專利名稱：與生物分子連接的聚氧化亞甲基-氧化乙烯共聚物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提高活性的生物因子，它包括生物分子共價(jià)地鍵合到一種或多種合成的聚合物上，其中所說的合成聚合物是由氧化亞甲基-氧化乙烯部分結(jié)構(gòu)衍生而來的。
許多為治療目的而被給藥使用的生物學(xué)上的分子(生物分子)通過腎小球過濾作用從循環(huán)中迅速地清除出去，因而，顯示相當(dāng)短期的藥理活性。正是由于這樣迅速的清除作用，所以常常需要在較頻繁的間隔給予大量的生物分子，以便達(dá)到所要求的治療響應(yīng)。曾有報(bào)導(dǎo)，在許多情況下，該治療試劑的清除時(shí)間可以通過水可溶的聚合物的共價(jià)接合而被延長(zhǎng)，這類水可溶聚合物的實(shí)例有聚乙二醇、乙二醇與丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮和聚脯氨酸[Abuchowski and Daris，Soluble Polymer-Enzyme Adducts.InEnzymes as Drugs，Holcenderg and Roberts，eds.，Wiley-Interscience，New York，NY，1981，pp.367-383;Newmark，et al.，J.Appl.Biochem.4185-189(1982);katre，et al.，proc.Natl.Acad.sci.USA 841487-1491(1987)]。要求與這些聚合物的接合是為了提高更多疏水性藥品在水中的溶解性、消除肽和蛋白質(zhì)的聚集作用并大大地減少它們的免疫性和抗原性，通?？梢蕴岣咧委熢噭┑奈锢砗突瘜W(xué)的穩(wěn)定性。對(duì)于蛋白質(zhì)和肽[Fuertges and Abuchowski，J.controlled release，11139-148(1990)]、低分子量治療試劑[Zalli psky et al.，Eur.polym.J.，191177-1183(1983)]以及，新近對(duì)于脂質(zhì)體類[Woodle，et al.，US patent 5013556，issued 7th May 1991]的改進(jìn)性質(zhì)均已報(bào)導(dǎo)過了。
盡管有許多明確的報(bào)導(dǎo)，查閱科技文獻(xiàn)表明，共價(jià)鍵連接到合成的水可溶聚合物上沒有預(yù)示可提高生物分子的生物活性。例如，鏈激酶-血纖維蛋白溶酶配合物和Pluronic F68，即乙二醇和丙二醇的嵌段共聚物的結(jié)合破壞這種酶的活性[Newmark，et al.，J.Appl.Biochem.4185-189，(1982)]。曾報(bào)導(dǎo)過幾種蛋白質(zhì)的葡聚糖結(jié)合物對(duì)兔、羊和豚鼠是強(qiáng)化地致免疫的[Richter et al.，Int.Arch.Allergy，42885-902(1972)。尿酸酶的葡聚糖連接物對(duì)于小鼠的等離子體半衰期依賴于葡聚糖的電荷情況，陽離子型的和中性的葡聚糖加速蛋白質(zhì)的消除作用，而陰離子型葡聚糖則提高半衰期[Fujita et al.，J.controlled Release，11149-156(1990)]。曾已發(fā)現(xiàn)，聚乙烯基吡咯烷酮連接物是免疫的[Abuchowski and Davis，Soluble polymer-Enzyme Adducts.InEnzymes as Drugs，Holcenberg and Roberts，eds.，Wiley-Interscience，New York，NY，1981，PP.367-383]，并且破壞核糖核酸酶的生物活性(Veronese，et al.J.Bioactive comp.polym.，5167-178(1990))。相反，核糖核酸酶與聚乙二醇(PEG)連接之后則保持它的活性[Veronese，et al.，Appl.Biochem.Biotech.，11141-152(1985)]。甚至于取代度和連接鍵的類型都能夠影響生物分子的生物活性。例如，1989年4月10日公開的歐洲申請(qǐng)0335423A2所披露的那樣，氰尿酰氯活化的PGE對(duì)蛋白質(zhì)粒性細(xì)胞集群激化因子(G-CSF)的漸進(jìn)連接作用成比例地減少它的體外生物活性。這些例子表明，生物分子與水可溶聚合物的連接作用不可能預(yù)示到改進(jìn)治療試劑的生物學(xué)性質(zhì)的方法。
聚-1，3-二氧戊環(huán)是含有通式-[-O-CH2-O-CH2-CH2-]n-的合成水溶性聚合物。聚-1，3，6-三氧辛環(huán)是結(jié)構(gòu)相關(guān)具有通式-[-O-CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-]n-聚合物。其中，n是重復(fù)鏈節(jié)單元數(shù)，其理論值可以從10以下到成千上萬。這兩種聚合物均含有氧化亞甲基-氧化乙烯部分結(jié)構(gòu)。盡管聚合物具有的這種結(jié)構(gòu)是現(xiàn)有技術(shù)中已知的[Franta，et al.，Die Makromol.Chem.1911689-1698(1990);Velichove，et al.，J.Polymer Science，Part A，283145-54(1990)]，但是迄今為止，沒有任何人使其與生物分子連接起來以便提高后者的活性。
含有氧化亞甲基-氧化乙烯部分結(jié)構(gòu)的聚合物的簡(jiǎn)易制法，是使環(huán)狀單體1，3-二氧戊環(huán)或1，3，6-三氧辛環(huán)進(jìn)行開環(huán)聚合。在得到的聚合物(聚-1，3-二氧戊環(huán)和聚-1，3，6-三氧辛環(huán))中亞甲基氧對(duì)乙烯氧基的比例分別為1∶1和1∶2。由1，3-二氧戊環(huán)和1，3，6-三氧辛環(huán)互相之間或與其它單體之間的共聚合作用而使該比例可以在非整數(shù)值的廣泛的范圍內(nèi)變化。例如，具有通式(CH2O)3的1，3，5-三噁烷已經(jīng)或與1，3-二氧戊環(huán)或與1，3，6-三氧辛環(huán)進(jìn)行共聚合來提高聚合物中的亞甲基氧基的含量。另外，與環(huán)氧乙烷的共聚合可以提高乙烯氧基的含量。這些氧化亞甲基-氧化乙烯聚合物與生物試劑的結(jié)合構(gòu)成了本發(fā)明。
