專利名稱：生產(chǎn)產(chǎn)氣莢膜桿菌疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)能誘發(fā)人或動物中抗產(chǎn)氣莢膜桿菌保護(hù)性免疫反應(yīng)的新型多肽的方法;特別是能引發(fā)抗所述微生物α毒素的上述保護(hù)性反應(yīng)的新肽，以及生產(chǎn)其抗體和抗血清的方法。
產(chǎn)氣莢膜桿菌(C.Perfringens)在環(huán)境中廣泛存在，并已在土壤中發(fā)現(xiàn)，使人和動物中的有機(jī)物質(zhì)和類似腸菌叢的物質(zhì)腐敗。根據(jù)所產(chǎn)生的毒素的光譜(McDonel(1986)PharmacologyofBacterialToxins;FDornerandJDrews(Editors)PergamonPress，Oxford)可以將產(chǎn)氣莢膜桿菌的不同菌株分成5個生物型(A-E)。生物型A菌株是人氣性壞疽的特別重要的病原因子。該疾病在年紀(jì)較大者和糖尿病人群中，特別是經(jīng)受了下肢手術(shù)的人群中有顯著的增加(其中損害了向組織的血液供應(yīng)可導(dǎo)致適于細(xì)菌繁殖的缺氧條件)。在經(jīng)受過胃腸道手術(shù)的患者中，如果腸內(nèi)容易污染了受損傷的組織后，則能夠引起這種疾病，已經(jīng)表明，在武裝沖突期間會出現(xiàn)氣性壞疽發(fā)病率的周期性增加。第一次世界大戰(zhàn)期間，由于臟東西污染了傷員深部組織傷口，并且不能迅速治療上述傷員從而導(dǎo)致了數(shù)萬戰(zhàn)士的死亡。
氣性壞疽的發(fā)病機(jī)制在很大程度上歸因于由細(xì)菌產(chǎn)生的強(qiáng)外毒素，其中α毒素作為引起疾病的主要因素受到注意。通過損壞并減少給組織的血液供應(yīng)并因此促使感染擴(kuò)散所需的條件，毒素可以在感染的起始病灶之表面上起作用。在疾病后期，毒素可影響全身引起死亡。早在1937年以前既已證明產(chǎn)氣莢膜桿菌類毒素疫苗可提供抗實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的氣性壞疽保護(hù)作用(PenfoldandTolhurst(1937)MedicalJournalofAustraliaPP604)，并且隨后的研究表明該疫苗的有效成份來自α毒素(RoberstonandKePPie(1943)，Lancet2P311;Boydetal(1972)J.Med.Microbiol5，P467;Kameyama(1975)JaPaneseJournalofMedicine，ScienceandBiology25，P200)。
除這些進(jìn)展外，還設(shè)有開發(fā)出適用于人的安全疫苗，而目前對氣壞性壞疽的治療通常是除去受影響的肢體或組織。
本發(fā)明之前已分離了編碼α毒素的基因(Titballetal(1989)InfectionandImmunity，Vol57，P357-376)并檢測了該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)一功能之間的關(guān)系(TitballandRubidge1990;Titballetal(1991)InfectionandImmunityVol59.P1872-1874)。作為這些研究的一部分，確定了一些抗體抗原決定簇的位置(Logenetal(1992)InfectionandImmunityVol.59，P4338-4382)。
本發(fā)明的目的之一是提供生產(chǎn)新疫苗的方法，當(dāng)給動物或人施用時，該疫苗可誘導(dǎo)生產(chǎn)直接抗產(chǎn)氣莢膜桿菌α毒素(CP2)的抗體，并由此提供預(yù)防由產(chǎn)氣莢膜桿菌和/或α毒素本身引起的感染。本發(fā)明的主要目的是提供相對安全并易于生產(chǎn)的上述疫苗。另外也提供生產(chǎn)抗體和抗血清的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗CPα抗體的疫苗，以便在研究氣性壞疽發(fā)病機(jī)制中α毒素的作用時將其用作工具;上述疫苗沒有其它產(chǎn)氣莢膜桿菌類毒素活性。為了實(shí)現(xiàn)這些目的，本發(fā)明人已提供了生產(chǎn)該新肽的方法，在上述疫苗中可將該肽用作活性免疫劑或試劑。
