專利名稱：鑒定患有細胞異常性的個體的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及根據(jù)識別某些存在人白細胞抗原和由其表面上酪氨酸酶衍生之肽的復合物的異常細胞所導出的各種治療方法學。此外，本發(fā)明還涉及鑒定那些根據(jù)以細胞異常性為特征之條件而診斷的個體的能力，其中所說個體的異常細胞存在該復合物、所呈現(xiàn)的肽及其分支。
哺乳動物免疫系統(tǒng)識別外來或異種并與之反應的過程是十分復雜的。該系統(tǒng)的一個重要方面是T細胞反應。該反應需要T細胞識別稱為人白細胞抗原(“HLA”)或主要組織相容性抗原(“MHCs”)之細胞表面分子與肽的復合物，并與之反應。所說的肽衍生于被其中也存在HLA/MHC分子的細胞加工的大分子[參見Male et al.，Advanced Immunology(J.P.Lipincott Company，1987)，特別是第6-10章)。T細胞與HLA/肽復合物的相互作用受到約束，需要有對HLA分子和肽的特定結(jié)合的特異的T細胞。如果不存在特異性T細胞，即使存在其對象復合物也不會有T細胞反應。同樣，如果沒有特異性復合物，而只存在T細胞也不會出現(xiàn)反應。該機制在自身免疫病理學中參予免疫系統(tǒng)對外來物質(zhì)的反應，并參予對細胞異常的反應。目前，大量的研究工作已集中于使蛋白質(zhì)加工成HLA結(jié)合肽的機制上(對此可參見Barinaga，Science 257880(1992);Fremont et al.，Science 257919(1992);Matsumura et al.，Science 257927(1992);Latron et al.，Science 257964(1992))。
也已證明T細胞識別細胞異常性的機制與腫瘤有關。例如，PCT申請PCT/US92/04354(申請日1992年5月22日，
公開日1992年11月26日，該文獻列為本文的參考文獻)公開了一家被加工成肽的基因家族，這些基因本身在細胞表面上表達，從而導致腫瘤細胞被特異性CTLs溶解。據(jù)說這些基因編碼“腫瘤排斥抗原前體”或稱“TRAP”分子，且由之衍生的肽被稱為“腫瘤排斥抗原”或“TRAs”(有關這一基因家族的進一步信息參見Traversari et al.，Immunogenetics35∶145(1992)∶van der Bruggen et al.，Science 254∶1643(1991))。
美國專利申請序號938，334(其中公開的內(nèi)容列為本文參考文獻)描述了與HLA-A1分子結(jié)合的九肽。該參考文獻教導了特定肽對特定HLA分子的給定的已知特異性，故可期望某特定肽可與一種HLA分子結(jié)合，而不與其他分子結(jié)合。因為不同的個體具有不同的HLA表型，所以這一特異性是很重要的。作為結(jié)果，雖然鑒定一特定肽為特異性HLA分子的反應對象具有診斷和治療意義，但這些只是對帶有該特定HLA表型的個體相關的。因為細胞異常性并不限定于一種特定HLA表型，而且有針對性的治療需要有關于某些在組織上異常細胞表型的知識，所以有必要就這一領域作更深入的研究。
酪氨酸酶催化使酪氨酸轉(zhuǎn)化為二羥基苯丙氨酸或“DOPA”反應，并且似乎是在單核細胞中得以選擇性表達的(Muller et al.，EMBOJ72715(1988))。有關這種人類酶之cDNA的早期報導見于Kwon的美國專利4，898，814號。后來Bouchard等人(J.Exp.Med.1692029(1989))的報導提供了稍微不同的順序。因為已證明該酶的抑制劑與色素沉著性疾病有關，所以大量工作已深入到對這些抑制劑的研究。這方面的文獻包括Jinbow的WO9116302，Mishima等人的美國專利5，077，059號和Nazzaropor的美國專利4，818，768號。本領域的技術(shù)人員將熟知那些提供相似材料的其他參考文獻。