先前介紹的有關(guān)制備聚合物-結(jié)合加合物的各種方法，沒有一種對(duì)于如何用主題聚合物改性生物分子以提高其體內(nèi)生物活性的任何細(xì)節(jié)加以披露。
本發(fā)明公開一類新的具有改進(jìn)的性質(zhì)，例如較大的穩(wěn)定性，較長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期、降低的免疫性和抗原性、以及提高了的對(duì)哺乳動(dòng)物的效能的生物試劑的聚合物衍生物。該聚合物是由按有規(guī)、無規(guī)或嵌段方式排列的氧化亞甲基和氧化乙烯基的鏈節(jié)組成的。氧化乙烯對(duì)氧化亞甲基的比例可在很寬的范圍變化，并且可以通過選擇用于制備該聚合物的單體而被確定，根據(jù)聚合引發(fā)劑和催化劑而定，可以用未反應(yīng)的嵌段基團(tuán)，例如烷基或芳基醚基，在鏈的末端對(duì)該聚合物進(jìn)行部分地取代或在鏈的末端不進(jìn)行取代。該水溶性氧化亞甲基-氧化乙烯共聚物具有至少一個(gè)末端反應(yīng)基與生物分子的功能基因結(jié)合，并對(duì)所制得的加合物進(jìn)行純化，以便生產(chǎn)一種具有延長(zhǎng)了循環(huán)半衰期的和提高了生物活性的改性的生物分子。


圖1、一次皮下注射100μg/kg的rhu G-CSF(+)，100μg/kg的α-乙氧基-聚(1，3-二氧戊環(huán))-ω-琥珀酸酯-rhu G-CSF，實(shí)施例3A，(-◇-)，或安慰劑(-○-)，之后在倉(cāng)鼠體內(nèi)循環(huán)的白(血)細(xì)胞的含量。
圖2、一次皮下注射100μg/kg的rhu G-CSF(+)，100μg/kg的α-乙氧基-聚(1，3-二氧戊環(huán))-ω-碳酸酯-rhu G-CSF，實(shí)施例3B，(-◇-)，或安慰劑(-○-)，之后在倉(cāng)鼠體內(nèi)循環(huán)的白(血)細(xì)胞的含量。
圖3、7天皮下注射1 mg/kg的rr-SCF，1mg/kg的α-乙氧基-ω-羧甲基-聚(1，3-二氧戊環(huán))-rr-SCF[EPD-rr-SCF(2X)，實(shí)施例3C;EPD-rr-SCF(10X)，實(shí)施例3D]，1mg/kg的α-乙氧基-ω-羧甲基-聚(1，3，6-三氧辛環(huán))-rr-SCF[EPT-rr-SCF(2X)，實(shí)施例3E;EPT-rr-SCF(10X)，實(shí)施例3F]或安慰劑(-○-)之后在小鼠體內(nèi)循環(huán)的白(血)細(xì)胞的含量。
本發(fā)明涉及具有提高了生物活性的生物因子，它包括生物分子共價(jià)地鍵合到一種或多種聚合上，其中所說的聚合物含有氧化亞甲基-氧化乙烯部分結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的生物分子包括那些具有顯著生物學(xué)活性(最好是體內(nèi)活性)的任何一種分子，或者是具有顯著生物學(xué)活性的分子載體。生物活性指的是對(duì)于生物系統(tǒng)內(nèi)發(fā)生的任何一種反應(yīng)的發(fā)生、進(jìn)行速度、效率、和/或抑制的影響的能力，包括生物分子對(duì)受體的結(jié)合和對(duì)受體結(jié)合的細(xì)胞響應(yīng)。聚合的結(jié)合物可顯示出提高生物活性的生物分子和載體可舉例說明為，(但是不限于)蛋白質(zhì)、聚肽、脂質(zhì)體和低聚糖。其中較重要的蛋白質(zhì)是(a)粒細(xì)胞集群激發(fā)因子(G-CSF)，干細(xì)胞因子(SCF)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)和其它細(xì)胞分裂素(cytokines)，(b)腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性因子(BDNF)和其它神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性因子，(c)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，角蛋白(keratinocyte)生長(zhǎng)因子(KGF)和其它生長(zhǎng)因子，(d)金屬蛋白酶抑制劑(MI)，同感干擾素和其它在體內(nèi)可有酶促活性或抑制酶促活性的內(nèi)生蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的聚合物是由氧化亞甲基和氧化乙烯基氧化亞甲基-[-O-CH2]-氧化乙烯基-[O-CH2-CH2]-的鏈節(jié)構(gòu)成的。
如上所列，本發(fā)明的聚合物可由構(gòu)成聚合物鏈的氧化亞甲基和氧化乙烯基的完全無規(guī)的鏈段所組成。該聚合物也可以由氧化亞甲基和氧化乙烯基的有規(guī)鏈段，如其重復(fù)基團(tuán)為-O-CH2-O-CH2-CH2-的有規(guī)鏈段衍生而來，在此情況下氧化亞甲基和氧化乙烯基在整個(gè)聚合物鏈中交替排列著的。另一種方法是，該聚合物可以是含有較長(zhǎng)的氧化亞甲基或氧化乙烯基的鏈段，如[-O-CH2]n-或-[O-CH2-CH2]n-的嵌段共聚物。該聚合物還可以是所有這些分子結(jié)構(gòu)的組合。優(yōu)選的是，氧化亞甲基的重復(fù)基團(tuán)是以至少10%(按數(shù)目計(jì))，較優(yōu)選為至少25%(按數(shù)目計(jì))，最優(yōu)選為大約50%的含量存在于該聚合物之中。
含有氧化亞甲基一氧化乙烯部分結(jié)構(gòu)的聚合物的簡(jiǎn)易制法是環(huán)狀單體1，3-二氧戊環(huán)或1，3，6-三氧辛環(huán)的開環(huán)聚合法。在所制得的聚合物(聚-1，3-二氧戊環(huán)和聚-1，3，6-三氧辛環(huán))中，亞甲基氧對(duì)乙烯基氧的比例分別為1∶1和1∶2。通過1，3-二氧戊環(huán)和1，3，6-三氧辛環(huán)互相之間或與其它單體之間的共聚合反應(yīng)，可使該比例在很寬的非整數(shù)區(qū)域變化。例如具有通式(CH2O)3的1，3，5-三噁烷可以隨便與1，3-二氧戊環(huán)或1，3，6-三氧辛環(huán)進(jìn)行共聚合，以便增加聚合物中亞甲基氧的含量。另外與環(huán)氧乙烷的共聚合可以用來增加乙烯基氧的含量。
