專(zhuān)利名稱(chēng)：抗弓形蟲(chóng)新藥青蒿琥酯組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗弓形蟲(chóng)病新藥青蒿琥酯組合物(簡(jiǎn)稱(chēng)組合物)，由青蒿琥酯(青蒿琥珀單酯)和β-環(huán)糊精(環(huán)狀低聚糖物質(zhì))的最佳配比組成，屬醫(yī)藥化工領(lǐng)域。
青蒿琥酯組合物的主要成分是二氫青蒿素-2-a-琥珀單酯(Dihyroatemisinine-12-a-Sunccinate)，是我國(guó)研制成功的新型抗瘧藥，現(xiàn)經(jīng)研究證明該藥具有抗弓形蟲(chóng)病的新用途。其化學(xué)性狀為1.化學(xué)結(jié)構(gòu)式
5.性狀無(wú)色針形結(jié)晶或白色結(jié)晶粉末，無(wú)臭、無(wú)味，易溶于乙醇、丙酮、氯仿或碳酸氫鈉溶液中形成水溶性鈉鹽。
組合物的另一成分是由六個(gè)或更多的葡萄糖分子構(gòu)成的環(huán)狀低聚糖物質(zhì)β-環(huán)糊精，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為
由弓形蟲(chóng)引起的弓形蟲(chóng)病是人、畜共患疾病，全世界受感染者達(dá)10億人之多。該病在我國(guó)分布甚廣，正常人群中平均感染率為4-9%。在家畜中傳播快、發(fā)病急、死亡率高，經(jīng)濟(jì)損失大，患者的多種臟器受侵犯，幾乎涉及臨床各學(xué)科?；脊蜗x(chóng)病的孕婦，其胎兒受傳染者達(dá)40%，妊娠早期可引起的流產(chǎn)、死產(chǎn)，晚期則新生兒出現(xiàn)耳聾、視力障礙，小頭畸形和智力低下。免疫功能缺陷的艾滋病人大多發(fā)生弓形蟲(chóng)病，愛(ài)玩寵物(狗、貓)的人弓形蟲(chóng)的感染率高達(dá)80%。
弓形蟲(chóng)病尚無(wú)特效藥，現(xiàn)有的乙胺嘧啶、磺胺嘧啶和螺旋霉素均有不同程度的毒副作用。
本發(fā)明的目的在于為弓形蟲(chóng)病的治療提供一種速效低毒的新制劑。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
一、確定青蒿琥酯組合物中環(huán)糊精與青蒿琥酯的最佳配比關(guān)系由于青蒿琥酯的單體成份在一般溶液中難以充分溶解，因而不能充分發(fā)揮其穩(wěn)定的殺蟲(chóng)作用，本發(fā)明利用篩選出的環(huán)狀低聚糖物質(zhì)β-環(huán)糊精)制成青蒿琥酯組合物，以提高青蒿琥酯的溶解度和殺蟲(chóng)效果的穩(wěn)定性。其配比關(guān)系是通過(guò)以青蒿琥酯60mg，加于0.6ml5%的碳酸氫鈉溶液中，待充分溶解后，再加入系列濃度的β-環(huán)糊精，所獲青蒿琥酯的最終濃度為0.5%-20%，然后將此系列濃度形成的組合物和單純青蒿琥酯溶液對(duì)比觀察24小時(shí)，取組合物中不出現(xiàn)沉淀物析出的濃度作為合格的配比濃度，按此方法證實(shí)青蒿琥酯在2-8%的β-環(huán)糊精濃度范圍內(nèi)配制的組合物，具有顯著的殺蟲(chóng)效果，由此確定20∶1-5∶1為組合物的最佳劑量配比。
二、青蒿琥酯組合物對(duì)入侵機(jī)體細(xì)胞的蟲(chóng)體和已在細(xì)胞內(nèi)增殖蟲(chóng)體抑殺效果的測(cè)定方法以感染弓形蟲(chóng)的Hela細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)胞片為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?jīng)不同濃度組合物處理組和未經(jīng)組合物處理的空白對(duì)照組以及乙胺嘧啶治療對(duì)照組，分別進(jìn)行對(duì)比觀察24、48和72小時(shí)，其間計(jì)算細(xì)胞的群體感染率(%)和單個(gè)細(xì)胞內(nèi)蟲(chóng)體的增殖率(%)。結(jié)果證明組合物處理組對(duì)入侵Hela細(xì)胞的和在細(xì)胞內(nèi)增殖弓形蟲(chóng)的抑殺率高于乙胺嘧啶和磺胺最小有效殺蟲(chóng)劑量治療組的4-6倍，由此確定該組合物的最小有效殺蟲(chóng)劑量為3-5μg/ml，對(duì)Hela細(xì)胞的有效保護(hù)率為67%，高于乙胺嘧啶5-8倍。