因此，在其最主要的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)疫苗的方法，當(dāng)給人或動物施用時，該疫苗能提供抗產(chǎn)氣莢膜桿菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)，該方法包括將肽或肽結(jié)合物與藥物可接受的載體混合，所述的肽或肽結(jié)合物包括產(chǎn)氣莢膜桿菌α毒素氨基酸261到氨基酸300的抗原決定簇氨基酸序列，但沒有磷脂酶C和/或見于α毒素氨基酸1到240之間的神經(jīng)鞘髓磷脂水解活性所需的抗原決定簇，該方法最好包括摻入佐劑，如弗氏不完全或完全佐劑的步驟。
理論上，可以經(jīng)本領(lǐng)域已知的肽化學(xué)合成法連接氨基酸來生產(chǎn)該肽或肽結(jié)合物;然后篩選上述產(chǎn)物活性。然而，可用本發(fā)明優(yōu)選的方法生產(chǎn)能作為疫苗之活性劑的肽或肽結(jié)合物，以提供抗產(chǎn)氣莢膜桿菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)，該方法包括將編碼該肽的DNA序列插入到宿主微生物的DNA中，所述肽包括產(chǎn)氣莢膜桿菌α毒素氨基酸261到300的抗原決定簇序列，但沒有見于磷酸酶C和/或α毒素氨基酸1到240之間的神經(jīng)鞘髓磷脂水解活性所需的抗原決定簇氨基酸序列，培養(yǎng)該生物體以使其表達(dá)所述的肽，并以純化形式或作為非純化部分分離該肽。
優(yōu)選的方法是插入編碼產(chǎn)氣莢膜桿菌α毒素氨基酸261到氨基酸370，最好是編碼247到370位氨基酸序列肽的DNA序列。
在最佳形式中，編碼的肽僅由產(chǎn)氣莢膜桿菌α毒素之氨基酸247到370的氨基酸序列組成或?yàn)樵摪被嵝蛄信c不是α毒素氨基酸1到氨基酸246的另一氨基酸序列之融合肽的形式或與如有其它所需效應(yīng)之其他制劑所成之結(jié)合物形式。術(shù)語“其它氨基酸序列”是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的包括完整蛋白質(zhì)以及適于使用者需要的相對短序列。例如也可以包括與前述提供其它免疫或標(biāo)記目的的序列融合的非產(chǎn)氣莢膜桿菌抗原蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供了生產(chǎn)含有適當(dāng)劑量的前述肽或結(jié)合物的疫苗的方法，用其它制劑按需要選擇性地補(bǔ)充這些肽或結(jié)合物以提供最佳保護(hù)。
本發(fā)明人和同事以前的工作已經(jīng)確定，N末端(氨基酸1-249＝CPα249)或C末端(氨基酸250-370)區(qū)域均不能對其本身有致死性影響。據(jù)此，令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，磷脂酶完全存在于N末端區(qū)域，而與抗原決定簇相關(guān)的已知神經(jīng)鞘髓磷脂酶并不在C末端區(qū)域的序列內(nèi)。
這些研究人員所做的其它實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，盡管針對這些N末端區(qū)域抗原決定簇的抗體可中和毒素的影響，但N末端區(qū)域本身并不能誘發(fā)保護(hù)性反應(yīng)。因此，可以很容易地看出，有關(guān)的非活性C末端區(qū)域可引發(fā)保護(hù)性反應(yīng)而有關(guān)的活性N末端則不能這一發(fā)現(xiàn)是完全令人驚奇的結(jié)果。
本發(fā)明人和其同事以前已確定了C末端抗原決定簇的位置，并發(fā)現(xiàn)其位于α毒素氨基酸序列的約273-275及295-297位。預(yù)期在不同分離物中這些抗原決定簇的位置或性質(zhì)可輕微地變化而保持功能活性不變，因此，上述變化也包括在維持保護(hù)性反應(yīng)的本發(fā)明范圍內(nèi)。