然而，這些參考文獻均沒有教導或提示酪氨酸酶可按與外來抗原或TRAP分子相似的方式受到處理，即現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在某些細胞異常如黑素瘤中，酪氨酸酶被加工，并且由之衍生的肽與某些異常細胞上的HLA分子形成復合物。這些復合物被溶胞性T細胞(“CTL”)識別，然后CTL溶解存在該復合物的細胞。這一令人驚異和不可預見的現(xiàn)象便構(gòu)成了本發(fā)明的主題，下文將作更為詳細的描述。


圖1集中描述細胞溶解研究結(jié)果。具體地是圖1A顯示細胞系LB24的溶解;
圖1B顯示細胞系SK29-MEL的溶解;
圖1C顯示細胞系LB4，MEL的溶解;
圖1D顯示細胞系SK23，MEL的溶解;
圖1E顯示細胞系LE516，MEL的溶解;
圖1F顯示對NK靶K562所作的溶解研究;
圖1G顯示自體固有的EBV-B轉(zhuǎn)化的細胞的溶解;
圖1H顯示在用HLA-A2的基因轉(zhuǎn)化后，圖1F中丟失變異體的溶解;
圖1I顯示自體固有的IEBV-β轉(zhuǎn)化的細胞的溶解。
圖2顯示CTL IVSB的TNF釋放研究結(jié)果。
圖3描述CTL 210/9的TNF釋放研究。
圖4描述細胞溶解性T細胞克隆CTL-IVSB但不是細胞溶解性T細胞克隆CTL 2/9對肽YMNGTMSQV的識別。
圖5顯示肽YMNGTMSQV不被細胞溶解性T細胞克隆CTL 210/9所識別。
圖6顯示當對各種細胞，包括在其表面上呈現(xiàn)HLA-B44的細胞進行TNF釋放分析時所獲得的結(jié)果。
圖7為SEQ ID NO1。
實施例1在下列實驗中使用研究者多年前得到的黑素瘤細胞系29-MEL(文獻中也稱之為SK MEL-29)和LB24-MEL。
由病人AV和LB24-MEL體內(nèi)(這些病人也分別是SK 29-MEL和LB24-MEL的來源)采得含單核血細胞的樣品。使黑素瘤細胞系與含單核血細胞的樣品接觸。觀察混合物中黑素瘤細胞系的溶解情況，這一細胞溶解現(xiàn)象表明樣品中存在與存在于黑素瘤細胞的對肽的HLA分子復合物相特異的細胞溶解性T細胞(“CTL”)。
所使用的溶解檢測法是由Herin等人(Int.J.Cancer 39390-396(1987)，其中公開的內(nèi)容列為本文參考文獻)建立的鉻釋放法。本文再次描述這一方法。體外生長靶黑素瘤細胞，然后將其以107細胞/ml濃度再次懸浮于添加了10mM HEPES及30%FCS的DMEM中，并在37℃下與200μCi/ml Na(51Cr)O4一起保溫45分鐘。用加有10mM HEPES的DMEM將標記的細胞洗三次。然后重新懸浮于加有10mM HEPES和10%FCS的DMEM中，并在加入含103個細胞的100μl等分樣品后分加于96小井微量滴定板內(nèi)。向100μl同樣培養(yǎng)基中加入PBL樣品，以一式兩份進行檢測。以100g將平板離心4分鐘，并在5.5%CO2環(huán)境中37℃保溫4小時。
再次離心此平板，收集100μl等分的上清液并進行細胞計算。按下列公式計算51Cr釋放的百分率%51Cr釋放＝ ((ER-SR))/((MR-SR)) ×100其中ER觀察的是實驗組51Cr釋放，SR是在200μl單一培養(yǎng)基中保溫108個標記細胞測得的自發(fā)釋放，且MR是向靶細胞內(nèi)加入100μl 0.3%Triton X-100所測得的最大釋放。
擴展并通過有限稀釋法克隆那些顯示了高CTL活性的單核血細胞樣品，并使用同一方法學再次篩選之。
使用相同方法試驗靶K562細胞。當使用EBV-B細胞時，只是將DMEM培養(yǎng)基換成添加有5%FCS的Hank′s培養(yǎng)基。
這些實驗導致從病人AV中分離出CTL克隆“IVSB”和從病人LB24中分離出CTL克隆210/9。
圖1分別在A、B、G和I框中給出了這些實驗的結(jié)果。具體地說，從中可以看出兩種CTL可溶解兩個黑素瘤細胞素，而且看出沒有溶解K562和EBVB細胞系。