三、以動(dòng)物模型試驗(yàn)確定青蒿琥酯組合物對(duì)已感染弓形蟲(chóng)的機(jī)體的保護(hù)作用，以小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，用?-4×105個(gè)/0.5ml弓形蟲(chóng)溶液腹腔攻擊小鼠，2小時(shí)后開(kāi)始用組合物灌腸給藥，每天1次，連續(xù)7天，停藥后繼續(xù)觀察7天，另設(shè)乙胺嘧啶磺胺治療組為平行對(duì)照，其間每天記錄動(dòng)物的一般癥狀、死亡和存活情況，結(jié)果組合物治療組動(dòng)物的存活數(shù)和存活時(shí)間均超過(guò)乙胺嘧啶和磺胺治療組分別為1.5倍和2倍，表明組合物對(duì)感染弓形蟲(chóng)的動(dòng)物機(jī)體有較好的保護(hù)作用。
四、用電子顯微鏡觀察青蒿琥酯組合物對(duì)弓形蟲(chóng)的藥理作用在2-4萬(wàn)倍電鏡下發(fā)現(xiàn)組合物一方面作用于弓形蟲(chóng)體膜系統(tǒng)，由于膜受藥物損傷，進(jìn)入蟲(chóng)體內(nèi)的藥物濃度增高，加強(qiáng)了青蒿琥酯對(duì)弓形蟲(chóng)的抑殺能力，另一方面是組合物對(duì)蟲(chóng)體細(xì)胞核酸的抑制作用，致使與藥物接觸的蟲(chóng)體失去繁殖能力和感染力。
五、按藥理學(xué)方法測(cè)定組合物在臨床應(yīng)用中的一般藥理作用以大鼠、小鼠和貓為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，在口?0于倍抗弓形蟲(chóng)劑量ED90(60-120mg/kg)的組合物后，觀察28天，動(dòng)物無(wú)明顯的藥理學(xué)反應(yīng)。劑量提高到16倍于ED90時(shí)，動(dòng)物(豚鼠、兔、狗、猴)的神經(jīng)系統(tǒng)均未出現(xiàn)異常，劑量增至32倍于ED90時(shí)，家兔的腦電波呈現(xiàn)從興奮到抑制的變化，劑量增至64倍于ED90時(shí)，狗的呼吸速率和心率均減緩，血壓下降，但心電圖無(wú)異常，表明上述劑量的組合物對(duì)健康動(dòng)物機(jī)體的神經(jīng)、心血管和呼吸等系統(tǒng)均未出現(xiàn)嚴(yán)重的藥理活性變化。
六、按毒理學(xué)方法對(duì)組合物的安全性評(píng)價(jià)急性毒性鑒定是以小鼠為試驗(yàn)?zāi)Ｐ停浒霐?shù)致死量(LD50)為1011mg/kg(♂)和1358mg/kg(♀)對(duì)動(dòng)物灌胃給藥，同時(shí)以LD50700mg/kg(♂)和690mg/kg(♀)腹腔注射給藥;對(duì)大鼠LD50為873mg/kg(♂)和586mg/kg(♀)灌胃給藥后，連續(xù)觀察28天，結(jié)果按化學(xué)毒物分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)，該組合物的毒性級(jí)別屬于低毒級(jí)藥物，實(shí)驗(yàn)所得青蒿琥酯的安全指數(shù)為79.9mg/kg。組合物大劑量毒性試驗(yàn)是用大鼠和Beagle狗為模型，大鼠試驗(yàn)組的組合物劃分為大劑量(150mg/kg)組中劑量組100mg/kg和小劑量(50mg/kg)組Beagle狗大劑量(150mg/kg，中劑量82.5mg/kg，小劑量15mg/kg，口服給藥，均為每天一次，連服28天，其間連續(xù)檢查動(dòng)物的飲食、體重、血液和生化等指標(biāo)以及主要臟器和藥物靶器官的病理形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果證明大劑量鑒定組大鼠的基本安全劑量為25MKD，相當(dāng)于臨床劑量的8倍。Beagle狗的安全劑量為15MKD，相當(dāng)于人用劑量的5倍。大劑量組動(dòng)物的毒性表現(xiàn)特點(diǎn)是靶器管骨髓、造血功能受到輕度抑制，腸粘膜、肝、腎、肺僅有輕度損傷，停藥28天后，除骨髓恢復(fù)稍慢以外，其它臟器的損傷灶已完全消失。對(duì)各臟器的損傷只是一過(guò)性可逆反應(yīng)，屬于低毒藥物、安全范圍較寬。
