專利名稱：N-(膦?；阴；?-l-天冬氨酸組合物及其作為廣譜抗病毒的使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療多種人和動(dòng)物(包括鳥類)病毒感染的方法，其所使用的藥物制劑中的活性成份由N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸(PALA)或其藥物許可的類似物組成。這些組合物具有有效的廣譜抗病毒活性而且既可單獨(dú)使用也可與其它的治療劑一起使用，從而治療病毒感染。
PALAPALA是一種化合物，最初是作為天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酰酶的過渡階段類似物抑制劑而進(jìn)行研制的。見Stark等人，(1974)J.Biol.Chem.2466599。隨后，PALA(NSCNO.224131作為抗癌劑被徹底地研究過。參見例如Johnson等人(1976)CancerRes.362720-2725;Erlichman等人(1982)J.Nat.CancerInst，68227-231。
PALA、其鹽類和類似物，及其制備過程已描述于Schultz等人的美國專利4，179，464、4，215，070、4，267，162、4，348，522，和英國專利GB2008118和GB2051070以及Parsons等人的美國專利4，154，759和4，178，306中。
N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸(PALA)從一開始就抑制嘧啶的生物合成，其原因在于它阻斷了酶，L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(ATCase)一這種酶能催化L-天冬氨酯和氨甲酰磷酸的縮合，這一縮合作用是乳清酸和終產(chǎn)品尿苷的合成中所必需的。該抑制作用的最終結(jié)果是缺失核苷酸庫，即UTP、CTP以及核苷酸中間產(chǎn)品，即UDP-GlcN、CMP-NeuNAc，這些核苷酸中間產(chǎn)品對(duì)于延長低聚糖鏈?zhǔn)潜夭豢缮俚?。見Johnson，R.K.，Aeon，T.，Golden，A.和Stark，G.R.(1985)J.Med.Chem.282720-262。ClinicalBrochure，NSCNo.224131，Div.ofCarnerTreatment，NationalCancerImstitute，Bethesda，MD.1977。因此，當(dāng)PALA主要通過抑制核苷酸的生物合成而起作用時(shí)，其對(duì)中間產(chǎn)品的影響也會(huì)反映到它的終產(chǎn)品碳水化合物、蛋白質(zhì)以及核苷酸(RNA和DNA)上。
PALA以氨甲酰磷酸的競(jìng)爭(zhēng)抑制劑和天冬氨酸的非競(jìng)爭(zhēng)抑制劑形式而發(fā)揮作用。見Hooengraad，N.J.(1974)Arch.Biochem.Biophys.16176-82。其Ka值是天然酶作用物，氨甲酰磷酸的1000倍。見Moore，E.C.，F(xiàn)riedman，J.，Valdivieso，M.，Plunkett，W.Marti，J.R.等人，(1982)BiochemPharmacol.313317-3321。因?yàn)樗鄬?duì)地缺少毒性和一些堅(jiān)固鼠腫瘤系的敏感性，所以PALA已用于實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)研究中。最近的研究表明當(dāng)與鹵代嘧啶例如5-氟尿嘧啶一起在體外和體內(nèi)使用時(shí)，PALA具有獨(dú)特的調(diào)節(jié)活性。見Liang，C.，Donchower，R.C，Chabner，B.A.(1982)Mol，Pharmacol.21224-230;Ardalan，B.，Galzer，R.I.，Kensler，T.W.等人，(1981)Biochem.Pharmcol.302045-2049;Anakarahanonta，T.，Holstege，A.和Keppler，D.O.R.(1980)Eur，J.Cancer161171-1180。最近，PALA作為嘧啶生物合成抑制劑已被公開，它可用于處理自免疫疾病、慢性炎癥和器官移植排斥。參見國際申請(qǐng)PCT/US90/05942，WO91/06863，于1991年5月16日公開。
該文獻(xiàn)的一篇評(píng)論表明PALA在單獨(dú)用于治療癌癥(瘤)時(shí)在臨床上效果較差。見Valdivies，M.，Moore，E.C.，Burgess，A.M.，Marti，J.R.，Russ，J.Plunkett，W.(1980)CancerTreat.Rep.461301-1305;Ehrichman，C.，StrongJ.M.，Wiernik，P.H.，McAvoy，L.M.，Cohen，M.H.，Levine，A.S.，Hubbard，S.M.，和Chabner，B.(1979)CancerRes.393992-3995;Grem，J.L.King，S.A.，ODwyer，P.J.和Leyland-Jones，B.(1988)Cancer.Res.484411-4454。
一篇涉及膦酰基乙酸(“PAA”)及其類似物的結(jié)構(gòu)活性關(guān)系的報(bào)告已經(jīng)問世(Mao，J.C.H.等人，1985，Antimicrob.AgentsChemother.27(2)197-202)。這些工作者們發(fā)現(xiàn)PAA是一種選擇性的抗皰疹病毒試劑并且還發(fā)現(xiàn)PAA的誘導(dǎo)作用導(dǎo)致較低的活性而無一例外。尤其是，發(fā)現(xiàn)PALA的效果顯著低于親代PAA，其倍數(shù)在200以上。
抗病毒藥物的一般發(fā)展自從人們發(fā)現(xiàn)了鹵代核苷酸能作為抗病毒用于皰疹角膜炎的治療以來，在開發(fā)用于合成鏈終止劑的復(fù)雜工藝之前，有一段很長的滯后期，所述鏈終止劑例如用于HSV的無環(huán)鳥苷、2′，3′-二脫氧胸苷類似物例如用于HIV的AZT，ddⅠ，和ddc;用于拉薩熱(Lassa fever)、Hantaan和呼吸合胞病毒的三氮唑核苷(vizazole
);碳環(huán)核苷酸、cyclobut-A，它們都對(duì)HIV和皰疹病毒(CMV、HSV、水痘)具有廣譜抗病毒活性，還有無環(huán)核苷酸，膦?；?甲氧基乙基腺嘌呤(PMEA)，它們?cè)诤軐挿秶鷥?nèi)具有抗RNA和DNA病毒性。許多這類化合物已經(jīng)被證明在臨床使用時(shí)有劇毒和/或迅速導(dǎo)致抗藥菌株的發(fā)育;其中后面的這些病毒，有許多似乎表現(xiàn)出對(duì)對(duì)照化合物的交叉抗性，例如AZT與ddC，同時(shí);藥品抗性或毒性的發(fā)展導(dǎo)致使用組合療法，開始是為HIV，以達(dá)到附加和/或協(xié)同效應(yīng)。見Larder，B.A.，Purifoy，D.J.M.，Powell，K.L.和Darby，G.(1987)Nature(Lond)327716-717。DeClercq，Erik E.(1987)Cancer Res.71023-1038。
另外一種抗病毒是2-脫氧-葡萄糖(2-dGlc)，它公開于US4，315，001中。這種化合物對(duì)抗“外來”RNA病毒(例如，不是美國固有的那些病毒)幾乎沒有取得成功，據(jù)推測(cè)可能是因?yàn)镹-連接糖基化過程在感染過程中似乎沒有起到主要的作用(還有一個(gè)事實(shí)是在后者基因上只有很少一些低聚糖鏈)。然而，Blough，H.A.，Kefeuver，D.Clausen，H.和Hausen，J.-S(1991)在Proc.Amer.Soc.Trop.Med.&Hyg.45168Boston，MA(摘要)中最近報(bào)導(dǎo)了原始碳水化合物中一種新抗原的存在，它可能是O-連接在白蛉熱(SFB)和黃熱病(YE)病毒粒子上的;用特異單克隆抗體予處理這些RNA病毒，(對(duì)這些碳水化合物)可以中和這些本雅(bunya-)病毒和黃熱病病毒(flaviviruses)。
人們已經(jīng)知道了一些與HIV的RT結(jié)合的新藥和防止病毒融合，以及由此防止病毒進(jìn)入的糖基化作用抑制劑(例如，2-dGlc)。還已知了細(xì)胞激動(dòng)素(cytokines)(例如干擾素)、調(diào)節(jié)基因的抑制劑、阻斷流行性感冒病毒脫殼的金剛胺(adamantidine)和以受體水平為目標(biāo)的新化合物。然而，很清楚的是在本發(fā)明的時(shí)候，人們尚不認(rèn)為廣譜抗病毒是可能的，這主要是因?yàn)楸还J(rèn)的毒性以及缺少“目標(biāo)”。許多新途徑是遺傳學(xué)的和/或分子的;反義或無義的寡聚物，用遺傳工程的和/或合成的肽作疫苗，和/或目標(biāo)蛋白酶抑制劑-都以單病毒為目標(biāo)(即，那些具有單一的或?qū)ｉT的核苷酸和/或氨基酸序列的)。
考慮到本領(lǐng)域的目前狀態(tài)，人們希望有一種廣譜抗病毒試劑，它既能單獨(dú)使用也能與其它治療結(jié)合使用，特別是與另外的抗病毒一起使用，從而治療或防止病毒感染。很清楚，就結(jié)合治療而論，這樣的一種廣譜抗病毒試劑可以降低現(xiàn)時(shí)使用的抗病毒的毒性或有害作用，由此提供了較好的治療指數(shù)。
本發(fā)明涉及治療或防止人、動(dòng)物和鳥類病毒感染的方法，它采用有效量的PALA或藥物許可類似物，單獨(dú)使用或與其它治療試劑一起使用均可。本發(fā)明另一方面涉及用于治療或防止人或獸類病毒感染的藥物組合物和配方，其中所述組合物包含有效量的PALA或其藥物許可的類似物。本發(fā)明部分是基于這樣一個(gè)發(fā)現(xiàn)，即雖然據(jù)報(bào)導(dǎo)PALA在單獨(dú)使用時(shí)，在治癌方面相當(dāng)無效，但當(dāng)PALA用作抗病毒時(shí)其反面卻是真實(shí)的，即單獨(dú)使用時(shí)，PALA具有廣譜抗病毒活性，而當(dāng)它與其它藥物(包括但不限于抗病毒試劑和/或病毒復(fù)制抑制劑)一起起作用時(shí)，則PALA具有附加的和/或協(xié)同效應(yīng)。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種抗病毒化合物，該化合物對(duì)廣譜抗病毒是有效的。
本發(fā)明第二個(gè)目的是提供組合治療，該治療能阻止病毒對(duì)PALA抑制作用的可能回避。另外，本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供組合治療，它能降低PALA和/或與PALA一同使用的治療試劑的毒性。
本發(fā)明第三個(gè)目的是治療遭受病毒(包括反轉(zhuǎn)錄病毒)感染(或可能向病毒暴露的)的人、動(dòng)物和鳥類的方法，并且提供防止在人、動(dòng)物和鳥中發(fā)生這類感染(化學(xué)預(yù)防)的方法。
本發(fā)明的第四個(gè)目的上提供用于治療遭受病毒感染的(或可能向病毒暴露的)人、動(dòng)物和鳥類的藥物組合物。對(duì)于防止在人、動(dòng)物和鳥類中發(fā)生這類傳染，這種藥物組合物也是有效的。
本發(fā)明第五個(gè)目的是提供廣譜抗病毒化合物，它具有低水平的毒性，因而具有較高的治療指數(shù)。
本發(fā)明第六個(gè)目的是提供廣譜抗病毒試劑，當(dāng)將它單獨(dú)或與其它藥物(包括但不限于抗病毒試劑和/或病毒復(fù)制抑制劑)結(jié)合使用時(shí)，它對(duì)于抗藥性病毒菌株具有極好的使用價(jià)值。
本發(fā)明第七個(gè)目的是提供藥物許可的PALA類似物，口服給藥時(shí)它能顯示出抗病毒活性。
根據(jù)本說明書和所附權(quán)利要求書，本發(fā)明的種種目的對(duì)于所屬技術(shù)領(lǐng)域的一般技術(shù)人員來說是明顯的。


圖1是AD169HCMV滴定圖，它是由對(duì)接種DHPG(ganciclovir)后的上清液測(cè)試中獲得的。
圖2是與AD169細(xì)胞結(jié)合的HCMV滴定圖，它是由接種DHPG、PALA后或空白對(duì)照物的經(jīng)過超聲處理的細(xì)胞球獲得的。
圖3是HCMV臨床分離物滴定圖，它是由接種DHPG、PALA后或空白對(duì)照物的上清液測(cè)試中獲得的。
圖4是與HCMV細(xì)胞結(jié)合的臨床分離物滴定圖，它是由接種DHPG、PALA后或空白對(duì)照物的經(jīng)過超聲處理的細(xì)胞球獲得的。
圖5是HCMVDHPG抗性分離物滴定圖，它是由對(duì)接種DHPG、PALA后或空白對(duì)照劑的上清液測(cè)試中獲得的。
圖6是與HCMV細(xì)胞結(jié)合的DHPG抗性病毒滴定圖，它是由接種DHPG、PALA后或空白對(duì)照劑的經(jīng)過超聲處理的細(xì)胞球獲得的。
圖7是在下文例5動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的玻璃體炎嚴(yán)重程度的條形圖。
圖8是例6中單一和結(jié)合試劑治療組中的平均玻璃體炎嚴(yán)重程度的條形圖。
圖9是例7治療組中發(fā)現(xiàn)的平均玻璃體炎病嚴(yán)重程度的條形圖。
圖10是例7治療組中平均視神經(jīng)疾病嚴(yán)重程度的條形圖。
圖11是PALA、PALA+三氮唑核苷和對(duì)照治療組的病毒滴定度條形圖。
圖12是PALA、利福平和PAL+利福平治療組的疫苗損害等級(jí)分的標(biāo)繪圖。
圖13是治療組PALA、利福平和PALA+利福平的牛痘病毒滴定度對(duì)數(shù)的標(biāo)繪圖。
本發(fā)明涉及治療人類和動(dòng)物，包括鳥類廣譜抗病毒感染的方法，它包括向需要治療或防止病毒感染的人或動(dòng)物體施用有效量的PALA或其藥物活性的類似物。本發(fā)明方法還包括組合治療法，其中PALA和至少一種別的治療藥劑作為混合物或按次序給藥。本發(fā)明還涉及藥物組合物，其活性成分包括化合物PALA或適當(dāng)?shù)念愃莆?，并且任選地可與至少一種用于治療人、動(dòng)物和鳥類病毒感染的選定的藥品以混合物形式使用。
本發(fā)明部分是基于這樣一個(gè)發(fā)現(xiàn)，即PALA是一種據(jù)報(bào)導(dǎo)在單獨(dú)使用時(shí)對(duì)治療癌癥無效的藥品，但當(dāng)作廣譜抗病毒使用時(shí)卻有效。當(dāng)單獨(dú)使用或與別的藥品一塊使用時(shí)，都證明PALA作為抗病毒劑用于人和獸類中具有普及利用價(jià)值。
用PALA治療病毒感染病毒，按其定義屬于專性胞內(nèi)寄生蟲，它取代寄主細(xì)胞組織機(jī)構(gòu)并利用現(xiàn)存的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，如多核蛋白體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和特定的寄主細(xì)胞大分子，即酶、tRNA等，來產(chǎn)生病毒mRNA的模板或轉(zhuǎn)錄體。利用特有的聚合酶可轉(zhuǎn)錄病毒核酸，而利用病毒mRNA可翻譯病毒蛋白(結(jié)構(gòu)的和非結(jié)構(gòu)的)。還可以進(jìn)行轉(zhuǎn)譯后的修飾(通過蛋白酶裂解和糖基化作用)。病毒組合可以再次發(fā)生(裸病毒粒子)或采用可將重復(fù)表面突出物(粘蛋白)包埋在其中的脂質(zhì)膜。在后一情況下，被膜包圍著病毒粒子。
適宜根據(jù)本發(fā)明用PALA處理的病毒包括所有的已知病毒的型和類，其中包括DNA和RNA病毒(陽性和陰性鏈狀病毒)。PALA能用于抗DNA和RNA病毒和病毒類型，它們包括但不限于下列腺病毒(Adenoviruses)痘病毒(Poxviruses)牛痘(Vaccinia)
軟疣接觸傳染病毒(molluscumcontagiosumvirus)牛痘病毒構(gòu)建物(vacciniaviralcontructs)本雅病毒(Bunyaviruses)立夫特山谷熱病毒(Riftvalleyfevervirus)白蛉熱病毒(Sandlyfevervirus)登革熱病毒(Dengucviruses)疣特托羅(PuntaToro)黃熱病病毒(Flavivirus)黃熱病病毒(yellowfevervirus)流行性乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus)皰疹病毒(Herpesviruses)巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus(CMV))水痘(Varicella)人皰疹病毒-6(humanherpesvirus-6)Mare′x疾病病毒(獸類)馬貧血病毒(Equineanemiavirus)皰疹病毒1和2(herpesviruses1&2)愛潑斯坦氏-巴爾氏病毒(Epstein-BarrVirus)副粘液病毒(Paramyxoviruses)呼吸合胞體病毒(respiratoryeymcytialvirus)麻疹病毒(measlesvirus)副流感病毒(parainflnenzaviruses)牛瘟病毒(rinderpestvirus(獸類))新城疫病毒(Nencastlediseasevirns(獸類))
腮腺炎病毒(mumps)流感病毒(ortlomyxoviruses)流感A(H2N2& H3N2流感B(某些菌株)流感C肝炎病毒(Hepadmaviruses)乙型肝炎其它肝炎病毒(未完全分類)甲型肝炎(HAV)丙型肝炎(HCV)肝炎E(HEV)細(xì)小核糖核酸病毒(Picornaviruses)脊髓灰質(zhì)炎病毒(Polioviruses)柯薩奇病毒(Coxsackieviruses)?？刹《?ECHOviruses)口蹄疫(foot&mouthdisease(EMDV)(獸類)鼻病毒(rhinoviruses)棒狀病毒(Rhabdoviruses)狂犬病病毒(rabienvirus)外衣病毒(Togaviruses)委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒(Venezueleanequineencephalitisvirus)絲狀病毒(Filoviruses)歐鮑拉病毒(Ebolavirus)
馬堡病毒(Marburgvirus)乳多空病毒(Papovaviruses)人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus)風(fēng)疹樣病毒風(fēng)疹病毒(rubellavirus)斑狀病毒(orbiviruses)科羅拉多蜱熱病毒(Coloradotickvirus)胡寧和馬體波病毒(Junin&Machupoviruses)Hantaan病毒Hantaan出血熱病毒(Hataanhenurrhagiofevervirus)剛果/克里米亞出血熱病毒(congo/crimeanhemorrhagiofevervirus)反轉(zhuǎn)錄病毒和豆?fàn)畈《?Lentiviruese)HTLV1和2HIV1和2當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“病毒感染”說明一種病態(tài)，其中一種病毒侵入健康的細(xì)胞，利用該細(xì)胞的繁殖“機(jī)構(gòu)”去重復(fù)或復(fù)制且最終溶解該細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞死亡，釋放出病毒粒子以及使其它細(xì)胞受到所產(chǎn)生的子代病毒的感染。受某些病毒的潛伏感染也是產(chǎn)生病毒感染的一個(gè)可能后果。很清楚所屬技術(shù)領(lǐng)域的一般技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解這些術(shù)語的涵義和與它有關(guān)的疾病和/或感染。
此外，當(dāng)用于本文時(shí)，短語“治療或防止人、動(dòng)物或鳥類病毒感染”意思是抑制特定病毒的復(fù)制或防止病毒本身構(gòu)建于其寄主中以及改善或減輕由病毒感染引起的疾病癥狀。
當(dāng)用于抗這些病毒時(shí)，PALA及其藥物許可的類似物可單獨(dú)使用也可與另外的治療試劑一起使用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)當(dāng)治療皰疹病毒時(shí)，最好PALA與另外的治療試劑如抗病毒無環(huán)鳥苷或ganciclovir一塊使用。在組合治療皰疹病毒中使用PALA或藥物許可類似物，其效果將超過現(xiàn)在所能得到的治療;例如可以降低現(xiàn)時(shí)用于治療這些病毒感染的抗病毒的毒性。另外，PALA或其藥物許可類似物，對(duì)具有抗藥性的皰疹病毒菌株具有獨(dú)特的使用價(jià)值，如對(duì)于無環(huán)鳥苷或ganciclovir。此外，PALA或其藥物許可類似物在延期或阻斷抗性病毒菌株，如DHPG或無環(huán)鳥苷的發(fā)展方面也是有用的。
還發(fā)現(xiàn)PALA或其藥物許可類似物能單獨(dú)使用或與另外的藥物如抗病毒的利福平一塊使用，以用于治療或防止由牛痘病毒或用于制備疫苗的牛痘病毒構(gòu)建物引起的感染。涉及使用牛痘構(gòu)建物的職業(yè)危害性由此而降至最低。通常，使用PALA或其藥物許可類似物可使受到免疫損害的個(gè)體得以保護(hù)或治療。
還發(fā)現(xiàn)PALA或其藥物許可類似物，作為單一的體內(nèi)治療呼吸合胞體病毒的試劑較三氮唑核苷更加有效。
五種主要的病毒性肝炎已被鑒定(Consolo和Freni，Nephron61252-254，1992)，它們代表不同的病毒(DNA和RNA)分子組。這些病毒性肝炎病毒是甲型肝炎(HAV)、乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(非甲、非乙型肝炎或HCV)、肝炎D(δ因子或HDV)以及肝炎E(HEV)。廣譜抗病毒是一種理想的抗這些病毒的試劑，這是因?yàn)樗鼈冊(cè)谶z傳上和分子上存在著相異性。使用PALA或其藥物許可類似物(或單獨(dú)或與另外的治療藥劑，包括另外的抗病毒一塊使用)去治療或防止由甲型肝炎、丙型肝炎和乙型肝炎引起的病毒感染屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。尤其是，PALA能單獨(dú)使用，也能與DHPG(ganciclovir)、膦?；姿狨ァ?TC(BiochemPharma&Glaxo)、α-干擾素(α-2bIF)或甾類化合物一塊使用，上述這些藥物都是通常用于阻斷肝炎發(fā)炎反應(yīng)，治療或預(yù)防由乙型肝炎引起的病毒感染的藥物。
為了說明其廣譜抗病毒活性，我們對(duì)PALA抗大量病毒，例如有軍用意義的病毒，如黃熱(flavi-)、本雅(buya-)和外衣病毒(togaviruses)的情況進(jìn)行了檢測(cè)并且在內(nèi)含牛痘病毒的篩子中對(duì)PALA進(jìn)行了檢測(cè)。后者病毒的存在具有異乎尋常的意義，這是因?yàn)榇藭r(shí)廣泛采用了質(zhì)粒構(gòu)造物，在該構(gòu)造物中牛痘被用作為載體來產(chǎn)生活疫苗。隨后實(shí)驗(yàn)由黃熱一、外衣-和本雅病毒向涉及美國大陸公共健康重要意義的病毒方面擴(kuò)展，如粘液病毒、皰疹病毒(CMV，水痘)副粘病毒和正極性RNA病毒(細(xì)小核糖核酸病毒)以及反轉(zhuǎn)錄病毒。盡管不限于任何理論，但我們相信PALA是通過抑制副嘧啶生物合成，即ATCase的早期步驟，結(jié)果使核苷酸庫減少，或通過抑制病毒DNA聚合酶，結(jié)果產(chǎn)生如下表1-3中所示的活性而發(fā)揮其抗病毒作用。
