。而且，這組氨基糖甙類內(nèi)，凈正電荷之間有某種關(guān)系，但這不是絕對的;卡那霉素被預(yù)言比鏈霉素更有效，但它卻沒有活性的。
各種聚胺的試驗(yàn)在凈正電荷和效能之間呈現(xiàn)更多和更明顯的矛盾。對三類聚胺結(jié)構(gòu)進(jìn)行試驗(yàn)(1)直鏈，(2)支鏈，和(3)環(huán)狀。檢定的聚胺結(jié)構(gòu)如圖1所示。在直鏈聚胺中，精胺(+4;EC50＝150μM)比五亞乙基六胺(+6;EC50＝500μM)和四亞乙基五胺(+5;EC50＝2.5mM)更有效，即使后種分子具有更多的凈正電荷。
我們合成了一些支鏈聚胺，它們具有不同數(shù)目的仲氨基和伯氨基，從而改變了凈正電荷。檢定了這些分子中的二種，即NPS381和NPS382對牛甲狀旁腺細(xì)胞中[Ca2+]i的作用。NPS382(+8;EC50＝50μM)的效能約為NPS381(+10;EC50＝100μM)的二倍，即使它所含的正電荷少2個(gè)。
在環(huán)狀聚胺的試驗(yàn)中也看到正電荷和效能之間的類似矛盾，例如，hexacyclen(+6;EC50＝20μM)比NPS383(+8;EC50＝150μM)更有效。由這些聚胺得到的結(jié)果表明正電荷不是影響效能的唯一因素。
另外的研究使我們了解到分子的結(jié)構(gòu)特性，這些結(jié)構(gòu)特性使甲狀旁腺細(xì)胞Ca2+受體具有活性。結(jié)構(gòu)上的重要特性之一是氮(它帶有正電荷)之間的分子內(nèi)距離。因此，在引起牛甲狀旁腺細(xì)胞中[Ca2+]i增加的效能方面，精胺比三亞乙基四胺(EC50＝8mM)高50倍，盡管兩種分子均帶有+4的凈正電荷。這兩種聚胺之間結(jié)構(gòu)中的差別僅在于隔開氮的亞甲基數(shù)目不同在精胺中為3-4-3，而在三亞乙基四胺中為2-2-2?？磥淼g隔中的很小變化對其效能有極大影響，并認(rèn)為分子內(nèi)氮的結(jié)構(gòu)關(guān)系是關(guān)鍵性的。由hexacyclen和五亞乙基六胺得到的結(jié)果支持這種結(jié)論。前種分子僅僅是后者的環(huán)狀類似物，所有氮之間所含的亞甲基數(shù)目相同，這種環(huán)結(jié)構(gòu)的存在也使其效能增加25倍。這些結(jié)果表明正電荷本身不是決定有機(jī)分子對Ca2+受體的活性的關(guān)鍵因素。
另一組試驗(yàn)揭示芳基在決定對Ca2+受體活性中的重要性。該結(jié)果是用Argiope lobata蜘蛛的毒液中分離的二種芳烷基胺得到的。這些分子，黃金蛛毒素636和黃金蛛毒素659具有相同的聚陽離子部分，它與不同的芳基相連接(圖24)。當(dāng)在100-300μM的濃度下進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，黃金蛛毒素659引起牛甲狀旁腺細(xì)胞中[Ca2+]i暫時(shí)增加。相反，當(dāng)在相同濃度下試驗(yàn)時(shí)，黃金蛛毒素636沒有作用。這二種芳烷基胺結(jié)構(gòu)之間差別僅在于該分子的芳族部分不同黃金蛛毒素659含有4-羥基吲哚部分，而黃金蛛毒素636含有2，4-二羥基苯基基團(tuán)。在這二種芳基烷基胺中的凈正電荷是相同(+4)的，所以其效能的差別必然是由不同的芳基引起的。這說明凈正電荷不能獨(dú)立的決定效能。然而，這些研究的客觀重要性在于發(fā)現(xiàn)芳族基團(tuán)能明顯影響分子活化Ca2+受體的能力。
EC50分別為6和22μM的Agatoxin毒素489(NPS017)和Agatoxin毒素505(NPS015)兩者均能引起甲狀旁腺細(xì)胞中胞內(nèi)Ca2+遷移。這些分子結(jié)構(gòu)上的差異僅在于吲哚部分中的羥基不同(圖1)。這些說明該分子芳族部分中的取代會影響其效能。這表明研究的另外一些引導(dǎo)分子將包括具有取代了的芳基部分的那些分子。
本文所述系統(tǒng)改變的引導(dǎo)分子結(jié)構(gòu)特性包括(1)凈正電荷，(2)分隔氮的亞甲基數(shù)目，和(3)環(huán)的型式，如，聚胺，在亞甲基間距和凈正電荷中有和沒有變化;此外，如，在各種由胡蜂和蜘蛛毒液分離的芳烷基胺中可以檢定芳基結(jié)構(gòu)和位置的規(guī)則變化;將市售的芳基部分與黃金蛛屬毒素聚胺部分偶合可制備合成分子。該黃金蛛屬毒素聚胺部分容易與任何含有一個(gè)羧酸的芳基部分偶合。因此，系統(tǒng)篩選苯乙酸和苯甲酸以及羥基吲哚乙酸系的羥基和甲氧基衍生物是簡單的。并且能制備含有雜芳族功能團(tuán)的類似物，并測定其活性。
這些分子中效能和效力的比較可揭示正電荷不變時(shí)芳族基團(tuán)的最佳結(jié)構(gòu)和位置。
似乎會提高效能的聚胺主鏈(motif)的結(jié)構(gòu)變化之一是存在直鏈母分子的環(huán)狀變體從植物Albizia amara中分離的Budmunchiamine A是精胺的環(huán)狀衍生物(圖1)。在牛甲狀旁腺細(xì)胞中加入Budmunchiamine A會引起[Ca2+]i快速和暫時(shí)增加，在缺少胞外Ca2+的情況下會持續(xù)增加，用PMA預(yù)處理會使增加減慢。因此，它引起甲狀旁腺細(xì)胞中胞內(nèi)Ca2+遷移，可能是由于在Ca2+受體上的作用。它差不多與精胺(EC50約為200μM)等效，而所帶正電荷(+3)比精胺少一個(gè)。
由budmunchiamine A得到的結(jié)果證明了結(jié)構(gòu)一活性研究的預(yù)言能力，通過天然產(chǎn)物的試驗(yàn)可獲得新的結(jié)構(gòu)資料。因此，天然產(chǎn)物的篩選，根據(jù)結(jié)構(gòu)資料合理地選擇，是容易進(jìn)行的，例如，基于完全確立的化學(xué)分類學(xué)原則，用合適的資料能選擇分子，如Napralert。例如，能篩選從與Albizia如，Pithecolobium有關(guān)的Papilionoid豆料植物衍生的六環(huán)聚胺生物堿和其它由植物衍生的分子。
圖36提供能篩選測定本發(fā)明有用分子的一系列分子的第二個(gè)例子。這些分子通常從苯乙二苯丙胺衍生，并試驗(yàn)測定它們各自的EC50。此外，有關(guān)分子如NPS447和NPS448的試驗(yàn)揭示了分子結(jié)構(gòu)的立體有擇作用。目前試驗(yàn)的大多數(shù)活性化合物，是稱為NPS467和NPS568的新化合物，它們的EC50值小于5μM。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過研究這系列分子，能測定其它可以在本發(fā)明中被測示的適用的衍生物。
這些例子說明了用于本發(fā)明的一般設(shè)計(jì)和篩選方法并指出另外的化合物和天然產(chǎn)物庫能被本領(lǐng)域技術(shù)人員按要求篩選以測定其它有用的引導(dǎo)分子或本發(fā)明的新分子。
正如上面討論指出，用作模擬鈣的分子例子包括分支或環(huán)狀聚胺，帶正電荷的聚氨基酸、和芳烷基胺。此外，其它帶正電荷的有機(jī)分子，包括天然存在的分子及其類似物也是有用的模擬鈣。最好這些天然存在的分子及其類似物所具有的正電荷與質(zhì)量比率與本文所例舉的那些分子的比率相關(guān)。(這些例子包括從海生動物，節(jié)肢動物毒液、陸生植物中分離的物質(zhì)以及從細(xì)菌和真菌得到的發(fā)酵液體培養(yǎng)基)。可以預(yù)料用作模擬鈣的的一組優(yōu)選天然存在的分子和類似物將具有的正電荷分子量比(以道爾頓表示)約為1∶40-1∶200，優(yōu)選為約1∶40-1∶100，這些分子的更具體例子如下所述。
聚胺在本發(fā)明中適于用作模擬鈣的聚胺可以是分支的或環(huán)狀的。分支或環(huán)狀聚胺可能比其直鏈類似物具有更高的模擬鈣活性。即，分支或環(huán)狀聚胺比它們的相應(yīng)線性聚胺(在生理PH下具有相同的有效電荷)勢必具有更低的EC50(見表1)。
表1分子凈(+)電荷 EC50(μM)新霉素 +6 20或40六聚環(huán)乙胺(Hexacyclen) +6 20NPS382 +8 50NPS381 +10 100NPS383 +8 150慶大霉素 +5 150精胺 +4 150卡那霉素B(Bekanamycin) +5 200黃金蛛屬毒素-659 +4 300五亞乙基六胺(PEHA) +6 500鏈霉素 +3 600亞精胺 +3 2000四亞乙基五胺(TEPA) +5 25001.12-二氨基十二烷(DADD) +2 3000三亞乙基四胺(TETA)(Triethylene-tramine) +4 8000本文所用的“分支聚胺”是指一種鏈分子，它由短烷基橋或通過氨基鍵合連接在一起的烷基組成，并含有鏈分支的點(diǎn)。這些“支點(diǎn)”可以位于碳原子或氮原子，最好是氮原子。通常氮原子支點(diǎn)為叔胺，但也可為季胺。分支的聚胺有1-20個(gè)支點(diǎn)，最好有1-10個(gè)支點(diǎn)。
通常，分支聚胺中烷基橋和烷基支鏈長度為1-50個(gè)碳原子，優(yōu)選2-6個(gè)碳原子。烷基支鏈也可以被1個(gè)或多個(gè)雜原子(氮、氧或硫)斷開，或者用下列功能基取代，例如鹵素包括氟、氯、溴、或碘;羥基;硝基;酰氧基(R'COO-)，酰氨基(R'CONH-)，或烷氧基(-OR')，其中R'可以含有1-4個(gè)碳原子。烷基支鏈也可用在生理PH下是正電荷的基團(tuán)取代，例如氨基或胍基。這些功能性取代基可增加或改變其物理性能如溶解度以增加該分子的活性、傳送或生物可用性。
該分支聚胺具有3個(gè)或更多個(gè)鏈和分支終點(diǎn)。這些終點(diǎn)可為甲基或氨基，優(yōu)選氨基。
一組優(yōu)選的分子是具有下列化學(xué)式的分支聚胺
其中k為1-10的整數(shù)，每個(gè)j可以相同或不同，它可以是2-20的整數(shù)，每個(gè)Ri可以相同或不同，它選自氫和-(CH2)j-NH2，其中j的限定如上，并且至少一個(gè)Ri不是氫。
本發(fā)明特別優(yōu)選的分支聚胺是分子N1，N1，N5，N10，N14，N14-六-(3-氨基丙基)精胺和N1，N5，N14，N14-四(3-氨基丙基)精胺，它們在圖1中分別稱為NPS381和NPS382。
本文所用的“環(huán)狀聚胺”是指含有2個(gè)或更多個(gè)雜原子(氮、氧或硫)的雜環(huán)，其中至少兩個(gè)雜原子是氮原子。該雜環(huán)圓周通常約為6-20個(gè)原子，最好圓周約為10-18個(gè)原子。氮雜原子被2-10碳原子分開。該雜環(huán)在氮位置上也可以用氨基烷或氨基芳基(NH2R-)(其中R是氨基芳基或2-6個(gè)碳原子的低級烷基)取代。
本發(fā)明特別優(yōu)選的環(huán)狀聚胺如圖1所示，為hexacyclen(1，4，7，10，13，16-六氮雜-環(huán)辛烷)和NPS383。
聚氨基酸用于本發(fā)明的聚氨基酸在生理PH條件下可以含二個(gè)或更多個(gè)正電荷氨基酸殘基。這些正電荷氨基酸包括組氨酸、賴氨酸和精氨酸。這些多肽的長度將在2-800個(gè)氨基酸長度變化，更優(yōu)選為20-300個(gè)氨基酸長度。這些多肽可包括簡單重復(fù)的氨基酸殘基，或者可以具有各種天然存在的蛋白質(zhì)或酶。
含有聚氨基酸的氨基酸殘基可為20種天然存在的氨基酸中的任何一種或其它可選擇的殘基?？蛇x擇的殘基包括，例如，ω-氨基酸，其化學(xué)式為H2N(CH2)nCOOH，其中n為2-6，這些是中性的、非極性的氨基酸，如肌氨酸、叔丁基氨基丙酸，叔丁基甘氨酸，N-甲基異亮氨酸，正亮氨酸，苯基甘氨酸，瓜氨酸，甲硫氨酸亞砜，環(huán)己基氨基丙酸和羥基脯氨酸。鳥氨酸是一種可選擇的正電荷氨基酸殘基。本發(fā)明的聚氨基酸也可以是用公知方法化學(xué)衍生的。
本發(fā)明特別優(yōu)選的聚氨基酸包括聚精氨酸、聚賴氨酸和聚(精氨酰-酪氨酸)，含有20-300個(gè)殘基。另一個(gè)優(yōu)選的聚氨基酸是魚精蛋白或魚精蛋白的類似物。
芳烷基胺本文所用的“芳烷基胺”是指一類由節(jié)肢動物毒液得到的正電荷毒素。本發(fā)明優(yōu)選的芳烷基胺包括大頭泥蜂毒素(Philanthotoxin)-433，黃金蛛屬毒素-636和黃金蛛屬毒素-659，agatoxin 505、agatoxin 489，(其結(jié)構(gòu)如圖1所示)，以及其它仿制這些天然產(chǎn)物的合成分子，例如NPS019。
附加組分本發(fā)明的組合物不僅至少包括一種模擬鈣或溶解鈣，而且還包括某些附加成分，這些附加組分包括靶組分、標(biāo)記物和其它能用于本申請的功能性成分，如用于篩選胞外Ca2+拮抗物或?qū)刮锏某煞帧?br> 例如，免疫球蛋白或其部分、或者對甲狀旁腺細(xì)胞或Ca2+受體具有特異性配體均可用作特定的靶組分。免疫球蛋白可為多克隆或單克隆抗體，并且可以含有完整的抗體或這些抗體的免疫反應(yīng)片段，如Fab′、Fab、或(Fab′)2也可以使用特定的受體配體。
本發(fā)明的組合物也可以含有用作標(biāo)記物的分子或離子衍生的某些成分?？梢允褂酶鞣N標(biāo)記部分，包括放射性同位素、發(fā)色團(tuán)和熒光標(biāo)記物。放射性同位素標(biāo)記尤其便于在體內(nèi)檢測。放射性同位素可以在卟淋體系中作為陽離子配位偶合。有用的陽離子包括锝、鎵和銦。在該組合物中，正電荷分子能與標(biāo)記物連接或締合。
合成方法聚胺的合成和改性方法包括使用各種各樣的胺保護(hù)基團(tuán)(苯二甲酰亞氨基、BOC、CBZ、芐基和腈)，，它們可以被選擇性地去除以構(gòu)成官能分子。所包括的合成方法是模擬用于構(gòu)成argiopines 636和659和從蜘蛛毒液得到的其它芳烷基胺的方法。
2-4亞甲基的鏈延伸通常是通過用相應(yīng)的N-(溴代烷基)苯鄰二甲酰亞胺烷基化而完成的。使胺與溴代烷基苯鄰二甲酰亞胺的1∶1.2混合物在乙腈中、在存在50%KF/硅藻土的情況下進(jìn)行回流。鏈的延伸也可通過用丙烯腈或丙烯酸乙酯使給定的胺烷基化而完成。反應(yīng)進(jìn)程用TLC監(jiān)測，用二氯甲烷、甲醇和異丙胺混合物在硅膠上純化中間產(chǎn)物。通過陽離子交換(HEMA-SB)和RP-HPLC(VydacC-18)純化最終產(chǎn)物。純度和結(jié)構(gòu)鑒定用1H-和13C-NMR和高辨質(zhì)譜法(EI、CI和/或FAB)完成。
在存在催化量的二甲基氨基吡啶的情況下，在二氯甲烷中，用二叔丁基碳酸氫酯處理胺(1°或2°)從而加入BOC保護(hù)基。以下列二種方法之一種加入芐基保護(hù)基(1)將1°胺與苯甲醛縮合，然后進(jìn)行硼氫化鈉還原，或(2)在KF存在情況下，用苯甲酰溴使2°胺烷基化。酰胺連接和環(huán)化通常是通過胺(1°或2°)與給定酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)而完成的。這可以通過在稀釋條件下用二環(huán)己基碳二亞胺處理“氨基酸”而直接完成(在環(huán)化情況下)。
苯二甲酰亞氨基官能團(tuán)的脫保護(hù)是在回流的甲醇中用肼還原而完成的。BOC官能團(tuán)的脫保護(hù)是在無水TFA中完成的。芐基、睛和CBZ保護(hù)官能團(tuán)的脫保護(hù)是在催化量的氫氧化鈀/碳存在條件下、在55psi氫氣下、通過在冰醋酸中還原而完成的。在海錦狀阮內(nèi)鎳存在條件下、在氫氣氛條件下可選擇性還原腈官能團(tuán)(在芐基和CBZ基團(tuán)存在條件下)。
具體地說，分支聚胺通常由簡單的二氨基鏈烷烴(化學(xué)式為NH2-(CH2)n-NH2)或簡單的聚胺如亞精胺或精胺制備。二個(gè)主要(末端)胺之一用下列保護(hù)基保護(hù)或“掩蔽”，例如，BOC(叔丁氧羰基)，苯二(甲)酰亞氨基，芐基，2-乙睛(胺與丙烯腈的Michael縮合產(chǎn)生的產(chǎn)物)或酰胺。典型的反應(yīng)是用二叔丁基碳酸氫酯(BOC酐)處理從而加入BOC保護(hù)基團(tuán)
用簡單的色譜法或蒸鎦法從未保護(hù)和二保護(hù)產(chǎn)物中分離單保護(hù)的產(chǎn)物。
然后用烷基化(或酰化)試劑使單保護(hù)產(chǎn)物中其余的游離胺選擇性烷基化(或?；?。為確保單烷基化，該游離胺通過與苯甲醛縮合。然后用硼氫化鈉還原生成N-芐基衍生物而達(dá)到部分保護(hù)。
然后使N-芐基衍生物與烷基化試劑反應(yīng)。典型的烷基化試劑是N-(溴代烷基)苯鄰二甲酰亞胺，其反應(yīng)如下
例如，用N-(溴代丁基)苯鄰二甲酰亞胺使具有四個(gè)亞甲基單元的鏈延長或分支。另一種方法是，先與丙烯腈反應(yīng)，再用氰基還原使鏈延長三個(gè)亞甲基和一個(gè)氨基。
然后可以將所得到的鏈延長分子的保護(hù)基選擇性斷裂以產(chǎn)生新的游離胺。例如，用三氟乙酸除去BOC基團(tuán);用催化氫化減少腈官能團(tuán)并除去芐基;按下圖所示用肼除去苯二(甲)酰亞氨基
新游離胺可以再按上述方法烷基化(或酰化)以增加該聚胺長度。重復(fù)該方法直到獲得所需的鏈長和支鏈數(shù)目。最后步驟為產(chǎn)物的脫保護(hù)，結(jié)果得到所需的聚胺。而且，在按下述方法脫保護(hù)前保護(hù)終止時(shí)可再進(jìn)行修飾例如，在BOC脫保護(hù)前，用3，4-二甲氧基苯基乙酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯使聚胺?；陨啥Ｗo(hù)的聚胺