根據(jù)上述的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員會很清楚的了解C末端區(qū)域中的特定序列可比其它序列更有效地提供必需的免疫活性。這是因?yàn)楸Ｗo(hù)性作用一般在一定程度上取決于肽在所需的抗原決定簇中的相互定向過程中的三維排列。這一點(diǎn)可由活性抗原決定簇支持N末端區(qū)域并不致死其本身的事實(shí)進(jìn)一步證實(shí)，并說明C末端對于這些抗原決定簇的正確定位也是必須的。從本文所給的資料可很清楚地看出，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可以篩選用于所需活性的本發(fā)明的各種序列，并可用遺傳工程技術(shù)如多聚酶鏈反應(yīng)和基因克隆技術(shù)很容易地提供沒有不需要的磷脂酶和神經(jīng)鞘髓磷脂活性的各種序列。對“不需要的”區(qū)域在本發(fā)明作者及同事的文章中已有詳細(xì)描述(Shuttleworthetal(1988)′EpitopemappingofClostridiumperfringensalpha-toxin′inFJFehrenbachetal(Editors)bacterialProteinToxins，GustavFischerVerlag，Stuttgart，p65-66.Titballetal(1989)InfectionandImmunity，Vol57，p357-376;Titballetal(1991)InfectionandImmunity，Vol59，5.p1872-1874;Loganetal(1991)InfectionImmunity，Vol59，12.p4338-4382).
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)編碼本發(fā)明肽的重組DNA，含有上述DNA的質(zhì)粒和細(xì)胞系，含有這些質(zhì)?；蛑亟MDNA本身的以便完成肽表達(dá)合適的大腸桿菌或酵母細(xì)胞。由PCR擴(kuò)增編碼所需序列如CPα247-370或CPα261-370的DNA來提供上述重組DNA，PCR使用的引物以天然產(chǎn)氣莢膜桿菌DNA提供的雙鏈序列的各自末端為目標(biāo)，該引物形成雙鏈末端的一半。將該擴(kuò)增的DNA連接到適宜的載體中，可以適當(dāng)與含有所需融合肽之其余部分的序列相鄰接，并將該載體插入到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞如大腸桿菌中?？梢杂靡阎姆椒ㄈ鏦estern印跡法篩選表達(dá)所需肽的細(xì)胞系。
應(yīng)注意的是通過提供可裂解的相對較大的部分來選擇特定融合肽，可利于分離該肽以便在開始純化后得到與α毒素有關(guān)的肽。
本發(fā)明另一方面提供了用由本發(fā)明的肽生產(chǎn)抗該肽之抗血清及抗體的方法。此外，本發(fā)明還提供了抗本發(fā)明肽的單克隆抗體以及生產(chǎn)該抗體雜交瘤細(xì)胞。
用按本發(fā)明方法轉(zhuǎn)化的微生物生產(chǎn)的肽注射宿主動物(如小鼠或兔)，待到適宜的抗體產(chǎn)生期后，如14到28天從中分離血清，可以很容易地制備本發(fā)明提供的抗血清。用任何的已知方法，如使用本發(fā)明提供的固定化肽的親和層析以保留抗體，即可從動物的血液及其血清中分離出抗體?？捎靡阎椒ㄉa(chǎn)表達(dá)抗本發(fā)明肽之抗體的雜交瘤細(xì)胞系，以很容易地制備相似的單克隆抗體?？墒褂脤⒖贡景l(fā)明肽的小鼠單克隆抗體輕鏈與人抗體重鏈摻在一起的已知方法，而使上述單克隆抗體人性化。
為了幫助本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員，現(xiàn)提供生產(chǎn)本發(fā)明肽和肽疫苗的有關(guān)附圖及說明性實(shí)施例。這些非限定性實(shí)施例提供有關(guān)基本C末端區(qū)域肽之有效性的資料，據(jù)此本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可以作出可能的改變也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
附圖

圖1顯示在完整的α毒素序列(CPα1-370)＝A上、本發(fā)明的C末端區(qū)域肽(CPα247-370)＝B上及本發(fā)明融合肽(GST-CPα247-370)＝C上之主要抗原決定簇的相對位置。數(shù)字說明抗原決定簇的大致位置。