實施例2對其他黑素瘤細胞系試驗所述的CTL，以確定是否其他黑素瘤細胞系也共有它們的靶。按實施例1中所述的細胞溶解法研究細胞系LB4，MEL，SK23，MEL(也稱為SK MEL-23)和LE516，MEL。圖1的C、D和E框顯示所述克隆溶解這些細胞系。
被試驗的細胞系已知為HLA-A2型，且結(jié)果提示CTL是對肽和HLA-A2的復合物特異的。這一提示可經(jīng)試驗已失去HLA-A2表達能力的SK 29-MEL的變異體得以證實。圖1的F框中顯示了這些結(jié)果。兩克隆均不溶解丟失HLA的變異體。然而，當用SK29-MEL的HLA-A2基因轉(zhuǎn)化此變異體并重新進行試驗，則觀察到細胞溶解作用。因此可以認為，所呈現(xiàn)的分子是HLA-A2。
實施例3一旦鑒定出HLA分子，即進行一步的研究以鑒定下文稱為“腫瘤排斥抗原前體”或“TRAP”分子(其為所提出的肽的來源)的分子。
為此目的，從SK29-MEL的亞克隆的細胞系SK29-MEL.1中分離總RNA。按已知技術(shù)，使用Oligo-dT結(jié)合藥盒分離RNA。一旦得到總RNA，即使用標準方法學將其轉(zhuǎn)化成cDNA。然后將cDNA連接到EcoRI接頭上并按制造商推薦的方法克隆到質(zhì)粒pcDNA-I/Amp的EcoRI位點中。然后用電穿孔法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)換到大腸桿菌JM101中(電穿孔條件25微法，2500V1個脈沖)。
用氨芐青霉素(50μg/ml)選擇被轉(zhuǎn)化的細菌，然后分成700份，每份含200個克隆。各份代表了大約100個不同的cDNA，如分析所顯示的，大約50%的質(zhì)粒含有一插入段。將各份擴增至飽和，并按Maniatis等人(Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y.，1982)所述方法，通過堿溶解、醋酸鉀沉淀和苯酚提取分離質(zhì)粒DNA。不使用銫梯度離心技術(shù)。
實施例4然后將擴展的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到真核細胞中。以15，000個細胞/小井的濃度將COS-7細胞的樣品(加在補充有10%胎牛血清的Dulbeco′s改進的Eagles培養(yǎng)基(“DMEM”)中)授種于平底組織培養(yǎng)微滴定板中。將細胞于37℃保溫過夜，除去培養(yǎng)基后換成每小井30μl含有10%Nu血清、400μl/ml DEAE-葡聚糖、100μM氯喹、10ng質(zhì)粒pcDNA-I/Amp-A2和100ng上述合并之cDNA庫DNA的DMEM培養(yǎng)基。質(zhì)粒pcDNA-I/Amp-A2含有來自SK29-MEL的HLA-A2基因。37℃保溫4小時后，除去培養(yǎng)基并換成50μl含10%DMSO的PBS。2分鐘后除去該培養(yǎng)基中并換成200μl添加了10%FCS的DMEM。
改變培養(yǎng)基后，將COS細胞于37℃保溫48小時。棄去培養(yǎng)基，分別加入上述各CTL克隆的2000個細胞(在100μl含10%合并之人血清的Iscove培養(yǎng)基中)。當使用克隆210/9時，培養(yǎng)基中添加25U/ml IL-2。24小時后除去培養(yǎng)基，按Traversari等人(Immunogenetics 35145-152(1992)，其公開內(nèi)容列入本文作為參考)所述方法對WEHI細胞進行檢測，以確定TNF含量。
用IVSB試驗的700個小井中，有696個顯示每小井有0.6至4pg TNF。其余的4個小井則含有10至20pg/ml TNF。用CTL 210/9試驗的類似小井顯示出相似的、明顯高的值。圖2和3中給出了這些數(shù)據(jù)。