最終將產(chǎn)生芳基聚胺。
然后用三氟乙酸選擇性除去BOC基團(tuán)，以暴露出其他能按上述方法延長的氨基末端。
在上述形成的聚胺中通過使游離的伯和仲胺同時(shí)烷基化或?；闪四承┓种У木郯贰＠?，用過量丙烯腈處理精胺，然后催化還原，得到如下結(jié)果
按上述方法，用起始原料如1，4，7，10，13，16-六氮雜-環(huán)辛烷(hexacylen)(Aldricn Chem)可以制備環(huán)狀聚胺。
本發(fā)明范圍內(nèi)的聚氨基酸可以采用現(xiàn)有技術(shù)已知的重組技術(shù)制成或者采用現(xiàn)有技術(shù)已知的標(biāo)準(zhǔn)固相技術(shù)合成。固相合成是用α-氨基保護(hù)的氨基酸從肽的羧基末端開始。BOC保護(hù)基可用于所有的氨基，即使其它保護(hù)基也是適用的。例如，BOC-lys-OH能被酯化以載于氯甲基化的聚苯乙烯樹脂載體上。該聚苯乙烯樹脂載體最好是苯乙烯與約0.5-2%二乙烯基苯(作為一種交聯(lián)劑，它能使聚苯乙烯聚合物完全不溶于某些有機(jī)溶劑)的共聚物(參見Stewart等人.，固相肽合成(1969)，W.H.Freeman Co，San Francisco和Merrifield，J.Am.Chem.Soc.(1963)852149-2154。這些和其它肽合成方法也在美國專利US3862925;US3842067;US3972859和4105602中舉例說明。
該多肽合成可以用手工操作方法或自動進(jìn)行，例如，采用Applied Biosystems403A肽合成器(Foster City，California)或Biosearch SAM Ⅱ自動肽合成器(Biosearch，Inc.，San Rafael，California)，按制造商提供的使用指南中的指導(dǎo)操作。
本發(fā)明的芳烷基胺是用已知技術(shù)分離的天然產(chǎn)物，或者按Jasys等人在Tetrahedron Lett(1988)296223-6226和Nason等人在Tetrahedron Lett(1989)302337-2340中所述方法合成。
制備苯乙二苯丙胺(或圖36所示的苯乙二苯丙胺類似物的)的一般方案如下。在裝有磁攪棒和橡皮隔膜的10ml圓底燒瓶中，用1.1m mole苯酚和1.0m mole乙酰苯(或取代的乙酰苯)處理在2ml乙醇中的1.0m mole 3，3'-雙苯基丙胺(或伯烷基胺)。在此溶液中加入2.0m mole MgSO4和1.0m mole NaCNBH3。在氮?dú)夥障?、在室?約20℃)攪拌該反應(yīng)物24小時(shí)。將反應(yīng)物倒入50ml乙醚中，用1N NaOH洗滌3次，并用鹽水洗滌1次。用無水K2CO3干燥醚層，并真空中濃縮(reduced)。然后用柱色譜法或引入了二氧化硅固定相和CH2Cl2-甲醇-異丙胺(通常為3%甲醇和0.1%異丙胺在二氯甲基烷中)混合物的HPLC純化產(chǎn)物。
制備苯乙二苯丙胺或苯乙二苯丙胺類似物(如圖36所示那些)的優(yōu)選方法采用異丙氧基鈦，并按J.Org.Chem.552552(1990)所述方法加以改進(jìn)。對于合成NPS544而言，用四氯化鈦(如Tetrahedron Letters 315547(1990)所述方法)代替異丙氧基鈦(Ⅳ)。反應(yīng)流程如圖43a所示。在圖43a中，R、R′和R″表示烴基。按照一個(gè)實(shí)施方案，在一個(gè)4ml玻璃瓶中，將1m mole胺(1)(通常為伯胺)和1mmole酮或醛(2)(通常為乙酰苯)混合，然后用1.25m mole異丙氧基鈦(Ⅳ)(3)處理，使其在室溫下靜置(偶爾攪拌)約30分鐘。另一種方法是，用仲胺代替(1)。注意某些反應(yīng)將得到大量沉淀或固體，在反應(yīng)過程中可將該固體加溫/加熱(到其熔點(diǎn))以使其攪拌/混合幾次。用1ml含有1m mole氰基硼氫化鈉(4)的乙醇處理反應(yīng)混合物，然后使得到的混合物在室溫靜置(偶爾攪拌)約16小時(shí)。然后加入約500μl水使反應(yīng)物驟冷。然后用乙醚將反應(yīng)混合物稀釋到約4ml的總體積，再進(jìn)行離心。取出上層有機(jī)相，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮(reduced)。得到的產(chǎn)物(b)經(jīng)色譜法通過二氧化硅短柱(或者另一種方法是在二氧化硅上采用預(yù)備TLC)，使用二氯甲烷∶甲醇∶異丙胺(通常為95∶5∶0.1)的混合物進(jìn)行部分純化，然后經(jīng)HPLC純化，(正相用含二氯甲烷∶甲醇∶異丙胺的二氧化硅，或反相，C-18含0.1%TFA，乙腈或甲醇)。
若合適或需要的話，手性拆解可采用如實(shí)施例21中所述方法完成。
制劑和給藥正如本文所證明的本發(fā)明的分子可用于(a)模擬或?qū)拱釩a2+的一種或多種作用;(b)影響各個(gè)胞外游離Ca2+濃度;和(c)治療疾病，例如甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、骨質(zhì)疏松癥和高血壓病。通常該分子已表明對甲狀旁腺細(xì)胞具有影響，同時(shí)它們也能調(diào)節(jié)其它細(xì)胞中的Ca2+受體，這些細(xì)胞包括骨破骨細(xì)胞，近腎小球腎細(xì)胞、近管腎細(xì)胞、角化細(xì)胞、類卵泡甲狀腺細(xì)胞，及胎盤滋養(yǎng)層。
這些分子通常用于治療人的疾病，同時(shí)它們也能用于治療其它溫血動物中類似或相同的疾病。這類動物是例如其它的靈長目動物、飼養(yǎng)場動物如豬、牛和雞鴨等;和運(yùn)動用動物及人們喜愛的動物如馬、狗和貓。
在治療和/或診斷應(yīng)用中，本發(fā)明分子可以按不同給藥方式(包括全身和表面或局部給藥)配制。配制方法和制劑通常在Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA中可找到。
對于全身給藥，最好是口服給藥。另一種方法，可用注射方法，例如肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下注射。用于注射時(shí)，將本發(fā)明分子制成液態(tài)溶液，最好是在生理可匹配的緩沖液中，如Hank氏溶液或Ringer溶液。此外，該分子可制成固體劑型，使用前再立即溶解或懸浮。還包括冷凍干燥劑型。
全身給藥也可以通過透粘膜或透皮方式，或?qū)⒃摲肿右钥诜绞浇o藥。對于透粘膜或透皮給藥，在制劑中使用能透過阻擋物的合適滲透劑。這些滲透劑通常是現(xiàn)有技術(shù)中公知的，包括，例如，用于透粘膜給藥的膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。此外，可以使用去污劑以利于滲透。透粘膜給藥可以通過例如鼻子噴霧，或者使用栓劑，對于口服給藥，該分子可配成常規(guī)口服給藥劑型，例如膠囊、片劑和滋補(bǔ)藥。
對于局部給藥，通常采用現(xiàn)有技術(shù)公知的方法，將本發(fā)明的分子配制成軟膏、油膏、凝膠或乳膏。
如下面實(shí)施例所述，本發(fā)明各種化合物的必需用藥量可用標(biāo)準(zhǔn)方法測定。通常其量為1-50mg/kg受治療的動物。
重組Ca2+受體通常天然產(chǎn)物篩選可提供研制各種治療分子的引導(dǎo)結(jié)構(gòu)。然而，在以前對Ca2+受體具有活性的天然產(chǎn)品庫或其他分子庫的高產(chǎn)率篩選是不可能的。要達(dá)到這種能力，最好是克隆Ca2+受體cDNA，然后建立適于高產(chǎn)率篩選的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。還可用受體的結(jié)構(gòu)來加深理解配體結(jié)合位點(diǎn)的分子幾何結(jié)構(gòu)，并且如前面所討論的那樣，用這些資料來擴(kuò)大合理的藥物設(shè)計(jì)程序。有限的結(jié)構(gòu)活性研究工作以及對所選擇的天然產(chǎn)品分子進(jìn)行的試驗(yàn)，可提供指導(dǎo)合理的天然產(chǎn)品篩選和藥物設(shè)計(jì)所必需的起始結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
可以通過非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞中的功能表達(dá)克隆牛和人甲狀旁腺細(xì)胞Ca2+受體cDNA。通過測定通過內(nèi)在的Ca2+活化的Cl-通道的流可以間接地監(jiān)測非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞中胞內(nèi)Ca2+的增加。由這種信號傳導(dǎo)途徑提供的響應(yīng)放大作用能夠測定很低水平的由mRNA編碼的受體蛋白質(zhì)。這樣就能夠測定受體特異性cDNA克隆，而不需要高親合性配體，特異性抗血清或蛋白質(zhì)或核酸序列資料。這樣一種方法的實(shí)施例如下。
由非洲蟾蜍屬I(Ann Arbor.MI)得到成年雌性Xenopus laevis，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法養(yǎng)護(hù)。將卵巢葉從低溫麻醉的蟾蜍上切除。將卵母細(xì)胞簇移入改性的Barth鹽水(MBS)中。在含有2mg/ml膠原酶(Sigma，Type 1A)的MBS中于21℃培養(yǎng)2小時(shí)，得到單個(gè)的卵母細(xì)胞，選擇Ⅴ-Ⅵ期的卵母細(xì)胞進(jìn)行注射。
把玻璃毛細(xì)管(直徑1mm)拉成細(xì)尖，用手折斷，其尖的直徑為15uM。一滴mRNA(1ng/nl，在焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的水中)放在巴拉膜(Parafilm)上，并吸入毛細(xì)管中。然后把毛細(xì)管與波可濺珠泡水(Picospritzer)(WPI儀器公司)相連，調(diào)節(jié)空氣脈沖微滴的體積以輸送50ng mRNA(通常為50nl)。使用具有固定在底部的尼龍料蓋35mm的培養(yǎng)皿，以保證在將mRNA注射到植物極過程中卵母細(xì)胞的安全。將已注射的卵母細(xì)胞放入35mm培養(yǎng)皿中，其中含有MBS、100ug/ml青霉素和100U/ml鏈霉素，于18℃培養(yǎng)3天。
培養(yǎng)之后，將卵母細(xì)胞放入100ul塑料槽中，利用蠕動泵以0.5ml/min流速用MBS使其過冷。通過將管子快速插入不同的緩沖液，加入試驗(yàn)分子或無機(jī)聚陽離子。記錄與通過電流的電極由拉制成電阻為1-3M歐的薄壁毛細(xì)管構(gòu)成，并裝有3M KCl。在顯微鏡觀察下，用兩個(gè)電極刺穿卵母細(xì)胞(在動物極)，并與Axon Instruments Axoclamp 2A電壓鉗放大器相連，該放大器用來設(shè)定支持電位(-70至-80mV，holding potential)，以及測定維持支持電位所通過的電流，電流直接記錄在長條紙記錄器上。
為了制備mRNA，從患有繼發(fā)性HPT的腓腸或進(jìn)行外科切除甲狀旁腺的病人得到組織。無需制備純化的細(xì)胞;用整個(gè)腺制備指導(dǎo)非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞中Ca2+受體表達(dá)的mRNA。用酸性硫氰酸胍/苯酚提取均化的腺制備全細(xì)胞RNA。用低-dT纖維素色譜法通過標(biāo)準(zhǔn)方法選擇poly(A)+mRNA。對于mRNA大小分離，可以使用甘油梯度離心分離。用20mm甲基汞氫氧化物使mRNA變性，然后將其裝入(50-100ug，濃度為1mg/ml)線性15-30%甘油梯度柱，其梯度柱是用BeckmanTLS55管制備的。以34000rpm離心16小時(shí)后，收集到0.3ml梯度餾分，用等體積含5mMβ-巰基乙醇的水稀釋。然后兩次循環(huán)乙醇沉淀回收mRNA。如果需要，可在1.2%瓊脂糖/6.0M尿素制備凝膠上分離mRNA(50-100ug poly(A)+)，只是要使用各種RNA大小標(biāo)記。用溴化乙錠染色目測mRNA之后，切下含有～1.5-2.0kb大小梯級的RNA的凝膠切片。用RNAid結(jié)合基質(zhì)從瓊脂糖凝膠切片上回收mRNA(根據(jù)Supplier標(biāo)準(zhǔn)方案;Stratagcne，Inc.)，并將回收的mRNA餾分洗脫到DEPC一處理的水中。
用紫外吸收測量方法對所回收的mRNA進(jìn)行定量分析。使用少量的每種樣品(0.5μg)經(jīng)甲醛/瓊脂糖凝膠電泳測定每個(gè)餾分中所含mRNA的大小范圍。通過體外轉(zhuǎn)化每個(gè)樣品可以測定整體mRNA。使用網(wǎng)狀細(xì)胞溶胞產(chǎn)物(在市場可購買到的藥盒;BRL)轉(zhuǎn)化0.05-0.5ug的每個(gè)mRNA餾分。所得到的35S-標(biāo)記蛋白質(zhì)用SDS-PAGE進(jìn)行分析。完整的mRNA能夠指導(dǎo)整個(gè)大小范圍的蛋白質(zhì)的合成，這樣的大小范圍大致相應(yīng)于各個(gè)mRNA餾分的大小。
在修改Gubler和Hoffman技術(shù)之后，在載體λZAPⅡ中構(gòu)建cDNA庫。在卵母細(xì)胞檢驗(yàn)中，具有最佳響應(yīng)的餾分中的RNA可用作原料。用低-dT/NOt I引物連接物引導(dǎo)第一股cDNA鏈合成。再通過RNase H/DNA聚合酶I自身引導(dǎo)法引導(dǎo)第二股鏈的合成。用T4DNA聚合酶使雙鏈cDNA鈍化，并用74連接酶將Eco RI接合體鈍化端與cDNA連接。在NOt I消化以切掉連接物之后，在Sephacry1 500HA上通過排阻色譜法對全長cDNA進(jìn)行大小選擇。第一股cDNA鏈用α-32P-dATP進(jìn)行放射標(biāo)記，在引入放射性之后，監(jiān)測整個(gè)合成和回收步驟。將從分級柱上回收的全長cDNA與Eco RI/Not I消化的λZAPⅡ臂連接起來。用市售高效封裝提取物(Stratagen，Inc)，對連接混合物進(jìn)行組裝(packaged)試驗(yàn)，并在適當(dāng)?shù)乃拗骶?XLI-blue)上平板培養(yǎng)。當(dāng)該庫是在IPTG和X-gal上平板培養(yǎng)時(shí)，通過白色斑點(diǎn)對蘭色斑點(diǎn)的比率測定重組噬菌體的百分?jǐn)?shù)。
從十個(gè)隨機(jī)選擇的克隆測定插入子的平均大小。噬菌體DNA“mini-preps”是用Eco RI和Not I消化而放出其插入子的，并由瓊脂糖凝膠電泳測定其大小。該庫由＞90%的重組噬菌體和1.5-4.2kb大小的插入子組成。大規(guī)模組裝重組連接生成800000個(gè)最初的克隆。校準(zhǔn)組裝混合物，并以每15cm平板50000個(gè)斑點(diǎn)進(jìn)行平板培養(yǎng)。用SM緩沖液洗脫50000個(gè)克隆的每個(gè)庫，并且單獨(dú)貯存。
小規(guī)模制備噬菌體DNA使用每個(gè)克隆庫的平板胞溶產(chǎn)物儲備物。噬菌體顆粒經(jīng)聚乙二醇沉淀被濃縮，用蛋白酶K消化后用苯酚∶氯仿提取純化噬菌體DNA。將20微克DNA用Not I消化，并用作體外轉(zhuǎn)錄敏感鏈RNA的模板。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案，在50ul總反應(yīng)體積中用T7 RNA聚合酶和5'帽類似物m7GppG進(jìn)行上述體外轉(zhuǎn)錄。在DnaseI/蛋白酶K消化和苯酚/氯仿提取后，用乙醇沉淀法濃縮RNA，并將RNA用于卵母細(xì)胞注射。
用來自每個(gè)亞庫為50000單個(gè)克隆構(gòu)成的16個(gè)庫的亞庫中的合成mRNA(cRNA)注射卵母細(xì)胞。在培養(yǎng)3-4天后，對卵母細(xì)胞進(jìn)行10mM新霉素引起Ca2+依賴性Cl-流的能力的分析。指定為6的庫給出正信號，因此它含有編碼功能鈣受體的cDNA克隆。為了減少6庫的復(fù)雜性，并因此繼續(xù)純化該庫中所含的鈣受體克隆，以每塊板約20000斑點(diǎn)再平板培養(yǎng)6庫噬菌體，并得到12塊平板。由這些亞庫中的每個(gè)亞庫制備DNA并合成cRNA。再用cRNA注射卵母細(xì)胞，并在3-4天后，對10mM新霉素引起Ca2+依賴性Cl-流的能力進(jìn)行分析。亞庫6-3是正的，并使該庫進(jìn)行下一輪平板培養(yǎng)，將庫的復(fù)雜性降低到每個(gè)庫約5000克隆。通過制備cRNA并在卵母細(xì)胞中注射再次檢驗(yàn)各庫。亞庫6-3.4是正的。為了加快進(jìn)一步純化庫6-3.4中的正克隆，通過用輔助噬菌體ExAssist重復(fù)感染從這個(gè)庫中挽救出噬菌體DNA作為質(zhì)粒DNA。所挽救的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)菌菌株DH5alphaF'中，在青霉素平板上生成轉(zhuǎn)化的細(xì)菌菌落。在每個(gè)庫有900克隆的庫中得到這些細(xì)菌菌落。然后由每個(gè)亞庫制備出質(zhì)粒DNA，并合成cRNA，并以常見的方式予以檢驗(yàn)。亞庫6-3.4.4是正的。在每個(gè)亞庫為約50克隆的亞庫中平板培養(yǎng)出含質(zhì)粒亞庫6-3.4.4的細(xì)菌。這種過程希望持續(xù)下去以生成編碼功能鈣受體的單個(gè)克隆。