七、該組合物和乙胺嘧啶磺胺的抗弓形蟲(chóng)病臨床對(duì)比觀察正在積極進(jìn)行中通過(guò)查新了解，迄至目前未見(jiàn)到和本發(fā)明技術(shù)方案相同的或相似的利用青蒿琥酯組合物治療弓形蟲(chóng)病的報(bào)道(附查新證明書(shū))。
本發(fā)明提出的技術(shù)方案實(shí)施例如下實(shí)施例1青蒿琥酯組合物中β-環(huán)糊精和青蒿琥酯劑量配比的確定取白色粒狀結(jié)晶青蒿琥酯60mg溶于0.6ml5%碳酸氫鈉溶液中，待充分溶解，加入系列濃度的β-環(huán)糊精配成青蒿琥酯最終濃度為0.5-20%溶液，然后以此系列濃度的青蒿琥酯組合物和不加β-環(huán)糊精的青蒿琥酯溶液進(jìn)行平行對(duì)比觀察24小時(shí)，以不出現(xiàn)沉淀物析出者為青蒿琥酯的最佳溶解度，由此確定2-8%的β-環(huán)糊精濃度范圍內(nèi)求出β-環(huán)糊精和青蒿琥酯的最佳劑量配比。
實(shí)施例2組合物抑殺入侵機(jī)體的或在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)增殖弓形蟲(chóng)的鑒定方法以感染弓形蟲(chóng)的Hela細(xì)胞為體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，設(shè)定三個(gè)實(shí)驗(yàn)組(一)不同濃度組合物處理組;(二)乙胺嘧啶磺胺處理組和(三)無(wú)治療陽(yáng)性對(duì)照組，三組平行對(duì)比觀察24、48和72小時(shí)，其間計(jì)算細(xì)胞群體感染率(%)和單個(gè)細(xì)胞內(nèi)蟲(chóng)體的增殖率(%)的變化，用此方法證實(shí)組合物的最小有效殺蟲(chóng)劑量。
實(shí)施例3組合物的感染弓形蟲(chóng)動(dòng)物機(jī)體保護(hù)作用的確定以受弓形蟲(chóng)感染(腹腔攻擊)2小時(shí)后的小鼠為模型，用胃飼管給藥，每天1次，連續(xù)7天停藥，繼續(xù)觀察7天，同時(shí)以不治療的陽(yáng)性對(duì)照組平行對(duì)照觀察，其間，錄兩組動(dòng)物的一般癥狀，死亡和存活情況，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(P值)。
實(shí)施例4用電子顯微鏡觀察青蒿琥酯組合物對(duì)弓形蟲(chóng)的藥理學(xué)作用，在2-4萬(wàn)倍電鏡下可以看到①與組合物接觸一定時(shí)間的弓形蟲(chóng)蟲(chóng)體膜系統(tǒng)受藥物損傷，導(dǎo)致進(jìn)入蟲(chóng)體內(nèi)組合物濃度的增高;②蟲(chóng)體細(xì)胞內(nèi)核酸受抑制，使弓形蟲(chóng)失去繁殖力和感染力。
實(shí)施例5按藥理學(xué)方法確定組合物臨床應(yīng)用中的藥理學(xué)反應(yīng)。
以三種動(dòng)物(小鼠、大鼠和貓)為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，口服組合物10倍于ED90(mg/kg)抗弓形蟲(chóng)劑量，連續(xù)觀察28天，測(cè)定并記錄動(dòng)物的臨床反應(yīng)，包括動(dòng)物的神經(jīng)、心血管和呼吸系統(tǒng)的藥理活性變化，以確定其有否藥理學(xué)影響。