此外，我們還對(duì)PALA對(duì)在初級(jí)鴨肝細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)的鴨乙型肝炎;非洲綠猴體內(nèi)的猴水痘病毒的感染;非洲綠猴體內(nèi)牛痘病毒;以及在兔子體外和體內(nèi)人類巨細(xì)胞病毒(HCMV)的抵抗情況進(jìn)行了測(cè)試。由這些研究所得到的結(jié)果將描述在下文的各實(shí)例中。
PALA可與另外的治療試劑一塊使用，以便能提高所達(dá)到的抗病毒效果。例如，這些附加的抗病毒試劑包括但不限于在與病毒復(fù)制有關(guān)的不同靶分子上起作用的那些試劑;在同種分子不同位置上起作用的那些試劑;能抑制補(bǔ)救途徑(下文說明)從而防止或降低病毒抗性出現(xiàn)的試劑。
當(dāng)PALA或PALA藥物許可類似物用于組合治療中時(shí)，最好將PALA與其它治療試劑分開但持續(xù)地給藥，另外，還可間歇地施用PALA。
雖然病毒有自己的DNA或RNA聚合酶，但比較復(fù)雜的病毒，即皰疹病毒和痘病毒，(僅少量舉例)還具有負(fù)責(zé)核苷酸生物合成的單個(gè)酶，例如轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶或核苷酸磷酸化酶，這些酶也可以作為寄主細(xì)胞酶存在。這些酶可賦予嘧啶合成另一種路線或“補(bǔ)救途徑”，從而回避了抗病毒試劑的抑制作用。因此，正如某些瘤的情況那樣，可能會(huì)出現(xiàn)對(duì)抗病毒化合物的病毒抗性，但這種可能性可以通過組合治療而避開，例如將核苷酸類似物與PALA及其它抗病毒試劑結(jié)合使用，所述的核苷酸包括但不限于腺嘌呤阿糖苷、腺嘌呤阿糖苷單磷酸、碘苷、三氟胸苷、無環(huán)鳥苷(acycloquanosine)、溴乙烯基脫氧尿苷、溴乙烯基脫氧阿拉伯尿苷(bromovinyldeoxyarauridine)(Bristol-Myers Squibb的BvaraV)、氟碘阿拉伯胞嘧啶(fluoroiodoaracytosine)、DHPA和三氮唑核苷(vizazole
)、糖基化抑制劑(如2-dGlc)、蛋白酶抑制劑、干擾素、核苷酸運(yùn)載抑制劑如雙嘧啶氨醇和硝基芐硫代肌苷，DNA從屬RNA聚合酶抑制劑，例如利福平(rifadin
)、鏈終止劑，例如ganciclovir(DHPG)、無環(huán)鳥苷(ACV)、AZT、ddc。
除了概述于下文表1-3的實(shí)驗(yàn)以外，我們還進(jìn)行了PALA與其它抗病毒化合物結(jié)合的實(shí)驗(yàn);例如，將PALA與抗白蛉溪谷熱病毒(Sandfly valley fever)的三氮唑核苷(virazole
)結(jié)合并且和2-脫氧-D-葡萄糖(2-dGlc)(一種已知的抗HSV)的抗病毒(人們已經(jīng)用它在人身上進(jìn)行了擴(kuò)大臨床試驗(yàn)，見Blough，H.A.和Giuntoli，R.G.(1979)J.Amer.Med.Assoc.2412798-2801)結(jié)合在一起。PALA還可任選地與利福平(rifadin
)結(jié)合用于牛痘;任意地與AZT、ddI、ddc及其混合物結(jié)合用于HIV-1和2;任意地與金剛胺(adamantidine-)結(jié)合用于流行性感冒;任意地與三氮唑核苷(virazole
)結(jié)合用于拉薩熱、Hantaan和CCHF病毒;和任意地與無環(huán)鳥苷ACV結(jié)合用于水痘-帶狀皰疹以及任意地與干擾素-α或氟尿嘧啶結(jié)合用于人乳頭狀瘤病毒。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)PALA與其它的病毒抑制劑結(jié)合較任何一種單獨(dú)的化合物能達(dá)到更好的抑制效果。例如2-dGlc本身無抗黃熱病毒的效果，但用PALA與2-dGlc一起就能觀察到增強(qiáng)的抗SFS的效果。另外，與未處理的對(duì)比物和感染過HIV同時(shí)僅接受單一抗病毒(僅AZT或反PALA)處理的細(xì)胞相比，采用PALA和AZT的組合治療能使HIV-1的病毒復(fù)制大約再降低20%，(用放射免疫沉淀法或Western印痕法(用密度測(cè)定儀定量)根據(jù)P24的下降而測(cè)出)。此外，將PALA與另外的抗病毒試劑結(jié)合起來使用會(huì)使所用的一種或兩種活性試劑的劑量降低，以便使治療指數(shù)提高，而有毒的副作用降低。
因?yàn)镻ALA沒有顯現(xiàn)出改變體液的免疫應(yīng)答-至少是在長瘤的動(dòng)物中(Johnson，R.K，Swyryd，E.A.和Stark，G.R.(1978)CancerRes.38371-378)，根據(jù)本發(fā)明使用PALA可以使某些病毒獲得共同免疫(采用合適的疫苗，例如滅活的病毒或合成肽作免疫原)。如上面所指出的，所遇到的潛在問題是抗性菌株可能會(huì)通過突變或選擇或因某些病毒(或細(xì)胞)具有使用DNA合成的“補(bǔ)救”途徑的能力而發(fā)生進(jìn)化;(這些補(bǔ)救途徑在感染HSV的細(xì)胞中似乎是有效的)，由此將失去效果。
另外，PALA能穿過腦血栓，因此在視網(wǎng)膜和腦內(nèi)可達(dá)到較高的濃度;從而，PALA在治療由HIV誘導(dǎo)的腦病方面、和由CMV誘導(dǎo)以及由水痘誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜炎方面是有用的。
PALA的預(yù)防和其它用途對(duì)于進(jìn)入正流行某些“外來RNA病毒”，但至今還不能得到免疫(對(duì)那種病毒)或未取得效果的地理區(qū)域的個(gè)體來說，PALA還可作為預(yù)防藥品。另外，多價(jià)的、遺傳工程疫苗可使用牛痘構(gòu)建物;這樣一來，在病人和或在實(shí)驗(yàn)工作人員身上采用綜合牛痘的可能性將是現(xiàn)實(shí)的。由于可以采用像單一的PALA，或其與利福平(rifadin )結(jié)合起來的一種藥品，這就給治療的醫(yī)生一個(gè)特別的回旋機(jī)會(huì)。許多帶有這種遺傳工程病毒的上述個(gè)體(偶然暴露)，可以作為門診病人而用PALA接受治療，預(yù)防性的、治療性的皆可。
PALA還可用于妊娠期以防止病毒向胎兒轉(zhuǎn)移，只要無畸胎作用就可以。PALA可用于移植外科手術(shù)中，例如做化學(xué)治療的腎臟和骨髓移植接受者以及因?yàn)槠鞴倩蚬撬枰浦搀w經(jīng)常受CMV治療的癌癥病人。為了防止在供體組織內(nèi)存在的病毒發(fā)生復(fù)制，受體和供體都要用單一的PALA或組合療法加以治療，例如在捐獻(xiàn)或接受組織或器官移植之前按照醫(yī)生的診斷進(jìn)行治療。
PALA對(duì)于除了傳染人的副粘液病毒(包括麻疹)之外的呼吸合胞體(respiratorysyncytial)病毒(RSV)是有用的，因此PALA可通過靜脈向嬰兒施藥，無須使用三氮唑核苷(virazole )必須的昂貴的正壓力器械。另外，在黃熱(flavi)-、外衣(toga)和本雅病毒上(表1)使用PALA的結(jié)果為抗“外來”病毒提供了一種新的治療和化學(xué)治療方法，所述“外來”病毒在世界偏僻地域能夠遇到;PALA對(duì)歐鮑拉(Ebola)、馬堡(Marburg)和拉薩(Lassa)熱病毒是有功效的。此外，獸醫(yī)學(xué)上重要的病毒，例如口蹄疫(foot and mouth disease)(FMDV)、牛瘟(rinderpest)、新城疫病(New castle disease)、假性狂太病、馬貧血癥和牛鼻氣管炎病毒，都可用PALA進(jìn)行診治;因此PALA能預(yù)防或控制動(dòng)物的流行病，防止或改善由于病毒性疫病而引起的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，所述動(dòng)物包括但不限于家畜，鳥或馬，尤其是賽馬。
劑量在治療已感染病毒的動(dòng)物，特別是人時(shí)，應(yīng)施用治療上有效量的PALA，即以足夠抑制病毒復(fù)制的劑量給藥。例如，PALA作為一種浸劑用藥量每天大約1-100mg/公斤，持續(xù)約1周到1個(gè)月。優(yōu)選的劑量為約25-50mg/kg;按表面積計(jì)PALA或其藥物許可類似物的日當(dāng)量劑量，為約100-約600mg/m2。最佳劑量約5mg/kg-60mg/kg，持續(xù)約1周到1個(gè)月。PALA或其藥物許可類似物的劑量間隔為約1周到1個(gè)月，最好約7到約10天。優(yōu)選的用藥劑量應(yīng)使PALA或其藥物許可類似物達(dá)到約50-約100μM的峰值血漿濃度。這一點(diǎn)可通過例如靜脈注射無菌的含有約0.05%～10%用藥組分的溶液(在緩沖鹽水中)(對(duì)藥物化學(xué)領(lǐng)域的一般技術(shù)人員是已知的任何適當(dāng)鹽水溶液都可使用)。根據(jù)用HPLC測(cè)得的血漿水平通過連續(xù)注入PALA而維持所需的血液濃度。通過降低各種藥品的劑量約25%-50%，可以實(shí)現(xiàn)用PALA或其藥物許可類似物進(jìn)行組合療法。應(yīng)該注意護(hù)理醫(yī)生應(yīng)知道如何進(jìn)行和什么時(shí)候終止、中斷或?qū)⒅委熣{(diào)節(jié)到較低劑量，這是考慮到毒性、或骨髓、肝或腎功能障礙。相反，護(hù)理醫(yī)生還應(yīng)知道如果臨床反應(yīng)未滿足要求(不包括毒性在內(nèi))時(shí)，則應(yīng)將治療調(diào)節(jié)至較高的水平。與上述討論過的對(duì)應(yīng)方案可用于獸類。
在急性和慢性治療病毒感染中所用的PALA的預(yù)防或治療的劑量范圍隨所處理的病情的嚴(yán)重程度和用藥途徑而變化。再次聲明，應(yīng)該注意的是門診醫(yī)師或醫(yī)生應(yīng)知道由于毒性或骨髓、肝或腎功能障礙而在什么時(shí)候中斷和/或調(diào)節(jié)治療劑量。劑量以及用藥頻率，將依年齡、體重和各個(gè)病人的反應(yīng)而變化。通常，如上所討論的，對(duì)于本文所述大多數(shù)的病毒來說PALA或其藥物許可類似物的日總劑量范圍，約為1-100mg/kg病人。優(yōu)選的日劑量范圍在約5-約75mg/kg之間，然而最佳的日劑量范圍應(yīng)在約5-60mg/kg之間。另一個(gè)優(yōu)選的范圍是每天約25-50mg/kg。在治療病人時(shí)，治療應(yīng)從較低的劑量開始，例如約5mg/kg-約10mg/kg，然后提高到約25mg/kg或更高，這取決于各個(gè)病人的反應(yīng)。進(jìn)一步推薦的是對(duì)于嬰兒、兒童和超過65歲的病人，以及腎臟或肝功能有障礙的那些人，開始時(shí)接受低劑量，并且根據(jù)個(gè)體臨床反應(yīng)和血濃度進(jìn)行滴定。正如本技術(shù)領(lǐng)域的一般技術(shù)人員都清楚的那樣在某些情況下，必須使用超出這些范圍的劑量。各種術(shù)語“足夠減輕或防止病毒感染的量”、“足夠治療或防止病毒感染的量”或“有效抗病毒量”意思都是指上述用藥劑量和劑量頻率計(jì)劃。
如下面進(jìn)一步討論的，為了向病人提供有效劑量的PALA，任何合適的用藥途徑都可使用。例如，口服、腸胃外的(皮下的、靜脈的和肌肉的);直腸的、經(jīng)皮的、陰道等。劑型包括片劑、錠劑、分散劑、懸浮劑、栓劑、溶液、膠囊、乳劑、膏、微型泵(Alza公司)等。
藥物組合物本發(fā)明的藥物組合物含有作為活性成分的PALA或其藥物許可類似物，所述化合物在治療或防止人、動(dòng)物和鳥類的病毒感染方面是有效的。這些藥物組合物還可含有治療劑，包括除了PALA或其藥物許可類似物之外的其它一些抗病毒試劑;這些新的組合物為治療病毒感染提供了組合療法。這種組合療法具有附加的和/或協(xié)同效果。
例如，含PALA的藥物組合物任意地可含有至少一種其它的治療試劑，如核苷酸類似物，包括核苷酸運(yùn)送抑制劑;和鏈終止劑(例如二脫氧核苷酸)。適用于與PALA或其藥物活性類似物的組合療法中的一些化合物可以在Fields Virology，2nd Edition，Raven 1990;White，D.O.and Fenner，F(xiàn).，Chepter T7“Chemotherapy of viral Diseades”in Medical Virology，3rd Edition，Academic Press，Inc.，Crlando，F(xiàn)la，1986中找到，這些文獻(xiàn)公開的內(nèi)容作為參考文獻(xiàn)編入本文。適用于本發(fā)明內(nèi)的PALA組合療法的化合物包括但不限于2-脫氧-D-葡萄糖(2-dGlc)，脫氧野尻霉素、無環(huán)鳥苷(acycloguanosine)、三氮唑核苷(Virazole
)、利福平(rifadin
)、金剛胺(adamantidine)、利福丁炔(rifabutine)、ganciclovir、(DHPG)3′-疊氮基-3′-脫氧胸苷(AZT或Zidovudine
)、2′，3′-二脫氧肌苷(ddI)、2′，3′-二脫氧胞苷(ddc)、氟碘阿拉伯胞嘧啶(fluoroiodoaracytosine)、碘苷、三氟胸苷、阿糖腺苷(ara-A)、ara-AMP、溴乙烯基脫氧尿苷、溴乙烯基阿拉伯尿嘧啶(bromovinylarauracil)(BVaraV，來自Bristol-Meyers Squibb(1-β-D-阿糖-furanylo-E-5-[2-溴乙烯基]尿嘧啶))金剛(烷)乙胺、苯己庚二酮、二芳基脒、(S)-9-(2，3-二羥丙基)腺嘌呤(DHPA)、干擾素-α、雙嘧啶氨醇、硝基芐基硫代肌苷、S-(P-硝基芐基-)6-硫代肌苷和膦酰基甲酸。屬于本發(fā)明的新型藥物組合物包括但不限于PALA，或其藥物許可類似物，和三氮唑核苷(virazole
);PALA和利福平(rifadin
);PALA和AZT;PALA和ddI;PALA和ddc;PALA和金剛胺;PALA和無環(huán)鳥苷(acycloguanosine);PALA和2-脫氧-D-葡萄糖;PALA和脫氧野尻霉素;PALA和干擾素-α以及PALA和ganciclovir。本發(fā)明還包含藥物組合物，該組合物含PALA，或藥物許可的類似物，和任選一種以上的另外的治療化合物，以提供組合療法。
PALA的制備PALA及其大量的類似物的制備可按照下述方法進(jìn)行，這些方法描述于US4，179，464、4，215，070、4，267，126、4，348，522、4，154，759、4，178，306和GB2008118和GB2051070，這些專利所公開的內(nèi)容作為一個(gè)整體編入本文作參考。此外，PALA也可按照下列另外一些方法來制備，這些方法為Gloede，J.等人(1988)Pharmazie43(6)434;Henklein，P.等人(1989)DD272092A1Sept.27，1989;Kafarski，P.等人(1982)Synthesis3219-221;Montero，J.L.等人(1982)Eur.J.Med.Chem-chim.Ther.17(1)97-99;Stiebitz，B.等人(1991)，DD286589A5Jan.31，1991;Goodson，J.J.等人(1980)J.Chem.Soc.，PerkinTrans.1(12)2721-2727，這些文獻(xiàn)公開的內(nèi)容作為整體編入本文作參考。
PALA類似物在本發(fā)明另一些特殊實(shí)施例中，大量的N-(膦酰基乙?；?-L-天冬氨酸(PALA)類似物被用作為廣譜抗病毒試劑。正如所屬技術(shù)領(lǐng)域的一般技術(shù)人員都清楚的那樣，PALA含4個(gè)高酸性的氫(即兩個(gè)羧酸質(zhì)子和兩個(gè)膦酸質(zhì)子)和一個(gè)堿性氮取代基。因此，在游離酸、酯、無機(jī)或有機(jī)鹽官能物之間可能存在許多種組合。這些可能性通過PALA通式的結(jié)構(gòu)表達(dá)式可以更好地被理解，該通式中包含游離酸、鹽、酯或結(jié)合這些官能團(tuán)的化合物，術(shù)語“PALA的類似物”用于本文的意思包括任意的鹽、酯或其它衍生物，這些物質(zhì)是通過可得到的官能物由PALA制成的。術(shù)語“PALA”用于本文時(shí)其含義包括質(zhì)子化的酸或N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸的藥物許可鹽。優(yōu)選的一種鹽是二鈉鹽;另一種是下文的四鈉鹽。PALA的類似物在本發(fā)明的藥物組合物中具有特殊的使用價(jià)值，尤其是為口服用藥配制的那些。
N-(膦酰基乙?；?-L-天冬氨酸(PALA)核上述通式PALA核中的R基團(tuán)獨(dú)立地代表氫、烴、硅烷、有機(jī)鹽或無機(jī)鹽基團(tuán)，以及這些基團(tuán)的所有可能的組合。當(dāng)R是烴基時(shí)，所得到的類似物可稱為羧酸酯或膦酸酯。烴基可具有1-20個(gè)碳原子，最好1-8個(gè)，在性質(zhì)上可以是環(huán)狀的，無環(huán)的，芳族的或脂族的，它還可任意地含有一些官能團(tuán)，如羥基、醚基、氨基、硫醚基、锍基、氟及其類似物。合適的烴取代基的特殊例子包括但不限于甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、環(huán)己基、苯基、芐基、對(duì)-硝基芐基及類似物。
當(dāng)然，也可獲得相應(yīng)的硅烷酯，其中的R是硅烷基，如三烷基甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基、三-叔-丁基甲硅烷基或甲基-二-叔-丁基甲硅烷基以及類似物)。
本發(fā)明還期待制備和使用作為抗病毒試劑的PALA類似物。在本發(fā)明一些特殊實(shí)施例中，通過本領(lǐng)域內(nèi)一般技術(shù)人員所熟知的方法來制備PALA的銨，一、二、三和四元取代的銨鹽，這些方法包括但不限于PALA和胺之間的簡(jiǎn)單的酸堿反應(yīng)或通過離子交換柱。正如一般技術(shù)人員所顯而易見的，各種胺都可以用來生成胺鹽，它包括伯、仲或叔胺。確實(shí)，甚至季銨基也能生成PALA鹽，只要PALA以鹽的形式存在即可。當(dāng)然，PALA的胺鹽可以根據(jù)特定堿或取代物的量、強(qiáng)度或而僅與在分子其它酸性部分處存在的磷酸鹽基團(tuán)，一個(gè)或兩個(gè)羧酸基團(tuán)，或按上述結(jié)構(gòu)式所描繪的PALA核的全部酸性部分相結(jié)合。
盡管并未打算只限于公開于本文那些物質(zhì)，但是為了讀者的利益現(xiàn)舉出下列胺。其它合適的無機(jī)鹽在本說明書的其它部分已經(jīng)提到，而且應(yīng)該理解到這些無機(jī)鹽能和烴或硅烷酯基團(tuán)、以及用有機(jī)胺舉例說明的有機(jī)鹽一塊存在。因此，無機(jī)銨離子源的使用是有利的，例如除了氨本身以外的氫氧化銨、碘化銨、溴化銨、氯化銨以及類似物。
有機(jī)胺也是合適的，正如早已指出的那樣。例如，低級(jí)烷基(如C1-C4烴)胺基具有極大的使用價(jià)值。烷基醇胺(其中存在著氨基和羥基)是特別希望的。因此，甲醇胺、乙醇胺、丙醇胺、異丙醇胺、丁醇胺等都可制成具有吸引力的PALA胺鹽或類似物。同樣地，二烷基醇，三烷基醇或四烷基醇銨的基團(tuán)也是希望的。含有多氨基的化合物也在預(yù)見之中，如乙二胺、二乙三胺或其N-烷基或其N-鏈烷醇-取代衍生物。另外，N-烴取代基的定義類似上述酯烴基的定義，即它們可以是環(huán)狀、無環(huán)、脂族或芳族并且可任意地含有除羥基以外的官能團(tuán)，如醚基、氨基、硫代醚基、巰基、氟及類似物。
下列文獻(xiàn)中詳細(xì)地描述了制備PALA及其類似物的方法，這些文獻(xiàn)公開的全部內(nèi)容作為參考而編入本文Stiebitz等人，DD286589A5(1991);Henklein等人，DD272092A1(1989);Gloede等人，Pharmazie43(6)434(1988);Mao等人，Antimicrob，AgentsChemother，27(2)197-202(1985);Kafarski等人，Synthesis3219-221(1982);Goodson等人，J.Chem.Soc.，PerkinTrans.1(12)2721-7(1980);Montero等人，Eur.J.Med.Chem-Chim.Ther.17(1)97-9(1982);Cole等人，Biochem.J.255(3)813-16(1988);Starks等人，DE2849396(1979);Bakunniak等人，J.Environ.Sci.Health.PartBB18(4-5)485-96(1983);Collins等人，J.Biol.Chem.246(21)6599-605(1971)。
藥物制劑本發(fā)明的藥物組合物包含作為活性成分的PALA，或其藥物許可類似物，并且還可含有一種藥物許可的載體以及任選的其它的治療成分。
如上所指出的，術(shù)語“藥物許可的類似物”包括鹽類、酯類和其它的PALA的衍生物。所述鹽類是由藥物許可的非毒性酸與堿制備的(包括無機(jī)酸或堿和有機(jī)酸或堿)。這種鹽可包括堿金屬鹽，例如鈉或鉀，以及堿土金屬鹽或銨鹽。多種PALA的鹽都能在上面提過的Schultz等人和Parson等人的專利中找到。
此外，由于本發(fā)明的化合物是兩性的，所以鹽可以由藥物許可的非毒性堿或酸(包括無機(jī)和有機(jī)堿或酸)和金屬制成。適合本發(fā)明化合物的藥物許可的堿加成鹽包括但不限于由鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉和鋅制成的金屬鹽，或由N，N′-二芐基乙二胺、氯代普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、甲基葡胺(n-甲基葡糖胺)和普魯卡因制成的有機(jī)鹽。優(yōu)選的鹽是PALA的四鈉鹽，另一種優(yōu)選的鹽是PALA的二鈉鹽。
在本發(fā)明一個(gè)特殊實(shí)施例中，公開了適于口服、直腸、經(jīng)皮進(jìn)入、局部的、陰道和非腸胃(包括皮下、肌肉和靜脈)用藥的制劑，盡管在任何指定的情況下，其最合適的途徑將取決于所治療的或防止的病毒性疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度。優(yōu)選的一種用藥途徑是通過靜脈注射。本發(fā)明組合物可以較方便地以單位劑量的形式提供，并且可通過任何為藥物化學(xué)領(lǐng)域的一般技術(shù)人員知曉的方法制備。
在實(shí)際應(yīng)用中，可以按常規(guī)藥物配料技術(shù)將PALA作為緊密混合物中的活性成分與一種藥物載體混合。所述載體可以有多種形式，這取決于用藥所要求的劑型，例如口服的或非腸胃的。在制備適于口服劑型的組合物時(shí)，任何常用的藥物介質(zhì)都可以使用。常用的藥物介質(zhì)包括例如水、甘醇、油、乙醇、調(diào)味劑、防腐劑、著色劑等(在口服液體制劑的情況下，例如，懸浮劑、溶液和酏劑);在氣霧劑的情況下，表面活性劑(用于輸送通過粘膜);或載體如淀粉、糖、微晶纖維素、稀釋劑、造粒劑、潤滑劑、粘著劑、分散劑等(在口服固體制劑的情況下，例如，粉劑、膠囊和片劑)?？诜腆w制劑比口服液體制劑優(yōu)先。最優(yōu)選的口服固體制劑是片劑或膠囊。當(dāng)用直腸用制劑時(shí)，可在聚乙烯二醇組份中制備該制劑。
由于易于給藥，片劑和膠囊代表最有利的口服劑量單位類型，在這種情況下需使用固體藥物載體。如果需要的話，還可通過標(biāo)準(zhǔn)含水的或無水的工藝對(duì)片劑制作進(jìn)一步涂覆。
除了上述普通的劑型外，本發(fā)明的所述化合物還可通過受控釋放裝置和/或輸送裝置用藥，該裝置包括Alzet
滲透泵，它可以由Alza公司獲得。合適的輸送裝置已描述于US3，845，770;3，916，899;3，536，809;3，598，123;3，944，064和4，008，719中。這些專利的公開內(nèi)容全部編入本文供參考。