開始的實(shí)驗(yàn)使用了非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞，這種細(xì)胞注入了水或從牛甲狀旁腺細(xì)胞得到的Poly(A)+富集的mRNA(50ng)。三天之后，檢測卵母細(xì)胞響應(yīng)胞外二價(jià)與三價(jià)陽離子濃度的增加而增加胞內(nèi)Ca2+的能力。用記錄與通過流的電極刺穿卵母細(xì)胞，并通過測量內(nèi)源Ca2+-活化的Cl-通道的流間接檢測[Ca2+]i。在用牛(或人，圖26)甲狀旁腺細(xì)胞的Poly(A)+-富集的mRNA注射的卵母細(xì)胞中，胞外Ca2+濃度由0.7mM增加到3、5或10mM，引起Cl-傳導(dǎo)快速瞬時(shí)增加，其傳導(dǎo)然后在較高傳導(dǎo)基礎(chǔ)上波動。胞外Mg2+濃度由1mM增加到10mM，同樣引起Cl-傳導(dǎo)波動增加。當(dāng)胞外Cl2+濃度降到＜1μM時(shí)，Cl-傳導(dǎo)持續(xù)對胞外Mg2+響應(yīng)(圖25)。
不滲透的三價(jià)陽離子Gd3+(600uM)也引起Cl-傳導(dǎo)的波動增加(圖25)。當(dāng)允許卵母細(xì)胞表達(dá)其他Ca2+-遷移受體和用適當(dāng)?shù)呐潴w(例如，物質(zhì)K，圖25)刺激該卵母細(xì)胞時(shí)，注意到Cl-傳導(dǎo)率的這種增加，該傳導(dǎo)名義上無胞外Ca2+的波動和持續(xù)。在這些情況下，Cl-傳導(dǎo)的增加反映胞內(nèi)Ca2+的遷移。這些初始研究工作同樣表明，在甲狀旁腺細(xì)胞的注射mRNA的卵母細(xì)胞中，胞外多價(jià)陽離子遷移胞內(nèi)Ca2+。
用水注射的卵母細(xì)胞在與胞外Ca2+(10mM)或Mg2+(20或30mM)接觸時(shí)，未顯示任何Cl-流的變化。在一系列實(shí)驗(yàn)中，用編碼物質(zhì)K受體的mRNA注射卵母細(xì)胞。在這些卵母細(xì)胞中，胞外Mg2+(20mM)沒有引起任何流，但這些細(xì)胞對所加的物質(zhì)K產(chǎn)生強(qiáng)烈響應(yīng)(圖25)。這些實(shí)驗(yàn)表明卵母細(xì)胞對胞外Ca2+或Mg2+沒有內(nèi)在的敏感性。
使用由人甲狀旁腺(繼發(fā)性HPT患者的增生組織)得到的poly(A)+-富集的mRNA注射的卵母細(xì)胞進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)。在這些卵母細(xì)胞中，胞外Ca2+濃度的增加引起Cl-傳導(dǎo)的可逆波動增加(圖26)。補(bǔ)充300μMLa3+同樣引起Cl-傳導(dǎo)的波動增加。胞外Mg2+濃度由1mM增加到10mM引起在無胞外Ca2+時(shí)Cl-傳導(dǎo)持續(xù)增加。另外的試驗(yàn)表明，對胞外Ca2+的響應(yīng)是濃度依賴性的。因此，在三種mRNA注射的卵母細(xì)胞中，Cl-傳導(dǎo)在3mM胞外Ca2+時(shí)增加到最大值111±22nA，在10mM胞外Ca2+時(shí)增加到最大值233±101nA。
在非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞中得到的結(jié)果證明在編碼蛋白質(zhì)的甲狀旁腺細(xì)胞中存在mRNA，而該蛋白質(zhì)在正常無反應(yīng)的細(xì)胞中可能具有對胞外Ca2+的敏感性。而且，在沒有胞外Ca2+的情況下，胞外Mg2+引起Cl-流波動增加的能力證明Cl-流取決于胞內(nèi)Ca2+的遷移而不是胞外Ca2+的流入。用La3+得到的結(jié)果同樣表明，所表達(dá)的蛋白質(zhì)與胞內(nèi)Ca2+遷移相關(guān)。同時(shí)，這些資料表明，所表達(dá)的蛋白質(zhì)起細(xì)胞表面受體而不是通道的作用。這些研究提供了有力的證據(jù)，證明在甲狀旁腺細(xì)胞表面上存在Ca2+受體蛋白質(zhì)，并且證明了用非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞系統(tǒng)獲得Ca2+受體cDNA分子克隆的可行性。
在另外一系列實(shí)驗(yàn)中，將用甲基汞氫氧化物變性的甲狀旁腺細(xì)胞mRNA通過甘油梯度離心進(jìn)行大小分級。收集十份餾分。將每組注入非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞中，在三天培養(yǎng)期之后，檢驗(yàn)卵母細(xì)胞的Ca2+受體表達(dá)。用餾分4-6注射的卵母細(xì)胞表明，對胞外Ca2+響應(yīng)的Cl-傳導(dǎo)最大和最協(xié)調(diào)地增加(圖35)。這些結(jié)果表明Ca2+受體是由2.5-3.5kb大小的mRNA編碼。這表明由轉(zhuǎn)錄載體cDNA庫合成的直接表達(dá)RNA的策略是可行的。進(jìn)行大小分級這類試驗(yàn)，并且在三種不同的分級試驗(yàn)的每一個(gè)試驗(yàn)中得到了相似的結(jié)果。
可以對所得到的并且具有前述試驗(yàn)中特征的mRNA餾分注入卵母細(xì)胞中進(jìn)行檢驗(yàn)。對于每個(gè)mRNA餾分，將濃度為1ng/nl(在水中)的50ng RNA注入10-20個(gè)卵母細(xì)胞中。已注射的卵母細(xì)胞于18℃維持48-72小時(shí)，其后測量Cl-流以檢驗(yàn)細(xì)胞Ca2+受體的表達(dá)。對于每組已注射的卵母細(xì)胞，測定受體表達(dá)呈陽性的數(shù)目，以及測定所測量的Ca2+依賴性Cl-流大小。作為負(fù)對照，用老鼠肝poly(A)+-富集的mRNA、酵母RNA或水注入卵母細(xì)胞。
預(yù)料2.5-3.5kb的mRNA可編碼該受體。其更大的mRNA，在卵母細(xì)胞注射之前可能需要以甲狀旁腺mRNA的雜交缺失為基礎(chǔ)的克隆法。為了取得成功，這種策略不取決于全長cDNA克隆的增殖。如果用單一大小的mRNA餾分得不到受體表達(dá)，則用混合大小餾分注入卵母細(xì)胞以確定導(dǎo)致功能受體的組合。如果生成功能受體需要多重亞單位，則使用雜交缺失表達(dá)克隆戰(zhàn)略。在這種方法中，根據(jù)使全部mRNA群體中的特殊mRNA缺失的能力來選擇克隆。根據(jù)其防止生成活性多亞單位復(fù)合物的能力確定編碼單個(gè)亞單位的克隆。通過詳細(xì)的篩選有可能確定出編碼所有必需亞單位的克隆。
這種方法能夠分離編碼生成功能受體復(fù)合物所需要的各個(gè)亞單位的克隆。利用用于分析原始mRNA餾分的相同技術(shù)，檢驗(yàn)克隆庫的合成RNA誘導(dǎo)非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞中Ca2+受體表達(dá)的能力。最初檢測了10個(gè)代表100000個(gè)初級克隆的庫。以較低(通常為4-10倍)復(fù)雜性篩選顯示正響應(yīng)的克隆庫，還要對正庫進(jìn)一步細(xì)分和篩選。接著進(jìn)行庫亞分離過程，直到確定出各個(gè)正克隆。作為卵母細(xì)胞表達(dá)檢驗(yàn)的負(fù)對照，由誘導(dǎo)正響應(yīng)的那些DNA模板的T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生抗敏感轉(zhuǎn)錄本，抗敏感轉(zhuǎn)錄本不能得到真正的受體，這將控制由注入合成RNA出現(xiàn)的任何非特異性正信號。另一個(gè)所關(guān)切的事是合成的RNA可能通過一種未確定的機(jī)制，偶然地使已注射的卵母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)譯“中毒”。為了對這種可能性加以控制，將含有甲狀旁腺細(xì)胞mRNA的不同的稀釋液與提供負(fù)響應(yīng)的合成RNAs一同注射，以確定它們是否非特異性干擾Ca2+受體的表達(dá)。
在確定編碼Ca2+受體的各個(gè)克隆時(shí)，從入載體切去cDNA插入子，并且用于大規(guī)模生產(chǎn)合成RNA。這種單一RNA的卵母細(xì)胞注射使得能夠精確估價(jià)所表達(dá)受體的特性。
如果編碼Ca2+受體的mRNA大小對于通過直接轉(zhuǎn)錄和表達(dá)而克隆來說是太大的話，或者如果涉及多重亞單位的話，則使用篩選克隆庫的雜交缺失技術(shù)。從由大小選擇的甲狀旁腺細(xì)胞cDNA庫得到的克隆庫制備cDNA插入子DNA。在生成DNA/RNA雙螺旋的條件下，將這種DNA與甲狀旁腺細(xì)胞mRNA雜交?；厥瘴赐嘶鸬碾s交缺失RNA，并用于卵母細(xì)胞注射。從整個(gè)甲狀旁腺細(xì)胞mRNA群體中的這種mRNA中，排除含有表示Ca2+受體mRNA的序列的克隆庫的DNA，由于卵母細(xì)胞注射，該受體的表達(dá)減少或缺少。接著對降低復(fù)雜性的克隆庫進(jìn)行細(xì)分級過程，在每一步驟對克隆的DNA進(jìn)行檢驗(yàn)，該克隆的DNA使整個(gè)甲狀旁腺細(xì)胞mRNA群體的Ca2+受體編碼的mRNA缺失。在雜交缺失檢驗(yàn)過程中使用內(nèi)對照以保證雜交缺失的RNA是完整的，并且能在卵母細(xì)胞中被轉(zhuǎn)譯。
人甲狀旁腺細(xì)胞表達(dá)與腺苷酸環(huán)化酶偶合的β-腎上腺素能受體。這種受體可以在卵母細(xì)胞中被表達(dá)，在卵母細(xì)胞中它具有興奮劑誘導(dǎo)活化內(nèi)源腺苷酸環(huán)化酶的能力。在雜交缺失篩選Ca2+受體克隆過程中，對用雜交缺失的mRNA注射的卵母細(xì)胞進(jìn)行異丙基腎上腺素誘導(dǎo)的腺苷酸環(huán)化酶活化分析。該分析中的正響應(yīng)表明任何觀察到的Ca2+受體響應(yīng)的抑制作用是特異性的，并不是由于整個(gè)mRNA群體的一般抑制作用。
雜交缺失篩選策略可能導(dǎo)致分離不包括完整蛋白質(zhì)編碼區(qū)的克隆。將通過這種篩選策略分離的正克隆排出順序以確定它們的蛋白質(zhì)編碼能力。人甲狀旁腺RNA的mRNA印跡分析能夠測定相應(yīng)于特定克隆的完整mRNA的大小。如果正克隆不是全長的話，那么已克隆的cDNA可以作為雜交探針以篩選整個(gè)cDNAs的甲狀旁腺cDNA庫。
許多細(xì)胞系都能將外源表達(dá)的受體與內(nèi)源功能響應(yīng)聯(lián)系起來。可以對許多這些細(xì)胞系(如NIH-3T3、HeLa、NG115、CHO、HEK、293和COS7)進(jìn)行試驗(yàn)以證實(shí)它們?nèi)鄙賰?nèi)源Ca2+受體。那些對外部Ca2+沒有響應(yīng)的細(xì)胞系可以用于建立表達(dá)已克隆的Ca2+受體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。
由表達(dá)克隆確定的Ca2+受體cDNA克隆的序列分析可以描述編碼受體蛋白質(zhì)的開放閱讀框架。該cDNA的編碼區(qū)將亞克隆到真核表達(dá)載體pMSG的多克隆位點(diǎn)上。這種載體使得由小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子驅(qū)動高水平的轉(zhuǎn)錄，并且在很多哺乳動物細(xì)胞中這種載體都是活性的。這種載體還含有對霉酚酸具有抗性的gpt基因，該霉酚酸處于SV40早啟動子的控制之下，該載體還含有在細(xì)菌中選擇與生長所必需的序列。從大腸桿菌中生長和純化出大量表達(dá)載體/受體cDNA質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。
用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞系的最有效的方法隨所給出的細(xì)胞類型而變化。采用適宜的技術(shù)，或者Ca2+磷酸鹽沉淀、DEAD-葡聚糖轉(zhuǎn)染、脂染(lipofection)，或者electroporation，將Ca2+受體表達(dá)結(jié)構(gòu)引入培養(yǎng)的細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染步驟之后，在抗生素G418存在下使細(xì)胞生長，以選擇表達(dá)新霉素抗性基因的細(xì)胞。再將G418抗性轉(zhuǎn)染體菌落亞克隆，并建立為單個(gè)細(xì)胞系。在G418抗性細(xì)胞中的Ca2+受體蛋白質(zhì)的表達(dá)可用幾種方法檢驗(yàn)。Southern印跡分析和slot印跡分析將證實(shí)受體cDNA序列的存在和復(fù)制數(shù)、使用Northern印跡分析將證實(shí)受體mRNA是由質(zhì)粒結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄的。通過測量對外施Ca2+受體興奮劑響應(yīng)的胞內(nèi)Ca2+的遷移作用，可以確定受體蛋白質(zhì)的功能表達(dá)。
Ca2+受體克隆能從結(jié)構(gòu)與功能兩方面研究這種新的受體?？梢詫⒅亟M制備的受體結(jié)晶用于結(jié)構(gòu)研究。表達(dá)該受體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系可用于高產(chǎn)率篩選天然產(chǎn)品或其他化合物庫。對具有必不可少的效能和專一性的分子可進(jìn)行標(biāo)記(放射性法和螢光法)。試驗(yàn)分子顯示這樣一種標(biāo)記分子的提取物的能力將構(gòu)成高產(chǎn)率篩選試驗(yàn)的基礎(chǔ)。
如果提供表達(dá)其他鈣受體的適宜細(xì)胞或組織，則這些受體可以按照與前面對甲狀旁腺細(xì)胞鈣受體描述的相似方法進(jìn)行克隆。例如，人破骨細(xì)胞瘤組織的mRNA編碼破骨細(xì)胞鈣受體(圖34)。因此，要分離人破骨細(xì)胞受體克隆，人們只需要從破骨細(xì)胞瘤組織分離mRNA，按前面所敘述的方法制備一個(gè)cDNA庫和檢驗(yàn)/分離亞庫。再者，優(yōu)選的藥物篩選用的受體是來源于人的。可以使用編碼一個(gè)物種的鈣受體的克隆，以通過本技術(shù)領(lǐng)域?qū)I(yè)人員眾所周知的交叉雜交方法得到相應(yīng)的人cDNA克隆。此外，這種甲狀旁腺細(xì)胞或其他細(xì)胞Ca2+受體的克隆能分離編碼其他細(xì)胞中類似Ca2+-敏感蛋白質(zhì)的基因，并且表達(dá)那些蛋白質(zhì)?？梢杂迷S多方法做到這一點(diǎn)。利用Ca2+受體cDNA作雜交探針，對人基因組DNA進(jìn)行Southern印跡分析將顯示出該基因組中所編碼的相關(guān)序列數(shù)。不同程度的雜交將顯示出相關(guān)序列中的偏離程度。這將提供有關(guān)編碼相關(guān)受體蛋白質(zhì)的基因潛在數(shù)量的信息。以Ca2+受體cDNA作探針的Northern印跡分析將確定在各種組織中是否有相同或相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本存在。若探測出與甲狀旁腺細(xì)胞Ca2+受體相似的相關(guān)轉(zhuǎn)錄本，則通過篩選合適的cDNA庫或采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)得到這些mRNA的克隆就是相當(dāng)簡單的事情。這樣得到的新受體克隆就可以在卵母細(xì)胞中或在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中通過表達(dá)進(jìn)行功能檢測。表達(dá)細(xì)胞特異性Ca2+受體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系可以提供一種專門對例如破骨細(xì)胞或腎小球細(xì)胞的Ca2+-敏感機(jī)制起作用的分子進(jìn)行高產(chǎn)率篩選的方法。
在另一方法中，通過在真核細(xì)胞中表達(dá)可以對鈣受體進(jìn)行克隆。例如，可以由甲狀旁腺mRNA制備cDNA庫，并將該庫克隆到真核表達(dá)載體pCDNA1中。來自這個(gè)庫的亞庫可以被轉(zhuǎn)染到諸如COS7或HEK293細(xì)胞之類的真核細(xì)胞中，這些真核細(xì)胞導(dǎo)致已編碼的cDNA序列較高水平的瞬時(shí)表達(dá)。用功能鈣受體克隆轉(zhuǎn)染的細(xì)胞將表達(dá)能被鈣、新霉素或其他模擬鈣化合物活化的鈣受體。若細(xì)胞首先載有[Ca2+]i的螢光指示劑，則鈣受體的活化導(dǎo)致螢光增加。因此，含鈣受體庫的亞庫可以在轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中時(shí)，利用它們誘導(dǎo)鈣或模擬鈣特異性螢光增加的能力進(jìn)行確定。可以使用螢光計(jì)或螢光活化細(xì)胞分揀器(FACS)測定其螢光。