圖2;顯示用試驗(yàn)疫苗開始注射后(I.P.)V天log10抗體滴定度。用在X軸上的∧注釋表明加強(qiáng)注射。上述滴定度對保護(hù)作用是非依賴性的。
序列目錄1顯示按本發(fā)明優(yōu)選的方法提供的細(xì)胞生產(chǎn)的優(yōu)選α毒素剪短之肽的完整氨基酸序列。
序列目錄2顯示天然產(chǎn)生的α毒素的完整氨基酸序列。
序列目錄3顯示編碼α毒素的完整DNA序列，其中本發(fā)明方法提供的優(yōu)選肽的編碼序列下面劃了線。
實(shí)施例產(chǎn)生氣莢膜桿菌α毒素的C末端(CPα247-370)肽在大腸桿菌中表達(dá)編碼α毒素之C末端區(qū)域(氨基酸247-370＝CPα247-370)的α毒素基因片段，得到抗產(chǎn)氣莢膜桿菌α毒素的候選疫苗肽。用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增α毒素基因序列之核苷酸823到1194間的區(qū)域，從而得到α毒素基因片斷。將與核苷酸823起始區(qū)域同源的PCR引物摻入核苷酸尾部(GGGATG)以利于基因片段的克隆和表達(dá)。純化PCR產(chǎn)物并將其與適當(dāng)消化的pBluescriPt連接，并用常規(guī)方法(Maniatis et al 1989.Molecular Cloninga Laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press)進(jìn)一步證實(shí)克隆之片的核苷酸序列可靠性。
從pBluescriPt克隆中分離CPα247-370編碼片段(SmaI-HindⅢ片段)，并將此片段與SmaI消化的PGEX-3X載體DNA(LRB-Pharmacia Biotechnology)連接，以實(shí)現(xiàn)表達(dá)。所得的重組質(zhì)粒(PB3×13)表達(dá)了作為帶有編碼谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的載體的融合蛋白(＝GST-CPα247-370)的CPα247-370。按制造商有關(guān)純化GST的說明書純化該蛋白質(zhì)。
簡單地說，在1升L-肉湯+氨芐青霉素中培養(yǎng)含PB3×13的大腸桿菌(37℃，150rpm)，直到培養(yǎng)物的光密度(600nm)達(dá)到約0.3。加入IPTG直到終濃度為1mM，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，在30ml PBS+triton×100(1%)中重新懸浮細(xì)胞以制備總細(xì)胞溶胞產(chǎn)物，并在冰上用Braun Labsonic超聲處理器超聲處理5×30秒。從谷胱甘肽-SePharose(LKB-Pharmacia)柱上選擇性洗脫以純化離心后得到的上清液。為了分離單獨(dú)的CPα247-370片段，用因子(15U)將CPα247-370肽(在800μl中約10mg)室溫消化過夜，通過谷胱甘肽-SePharose柱從GST分離出CPα247-370片段。
候選疫苗的毒性通過腹腔注射將10μg量的疫苗經(jīng)腹腔接種到一組6只小鼠體內(nèi)，以確定疫苗融合肽的毒性。在這些劑量下候選疫苗是非致死性的，并且在直到接種后2星期小鼠都沒有急性或慢性中毒癥狀。
對疫苗的抗體反應(yīng)通過腹腔注射，將疫苗與佐劑一起注入 6只小鼠體內(nèi)，用ELISA監(jiān)測抗α毒素抗體的出現(xiàn)。加強(qiáng)接種后，CPα247-370或GST-CPα247-370誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的不斷增強(qiáng)的抗α毒素抗體反應(yīng)(圖2)。CPα247-370與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶融合并不影響抗該多肽的α毒素抗體反應(yīng)。給予粗甲醛α類毒素后，觀察到的抗CPα249(N末端區(qū))CPα247-370或GST-CPα247-370的抗體反應(yīng)程度相似。