本發(fā)明適用于口服給藥的藥物組合物可按獨(dú)立單位提供(例如膠囊、藥包、或片劑、或氣霧劑)，每一種都含預(yù)定量的活性成分，該組分可以是粉末或顆粒、或作為在水溶液、非水溶液、水包油型乳狀液中的一種溶液或一種懸浮液、或油包水型液體乳狀液，或以適當(dāng)?shù)娜橐河糜诰植炕蜿幍纼?nèi)。這些組合物可通過藥物學(xué)中任何已知的方法來制備，但所有的方法都包含使活性成分與載體結(jié)合的步驟，該載體中一種或多種必要的成分組成。通常，制備所述組合物的過程都是將活性成分和液體載體或粉末狀固體載體或兩者均勻地且緊密地混合，然后，如果需要的話，將產(chǎn)品成型為所需的形式。
例如，可以經(jīng)過壓制或模制而制備一種片劑，此時(shí)可任選地帶有一種或多種輔助成分。制備壓制片劑時(shí)可通過將自由流動(dòng)的活性成分如粉末或顆粒在合適的機(jī)器中加壓加壓制成，此時(shí)該活性成分可任選地與一種粘著劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、表面活性劑或分散劑混合，制造模制片劑時(shí)，可以在一適當(dāng)?shù)臋C(jī)器內(nèi)，對(duì)用惰性液體稀釋劑潤濕過的所述粉狀化合物的混合物進(jìn)行模制。按要求，每一片劑含約100-約500mg的活性成分，而每個(gè)藥包或膠囊含100mg-約500mg的活性成分，PALA。最好，片劑、藥包或膠囊含3分之一劑量，約100mg、約200mg、或約500mg的活性成分。
本發(fā)明所述的化合物特別適合用膠囊包起來(例如用脂質(zhì)體)或與蛋白載體及類似物交聯(lián)。具有該性質(zhì)的一些輸送系統(tǒng)描述于“BiologicalApproachestotheControlledDiliveryofDrugs，editorR.L.Juliano，Volume507，AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences(1987)，該文獻(xiàn)的公開內(nèi)容編入本文供參考。
適用于靜脈、皮下或肌肉注射的配方列于下面。
配方數(shù)量ABC活性成分PALA,二鈉鹽125mg250mg500mg消毒的無熱原物的水,它具有PALA的EDTA(1.0mg/ml)適量到5ml25mg/ml50mg/ml100mg/ml合適的片劑或膠囊(含PALA)組合物說明如下片劑配方每片數(shù)量以mg計(jì)ABC活性成分,PALA,二鈉100200500用于評(píng)價(jià)組合療法的動(dòng)物模型系統(tǒng)下列動(dòng)物模型體系可用于評(píng)價(jià)各種治療方式的效果，所述處理方式使用PALA或其類似物并配合任何上述的化合物。
1.用于本雅(Bunya-)和黃熱病毒(Flavivirus)的小鼠模型系統(tǒng)龐特托羅病毒(PuntaToroVirus)用3周齡期小鼠C57BL/6(9.6-13.6g)在體內(nèi)評(píng)價(jià)化合物抗由于皮下(S.C)接種龐特托羅(Punta Toro)(Adames)病毒(21天)而誘發(fā)的肝部感染的效果，其方式如前面對(duì)三氮唑核苷(Virazole
)(用作正對(duì)比物)和核脒(ribamidine)所述的。參見Sidwell等人，(1988)Antimicrob.Agents Chemother.，32331-336。
流行性乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus)將體重12-14g的10只C57B1/6小鼠(VAF+，Charles River Lab S)分成一組，用磷酸鹽-緩沖鹽水(PBS)或藥品每日在腹腔內(nèi)(i.p)處理兩次(b.i.d)，療程為5天，在病毒攻擊的前一天(1-天)進(jìn)行第1次用藥。每組10只動(dòng)物中有5只用JE病毒(Beijing菌株)100LD50進(jìn)行感染(S.C.)，其劑量在第一次施用化合物(天0)后的6小時(shí)內(nèi)應(yīng)足以產(chǎn)生100%的死亡率(稀釋劑對(duì)比物)。對(duì)比物包括未治療、未感染的小鼠;未治療的但感染了病毒的小鼠;用稀釋劑處理的感染過病毒(和未感染過)的小鼠。用聚(ICLC)(一種三氮唑核苷)(ribarivin
)作為正面處理比物。病毒攻擊后6天(+6天)，采集感染過的鼠腦供病毒滴定。將腦懸浮液(10%W/V)通過在vero細(xì)胞培養(yǎng)基中用噬菌斑試驗(yàn)進(jìn)行滴定。在1-天到+6天記錄體重。測(cè)量重量變化，將其作為藥品毒性的測(cè)量值。
2.用于HCMV的兔模型系統(tǒng)本次研究總共使用20只染色兔子。用狹縫燈和間接檢眼鏡評(píng)價(jià)動(dòng)物，確定正常的視覺組織和原先不存在病狀。
處理兔子的方式如下(1)在0天時(shí)，所有兔子都通過玻璃體中(mid vitriol)注射接種106PFU HCMV菌株AD169。
(2)使動(dòng)物保持在各個(gè)籠子里并在接種后第2天監(jiān)測(cè)脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜HCMV病發(fā)展?fàn)顩r。在接種后第2天時(shí)，將接種HCMV的具有同等脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病態(tài)的動(dòng)物分成4個(gè)組，并按下文指不進(jìn)行靜脈注射治療。
組＃1-五只動(dòng)物，在注射后第2、3、4、5和6天，分兩次給藥劑量每日靜脈注射藥品。藥品的濃度在體外測(cè)量時(shí)為ED90的1/2。
組＃2-五只動(dòng)物，在注射后第2、3、4、5和6天，分兩次給藥劑量每日靜脈注射藥品。藥品的濃度在體外測(cè)量時(shí)為ED90。
組＃3-五只動(dòng)物，在注射后第2、3、4、5和6天，分兩次給藥每日靜脈注射藥品。藥品的濃度在體外測(cè)量時(shí)為ED90的2倍。
組＃4-五只動(dòng)物，在注射后第2、3、4、5和6天，靜脈注射空白對(duì)照物。
(3)所有的動(dòng)物每日都接受檢眼鏡的間接檢查，以評(píng)價(jià)臨床HCMV病的進(jìn)展。間接檢眼鏡檢查由兩個(gè)偽裝的閱讀器獨(dú)立完成，以便使兔子接受治療。
(4)將所有的動(dòng)物在注射后第8天殺死。取出脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜和虹膜組織和玻璃體(在某些情況下還有肺組織)樣品并對(duì)樣品進(jìn)行處理，通過在Hs68單細(xì)胞層上進(jìn)行細(xì)胞聲處理檢驗(yàn)法而回收HCMV。用組織化學(xué)法處理選出的組織樣品以評(píng)價(jià)治療和非治療組由HCMV誘導(dǎo)出的眼病狀態(tài)。
對(duì)臨床和組織分析結(jié)果與所有用藥品處理過的、靜脈治療的組的病毒回收結(jié)果一起進(jìn)行評(píng)價(jià)，并且將它們彼此之間和與接受空白試劑治療的組聯(lián)系起來。本次研究結(jié)果可以使我們選擇用于靜脈治療由CMV誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜炎的最佳藥品濃度。
3.用于RSV的靈長目動(dòng)物模型使用對(duì)RSV呈血清反應(yīng)陰性的23只年幼的非洲綠猴。所有的猴子都被逐個(gè)地放在籠子里，置于靈長目動(dòng)物中心(Primate Center)的一間房子中。保持它們的溫度在75°+/-3°F，相對(duì)濕度為50-60%。隨時(shí)供應(yīng)Purina猴以食品和水且逐日監(jiān)測(cè)動(dòng)物的臨床病征和食物的消耗情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，所有的動(dòng)物都用Beuthansia D Sqecial(安樂死溶液，Shering公司)在酮胺(Ketamine)麻醉的條件下殺死，再進(jìn)行尸體剖檢。
使用兩種RSV菌株;一種是長型菌株(ATCC VR-26)而第二種是從澳大利亞人體RSV分離菌得到的，所述分離菌的提供者為Dr.Gail Wertz(School of Medicine，Vniversity of Alabama at Birmingham)。向非洲綠猴通入兩次病毒并制成BSC-40細(xì)胞(非洲綠猴腎)的儲(chǔ)備庫。病毒庫具有大約105TCID50/ml的滴定度并保存于-70℃下。
病毒接種物由稀釋10-1或10-2倍的儲(chǔ)備FSV組成，這是通過氣管導(dǎo)管(1.0ml)和鼻內(nèi)滴注(1.0ml)給藥而實(shí)現(xiàn)的。逐日獲取咽喉拭子并將其放入1.0ml的組織培養(yǎng)基中(具有10%胎牛血清和抗菌素的小型基本培養(yǎng)基)。從拭子中壓榨出體液后在1.0ml培養(yǎng)基上進(jìn)行滴定(表1)。通過制備各樣品10倍系列的稀釋液并將每份稀釋液接種到用BSC-40細(xì)胞接種的24孔培養(yǎng)板的復(fù)制孔內(nèi)而完成的。通過用顯微鏡檢查培養(yǎng)基中由病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病征而獲得滴定度，且將所述的滴定度表達(dá)為TCID50/ml。
在尸體剖檢時(shí)從每只猴子中取下很小一部分肺，稱重并在玻璃組織磨中研磨成10%的勻漿(在pH7.2磷酸緩沖鹽水中)，取其中的0.1ml在血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)以便作細(xì)菌學(xué)評(píng)價(jià)。將部分勻漿和肺灌洗液稀釋10倍以便滴定BSC-40細(xì)胞中的病毒。
記錄總的變化后，再將氣孔灌滿10%緩沖福爾馬林溶液。收集氣管、鼻腔中的組織樣品并將整個(gè)的肺結(jié)構(gòu)浸于10%的緩沖福爾馬林溶液中。固定48小時(shí)后，將各肺葉制成切片，處理氣管和鼻甲(采用標(biāo)準(zhǔn)石蠟技術(shù))，再以4-6μ進(jìn)行切片并用蘇木精-曙紅(HE)進(jìn)行染色;某些切片的染色采用PeriodicAcidShiff(PAS)和免疫過氧化酶(用一種在山羊抗猴中產(chǎn)生的(IgG，IgM，e3)(NordicImmunologicLaboratories，CapistranoBeach，CA)和Histomark免疫過氧化酶藥盒(KirkegaardandPerryLaboratories，Gaitherburg，MD)。
對(duì)總的和顯微鏡變化與病毒滴定度一塊進(jìn)行評(píng)價(jià)。采用過氧化酶工藝來確定用RSV的A-2(Wertz)菌株顯著見到的基底膜變化。
參照下列描述本發(fā)明的實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的限定。對(duì)所屬技術(shù)領(lǐng)域的一般技術(shù)人員來說，很顯然，有許多改進(jìn)(包括材料和方法)并不偏離本發(fā)明的范圍和精神。
實(shí)施例實(shí)施例11.1材料和方法得到的PALA呈晶狀粉末，以二鈉鹽的形式。將它放在光化玻璃器皿中，并溶解在消過毒的水或含1%牛血清蛋白的Eagle′s基本培養(yǎng)基中(作為一種10×或100×溶液)。使所有溶液通過微孔過濾器而消毒。使用下列細(xì)胞株Vero或CeM;Hep-2和人包皮細(xì)胞。采用3-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯四唑鎓溴化物(MTT)、利用Pauwels等人(1988)在J.Virol.Methods中所述的方法20309-321(該說明書已列入本文參考文獻(xiàn))觀察病毒抑制過程。
1.2體外抗病毒和細(xì)胞毒性試驗(yàn)所有試驗(yàn)均在Vero細(xì)胞中進(jìn)行(除HIV-1試驗(yàn)中用CEM細(xì)胞以外)。使用下列病毒(病毒菌株)對(duì)化合物的抗病毒效果進(jìn)行評(píng)價(jià)a)流行性乙型腦炎病毒，JE，(Nakayama);b)黃熱病毒，YF，(Asibi);c)白蛉熱病毒，SF，(Sicilian);d)龐特托羅(PuntaToro)病毒，(PT)(Adames);e)委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒(VEE)，(Trinidad驢);f)牛痘病毒(VV)，(Lederle疫苗);g)登革型-4(Caribbean)病毒;h)人免疫缺乏病毒，類型1或2，HIV1或2。病毒(a-f)包括用于對(duì)藥物進(jìn)行評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)組。該試驗(yàn)化合物的體外抗病毒和細(xì)胞毒性作用的測(cè)量方法有a)通過用MTT-試驗(yàn)(JE、YE、SF、PT、VEE、VV和HIV病毒)，(Pauwels等人(1988)J.Virol.Methods20309-321)來觀察對(duì)病毒細(xì)胞致病作用的抑制情況，或b)通過一種常用的噬菌斑減少試驗(yàn)(所有其它病毒)。
在本發(fā)明中所用的基本測(cè)量值和定義包括(a)細(xì)胞毒性或濃度50%，TC50，其定義為在MTT試驗(yàn)中與未傳染的在二倍試驗(yàn)井中的對(duì)照細(xì)胞的存活力相比使細(xì)胞的數(shù)目和它們的代謝活性減少50%的藥物濃度(μg/ml);(b)病毒抑制濃度50%，IC50，其定義為在三倍試驗(yàn)井中所觀察到的使病毒細(xì)胞致病作用(CPE)減少50%的藥物濃度(μg/ml)。治療(或抗病毒)指數(shù)，TI，它是一個(gè)與總的體外活性成比例的值。它以TC50/IC50的比率計(jì)算。它是在相同試樣和相同時(shí)間周期中某種化合物的相對(duì)抗細(xì)胞和抗病毒效果的單一藥物濃度的測(cè)量值。所有在體外MTT試驗(yàn)中所給出的結(jié)果代表2-6個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)結(jié)果的平均值。
1.3結(jié)果如上所述試驗(yàn)方法可對(duì)病毒復(fù)制和毒性水平進(jìn)行測(cè)量?；罴?xì)胞將MTT四唑鎓轉(zhuǎn)化成藍(lán)MTT甲脂(使用線粒體酶);死細(xì)胞沒有這種轉(zhuǎn)化能力。另一方面，也用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞致病作用和毒性試驗(yàn)(通過光顯微技術(shù))來補(bǔ)充篩選。除了在進(jìn)行病毒攻擊之前將細(xì)胞片用PALA預(yù)處理16小時(shí)之外，如前所述地對(duì)PALA的系列濃度進(jìn)行測(cè)試。(參見，例如由Kumarasamy，R.和Blough，H.A.(1984)在Virology138156-161中所述的方法)。使用合適的抑制劑和病毒對(duì)照組，并評(píng)價(jià)其毒性。治療指數(shù)如上所述用常規(guī)方式進(jìn)行計(jì)算，在表1中給出3對(duì)黃熱病毒、外衣病毒和本雅病毒(負(fù)和正鏈RNA病毒)的篩選結(jié)果;同樣對(duì)于這些病毒的證實(shí)數(shù)據(jù)在表2中給出。
注TI是治療指數(shù)，即TC/IC;a)50%抑制時(shí)的μg/ml;b)50%抑制時(shí)的μg/ml;c)50%抑制;d)95%抑制。
注TI是治療指數(shù)，即TC/IC;a)50%抑制時(shí)的μg/ml;b)50%抑制時(shí)的μg/ml;c)50%抑制;d)95%抑制。
僅在體外使用PALA的結(jié)果是明確的;PALA在濃度為約10至約25μg/ml時(shí)對(duì)所有這些RNA病毒(除了VEE)均具有廣譜抗病毒活性，并且在所有檢測(cè)系統(tǒng)中具有最小的毒性，這一點(diǎn)可以通過TC50值大于約320μg/ml而證實(shí);因此，PALA對(duì)于大部分所檢測(cè)的病毒具有約20至30的治療指數(shù)。
當(dāng)這些研究擴(kuò)大到DNA病毒和其他RNA病毒(正和負(fù)鏈病毒以及反轉(zhuǎn)錄病毒)時(shí)證明四個(gè)含DNA病毒中有三個(gè)對(duì)PALA抑制作用是同樣敏感的。除了1型和2型皰疹病毒沒有觀察到抑制活性之外，PALA在約10μg/ml的濃度時(shí)對(duì)以上所有的病毒均具有活性。如表3中所示，一種RNA正鏈病毒，柯薩奇病毒B3(CoxsackieB3)對(duì)于50%抑制作用需要約33μg/ml;對(duì)于大部分這些病毒的治療指數(shù)為約32。
＊人包皮纖維細(xì)胞;a)50%抑制實(shí)例2使用鴨肝模型(DHBV)，用各種濃度的PALA(二鈉鹽)對(duì)初始的鴨肝細(xì)胞進(jìn)行處理，并對(duì)細(xì)胞致病作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。另一方面，用狹縫點(diǎn)印跡法對(duì)病毒DNA的復(fù)制進(jìn)行試驗(yàn)。在濃度為40-50μM的條件下，在菌斑中觀察到50%的減少(IC50);在高濃度下，即，500μM，具有95%的抑制作用，此時(shí)只有很少或沒有毒性。將這些實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次以驗(yàn)證其結(jié)果。
實(shí)例3下面各個(gè)部分描述了一些實(shí)驗(yàn)，在這些實(shí)驗(yàn)中用非洲綠猴進(jìn)行猴水痘病毒傳染，并用PALA，無環(huán)鳥苷或它們的結(jié)合進(jìn)行治療。其結(jié)果表明PALA與無環(huán)鳥式的結(jié)合減少了疹且最小限度地減輕了病毒血癥，特別是在傳染期結(jié)束時(shí)。在高濃度條件下可以注意到一些與濃度有關(guān)的免疫抑制。此外，PALA表現(xiàn)出與BVaraU(Bristol-MyersSquibb)有極好的協(xié)同作用(未示出結(jié)果)。
1材料和方法將15只非洲綠猴稱重并抽血以獲得臨床化學(xué)血液學(xué)原始數(shù)據(jù)。這些猴在此之前沒有表現(xiàn)出對(duì)猴水痘病毒Sf具有抗體。對(duì)15只猴中的每一只通過氣管內(nèi)接種3.7×104菌斑形成單位(PFU)的猴水痘病毒來感染猴水痘病毒。將這些猴分成5組，每三只猴為一組，并規(guī)定出治療組如在表4中所示的。該方案導(dǎo)致了下列治療組。對(duì)照猴，作為感染對(duì)照組，每日兩次靜脈注射磷酸鹽緩沖鹽溶液，施用量為0.1ml/kg(體重)。第二組的三只猴接受PALA，用量為每日50mg/kg，通過靜脈團(tuán)注射進(jìn)入到隱靜脈中。第三組以同樣方式以每日20mg/kg的施用量施用較小劑量的PALA。無環(huán)鳥苷治療也通過靜脈團(tuán)注射進(jìn)入到隱靜脈中來施用每日10mg/kg的次有效劑量。第五組的三只猴接受PALA，每日為20mg/kg和無環(huán)鳥苷為每日10mg/kg的組合治療。在每一次治療中其藥物注射到對(duì)向靜脈里。
藥物溶液是在治療之前每日配制。在病毒接種之后24小時(shí)開始治療。PALA是以溶液來提供的，它置于含有5ml溶液的小玻璃瓶中，其含量為100mg/ml。合并三只小玻璃瓶內(nèi)的物質(zhì)，且將7ml合并藥物稀釋到28ml以得到濃度為25mg/ml。將5ml這種溶液稀釋至50ml，從而得到10mg/ml。每日施用兩次藥物，使每日的總劑量為50或20mg/kg/日。
將從BurroughsWellcome作為禮物而獲得的無環(huán)鳥苷稱出200mg。將其用5mlPBS稀釋，且將pH用1NNaOH調(diào)至11.0成為有效溶液。隨后將該溶液稀釋到40ml，從而得到5mg/ml的溶液，且通過過濾來消毒。再一次，通過每日兩次靜脈注射，施用1ml/kg體重，其結(jié)果為每日10mg/kg的劑量。
在猴水痘感染的臨床過程之后在接種之后第2、5、7、9和11天采集肝素中的血2ml。將這2ml樣品中的淋巴細(xì)胞在ficol-3，5-二乙酰胺基-2，4，6-三碘苯甲酸鈉(hypaque)梯度上分離，在RPMI-1640介質(zhì)中洗滌兩次，且在10ml這種介質(zhì)中將其懸浮。將其10ml體積分開在兩個(gè)25cm2的組織培養(yǎng)燒瓶中，在此之前24小時(shí)已用Vero細(xì)胞接種該燒瓶。在5-7天培育期之后，將其培養(yǎng)液從該燒瓶中倒出，且用甲醇固定其細(xì)胞單層，并用甲烷藍(lán)基品紅著色。當(dāng)干燥時(shí)，計(jì)算在每個(gè)燒瓶中的菌斑的數(shù)量，并確定在這兩個(gè)燒瓶之間的菌斑平均數(shù)，將其表示為每ml血液的病毒血癥的測(cè)量值。
使用一種主觀的從±至4+的嚴(yán)重程度的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)來對(duì)疹作每日評(píng)估。一個(gè)±評(píng)分表示在猴的皮膚上看到小于10個(gè)的小泡，而4+則表示很多小泡覆蓋了大部分身體表面。白天檢查總的臨床條件并通過計(jì)數(shù)每日食品餅干的數(shù)量記錄厭食情況。將在實(shí)驗(yàn)過程中死去的猴子進(jìn)行尸體剖檢，且根據(jù)典型的病理學(xué)基礎(chǔ)將猴水痘確定為死因?；A(chǔ)血液學(xué)和臨床化學(xué)試驗(yàn)在病毒接種之前三天時(shí)進(jìn)行，并在病毒接種之前0天立刻再做一次。隨后在3、7、9和11天時(shí)獲取猴的水痘病毒血液以供血液學(xué)和臨床化學(xué)試驗(yàn)。
在病毒接種之后14和21天時(shí)，抽取血液，且為測(cè)定抗體而分離血清。使用一種噬菌斑減少試驗(yàn)在血清中和試驗(yàn)中獲得抗體的滴定度。所表示的抗體滴定度是菌斑數(shù)量比沒有加血清的對(duì)照培養(yǎng)物中所產(chǎn)生的數(shù)量減少80%時(shí)的血清稀釋量。
2結(jié)果表4表示了有關(guān)每日記錄的疹的數(shù)據(jù)。三只對(duì)照猴的每一只都出了疹，而其中一個(gè)猴在第11天疹子發(fā)展到最高程度4±。這只猴在猴水痘靠近到它的肺和肝后的第二天就死了。其余兩只對(duì)照猴發(fā)展的最多出疹程度為2+和3+，并在每只猴身上都持續(xù)了兩天。用50mg/kg/天PALA處理的三只猴中有兩只發(fā)展到最高出疹程度4+，第三只猴在第9天僅表現(xiàn)出1+的疹，但是在第10天得了全身性猴水痘而死了。使用低劑量的PALA，結(jié)果在一只猴身上有1+的出疹，而在第二只猴身上有2+出疹。第三只猴在第10天表現(xiàn)出3+的出疹，但在同一天的晚些時(shí)候就死了。以次有效量(每日10mg/kg)條件使用無環(huán)鳥苷的結(jié)果是在兩只猴身上表現(xiàn)出中等嚴(yán)重程度的3+出疹，而在第三只猴身上表現(xiàn)出輕度的1+出疹。以每天10mg為劑量進(jìn)行組合處理的結(jié)果則可減輕出疹在多數(shù)日子里僅看到±出疹，最嚴(yán)重的是有一只猴有1+的記錄。
病毒血癥在一只對(duì)照猴身上較嚴(yán)重的(＞1000PFU/ml血)而在其它兩只對(duì)照猴身上是中度的(為100～300PFU/ml血)(見表3)。當(dāng)這些猴以每日50mg/kg的PALA進(jìn)行治療時(shí)，一只猴得了嚴(yán)重的病毒血癥而死了，第二只得了較嚴(yán)重的病毒血癥(300-800PFU/ml)，而第三只則得了中度病毒血癥。用每日20mg/kgPALA的劑量進(jìn)行治療的猴身上可見到同樣結(jié)果。以每日10mg/kg的劑量施用無環(huán)鳥苷時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)中度的病毒血癥沒有作用。兩只猴得了嚴(yán)重的病毒血癥，而另一只猴表現(xiàn)出較重度的病毒血癥。用PALA和無環(huán)鳥苷進(jìn)行組合治療可以看到稍微有點(diǎn)收益。一只猴得了較重的病毒血癥，一只得了中度病毒血癥，而第三只得了最輕的病毒血癥。