在另一種方法中，可以用所產(chǎn)生的抗該受體的單克隆抗體克隆Ca2+受體。單克隆抗體提供了免疫親合性純化特殊蛋白質(zhì)的強(qiáng)有力的工具。一旦純化，就可以從有意義的蛋白質(zhì)得到已限定的氨基酸序列資料，并且該資料用于設(shè)計(jì)低核苷酸序列探針，以篩選完整cDNA序列的克隆。
為生產(chǎn)雜交瘤，使用整個(gè)牛的甲狀旁腺細(xì)胞作免疫原。根據(jù)已建立的方法，得到純化的分散細(xì)胞，并且將活細(xì)胞制劑腹膜內(nèi)注射到適當(dāng)?shù)睦鲜蠓N內(nèi)。對于免疫程序和生產(chǎn)雜交瘤來說要遵照標(biāo)準(zhǔn)方案。用兩步篩選法確定分泌可識別Ca2+受體的單克隆抗體的雜交瘤。開始篩選將確定那些可識別甲狀旁腺細(xì)胞表面抗原的單克隆。然后用免疫組織化學(xué)技術(shù)篩選雜交瘤上清液，以挑選出存在與甲狀旁腺細(xì)胞表面結(jié)合的老鼠抗體的那些上清液。這種篩選在甲狀旁腺組織的固定切片上進(jìn)行，或者在一級培養(yǎng)物中的分散細(xì)胞上進(jìn)行。文獻(xiàn)中已經(jīng)很好地建立了這種檢驗(yàn)技術(shù)。
這種篩選將確定產(chǎn)生對各種細(xì)胞表面決定子的單克隆抗體的雜交瘤，并且可以預(yù)料對Ca2+受體具有特異性的單克隆只包括它們的小亞群。要確定與Ca2+受體結(jié)合的單克隆抗體，就要對在開始篩選時(shí)實(shí)驗(yàn)證明呈陽性的雜交瘤上清液進(jìn)行分析，以分析其阻斷培養(yǎng)的甲狀旁腺細(xì)胞對Ca2+受體興奮劑響應(yīng)的能力。可以預(yù)料一些與胞外區(qū)域中的受體結(jié)合的抗體能夠抑制或活化配體結(jié)合，或者反過來干擾或影響受體活化。
通過Western印跡法、免疫沉淀和免疫組織化學(xué)法表征在兩種篩選中呈陽性的單克隆抗體。這樣就決定了所識別的抗原的大小及其組織分布。然后依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將適宜的單克隆抗體用于免疫親合色譜法純化Ca2+受體蛋白質(zhì)。得到足夠量的蛋白質(zhì)就能確定有限的氨基酸順序。然后根據(jù)肽序列信息可以設(shè)計(jì)變性的低核苷酸探針。再利用這些探針篩選Ca2+受體的全長克隆的甲狀旁腺cDNA庫。在卵母細(xì)胞系統(tǒng)中和在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞系中，利用DNA序列和功能表達(dá)可以表征所得到的克隆。
另外一方面，可以使用該抗體篩選諸如在λgt11中的cDNA之類的表達(dá)庫或其等同物，以確定表達(dá)抗原性反應(yīng)蛋白質(zhì)的那些克隆。然后可以排出這些克隆的序列，以確定它們是否能夠編碼也許是Ca2+受體的蛋白質(zhì)。
本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員還應(yīng)該知道，可以用噬菌體顯示庫克隆和分析鈣受體而不是單克隆抗體。在這些庫中，抗體的可變區(qū)或隨機(jī)的肽漫無目的的克隆到噬菌體表達(dá)載體中，以致抗體區(qū)或肽在噬菌體粒子表面上顯示出來。顯示能高度專一結(jié)合到鈣受體上的抗體區(qū)或肽的噬菌體將結(jié)合到顯示這些受體的細(xì)胞上(例如甲狀旁腺細(xì)胞、C-細(xì)胞、破骨細(xì)胞等)?？梢耘臄z到數(shù)百萬這種噬菌體(包括結(jié)合到鈣受體上的那些噬菌體)，它們對抗這些僅僅選擇可結(jié)合到這些細(xì)胞上的那些噬菌體的細(xì)胞類型。以這種方式可以極大地降低庫的復(fù)雜性。隨后，前面有關(guān)單克隆抗體的篩選可用于分離能顯示結(jié)合鈣受體的抗體或肽區(qū)域的噬菌體。這些噬菌體可用于分離用于結(jié)構(gòu)鑒定和克隆目的的鈣受體。制備這種噬菌體顯示庫的藥盒在市場上是可以買到的(例如，Stratacyte，或Cambridge Antibody Technology Limited)。被賦予這種結(jié)合鈣受體性質(zhì)的重組噬菌體還可以代替單克隆抗體用于各種鈣受體分析中。在高產(chǎn)率結(jié)合競爭篩選中，也可以使用這種噬菌體以確定能夠與鈣受體功能結(jié)合的有機(jī)化合物，這些化合物可以作為結(jié)構(gòu)引導(dǎo)，來研究作用于鈣受體的人體治療方法。
在另一種情況下，如Pilch & Czech(1 Receptor Biochem，Methodol.161，1984)所述，放射配體與它們的受體的親合交聯(lián)可用于分離受體蛋白質(zhì)。放射配體的共價(jià)連接物使得能夠充分洗滌以除去非特異性結(jié)合物。例如，將高親合性分子如精氨酸與酪氨酸的隨機(jī)共聚物(MW＝22K，精氨酸與酪氨酸之比為4∶1)(它能夠遷移胞內(nèi)Ca2+，EC50為約100nM或更少)，用125I碘化，并且交聯(lián)。如Dottavio-Martin & Ravel(87 Analyt.Biochem 562，1978)所描述的，魚精蛋白因其小得多而在交聯(lián)研究中是更可取的，并且烷基化可能被降低。
在未標(biāo)記的多價(jià)、二價(jià)和三價(jià)陽離子存在下，非特異性標(biāo)記因交聯(lián)作用而保持在最低。這些分子在濃度高時(shí)，其標(biāo)記物與該細(xì)胞表面的非特異性相互作用可能被減少。
應(yīng)用用高鈣血和升高水平的循環(huán)PTR表征原發(fā)性副甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)(HPT)。HPT中主要缺陷之一表明是甲狀旁腺細(xì)胞對胞外Ca2+的負(fù)反饋調(diào)節(jié)的靈敏度降低。因此，在患有原發(fā)性HPT的病人組織中，胞外Ca2+的“設(shè)定點(diǎn)”向右移動，這樣就需要高于正常濃度的胞外Ca2+來抑制PTH分泌。而且，在原發(fā)性HPT中甚至高濃度的胞外Ca2+也常常只是部分抑制PTH分泌。在繼發(fā)性(尿毒癥)HPT中，觀察到胞外Ca2+設(shè)定點(diǎn)的類似增加，盡管對于這種增加來說Ca2+抑制PTH分泌的程度是正常的。PTH的分泌通過[Ca2+]i變化而平行變化胞外Ca2+誘導(dǎo)的[Ca2+]i增加的設(shè)定點(diǎn)向右移動，并且這種增加幅度降低。而且，在腺瘤和增生的甲狀旁腺細(xì)胞中，具有識別Ca2+受體的單克隆抗體的組織染色被降低。
Ca2+受體構(gòu)成了藥理干預(yù)用的分離的分子實(shí)體。模擬或?qū)拱釩a2+作用的分子在長期治療原發(fā)和繼發(fā)性HPT方面都是有益的。這種分子提供了需要抑制只是高鈣血條件不能達(dá)到的PTH分泌的附加刺激。這種比胞外Ca2+有更高效能的分子可以戰(zhàn)勝在腺瘤組織中特別困難的表觀不能抑制PTH分泌的組分。另外，這種分子可以抑制PTH的合成，正如所表明的延長高鈣血以抑制牛和人腺瘤甲狀旁腺組織中的prepro PTH mRNA水平。延長高鈣血也抑制體外甲狀旁腺細(xì)胞增生，這樣模擬鈣在限制繼發(fā)性HPT的甲狀旁腺細(xì)胞增生特性方面也可能是有效的。
體內(nèi)其他細(xì)胞可以直接對胞外Ca2+濃度的生理變化響應(yīng)。甲狀腺(C-細(xì)胞)中由類卵泡細(xì)胞分泌降鈣素是通過胞外Ca2+濃度變化調(diào)節(jié)的。同PTH分泌一樣，由腎中腎小球細(xì)胞分泌血管緊張肽原酶通過胞外Ca2+濃度增加而被抑制。胞外Ca2+引起這些細(xì)胞中胞內(nèi)Ca2+的遷移。已分離的破骨細(xì)胞對胞外Ca2+濃度的增加產(chǎn)生響應(yīng)，后者伴隨著相應(yīng)的[Ca2+]i增加，[Ca2+]i相應(yīng)增加部分是由于胞內(nèi)Ca2+遷移造成的。破骨細(xì)胞中[Ca2+]i增加是與和甲狀旁腺細(xì)胞中PTH分泌類似的功能響應(yīng)(骨吸收)的抑制作用相關(guān)的。因此，有足夠跡像表明，除了作為胞內(nèi)信號的普遍作用之外，Ca2+還可作為細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)某些特殊細(xì)胞的響應(yīng)。本發(fā)明的分子可用于治療與這些細(xì)胞中已中斷的Ca2+響應(yīng)相關(guān)的疾病。
在甲狀旁腺細(xì)胞和其他細(xì)胞上克隆Ca2+受體將允許在其他細(xì)胞中存在同種蛋白質(zhì)以直接進(jìn)行檢驗(yàn)。于是可以得到一組結(jié)構(gòu)類似的Ca2+受體蛋白質(zhì)。這種受體將使得能夠理解到這些細(xì)胞如何檢驗(yàn)胞外Ca2+，并且能對在本文所描述的有效治療HPT、骨質(zhì)疏松和高血壓，以及其他涉及骨和礦物質(zhì)的疾病新的治療方面作為治療作用位點(diǎn)的機(jī)制作出評價(jià)。
其他應(yīng)用在上面已有討論。例如，在治療中可以使用重組Ca2+受體蛋白質(zhì)，并且該蛋白質(zhì)可通過標(biāo)準(zhǔn)方法(如轉(zhuǎn)染編碼那種蛋白質(zhì)的核酸)引入。此外，這種蛋白質(zhì)在本發(fā)明模擬鈣分子的檢驗(yàn)方面是有用的。
下面的實(shí)施例說明本發(fā)明但不限制其范圍。
實(shí)施例在這里敘述的研究工作中，發(fā)現(xiàn)許多有機(jī)分子都能遷移細(xì)胞外Ca2+和抑制甲狀旁腺細(xì)胞中PTH分泌。這些分子在結(jié)構(gòu)上是不同的，但大多數(shù)在生理PH條件下具有凈正電荷。有機(jī)分子的陽離子性質(zhì)起著重要的作用，但不是決定活性的唯一因子。
實(shí)施例1在牛甲狀旁腺細(xì)胞上篩選模擬鈣分子在Percoll梯度柱上純化已離解的牛甲狀旁腺細(xì)胞，并在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。接著使這些細(xì)胞載帶fura-2，和螢光法測定游離細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度。利用[Ca2+]i變化篩選在Ca2+受體上具有活性的分子?？紤]到模擬鈣，要求分子顯示出由于細(xì)胞外Ca2+增加所引起的，并由Ca2+受體活化所觸發(fā)的正常效應(yīng)。這就是
1)該分子必須在沒有細(xì)胞外Ca2+時(shí)持續(xù)地誘發(fā)[Ca2+]i增加(證明細(xì)胞內(nèi)Ca2+遷移);
2)該分子必須引起異丙基腎上腺素刺激的環(huán)形AMP形成的降低，該形成被百口咳毒素阻斷;
3)該分子必須抑制在引起[Ca2+]i增加的相同濃度范圍內(nèi)PTH分泌。
4)由該分子引起的Ca2+遷移和PTH分泌濃度響應(yīng)曲線必須由諸如肉豆蔻酸醋酸佛波醇酯(PMA)之類的PKC活化劑將其向右移動。
試驗(yàn)過在結(jié)構(gòu)上不同的幾類分子聚胺、氨基糖甙抗菌素、魚精蛋白和賴氨酸或精氨酸的聚合物。這些分子的結(jié)構(gòu)繪于圖1。圖1中包括分子的凈正電荷和引起牛甲狀旁腺細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)Ca2+遷移的EC'50。
一般而論，分子的凈正電荷越大，則引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+遷移的能力也越大。但是已發(fā)現(xiàn)，正如下面所討論的，這種表現(xiàn)規(guī)律有一些很例外。
由圖可以看到，在載帶fura-2的牛的甲狀旁腺細(xì)胞中，精胺、新霉素B和魚精蛋白引起[Ca2+]i的快速、瞬時(shí)增加(圖6、7、11)。然而，它們不能引起在牛的甲狀旁腺細(xì)胞中持續(xù)穩(wěn)定的[Ca2+]i增加(圖6、11)，盡管它們在人體甲狀旁腺細(xì)胞中也引起增加(圖19)。在這方面，它們類似于由細(xì)胞外Mg2+引起的細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+的響應(yīng)，Mg2+引起在牛細(xì)胞中因細(xì)胞外Ca2+流入而未伴隨的細(xì)胞內(nèi)Ca2+的遷移(圖11b)。由精胺、新霉素B或魚精蛋白引起的瞬時(shí)[Ca2+]i增加不會被低濃度(1μM)La3+或Gd3+阻斷(圖11f、g)。在沒有細(xì)胞外Ca2+時(shí)，該分子聚陽離子引起細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+瞬變狀態(tài)持續(xù)下去，但用伊屋諾霉素預(yù)處理而減少Ca2+的細(xì)胞貯存物時(shí)則被阻斷(圖7，11h，i)。因此，所有這些分子都能引起在甲狀旁腺細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)Ca2+的遷移。
另外還表明，該分子聚陽離子遷移細(xì)胞內(nèi)Ca2+的相同庫，如由細(xì)胞外Ca2+使用的那樣。因此，提高細(xì)胞外Ca2+濃度逐漸抑制由精胺引起的[Ca2+]i瞬時(shí)增加(圖6)。反之，精胺或新霉素B的最大有效濃度(圖12)阻斷由細(xì)胞外Ca2+引起的瞬時(shí)但不是穩(wěn)定態(tài)[Ca2+]i增加。
有意義地，精胺、新霉素B和魚精蛋白抑制PTH分泌的程度與細(xì)胞外Ca2+相同。這些對分泌的抑制作用是以引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+遷移的濃度得到的(圖8、13)。這些發(fā)現(xiàn)是與對細(xì)胞外Ca2+調(diào)節(jié)PTH分泌的作用機(jī)制的認(rèn)識有關(guān)的。因?yàn)楦鞣N無機(jī)聚陽離子都抑制分泌，而只有細(xì)胞外Ca2+引起持久、穩(wěn)定態(tài)的[Ca2+]i增加，所以這樣的[Ca2+]i增加不可能與分泌調(diào)節(jié)很有關(guān)。細(xì)胞內(nèi)Ca2+的遷移，而不是細(xì)胞外Ca2+流入，才是與抑制PTH分泌相關(guān)的重要機(jī)制。這是重要的，因?yàn)槿绶肿邮怯绊慞TH分泌的話，則它確定了充分影響機(jī)制;選擇性地刺激流入細(xì)胞外Ca2+的分子，相對地在抑制PTH分泌方面則是無效的。反過來，只是引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+遷移的分子，在抑制PTH分泌方面正好與細(xì)胞外Ca2+一樣有效。
正象由細(xì)胞外Ca2+引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+的遷移一樣，分子聚陽離子引起的這種遷移受到PMA的抑制。圖14示出了一個(gè)有代表性的試驗(yàn)，該試驗(yàn)表明PMA對由精胺引起的細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+瞬變狀態(tài)的優(yōu)先抑制作用。由ATP引起的細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+瞬變是不受影響的，甚至使用次最大濃度的ATP也是如此。PMA對由其分子聚陽離子引起的細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+瞬變狀態(tài)的影響與它對細(xì)胞外Ca2+的響應(yīng)的影響是并行的;在這兩種情況下，濃度響應(yīng)曲線向右移動(圖15)。因增強(qiáng)對有機(jī)聚陽離子較高濃度所克服的分泌作用的影響而伴隨有PMA對[Ca2+]i的抑制作用(圖16)。
由分子聚陽離子引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+的遷移與肌醇磷酸酯生成增加相關(guān)。例如，魚精蛋白引起因IP1水平提高而伴隨生成IP3的快速(30秒內(nèi))增加。這兩種作用都取決于細(xì)胞外魚精蛋白的濃度(圖17)。因此，PMA的預(yù)處理鈍化了由分子聚陽離子引起的肌醇磷酸酯的生成。用精胺得到的有代表性的結(jié)果列于圖18。
精胺、新霉素B和魚精蛋白抑制異丙基腎上腺素誘發(fā)的環(huán)狀A(yù)MP的增加。類似細(xì)胞外Ca2+對環(huán)狀A(yù)MP生成的抑制作用，由分子聚陽離子引起的那些作用被百口咳毒素預(yù)處理所阻斷(表2)。
表2環(huán)狀A(yù)MP(對照的%)對照 +PT×0.5mM Ca2+100 106±82.0mM Ca2+19±4 94±20.5mM Ca2+,200μM精胺 23±5 93±60.5mM Ca2+,30μM新霉素B 28±8 87±60.5mM Ca2+,2μg/ml魚精蛋白 20±4 89±9百日咳毒素(PTX)阻斷細(xì)胞外Ca2+和分子聚陽離子對環(huán)狀A(yù)MP的抑制作用。牛的甲狀旁腺細(xì)胞在有或沒有100ng/ml百日咳毒素的情況下培養(yǎng)16小時(shí)。接著洗滌這些細(xì)胞，并在有或沒有指定濃度的細(xì)胞外Ca2+或分子聚陽離子情況下，用10uM異丙基腎上腺素培養(yǎng)15分鐘。用RIA法測定了總環(huán)狀A(yù)MP(細(xì)胞十上清液)，其結(jié)果是以0.5mM Ca2+得到的水平百分?jǐn)?shù)表示的(112±17p mole/106細(xì)胞)。