具有氧化亞甲基和氧化乙烯基無規(guī)排列的優(yōu)選聚合物可以采用環(huán)狀單體對(duì)的陽離子開環(huán)聚合而制備。適于該目的的優(yōu)選環(huán)狀單體是1，3-二氧戊環(huán)、1，3，6-三氧辛環(huán)、環(huán)氧乙烷和1，3，5-三噁烷，較優(yōu)選的是1，3-二氧辛環(huán)、1，3，6-三氧辛烷和1，3，5-三噁烷。這些優(yōu)選的單體可以按各種組合進(jìn)行共聚以便形成聚合物，其中最好的是構(gòu)成單體時(shí)，例如是環(huán)氧乙烷與1，3-二氧戊環(huán)、1，3-二氧戊環(huán)與1，3，5-三噁烷、1，3-二氧戊環(huán)與1，3，6-三氧辛環(huán)以及1，3，6-三氧辛環(huán)與1，3，5-三噁烷。
最優(yōu)選的實(shí)施方案是聚(1，3-二氧戊環(huán))，其中聚合物鏈中氧化亞甲基為50%(按數(shù)目計(jì))，并且其規(guī)則的重復(fù)鏈段為-(OCH2OCH2CH2)-。按照已知方法1，3-二氧戊環(huán)進(jìn)行陽離子開環(huán)聚合可以制得該聚合物[Franta et al.，Die Makromol，Chem.，1911689-1698(1990)]。第二種最優(yōu)選的實(shí)施方案是聚(1，3，6-三氧辛環(huán))，其中氧化亞甲基含量為33%(按數(shù)目計(jì))，并且其規(guī)則重復(fù)鏈段為-(OCH2OCH2CH2OCH2CH2)-。按照已知方法[Velichova，et al.，J.Polymer Science，Part A，283145-54(1990)]使1，3，6-三氧辛環(huán)進(jìn)行陽離子聚合可以制得該聚合物。第三種最優(yōu)選的實(shí)施方案是一種具有由1，3-二氧戊環(huán)和1，3，5-三噁烷共聚合得到的無規(guī)鏈段的聚合物，該聚合物中氧化亞甲基含量接近于80%(按數(shù)目計(jì))。按照實(shí)施例1c所述的方法可以獲得該聚合物。
在預(yù)聚物存在下使一種單體進(jìn)行引發(fā)聚合可以制備嵌段共聚物。例如，眾所周知，在市售的羥基封端的聚乙二醇存在下，使1，3-二氧戊環(huán)進(jìn)行陽離子聚合將導(dǎo)致嵌段共聚物的形成[Reibel，et al.，Makromol.Chem.Macromol.Symp.3221-230(1986)]。正如聚合物化學(xué)家們業(yè)已知道的那樣，具有不相等反應(yīng)性的單體的共聚合將不能得到完全無規(guī)的單體單元排列，但是可以得到一種含有一個(gè)或兩個(gè)鏈節(jié)單元的長(zhǎng)鏈段的聚合物。
本發(fā)明的聚合物的優(yōu)選尺寸是適于方便的連接到生物分子上并適于改進(jìn)或提高該生物分子的生物活性。對(duì)于本發(fā)明聚合物的適宜尺寸優(yōu)選的是，其數(shù)均分子量小于100，000，較優(yōu)選的是數(shù)均分子量在500和50，000之間，最優(yōu)選的是數(shù)均分子量在1，000和10，000之間。
采用本技術(shù)領(lǐng)域通常已知的方法使主題聚合物對(duì)任何一種生物分子的結(jié)合都能夠是有效的，例如，該聚合物可以方便地連接到肽或蛋白質(zhì)中的一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)性的氨基酸殘基(如氨基末端的氨基酸的α-氨基、賴氨酸側(cè)鏈的ε-氨基)、半胱氨酸側(cè)鏈的巰基、天冬氨酰和谷氨?；鶄?cè)鏈的羧基、羧基末端的氨基酸的α-羧基、酪氨酸側(cè)鏈，或連接到已連接到某些天冬酰胺、絲氨酸或蘇氨酸殘基上的糖基鏈的活化衍生物上。官能團(tuán)的類似變化也存在于與低分子量藥物的結(jié)合之中。例如，PEG已被結(jié)合到使用羥基、羧基和氨基等官能度的青霉素v、阿司匹靈、苯異丙胺、奎寧和阿托品上[Zalipsky et al.，Eur.polym.J.，191177-1183(1983)]。
適于直接與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氧化亞甲基-氧化乙烯聚合物的大多數(shù)活化形式都可以被使用。對(duì)于與生物分子的氨基基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)的有用的官能團(tuán)包括碳酸酯衍生物或羧酸的活化酯類、尤其是，其中離去基團(tuán)是N-羥基丁二酰亞胺、對(duì)一硝基苯酚、或1-羥基-2-硝基苯-4-磺酸酯。含有馬來酰亞氨基或鹵代乙?；木酆衔镅苌飳?duì)于游離巰基的結(jié)合作用是有用的試劑。同樣，含有氨基、肼或酰肼基團(tuán)的試劑，對(duì)于與由生物分子的碳水化合物基團(tuán)的高碘酸氧化作用而產(chǎn)生的醛類進(jìn)行反應(yīng)是有用的。
重要的是，應(yīng)當(dāng)控制氧化亞甲基-氧化乙烯聚合物上的活化基團(tuán)數(shù)。尤其是，如果生物分子具有一個(gè)以上的官能團(tuán)能夠結(jié)合時(shí)，最好借助于聚合物鏈的單一末端基進(jìn)行結(jié)合;多官能的聚合物與多官能的生物分子反應(yīng)時(shí)，非?？赡墚a(chǎn)生不可控制的連環(huán)作用和交聯(lián)的產(chǎn)物。具有單一反應(yīng)基的聚合物的制備方法是通過特殊選擇的催化劑和引發(fā)劑的聚合條件而實(shí)現(xiàn)的。在三氟代甲磺酸催化劑存在下以醇類作為引發(fā)劑對(duì)1，3-二氧戊環(huán)和1，3，6-三氧辛環(huán)等單體進(jìn)行開環(huán)聚合;能產(chǎn)生出含有一個(gè)羥基末端基和一個(gè)烷氧基末端基的聚合物[Franta，et al.，Die Makromol.Chem.1911689-1698(1990)]。用氟代磺酸甲酯或三氟甲磺酸甲酯作為催化劑對(duì)1，3-二氧戊環(huán)進(jìn)行聚合制備出的聚合物為α-甲氧基-ω-羥基-聚(1，3-二氧戊環(huán))，該聚合物含有一個(gè)甲氧基和一個(gè)羥基末端基[Yokoyama，et al.，Polymes J.，365-370(1979)]。
正如聚合物科學(xué)家們所熟知的那樣，由公式Mn＝[ROH]-1可見，產(chǎn)物的分子量將直接地與所用的醇的摩爾數(shù)有關(guān)。因此，使用多元醇時(shí)將使之有可能制備出含有氧化亞甲基和氧化乙烯鏈的支化聚合物。