血液學(xué)試驗(yàn)表明沒有持續(xù)的不規(guī)則數(shù)值。在用PALA以每日50mg/kg劑量治療的一只猴(M636)身上和用無環(huán)鳥苷治療的兩只猴(M642和M639)身上在第11天觀察到了血小極減少癥?；瘜W(xué)數(shù)值確實(shí)反映出由于猴水痘病毒而存在的肝炎后果。從按所用劑量施用該藥物來治療的結(jié)果來看沒有異?，F(xiàn)象。
將血清中和抗體的滴定度與對(duì)照組中的猴子進(jìn)行比較，并且與用PALA劑量或用無環(huán)鳥苷治療的猴子進(jìn)行比較。用PALA和無環(huán)鳥苷組合治療的猴子在與其它猴子的滴定度進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出對(duì)于猴水痘病毒具有低滴定度抗體。這很可能是由于組合治療而對(duì)病毒復(fù)制產(chǎn)生了抑制作用。
表4PALA和無環(huán)鳥苷組合治療對(duì)猴水痘病毒的治療效果疹疹子的程度-注射后的天數(shù)治療組猴子數(shù)量789101112131416對(duì)比M644--1+3+4+死亡PBSM634-±2+2+1+±---M547±1+2+3+3+1+±±±PALA:M646-±1+死亡50mg/kg/dM636-1+2+2+2+3+4+4+3+M635--2+2+2+3+4+4+3+PALA:M633-1+2+3+死亡d20mg/kg/dM637----1+2+2+2+-M638--±1+1+1+1+1+-無環(huán)鳥苷M642-±±1+1+±±±-10mg/kg/dM6391+1+1+2+3+3+3+2+1+M6431+2+2+3+2+2+1+1+±PALA:M640---±1+±---20mg/kg/dM645--±±±±±±-+無環(huán)鳥苷M641--±±±±---10mg/kg/d通過在接種病毒后24小時(shí)開始的分開劑量每天兩次靜脈內(nèi)注射而治療表5PALA和無環(huán)鳥苷組合治療對(duì)猴水痘病毒的治療效果病毒血癥平均PFU-注射后天數(shù)治療組猴子數(shù)量357911對(duì)比M6446105>1000>1000死亡PBSM634161385100M6471918123300PALA:M6461136>1000>1000死亡50mg/kg/dM6367254508892M6357248213100PALA:M63313195>1000>100死亡20mg/kg/dM637913017340M63857930570無環(huán)鳥苷M6429342>1000322010mg/kg/dM639290>10007060M643521050400PALA:M6400816113020mg/kg/dM64512113550110+無環(huán)鳥苷M641748300010mg/kg/通過在接種病毒后24小時(shí)開始的分開劑量每天兩次靜脈內(nèi)注射而治療表6PALA和無環(huán)鳥苷治療對(duì)猴水痘病毒的血清中和抗體滴定度的影響SerumNeutral血清中和抗體滴定度Fiter-注射后天數(shù)治療組猴子數(shù)量14天天對(duì)比M644死亡死亡-M6341:6401:1280M6471:3201:1280PALA:M646死亡死亡50mg/kg/天M6361:801:1280M6351:320≥1:1280PALA:M633死亡死亡20mg/kg/天M6371:640≥1:1280M6381:1601:320無環(huán)鳥苷M6421:6401:64010mg/kg/天M6391:1601:1280M6431:1601:160PALA:M6401:801:64020mg/kg/天M6451:201:320+無環(huán)鳥苷M6411:801:64010mg/kg/天以導(dǎo)致病毒菌斑數(shù)比對(duì)比培養(yǎng)物的數(shù)降低80%或更多時(shí)的血清稀釋值作為滴定度實(shí)例4在Hs68細(xì)胞單層上在AD169傳染過程中體外用藥的效果。
這些實(shí)驗(yàn)是用來證實(shí)在HCMV傳染過程中10μg/ml濃度的PALA的體外效果。在Hs68細(xì)胞學(xué)層上的體外感染和效果的評(píng)價(jià)是對(duì)以下HCMV病毒分離物進(jìn)行的[1]AD169，一種標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室巨細(xì)胞病毒菌株;[2]一種DHPG抗性HCMV分離物(胸苷激酶抗性DHPG;ED50＝＞55μg)，和[3]一種最近獲得的HCMV臨床分離物。這一研究還可以對(duì)采用該實(shí)驗(yàn)性藥物和采用DHPG在活性抑制過程中的HCMV滴定度減少的情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。
這些小部分證明所有三個(gè)菌株CMV實(shí)驗(yàn)室菌株、人體HCMV分離物和DHPG抗性菌株對(duì)PALA是敏感的，病毒量減少了2～3log10。
1方法將特征如上所述的[1]菌株AD169;[2]DHPG抗性HCMV;或[3]最近分離的臨床HCMV菌株的104PFU/mlHCMV接種到會(huì)合的Hs68細(xì)胞單層(35mm培養(yǎng)盤)上并在37℃下將其吸附于該單層上達(dá)1小時(shí)。將接種物吸出，且將含有實(shí)驗(yàn)藥物或DHPG的培養(yǎng)基，或不含藥物的培養(yǎng)基加入到接種了HCMV的單層中。將含有適當(dāng)?shù)乃幬锾砑拥降呐囵B(yǎng)每日變化。以24小時(shí)為間隔，從接種后第1天到第7天，將該接種HCMV且經(jīng)藥物處理的單層按下列方式處理將含有無細(xì)胞病毒的上清液從該細(xì)胞中去除，而在該上清液中HCMV無細(xì)胞病毒的滴定度通過標(biāo)準(zhǔn)噬菌斑試驗(yàn)來確定。將該單細(xì)胞層用HBSS洗滌，以去除剩余的藥物，并通過刮削來收集細(xì)胞。將該細(xì)胞用聲波和離心作用來處理使其成為丸狀細(xì)胞碎片。測(cè)定從感染的單細(xì)胞層中釋放出的無細(xì)胞HCMV的滴定度。該藥物的效果用與無藥物處理的HCMV PFU/ml和DHPGHCMV抑制相比HCMVPFU/ml的減少量來表示。
2結(jié)果2.1用AD169感染的Hs68單細(xì)胞層在3μg/ml的濃度下使用PALA當(dāng)與用空白對(duì)照物處理的對(duì)照組相比較時(shí)在減少HCNV滴定度方面它是有效的。當(dāng)PALA與體外治療中的DHPG(19μg/ml;ED50對(duì)于AD169)相比較時(shí)，其HCMV滴度的降低與用DHPG處理的單層相類似，但其滴度卻比DHPG的滴度稍微高一些。用PALA治療之后的HCMV滴度的降低與該上清液(無細(xì)胞HCMC)和與其細(xì)胞丸(與細(xì)胞有關(guān)的HCMV滴度)是相類似的。HCMV滴度從細(xì)胞上清液和從細(xì)胞丸試驗(yàn)中的回跳(目前未有解釋)在接種后第3天出現(xiàn)。該滴度與接種后第4和第5天的DHPG相比仍保持較高水平。在第5天之后由于單層中細(xì)胞的損失，沒有樣品被處理。到接種后第5天，在用藥物處理過的樣品中該單細(xì)胞層約有50%已經(jīng)損失。HCMV滴度在表7a和圖1以及2中列出。
2.2臨床HCMV分離物從一個(gè)已證實(shí)的HCMV新生兒感染病例中獲得一種臨床分離物。該病毒通過中和作用證實(shí)為HCMV。PALA和DHPG可以有效地降低該HCMV臨床分離物的滴度。在這兩種治療之間和在它們降低HCMV滴度的作用上沒有不同。HCMV滴度在表7b和在圖3以及4中列出。
2.3DHPG抗性HCMV將一種DHPG抗性HCMV分離物(以前認(rèn)為其特征根據(jù)DHPG敏感性體外減少情況認(rèn)為是一種DHPG抗性分離物;該病毒具有不同的胸苷激酶活性)用于這些體外試驗(yàn)中。DHPG在與細(xì)胞有關(guān)的或無細(xì)胞試驗(yàn)中對(duì)降低HCMV的滴度是沒有效的。在該用DHPG處理的組中DHPG抗性HCMV的滴度與用空白對(duì)照物處理的單細(xì)胞層相同或高一些(沒有統(tǒng)計(jì)意義)。PALA在降低DHPG抗性HCMV的滴度方面是有效的。到接種后第4-5天，用PALA處理的單細(xì)胞層比用DHPG處理的或用空白對(duì)照物處理的單細(xì)胞層明顯地降低了HCMV的滴度。HCMV滴度在表8和圖5以及6中列出。
表7a用DHPG、PALA和空白液接種后的無細(xì)胞(上清液)的HCMV滴定度DHPGPALA接種后的天數(shù)對(duì)比 AD 169 DHPGR臨床分離物 AD169 DHPGR臨床分離物0 1051051051051051051051 1021011031011011011022 1021011041011011011013 1031011051011031021024 1040 1051011021021015 1050 1040 101101101
表7b用DHPG、PALA和空白液接種后的與細(xì)胞有關(guān)(細(xì)胞丸處理)的HCMV滴定度DHPGPALA接種后的天數(shù)對(duì)比 AD 169 DHPGR臨床分離物 AD169 DHPGR0 1021021021021021021021 1041021031031031031032 1041011031021011011023 1031011051011011011014 1031011051011011011015 1040 1040 1010 06 1031011041011011011017 1010 1021010 101101實(shí)例5在HCMV脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜的兔模型中對(duì)單一的和組合試劑PALA和DHPG的增加劑量以及頻率效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。
這些研究通過比較臨床的、病毒恢復(fù)和組織病理學(xué)上由HCMV誘導(dǎo)的疾病程度對(duì)在增加劑量濃度和頻率的研究中靜脈治療過程中的單一的和組合試劑PALA和DHPG的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)藥物濃度，20和50mg/kg，在2種不同施用頻率條件下的情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，每天以及從接種后第一天至第10天每隔一天進(jìn)行評(píng)價(jià)。將該實(shí)驗(yàn)藥物的體內(nèi)效果與靜脈DHPG治療作比較。其結(jié)果表明用組合試劑劑量PALA加低劑量DHPG(組＃7)＞＞對(duì)照組(組＃8)＝單一試劑DHPG(組＃1和＃2)和低劑量(組＃3)PALA＞＞組合試劑高劑量PALA加低劑量DHPG(組＃5)＞＞組合試劑高劑量PALA加低劑量DHPG(組＃4)。
1方法在該研究中總共使用32只有色兔。將這些動(dòng)物通過狹縫燈和間接檢眼鏡確定正常的眼的形態(tài)以及原始病理缺陷，以對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。將這些動(dòng)物按下述方式進(jìn)行處理[1]在第0天，所有兔通過玻璃體中(mid-vitreal)注射105PFU HCMV菌株AD169(100μl)來接種。將動(dòng)物們關(guān)在各自的籠子中，每日監(jiān)測(cè)脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜HCMV疾病的發(fā)展。在接種后第2天，將接種HCMV的動(dòng)物分成8個(gè)組，每4只為一組，每一只具有類似的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病記錄。將感染HCMV的兔子接受靜脈治療，方式如下組＃1;4只動(dòng)物，從接種后第2天至10天每日靜脈注射高劑量實(shí)驗(yàn)藥物(50mg/kg)。共靜脈注射9次。
組＃34只動(dòng)物，從接種后第2天至10天每日靜脈注射低劑量實(shí)驗(yàn)藥物(20mg/kg)。共靜脈注射9次。
組＃44只動(dòng)物，從接種后第2天至10天每日靜脈注射高劑量實(shí)驗(yàn)藥物(50mg/kg)(共9次靜脈注射)，且從接種后第2天至10天每日2次注射高劑量DHPG10mg/kg/天(總共18次靜脈注射)。
組＃54只動(dòng)物，從接種后第2天至第10天每日靜脈注射高劑量實(shí)驗(yàn)藥物(50mg/kg)(共9次靜脈注射)，且從接種后第2天至第10天每日兩次注射低劑量DHPG5mg/kg/天(共18次靜脈注射)。
組＃64只動(dòng)物，從接種后第2天至第10天每日靜脈注射低劑量實(shí)驗(yàn)藥物(20mg/kg)(共9次靜脈注射)，且從接種后第2天至第10天將低劑量DHPG5mg/kg/天分兩次施用(共18次靜脈注射)。
組＃74只動(dòng)物，從接種后第2天至第10天每天分兩次靜脈注射的DHPG10mg/kg/天。共18次注射。
組＃84只動(dòng)物，從接種后第2天至第10天靜脈注射消毒鹽水。所有動(dòng)物每日接受間接檢眼鏡的檢查，以評(píng)價(jià)臨床HCMV疾病的進(jìn)展(從接種后第2天至第10天)。該間接檢眼鏡的檢查是通過兩臺(tái)讀出器獨(dú)立地進(jìn)行的，該讀出器被偽裝進(jìn)來，以方便正在接受治療的兔子。將所有動(dòng)物在接種后第12天殺死，將脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜和虹膜組織和玻璃體樣品取下來并作處理從而通過在Hs68單細(xì)胞層上進(jìn)行細(xì)胞聲波試驗(yàn)而收集HCMV。對(duì)所選擇的眼睛的和肺的組織樣品進(jìn)行組織化學(xué)處理，以評(píng)價(jià)在治療組和未治療組中由HCMV誘發(fā)的眼睛的病狀。
將由所有經(jīng)過藥物治療的靜脈治療組得到的有關(guān)臨床的、病毒收集以及組織病理效果的結(jié)果互相聯(lián)系起來，且與空白對(duì)照治療組聯(lián)系起來。
2結(jié)果單一試劑靜脈內(nèi)治療組將在兔子身上由HCMV誘發(fā)的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病過程中由單一試劑和組合試劑進(jìn)行靜脈治療的效果的數(shù)據(jù)總結(jié)于圖5。以下是各個(gè)治療的概述。
組＃1從接種后第2天至第10天每日靜脈注射高劑量PALA(50mg/kg)進(jìn)行單一試劑的治療。
每日用單一劑量靜脈施用濃度為50mg/kg的PALA。在接種HCMV的動(dòng)物中對(duì)于降低疾病的發(fā)展僅勉強(qiáng)有效。在接種后3-4天內(nèi)玻璃體炎發(fā)展到中等程度。玻璃體炎的進(jìn)一步發(fā)展會(huì)妨礙在這些動(dòng)物中對(duì)脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎的全面評(píng)價(jià)，其結(jié)果，組織學(xué)的評(píng)價(jià)在確定脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病的范圍和單一PALA制劑的效果方面將變得更為重要。視神經(jīng)乳頭水腫和發(fā)紅(在這種兔模型中HCMV感染的臨床癥狀)在接種后第3至7天表現(xiàn)出來。該研究的結(jié)論為，在眼底部可見的動(dòng)物中視神經(jīng)乳頭的紅腫和發(fā)紅正在減輕。雖然眼底視覺和正在發(fā)展的HCMV脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病由于玻璃體炎而被遮蔽，但是在用高劑量PALA治療的那些動(dòng)物中其臨床的感覺是該治療僅有極小的效果而且通過這種高劑量單一試劑的治療，由HCMV誘發(fā)的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎疾病的發(fā)展和進(jìn)展沒有停止。
組織學(xué)初步評(píng)價(jià)表明中等面積的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜HCMV疾病限制在內(nèi)視網(wǎng)膜上。偶然地，HCMV感染會(huì)深及傳播疾病中的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜的較大面積。脈絡(luò)膜的水腫和血管充血在中等水平條件下是突出的。在這些用PALA治療的眼睛中由HCMV產(chǎn)生的疾病的面積會(huì)集中在某一地區(qū)，這表明發(fā)生了中等脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜感染。涉及免疫細(xì)胞的范圍由單細(xì)胞的和多形核細(xì)胞浸潤物組成。這些初步的組織學(xué)評(píng)價(jià)證實(shí)了該臨床疾病印象。宰殺時(shí)，其肺清晰且無充血。對(duì)樣品作常規(guī)的組織學(xué)處理，其結(jié)果有待給出。
在接種后第12天沒有從任何脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜細(xì)胞聲波共同培養(yǎng)物中回收到HCMV。沒有回收到HCMV可能(且也許)直接與選定回收HCMV的時(shí)間有關(guān)，即與接種后第12天有關(guān)。為了對(duì)這些單一試劑治療的效果作更全面的評(píng)價(jià)，在整個(gè)治療過程有一段動(dòng)物宰殺時(shí)間將是必須的。(在沒有治療的眼睛中，HCMV通常出現(xiàn)在接種后第8或9天。在接種后第9或10天之后的回收是不確定的)。
組＃2從接種第2天到第10天中用高劑量PALA(50mg/kg)每隔一天靜脈注射單一試劑進(jìn)行治療以50mg/kg濃度每隔一天用單一劑量靜脈施用PALA對(duì)于在接種HCMV的動(dòng)物中減輕疾病的發(fā)展是勉強(qiáng)有效的。用這種PALA濃度治療的動(dòng)物中的疾病的發(fā)展與每日用50mg/kg靜脈治療組中HCMV疾病的進(jìn)展情況相類似。玻璃體炎在接種后3-4天內(nèi)發(fā)展到中等至嚴(yán)重水平。玻璃體炎的發(fā)展妨礙了對(duì)這些動(dòng)物的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病的全面評(píng)價(jià)，其結(jié)果，該組織學(xué)評(píng)價(jià)在確定脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病的范圍和該P(yáng)ALA制劑的單一試劑效果方面將變得更為重要。在接種后3-4天視神經(jīng)乳頭水腫和發(fā)紅(在這一兔模型中HCMV感染的臨床特征)較嚴(yán)重，且在第5至7天不能進(jìn)行評(píng)價(jià)，這表明盡管進(jìn)行了治療，但眼睛中的HCMV疾病仍在發(fā)展。雖然眼底視覺和發(fā)展的HCMV脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病由于在這些動(dòng)物中玻璃體炎而被遮蔽，但是在這些用高劑量PALA每隔一天治療的動(dòng)物中由HCMV誘發(fā)的疾病的臨床感覺是這種治療辦法對(duì)于減輕HCMV疾病的發(fā)展是沒有效力的。在這兩個(gè)高劑量PALA治療組中由HCMV誘發(fā)的疾病的發(fā)展相互之間沒有不同(圖7)。宰殺時(shí)其肺清晰且無充血。
在接種后第12天沒有從任何脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜細(xì)胞聲波共同培養(yǎng)物中回收到HCMV。回收不到HCMV可能(且也許)直接與所選擇的HCMV回收時(shí)間有關(guān)。
組＃3從接種后第2天到第10天用低劑量PALA(20mg/kg)每日靜脈注射單一試劑進(jìn)行治療以20mg/kg的濃度每隔一天用單一試劑靜脈注射施用PALA在已接種HCMV的動(dòng)物中對(duì)于減輕疾病的發(fā)展來說與其它治療組和空白對(duì)照劑治療組相比是沒有效果的。該疾病的進(jìn)展與組＃2的報(bào)告相類似。
初步的組織學(xué)結(jié)果表明發(fā)生了擴(kuò)散性疾病并伴有中度到嚴(yán)重的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病。
在接種后第12天沒有從任何脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜細(xì)胞聲波共同培養(yǎng)物中回收到HCMV。回收不到HCMV可能是直接與所選擇的回收HCMV的時(shí)間有關(guān)。
組＃7從接種后第2天至第10天對(duì)已接種HCMV的動(dòng)物靜脈注射DHPG(每日10mg/kg分兩次注射)在這一實(shí)驗(yàn)中用DHPG作為對(duì)照治療。動(dòng)物從接種后第2天開始接受DHPG治療，并持續(xù)到接種后第10天。每日10mg/kg分兩次施用DHPG進(jìn)行治療確實(shí)可以減輕HCMV脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜感染和疾病的發(fā)展。到接種后第6-7天在70%用DHPG治療的眼睛中，其平均HCMV脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病程度已穩(wěn)定且該疾病在第8天已開始緩解。雖然眼底視力由于玻璃體炎的發(fā)展而部分被遮蔽，但是脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病仍保持明顯的病灶，同時(shí)其視神經(jīng)乳頭仍存在中度炎癥。該脈絡(luò)膜直到接種后第10天仍存在著充血。從接種后第4天至第10天這些動(dòng)物的玻璃體炎仍處于中度水平。在這些被治療的眼睛中該疾病的臨床感覺是該DHPG單一試劑治療組是所有治療組中改進(jìn)最大的組。在整個(gè)研究過程中，DHPG治療組與三個(gè)PALA單一試劑治療組相比，一直具有較輕的玻璃體炎(間接的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病程度)。由于該治療組的中度病癥發(fā)展成為嚴(yán)重的玻璃體炎，所以它與空白對(duì)照物治療組的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較是不可能的(對(duì)照組和DHPG治療組具有類似程度的玻璃體炎)。宰殺時(shí)，其肺正常。對(duì)樣品作常規(guī)的組織學(xué)處理，結(jié)果待定。
在接種后第12天沒有從任何脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜細(xì)胞聲波共同培養(yǎng)物中回收到HCMV?；厥詹坏紿CMV可能(且也許)直接與所選擇的回收HCMV的時(shí)間有關(guān)。