產(chǎn)生的抗疫苗抗體的性質(zhì)研究用CPα249，CPα247-370或GST-CPα247-370免疫之動物的血清體外中和與α毒素有關(guān)之生物活性的能力。全部都能有效地抑制毒素的磷脂酶C活性;而只有抗CPα247-370或GST-CPα247-370產(chǎn)生的抗血清抑制毒素的溶血活性。
抗毒性攻擊保護(hù)作用用5μg純化的α毒素(約50LD50劑量)腹腔注射攻擊單獨(dú)用甲醛類毒素、CPα249、CPα247-370、GST-CPα247-370或GST免疫的動物。對照小鼠及用GST兔疫的小鼠在24小時內(nèi)死亡，而用CPα249免疫的6只小鼠中的4只也在該期間死亡。用甲醛類毒素，CPα247-370或GST-CPα247-370免疫的小鼠則存活下來并且沒有中毒跡象。
抗微生物攻擊的保護(hù)作用為了研究甲醛類毒素，CPα247-370或 GST-CPα247-370也誘導(dǎo)抗實(shí)驗(yàn)性氣性壞疽之保護(hù)作用的可能性，用產(chǎn)氣莢膜桿菌NCTC8237的1010個活細(xì)胞對已用這些候選疫苗免疫的每組6只小鼠進(jìn)行肌內(nèi)注射攻擊。該攻擊實(shí)驗(yàn)的被免疫動物全部存活，而未免疫的對照動物則在48小時內(nèi)死亡。
結(jié)論在該研究期間產(chǎn)生了用最容易的遺傳工程方法加工的疫苗，CPα247-370代表毒素的C末端區(qū)。該蛋白質(zhì)以至少高達(dá)10μg的劑量，在小鼠中未表現(xiàn)出毒性。用該蛋白質(zhì)重復(fù)接種小鼠可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的保護(hù)動物以對抗α毒素及對抗產(chǎn)氣莢膜桿菌攻擊的抗體反應(yīng)。該疫苗可比甲醛類毒素提供數(shù)種潛在的優(yōu)點(diǎn)它更容易制備并且由于它沒有甲醛、沒有其它類毒素樣產(chǎn)氣莢膜桿菌毒素以及部分類毒素物質(zhì)，所以該疫菌使用起來安全且反應(yīng)原性較低。
表1由候選疫苗免疫提供的抗α毒素攻擊的保護(hù)作用。每組6只Balb/C小鼠在80天的時間內(nèi)，接受與弗氏不完全佐劑混合的6×10μg抗原腹腔內(nèi)注射。用10μg純化的α毒素腹腔注射攻擊這樣小鼠并記錄至24小時后的死亡數(shù)。
抗原用α毒素攻擊劑量(μg)存活者無100/6甲醛類毒素106/6Cp α247-37010 6/6GST-Cp α247-37010 6/權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)當(dāng)給人或動物使用時能提供抗產(chǎn)氣莢膜桿菌保護(hù)性免疫反應(yīng)之疫苗的方法，該方法包括將肽或肽結(jié)合物與藥物學(xué)上可接受的載體混合，所述的肽或肽結(jié)合物包括產(chǎn)氣莢膜桿菌α毒素的從氨基酸261到氨基酸300的抗原決定簇氨基酸序列，但沒有見于α毒素之氨基酸1到240之間的對磷脂酶C和/或神經(jīng)鞘髓磷脂水解活性必需的抗原決定簇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中還包括摻入佐劑的步驟。
3.一種生產(chǎn)能作為疫苗中活性劑的肽或肽結(jié)合物的方法，當(dāng)給人或動物使用時，該疫苗提供抗產(chǎn)氣莢膜桿菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)，該方法包括將編碼肽的DNA序列插入到宿主微生物的DNA中，培養(yǎng)該微生物以便表達(dá)該肽，并以純化或非純化形式分離該肽，所述肽包括產(chǎn)氣莢膜桿菌α毒素的從氨基酸261到氨基酸300的抗原決定簇氨基酸序列，但沒有見于在α毒素之氨基酸1到240間的對磷脂酶C和/或神經(jīng)鞘髓磷脂水解活性必需的抗原決定簇。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中插入到微生物之DNA中的DNA序列編碼產(chǎn)氣莢膜桿菌α毒素的從氨基酸261到氨基酸370的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求4要求的方法中，其中插入到微生物之DNA中的DNA序列編碼產(chǎn)氣莢膜桿菌α毒素的從氨基酸247到氨基酸370的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中插入到微生物之DNA中的DNA序列編碼由產(chǎn)氣莢膜桿菌α毒素的氨基酸247到氨基酸370的氨基酸序列或者以與另一不是α毒素之氨基酸1到氨基酸246的氨基酸序列所成之融合肽形式組成，或編碼與具有其它所需作用的制劑所成之結(jié)合物形式的氨基酸247到370。