實(shí)施例6按毒理學(xué)方法對(duì)組合物的毒性鑒定及其安全性評(píng)價(jià)急性毒性鑒定是以鼠類(lèi)為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?duì)小鼠的半數(shù)致死量(LD50)為1011mg/kg(♂)和1358mg/kg(♀)灌胃給藥，同時(shí)以700mg/kg(♂)和690mg/kg(♀)腹腔注射給藥;對(duì)大鼠的LD50為873mg/kg(♂)和586mg/kg(♀)灌胃給藥，連續(xù)觀察28天，結(jié)果按化學(xué)毒物分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)組合物的藥物毒性級(jí)別;該組合物大劑量毒性鑒定是以大鼠和Beagle狗為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，將組合物劃分為大、中、小三個(gè)劑量組，其中大鼠大劑量組為150mg/kg、中劑量組為100mg/kg，小劑量組為50mg/kg，Beagle狗的大劑量組為150mg/kg、中劑量組為82.5mg/kg，小劑量組為15mg/kg。各組動(dòng)物均以口服給藥，每天1次，連續(xù)給藥28天，停藥后觀察28天，其間連續(xù)檢查動(dòng)物的飲食、體重、血液、生化等指標(biāo)以及主要臟器和藥物靶器官的病理形態(tài)學(xué)變化，然后根據(jù)結(jié)果計(jì)算出大鼠的基本安全劑量(MKD);Beagle狗的安全劑量(MKD)。
實(shí)施例7組合物產(chǎn)品的劑型是根據(jù)不同情況的病人需要，制成片劑、膠囊、膠丸、栓劑。
實(shí)施例8感染弓形蟲(chóng)的Hela細(xì)胞試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹苽浞椒?，以RH株弓形蟲(chóng)懸液1ml(含蟲(chóng)體300個(gè))加入預(yù)先準(zhǔn)備的Hela細(xì)胞培養(yǎng)物即感染細(xì)胞片中，然后以37℃孵育24、48和72小時(shí)，再以Henks溶液漂洗Hela細(xì)胞，用丙酮固定，進(jìn)行不同時(shí)間的姬姆薩染色，鏡檢、記錄其感染細(xì)胞數(shù)、蟲(chóng)體總數(shù)等，按不同時(shí)間計(jì)算弓形蟲(chóng)的細(xì)胞感染率和單個(gè)感染細(xì)胞的蟲(chóng)體均數(shù)，最后確定感染蟲(chóng)體的Hela細(xì)胞標(biāo)本能否作為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br> 實(shí)施例9青蒿琥酯對(duì)受弓形蟲(chóng)感染機(jī)體的保護(hù)作用，將含有2-4×105個(gè)蟲(chóng)體/0.5ml的溶液腹腔攻擊小鼠，2小時(shí)后用組合物灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7天，停藥后繼續(xù)觀察7天，其間每天記錄動(dòng)物的一般癥狀表現(xiàn)、死亡和活存情況，并用統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
權(quán)利要求
1.一種抗弓形蟲(chóng)病新藥青蒿琥酯(青蒿琥珀單酯)和β-環(huán)糊精(環(huán)狀低聚糖物質(zhì))的最佳劑量配比組成，其特征在于①由系列配比實(shí)驗(yàn)法確定β-環(huán)糊精和青蒿琥酯組合物的最佳配比；②以Hela細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)方法確定組合物最小有效殺蟲(chóng)劑量；③以動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)方法證明組合物對(duì)機(jī)體的保護(hù)效應(yīng)；④以藥理毒理學(xué)方法確定對(duì)組合物的安全性評(píng)價(jià)，