每個(gè)值是三次試驗(yàn)的平均值±SEM。
在人體甲狀旁腺細(xì)胞中，除了快速瞬時(shí)增加外，細(xì)胞外Mg2+還引起持續(xù)、穩(wěn)定態(tài)[Ca2+]i的增加(圖10)。如相應(yīng)于細(xì)胞外Ca2+在牛甲狀旁腺細(xì)胞中一樣，在人體甲狀旁腺細(xì)胞中Mg2+引起的穩(wěn)定態(tài)[Ca2+]i增加是由于Ca2+通過對電壓不靈敏通道流入造成的(圖10a)。Mg2+對人體甲狀旁腺細(xì)胞中穩(wěn)定態(tài)[Ca2+]i的這種影響在腺瘤和增生組織中都可以見到。
曾試驗(yàn)過新霉素B和魚精蛋白對由腺瘤組織制備的人體甲狀旁腺細(xì)胞中[Ca2+]i的影響。新霉素B的有代表性的試驗(yàn)結(jié)果示于圖19。新霉素B在人體甲狀旁腺細(xì)胞中不僅引起瞬時(shí)的，而且還引起穩(wěn)定態(tài)[Ca2+]i的增加(圖19a)。因此，在人體細(xì)胞中，由胞外Ca2+、Mg2+或新霉素B引起的[Ca2+]i變化圖樣是非常相似的。
由新霉素B引起的細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+瞬變在La3+(1μM)存在下并且無胞外Ca2+時(shí)都是持續(xù)的。這樣，新霉素B引起人體甲狀旁腺細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)Ca2+的遷移。新霉素B在能引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+遷移的濃度下抑制人體甲狀旁腺細(xì)胞的PTH分泌(圖13)。然而，人與牛的甲狀旁腺細(xì)胞對新霉素B的響應(yīng)有一些差別。對于細(xì)胞內(nèi)鈣的遷移來說，新霉素B的EC50在牛中為40μM，在人體甲狀旁腺細(xì)胞中為20μM(參見圖13和15)。而精氨的效能在牛和人的甲狀旁腺細(xì)胞中是相似的(EC50＝150μM)。因此，盡管牛細(xì)胞可以用作篩選活性試驗(yàn)分子的初步研究工作，但重要的是用人的甲狀旁腺細(xì)胞進(jìn)行繼續(xù)研究。
為了檢驗(yàn)分子聚陽離子對C-細(xì)胞的影響，使用了由老鼠神經(jīng)甲狀腺癌得到的贅生性細(xì)胞株(rMTC 6-23細(xì)胞)。精胺(10μM)和新霉素B(5mM)對這些細(xì)胞中基本[Ca2+]i沒有影響。這兩種分子也不影響對后來添加的細(xì)胞外Ca2+的響應(yīng)。圖21示出有關(guān)缺少新霉素B作用的代表性結(jié)果。新霉素B(1mM)或精胺(1或5mM)沒有誘發(fā)破骨細(xì)胞中任何[Ca2+]i的增加(圖23)。有點(diǎn)跡象顯示，對細(xì)胞外Ca2+濃度相繼增加的響應(yīng)似乎有些加強(qiáng)，盡管這不是一種始終如一的發(fā)現(xiàn)。在這兩種細(xì)胞中，精胺(5mM)也是對基本[Ca2+]i沒有影響，并且對細(xì)胞外Ca2+誘導(dǎo)的[Ca2+]i增加引起小小的抑制(約15%)。在第三種細(xì)胞中，新霉素B(5mM)對基本[Ca2+]i沒有影響，也不影響由細(xì)胞外Ca2+引起的[Ca2+]i增加。由這些研究工作展示出總圖畫是，精胺和新霉素B對破骨細(xì)胞中細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+的基本水平或刺激水平都沒有影響。
分子聚陽離子影響C-細(xì)胞或破骨細(xì)胞的Ca2+靈敏機(jī)制的失敗，證明有能力發(fā)現(xiàn)或設(shè)計(jì)新的引導(dǎo)分子，這種分子專門對甲狀旁腺細(xì)胞Ca2+受體起作用，或者調(diào)節(jié)甲狀旁腺細(xì)胞對[Ca2+]i正常響應(yīng)的一種或多種功能。
下面詳細(xì)地?cái)⑹龊Y選各種其他的分子，并將結(jié)果匯集于表1。
實(shí)施例2聚胺篩選如實(shí)施例1篩選出直鏈聚胺(精胺、亞精胺、TETA、TEPA和PEHA)以及兩種衍生物(NPS381和NPS382)。發(fā)現(xiàn)所有這些分子都遷移牛甲狀旁細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)Ca2+。它們的效能順序及括號中所列的凈正電荷列于如下
表3分子 EC50(以μ M為單位)NPS382 (+8) 50NPS381 (+10) 100精胺 (+4) 150PEHA (+6) 500亞精胺 (+3) 2000TEPA (+5) 2500TETA (+4) 8000腐胺(+2)和尸胺(+2)在2mM濃度都是失活的。
另一個(gè)直鏈聚胺、DADD與其他聚胺的表現(xiàn)稍有差異，在實(shí)施例7中予以敘述。
實(shí)施例3環(huán)狀聚胺的篩選按實(shí)施例1篩選了兩種環(huán)狀聚胺，hexacyclen和NPS383。Hexacyclen(+6，EC50＝20μM)比NPS 383(+8，EC50＝150μM)強(qiáng)7倍。希望是這種轉(zhuǎn)變(converse)完全基于凈正電荷作為Ca2+受體活性的結(jié)構(gòu)特征。
實(shí)施例4氨基糖甙抗生素篩選按實(shí)施例1篩選六種抗生素。
細(xì)胞內(nèi)Ca2+遷移的最終EC50，按效能順序排列是表4抗生素 EC50(以μ M為單位)新霉素 (+6) 10慶大霉素 (+5) 150
卡那霉素B(+5) 200鏈霉素(+3) 600卡那霉素(+4，5)和林可霉素(+1)在濃度為500uM時(shí)沒有作用。在氨基糖甙系列中，凈電荷與效能之間有一種相關(guān)性。然而，新霉素比其他正電荷相同或大些的聚胺(NPS381、NPS382、NPS383、PEHA)強(qiáng)得多。
實(shí)施例5肽和聚氨基酸篩選魚精蛋白和賴氨酸或精氨酸的按肽長度而改變的聚合物，按照實(shí)施例1以它們遷移細(xì)胞內(nèi)Ca2+的能力進(jìn)行篩選。所得到的細(xì)胞內(nèi)Ca2+遷移EC50，按效能順序排列如下表5肽(以KD計(jì)MW) EC50(以mM為單位)polyArg (100) 4polyArg (40) 15polyLYS (27) 30魚精蛋白 (4.8) 75polyArgTyr (22) 200polyLYS (14) 1000polyLYS (3.8) 3000這些聚合物的凈正電荷隨MW增加而增加。因此，如對氨基糖甙來說，這組聚氨基酸中凈電荷與效能間存在正相關(guān)。魚精蛋白實(shí)質(zhì)上是凈正電荷為+21的polyArg。
實(shí)施例6芳烷基胺篩選按照實(shí)施例1敘述的，從黃蜂和蜘蛛毒液衍生的這類芳烷基胺毒素中選擇的分子進(jìn)行篩選。
大頭泥蜂gtxz麥青素(Philanthotoxin)-433(+3)在濃度為500μM時(shí)無作用。在結(jié)構(gòu)上，它與下面敘述的黃金蛛毒素是相似的。
黃金蛛毒素(Argiotoxin)-636(400μM)沒有引起[Ca2+]i增加，但它確實(shí)增強(qiáng)了細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+對后續(xù)添加細(xì)胞外Ca2+的響應(yīng)。這是可活化Ca2+受體的所有分子共同特征，并且對于許多細(xì)胞外二價(jià)陽離子來說這也都是已知的。在實(shí)施例7更詳細(xì)地說明了這一點(diǎn)。
與黃金蛛毒素-636相反，黃金蛛毒素-659引起[Ca2+]i增加，且EC50為300μM。黃金蛛毒素-659與黃金蛛毒素-636不同在于前者具有羥基化的吲哚單元而不是二羥基苯基基因。這便是這兩種分子在結(jié)構(gòu)上的唯一區(qū)別。因此，效能的差別在于芳香基的性質(zhì)，而不在于帶正電荷的聚胺鏈。
實(shí)施例7Ca2+通道阻斷劑的篩選Ca2+通道阻斷劑，也就是阻斷細(xì)胞外Ca2+通過電壓敏感的Ca2+通道流入的那些分子，按照實(shí)施例1篩選上述阻斷劑。Ca2+通道阻斷劑有三種結(jié)構(gòu)類型(1)二氫吡啶，(2)苯烷基胺和(3)benzothiazipine。
所試驗(yàn)的二氫吡啶(硝苯吡啶、硝吡乙甲酯、BAY K 8644，和(-)202-791和(+)202-791)在1μM進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，沒有一個(gè)對基本[Ca2+]i或細(xì)胞外Ca2+引起的[Ca2+]i增加有任何影響。以前的研究工作表明，甲狀旁腺細(xì)胞缺少電壓敏感Ca2+通道，但確實(shí)具有受Ca2+受體調(diào)節(jié)的電壓不敏感Ca2+通道。
所試驗(yàn)的苯烷基胺是戊脈安、D-600(戊脈安的甲氧基衍生物)、TMB-8及TMB-8類似物、NPS384。前三種分子試驗(yàn)濃度為100μM。苯烷基胺的行為與其他的所研究分子不同。它們加到處于含有低濃度細(xì)胞外Ca2+的緩沖溶液的細(xì)胞時(shí)則沒有引起[Ca2+]i的變化。但是戊脈安、D-600和TMB-8增強(qiáng)了由細(xì)胞外二價(jià)陽離子引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+的遷移，它們還阻斷了細(xì)胞外Ca2+流入。當(dāng)細(xì)胞外Ca2+處于中等水平(1-1.5mM)時(shí)，這些分子能引起由細(xì)胞內(nèi)Ca2+遷移造成的小而強(qiáng)的[Ca2+]i增加。
苯烷基胺的作用不同于有機(jī)聚陽離子，如新霉素。其數(shù)據(jù)表明，戊脈安、D-600和TMB-8在Ca2+受體附近是部分激動劑，而相反地，其他所研究的分子是完全激動劑。
濃度為300μM的分子NPS384不引起[Ca2+]i增加，但它阻斷細(xì)胞外Ca2+流入。以更高濃度試驗(yàn)有可能揭示這種分子具有使細(xì)胞內(nèi)Ca2+遷移的能力。
這些分子阻斷流入的能力是有迷惑力的，而且并非是完全意想不到的，這些分子引起[Ca2+]i瞬時(shí)增加的能力(由于細(xì)胞內(nèi)Ca2+遷移的結(jié)果)是重要的。
測定甲狀旁腺細(xì)胞中的[Ca2+]i的大量試驗(yàn)表明，[Ca2+]i瞬時(shí)增加幾乎肯定地是由于細(xì)胞內(nèi)Ca2+遷移的結(jié)果，因而反應(yīng)了Ca2+受體的活化作用。
所研究的benzothiazipine、硫氮苯酮在各個(gè)方面與戊胺安和D-600都是相近的，而且在100μM也是有效的。
應(yīng)該指出的是，除苯烷胺外，上面試驗(yàn)的所有活性分子引起[Ca2+]i增加幅度與最大有效濃度的細(xì)胞外Ca2+所引起的是相近的。這表明這些分子同細(xì)胞外二價(jià)陽離子是同等有效的。這一點(diǎn)與似乎只起部分激動劑作用的苯烷基胺活性相反。
在苯烷基胺中，出現(xiàn)了一些有意義的結(jié)構(gòu)一活性關(guān)系式。像TMB-8和NPS384分子效能差別很大。100μM的TMB-8增強(qiáng)瞬時(shí)[Ca2+]i增加，而NPS384甚至300μM都沒有這種增強(qiáng)作用，而這些分子都攜帶相同的凈正電荷。由此得出，一些其他的與凈電荷無關(guān)的結(jié)構(gòu)特征賦予TMB-8更大的效能。
實(shí)施例8在人體甲狀旁腺細(xì)胞上的分子篩選試驗(yàn)過精胺和新霉素對由外科手術(shù)取出的甲狀旁腺得到并按實(shí)施例1制備的人體甲狀旁腺細(xì)胞中[Ca2+]i的影響。在人的甲狀旁腺細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)精胺試驗(yàn)濃度為300μM時(shí)只引起[Ca2+]i稍稍增加。
另一方面，新霉素的試驗(yàn)濃度為20μM時(shí)引起人的甲狀旁腺細(xì)胞中[Ca2+]i很大增加。由新霉素得到的響應(yīng)幅度與由最大有效濃度的細(xì)胞外Ca2+得到的是相等的。
實(shí)施例9在非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞上的分子篩選用人的甲狀旁腺細(xì)胞的mRNA注入的卵母細(xì)胞表達(dá)Ca2+受體，并且應(yīng)隨各種細(xì)胞外無機(jī)二價(jià)和三價(jià)陽離子而遷移細(xì)胞內(nèi)Ca2+。人們用這種篩選法試驗(yàn)直接對Ca2+受體的作用。表達(dá)Ca2+受體的卵母細(xì)胞還對如下篩選時(shí)完整甲狀旁腺細(xì)胞上的幾種活化分子有響應(yīng)。濃度為135μM時(shí)，Hexacyclen引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+的遷移。新霉素(100μM)和NPS382(5mM)也是有效的。這就提供相當(dāng)有力的證據(jù)說明這些分子在Ca2+受體上起作用，或者在與其功能密切相關(guān)的一些其他蛋白質(zhì)上起作用。
例如，我們已能夠由測量45Ca2+遷移來探測卵母細(xì)胞中Ca2+受體的表達(dá)。在這些實(shí)驗(yàn)中，用牛的甲狀旁腺mRNA或水注入卵母細(xì)胞，并在72小時(shí)后與血清或10mM新霉素接觸。在接受刺激之前，卵母細(xì)胞吸收45Ca2+。用血清刺激20分鐘導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)45Ca2+釋放增加45%(與用緩沖液典型刺激相比)。用10mM新霉素刺激20分鐘導(dǎo)致45Ca2+釋放增加76%。該試驗(yàn)在克隆Ca2+受體的應(yīng)用方面是足夠靈敏的，并且具有的優(yōu)點(diǎn)是比Cl-流活化的電生理測量有更高的通過量。
在另外的實(shí)施例中，人體破骨細(xì)胞瘤組織是由骨的活體解剖組織得到的。使用由這種組織分離出的mRNA注入的卵母細(xì)胞用30mM Ca2+刺激。對照沒有響應(yīng)，而用破骨細(xì)胞瘤mRNA注入的12個(gè)卵母細(xì)胞中有8個(gè)適當(dāng)響應(yīng)(圖34)。這些實(shí)驗(yàn)提供第一個(gè)證據(jù)，即事實(shí)上一般破骨細(xì)胞對細(xì)胞外Ca2+的Ca2+響應(yīng)被編碼。該結(jié)果還表明，破骨細(xì)胞Ca2+受體可通過非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞中的表達(dá)克隆。
實(shí)施例10在老鼠破骨細(xì)胞上的分子篩選然而，甲狀旁腺細(xì)胞和破骨細(xì)胞對細(xì)胞外Ca2+的不同靈敏度表明，它們的Ca2+受體是不同的。當(dāng)甲狀旁腺細(xì)胞相應(yīng)于細(xì)胞外Ca2+濃度為0.5-3mM時(shí)，破骨細(xì)胞只是細(xì)胞外Ca2+的水平增加超過5mM時(shí)才有響應(yīng)。對于破骨細(xì)胞來說，這種相當(dāng)高Ca2+濃度仍然是生理性的;當(dāng)它們再吸收骨時(shí)，細(xì)胞外Ca2+的局部濃度可能高達(dá)30mM。
用破骨細(xì)胞篩選分子按如下步驟實(shí)施。由新生鼠的長骨得到了破骨細(xì)胞。用螢光法指示劑indo-1測量單細(xì)胞中[Ca2+]i。精胺、亞精胺、新霉素和戊脈安已試驗(yàn)過，其中沒有一個(gè)引起了破骨細(xì)胞中[Ca2+]i的任何很大的增加(雖然探測出很小的響應(yīng))。
濃度為1mM的亞精胺引起[Ca2+]i很小的增加(是最大的細(xì)胞外Ca2+濃度所引起的約10%)。無論新霉素(10mM)還是精胺(10或20mM)都沒有引起老鼠破骨細(xì)胞中[Ca2+]i的增加。新霉素(10mM)沒有阻斷在后續(xù)加入25mM細(xì)胞外Ca2+所引起的[Ca2+]i增加。然而用精胺(20mM)予處理確實(shí)抑制了對細(xì)胞外Ca2+的響應(yīng)。戊脈安沒有引起可探測到[Ca2+]i的增加，但它確實(shí)阻斷對細(xì)胞外Ca2+的響應(yīng)。
破骨細(xì)胞與甲狀旁腺細(xì)胞之間的比較表明，后者上的活性分子在破骨細(xì)胞中是相當(dāng)無效的。這就證明，以特定Ca2+受體為目標(biāo)，但又不影響其他Ca2+-敏細(xì)胞上的那些類型受體的藥物是容易研制的。同樣地，也可研制在二種或二種以上這種Ca2+受體上具有活性的藥物。