在生物分子中反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目，它們相對(duì)于受體連接位的空間分布、以及它們?cè)诰S持固有結(jié)構(gòu)和生物活性中的重要性方面，各種化合物之間是各不相同的。鑒于這一原因，通常是不可能先驗(yàn)地預(yù)示將產(chǎn)生最佳的長(zhǎng)期結(jié)合又不破壞它的理想的生物活性的改性的程度或聚合物連接位。
改性的生物因子(包括生物分子共價(jià)地鍵合到一種或多種聚合物鏈上)可以用于改進(jìn)或提高生物分子的生物活性。改進(jìn)生物分子的生物活性將包括提高它的特效活性、提高它的循環(huán)半衰期、降低它的清除性、降低它對(duì)酶降解的敏感性、提高它的吸收性、提高它的物理的和熱的穩(wěn)定性、減少它的抗原性、或提高它的溶解性。
本發(fā)明的改性生物因子的給藥包括含有作為活性組分的改性生物因子的藥物組合物的合適量的給藥。該藥物組合物除了活性組分之外，還可以含有適當(dāng)?shù)木彌_劑，稀釋劑和添加劑。給藥可以采用包括但不限于靜脈內(nèi)的、皮下的、或肌肉內(nèi)的任何一種慣用方法進(jìn)行。
最好，藥物制劑是按單位劑量形式。在這樣的形式中，制劑再被細(xì)分成含有合適量例如為達(dá)到要求目的的有效量的活性組分的單位劑量。
使用的實(shí)際劑量可以根據(jù)患者的需要和處理情況的嚴(yán)重程度加以改變。對(duì)于特殊情況的合適劑量的確定是本技術(shù)領(lǐng)域熟知的。通常，處理是以小于該化合物的最佳劑量的較小劑量開始的。因此，增加劑量是通過少量增加直到在這些情況下達(dá)到最佳效果。給藥量和給藥頻率將根據(jù)考慮到如患者的年令、病情和體重以及待處理的疾病的嚴(yán)重程度的照管臨床醫(yī)生的判斷進(jìn)行調(diào)節(jié)。
實(shí)施例下面提供幾個(gè)實(shí)施例作為本發(fā)明的特定實(shí)施方案，但是對(duì)本發(fā)明的范圍沒有任何限制。
實(shí)施例1聚合物的制備根據(jù)Franta等人所介紹的方法[Die Makromolek Chem.1911689-1698(1990)]分別對(duì)1，3-二氧戊環(huán)和1，3，6-三氧辛環(huán)進(jìn)行陽離子均聚來制備聚(1，3-二氧戊環(huán))和聚(1，3，6-三氧辛環(huán))。1，3-二氧戊環(huán)和1，3，6-三氧辛環(huán)彼此之間和與1，3，5-三噁烷之間的共聚物是通過同樣的方法，使用合適的單體混合物進(jìn)行制備的。聚合物的末端基和分子量是通過選擇催化劑和引發(fā)劑加以控制的。
A、α-乙氧基-ω-羥基-聚(1，3-二氧戊環(huán))將二氯甲烷(26.9克)和1，3-二氧戊環(huán)(32.5克)放在氫化鈣上保存過夜進(jìn)行干燥，然后在氮?dú)庀抡麴s到引發(fā)劑2-(2-乙氧基乙氧基)乙醇(0.62克)和催化劑三氟甲磺酸(30毫升)的玻璃器皿中。在50℃下進(jìn)行聚合。5小時(shí)以后，加入1毫升氫氧化鉀水溶液并對(duì)混合物進(jìn)行振蕩，然后注入到冷乙醚中。對(duì)沉淀的聚合物進(jìn)行過濾，并在真空下進(jìn)行干燥，然后用核磁共振(NMR)和紅外光譜(IR)以及凝膠滲透色譜(GPC)進(jìn)行鑒定。熔點(diǎn)為44℃。特性粘度為[η]＝0.273(CHCl3中測(cè)定的)。1H-NMR光譜表明主峰在4.76.(-O-CH2-O-)和3.73PPM(-O-CH2CH2-O-)，比例2∶4，由于末端乙氧基引起的子峰在1.21(t，J＝7Hz，-CH3)和3.53(q，J＝7Hz，-OCH2-).IR(液膜)峰出現(xiàn)在3550CM-1(OH末端基);GPC(超級(jí)聚苯乙烯型交聯(lián)共聚物，CHCl3，聚乙二醇標(biāo)準(zhǔn)樣)Mn＝5400，Mw/Mn＝1.71。
α-甲氧基-ω-羥基-聚(1，3-二氧戊環(huán))的制備是用取代的三氟甲磺酸甲酯代替三氟甲磺酸，并且不用2-(2-乙氧基乙氧基)-乙醇。
B、聚(1，3，6-三氧辛環(huán))于甲苯中在Amberlite IR-120(Rohm and haas co.)存在下由甲醛與二乙二醇的反應(yīng)來制備1，3，6-三氧辛環(huán)，這是按照Astle等人介紹的方法進(jìn)行的[Ind.Eng.Chem.，46(4)787-91(1954)]。1，3，6-三氧辛環(huán)(15.5克)的聚合是在50℃下干燥的硝基甲烷(22.2克)中，使用2-(2-乙氧基乙氧基)乙醇(0.20克，1.48毫摩爾)作為引發(fā)劑和三氟甲烷磺酸(100μl，1.13毫摩爾)作為催化劑的條件下進(jìn)行的。15分鐘以后，用叔-丁基胺驟冷該混合物，然后通過用乙醚沉淀來離析該產(chǎn)物。對(duì)沉淀的聚合物(13.3克，86%)進(jìn)行過濾、在真空下干燥，并用NMR和IR光譜以及凝膠滲透色譜(GPC)進(jìn)行鑒定。特性粘度[η]＝0.31(CHCl3)。1H-NMR光譜展示的主峰在4.74(-O-CH2-O-)和3.69PPM(-O-CH2-CH2-O-)，比例2∶8，以及由乙氧末端基引起的子峰在1.21(t，J＝7Hz，-CH3)。IR(液膜)峰出現(xiàn)在3550cm-1(OH末端基);GPC(超級(jí)聚苯乙烯型交聯(lián)共聚物，CHCl3，聚乙二醇標(biāo)準(zhǔn)樣)Mn＝7440，Mw/Mn＝1.15。
C、1，3-二氧戊環(huán)和1，3，5-三噁烷的共聚物將二氯甲烷(28克)和1，3-二氧戊環(huán)(37.0克)于氫化鈣中保存過夜來進(jìn)行干燥，然后在氮?dú)庀抡麴s到內(nèi)裝1，3，5-三噁烷(45.0克)、引發(fā)劑2-(2-乙氧基乙氧基)乙醇(0.62克)和催化劑三氟甲磺酸(30微升)的玻璃器皿中。在50℃下進(jìn)行聚合。5小時(shí)之后，加入1毫升的氫氧化鉀水溶液并振蕩該混合物，然后注入冷乙醚中。對(duì)沉淀的聚合物進(jìn)行過濾、在真空下干燥和用NMR和IR光譜以及凝膠滲透色譜進(jìn)行鑒定。特性粘度[η]＝.3(CHCl3)。1H-NMR光譜展示的主峰在4.76(-O-CH2-O-)和3.73PPM(-O-CH2-CH2-O-)，比例8∶4，和由乙氧末端基產(chǎn)生的子峰在1.21(t，J＝7Hz，-CH3)和3.53(q，J＝7Hz，-OCH2-)。IR(液膜)3550 cm-1(OH末端基);GPC(超級(jí)聚苯乙烯型交聯(lián)共聚物，CHCl3，聚乙二醇標(biāo)準(zhǔn)樣)Mn＝5000，Mw/Mn＝1.7。