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中肽是一種為進(jìn)一步包括谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶之氨基酸序列的融合肽的肽結(jié)合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求3至7中任一項(xiàng)的方法，其中將分離的純化或未純化的肽或肽結(jié)合物進(jìn)一步與佐劑混合。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中佐劑是弗氏不完全佐劑。
10.根據(jù)要求3到9中任一項(xiàng)的方法，其中借助以天然產(chǎn)生的產(chǎn)氣莢膜桿菌DNA作模板的多聚酶鏈反應(yīng)提供編碼肽或肽結(jié)合物的DNA。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中將產(chǎn)生的DNA插入到質(zhì)粒中。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中通過將質(zhì)粒包含于細(xì)胞內(nèi)而將質(zhì)粒插入到能支持肽表達(dá)的細(xì)胞中。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞或酵母。
14.生產(chǎn)能抑制人或動物中產(chǎn)氣莢膜桿菌致死效應(yīng)之抗血清的方法，該方法包括給動物使用按權(quán)利要求3到13中之任一項(xiàng)的方法生產(chǎn)的肽或肽結(jié)合物，并在抗體誘導(dǎo)期后從動物體內(nèi)除去血清。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中動物是兔豬或小鼠。
16.生產(chǎn)能抑制人或動物中產(chǎn)氣莢膜桿菌致死效應(yīng)之抗體的方法，該方法包括用親和層析法純化按權(quán)利要求14或15的方法生產(chǎn)的抗血清。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中親和層析使用按權(quán)利要求3到13中任一項(xiàng)的方法生產(chǎn)的固相化的肽或肽結(jié)合物以結(jié)合抗血清中的抗體，然后從固相化肽或肽結(jié)合物上洗脫這些抗體。
18.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中抗體是抗體生成細(xì)胞與雜交瘤細(xì)胞融合所產(chǎn)生的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了生產(chǎn)新肽和疫苗的方法，包括給動物使用所述新肽和疫苗后，它們能在動物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生直接抗產(chǎn)氣莢膜桿菌α毒素(CPα)的抗體并由此預(yù)防由產(chǎn)氣莢膜桿菌和/或α毒素本身引起的感染。本發(fā)明優(yōu)選的肽含有產(chǎn)生氣莢膜桿菌α毒素之氨基酸247到370的氨基酸序列，但沒有見于氨基酸1到240之間的磷脂酶C和/或神經(jīng)鞘髓磷脂水解活性必需的抗原決定簇序列。另外還提供了產(chǎn)生抗本發(fā)明產(chǎn)生之肽和疫苗的抗血清和抗體，特別是單克隆抗體以及用于其生產(chǎn)目的之雜交瘤細(xì)胞系的方法。
文檔編號A61P31/04GK1084407SQ9310758
公開日1994年3月30日 申請日期1993年5月20日 優(yōu)先權(quán)日1992年5月20日
發(fā)明者R·W·蒂特波爾, E·D·威廉森 申請人:大不列顛及北愛爾蘭聯(lián)合王國國防大臣