其他Ca2+受體實(shí)施例下面的實(shí)施例證明，正如分子配位體有亞型受體一樣，似乎確實(shí)也有可能受藥物不同影響的Ca2+受體亞型。甲狀旁腺細(xì)胞Ca2+受體感受到約1.5mM細(xì)胞外Ca2+的水平，而破骨細(xì)胞上Ca2+受體在約10mM的水平響應(yīng)(圖22)。新霉素或精胺，活化其甲狀旁腺細(xì)胞Ca2+受體，它們不影響C-細(xì)胞或破骨細(xì)胞上的Ca2+受體(圖21和23)，這些數(shù)據(jù)是藥理上不同亞類Ca2+受體的第一證據(jù)，并且這些數(shù)據(jù)被用來設(shè)計(jì)和研制對特定類型Ca2+受體選擇性地起作用的藥物。的確，引導(dǎo)分子的試驗(yàn)證明這類細(xì)胞特異性作用。例如，NPS-449引起破骨細(xì)胞中[Ca2+]i的增加，NPS-449對甲狀旁腺細(xì)胞中Ca2+沒有影響。相反地，NPS 447它活化甲狀旁腺細(xì)胞Ca2+受體，只有在10倍高濃度才能有效地活化破骨細(xì)胞Ca2+受體。最后，agatoxin489盡管在活化C-細(xì)胞Ca2+受體(EC50＝150μM)方面不是很強(qiáng)，但它是甲狀旁腺細(xì)胞Ca2+受體(EC50＝3μM)很強(qiáng)的活化劑。目前正在研制的引導(dǎo)分子會選擇性地影響體內(nèi)特殊類型Ca2+-敏感細(xì)胞的活性。
在治療上必定不希望特異性差的藥物。因此，抑制破骨細(xì)胞活性和刺激降鈣素分泌是抑制骨吸收的兩種不同的方法。瞄準(zhǔn)這兩種細(xì)胞上Ca2+受體的藥物也許是很有效的骨質(zhì)疏松治療方案。因?yàn)镻TH還涉及調(diào)節(jié)骨代謝，對甲狀旁腺細(xì)胞Ca2+受體起作用的藥物在治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松方面可能也是有用的。
下面列出某些試驗(yàn)分子的結(jié)果。表6列出模擬鈣分子的對比活性。牛的甲狀旁腺細(xì)胞和C-細(xì)胞(rMT6-23細(xì)胞)載帶fura-2，載帶indo-1鼠破骨細(xì)胞，并且所指定分子遷移細(xì)胞內(nèi)Ca2+的效能由繪制的累積濃度-響應(yīng)曲線決定。試驗(yàn)濃度為1mM時(shí)，列為“非活性”的分子沒有改變[Ca2+]i。
表6EC50(μ M)化合物 甲狀旁腺細(xì)胞 破骨細(xì)胞 C-細(xì)胞NPS568(EE) 0.78 200 >300NPS568(LE) 30 - -NPS467(EE) 2 >100 -NPS467(LE) >30 - -NPS017 6 無活性 150NPS447 9 150 -NPS456*15 200 >100NPS015 22 - 無活性NPS109 40 >300 5NPS449 無活性 150 -NPS468*30 250 -精胺 150 無活性 無活性新霉素 40 無活性 無活性＊消旋混合物，“無活性”定義為濃度為1-5mM時(shí)沒有引起細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+的增加;EE是早洗脫的，LE是后洗脫的。
實(shí)施例11甲狀旁腺Ca2+受體的引導(dǎo)分子用聚胺和芳烷基胺進(jìn)行的結(jié)構(gòu)-活性研究導(dǎo)致結(jié)構(gòu)上與NPS456相似的分子的試驗(yàn)。NPS456是一種甲狀旁腺細(xì)胞Ca2+受體的強(qiáng)活化劑。這種分子是值得注意的，因?yàn)樗挥幸粋€(gè)正電荷，然而它比許多多堿基分子強(qiáng)得多。用PMA簡單(2分鐘)預(yù)處理能使NPS456的濃度-響應(yīng)曲線向右移動。這表明NPS456通過由細(xì)胞外Ca2+的相同機(jī)制起作用。NPS456引起表達(dá)甲狀旁腺細(xì)胞Ca2+受體的非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)Ca2+遷移，這證明對Ca2+受體直接起作用(圖33)。因此，NPS456含手征性碳，因而有兩種同分異構(gòu)體存在。曾合成這兩種同分異構(gòu)體，并對活性作了研究。R-同分異構(gòu)體，NPS447，比S-同分異構(gòu)體NPS448，強(qiáng)12倍(圖28)。這是Ca2+受體可以以立體特異性方式識別有機(jī)分子的第一證據(jù)。
因?yàn)镹PS447是一種對甲狀旁腺細(xì)胞Ca2+受體具有選擇性強(qiáng)影響的一種結(jié)構(gòu)簡單分子，所以圍繞這種引導(dǎo)分子所進(jìn)行的結(jié)構(gòu)-活性研究都是簡單的。這些研究的目的就是按照各種特性對有關(guān)分子排隊(duì)，由這些特性可以挑選最后的研制候選者。這種努力已經(jīng)揭示出一些對活性和效能有貢獻(xiàn)的NPS447結(jié)構(gòu)范圍。例如，新化合物NPS459是NPS447的類似物，該分子較小(MW＜240)，但效力幾乎與母體分子一樣強(qiáng)，而其他幾種類似物相對來說則無活性。將這種類似物設(shè)計(jì)中最有意義的分子可放入體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，對PTH分泌和血清Ca2+水平的影響(參見實(shí)施例15、16、17、18和23)。
新化合物NPS467是一種甚至比NPS447更小的分子，然而在引起甲狀旁腺細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)Ca2+遷移方面，前者比后者強(qiáng)約3倍。類似于NPS456，NPS467是一種消旋混合物?？梢灶A(yù)料，NPS467折解成其對映體得到一種比消旋混合物效能甚至更大的同分異構(gòu)體(參見實(shí)施例16)。在引起甲狀旁腺細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)Ca2+遷移方面，NPS551是另一種和NPS467一樣強(qiáng)的新化合物。NPS551是一種消旋混合物，可以預(yù)料，NPS551折解成其對映體，會得到一種比消旋混合物更強(qiáng)的同分異構(gòu)體。對與NPS447、NPS467、NPS551和NPS568相關(guān)分子的結(jié)構(gòu)-活性作進(jìn)一步研究，可預(yù)料會得到一些純的同分異構(gòu)體，其效能比它們的消旋物形式的這些分子要更大些。
NPS456得到的結(jié)果(圖33)表明，濃度為100μM時(shí)引起Cl-流的波動增加。NPS456是在表達(dá)甲狀旁腺細(xì)胞Ca2+受體的非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞上最強(qiáng)的活化分子。用新霉素和NPS456在這種表達(dá)系統(tǒng)中得到的結(jié)果證明這些分子直接對Ca2+受體起作用。
實(shí)施例12破骨細(xì)胞Ca2+受體的引導(dǎo)分子用于說明細(xì)胞外Ca2+對破骨細(xì)胞作用機(jī)制的策略與被證明在甲狀旁腺細(xì)胞中有效的策略是相似的。第一個(gè)試驗(yàn)研究了La3+對載帶螢光法指示劑indo-1的單個(gè)老鼠破骨細(xì)胞中[Ca2+]i的影響。如上所述，三價(jià)陽離子如La3+是不滲透的，并阻斷Ca2+流入。低的La3+微摩爾濃度部分抑制對細(xì)胞外Ca2+誘導(dǎo)的[Ca2+]i增加(圖29)。La3+阻止[Ca2+]i增加的行為提供了細(xì)胞外Ca2+遷移的證據(jù)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似于甲狀旁腺細(xì)胞中得到的結(jié)果，并且表明細(xì)胞外Ca2+通過類似的機(jī)制調(diào)節(jié)這兩類細(xì)胞中的[Ca2+]i。
另一系列試驗(yàn)表明，細(xì)胞外Mn2+引起沒有細(xì)胞外Ca2+時(shí)仍持續(xù)(圖30B)的瞬時(shí)[Ca2+]i增加(圖30(a))。這些結(jié)果同樣是細(xì)胞外Ca2+遷移的征兆。盡管Mn2+可能進(jìn)入一些分子，但不可能在破骨細(xì)胞中這樣進(jìn)行，因?yàn)镸n2+使indo-1螢光猝滅。因此。如果Mn2+從細(xì)胞內(nèi)進(jìn)入，應(yīng)觀察到螢光信號的降低而不是增加。
用許多二價(jià)和三價(jià)陽離得到的結(jié)果與破骨細(xì)胞表面上有Ca2+受體是完全一致的，這與細(xì)胞內(nèi)Ca2+遷移和細(xì)胞外Ca2+通過對電壓不敏感通道流入相關(guān)。結(jié)果展現(xiàn)了在人的破骨細(xì)胞中Ca2+為受體蛋白質(zhì)編碼的遺傳物質(zhì)的證據(jù)。由于細(xì)胞內(nèi)Ca2+遷移而瞬時(shí)增加的[Ca2+]i，足以抑制體外破骨細(xì)胞的骨吸收。因此，如同甲狀旁腺細(xì)胞一樣，Ca2+受體的活化作用似乎是抑制破骨細(xì)胞活性的可行方法。
目前，NPS449是這種受體上模擬鈣藥物的引導(dǎo)分子。它是一個(gè)小分子(MW＜425)，EC50為200μM時(shí)它遷移老鼠破骨細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)Ca2+(圖31A和31B)。盡管NPS449的效能是相當(dāng)?shù)?，但它的結(jié)構(gòu)簡單，只有一個(gè)正電荷，預(yù)料它具有所要求的藥效學(xué)和藥物動力學(xué)的特性。
曾研究NPS449抑制體外骨吸收的能力。曾用掃描電子顯微鏡形態(tài)分析牛皮層骨的薄切片的斑點(diǎn)形成來研究其能力。老鼠破骨細(xì)胞在有或沒有各種濃度NPS449的情況下在骨薄切片中培育24小時(shí)。IC50為10μM，NPS449引起與濃度相關(guān)的骨吸收抑制作用。預(yù)期的結(jié)果提供了第一證據(jù)。在這個(gè)新位點(diǎn)起作用的分子可以抑制破骨細(xì)胞的骨吸收。用化學(xué)合成方法可得到更強(qiáng)的NPS449類似物，并用本文敘述的方法進(jìn)行試驗(yàn)和分析。
實(shí)施例13。C-細(xì)胞Ca2+受體引導(dǎo)分子C-細(xì)胞Ca2+受體的活化作用刺激降鈣素分泌，而降鈣素在破骨細(xì)胞上起抑制骨吸收的作用。選擇性地影響C-細(xì)胞的模擬鈣藥物在治療骨質(zhì)疏松方面是有用的。
細(xì)胞內(nèi)Ca2+的遷移作用可用作Ca2+受體活性的功能指數(shù)。由于可得到表達(dá)C-細(xì)胞表現(xiàn)型的已培養(yǎng)的細(xì)胞系(例如，老鼠髓甲狀腺癌細(xì)胞，rMTC6-23細(xì)胞)，因而有利于在C-細(xì)胞中的篩選工作。初始研究選擇了三種芳烷基胺分子。兩種是自然存在的(agatoxin489和agatoxin505)，另外(NPS 019)是合成的agatoxin類似物。發(fā)現(xiàn)agatoxin 505的IC50為3μM時(shí)阻斷細(xì)胞外Ca2+誘導(dǎo)[Ca2+]i增加，其抑制作用是由于在這些細(xì)胞中存在的L-型電壓敏感Ca2+通道阻斷的結(jié)果。相反地，發(fā)現(xiàn)agatoxin 489的EC50為150μM時(shí)遷移rMTC細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)Ca2+。這是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)活化C-細(xì)胞Ca2+受體的有機(jī)分子。其合成的類似物(NPS 019)甚至是更強(qiáng)的，并且以EC50為5μM遷移細(xì)胞內(nèi)Ca2+。有意義的是，NPS 019與agatoxin 489的唯一結(jié)構(gòu)差別是羥基存在與否。結(jié)構(gòu)上的這種細(xì)微差別深深地影響分子的效能，這一事實(shí)表明在Ca2+受體上有結(jié)構(gòu)特異的結(jié)合位點(diǎn)。同樣，這就鼓勵了這種觀點(diǎn)，即可以研制很強(qiáng)、選擇性很好的Ca2+受體活化劑。
NPS 019是一個(gè)小分子(MW＜500)，是研制C-細(xì)胞Ca2+受體的模擬鈣的引導(dǎo)分子，可以試驗(yàn)它在體外刺激降鈣素分泌的能力。接著體內(nèi)試驗(yàn)決定這種分子刺激降鈣素分泌和抑制骨吸收的能力。這些體內(nèi)研究工作是用老鼠進(jìn)行的。這些研究工作得到的結(jié)果預(yù)料是積極的，這些結(jié)果提供了第一證據(jù)，說明在新的受體上起作用的小有機(jī)分子可能刺激降鈣素的分泌和抑制骨吸收。
實(shí)施例14 甲狀旁腺細(xì)胞上NPS 021的溶解鈣活性對于看作是模擬鈣的一種化合物來說，它應(yīng)該阻斷細(xì)胞外Ca2+或模擬鈣化合物對細(xì)胞外Ca2+敏感細(xì)胞的作用。模擬鈣化合物的一個(gè)例子是NPS021，它的結(jié)構(gòu)于圖1中。在載帶fura-2的牛的甲狀旁腺細(xì)胞中，NPS021阻斷由細(xì)胞外Ca2+引起的[Ca2+]i增加。NPS021阻斷這種響應(yīng)的IC50是約200μM并且濃度約500μM時(shí)，細(xì)胞外引起的[Ca2+]i增加消失。在低[Ca2+](0.5mM)時(shí)，NPS021明顯地本身不引起[Ca2+]i的任何改變(圖37)。
實(shí)施例15NPS467降低血清離子化鈣對于體內(nèi)低鈣血活性來說，試驗(yàn)了顯示活化體外牛甲狀腺細(xì)胞Ca2+受體的化合物。在接受試驗(yàn)物質(zhì)或?qū)φ蛰d體之前，雄性Spraque-Dawly鼠(200克)保持低鈣飲食一個(gè)星期，在腹膜內(nèi)注入NPS467后三小時(shí)從尾部靜脈采血。使用Ciba-Corning 634 Analyzer按照該儀器提供的說明書測量全部血液或血清中的離子Ca2+。利用本技術(shù)領(lǐng)域所熟知的技術(shù)測量血清總鈣、白蛋白和磷酸鹽。
NPS467引起血清或全部血液鈣的劑量依賴性降低(圖38)。這時(shí)血液Ca2+降低與血液總鈣水平成比例降低是平行的。血清白蛋白或磷酸鹽水平在所研究的任何劑量下都沒有變化。初步研究工作中，NPS467以降低血液Ca2+的有效劑量引起PTH循環(huán)水平的劑量依賴性降低(圖39)。三小時(shí)內(nèi)NPS467的低鈣血作用最大，在24小時(shí)后又回到對照水平(圖40)。
在以正常的，補(bǔ)足了鈣的飲食喂的老鼠中，NPS467(EE同分異構(gòu)體，參見實(shí)施例16)在降低血清離子Ca2+方面是有效的。NPS467單次劑量(EE同分異構(gòu)，10mg/Kg i.p.)引起血清離子Ca2+水平迅速降低，1小時(shí)時(shí)最大(22%，從對照水平降低)并且最高到6小時(shí)都仍降低到或接近這個(gè)水平。
實(shí)施例16NPS467以立體特異方式降低血清離子鈣NPS467是消旋混合物。在手征性柱上將NPS467析解成兩個(gè)對映體。如按引起甲狀旁腺細(xì)胞中[Ca2+]i增加的對映體能力檢測，在活化體外牛甲狀旁腺細(xì)胞的Ca2+受體方面，EE-同分異構(gòu)體(“早洗脫”參見實(shí)施例21)比LE-同分異構(gòu)體(“后洗脫”)強(qiáng)約100倍(圖41)。同樣地，將新的化合物NPS568同樣折解成其對映體，在牛的甲狀旁腺細(xì)胞中引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+遷移方面，EE-同分異構(gòu)體比LE-同分異構(gòu)體強(qiáng)40倍。(參見表6，supra)。
按照實(shí)施例15研究了NPS467的同分異構(gòu)體對血清Ca2+的影響。與體外的結(jié)果一致，在體內(nèi)降低血清Ca2+方面，EE-同分異構(gòu)體或NPS467證明是比LE-同分異構(gòu)體強(qiáng)(圖42，每種化合物的試驗(yàn)濃度為5mg/Kg體重)。
實(shí)施例17NPS467降低體內(nèi)繼發(fā)性副甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)模型中的血清離子鈣廣泛采用的由慢性腎損壞造成的繼發(fā)性副甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)的動物模型是腎切除5/6的老鼠。接受這種外科學(xué)術(shù)的動物開始是低鈣血，并且為保持血清Ca2+的水平，甲狀旁腺補(bǔ)嘗性增生，循環(huán)的PTH水平升高。雄性Sprague-Dawley老鼠(250克)接受5/6腎切除，并讓其恢復(fù)2星期。在此期間它們血鈣正常(由于血清PTH水平升高)。在繼發(fā)性副甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)的動物模型中，服用NPS467(EE同分異構(gòu)體，10mg/Kg i.p.)引起血清離子Ca2+水平快速(2小時(shí)內(nèi))降到對照的83%。這表明，這類化合物有效地抑制患有繼發(fā)性副甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)和甲狀旁腺增生病人的PTH分泌。