組＃8已接種HCMV的用空白對(duì)照物治療(空白對(duì)照物+EDTA)的動(dòng)物對(duì)用空白對(duì)照物治療的動(dòng)物從接種后第2天開始接收每日一次消毒鹽水+EDTA的注射，且持續(xù)到接種后第10天。用空白對(duì)照物治療的眼睛在接種后第2天形成了輕度脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜和玻璃體疾病。該疾病包括視網(wǎng)膜浸潤的病灶區(qū)、視神經(jīng)炎癥和紅腫以及輕度的玻璃體炎。該玻璃體炎包括玻璃體帶和周邊細(xì)胞浸潤物以及渾濁?？瞻讓?duì)照物治療沒有終止這些動(dòng)物身上的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病和玻璃體炎的發(fā)展。到接種后第4-5天，脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病加重且這些已感染HCMV的眼睛中正發(fā)展的玻璃體炎發(fā)展到嚴(yán)重水平，干擾了對(duì)脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病的全面評(píng)價(jià)，在接種后第5天，其玻璃體炎遮蔽了對(duì)視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜疾病的全面評(píng)價(jià)。
對(duì)用空白對(duì)照物治療的眼睛的初步組織學(xué)評(píng)價(jià)表明HCMV感染已從內(nèi)視網(wǎng)膜面發(fā)展到受光層。組織學(xué)結(jié)果證明了視網(wǎng)膜水腫面、混合細(xì)胞浸潤物和偶然的視網(wǎng)膜分離。視網(wǎng)膜HCMV疾病嚴(yán)重區(qū)域處于正常視網(wǎng)膜區(qū)的旁邊。組織學(xué)結(jié)果證實(shí)了脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜的中度和嚴(yán)重病狀。宰殺時(shí)，對(duì)肺的觀察表明在2只兔中有輕度到中度的乳濁和出血。還存在輕度至中度的水腫(充血)。
在接種后第12天沒有從任何脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜細(xì)胞聲波共同培養(yǎng)物中回收到HCMV。回收不到HCMV可能(且也許)直接與所選擇的回收HCMV的時(shí)間有關(guān)。
組合試劑PALA和DHPG靜脈注射治療組＃4從接種后第2天到第10天用高劑量PALA(50mg/kg)每日靜脈注射治療，同時(shí)靜脈注射高劑量DHPG(從接種后第2天到第10天每日10mg/kg分兩次施用)。
和組＃5從第2天到第10天用高劑量PALA(50mg/kg)每日靜脈注射治療，同時(shí)靜脈注射低劑量DHPG(從接種后第2天至第10天每日5mg/kg分兩次施用)。
用高劑量PALA(50mg/kg)和DHPG(10mg/kg)相結(jié)合每日靜脈注射治療[組＃4]或用高劑量PALA(50mg/kg)加上DHPG(5mg/kg，分兩次施用)每日靜脈注射治療(均從接種后第2天至第10天)對(duì)于減輕由HCMV誘發(fā)的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病的發(fā)展是沒有效的。事實(shí)上，玻璃體炎(HCMV病的間接測(cè)量手段)在這些結(jié)合治療組中比在單一試劑治療組、組合試劑治療組或空白對(duì)照物治療組中的疾病更嚴(yán)重。由HCMV誘發(fā)的疾病程度的加重可能是由這兩種化合物的對(duì)抗作用而引起的，具體地說50mg/kgPALA和10或5mg/kg的DHPG的對(duì)抗作用。在玻璃體炎發(fā)展成能遮蔽眼底視覺之前，該視神經(jīng)乳頭呈現(xiàn)出發(fā)紅且發(fā)炎變化特征(由HCMV誘發(fā)的疾病)。在接種后第10天，該視神經(jīng)乳頭的變化在那些其神經(jīng)乳頭可見的動(dòng)物身上已不再減少。根據(jù)在這些用高劑量PALA組合治療的眼睛中的由HCMV誘發(fā)的疾病的臨床感覺，組合治療的結(jié)果是其疾病比空白對(duì)照或在單一試劑治療組中的疾病更嚴(yán)重。雖然僅評(píng)價(jià)了8只眼睛(高劑量PALA組合治療組)，但該結(jié)合組呈現(xiàn)出是對(duì)抗性的(即，在組合組中的疾病比用50mg/kgUSNUS08或10mg/kgDHPG單一試劑的治療組更嚴(yán)重)。宰殺時(shí)肺病癥不明顯。對(duì)所選擇的樣品進(jìn)行組織學(xué)處理。
在接種后第12天沒有從任何脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜細(xì)胞聲波共同培養(yǎng)物中回收到HCMV?；厥詹坏紿CMV可能(且也許)直接與所選擇的回收HCMV的時(shí)間有關(guān)。
組＃6從第2天至第10天每日用低劑量PALA(20mg/kg)進(jìn)行靜脈注射治療，加上在接種后第2天至第10天以每日5mg/kg分兩次低劑量靜脈注射DHPG。
用每日低劑量PALA(20mg/kg)和每日低劑量DHPG(5mg/kg)的組合靜脈治療(組＃6)是最有效的組合試劑治療。這種組合在減輕玻璃體炎和視神經(jīng)乳頭變化方面比任何其它所評(píng)價(jià)的單一試劑或組合試劑的治療方式更為有效。這種組合試劑治療在整個(gè)治療過程中(接種后第2天至第10天)均超過所有其它的治療。事實(shí)上，在這種組合治療組中的玻璃體炎(間接的HCMV疾病的測(cè)試手段)并不比任何其它單一試劑治療組、組合試劑治療組或空白對(duì)照物治療組輕多少。在由HCMV誘發(fā)的疾病程度上的減輕可以解釋為兩種化合物的加和性(在這一結(jié)論能由統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果支持之前需要對(duì)其它的樣品進(jìn)行評(píng)價(jià))。在玻璃體炎發(fā)展到遮蔽眼底視覺之前，其視神經(jīng)乳頭呈現(xiàn)出中度紅腫和炎癥變化特征(由HCMV誘發(fā)的疾病)。在接種后第10天，視神經(jīng)乳頭的變化在那些神經(jīng)頭可看見的動(dòng)物中已減輕。根據(jù)在這些低劑量PALA組合治療的眼睛中中的對(duì)由HCMV誘發(fā)的疾病的臨床感覺，這種組合治療導(dǎo)致的疾病比在空白對(duì)照物治療組中的病癥或在單一試劑治療組中的病癥的嚴(yán)重程度低不了多少。宰殺時(shí)，肺部沒有明顯癥狀。對(duì)所選擇的樣品進(jìn)行組織學(xué)處理。
在接種后第12天，沒有從任何脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜細(xì)胞聲波共同培養(yǎng)物中回收到HCMV?；厥詹坏紿CMV可能(且也許)直接與所選擇的回收HCMV的時(shí)間有關(guān)。
3結(jié)論[1]在兔身上由HCMV誘發(fā)感染的過程中，當(dāng)PALA作為單一試劑時(shí)，其高劑量或低劑量的治療在減輕眼疾病的發(fā)展和進(jìn)程中是沒有效的(根據(jù)玻璃體炎和視神經(jīng)乳頭由HCMV誘發(fā)的變化)。用DHPG作單一試劑治療時(shí)，對(duì)于在兔身上減輕由HCMV誘發(fā)的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病的嚴(yán)重程度是有效的。高劑量PALA組合試劑的治療對(duì)于減緩眼睛由HCMV誘發(fā)的疾病的進(jìn)程是沒有效的。事實(shí)上，這些高劑量組合治療證明了一種對(duì)抗性抗病毒作用，它所造成的由HCMV誘發(fā)的眼疾病的嚴(yán)重程度比在其它單一的和組合試劑治療組中所觀察到的疾病更嚴(yán)重。用靜脈低劑量PALA和低劑量DHPG進(jìn)行組合試劑治療對(duì)于在這一模式中減輕由HCMV誘發(fā)的疾病的發(fā)展和嚴(yán)重程度是有效的。這種組合試劑的治療方式證明了一種附加的或協(xié)同的抗HCMV效果。
實(shí)例6在兔身上進(jìn)行PALA效果評(píng)價(jià)在治療后第3、4、5、和6天對(duì)其脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜中HCMV滴度的降低情況作精確分析來驗(yàn)證臨床單一和組合試劑的效果。
進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)是在兔模型中在感染HCMV之后通過比較臨床的、和組織病理學(xué)的由HCMV誘發(fā)的疾病的嚴(yán)重程度來證實(shí)PALA靜脈治療的效果。PALA靜脈治療結(jié)果通過治療過程中HCMV的回收情況評(píng)價(jià)。將從脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜聲波共同培養(yǎng)物中獲得的HCMV的滴度與DHPG和定向?qū)φ瘴锘厥盏味认啾容^。對(duì)高劑量PALA治療的單一試劑治療和與DHPG結(jié)合中的組合試劑治療結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)的。
1方法總共有41只著色的兔子用于這一研究。通過狹縫燈和間接檢眼鏡來評(píng)價(jià)這些動(dòng)物，以測(cè)定正常眼睛的形態(tài)和沒有原始病狀。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行如下處理[1]在第0天，所有動(dòng)物通過檢眼鏡進(jìn)行評(píng)價(jià)，以確保所有的后段(posteriorsegment)是正常的。在眼底檢查之后，動(dòng)物接受局部滴眼藥以擴(kuò)張瞳孔。局部滴眼藥治療每天都進(jìn)行，一直貫穿整個(gè)研究過程。在第0天，所有兔通過玻璃體內(nèi)(mid-vitreal)注射105PFU HCMV菌株AD169(100μl)來進(jìn)行接種。其它兔用非感染的Hs68單細(xì)胞層上清液進(jìn)行假接種。這些假接種的動(dòng)物用作靜脈治療組的對(duì)照物。這些動(dòng)物養(yǎng)在各自的籠子中，且對(duì)脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜HCMV疾病的發(fā)展進(jìn)行每日監(jiān)測(cè)。在接種后第2天，將接種HCMV的動(dòng)物分成組，每組有4-6只接種HCMV的兔子和一只假接種的兔子。已感染HCMV和假接種的兔如下所示接受靜脈治療每日單一試劑PALA靜脈治療組＃14只接種HCMV的動(dòng)物和1只假接種的動(dòng)物，在接種后2至10天靜脈注射高劑量PALA(50mg/kg)。共9次靜脈注射。
將這組動(dòng)物在進(jìn)行研究的這段時(shí)間中在接種后第3、4、5和6天宰殺，以評(píng)價(jià)HCMV回收量和滴度的降低情況。將眼睛摘除，并作處理以對(duì)細(xì)胞聲波物進(jìn)行HCMV回收。將假接種的動(dòng)物在接種后第12天宰殺，并用于對(duì)在靜脈治療之后PALA對(duì)視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的毒性作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。
組合試劑PALA和DHPG的靜脈治療滴度測(cè)定和臨床效果的證實(shí)。
組＃27只接種HCMV的動(dòng)物和1只假接種的動(dòng)物，在接種后第2天至10天靜脈注射高劑量PALA(50mg/kg)(共9次靜脈注射)加上從接種后第2至10天每天注射高劑量DHPG10mg/kg，分兩次用藥(總共18次靜脈注射)。
在這一治療組中，在接種后第3、4、5、和6天每天各宰殺一只動(dòng)物。摘出眼睛，并作處理從而通過細(xì)胞聲波處理物回收進(jìn)行HCMV回收，以測(cè)定HCMV的存在量和在脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜中的病毒的滴度。其余2只已感染HCMV的兔子和1只假接種的兔子到接種后第12天一直進(jìn)行評(píng)價(jià)。這些剩余的動(dòng)物用于證實(shí)PALA組合效果的臨床感覺，其證實(shí)方式如前面實(shí)例5中所述的那樣。
組＃36只接種HCMV的動(dòng)物和1只假接種的動(dòng)物，在接種后第2天至10天靜脈注射中等劑量PALA(25mg/kg)(共9次靜脈注射)加上從接種后第2至10天每日注射中等劑量的DHPG7.5mg/kg，分兩次用藥(共18次靜脈注射)。
在這一治療組中，在接種后第3、4、5和6天每天宰殺一只動(dòng)物。摘出眼睛，并作處理以通過細(xì)胞聲波處理回收HCMV，以測(cè)定HCMV的存在量和在脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜中的病毒的滴度。其余2只接種HCMV和1只假接種的兔子到接種后第12天一直用來進(jìn)行評(píng)價(jià)。這些剩余的動(dòng)物用于證實(shí)PALA組合效果的臨床感覺，其證實(shí)方式如前面實(shí)例5中所述的那樣，這些剩余的兔子還用于對(duì)最終狀態(tài)的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。
組＃46只接種HCMV的動(dòng)物和1只假接種的動(dòng)物，在接種后第2至10天靜脈注射低劑量PALA(10mg/kg)(共9次靜脈注射)加上從接種后第2至10天每日注射低劑量DHPG5mg/kg，分兩次用藥(共18次靜脈注射)。
在這一治療組中，從接種后第3、4、5、和6天每天宰殺一只動(dòng)物。摘出眼睛，并作處理以通過細(xì)胞聲波處理物回收HCMV，以測(cè)定HCMV的存在量和在脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜中的病毒的滴度。其余2只接種HCMV和1只假接種的兔子到接種后第12天一直用于進(jìn)行評(píng)價(jià)。這些剩余的動(dòng)物用于證實(shí)PALA組合效果的臨床感覺，其證實(shí)方式如前面實(shí)例5中所述的那樣。
單一試劑正負(fù)對(duì)照組＃56只接種HCMV的動(dòng)物，從接種后第2至10天每天靜脈注射DHPG10mg/kg，分兩次施藥。共18次靜脈注射。
在一段時(shí)間的研究過程中將這組動(dòng)物在接種后第3、4、5、和6天宰殺，以評(píng)價(jià)HCMV回收量和滴度的降低情況。將其摘除眼睛，并作處理以從視網(wǎng)膜的細(xì)胞聲波處理物中回收HCMV。將其余2只動(dòng)物在接種后第12天宰殺，以用于在靜脈治療后對(duì)PALA對(duì)視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的臨床作用過程進(jìn)行評(píng)價(jià)。
組＃66只接種HCMV的動(dòng)物，從接種后第2至10天靜脈注射消毒鹽水。
在一段時(shí)間的研究中將這組動(dòng)物在接種后第3、4、5、和6天宰殺，以評(píng)價(jià)HCMV的回收量和在視網(wǎng)膜的滴度的降低情況。摘除眼睛，并作處理以從細(xì)胞聲波處理物中回收HCMV。將其余2只動(dòng)物在接種后第12天宰殺，并用于在靜脈施藥后對(duì)PALA對(duì)視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的臨床作用過程進(jìn)行評(píng)價(jià)。所有動(dòng)物每日接受間接檢眼鏡檢查或用一個(gè)手持90屈光度透鏡進(jìn)行狹縫檢查，以評(píng)價(jià)臨床HCMV疾病的進(jìn)展(從接種后第2至10天)。通過兩個(gè)遮蔽(以便兔子接受治療)的讀出器進(jìn)行獨(dú)立的眼底檢查。將所有動(dòng)物在這段時(shí)間研究過程中宰殺以評(píng)價(jià)PALA單一的和組合試劑對(duì)HCMV滴度的降低作用，或在接種后第12天將其宰殺，以證實(shí)臨床過程PALA的治療效果。
對(duì)于所有經(jīng)過藥物處理的靜脈治療組，將其臨床的、病毒回收和組織效果結(jié)果在各組之間以及與空白對(duì)照物治療組之間相聯(lián)系起來。在整個(gè)效果評(píng)價(jià)過程中各個(gè)動(dòng)物的總結(jié)。
第1天所有動(dòng)物通過狹縫燈生物顯微鏡進(jìn)行初始評(píng)價(jià)以及眼底檢查。動(dòng)物編號(hào)從1到36;和S1-S5。將兔子立刻隨機(jī)地編進(jìn)各動(dòng)物組，以接受如下所述的靜脈治療組＃1兔＃1、2、3、4和假接種的兔S1-50mg/kgPALA。
組＃2兔＃5、6、7、8、9、10、11和1只假接種動(dòng)物＃S2-每日靜脈注射高劑量PALA(50mg/kg)和高劑量DHPG(10mg/kg/天)。
組＃3兔＃12、13、14、15、16、17和1只假接種動(dòng)物＃S3-每日靜脈注射中劑量PALA(25mg/kg)加上中劑量DHPG(7.5mg/kg/天)。
組＃4兔＃18、19、20、21、22、23和1只假接種動(dòng)物＃S4-每日靜脈注射低劑量PALA(10mg/kg)加上低劑量DHPG(5mg/kg/天)。
組＃5兔＃24、25、26、27、28、29和1只假接種動(dòng)物＃S5-每日靜脈注射高劑量DHPG(10mg/kg/天)。
組＃6兔＃30、31、32、33、34、35、和36-每日接受空白對(duì)照物靜脈治療(注射消毒鹽水)。
接種HCMV的并用單一和組合試劑治療的動(dòng)物的宰殺接種后第3天宰殺，并將得到的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜的細(xì)胞聲波處理物培養(yǎng)物進(jìn)行HCMV回收-組＃1兔＃1組＃2兔＃11組＃3兔＃16組＃4兔＃23組＃5兔＃28
組＃6兔＃34接種后第4天宰殺，并將得到的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜的細(xì)胞聲波處理物培養(yǎng)物進(jìn)行HCMV回收-組＃1兔＃2組＃2兔＃7組＃3兔＃12組＃4兔＃18組＃5兔＃24組＃6兔＃30接種后第5天宰殺，并將得到的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜的細(xì)胞聲波處理物培養(yǎng)物進(jìn)行HCMV回收-組＃1兔＃3組＃2兔＃8組＃3兔＃13組＃4兔＃19組＃5兔＃26組＃6兔＃31接種后第6天宰殺，并將得到的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜的細(xì)胞聲波處理物培養(yǎng)物進(jìn)行HCMV回收-組＃1兔＃4組＃2兔＃6組＃3兔＃14組＃4兔＃21組＃5兔＃27
組＃6兔＃33接種后第12天宰殺，并進(jìn)行組織處理以便進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)或從脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜聲波處理物培養(yǎng)物中進(jìn)行培養(yǎng)物HCMV回收。通過間接檢眼鏡對(duì)在效果評(píng)價(jià)結(jié)束時(shí)宰殺的動(dòng)物每日進(jìn)行觀察。將這些動(dòng)物中的HCMV疾病的臨床感覺用于構(gòu)建在本申請(qǐng)中圖示所表明的玻璃體炎和脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病的曲線圖。在評(píng)價(jià)結(jié)束時(shí)所宰殺的動(dòng)物包括組＃1沒有感染HCMV的兔子，S1組＃2兔＃9、10、S2組＃3兔＃15、17、S3組＃4兔＃20、22、S4組＃5兔＃25、29、S5組＃6兔＃32、35、36臨床疾病感覺玻璃體炎和脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病的發(fā)展圖6和圖7對(duì)在靜脈組合試劑和單一試劑治療組中的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎的發(fā)展和玻璃體炎的發(fā)展的數(shù)據(jù)進(jìn)行了總結(jié)。脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病的發(fā)展由于玻璃體炎的發(fā)展在接種后第5-8天被部分地遮蔽了，這在前面效果評(píng)價(jià)中已證明了。對(duì)于接種后這些天的平均記錄是以臨床感覺和前幾天眼底檢查的評(píng)價(jià)結(jié)果為根據(jù)的。
表8、9、10、和11總結(jié)了臨床玻璃體炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎和視神經(jīng)乳頭評(píng)分以及從治療組在接種后第3、4、5和6天所得到的2只眼睛中的HCMV的回收量。
2結(jié)果單一試劑PALA靜脈治療組＃1PALA單一試劑治療50mg/kg/天在這一治療組中所有兔子在研究HCMV回收的時(shí)間過程中被宰殺。在這一單一試劑治療組中沒有動(dòng)物連續(xù)地經(jīng)過整個(gè)靜脈治療過程而被評(píng)價(jià)。經(jīng)過假接種PALA50mg/kg/天治療的動(dòng)物，＃S1，在研究的過程中沒有得任何玻璃體炎也沒有脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病。
在這一單一試劑治療組中通過細(xì)胞聲波處理試驗(yàn)的HCMV回收結(jié)果證明在接種后第3、4、5和6天在脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜中存在病毒，HCMV在培養(yǎng)物樣品中的滴度在接種后第3天達(dá)到最高，從其樣品中平均回收到104pfuHCMV。HCMV是從在該時(shí)間段的評(píng)價(jià)中所宰殺的動(dòng)物的兩眼中回收的。HCMV滴度在整個(gè)恢復(fù)過程中是降低的，因此在接種后第6天在培養(yǎng)物中僅檢測(cè)到平均101pfoHCMV。HCMV在這一單一試劑治療組中的回收情況比在空白對(duì)照物處理組中的要好，但是在這個(gè)組中HCMV的滴度比其它組合試劑或單一試劑DHPG治療組更高。
組＃2組合試劑PALA(50mg/kg/天)加上DHPG(10mg/kg/天)臨床疾病(玻璃體炎和脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病)在這一高劑量PALA加上高劑量DHPG治療組中最輕。玻璃體炎(對(duì)脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜HCMV病狀的間接測(cè)量手段)在除了接種后第5天外的所有天中都與單一試劑DHPG的治療相當(dāng)。在這一高劑量治療組合組中的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病當(dāng)與單一試劑DHPG治療組相比較時(shí)可能具有一種附加的作用效果。這一高劑量組合組比其它PALA加DHPG治療組顯著地更好，且比空白對(duì)照物治療明顯地更好。在這個(gè)組中視神經(jīng)炎在接種后的所有天中都是輕的。在這一組中的平均神經(jīng)炎評(píng)分比所有其他組合試劑和單一試劑治療組更好。這個(gè)觀察結(jié)果是重要的且證明這一治療方式與其它結(jié)合和單一試劑的治療相比具有優(yōu)選。在這一HCMV感染模型中的視神經(jīng)乳頭變化是對(duì)脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病的發(fā)展和由HCMV誘發(fā)的病下的一種可靠的測(cè)定和評(píng)價(jià)手段。