實(shí)施例2活化的聚合物的制備A、琥珀酰亞胺基α-乙氧基-聚(1，3-二氧戊環(huán))-ω-碳酸酯將α-乙氧基-ω-羥基-聚(1，3-二氧戊環(huán))(3.5克，0.65毫摩爾)和N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(716毫克，2.80毫摩爾)溶解在無水二甲基甲酰胺(DMF)(20毫升)中，接著將無水DMF(10毫升)中的二甲基氨基吡啶(512mg，4.19毫摩爾)滴加進(jìn)去。在室溫下將該反應(yīng)混合物攪拌一小時(shí)，然后緩慢地加到4℃的無水乙醚(300毫升)中。過濾收集沉淀物，然后沉淀物再溶于無水DMF中并用無水乙醚使其沉淀再進(jìn)行回收，得到3克產(chǎn)物。
對(duì)該產(chǎn)物和其它琥珀酰亞胺基酯類的琥珀酰亞胺基含量進(jìn)行光譜測(cè)定，精確稱取大約2-3毫克的產(chǎn)物，并用100mM N-二(羥乙基)甘氨酸緩沖劑進(jìn)行稀釋，PH為8.0，以便得到濃度為1毫克/毫升。在一個(gè)1cm的小透明池中監(jiān)測(cè)260mm處的紫外線吸量作為時(shí)間的函數(shù)，一直監(jiān)測(cè)利獲得恒定的吸收為止。從起始的吸收(Ao)和最后的吸收(A∞)之差以及已知的N-羥基琥珀酰亞胺的消光系數(shù)8760M-1cm-1。
B、琥珀酰亞胺基α-乙氧基-聚(1，3-二氧戊環(huán))-ω-戊二酸酯將α-乙氧基-ω-羥基-聚(1，3-二氧戊環(huán))(2.7克，0.50毫摩爾)、戊二酸酐(285毫克，2.50毫摩爾)、二甲基氨基吡啶(244毫克，2.01毫摩爾)和三乙基胺(0.28毫升，2.01毫摩爾)溶于無水二噁烷(25毫升)中。在室溫下放置過夜之后，通過將反應(yīng)混合物滴入冷乙醚和環(huán)己烷(2∶1，300毫升)中而對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行回收。對(duì)沉淀物進(jìn)行過濾和真空干燥，生產(chǎn)出2.5克產(chǎn)物。將該中間產(chǎn)物戊二酸半酯(2.5克，0.45毫摩爾)溶于無水二氯甲烷(20毫升)中，然后加入二環(huán)己基羰基二酰亞胺(0.207毫克，1.00毫摩爾)。和N-羥基琥珀酰亞胺(0.12克，1.0毫摩爾)。將該溶液在室溫下放置過夜，然后通過過濾除去沉淀的二環(huán)已基脲并用二氯甲烷洗滌。經(jīng)蒸發(fā)濃縮過的濾液被加入到冷的無水乙醚/環(huán)己烷(2∶1，300毫升)中。沉淀的產(chǎn)物通過用乙醚/環(huán)己烷從無水DMF中再沉淀而被提純，得到2.2克產(chǎn)物。
C、琥珀酰亞胺基α-乙氧基-ω-羧甲基-聚(1，3-二氧戊環(huán))將α-乙氧基-ω-羥基-聚(1，3-二氧戊環(huán))(5克，0.09毫摩爾)溶于無水甲苯(20毫升)中，并加入叔-丁醇鉀(potassium t-butanoate)(1.6克，14毫摩爾)。使該溶液進(jìn)行回流，然后在50℃下保持5小時(shí)。緩慢地加入溴乙酸乙酯并在同樣的溫度下對(duì)該溶液攪拌過夜。通過過濾除去沉淀出來的鹽并用二氯甲烷(20毫升)進(jìn)行洗滌。通過部分地濃縮該濾液并緩慢地注入到乙醚/環(huán)已烷(1∶1，200毫升)中來回收該聚合物。真空下干燥的該聚合物再被溶于1N的NaOH(20毫升)中然后加NaCl(4克)。1小時(shí)之后，用2N的HCl酸化該溶液使其PH＝3.0，然后用二氯甲烷(3X50毫升)進(jìn)行萃取?；旌系挠袡C(jī)相被干燥(MgSO4)，濃縮到30毫升，然后注入到冷的乙醚/環(huán)己烷(3∶1，300毫升)中。通過過濾收集沉淀物并于真空下進(jìn)行干燥。
將得到的α-乙氧基-ω-羧甲基-聚(1，3-二氧戊環(huán))(5克，0.09毫摩爾)溶于無水二氯甲烷(20毫升)中，并加入N-羥基琥珀酰亞胺(0.23克，2.0毫摩爾)和二環(huán)己基羰基二酰亞胺(0.413克，2.00毫摩爾)。該溶液于室溫下放置過夜，之后通過過濾除去沉淀出來的環(huán)己基脲并用二氯甲烷洗滌。該溶液被濃縮并加入到冷的無水乙醚/環(huán)己烷(1∶1，300毫升)。通過用乙醚/環(huán)己烷從無水DMF的溶液中沉淀的辦法提純?cè)摦a(chǎn)物，得到4.8克產(chǎn)物。
D、琥珀酰亞胺基α-乙氧基-聚(1，3-二氧戊環(huán))-ω-琥珀酸酯將α-乙氧基-ω-羥基-聚(1，3-二氧戊環(huán))(5.4克，0.09毫摩爾)、琥珀酸酐(125毫克，1.25毫摩爾)、二甲基氨基吡啶(122毫克，1.00毫摩爾)和三乙基胺(0.14毫升，1.00毫摩爾)溶于無水二噁烷(30毫升)中并在室溫下放置過夜。蒸發(fā)除去溶劑，取出殘?jiān)湃胨穆然?15毫升)中，在冷乙醚(300)中過濾和沉淀。該沉淀物被過濾并在真空下被干燥。得到5.14克產(chǎn)物。將N-羥基琥珀酰亞胺(126毫克，1.09毫摩爾)加到于無水DMF(25毫升)中的該中間體(5克)中，接著再加入溶解在無水DMF(1毫升)中的二環(huán)己基羰基二酰亞胺(227毫克，1.10毫摩爾)。該混合物在室溫下放置過夜，并進(jìn)行過濾和通過在冷的無水乙醚(250毫升)中沉淀的辦法回收聚合物。在無水DMF中溶解和在乙醚中沉淀的操作過程重復(fù)兩次，得到4克產(chǎn)物。
E、琥珀酰亞胺基α-乙氧基-ω-羧甲基-聚(1，3，6-三氧辛環(huán))將α-乙氧基-ω-羥基-聚(1，3，6-三氧辛環(huán))(7.5克，1.0毫摩爾)溶于50℃下的無水叔-丁醇(50毫升)中，再加入叔-丁醇鉀(1.6克，14毫摩爾)。該溶液于50℃下攪拌8小時(shí)。緩慢地加入溴乙酸乙酯(1.6毫升，14毫摩爾)并將該溶液于同樣溫度下攪拌過夜，通過過濾除去沉淀出來的鹽并用二氯甲烷(20毫升)洗滌。通過部分地濃縮該濾液并緩慢地注入到乙醚(300毫升)中的辦法回收該聚合物。所沉淀出來的聚合物在真空下被干燥，然后溶于1N的NaOH(30毫升)中再加入NaCl(6克)。4小時(shí)以后，用2N的HCl酸化該溶液使其PH＝3.0，然后用二氯甲烷(3×50毫升)進(jìn)行萃取?；旌系挠袡C(jī)相被干燥(MgSO4)，濃縮到25毫升，然后注入到冷的乙醚(300毫升)中。通過過濾收集沉淀物然后于真空下進(jìn)行干燥。