實(shí)施例18NPS467不能在甲狀旁腺切除的動物中降低血清離子鈣水平為了確定NPS467在上面作用引起低鈣血響應(yīng)的初級目標(biāo)組織，用外科切除方法除去老鼠中的甲狀旁腺。接受完全切除甲狀旁腺的動物成為低鈣血，它們主要依靠每日規(guī)定攝取的鈣保持血清Ca2+的體內(nèi)平衡。甲狀旁腺切除的動物的血清離子Ca2+水平為0.92mM，在絕食6小時(shí)后逐漸降到0.76mM。在6小時(shí)里，服用單劑量的NPS 467 EE(10mg/Kg i.p.)對血清離子Ca2+水平?jīng)]有引起任何改變。這些結(jié)果證明，NPS467的低鈣血作用需要完整的甲狀旁腺。這些數(shù)據(jù)還證明，NPS467 EE可以把體內(nèi)的甲狀旁腺作為目標(biāo)。這些結(jié)果和下述看法是一致的，即NPS467 EE在體內(nèi)的甲狀旁腺細(xì)胞Ca2+受體上起作用。以抑制PTH的分泌，因而引起血清離子Ca2+水平降低。
實(shí)施例19NPS467在人的甲狀旁腺中增加細(xì)胞內(nèi)鈣由原發(fā)性副甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)病人經(jīng)外科手術(shù)得到的甲狀旁腺而制備分離的甲狀旁腺細(xì)胞。使這些細(xì)胞載帶fura-2，并按上述方法測定[Ca2+]i。NPS467 EE和NPS568 EE這兩者都引起濃度依賴性[Ca2+]i增加。NPS467 EE和NPS568的EC'50分別是20μM和3μM。這兩種化合物都能增加人的生理組織中的[Ca2+]i，因此希望能在原發(fā)性副甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)病人中降低血清PTH和Ca2+水平。
實(shí)施例20NPS467在甲狀旁腺細(xì)胞鈣受體上的作用機(jī)制分離的牛甲狀旁腺細(xì)胞用于進(jìn)一步揭示NPS467在受體水平上的作用機(jī)制。在0.5mM細(xì)胞外Ca2+存在下，NPS467EE引起快速瞬時(shí)[Ca2+]i增加，該增加在1μM La3+存在下持續(xù)，并且用PMA預(yù)處理(100nM，2分鐘)可部分地抑制。因此，NPS467(EE同分異構(gòu)體，30μM)引起用甲狀旁腺細(xì)胞mRNA注入的非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞中Cl-的傳異的快速增加。所有這些結(jié)果都是與NPS467對Ca2+受體的作用一致的。但是，當(dāng)甲狀旁腺細(xì)胞懸浮于無Ca2+的緩沖液中時(shí)，則細(xì)胞質(zhì)Ca2+對NPS467的響應(yīng)被消除。這表明，NPS467本身不能引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+的遷移。然而，在有少量細(xì)胞外Ca2+時(shí)，它確實(shí)引起甲狀旁腺細(xì)胞和卵母細(xì)胞中的響應(yīng)。這表明，NPS467需要部分占有結(jié)合Ca2+的位點(diǎn)來引起響應(yīng)。為了對這種假設(shè)進(jìn)行試驗(yàn)，將甲狀旁腺細(xì)胞懸浮于無Ca2+緩沖液中，并與次最大濃度的新霉素接觸。使用新霉素是因?yàn)樗趲缀跛蟹矫娑伎赡M細(xì)胞外Ca2+在表達(dá)甲狀旁腺細(xì)胞Ca2+受體的甲狀旁腺細(xì)胞和非洲蟾蜍類卵母細(xì)胞上的作用。在這些條件下，加10μM新霉素本身并不引起[Ca2+]i增加。但是，現(xiàn)在再加NPS467 EE(30μM)引起[Ca2+]i瞬時(shí)增加，因?yàn)闆]有任何的細(xì)胞外Ca2+，這種[Ca2+]i瞬時(shí)增加一定是來自于細(xì)胞內(nèi)Ca2+的遷移。當(dāng)無Ca2+緩沖液中的細(xì)胞與30μM NPS467接觸時(shí)，則[Ca2+]i沒有任何增加。當(dāng)有細(xì)胞外Ca2+(0.5mM)時(shí)，則NPS467的這個(gè)濃度在增加[Ca2+]方面是最有效的。但是，現(xiàn)在再加10μM新霉素則引起瞬時(shí)的[Ca2+]i增加。估計(jì)是，新霉素結(jié)合的位點(diǎn)與細(xì)胞外Ca2+的相同，并且在功能上可以取代細(xì)胞外Ca2+。使用次最大濃度，它本身不引起任何響應(yīng)，但達(dá)到Ca2+結(jié)合位點(diǎn)的部分占據(jù)，并且使Ca2+受體被NPS467活化。
所進(jìn)行的另外研究工作進(jìn)一步確定了NPS467的作用機(jī)制。將這些細(xì)胞再懸浮于無Ca2+的緩沖液中以保證觀察不到因細(xì)胞外Ca2+遷移造成的[Ca2+]i增加。然而，在這些試驗(yàn)中，使用了新霉素的最大的有效濃度(100μM)。沒有細(xì)胞外Ca2+時(shí)，100μM新霉素引起快速瞬時(shí)[Ca2+]i增加。再加30μM NPS467 EE不引起[Ca2+]i增加。在相反的試驗(yàn)中，在100μM新霉素之前加30μM NPS467 EE。正如所預(yù)料的，NPS467 EE不引起[Ca2+]i任何增加。而且，它不影響由隨后加入的100μM新霉素引起的[Ca2+]i增加。由NPS467和新霉素的最大有效濃度得到的結(jié)果表明這兩種化合物不是在相同的位點(diǎn)上起作用。確切地說，假定在Ca2+受體上有兩個(gè)分離的位點(diǎn)就可以充分地解釋這些結(jié)果，細(xì)胞外Ca2+和新霉素與其中一個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，NPS467和結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物(如NPS568)與其中的另一個(gè)位點(diǎn)結(jié)合。與前個(gè)位點(diǎn)結(jié)合的配位體導(dǎo)致Ca2+受體的充分活化，而與后個(gè)位點(diǎn)結(jié)合的配位體，當(dāng)結(jié)合細(xì)胞外鈣的位點(diǎn)占據(jù)到目前有點(diǎn)不太確定的程度時(shí)，則才可能出現(xiàn)和/或在功能上是相關(guān)的。結(jié)合到細(xì)胞外Ca2+結(jié)合位點(diǎn)的配位體可能與NPS467的在先閉塞的結(jié)合位點(diǎn)接觸。很明顯，NPS467結(jié)合位點(diǎn)是一種變構(gòu)位點(diǎn)，它隨在結(jié)合細(xì)胞外Ca2+的位點(diǎn)結(jié)合的配位體而提高受體的活化作用。
其數(shù)據(jù)證明甲狀旁腺細(xì)胞Ca2+受體具有至少兩個(gè)不同的有機(jī)配位體的位點(diǎn)。一個(gè)位點(diǎn)結(jié)合生理學(xué)配位體、細(xì)胞外Ca2+和類似于新霉素的某些有機(jī)聚陽離子。在這個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合導(dǎo)致Ca2+受體的充分活化、[Ca2+]i增加和抑制PTH分泌。NPS467在Ca2+受體上在先確定了未認(rèn)識的結(jié)合位點(diǎn)。在這個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合，當(dāng)部分占住結(jié)合細(xì)胞外Ca2+的位點(diǎn)時(shí)，才可能出現(xiàn)和/或?qū)е翪a2+受體的完全活化作用。在兩個(gè)位點(diǎn)中任一位點(diǎn)起作用的配位體，在抑制體內(nèi)血清Ca2+水平方面都是有效的。
實(shí)施例21NPS467的制備在250ml圓底燒瓶中，混合10.0克(100mM)3'-甲氧基乙酰苯和13.5克(100mM)3-苯丙基胺，并用125mM(35.5克)異丙醇鈦(Ⅳ)處理。其反應(yīng)混合物于氮?dú)庀略谑覝財(cái)嚢?0分鐘。此后用2分鐘滴加在100ml乙醇中的6.3克(100mM)氰基硼氫化鈉。在氮?dú)庀掠谑覝財(cái)嚢璺磻?yīng)16小時(shí)。此后，將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到裝有1.5升乙醚和0.5升水的2升分離漏斗中。將相平衡然后除去醚相。余下的水相用4份每份為1升醚充分提取。洗液合并，在無水碳酸鉀上干燥，還原成清沏、光亮的淺黃色油(amberoil)。
在二氧化硅上用氯仿-甲醇-異丙基胺(100∶5∶1)對這種物料進(jìn)行TLC分析，其分析結(jié)果表明產(chǎn)品的Rf為0.65，有微量Rf為0.99(3'-甲氧基乙酰苯)和Rf為0.0(3-苯丙基胺)的兩種原料。
用氯仿-甲醇-異丙基胺梯度(99∶1∶0.1)到(90∶10∶0.1)通過二氧化硅色譜分離其反應(yīng)混合物，得到13.66克已純化的NPS467。將這種物料溶于含0.1%二乙基胺的己烷-異丙醇(99∶1)中，得到濃度為50mg/ml的溶液。將4ml這種溶液(200mg，最大達(dá)到分離)經(jīng)過Chiralcel OD(25×2cm)，使用0.7%異丙基胺、0.07%己烷中的二乙基胺、以100ml/分進(jìn)行色譜分離，于260nm測定光密度，這樣實(shí)現(xiàn)手征性折解。在這些條件下(注入100mg物料)，于～26分鐘從該柱開始出現(xiàn)早洗脫的同分異構(gòu)體(NPS 467 EE)，晚洗脫的同分異構(gòu)體(NPS 467 LE)于～34分鐘開始出現(xiàn)。這些條件下實(shí)現(xiàn)基線折解。通過將3克游離堿溶于100ml乙醇中，并用含10摩爾等當(dāng)量HCl的100ml水處理，將每種光學(xué)異構(gòu)體(游離堿)轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的鹽酸鹽。該溶液凍干得到白色的固體。
實(shí)施例22NPS568的制備用實(shí)施例21敘述的方法制備NPS568，但用等當(dāng)量的3-(2-氯苯基)丙胺代替3-苯丙基胺。研究發(fā)現(xiàn)，在用NaCNBH3/EtOH處理之前，讓3'-甲氧基乙酰苯、3-(2-氯苯基)丙基胺和異丙醇鈦混合物攪拌5小時(shí)，得到的產(chǎn)率大得多(98%)。
實(shí)施例23口服時(shí)NPS467降低血清離子化鈣試驗(yàn)前給老鼠(雄性、Spraque-Dawly，250-300克)喂標(biāo)準(zhǔn)鼠食，并禁食過夜，將NPS467(EE同分異構(gòu)體)懸浮于玉米油中，通過管飼針以單次口服給藥。三小時(shí)后，由尾部靜脈采血樣，并檢驗(yàn)離子Ca2+水平。圖44表明，口服時(shí)NPS467 EE引起劑量依賴性的血清離子Ca2+水平降低。
其他具體實(shí)施方案在下述權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，其中包括一種分子，它通過引起細(xì)胞中[Ca2+]1的增加而模擬細(xì)胞外Ca2+的活性，或者阻斷由細(xì)胞外Ca2+引起的[Ca2+]1增加，所述分子的EC50小于或等于5μM，其中所述分子不是魚精蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述細(xì)胞中[Ca2+]i增加是瞬時(shí)的，時(shí)間少于30秒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物，其中所述[Ca2+]i增加是快速的，于30秒內(nèi)發(fā)生。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述分子引起[Ca2+]i持續(xù)增加，其時(shí)間大于30秒鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述分子進(jìn)一步引起肌醇-1、4、5-三磷酸酯或甘油二酯的增加。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其中所述肌醇-1、4、5-三磷酸酯或甘油二酯的增加于60秒內(nèi)發(fā)生。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其中用蛋白激酶C活化劑預(yù)處理所述細(xì)胞不到10分鐘而降低所述的瞬時(shí)增加。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中所述的蛋白激酶C活化劑選自于由佛波醇豆蔻酸醋酸酯、瑞香和(一)-吲哚內(nèi)酰胺組成的組中。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述的分子抑制多巴胺或異丙基腎上腺素刺激的環(huán)狀A(yù)MP的形成。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其中用10mM氟化鈉預(yù)處理所述細(xì)胞10分鐘而減少[Ca2+]i瞬時(shí)增加。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述的細(xì)胞是甲狀旁腺細(xì)胞，所述分子抑制從所述細(xì)胞分泌甲狀旁腺激素。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述分子引起在用下述一種細(xì)胞的mRNA注入的非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞中Cl-傳導(dǎo)的增加甲狀旁腺細(xì)胞、骨破骨細(xì)胞、腎小球腎細(xì)胞、近管腎細(xì)胞、角化細(xì)胞、類卵泡甲狀腺細(xì)胞和胎盤滋養(yǎng)層。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述分子近移細(xì)胞內(nèi)Ca2+以引起所述[Ca2+]i的增加。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述的細(xì)胞是C-細(xì)胞或破骨細(xì)胞，所述分子抑制體內(nèi)骨吸收。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述細(xì)胞是C-細(xì)胞，所述分子刺激體外或體內(nèi)降鈣素的分泌。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述分子是在Ca2+受體上的EC50或IC50為小于或等于5μM，的模擬鈣或溶解鈣。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述分子在一種或多種細(xì)胞，但不是所有細(xì)胞上的EC50小于或等于5μM，其細(xì)胞選自于由下述細(xì)胞組成的組中甲狀旁腺細(xì)胞、骨破骨細(xì)胞、腎小球腎細(xì)胞、近管腎細(xì)胞、角化細(xì)胞、類卵泡甲狀腺細(xì)胞和胎盤滋養(yǎng)層。
18.根據(jù)權(quán)利要求1或16或17所述的藥物組合物，其中所述分子的EC50或IC50小于或等于1μM。
19.根據(jù)權(quán)利要求1或16或17所述的藥物組合物，其中所述分子的EC50或IC50小于或等于100nM。
20.根據(jù)權(quán)利要求1或16或17所述的藥物組合物，其中所述分子的EC50或IC50小于或等于10nM。
21.根據(jù)權(quán)利要求1或16所述的藥物組合物，其中所述分子的EC50或IC50小于或等于1nM。
22.根據(jù)權(quán)利要求1或16或17所述的藥物組合物，其中所述分子在生理學(xué)PH條件下帶正電荷。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的藥物組合物，其中所述分子選自于由支鏈或環(huán)狀的聚胺、帶正電荷的聚氨基酸和芳烷基胺組成的組中。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的藥物組合物，其中所述支鏈聚胺具有下述化學(xué)式其中K是0-10的整數(shù)，每個(gè)j是相同的或不相同的，并且是2-20的整數(shù)，每個(gè)Ri是相同的或不相同的，并且選自于由氫和-(CH2)j-NH2組成的組中，其中j定義如前，以及其中至少一個(gè)Ri不是氫。
25.根據(jù)權(quán)利要求1、16或17所述的藥物組合物，其中所述分子具有如下化學(xué)式
其中每個(gè)X選自于下述的基團(tuán)(獨(dú)立地)H、CH3、CH3O、CH3CH2O、Br、Cl、F、CF3、CHF2、CH2F、CF3O、CH3S、OH、CH2OH、CONH2、CN-、NO2和CH3CH2;Ar是疏水本體;每個(gè)R獨(dú)立地選自于下述的基團(tuán)氫、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、茚基、2.3-二氫化茚基、二氫吲哚基、硫基二氫吲哚基和2-、3-或4-哌啶基;Y選自于由CH、氮和未飽和的碳組成的組中;Z選自于由氧、氮、硫、
組成的組中式中每個(gè)n獨(dú)立地是1-4，每個(gè)m獨(dú)立地是0-5;其中所述的分子或者是模擬鈣或者是溶解鈣。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的藥物組合物，所述疏水本體選自于由下述基團(tuán)組成的組中苯基、2-、3-或4-吡啶基、1-或2-萘基、1-或2-喹啉基、2-或3-吲哚基、苯甲基和苯氧基。
27.一種包含具有下述化學(xué)式分子的藥物組合物