在這一高劑量組合試劑治療組中通過細(xì)胞聲波處理試驗(yàn)的HCMV回收結(jié)果表明僅在接種后第3和4天在脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜中存在病毒。雖然在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上在每個(gè)組中僅處理2個(gè)樣品，但在第5和6天沒有病毒被回收到的事實(shí)是有意義的。在培養(yǎng)物樣品中HCMV滴度在接種后第3天達(dá)到最高，此時(shí)從樣品中平均回收到103.5pfuHCMV。從在該段評(píng)價(jià)時(shí)間中在接種后第3天殺的動(dòng)物(接種并經(jīng)藥物治療的動(dòng)物)的雙眼中回收HCMV。在接種后第4天，2只眼睛中僅有一只通過培養(yǎng)物表明其中存在HCMV。在這個(gè)脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜的樣品中的HCMV滴度是101pfuHCMV。這種從接種后第3至4天HCMV滴度的戲劇性降低表明這種組合試劑治療方式可能存在附加的反應(yīng)。在接種后第4天之后在這一組合試劑治療組中從脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜樣品里沒有回收到HCMV。在這一高劑量組合試劑治療組中HCMV回收比在用空白對(duì)照物治療的眼睛中的回收更好，且比在早期用PALA加DHPG組合治療組中的HCMV的回收要好(頻率和HCMV滴度)。在這一組中HCMV滴度的降低比其它組合試劑治療組更好，且顯示出與在單一試劑DHPG治療組中所觀察的HCMV滴度的降低一樣好。
組＃3組合試劑PALA(25mg/kg/天)加上DHPG(7.5mg/kg/天)[中等劑量組合治療]和組＃4組合試劑PALA(25mg/kg/天)加上DHPG(5mg/kg/天)[低劑量組合治療]。
臨床疾病(玻璃體炎和脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病)在中等劑量和低劑量PALA加中劑量DHPG治療組中是中度的。在這些組合試劑治療組中的玻璃體炎的評(píng)分與高劑量組合或單一試劑DHPG治療組相比沒有改進(jìn)。玻璃體炎在中等劑量組合治療組中在第10天還較嚴(yán)重。脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病的分析結(jié)果表明在接種后第10天在這兩個(gè)組合治療組中該疾病處于中度水平，而且視網(wǎng)膜病狀清晰可見。在這些組合治療組中平均脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜和玻璃體疾病比在高劑量組合劑治療組中更嚴(yán)重。在中等劑量治療組中疾病的進(jìn)展與在低劑量組合治療組中的疾病狀態(tài)沒有不同。玻璃體炎和脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病在這兩個(gè)組合組中呈現(xiàn)出中度水平。在中等劑量和低劑量組合治療組中，玻璃體炎和脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病比在高劑量組合和DHPG單一試劑治療組中更嚴(yán)重。視神經(jīng)炎和視神經(jīng)乳頭變化在這兩個(gè)中等劑量和低劑量治療組中存在于整個(gè)研究過程中。兩個(gè)組合治療組均表明中度的視神經(jīng)乳頭神經(jīng)炎和病癥。在這些組中視神經(jīng)乳頭變化與單一試劑DHPG治療組或空白對(duì)照物治療組沒有不同。在這些組中視神經(jīng)乳頭變化與高劑量組合試劑治療組相比更差。
在這些組合治療組中從脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜細(xì)胞聲波處理培養(yǎng)物中的HCMV回收介于空白對(duì)照物HCMV回收和單一試劑DHPGHCMV回收之間。在中等劑量回收組中，在接種后第3、4、和6天從聲波處理培養(yǎng)物中回收HCMV。滴度從接種后第3天的平均104降低到第6天的平均101。HCMV的回收量比在空白對(duì)照物治療組中的回收量更少。HCMV回收在中等劑量組中沒有象在高劑量組合治療組或單一劑DHPG治療組中降低得那樣快。
在低劑量組合試劑組中從脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜細(xì)胞聲波處理培養(yǎng)物中的HCMV的回收量與中等劑量治療組相當(dāng)。與在空白對(duì)照物組中或單一試劑PALA治療組中相比，在這一低劑量結(jié)合治療組中在第4、5、6天只有幾個(gè)脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜樣品是陽性的。在這一低劑量治療組中HCMV的滴度和回收頻率與中等劑量組合HCMV治療組的回收頻率和HCMV滴度相類似。
在中劑量和低劑量結(jié)合治療組上進(jìn)行組織解剖。該組織解剖總結(jié)如下。
中等劑量PALA加DHPG治療。在這一中等劑量組合治療組中該組織學(xué)結(jié)果表明在視網(wǎng)膜和靠近該視網(wǎng)膜的玻璃體中混合的細(xì)胞浸潤物發(fā)生輕度到中度的聚積。視網(wǎng)膜的破壞呈局部病灶具有水腫、壞死以及整個(gè)視網(wǎng)膜厚度消失明。脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜中度充血和水腫，視神經(jīng)乳頭變化包括該神經(jīng)發(fā)生病灶浸潤和在玻璃體內(nèi)界面處聚積混合細(xì)胞浸潤物。該病癥在這一樣品中是值得注意的。若與實(shí)例5中所表明的病癥相比較，該病癥比在高劑量PALA加DHPG治療組和在單一劑治療組中所看見的病癥更為嚴(yán)重。在這一中等劑量組合治療組中的病癥與在經(jīng)過空白對(duì)照物治療的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜樣品(實(shí)例5)中所看到的嚴(yán)重程度是不一樣的。
低劑量PALA加DHPG治療。玻璃體炎在這一樣品中為中度嚴(yán)重。脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病癥僅限于由正常視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜分開的免疫細(xì)胞浸潤作用的孤立區(qū)域。在涉及HCMV反應(yīng)的區(qū)域內(nèi)，該視網(wǎng)膜表現(xiàn)出水腫、免疫性細(xì)胞浸潤作用、壞死以及正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)的缺損。在脈絡(luò)管和常見的脈絡(luò)膜炎區(qū)域明顯充血腫脹的同時(shí)該脈絡(luò)膜嚴(yán)重地充血。在這一低劑量組合治療組中的病癥與在中等劑量治療組中的病癥相類似。該病癥比在高劑量PALA加DHPG組合治療組和在DHPG單一試劑治療組中的病癥更嚴(yán)重且分布面更廣。
組＃5單一試劑DHPG(10mg/kg/天)。
在這一單一試劑治療組中的動(dòng)物在接種后第2天開始接受DHPG治療，并一直持續(xù)到接種后第10天。每天10mg/kg的DHPG治療分成兩次施用。如在實(shí)例5中所證明的那樣，DHPG治療確實(shí)可減輕HCMV脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜感染和疾病以及玻璃體炎的發(fā)展。脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病仍保持病灶，其視神經(jīng)乳頭中度發(fā)炎并有中度免疫細(xì)胞浸潤。該脈絡(luò)膜存在中度充血。在這些經(jīng)過治療的眼睛中疾病的臨床感覺與高劑量PALA加DHPG組合治療組相類似。在這一單一試劑組中的HCMV疾病比中劑量和低劑量組合治療組中更好，且比空白對(duì)照物治療組更好。在該單一試劑DHPG治療組中的臨床疾病與高劑量PALA組合治療組相類似。事實(shí)上，該高劑量組合治療方式可能比該單一試劑DHPG的治療稍微更好一些，因此顯示出這兩個(gè)靜脈治療組的一個(gè)附加效果。
從細(xì)胞聲波處理培養(yǎng)物中的HCMV回收結(jié)果表明HCMV回收率和從該樣品中回收的HCMV的滴度出現(xiàn)了快速下降。在接種后第3天，在這一治療組中從這兩個(gè)脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜中均回收到了HCMV。HCMV的滴度測(cè)定為103pfu。在接種后第4天，HCMV回收值已降低至101滴度，且僅在2個(gè)脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜樣品中的1個(gè)中較明顯。在接種后第5天沒有回收到HCMV，然而在接種后第6天從一個(gè)脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜樣品中回收到一個(gè)較低的滴度(為101)。該HCMV回收頻率和HCMV滴度的降低比中等劑量和低劑量組合治療組和單一劑量試劑PALA組以及空白對(duì)照物治療組要好。HCMV回收的方式與高劑量組合治療組沒有不同。
組＃6空白對(duì)照物治療。
接受空白對(duì)照物治療的動(dòng)物在接種后第2天開始接受消毒鹽水+EDTA，每天注射一次，并持續(xù)到接種后第10天。經(jīng)過空白對(duì)照物治療的眼睛產(chǎn)生了輕度到中度的玻璃體炎。在該空白對(duì)照物治療組中的玻璃體炎與在其它單一試劑和組合試劑治療組中的嚴(yán)重程度不一樣。在這些經(jīng)過空白對(duì)照物治療的眼睛中的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病比其它治療組明顯地要差。病灶性視網(wǎng)膜靜脈出血和內(nèi)視網(wǎng)膜出血是常見的。HCMV疾病的病灶面很大且導(dǎo)致了平均評(píng)分為1.5至2+的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病。該疾病包括局部區(qū)域的視網(wǎng)膜浸潤病灶、視神經(jīng)炎癥和紅腫以及輕度玻璃體炎。玻璃體炎包括具有周邊細(xì)胞浸潤物的玻璃體條、細(xì)胞凝塊和混濁?？瞻讓?duì)照劑治療不能終止脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜的發(fā)展。在用空白對(duì)照物治療的眼睛中視神經(jīng)炎和炎癥的平均水平與其它治療組相當(dāng)。
從空白對(duì)照物治療組中HCMV回收結(jié)果表明在接種后第3-6天的HCMV回收量在該評(píng)價(jià)過程中其滴度從104降至102?？瞻讓?duì)照物治療組與其它治療組比較具有最高的滴度回收值。
3結(jié)論[1]使用高劑量PALA加DHPG的組合試劑治療要優(yōu)于所有其它組合試劑治療。事實(shí)上，這一高劑量治療與單獨(dú)的DHPG治療相比具有一種附加的抗病毒作用效果。從所有治療組中在分析過程中均回收到HCMV?；厥疹l率(如，呈陽性HCMV的病毒回收樣品的數(shù)量)的差異隨著治療后時(shí)間的增加而減少。很明顯從脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜的聲波處理樣品中所回收的病毒的滴度也隨著接種后時(shí)間的增加而降低。HCMV回收值和HCMV滴度的降低與兔子所接受的治療有關(guān)。組合試劑高劑量PALA加DHPG(治療組＃2)對(duì)于減輕臨床疾病和降低在脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜培養(yǎng)物中的HCMV回收值是最有效的組合試劑治療。這種組合治療與單一試劑DHPG的治療一樣好。這種組合試劑治療與單一試劑DHPG治療相比具有一種附加的抗病毒作用。在降低HCMV回收值方面，組合試劑和單一試劑治療組的效果排列為高劑量組合劑PALA加DHPG(組＃2)≈單一試劑DHPGDHPG(組＃5)＞＞中等劑量組合試劑PALA加DHPG(組＃3)＞低劑量組合試劑PALA加DHPG(組＃4)＞單一試劑PALA(組＃1)＞空白對(duì)照物(組＃6)。高劑量PALA加DHPG的組合治療對(duì)于保持視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)是最有效的(opthalmologically)且通過最終的組織病理學(xué)可證實(shí)(結(jié)果未示出)。
表9對(duì)用單一和組合試劑靜脈內(nèi)治療的動(dòng)物的視神經(jīng)炎評(píng)分視神經(jīng)炎評(píng)分10/1910/2010/2110/2210/2310/263456710組號(hào)動(dòng)物ONHONHONHONHONHONH29NR2220.52 10 2*2 4 4 5 1.52S22000000315NRNR4433317NR24NR623S30000004202NR22NR3422NRNR22624S4000000525NRNR43335292NR51635S5000000635015633636NR44NRNR4ONH-視神經(jīng)乳頭;NR-未讀出;＊評(píng)分代表每只兔子的兩只眼中的視神經(jīng)乳頭變化(視神經(jīng)炎)之和。
表10在接種后第3-6天由脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜細(xì)胞聲處理培養(yǎng)物中回收的HCMV宰殺的天數(shù)動(dòng)物數(shù)量回收的HCMVHCMV滴度ODOSODOS3 1 + + 1041043 11 + + 1031033 19 + - 104---3 23 + + 1021043 28 + + 1031033 34 + - 104-105---4 2 + + 1031024 7 - + --- 1014 12 + - 102---4 18 - + --- 1034 24 + - 101---4 30 + + 1031035 3 + + 10110258--------513--------519--------526--------5 31 - - --- 1026 4 + + 10110166--------6 14 - + --- 1016 21 + - 101---6 27 + - 101---6 33 - + --- 102培養(yǎng)物代表在靜脈內(nèi)治療期間的HCMV細(xì)胞聲處理培養(yǎng)物，將培養(yǎng)物放在12井中，將所有的陰性培養(yǎng)物在黑暗中傳代培養(yǎng)4次，共28天，在確定培養(yǎng)物中存在HCMV(陰性)之后利用標(biāo)準(zhǔn)噬菌斑試驗(yàn)確定陽性培養(yǎng)物中的HCMV滴度表11由單一和組合試劑治療組回收的HCMV由脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜培養(yǎng)物回收的HCMV的平均滴度接種后天數(shù)治療組3456組 #1 2/2*; 2/2; 2/2; 2/2; 104**102.5101.5101組 #2 2/2; 103.51/2; 0/2 0/2[50mg/kg/天PALA 加 10110mg/kg/天DHPG]Gro組 #3 1/2; 1041/2; 0/2 1/2;組 #4 2/2; 1031/2; 0/2 1/2;組 #5 2/2; 1031/2; 0/2 1/2; 101101組 #6 2/2; 104.52/2; 1/2; 1/2; 103102102例7兔體內(nèi)PALA上升劑量效能的評(píng)價(jià)，在評(píng)價(jià)過程中的臨床和HCMV回收情況。
通過對(duì)比臨床HCMV疾病、由細(xì)胞聲處理培養(yǎng)中回收的HCMV、和由HCMV誘導(dǎo)的組織病理學(xué)上疾病嚴(yán)重程度采用這些實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)在兔模型中感染HCMV后，上升劑量靜脈治療研究中PALA的效能。將由脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜聲處理共同培養(yǎng)物得到的HCMV滴度與用DHPG和空白對(duì)照物治療的動(dòng)物中回收的HCMV滴度作對(duì)比。
方法用于本研究的總共有60只染色的兔子，用狹縫燈和間接檢眼鏡評(píng)價(jià)動(dòng)物，以確定正常眼的形態(tài)和預(yù)先沒有病狀。
動(dòng)物的處理方式如下[1]0天時(shí)，所有的動(dòng)物都經(jīng)間接檢眼鏡評(píng)價(jià)，確保后段是正常的。在眼底檢查之后使動(dòng)物接受局部眼藥水使瞳孔放大。每日進(jìn)行局部眼藥水療法自接種后持續(xù)10天。0天時(shí)，所有的兔子都通過玻璃體(vitreal)注射100μl的105PFU HCMV菌株AD169進(jìn)行接種。將動(dòng)物保存在各個(gè)籠子內(nèi)并每日監(jiān)測(cè)發(fā)展的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜HCMV病。接種后第2天，將接種HCMV的動(dòng)物按每10只接種HCMV的兔子加1只假接種的兔子分為1組。感染HCMV的和假接種的兔子接受如下所述的靜脈治療單一試劑PALA上升劑量靜脈治療組＃110只接種HCMV的兔子，在接種后第2-10天靜脈注射PALA(50mg/kg)。每只兔子總共靜脈內(nèi)注射9次。
將這組兔子在研究過程中，于接種后第3、4、5和6天殺死，以評(píng)價(jià)HCMV回收和滴度的降低。取出兩只兔子(4只眼睛)并作處理從而在接種后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)從細(xì)胞聲處理物中回收HCMV。剩余的2只動(dòng)物接著進(jìn)行為期9天的療程。
組＃210只接種HCMV的兔子，在接種后第2-10天靜脈注射PALA(75mg/kg)。每只兔子Ⅳ注射9次。
將這組兔子在研究過程中，接種后第3、4、5和6天處死，以評(píng)價(jià)HCMV回收和滴度的降低。取出兩只動(dòng)物(4只眼睛)并作處理從而從聲處理細(xì)胞中在接種后每個(gè)時(shí)間點(diǎn)回收HCMV。剩余的2只動(dòng)物接著進(jìn)行為期9天的療程。
組＃310只接種過HCMV的兔子，在接種后第2-10天靜脈注射PALA(100mg/kg)。每只兔子靜脈內(nèi)注射9次。
將這組動(dòng)物在研究過程中在接種后3、4、5和6天處死，以評(píng)價(jià)HCMV的回收和滴度。取出兩只兔子(4只眼睛)并處理從而從聲處理細(xì)胞中在接種后每個(gè)時(shí)間點(diǎn)回收HCMV。剩余的2只兔子接著做為期9天的療程。
組合試劑PALA加地塞米松結(jié)膜下治療組＃410只兔子在HCMV接種前1小時(shí)，接受4mg的結(jié)膜下depo地塞米松。兔子接受靜脈注射PALA(接種后2-10天75mg/kg/天)。
將這組動(dòng)物在研究過程中在接種后第3、4、5和6天處死，以評(píng)價(jià)HCMV回收和滴度的降低。取出兩只動(dòng)物(4只眼睛)并處理從而從聲處理細(xì)胞中在接種后每個(gè)時(shí)間點(diǎn)回收HCMV。剩余2只兔子隨后進(jìn)行為期9天的療程。
正和負(fù)對(duì)比物治療組組＃510只接種HCMV的動(dòng)物，在接種后第2-10天按10mg/kg/天的劑量分兩次靜脈注射。
將這一組的動(dòng)物在研究過程中，在接種后第3、4、5和6天處死，以評(píng)價(jià)HCMV的回收和滴度降低情況。取出兩只動(dòng)物(4只眼)并作處理從而從聲處理細(xì)胞中、在接種后每個(gè)時(shí)間點(diǎn)回收HCMV。剩余2只動(dòng)物接著進(jìn)行為期9天的療程。
組＃610只接種HCMV的動(dòng)物，在接種后第2-10天靜脈注射消毒鹽水。
將這組在研究過程中，在接種后第3、4、5和6天處死，以評(píng)價(jià)從視網(wǎng)膜中的回收HCMV和滴度降低。取出兩只動(dòng)物(4只眼睛)并作處理從而從聲處理細(xì)胞中在接種后每個(gè)時(shí)間點(diǎn)回收HCMV。剩余的2只動(dòng)物接著作為期9天的療程。所有的動(dòng)物每天接受間接檢眼鏡的檢查或用手持+90屈光度棱鏡的狹縫燈檢查，以評(píng)價(jià)臨床HCMV病的進(jìn)展(接種后第2-10天)。由兩個(gè)偽裝起來的讀數(shù)器獨(dú)立完成眼底檢查，使兔子接受治療。所有兔子或在研究過程中在接種后第3、4、5和6天處死，以評(píng)價(jià)PALA單一試劑對(duì)HCMV滴度降低的影響，或者在接種后第2天從組織學(xué)上證實(shí)臨床過程PALA的療效。
將由所有經(jīng)過藥物處理的靜脈治療組得到的臨床、病毒回收和組織效能結(jié)果彼此之間和空白對(duì)照物治療組之間相互聯(lián)系進(jìn)來。
概括說明在整個(gè)上升劑量效果評(píng)價(jià)過程中的各個(gè)兔子。
第0天，所有的兔子通過狹縫燈生物顯微鏡和眼底檢查作預(yù)評(píng)價(jià)。動(dòng)物編號(hào)1-60;和S1-S3。在預(yù)檢查之后，立即對(duì)動(dòng)物進(jìn)行HCMV玻璃體內(nèi)(intrvitresl)注射接種。在按將兔子隨機(jī)分成幾個(gè)組第1天，動(dòng)物按下列指示接受靜脈治療(從1天-10天)組＃1兔子＃1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和假接種兔S1-50mg/kgPALA。
組＃2兔子＃11、12、13、14、15、16、17、18、19、20和1只假接種動(dòng)物＃S2-每日接受靜脈注射75mg/kgPALA。
組＃3兔子＃21、22、23、24、25、26、27、28、29、30和1只假接種動(dòng)物＃S3-每日接受靜脈注射100mg/kgPALA。
組＃4兔子＃31、32、33、34、35、36、37、38、39、和40在接種單一結(jié)膜下注射4mg醋酸6-甲強(qiáng)的松龍(depomedrol)(甾族化合物)后立即接種HCMV。然后使這些動(dòng)物每日接受75mg/kgPALA的靜脈治療。
組＃5兔子＃41、42、43、44、45、46、47、48、49和50每日接受DHPG(10mg/kg/天)的靜脈治療。
組＃6兔子＃51、52、53、54、55、56、57、58、59和60每日接受空白對(duì)照物的靜脈治療(消毒鹽水加EDTA注射液)。
接種HCMV且經(jīng)過單一試劑處理的動(dòng)物的宰殺接種后第3天為回收HCMV而將下列動(dòng)物殺死并進(jìn)行脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜細(xì)胞聲處理培養(yǎng)組＃1兔子＃1和2組＃2兔子＃11和12組＃3兔子＃21和22組＃4兔子＃31和32組＃5兔子＃41和42組＃6兔子＃51和52接種后第4天為回收HCMV而將下列動(dòng)物殺死并進(jìn)行脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜細(xì)胞聲處理培養(yǎng)組＃1兔子＃3和4組＃2兔子＃13和14