將得到的羧甲基衍生物(5.9克)溶于無水二氯甲烷(20毫升)中，然后加入N-羥基琥珀酰亞胺(0.18克，1.6毫摩爾)和二環(huán)己基羰基二酰亞胺(0.33毫克，1.6毫摩爾)。該溶液于室溫下放置過夜，此后通過過濾除去沉淀出來的環(huán)己基脲并用二氯甲烷洗滌。該溶液被濃縮并加到冷的無水乙醚(300毫升)中。通過重沉淀對(duì)該產(chǎn)物進(jìn)行提純，得到4.9克產(chǎn)物。
實(shí)施例3聚合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合A、聚(1，3-二氧戊環(huán))與G-CSF的結(jié)合將按實(shí)施例2D所述方法制備的琥珀酰亞胺基α-乙氧基-聚(1，3-二氧戊環(huán))-ω-琥珀酸酯(500毫克，80.6微摩爾，Mn＝6，700)加到3.0毫升含有30.3毫克(1.61微摩爾)在0.10M硼酸鈉中(PH＝9.0)的重組體的人的粒細(xì)胞集群激發(fā)因子(rhuG-CSF)的溶液中。該溶液在室溫下被攪拌30分鐘，然后用27毫升0.10M的檸檬酸鈉稀釋，使其PH＝3.25，再將其濃縮(Amicon Centriprep 10離心超濾機(jī))至最終體積接近于2毫升。該濃縮的粗制反應(yīng)混合物被送入凝膠過濾柱(pharmacia Superdex prep 200，1.6×60cm)然后再用0.10M的檸檬酸鈉，在PH＝3.25，和在0.25毫升/分鐘的流速下進(jìn)行洗脫。連續(xù)地監(jiān)測(cè)柱中的蛋白質(zhì)流出物(在280nm處的UV吸收)，收集各級(jí)份(1.0毫升)。各級(jí)份號(hào)為18-57，含有改性蛋白質(zhì)的絕大部分的這些級(jí)份，通過對(duì)于注射水逆向(WFI)的超濾作用(Amicon Ym10滲透膜)而被沉積，被滲析，用HCl滴定到PH＝3.25，然后通過超濾將其濃縮到最終的蛋白質(zhì)濃度為1.2毫克/毫升(是使用對(duì)于1.0毫克/毫升的溶液而言A280＝0.86的rhuG-CSF值由A280計(jì)算的)。
在類似凝膠過濾色譜條件下，未改性的rhuG-CSF洗脫的各級(jí)份編號(hào)為77-84。
B、聚(1，3-二氧戊環(huán))與G-CSF的結(jié)合將按實(shí)施例2A所述方法制備的琥珀酰亞胺基α-乙氧基聚(1，3-二氧戊環(huán))-ω-碳酸酯(437毫克，65.2微摩爾 Mn＝6700)加入到1.23毫升含有24.5毫克(1.30微摩爾)于0.10M硼酸鈉中的rhuG-CSF的溶液((PH＝9.0)中。該溶液于室溫下攪拌2小時(shí)，然后用11毫升0.10M的檸檬酸鈉，PH＝3.25，和49毫升的注射水(WFI)進(jìn)行稀釋。將該稀釋的粗制反應(yīng)混合物送入陽離子交換柱(Pharmacia Sepharose，1.5×2.3cm)中，該柱子已預(yù)先用20mM檸檬酸鈉預(yù)-平衡過了，PH＝3.25。一旦全部反應(yīng)混合物被吸收，則用8毫升20mM檸檬酸鈉洗滌，PH＝3.25，以便洗脫各種反應(yīng)付產(chǎn)物、N-羥基琥珀酰亞胺和α-乙氧基聚(1，3-二氧戊環(huán))-ω-碳酸酯。然后用24毫升20mM檸檬酸鈉，PH＝3.25，IMNaCl洗脫吸收的蛋白質(zhì)，采用逆向WFI的超濾作用(Amicon Ym10滲透膜)進(jìn)行滲析，用HCl滴定到PH＝3.25，再用超濾濃縮到最終的蛋白質(zhì)濃度為1.1毫克/毫升(是從使用對(duì)于1.0毫克/毫升溶液而言A280＝0.86的rhuG-CSF值的A280計(jì)算的)。采用在TosoHaas TSK G3000SWXL和TSK G4000SWXL串連柱子每個(gè)是0.78×30cm;5μ上的篩析HPLC分析反應(yīng)產(chǎn)物，用0.1M磷酸鈉，PH＝6.9，流速為1毫升/分，進(jìn)行洗脫，再用紫外線(280nm)和折射率測(cè)定儀連續(xù)地監(jiān)測(cè)流出物。最終產(chǎn)物沒有未結(jié)合的聚-1，3-二氧戊環(huán)和未改性的rhuG-CSF。
C、聚(1，3-二氧戊環(huán))與干細(xì)胞因子的結(jié)合將按實(shí)施例2C所述方法制備的琥珀酰亞胺基α-乙氧基-ω-羧甲基-聚(1，3-二氧戊環(huán))4.2毫克(0.793微摩爾)，加到于0.725毫升的0.1M N-(二羥基)甘氨酸緩沖液(PH＝8.0，室溫下)中的7.25毫克(0.396微摩爾)的重組大鼠干細(xì)胞因子(rr-SCF)中。1小時(shí)之后，反應(yīng)混合物用2.9毫升的WFI進(jìn)行稀釋，用1.0N的HCl滴定到PH＝4.0，并通過0.20μ醋酸纖維素過濾器(Nalgene no.156-4020)進(jìn)行過濾。濾液以4.0毫升/分的速度被送入6.0×1.6cm的Toypearl SP550C(TOSO-Haas)柱子中，該柱子已預(yù)先用20mM的醋酸鈉進(jìn)行了平衡(在室溫下PH＝4.0)。在試樣載荷期間按2.5毫克為一級(jí)份來收集從柱子中流出的流出物(編號(hào)為1-2)，并連續(xù)地監(jiān)測(cè)該流出物的紫外線吸收(A280)。然后柱子順序地用24.0毫升的平衡緩沖劑以4.0毫升/分的速度洗滌(級(jí)份編號(hào)為3-12)，再用48毫升的20mM醋酸鈉、0.3M的NaCl，PH＝4.0，以4.0毫升的速度進(jìn)行洗滌(級(jí)份編號(hào)為13-31)，最后用24.0毫升的20mM醋酸鈉，1.0M的NaCl，PH＝4.0，以8.0毫升/分的速度進(jìn)行洗滌(級(jí)份編號(hào)為32-41)?；旌虾芯酆衔?rr-SCF結(jié)合物的各級(jí)份(編號(hào)為16-23)，通過同10mM醋酸鈉，140mM的NaCl(PH＝50)逆向的超濾(Amicon YM-10滲透膜)來進(jìn)行滲析，再通過超濾(0.45μ醋酸纖維素膜;Costar no.8302)進(jìn)行滅菌，得到4.0毫克(按體積計(jì)為6.13毫升)的最終產(chǎn)物。