其中每個(gè)X獨(dú)立地選自于由下述的基團(tuán)組成的組中H、CH3、CH3O、CH3CH2O、Br、Cl、F、CF3、CHF2、CH2F、CF3O、CH3S、OH、CH2OH、CONH2、CN、NO2和CH3CH2;Ar是一個(gè)疏水的本體;每個(gè)R獨(dú)立地選自于由下述的基團(tuán)組成的組中氫、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、茚基、2.3-二氫化茚基、二氫吲哚基、硫基二氫吲哚基和2-、3-或4-哌啶基;Y選自于由CH、氮和不飽和的碳組成的組中;Z選自于由氧、氮、硫、
組成的組中式中每個(gè)n獨(dú)立地是1-4，每個(gè)m獨(dú)立地是0-5;其中所述的分子不是NPS447或NPS449。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中所述的分子是NPS467。
29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的藥物組合物，其中所述的分子是NPS459、NPS467、NPS551、或NPS568。
30.根據(jù)權(quán)利要求25所述的藥物組合物，其中所述的分子是R-二苯基丙基-α-苯乙基胺衍生物。
31.根據(jù)權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中所述的分子是R-二苯基丙基-α-苯乙基胺衍生物。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的藥物組合物，其中所述的分子具有下述化學(xué)式
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的藥物組合物，其中所述的分子具有下述化學(xué)式
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的藥物組合物，其中每個(gè)X獨(dú)立地選自于由Cl、F、CF3、CH3和CH3O組成的組中。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的藥物組合物，其中每個(gè)X獨(dú)立地選自于由Cl、F、CF3、CH3和CH3O組成的組中。
36.一種治療患有以在一種細(xì)胞或多種細(xì)胞中，或血液或血漿中不正常[Ca2+]或[Ca2+]i為特征的疾病的病人的方法，其中包括給所述病人服用在治療上有效量分子的步驟，該分子通過在細(xì)胞中引起[Ca2+]增加模擬細(xì)胞外Ca2+的活性，或者阻斷由細(xì)胞外Ca2+引起的[Ca2+]i增加。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述分子的EC50小于或等于5μM。
38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述分子不是魚精蛋白。
39.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述分子在Ca2+受體上以模擬鈣或溶解鈣形成相互作用。
40.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述細(xì)胞中[Ca2+]i增加是瞬時(shí)的，其時(shí)間少于30秒。
41.根據(jù)權(quán)利要求36或40所述的方法，其中所述[Ca2+]i增加是快速的，在30秒內(nèi)發(fā)生。
42.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述分子引起[Ca2+]i持續(xù)增加，其時(shí)間大于30秒。
43.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述分子進(jìn)一步引起肌醇-1、4、5-三磷酸酯或甘油二酯的增加。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述肌醇-1、4、5-三磷酸酯或甘油二酯的增加于不到60秒時(shí)間內(nèi)發(fā)生。
45.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述瞬時(shí)增加由于用蛋白激霉C的活化劑預(yù)處理所述細(xì)胞而降低。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述蛋白激霉C的活化劑選自于由佛波醇豆蔻酸醋酸酯、瑞香和(一)-吲哚內(nèi)酰胺V組成的組中。
47.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述分子抑制多巴胺或異丙基腎上腺素刺激的環(huán)形AMP的形成。
48.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述[Ca2+]i的瞬時(shí)增加由于用10mM氟化鈉預(yù)處理所述細(xì)胞達(dá)10分鐘而降低。
49.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述細(xì)胞是甲狀旁腺細(xì)胞，所述分子抑制由所述細(xì)胞分泌甲狀旁腺激素。
50.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述分子引起在由下述細(xì)胞的mRNA注入的非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞中Cl-傳導(dǎo)的增加甲狀旁腺細(xì)胞、骨破骨細(xì)胞、腎小球腎細(xì)胞、近管腎細(xì)胞、角化細(xì)胞、類卵泡甲狀腺細(xì)胞和胎盤滋養(yǎng)層。
51.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述分子遷移細(xì)胞中的Ca2+，引起所述[Ca2+]i增加。
52.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述細(xì)胞是C-細(xì)胞或破骨細(xì)胞，所述分子抑制體內(nèi)骨吸收。
53.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述細(xì)胞是C-細(xì)胞，所述分子刺激體外或體內(nèi)的降鈣素分泌。
54.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述分子是在Ca2+受體上的EC50或IC50小于或等于5μM的模擬鈣或溶解鈣。
55.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述分子在一種或多種細(xì)胞，但不是在由下述細(xì)胞組成的組中的所有細(xì)胞上的EC50小于或等于5μM，所述細(xì)胞為甲狀旁腺細(xì)胞、骨破骨細(xì)胞、腎小球腎細(xì)胞、近管腎細(xì)胞、角化細(xì)胞、類卵泡甲狀腺細(xì)胞和胎盤滋養(yǎng)層。
56.根據(jù)權(quán)利要求36、54或55所述的方法，其中所述分子的EC50或IC50小于或等于1μM。
57.根據(jù)權(quán)利要求36、54或55所述的方法，其中所述分子的EC50或IC50小于或等于100nM。
58.根據(jù)權(quán)利要求36、54或55所述的方法，其中所述分子的EC50或IC50小于或等于10nM。
59.根據(jù)權(quán)利要求38、54或55所述的方法，其中所述分子的EC50或IC50小于或等于1nM。
60.根據(jù)權(quán)利要求36、54或55所述的方法，其中所述分子在生理學(xué)PH條件下帶正電荷。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中所述分子選自于由支鏈或環(huán)形聚烷基胺、帶正電荷的聚氨基酸和芳基胺組成的組中。
62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述支鏈聚胺具有下述化學(xué)式式中，K是1-10的整數(shù)，每個(gè)j是相同的或不相同的，并且是2-20的整數(shù)，每個(gè)R是相同的或不相同的，并且R是選自于由氫和-(CH2)j-NH2組成的組中，式中j如上定義，其中至少一個(gè)Rj不是氫。
63.根據(jù)權(quán)利要求36、54或55所述的方法，其中所述分子具有下述化學(xué)式
式中每個(gè)X獨(dú)立地選自于由下述的基團(tuán)組成的組中H、CH3、CH3O、CH3CH2O、Br、Cl、F、CF3、CHF2、CH2F、CF3O、CH3S、OH、CH2OH、CONH2、CN、NO2和CH3CH2;Ar是一個(gè)疏水的本體;每個(gè)R獨(dú)立地選自于下述的基團(tuán)組成的組中氫、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、茚基、2，3-二氫化茚基、二氫吲哚基、硫基二氫吲哚基、2-、3-或4-哌啶基;Y選自于由CH、氮和不飽和的碳組成的組中;Z選自于由氧、氮、硫、
組成的組中式中每個(gè)n獨(dú)立地是1-4，每個(gè)m獨(dú)立地是0-5;其中所述的分子是模擬鈣或溶解鈣。
64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述疏水本體選自于由下述基團(tuán)組成的組中苯基、2-、3-或4-吡啶基、1-或2-萘基、1-或2-喹啉基、2-或3-吲哚基、苯甲基和苯氧基。
65.根據(jù)權(quán)利要求36、54或55所述的方法，其中所述分子具有下述化學(xué)式
式中每個(gè)X獨(dú)立地選自于由下述的基團(tuán)組成的組中H、CH3、CH3O、CH3CH2O、Br、Cl、F、CF3、CHF2、CH2F、CF3O、CH3S、OH、CH2OH、CONH2、CN、NO2和CH3CH2;Ar是一個(gè)疏水的本體;每個(gè)R獨(dú)立地選自于下述的基團(tuán)組成的組中氫、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、茚基、2.3-二氫化茚基、二氫吲哚基、硫基二氫吲哚基和2-、3-或4-哌啶基;Y選自于由CH、氮和不飽和的碳組成的組中;Z選自于由氧、氮、硫、
組成的組中式中每個(gè)n獨(dú)立地是1-4，每個(gè)m獨(dú)立地是0-5;其中所述的分子不是NPS447或NPS449。
66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其中所述分子是NPS467或NPS019。
67.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述分子是NPS467或NPS019或NPS456。
68.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述分子是R-二苯丙基-α-苯乙胺衍生物。
69.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其中所述分子是R-二苯丙基-α-苯乙胺衍生物。
70.根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法，其中所述分子具有下述化學(xué)式
71.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中所述分子具有下述化學(xué)式
72.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中每個(gè)X獨(dú)立地選自于Cl、F、CF3、CH3和CH3O組成的組中。
73.根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其中每個(gè)X獨(dú)立地選自于Cl、F、CF3、CH3和CH3O組成的組中。
74.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述病人患有以一種或多種離子或物質(zhì)的不正常水平為特征的疾病，它們的水平是由一種或多種Ca2+受體調(diào)節(jié)或影響的。
75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的方法，其中所述分子在由下述細(xì)胞組成的組中所選擇的細(xì)胞的Ca2+受體上具有活性，這些細(xì)胞是甲狀旁腺細(xì)胞、骨破骨細(xì)胞、腎小球腎細(xì)胞、近管腎細(xì)胞、角化細(xì)胞、類卵泡甲狀腺細(xì)胞和胎盤滋養(yǎng)層。
76.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述病人的疾病選自于由下述疾病組成的組中原發(fā)性和繼發(fā)性副甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、佩吉特病、高鈣血癌、骨質(zhì)疏松和高血壓。
77.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述分子僅在一種或多種Ca2+受體，而不是在所有所述Ca2+受體上具有活性。
78.根據(jù)權(quán)利要求75所述的方法，其中所述分子降低所述病人血清中甲狀旁腺激素的水平。
79.根據(jù)權(quán)利要求78所述的方法，其中所述甲狀旁腺激素的水平降低到正常個(gè)體中存在的水平。
80.根據(jù)權(quán)利要求78所述的方法，其中所述水平降低到足以引起血漿Ca2+降低的程度。
81.根據(jù)權(quán)利要求78所述的方法，其中提供所述分子的量足以使所述病人產(chǎn)生相當(dāng)?shù)闹委熜Ч?br> 82.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述分子阻斷由細(xì)胞外[Ca2+]引起的該細(xì)胞中的[Ca2+]i增加。
83.一種診斷病人疾病或病況的方法，其中包括測定所述病人體內(nèi)一種或多種Ca2+受體的數(shù)量和/或位置的步驟，并且將所述的數(shù)量和/或位置與正常病人所觀察到的進(jìn)行比較，以此作為所述疾病或病況存在的指示。
84.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中所述方法是免疫測定法，該法用Ca2+受體的抗體確定所述Ca2+受體的數(shù)量或位置。
85.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中所述免疫測定法包括提供與Ca2+受體結(jié)合的已標(biāo)記的模擬鈣或溶解鈣分子。
86.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中所述疾病是癌。
87.根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中所述癌是甲狀旁腺中異位瘤。
88.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中所述病況是以骨中破骨細(xì)胞增加數(shù)目或活性表征的。
89.一種治療骨質(zhì)疏松、副甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)或高血壓的方法，其中包括服用治療上有效量的一種分子的步驟，該分子因引起細(xì)胞中[Ca2+]i增加而模擬細(xì)胞外Ca2+的活性，或者阻斷[Ca2+]i增加(由細(xì)胞外Ca2+引起的)。
90.一種確定作為治療分子的有用分子的方法，其中包括篩選可能有用分子的步驟，這種有用分子具有模擬細(xì)胞中細(xì)胞外Ca2+的活性，或阻斷[Ca2+]i增加(由細(xì)胞外Ca2+引起的)的能力，該方法還包括測定所述分子的EC50是否小于或等于5μM的步驟。
91.一種重組Ca2+受體。
92.一種包含重組Ca2+受體的細(xì)胞。
93.一種確定有用模擬鈣分子的方法，其中包括確定一種分子的步驟，該分子在第一Ca2+受體而不是在第二Ca2+受體上模擬Ca2+的一種或一種以上的活性。
94.一種確定有用溶解鈣分子的方法，其中包括確定一種分子的步驟，該分子在第一Ca2+受體而不是在第二Ca2+受體上阻斷Ca2+的一種或一種以上的活性。
95.根據(jù)權(quán)利要求93或94所述的方法，其中所述方法包括在所述確定步驟中提供一種重組Ca2+受體。
96.已純化的編碼Ca2+受體的核酸。
97.分子NPS459、NPS467、NPS544、NPS551和NPS568。
全文摘要
治療患有一種或多種組分不正常水平為特征的疾病的病人的有用的方法與組合物，而組分的活性是由一種或一種以上的Ca
文檔編號A61K31/135GK1071333SQ92111580
公開日1993年4月28日 申請日期1992年8月22日 優(yōu)先權(quán)日1991年8月23日
發(fā)明者E·F·內(nèi)梅思, B·C·范瓦根倫, M·F·巴蘭德里因 申請人:Nps藥物有限公司