組＃3兔子＃23和24組＃4兔子＃33和34組＃5兔子＃43和44組＃6兔子＃53和54接種后第5天為回收HCMV而將下列動(dòng)物殺死并進(jìn)行脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜細(xì)胞聲處理培養(yǎng)組＃1兔子＃5和6組＃2兔子＃15和16組＃3兔子＃25和26組＃4兔子＃35和36組＃5兔子＃45和46組＃6兔子＃55和56接種后第6天為回收HCMV而將下列動(dòng)物殺死并進(jìn)行脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜細(xì)胞聲處理培養(yǎng)組＃1兔子＃7和8組＃2兔子＃17和18組＃3兔子＃27和28組＃4兔子＃37和38組＃5兔子＃47和48組＃6兔子＃57和58接種后第12天為了進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)或?yàn)榱藦拿}絡(luò)膜視網(wǎng)膜細(xì)胞聲處理培養(yǎng)物中回收培養(yǎng)的HCMV，將動(dòng)物處死并處理其組織。在效果評(píng)價(jià)結(jié)束時(shí)處死的動(dòng)物每天用間接檢眼鏡進(jìn)行觀察。將這些動(dòng)物HCMV病的臨床印象用于構(gòu)建玻璃體-視網(wǎng)膜病曲線(在本文中圖示證明的)，評(píng)價(jià)結(jié)束時(shí)處死的動(dòng)物包括臨床疾病印象玻璃體炎和脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病的發(fā)展圖9和10概述了在靜脈單一試劑組中有關(guān)玻璃體視網(wǎng)膜疾病的發(fā)展數(shù)據(jù)。脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病的發(fā)展由于40%的眼睛在接種后4-5天內(nèi)的玻璃體炎的發(fā)展而部分變得模糊不清。條形圖表明了在上升劑量PALA治療的和對(duì)比物治療的動(dòng)物中玻璃體-視網(wǎng)膜病程的趨勢(shì)。
表12、13、14和15概述了在接種后第3、4、5和6天從4只眼睛/治療組得到的有關(guān)玻璃體炎和視神經(jīng)乳頭疾病嚴(yán)重程度和回收HCMV的原始數(shù)據(jù)。
結(jié)果單一試劑PALA靜脈治療組＃1PALA單一試劑治療，50mg/kg/天將本治療組中的兔子＃1-8在HCMV回收研究過程中處死。隨后對(duì)50mg/kg/天單一試劑治療組中的動(dòng)物＃9和10在整個(gè)靜脈治療過程中進(jìn)行評(píng)價(jià)。到接種后第6天，臨床疾病表明玻璃體炎增強(qiáng)了。接種后第7天，玻璃體炎(炎癥反應(yīng))降至低水平。這種觀測(cè)與先前對(duì)單一試劑50mg/kg/天PALA治療中玻璃體炎病情發(fā)展的觀測(cè)結(jié)果相類似。視神經(jīng)乳頭病的嚴(yán)重程度也與以前報(bào)導(dǎo)的50mg/kg/天治療眼睛的相類似。在本項(xiàng)研究中，視神經(jīng)乳頭病狀在接種后第4天達(dá)到峰值，在研究的其余過程中降至低水平。
通過單一試劑治療組的細(xì)胞聲處理試驗(yàn)回收的HCMV結(jié)果表明在接種后第3、4、5和6天脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜中存在著病毒。培養(yǎng)樣品中的HCMV滴度最高是在接種后第3天，當(dāng)時(shí)由4種脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜細(xì)胞聲處理樣品回收的HCMV平均值為103.5pfu。接種后第4和5天，由處理過的眼睛回收HCMV的頻率下降。當(dāng)從4/4脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜細(xì)胞聲處理樣品回收HCMV時(shí)，可以看到在接種后第6天，病毒回收量(HCMV回收頻率)回縮。當(dāng)可以看到HCMV滴度輕微回縮至102pfu/ml時(shí)，除接種后第6天以外，整個(gè)回收過程中的HCMV滴度都在下降。在該單一試劑治療組中的HCMV回收，較從經(jīng)空白對(duì)照物處理的眼睛中的回收要好，而且與經(jīng)DHPG處理過的眼睛相當(dāng)。(用DHPG處理過的眼睛具有稍低的HCMV滴度而且在回收研究中，幾乎沒有陽性的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜樣品)。
假接種的且經(jīng)過PALA50mg/kg/天處理的動(dòng)物，＃S1，在研究的過程中出現(xiàn)了輕微的玻璃體炎。接種后第7天，50mg/kg/天假接種動(dòng)物的玻璃體炎水平為0.5-0.75。
組＃2PALA單一試劑治療，75mg/kg/天將該治療組中的兔子＃11-18，在HCMV回收研究過程中處死。隨后對(duì)75mg/kg/天單一試劑治療組中的動(dòng)物＃19和20在整個(gè)靜脈治療過程中進(jìn)行評(píng)價(jià)。到接種后第6天，臨床疾病表明為玻璃體炎增強(qiáng)了。在接種后第7天，玻璃體炎(炎癥反應(yīng))仍然在增加。視神經(jīng)乳頭疾病的嚴(yán)重程度與以前報(bào)導(dǎo)的50mg/kg/天治療眼睛的相類似。視神經(jīng)乳頭病狀在接種后第4天達(dá)到峰值而后迅速下降。在接種后第7天，根據(jù)臨床評(píng)價(jià)，沒有明顯的視神經(jīng)乳頭變化。假接種的且經(jīng)過PALA50mg/kg/天處理的動(dòng)物，＃S1，在研究的過程中沒有發(fā)生任何的玻璃體炎，也沒有發(fā)生脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病。
通過該單一試劑治療組的細(xì)胞聲處理試驗(yàn)回收的HCMV結(jié)果證明接種后第3、4、5和6天，在脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜中有病毒存在。接種后第3天和4天，培養(yǎng)樣品的HCMV滴度達(dá)到最高，當(dāng)時(shí)在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)從脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜細(xì)胞聲處理樣品中回收的HCMV平均為104.5103.75pfu。接種后第5天，HCMV滴度降至低水平。在接種后第4和5天，由處理過的眼睛回收HCMV的頻率下降。然而，從中回收病毒的樣品數(shù)量在接種后第6天增加，這說明在50mg/kg/天治療組中出現(xiàn)了回縮。在75mg/kg/天治療組中在接種后第6天，有3/4的樣品對(duì)通過細(xì)胞聲處理回收的HCMV呈陽性。在該單一試劑PALA處理組HCMV回收頻率的增加是可重復(fù)的。在該單一試劑治療組中的HCMV回收與空白對(duì)照物治療組相當(dāng)。該單一試劑治療組在降低HCMV滴度和降低HCMV回收頻率方面的效果不如DHPG，所述HCMV是從脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜組織回收的。
組＃3PALA單一試劑治療組，100mg/kg/天將這一治療組中的兔子＃21-28，在HCMV回收研究過程中處死。隨后對(duì)100mg/kg/天單藥劑治療組的兔子＃29和30，在整個(gè)靜脈療法過程中進(jìn)行評(píng)價(jià)。在整個(gè)研究過程中，臨床疾病證明玻璃體炎增強(qiáng)了。在接種后第7天，玻璃體炎(發(fā)炎反應(yīng))仍保持增強(qiáng)，并且與75mg/kg/天組所觀測(cè)到的玻璃體炎相當(dāng)。視神經(jīng)乳頭病狀在接種后第4天達(dá)到峰值。到接種后第7天，根據(jù)臨床評(píng)價(jià)，視神經(jīng)乳頭變化呈中等程度到高等程度，癥狀很明顯。玻璃體炎和視神經(jīng)乳頭疾病的嚴(yán)重程度與其它單一試劑PALA、DHPG和空白對(duì)照物治療相比增加了。100mg/kg/天的劑量可能是該化合物的毒性界限或稍微高予該毒性極限。但值得注意的事實(shí)是經(jīng)100mg/kg/天處理的HCMV病沒有取得改進(jìn)。有關(guān)上升劑量允許值的這些結(jié)果證明PALA在這樣高的濃度是不能忍受的。事實(shí)上，100mg/kg/day劑量對(duì)動(dòng)物是有毒的。
假接種的且經(jīng)過PALA/kg/天處理的動(dòng)物，＃3，在接種后第5-7天，發(fā)生中等的玻璃體炎和暫時(shí)性的視神經(jīng)乳頭變化。這些結(jié)果證明100mg/kg/天療法是在毒性范圍內(nèi)的。
在該單一試劑治療組中通過細(xì)胞聲處理試驗(yàn)回收的HCMV結(jié)果證明在接種后第3、4、5和6天脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜內(nèi)存在著病毒。培養(yǎng)樣品中的HCMV滴度在接種后第3天是最高的，當(dāng)時(shí)由脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜細(xì)胞聲處理樣品中回收的HCMV平均為104pfu。在接種后第5天，HCMV滴度降至很低的回收水平(102pfu/ml)。最重要的是，由處理過的眼睛回收HCMV的頻率在接種后第4和5天出現(xiàn)下降。然而，在接種后第6天，由脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜細(xì)胞聲處理培養(yǎng)回收的HCMV滴度出現(xiàn)上升同時(shí)陽性培養(yǎng)物的數(shù)量(例如，由細(xì)胞聲處理樣品的HCMV回收頻率)也在增加。在接種后第6天，在100mg/kg/天治療組中，對(duì)于由細(xì)胞聲處理回收的HCMV有3/4的樣品呈陽性。HCMV滴度增加到與接種后第3天HCMV回收滴度相同的水平。在這種單一試劑治療組中HCMV回收顯著高于經(jīng)空白對(duì)照物處理的動(dòng)物的HCMV回收。該單一試劑治療組在降低臨床疾病進(jìn)展或從細(xì)胞聲處理培養(yǎng)物的HCMV回收方面都是無效的。
組＃4PALA單一試劑治療(100mg/kg/天)加4mg結(jié)膜下的甾族化合物注射將該治療組的兔子＃31-38，在HCMV回收研究過程中處死。隨后對(duì)在該75mg/kg/天單一試劑治療加4mg結(jié)膜下的甾族化合物治療組中的兔子＃39和40，在整個(gè)靜脈治療過程中進(jìn)行評(píng)價(jià)。在整個(gè)評(píng)價(jià)期的過程中，臨床疾病證實(shí)玻璃體炎是輕微的。視神經(jīng)乳頭病的嚴(yán)重程度的降低與所有其它治療組相當(dāng)。該臨床疾病的嚴(yán)重程度的下降是結(jié)膜下的甾族化合物注射的直接反應(yīng)，所述注射可使眼睛鎮(zhèn)靜并可降低寄主對(duì)HCMV接種的免疫應(yīng)答。
在這種單一試劑治療組中，從細(xì)胞聲處理試驗(yàn)回收的HCMV，結(jié)果證明接種后第3、4、5和6天時(shí)脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜中有病毒存在。在整個(gè)研究過程中，培養(yǎng)樣品中的HCMV滴度仍保持增長。在接種后第3-6天回收的HCMV的平均滴度為103pfu。除了在甾族化合物治療組中回收到較高的HCMV滴度之外，HCMV回收頻率(陽性樣品數(shù)量)與50mg/kg/天和75mg/kg/天治療組相似(例如，HCMV回收頻率的逐漸降低，緊接著在接種后第6天HCMV回收出現(xiàn)回縮)。盡管玻璃體炎的發(fā)展和視神經(jīng)乳頭的變化在所述甾族化合物治療組內(nèi)有所下降，但是病毒的滴度還是有提高的，這說明甾族化合物增強(qiáng)了HCMV的復(fù)制(或檢測(cè))，75mg/kg/天PALA治療對(duì)于抑制疾病的發(fā)展、HCMV復(fù)制和由脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜組織的回收是無效的。
組＃5單一試劑DHPG(10mg/kg/天)。
將該治療組中的兔子＃41-48在HCMV回收研究的過程中處死。隨后對(duì)在10mg/kg/天單一試劑DHPG治療組中的兔子＃49和50，在整個(gè)靜脈治療過程中進(jìn)行評(píng)價(jià)。單一試劑治療組的動(dòng)物從接種后第2天開始持續(xù)到接種后第10天一直接受DHPG治療。10mg/kg/天DHPG劑量分成2次給藥。正如已前研究中所證明過的，DHPG治療能降低由HCMV誘導(dǎo)的視神經(jīng)疾病嚴(yán)重程度的發(fā)展。玻璃體炎的發(fā)展只在一定程度上受DHPG治療的影響。
從細(xì)胞聲處理培養(yǎng)物回收的HCMV結(jié)果證明HCMV的回收速率和由樣品回收的HCMV滴度迅速下降。在接種后第3天，測(cè)量的HCMV滴度是103pfu。在接種后第4天，HCMV回收已降至滴度101.25，HCMV回收頻率和滴度連續(xù)降到接種第6天。HCMV滴度或陽性HCMV組織數(shù)量在DHPG治療組中沒有出現(xiàn)回宿。HCMV回收和滴度降低圖與以前在其它的單一試劑DHPG治療組所證實(shí)的沒有差別。
組＃6空白對(duì)照物治療。
在HCMV回收研究過程中，將該治療組中的兔子＃51-58處死。隨后在靜脈治療過程中，對(duì)經(jīng)空白對(duì)照物處理的治療組中的兔子＃59和60進(jìn)行評(píng)價(jià)。經(jīng)空白對(duì)照物處理的動(dòng)物，從接種后第2天開始直到第10天每天接受消毒鹽水+EDTA的單一注射。經(jīng)空白對(duì)照物處理的眼睛發(fā)生輕微到中等程度的玻璃體炎?？瞻讓?duì)照物處理組的玻璃體炎在整個(gè)研究過程中一直在加劇。玻璃體炎包含玻璃體條，它具有周邊細(xì)胞侵潤、細(xì)胞聚集和混濁。在空白對(duì)照物處理過的眼睛中，視神經(jīng)炎和炎癥的平均水平與其它治療組相當(dāng)。
由空白對(duì)照物處理組回收的HCMV結(jié)果證實(shí)在評(píng)價(jià)過程中在接種后第3-6天回收的HCMV其滴度由104.5降至102?？瞻讓?duì)照物處理組與其它治療組相比具有較高滴度回收。正如在PALA單一試劑治療組所證明的那樣，在第6天的HCMV回收或滴度中不存在回縮。
結(jié)論[1]用PALA50，75和100mg/kg/天的上升劑量治療兔子，在效果方面沒有提高。事實(shí)上，100mg/kg/天組對(duì)動(dòng)物是有毒的。眼病仍保持在高水平上。當(dāng)與50mg/kg/天PALA劑量或10mg/kg/天DHPG劑量比較時(shí)，75mg/kg/天劑量沒有改善。從所有治療組的分析過程中均回收到HCMV，回收頻率(例如HCMV陽性病毒回收樣品的數(shù)量)方面的差異伴隨著治療后時(shí)間的延伸而減少。很明顯由脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜聲處理樣品回收的病毒滴度也伴隨接種后時(shí)間的延伸而減小。感興趣的結(jié)果是在所有的PALA單一試劑治療組中，在接種后第6天的HCMV檢測(cè)和HCMV滴度中均存在回縮。這種滴度和頻率的觀察結(jié)果在較高的PALA治療濃度時(shí)更加明顯。結(jié)膜下甾族化合物注射組的結(jié)果證明甾族化合物治療確實(shí)抑制了玻璃體炎和視神經(jīng)乳頭病癥。對(duì)甾族化合物處理組的病程的評(píng)價(jià)是容易的，75mg/kg/天治療，如同在非甾族化合物處理的75mg/kg/天治療中一樣，和DHPG治療一樣無效。使用甾族化合物的一個(gè)潛在問題是接種后第3-6天HCMV的滴度持續(xù)增長。除了滴度提高之外，HCMV回收頻率與單一試劑75mg/kg/天PALA處理眼睛對(duì)所觀察到的類似。在該上升劑量治療評(píng)價(jià)中，在減少HCMV回收方面單一試劑治療組的效果排列是DHPG治療(組＃5)＞PALA單一試劑50mg/kg/天(組＃1)＞＞PALA單一試劑75mg/kg/天(組＃2)＞或等于空白對(duì)照物治療(組＃6)＞＞單一試劑PALA100mg/kg/天(組＃3)＞單一試劑PALA75mg/kg/天加4mg結(jié)膜下甾族化合物注射(組＃4)。
根據(jù)本研究和以前研究的結(jié)果，單一試劑PALA治療在降低視網(wǎng)膜中HCMV疾病的發(fā)展和減少HCMV病毒回收方面(從脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜樣品中回收的HCMV的滴度和HCMV回收頻率)與DHPG治療一樣無效。因此，正如例6所證實(shí)的一樣，在治療HCMV病毒感染時(shí)，最好使用PALA組合治療。
表12用單一試劑靜脈注射治療處理的動(dòng)物的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜和玻璃體炎的評(píng)分玻璃體-視網(wǎng)膜評(píng)分組動(dòng)物1/111/121/131/141/15345671 9 1.0*0.75 0.65 0.75 0.41101.52.51.250.60.42192.252.751.752.0無2201.53.53.55.5評(píng)分5.03291.04.53.54.03.253300.753.753.04.04.254391.00.750.751.51.04401.01.51.01.752.255494.753.754.02.53.255505.05.755.05.255.56 59 1.0 2.25 3.0 3.0 1.75**61.252.752.753.03.0-＊評(píng)分代表兩只眼睛/兔子的總和。
＊＊只有一種可以評(píng)價(jià)。
＊＊＊只有白色反射表13用單一試劑靜脈治療法處理的動(dòng)物的視神經(jīng)炎評(píng)分視神經(jīng)炎評(píng)分Group#Animai1/111/121/131/141/1534567ONHONHONHONHONH192.02.01.01.01.01102.03.01.00.502192.04.03.02.002202.05.05.0NRNR3292.06.05.04.02.53303.05.04.04.04.0439001.00044001.01.00.50.55495.06.04.02.02.05504.05.05.02.0 6503.03.05.04.05.06 60 2.0 4.0 2.0*4.0 ONH-視神經(jīng)乳頭;NR-未讀出;＊評(píng)分代表兩只眼睛/兔子的視神經(jīng)乳頭變化(神經(jīng)炎)的總和。？眼底觀測(cè)模糊;＊＊只一面評(píng)價(jià)。
表14接種后3-6天從脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜細(xì)胞培養(yǎng)物回收的HCMV回收的HCMVHCMV滴度組殺死天數(shù)動(dòng)物序號(hào)ODOSODOS1 3 1 + + 1031041 3 2 + + 104103143------1 4 4 + - 104--1 5 5 - + -- 1021 5 6 + - 102--1 6 7 + + 1021031 6 8 + + 1021021129------11210------2 3 11 + + 1051042 3 12 + + 1041042 4 13 + + 1041032 4 14 + - 104--2515------2 5 16 - + -- 1022 6 17 + + 1031042618------21219------21220------3321無數(shù)據(jù)/動(dòng)物在培養(yǎng)前死去3 3 22 + + 1041033 4 23 + + 1051033 4 24 + + 1031043 5 25 - + -- 1023526------3 6 27 + - 102--3 6 28 + + 10210331229------31230------
表14(續(xù))回收的HCMVHCMV滴度組殺死天數(shù)動(dòng)物序號(hào)ODOSODOS4 3 31 + - 104--4 3 32 - + -- 1044 4 33 + + 1031044434------4535------4 5 36 - + -- 1034 6 37 + + 1041044 6 38 + - 103--41239------41240------5 3 41 + - 104--5 3 42 + + 1041035 4 43 + - 102--5 4 44 + - 103--5 5 45 - + -- 1025 5 46 + - 102--5647------5 6 48 - + -- 10251249------51250------6 3 51 + + 1041056 3 52 + + 1041046 4 53 + + 1021046 4 54 + + 1041036 5 55 + - 102--6 5 56 + + 1021026 6 57 + + 1031026 6 58 - + -- 10161259------61260------
大補(bǔ)元?dú)忸惻蛩诛嬈藚?、黃芪、山茱萸;
大補(bǔ)氣血雙虧類膨酥飲片人參、當(dāng)歸、黃芪、桂圓、何首烏;
防治高血壓類膨酥飲片杜仲、三七、枸杞子、決明子;
防治腦心血管疾病類膨酥飲片人參、丹參、三七、何首烏、枸杞子;
大補(bǔ)肺虛止咳祛痰類膨酥飲片桂圓、桔梗、杏仁、百合、山藥、五味子;
補(bǔ)心益智、寧心安神類膨酥飲片人參、百合、山藥、桂圓、茯苓、枸杞子;
補(bǔ)脾胃虛虧食欲不佳體弱無力類膨酥飲片白術(shù)、茯苓、芡實(shí)、熟地、天冬、仙靈脾、薏苡仁、何首烏、枸杞子、菟絲子、山藥;
補(bǔ)腎壯陽添精益髓類膨酥飲片肉蓯蓉、山株萸、枸杞子、菟絲子、五味子、蛇床子、芡實(shí);
補(bǔ)腎培元強(qiáng)筋狀骨延年益壽類膨酥飲片何首烏、枸杞子、菟絲子、五味子、覆盆子、肉蓯蓉、人參、杜仲、熟地、山藥、小茴香、
。
抗癌類膨酥飲片白術(shù)、百合、山藥、桂圓、茯苓、薏苡仁、無花果。
系列中藥膨酥飲片包括單味中藥和多味中藥膨酥飲片，供中老年人補(bǔ)品用。10類大補(bǔ)膨酥飲片不是方劑，只是歸類組合，使用時(shí)，遵照醫(yī)囑，臨癥配方服用。
傳統(tǒng)的中藥成方經(jīng)過上述七道工藝程序混合劑加工成各種成方膨酥飲片，一改現(xiàn)在中藥的成方劑型，變成飲片劑型，可以延長中成藥的保存期限，提高藥性、便于服用、利于人體健康。
1材料和方法在實(shí)驗(yàn)中使用15只成年非洲綠猴，以評(píng)價(jià)單獨(dú)的指定的PALA化合物和PALA與利福平的組合在抑制牛痘病毒感染方面的能力。在開始研究之前，對(duì)15只猴子的每一只中提取的血清在1∶10稀釋條件下進(jìn)行血清反應(yīng)陰性(對(duì)牛痘病毒)測(cè)試。所采用的試驗(yàn)采用100TCID50病毒進(jìn)行血清中和試驗(yàn)。
牛痘病毒感染是一種皮膚感染，它是通過皮內(nèi)注射0.1ml經(jīng)1∶100稀釋的貯存病毒而產(chǎn)生的，該注射在剃光的每個(gè)猴的背部八個(gè)位點(diǎn)的每一個(gè)上進(jìn)行。該病毒接種物的滴定表明每個(gè)注射位點(diǎn)接受了106TCID50病毒。