2.如權(quán)利要求1所述一種抗弓形蟲(chóng)病新藥青蒿琥酯組合物，其特征在于確定組合物最佳劑量配比關(guān)是采用系列配比試驗(yàn)法優(yōu)選出來(lái)的，即以青蒿琥酯60mg溶于0.6ml5%的碳酸氫鈉溶液中，加入系列濃度的β-糊精，取其0.5-20%濃度范圍內(nèi)最佳溶解度的樣品進(jìn)行抑殺弓形蟲(chóng)觀察，從中選出最小有效殺蟲(chóng)濃度作為最佳劑量配比，
3.如權(quán)利要求1所述一種抗弓形蟲(chóng)病新藥青蒿琥酯組合物，其特征在于以感染弓形蟲(chóng)的Hela細(xì)胞為模型，給與不同濃度組合物處理后24、48、和72小時(shí)，測(cè)定細(xì)胞的總感染率(%)和單個(gè)細(xì)胞內(nèi)蟲(chóng)體增殖率(%)的變化情況來(lái)確定組合物最小有效殺蟲(chóng)劑量，
4.如權(quán)利要求1所述一種抗弓形蟲(chóng)病新藥青蒿琥酯組合物，其特征在于組合物對(duì)機(jī)體保護(hù)作用的確定是采用經(jīng)2-4×105個(gè)蟲(chóng)體/ml弓形蟲(chóng)0.5ml腹腔攻擊的小鼠而進(jìn)行的，以灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7天，停藥后再觀察7天，并以乙胺嘧啶磺胺治療組為平行對(duì)照，觀察記錄動(dòng)物的一般癥狀，存活和死亡情況，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，
5.如權(quán)利要求1所述一種抗弓形蟲(chóng)病新藥青蒿琥酯組合物，其特征在于用電子顯微鏡2-4萬(wàn)倍下能觀察到弓形蟲(chóng)的膜系統(tǒng)受組合物損傷情況，以及蟲(chóng)體細(xì)胞內(nèi)核酸受抑制而失去繁殖力和感染力的情況，
6.如權(quán)利要求1所述，一種抗弓形蟲(chóng)病新藥青蒿琥酯組合物，其特征在于對(duì)組合物的安全性評(píng)價(jià)是以小鼠半數(shù)致死量(LD50)1011mg/kg(♂)和1358mg/kg(♀)，對(duì)大鼠LD50875mg/kg(♂)和586mg/kg(♀)對(duì)Beagle狗的大劑量為150mg/kg，中劑量82.5mg/kg，小劑量為15mg/kg口服給藥，分別觀察28天，然后按化學(xué)毒物分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定組合物的毒性級(jí)別，并測(cè)出其安全指數(shù)的安全界量(mg/kg)，
7.如權(quán)利要求1所述一種抗弓形蟲(chóng)病新藥青蒿琥酯組合物，其特征在于組合產(chǎn)品的劑型是根據(jù)病人的不同需要制成口服片劑，
8.如權(quán)利要求1所述一種抗弓形蟲(chóng)病新藥青蒿琥酯組合物，其特征在于根據(jù)病人不同情況制成口服膠丸。
全文摘要
一種抗弓形蟲(chóng)病新藥青蒿琥酯組合物，由青蒿琥珀單酯和環(huán)狀低聚糖物質(zhì)β-環(huán)糊精的最佳劑量配比組成。該組合物的藥理學(xué)效應(yīng)一、是破壞弓形蟲(chóng)的膜系統(tǒng)增加蟲(chóng)體內(nèi)藥液濃度；二、是抑制蟲(chóng)體細(xì)胞核酸，使弓形蟲(chóng)喪失繁殖力和感染力。屬于高效低毒藥物，臨床安全范圍較寬。
文檔編號(hào)A61K31/715GK1092293SQ9310274
公開(kāi)日1994年9月21日 申請(qǐng)日期1993年3月19日 優(yōu)先權(quán)日1993年3月19日
發(fā)明者王明道, 徐在海, 孔惟惟, 王京燕, 曹軍田, 李予川, 孫國(guó)璋, 王翠娥, 楊樹(shù)森, 武蘇平, 吳增強(qiáng), 楊秀珍 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所