D、聚(1，3-二氧戊環(huán))與SCF的結(jié)合將按實(shí)施例2C所述方法制備的琥珀酰亞胺基α-乙氧基-ω-羧甲基-聚(1，3-二氧戊環(huán))19.4毫克(3.66微摩爾)，加到在0.67毫升0.1M的n-(二羥基)甘氨酸緩沖劑(PH＝8.0，室溫下)中的6.70毫克(0.366微摩爾)的rr-SCF中。1小時(shí)之后，反應(yīng)混合物用2.68毫升的WFI稀釋，用1.0N的HCl滴定到PH＝4.0，通過0.20μ的醋酸纖維素過濾器(Nalgene no.156-4020)進(jìn)行過濾，然后以4.0毫升/分的速度送入6.0x1.6cm的Toyopearl SP550C(TOSO-Haas)柱子中，該柱子已預(yù)先用20mM的醋酸鈉平衡過了(室溫下PH＝4.0)。在試樣載荷過程中以2.5毫升為一級(jí)來收集柱中流出物(編號(hào)為1-2)，并連續(xù)地監(jiān)測(cè)流出物的紫外線吸收(A280)。然后按下列順序洗滌該柱子用24.0毫升的平衡緩沖劑以4.0毫升/分的速度洗(級(jí)份編號(hào)為3-12)、用48.0毫升20mM的醋酸鈉、0.3M的NaCl(PH＝4.0)以4.0毫升/分的速度洗(級(jí)份編號(hào)為13-31)，最后用24.0毫升的20mm醋酸鈉、1.0m的NaCl(PH＝4.0)以8.0毫升/的速度洗(級(jí)份編號(hào)為32-41)?；旌虾芯酆衔?rr-SCF結(jié)合物的各級(jí)份，通過同10mM醋酸鈉，140mM的NaCl(PH＝5.0)逆向的超濾(Amicon YM-10滲透膜)來進(jìn)行滲析，再通過超濾(0.45μ醋酸纖維素膜;Costar no.8302)進(jìn)行滅菌，得到3.26毫克(按體積計(jì)為6.94毫升)的最終產(chǎn)物。
E、聚(1，3，6-三氧辛環(huán))與SCF的結(jié)合將按實(shí)施例2E制備的琥珀酰亞胺基α-乙氧基-ω-羧甲基-聚(1，3，6-三氧辛環(huán))(4.6毫克，0.794微摩爾)加到7.26毫克(0.397微摩爾)的rr-SCF中[rr-SCF是在0.726毫升的0.1M N-(二羥基)甘氨酸緩沖劑(室溫下 PH＝8.0)中的]。1小時(shí)之后反應(yīng)混合物用2.90毫升的WFI稀釋，用1.0N的HCl滴定至PH＝4.0，再經(jīng)過一個(gè)0.20μ的醋酸纖維素過濾器(Nalgene no.156-4020)進(jìn)行過濾，以4.0毫升/分的速度將該濾液送至一個(gè)6.0×1.6cm的Toyopearl SP550C(TOSO-Haas)柱子中，該柱子已預(yù)先用20mM的醋酸鈉(室溫下PH＝4.0)平衡過了。在試樣載荷過程中以2.5毫升為一個(gè)級(jí)份收集柱子的流出物(編號(hào)為1-2)，并連續(xù)地監(jiān)測(cè)流出物的紫外線吸收(A280)。然后按下列順序依次對(duì)柱子進(jìn)行洗滌用24.0毫升的平衡緩沖劑以4.0毫升/分的速度洗(級(jí)份編號(hào)為3-12)，用48.0毫升的20mM醋酸鈉、0.3M的NaCl(PH＝4.0)以4.0毫升/分的速度洗滌(級(jí)份編號(hào)為13-31)，最后用24.0毫升的20mM醋酸鈉、1.0m的NaCl(PH＝4.0)以8.0毫升/分的速度洗(級(jí)份編號(hào)為32-41)?；旌虾芯酆衔?rr-SCF結(jié)合物的各級(jí)份(16-26)，通過同10mM醋酸鈉，140mM的NaCl(PH＝5.0)逆向的超濾(Amicon YM-10滲透膜)來進(jìn)行滲析，再通過超濾(0.45μ醋酸纖維素膜;costar no.8302)進(jìn)行滅菌，得到3.47毫克(按體積計(jì)為7.15毫升)的最終產(chǎn)物。
F、聚(1，3，6-三氧辛環(huán))與SCF的結(jié)合將按照實(shí)施例2E所述方法制備的琥珀酰亞胺基α-乙氧基-ω-羧甲基-聚(1，3，6-三氧辛環(huán))(24.3毫克，4.19微摩爾)加到在0.767毫升的0.1M N-(二羥基)甘氨酸緩沖劑(室溫下PH＝8.0)中的7.67毫克(0.419微摩爾)的rr-SCF中。1小時(shí)之后反應(yīng)混合物用3.07毫升的WFI稀釋，用1.0N的HCl滴定至PH＝4.0，再經(jīng)過一個(gè)0.20μ醋酸纖維素過濾器(Nalgene no.156-4020)進(jìn)行過濾。以4.0毫升/分的速度將該濾液送至6.0×1.6cm的Toyopearl SP550C(TOSO-Haas)柱子中，該柱子已預(yù)先用20mM的醋酸鈉(室溫下PH＝4.0)平衡過了。在試樣載荷過程中以2.5毫升為一個(gè)級(jí)份收集柱子的流出物(編號(hào)為1-2)，并連續(xù)地監(jiān)測(cè)流出物的紫外線吸收(A280)。然后按下列順序依次對(duì)柱子進(jìn)行洗滌用24.0毫升的平衡緩沖劑以4.0毫升/分的速度洗(級(jí)份編號(hào)為3-12)，用48.0毫升的20mM醋酸鈉、0.3M的NaCl以(PH＝4.0)4.0毫升/分的速度洗(級(jí)份編號(hào)為13-31)，最后用24毫升的20mM醋酸鈉、1.0m的NaCl(PH＝4.0)以8.0毫升/分的速度洗(級(jí)份編號(hào)為32-41)。混合含有聚合物-rr-SCF結(jié)合物的各級(jí)份(15-19)，通過同10mM醋酸鈉，140mM的NaCl(PH＝5.0)逆向的超濾(Amicon YM-10滲透膜)進(jìn)行滲析，再通過超濾(0.45μ醋酸纖維素膜;costar no.8302)進(jìn)行滅菌，得到5.85毫克(按體積計(jì)為7.62毫升)的最終產(chǎn)物。
實(shí)施例4通過結(jié)合作用提高生物活性A、ω-乙氧基聚(1，3-二氧戊環(huán))與G-SCF結(jié)合物的在活體內(nèi)活性以在活體內(nèi)倉(cāng)鼠粒細(xì)胞生成活體檢定來對(duì)實(shí)施例3A和3B中所述的聚(1，3-二氧戊環(huán)-rhuG-CSF連接物與未改性的rhuG-CSF進(jìn)行比較。每個(gè)實(shí)驗(yàn)試料，聚(1，3-二氧戊環(huán))-rhuG-CSF結(jié)合物、未改性的rhuG-CSF或安慰劑按每一次劑量為100微克蛋白質(zhì)/kg體重的劑量是通過皮下注射給35只Golden Syrian雄倉(cāng)鼠(90-110克)。在劑量給藥后0.5、1、1.5、2、4、7和10天的間距上通過心臟穿刺從每一處理組的5只動(dòng)物采取末梢血樣，并測(cè)量總的白(血)細(xì)胞(WBC)數(shù)目。在用聚(1，3-二氧戊環(huán))-rhuG-CSF結(jié)合物處理的動(dòng)物體內(nèi)WBC的含量在劑量給藥后兩天的保持在提高的水平上，而在用來改性的rhuG-CSF處理的動(dòng)物體內(nèi)在相同時(shí)間里WBC的含量已經(jīng)恢復(fù)到原來的水平了(圖1和2)。