在病毒注射之后，將這些猴分成5組，每組3只猴，分組結(jié)果列于表1。在接種病毒前，對(duì)每個(gè)猴稱重，提取5ml血漿作為原始血漿和淋巴細(xì)胞樣品。
在病毒接種后24小時(shí)開始用PALA和/或利福平進(jìn)行治療。兩種藥劑在治療當(dāng)天重新制備。PALA是在含有5ml溶液100mg/ml的小玻璃瓶中提供的。在pH7.2PBS中制備1∶4稀釋液，其結(jié)果藥物濃度為25mg/ml。在第1組和第3組中的猴接受PALA50mg/kg/天治療，通過靜脈注射給藥，分為每日早8點(diǎn)和晚8點(diǎn)鐘分開給藥。25mg/ml的PALA溶液進(jìn)入隱靜脈中，每公斤體重施用1ml。
將利福平按300mg等分稱出，將其溶解在10mlDMSO中且加到60ml體積。這一稀釋的結(jié)果是其濃度為5mg/ml。第2、3組接受靜脈注射，每公斤體重注射1ml或5mg/kg。每日在早8點(diǎn)鐘和晚8點(diǎn)鐘進(jìn)行兩次治療，結(jié)果每日劑量為10mg/kg。
第5組的猴子在感染后第1天和第7天接受PALA，以125mg/kg進(jìn)行一次靜脈注射。第4組是一個(gè)感染對(duì)照組，通過每日早8點(diǎn)和晚8點(diǎn)的靜脈注射施用PBS。所有的治療持續(xù)到第10天。
感染通過每日檢查損害位點(diǎn)而評(píng)價(jià)，且對(duì)于增加的嚴(yán)重程度以±到4+的等級(jí)對(duì)它們進(jìn)行評(píng)分。每只猴的總評(píng)分通過將各個(gè)損害值加在一起而確定，并通過用該總值除以注射位點(diǎn)數(shù)而確定平均值。因此對(duì)每只猴提供每日的平均損害值。
另一方面，在感染后第3、7、和10，對(duì)每只猴的一個(gè)損害位點(diǎn)進(jìn)行活體解剖，此時(shí)開一個(gè)8mm皮膚切口。通過縫合關(guān)閉該活體解剖位點(diǎn)。將每一塊活體解剖的皮膚轉(zhuǎn)移到一個(gè)玻璃組織研磨器中，且該組織在2ml組織培養(yǎng)基中均化(最小基本培養(yǎng)基，含有2%胎牛血清和抗生素)。該組織勻漿通過制備系列十倍稀釋物對(duì)牛痘病毒進(jìn)行滴定，該稀釋物是在含有Vero細(xì)胞的24小井培養(yǎng)板中復(fù)制培養(yǎng)的。在接種4天之后，將培養(yǎng)物在甲醇中固定，用亞甲藍(lán)基品紅染色，且進(jìn)行噬菌斑計(jì)數(shù)。
在感染后第0、3、6、8和10天，在肝素中收集5ml血液，將血漿和細(xì)胞分離。將該血漿冷凍在-200℃下，且用PBS1∶1稀釋該細(xì)胞，并層放在ficoll-hypaque梯度上。隨后以1400rpm的轉(zhuǎn)速離心作用30分鐘，收集淋巴細(xì)胞帶，并有含有15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中將其洗滌兩次。在第二次洗滌之后去除培養(yǎng)基，將沉淀的細(xì)胞懸浮在一種1mM二硫蘇糖醇、1mMEDTA和10mM乙酸鎂的溶液中，并冷凍在-70℃條件下。
將這些猴在第10、14、和21天稱重，并在第14和21天抽血以測(cè)定對(duì)牛痘病毒的抗體滴度?？贵w滴度通過血清中和試驗(yàn)來測(cè)定。
2結(jié)果每只猴的平均損害值示于表16中。在第3、6、7、8、9、10和13天對(duì)每個(gè)猴背上的所有位點(diǎn)進(jìn)行損害評(píng)分，并計(jì)算其平均值。每天對(duì)每一組的猴的平均值進(jìn)行測(cè)定，且以黑體字的型式看到。該數(shù)據(jù)表明50mg/kg/天的PALA和50mg/kg/天的PALA與10mg/kg/天的利福平的組合對(duì)于減輕損害發(fā)展和減小尺寸是有效的。兩只感染對(duì)照猴具有可看見的損害，而另一只對(duì)照猴具有中度損害。用利福平治療的猴也可看見具有可見的皮膚損害，又有兩只猴表現(xiàn)出比第三只猴子更嚴(yán)重的感染。在感染后第1-7天接受125mg/kgPALA施藥的組中，一只猴在用藥后4小時(shí)死去?？偟牟±韺W(xué)結(jié)果包括肝部的深紅色變色作用，這說明可能發(fā)生了急性休克或中毒。組織病理學(xué)結(jié)果在以后將會(huì)報(bào)告。在損害表現(xiàn)方面，接受高劑量PALA的一只猴表現(xiàn)出一般嚴(yán)重的損害，而另一只具有更為中等程度的損害。在感染后第1天和第7天用高劑量PALA治療的猴中，損害的嚴(yán)重程度要比用較低劑量PALA每日治療的猴所看見的損害更大。
從每個(gè)猴身上皮膚活體解剖中的病毒滴定在每個(gè)治療組內(nèi)以及在對(duì)照組中猴子和猴子之間各不相同(表3)。牛痘病毒的較高滴度在感染對(duì)照組、利福平組以及高劑量PALA組中表現(xiàn)出來。病毒的較低滴度在接受50mg/kg/天PALA的猴中和在接受PALA和利福平組合組中表現(xiàn)出來。
沒有明顯的跡象表明毒性存在于任何用PALA或用利福平治療的猴中(除了那只在施用PALA125mg/kg之后就死了的猴子之外)。兩只存活的接受這種劑量的猴子，在感染后第7天接受第2次125mg/kg的注射，沒有任何不良癥狀。
表16由感染牛痘病毒的非洲綠猴背上的接種點(diǎn)得到的牛痘損害評(píng)分
＊按+到4+的等級(jí)(相應(yīng)于增加的程度)進(jìn)行評(píng)分，每個(gè)評(píng)分代表每只猴子的7(＊＊)，6(＊＊＊)或5(＊＊＊＊)位點(diǎn)的平均值表17在來自非洲綠猴的皮膚損害活體解剖的勻漿中的牛痘病毒的滴度
＊在2.0ml組織培養(yǎng)介質(zhì)中將8mm活體解剖物均化，并在接種Vero細(xì)胞的24井板中的復(fù)制井中進(jìn)行滴定表18對(duì)用牛痘病毒感染的并用PALA和/或利福平治療的猴中的牛痘病毒的中和抗體滴度
表19用牛痘病毒感染的且用PALA和/或利福平治療的非洲綠猴的體重
實(shí)例9通過棉鼠研究PALA抗呼吸合胞體病毒(RSV)的情況。
以下部分描述了一些實(shí)驗(yàn)，其中用呼吸合胞體病毒先感染棉鼠，并用PALA、三氮唑核苷(ribavirin)、或它們的組合治療三天。其結(jié)果表明10mg/kg/天的PALA是最有效的;用PALA(10mg/kg/天)，組織病癥明顯減輕，且病毒滴度下降一個(gè)log10。
1材料棉鼠(遠(yuǎn)親繁殖的有短硬毛的棉田鼠(sigmodenhispidus))，任何性別，50至100克。攻擊病毒RSVA1，約100棉鼠中感染劑量(CRID50;100μl，鼻內(nèi)(i.n)給藥)。PALA(30mg/kg/天)、三氮唑核苷(30mg/kg/天)、以及它們的結(jié)合治療，兩個(gè)化合物均內(nèi)腹膜給藥(i.p.)。動(dòng)物在(+)4天處死，將肺均化，且對(duì)RSV進(jìn)行滴定。
總動(dòng)物數(shù)24。
實(shí)驗(yàn)記錄在棉鼠初步體內(nèi)篩中的呼吸合胞體病毒(RSV)(采用16只動(dòng)物)。
＊(天0＝病毒接種日，所用的各種藥物的劑量及方案均隨實(shí)驗(yàn)1的結(jié)果而變化)
呼吸合胞體病毒肺滴度(LOC10)PALA對(duì)三氮唑核苷實(shí)驗(yàn)(對(duì)RSV)
兩個(gè)平均值之間的統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)差異具有單程Anova(對(duì)T試驗(yàn)可變)的T試驗(yàn)空白對(duì)照物對(duì)PALA10mg/kg/d(t＝3.1650;df＝15;雙尾形p＝0.0064)。
2測(cè)試PALA抗棉鼠中RSV的抗病毒活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的總結(jié)2.1程序1.對(duì)50至100g任何性別的棉鼠在第0天用RSA2(庫8-28-92)進(jìn)行接種(i.n.)2.在第+1天如下所述向動(dòng)物供給空白對(duì)照物或PALA組1空白對(duì)照物(水)腹膜內(nèi)(i.p.)第+1天-第+3天組2PALA3mg/kg/天腹膜內(nèi)第+1天-第+3天組3PALA10mg/kg/天腹膜內(nèi)第+1天-第+3天組4三氮唑核苷40mg/kg/天腹膜內(nèi)第+1天-第+3天組5三氮唑核苷40mg/kg/天+第+1天-第+3天PALAmg/kg/天腹膜內(nèi)3.將所有動(dòng)物于第+4天處死，且將它們的肺用于RSV水平試驗(yàn)
劃線的表示在用Kruskal-Wallis非參數(shù)ANOVA試驗(yàn)和Newman-Reuls試驗(yàn)作多重比較時(shí)明顯不同于空白對(duì)照物的平均值(p＜0.05)，采用具有單程ANOVA的t-試驗(yàn)則更明顯。
＊多重比較方法＊＊所采用的治療以mg/kg/天計(jì)(腹膜內(nèi))3結(jié)論結(jié)果表明PALA作為單一藥物在抗呼吸合胞體病毒方面具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的效果。從統(tǒng)計(jì)學(xué)上看PALA比三氮唑核苷更好。在PALA和三氮唑核苷之間沒有呈現(xiàn)出附加的和/或協(xié)同的作用。
很明顯，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說在上述公開的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明作出修改和變化是可能的。應(yīng)當(dāng)知道，這些修改是包括在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的，這將通過權(quán)利要求書來限定。
權(quán)利要求
1.一種用于治療或防止人或獸類病毒感染的抗病毒組合物，包含有效抗病毒量的N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸及其藥物許可的類似物和至少一種另外的抗病毒試劑。
2.權(quán)利要求1所述抗病毒組合物，其中所述另外的抗病毒試劑選自利福平、ganciclovir、無環(huán)鳥苷、金剛胺(adamantidine)、三氮唑核苷及其混合物。
3.一種用于治療或防止人或獸類病毒感染的抗病毒組合物，含有效抗病毒量的N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸及其藥物許可類似物和和至少一種另外的糖基化抑制劑，該抑制劑選自2-脫氧-D-葡萄糖或脫氧野尻霉素。
4.一種用于治療或防止由人乳頭瘤病毒引起的疾病的抗病毒組合物，含有有效抗病毒量的N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸及其藥物許可類似物和一種有效量的治療試劑，該試劑選自干擾素-α和氟尿嘧啶及其一種混合物。
5.一種適用于治療或防止人或獸類病毒感染的藥物組合物，含有N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸及其藥物許可類似物，至少一種另外的抗病毒試劑和藥物許可載體。
6.一種治療或防止人或獸類病毒感染的方法，包括向需要進(jìn)行抗病毒治療的人或動(dòng)物施以有效抗病毒量的N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物。
7.一種治療或防止人或獸類病毒感染的方法，包含向需要進(jìn)行抗病毒治療的人或動(dòng)物施以有效抗病毒量的N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物以及至少一種有效量的另外的治療試劑。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述另外的治療試劑是一種抗病毒。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的抗病毒是一種核苷酸類似物，一種核苷酸運(yùn)載抑制劑，一種DNA或RNA鏈終止劑，一種糖基化抑制劑，或其一種混合物。
10.權(quán)利要求6或7所述的方法，其中所述的用藥是通過胃腸外或口服的。
11.權(quán)利要求6或7所述的方法，其中所述用藥是在局部、陰道或直腸上。
12.按權(quán)利要求6或7所述的方法，其中將約1mg/Kg/天-100mg/Kg/天的N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述對(duì)象上。
13.按權(quán)利要求12所述的方法，其中將約25mg/Kg/天-60mg/Kg/天的N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述對(duì)象上。
14.按權(quán)利要求12所述的方法，其中將約5-約60mg/Kg/天的N-(膦酰基乙?；?-L-天冬氨酸或藥物許可類似物施用到所述對(duì)象上。
15.按權(quán)利要求6或7所述的方法，其中所述病毒感染是由RNA病毒引起的。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述RNA病毒選自黃熱病毒、本雅病毒、Hantaan病毒和絲狀病毒。
17.按權(quán)利要求15所述的方法，其中所述RNA病毒選自黃熱病、白蛉熱、立夫特山谷熱、登革病毒1-4、何薩奇病毒、麻疹、呼吸合胞體、副流感和流感A(H2N2和H3N2)病毒。
18.按權(quán)利要求6或7所述的方法，其中所述病毒感染是由DNA病毒引起的。
19.按權(quán)利要求6所述的方法，其中所述病毒感染是由選自水痘、巨細(xì)胞和人皰疹病毒-6的DNA病毒引起的。
20.按權(quán)利要求9所述的方法，其中所述核苷酸類似物選自阿糖腺苷、阿糠腺苷單磷酸、碘苷、三氟胸苷、溴乙烯基脫氧尿苷、ganciclovir、無環(huán)鳥苷、溴乙烯阿拉伯尿嘧啶和(S)-9-(2，3-二羥丙基)腺嘌呤或其混合物。
21.按權(quán)利要求9所述的方法，其中所述抗病毒選自利福平、無環(huán)鳥苷、三氮唑核苷和金剛胺或其混合物。
22.按權(quán)利要求9所述的方法，其中所述DNA或RNA鏈終止劑選自2′，3′-二脫氧胞嘧啶、2′，3′-二脫氧肌苷、3′-疊氮基-3′-脫氧胸苷或其混合物。
23.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述糖基化抑制劑選自2-脫氧-D-葡萄糖或脫氧野尻霉素。
24.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述另外的治療試劑是與所述PALA或其藥物許可類似物一塊用藥的。
25.按權(quán)利要求7所述的方法，其中所述另外的治療試劑是在所述的PALA或其藥物許可類似物之前用藥的。
26.按權(quán)利要求7所述的方法，其中所述另外的治療劑在所述的PALA或其藥物許可類似物之后用藥的。
27.一種治療或防止由人乳頭瘤病毒引起的疾病的方法，包括向需要抗病毒治療的人施用有效抗病毒量的N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物，以及有效量的選自干擾素-α和氟尿嘧啶或其混合物的一種化合物。
28.一種治療或防止由丙型肝炎引起的疾病的方法，包括向需要這種治療的人施用有效抗病毒量的N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物。
29.一種治療或防止由丙型肝炎引起的疾病的方法，包括向需要這種治療的人施用有效抗病毒時(shí)的N-(膦酰基乙?；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物，至少一種有效治療時(shí)的另外的治療試劑。
30.按權(quán)利要求27的所述的方法，其中將約1mg/Kg/天-約100mg/Kg/天的N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述人體上。
31.按權(quán)利要求30的所述的方法，其中將約5-約60mg/Kg/天的N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸及其藥物許可類似物施用到所述對(duì)象上。
32.按權(quán)利要求30的所述的方法，其中所述治療試劑選自抗病毒和甾族化合物或其混合物。
33.按權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的抗病毒選自一種核苷酸類似物、一種核苷酸運(yùn)載抑制劑、一種RNA或DNA鏈終止劑和一種糖基化抑制劑。
34.按權(quán)利要求33所述的方法，其中所述抗病毒選自ganciclovir和膦?；姿峄蚱浠旌衔铩?br> 35.按權(quán)利要求30所述的方法，其中所述治療劑是3TC或α-干擾素。
36.一種治療或防止由乙型肝炎病毒引起的疾病的方法，包括向需這種治療的人施用有效抗病毒量的N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物。
37.一種治療或防止由乙型肝炎病毒引起的疾病的方法，包括向需要這種治療的人施用有效抗病毒量的N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物，以及至少一種有效量的另外的治療試劑。
38.按權(quán)利要求34所述的方法，其中將約1mg/Kg/天-約100mg/Kg/天的N-(膦酰基乙?；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施加到所述對(duì)象上。
39.按權(quán)利要求38所述的方法，其中將約5-約60mg/Kg/天的N-(膦酰基乙?；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述對(duì)象上。
40.按權(quán)利要求38所述的方法，其中所述治療試劑是一種抗病毒或一種甾族化合物。
41.按權(quán)利要求40所述的方法，其中所述抗病毒選自一種核苷酸類似物，一種核苷酸運(yùn)載抑制劑、一種DNA或RNA鏈終止劑和一種糖基化抑制劑。
42.一種治療或防止由水痘病毒引起的疾病的方法，包括向需要這種治療的人或動(dòng)物施用有效抗病毒量的N-(膦酰基乙?；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物以及有效量的無環(huán)鳥苷。
43.按權(quán)利要求42所述的方法，其中所述用藥是通過胃腸外。
44.按權(quán)利要求42所述的方法，其中所述用藥是口服。
45.按權(quán)利要求39所述的方法，其中將約1mg/Kg/天-約100mg/Kg/天的N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述對(duì)象上。
46.按權(quán)利要求45所述的方法，其中將約5-約60mg/Kg/天的N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述對(duì)象上。
47.按權(quán)利要求45所述的方法，其中將約20mg/Kg/天-約50mg/Kg/天的N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述對(duì)象上。
48.權(quán)利要求42所述的方法，其中將約10mg/Kg/天-約25mg/Kg/天的無環(huán)鳥苷施用到所述對(duì)象上。
49.一種治療或防止由牛痘病毒或牛痘病毒構(gòu)建物引起的疾病的方法，包括向需要進(jìn)行這種治療的人或動(dòng)物施用有效抗病毒量的N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物以及有效量的利福平。
50.按權(quán)利要求49所述的方法，其中將約1mg/Kg/天-約100mg/Kg/天的N-(膦酰基乙?；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述對(duì)象上。
51.按權(quán)利要求50所述的方法，其中將約5-約60mg/Kg/天的N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述對(duì)象上。
52.按權(quán)利要求49所述的方法，其中將約20mg/Kg/天-約50mg/Kg/天的N-(膦酰基乙?；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述對(duì)象上。
53.按權(quán)利要求49所述的方法，其中將約10mg/Kg/天-約20mg/Kg/天的利福平施用到所述對(duì)象上。
54.一種治療或防止由巨細(xì)胞病毒引起疾病的方法，其中包括向需要這種治療的人施用有效抗病毒量的N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物以及有效量的ganciclovir。
55.按權(quán)利要求54所述的方法，其中將約5mg/Kg/天-約60mg/Kg/天的N-(膦酰基乙?；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述對(duì)象上。
56.按權(quán)利要求55所述的方法，其中將約20mg/Kg/天-約50mg/Kg/天的N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述對(duì)象上。
57.按權(quán)利要求54所述的方法，其中將約5mg/Kg/天-約10mg/Kg/天的ganciclovir施用到所述人上。
58.按權(quán)利要求49或54所述的方法，其中所述用藥是通過胃腸外。
59.按權(quán)利要求49或54所述的方法，其中所述用藥是通過口服。
60.一種治療或防止免疫缺乏對(duì)象中的人或獸類病毒感染的方法，包括向缺乏免疫的人或動(dòng)物對(duì)象施用有效抗病毒量的N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物。
61.一種治療或防止免疫缺乏對(duì)象中的人或獸類病毒感染的方法，包括向缺乏免疫的人或動(dòng)物對(duì)象施用有效抗病毒量的N-(膦酰基乙?；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物和至少一種有效量的另外的治療試劑。
62.按權(quán)利要求61所述的方法，其中將約1mg/Kg/天-約100mg/Kg/天的PALA或其藥物許可類似物施用到所述對(duì)象上。
63.按權(quán)利要求62所述的方法，其中將約5-約60mg/Kg/天的N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸或其藥物許可類似物施用到所述對(duì)象上。
64.按權(quán)利要求60或61所述的方法，其中所述病毒感染是由DNA或RNA病毒引起的。
65.按權(quán)利要求60或61所述的方法，其中所述的病毒感染是一種機(jī)會(huì)性病毒(opportunisticviral)感染，它是由HIV-1或HIV-2，化學(xué)療法或其它免疫抑制因素次生的，它選自觸染性軟疣病毒、巨細(xì)胞病毒、水痘-帶狀皰疹病毒。
全文摘要
本申請(qǐng)公開了利用PALA的廣譜抗病毒活性的組合物和方法。該方化合物及其藥物許可類似物具有有效的活性，同時(shí)顯示出最小的毒性，因此其特征在于治療指數(shù)較高。還公開了任意地含有另外的治療試劑，例如另外的抗病毒試劑的組合物，并且還發(fā)現(xiàn)它具有協(xié)同的和/或附加的抗病毒活性。
文檔編號(hào)A61KGK1080853SQ9310459
公開日1994年1月19日 申請(qǐng)日期1993年3月18日 優(yōu)先權(quán)日1992年3月18日
發(fā)明者H·A·布勞 申請(qǐng)人:美國生物科學(xué)有限公司