B、ω-乙氧基聚(1，3，6-三氧辛環(huán))和ω-乙氧基聚-(1，3-二氧戊環(huán))與SCF結(jié)合物的生物活性分別將實(shí)施例3C-3D和3E-3F所述所述方法制備的重組大鼠SCF的聚(1，3-二氧戊環(huán))和聚(1，3，6-三氧辛環(huán))結(jié)合物每天投藥給雌性Swiss ICR outbred小鼠(Charles River Breeding Laboratories CD-1;22-24克)，并以1.0毫克/kg的劑量連續(xù)七天。每個(gè)處理組由5只動(dòng)物組成。劑量給藥溶液通過用10mM醋酸鈉、0.14M的NaCl、0.5毫克/毫升小鼠血清清蛋白(PH＝5.0)稀釋聚合物一蛋白質(zhì)結(jié)合物的辦法進(jìn)行制備，并以0.2毫升的體積量通過皮下注射給藥。在實(shí)驗(yàn)研究的第8天時(shí)，通過用無菌解剖刀切割側(cè)尾脈的辦法從每只小鼠采取血樣，然后用一次性的吸管收集0.02毫升等分試樣的血。該血樣立刻用抗凝血?jiǎng)┤芤哼M(jìn)行稀釋并用8-參數(shù)自動(dòng)血液分析儀(Model HC-820;Danam Electronics，Dallas，TX)進(jìn)行計(jì)數(shù)。在與用來改性的rr-SCF處理的小鼠進(jìn)行比較可見白血細(xì)胞量在用聚合物-rr-SCF結(jié)合物處理的小鼠體內(nèi)明顯提高，(見圖3)。
權(quán)利要求
1.一種提高了生物活性的生物因子，它包括生物分子共價(jià)地鍵合到一種或多種聚合物鏈上，其中所說的聚合物鏈?zhǔn)怯裳趸瘉喖谆脱趸蚁┗Y(jié)合組成的。
2.按照權(quán)利要求1的提高了生物活性的生物因子，其中所說的聚合物含有10%-90%的氧化亞甲基(按數(shù)目計(jì))。
3.按照權(quán)利要求1的提高了生物活性的生物因子，其中所說的聚合物含有50%的氧化亞甲基(按數(shù)目計(jì))。
4.按照權(quán)利要求1的提高了生物活性的生物因子，其中所說的聚合物含有大約33%的氧化亞甲基(按數(shù)目計(jì))。
5.按照權(quán)利要求1的提高了生物活性的生物因子，其中所說的聚合物含有-O-CH2-O-CH2CH2-重復(fù)基團(tuán)。
6.按照權(quán)利要求1的提高了生物活性的生物因子，其中所說的聚合物含有-O-CH2-OCH2-CH2-O-CH2CH2-重復(fù)基團(tuán)。
7.按照權(quán)利要求1的提高了生物活性的生物因子，其中所說的聚合物含有氧化亞甲基和氧化乙烯基的無規(guī)鏈段。
8.按照權(quán)利要求1的提高了生物活性的生物因子，其中所說的聚合物含有氧化亞甲基和氧化乙烯基的嵌段鏈段。
9.按照權(quán)利要求1的提高了生物活性的生物因子，其中所說的聚合物含有嵌段鏈段和無規(guī)鏈段。
10.按照權(quán)利要求1的提高了生物活性的生物因子，其中所說的生物分子選自蛋白質(zhì)、聚肽、碳水化合物、酶、金屬蛋白質(zhì)、和脂質(zhì)體。
11.按照權(quán)利要求1的生物因子，其中所說的生物分子是蛋白質(zhì)。
12.按照權(quán)利要求11的生物因子，其中所說的蛋白質(zhì)是促血紅細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
13.按照權(quán)利要求12的生物因子，其中所說的促血紅細(xì)胞生長(zhǎng)因子選自EGF、EPO、GM-CSF、G-CSF、PDGF、MI、同感干擾素、SCF。
14.按照權(quán)利要求1的包括生物分子共價(jià)地鍵合到一種或多種聚合物鏈上而提高了生物活性的生物因子，其中所說的聚合物是由兩種或多種共單體1，3-二氧戊環(huán)、1，3，6-三氧辛環(huán)、環(huán)氧乙烷、和1，3，5-三噁烷衍生來的。
15.按照權(quán)利要求1的包括生物分子共價(jià)地鍵合到一種或多種聚合物鏈上而提高了生物活性的生物因子，其中所說的聚合物的數(shù)均分子量為500-100，000。
16.按照權(quán)利要求15的包括生物分子共價(jià)地鍵合到一種或多種聚合物鏈上而提高了生物活性的生物因子，其中所說的聚合物的數(shù)均分子量為1，000-10，000。
17.按照權(quán)利要求1的包括生物分子共價(jià)地鍵合到一種或多種聚合物鏈上而提高了生物活性的生物因子，其中是借助同所說聚合物的碳酸衍生物或羧酸的活性酯的反應(yīng)而將所說的聚合物連接到生物分子上。
18.按照權(quán)利要求1的包括生物分子共價(jià)地鍵合到一種或多種聚合物鏈上而提高了生物活性的生物因子，其中是借助同該聚合物的N-羥基琥珀酰亞胺、對(duì)硝基苯酚、或1-羥基-2-硝基-苯-4-磺酸酯的反應(yīng)而將所說聚合物連接到生物分上。
19.按照權(quán)利要求1的包括生物分子共價(jià)地鍵合到一種或多種聚合物鏈上而提高了生物活性的生物因子，其中是借助生物分子的一個(gè)或多個(gè)游離的巰基與該聚合物的馬來酰亞氨基或鹵代乙?；苌锏姆磻?yīng)使所說聚合物連接到生物分子上。
20.按照權(quán)利要求1的包括生物分子共價(jià)地鍵合到一種或多種聚合物鏈上而提高了生物活性的生物因子，其中是借助與生物分子的氨基、羧基、巰基、或羥基的反應(yīng)使所說聚合物連接到生物分子上。
21.按照權(quán)利要求1的包括生物分子共價(jià)地鍵合到一種或多種聚合物鏈上而提高了生物活性的生物因子，其中是借助該聚合物的氨基、肼基或酰肼基衍生物與該生物分子的碳水化合物部分的氧化作用產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)醛基的反應(yīng)使所說的聚合物連接到生物分子上。
全文摘要
具有提高了生物活性的生物因子是通過將生物分子共價(jià)地鍵合到一種或多種合成的聚合物鏈上而制備的，其中的合成聚合物是由氧化亞甲基-氧化乙烯部分結(jié)構(gòu)衍生而來的。
文檔編號(hào)A61K38/22GK1083822SQ9310891
公開日1994年3月16日 申請(qǐng)日期1993年6月17日 優(yōu)先權(quán)日1992年6月17日
發(fā)明者C·G·皮特, W·亨德倫 申請(qǐng)人:安姆根有限公司