實施例5選擇出已鑒定為高生產(chǎn)菌株的4份合并物中的3份(編號為“123”、“181”和“384”)，用于進一步的實驗。具體地說，使細菌克隆化并試驗由各集合物得到570個細菌菌落。由其中提取質(zhì)粒DNA，按前述的相同方法將其轉(zhuǎn)染到新的COS細胞樣品中，并再次試驗這些細胞的CTL 210/9和CTL IVSB刺激作用。在集合物123(“p123，B2”)中發(fā)現(xiàn)了陽性克隆，且在集合物384(“p384.L6”)發(fā)現(xiàn)了一個。對用cDNA和HLA-A2基因轉(zhuǎn)染的COS細胞和只用HLA-A2轉(zhuǎn)染的COS細胞進行比較試驗，從而得到CTL識別被轉(zhuǎn)染之細胞的令人信服的證據(jù)。通過對WEHI細胞所作試驗來檢測CTL上清液中的TNF釋放。使用MTT檢測存活WEHI細胞的光度。結(jié)果如下列表1所示表1cDNA (123.B2) no cDNA++HLA-A2 DNA HLA-A2Run1 0.087 0.502Run2 0.108 0.562對于cDNA和HLA-A2轉(zhuǎn)染，WEHI光密度的值相當24pg/ml TNF，而對照組則相當于2.3pg/ml。
除去從陽性克隆中分離的質(zhì)粒，按本領域已知技術(shù)測定其順序。順序分析表明，質(zhì)粒插入段幾乎完全相同于如Bouchard等人(J.Exp.Med.1692029(1989)，此公開列為本文的參考文獻)所述的人酪氨酸酶的cDNA。因此，正常情況下存在的分子(即酪氨酸酶)可能是作為腫瘤排斥抗原前體并被加工以形成腫瘤排斥抗原肽，后者以與HLA-A2結(jié)合的形式存在于細胞表面上，從而刺激由CTL克隆產(chǎn)生的溶解作用。已鑒定之分子的核酸順序如SEQ ID NO1所示。
實施例6Chomez等人(Immunogenetics 35241(1992)報導的先期工作已顯示，含有編碼抗原肽之順序的小的基因片段可導致該肽的表達。該文獻(其全文列為本文參考文獻)提示了上文和SEQ ID NO1中所述人酪氨酸酶cDNA之小部分的克隆。使用實施例1-5中所述的方法學，用攜帶HLA-A2基因的各種cDNA片段共轉(zhuǎn)染COS-7細胞，并進行TNF釋放分析。這些實驗導致鑒定大約400個堿基對的片段，當在共轉(zhuǎn)染實驗中使用時，該片段引發(fā)從上文所述細胞溶解性T細胞克隆CTL IVSB釋放TNF，故表明它是對HLA-A2呈現(xiàn)細胞特異的。所用的該400堿基片段相當于SEQ ID NO1中的堿基711至1152。推測出由該片段編碼的氨基酸順序，然后將該順序與Hunt等人(Science 2551261(1992)和Falk等人(Nature 351290(1990))提供的資料相比較(上述公開均列入本文作為參考文獻)。這些參考文獻討論了HLA-A2呈現(xiàn)肽的相符順序。具體地說，Hunt討論了總是在第二位上發(fā)現(xiàn)有Leu或Ile的九肽，其中Leu是“優(yōu)勢殘基”。第九個殘基被描述為總是帶有脂族烴側(cè)鏈的殘基。Val是這個位置上的優(yōu)勢殘基。Hunt討論了第二位上的Leu的強信號和該位置上的Met、第6位上的Val、Leu、Ile或Thr之一以及第9位上的Val或Leu的中等信號，其中Val的信號特別強。在進行比較的基礎上合成九肽，然后觀察它們是否能致敏HLA-A2呈現(xiàn)細胞。為此使用了酪氨酸酶丟失變異體細胞系SK29-MEL 1.218和T202LB。向細胞系內(nèi)加入各種濃度的被試樣品，連同細胞溶解性T細胞克隆CTL IVSB或細胞溶解性T細胞克隆CTL 2/9。上述工作已經(jīng)確定前者可溶解呈現(xiàn)HLA-A2的酪氨酸酶表達細胞，而后者則不能。
在加或不加抗HLA-A2抗體MA2.1(用于穩(wěn)定空HLA-A2分子)的條件下，在含有51Cr的溶液中，將酪氨酸酶丟失的變異體37℃保溫1小時。試驗中，將細胞洗4次，然后與從100μM減至0.01μM的不同稀釋度的肽保溫。30分鐘后，以40/1的E/T比例加入效應物細胞，4小時后收集100λ上清液并進行放射活性計數(shù)。
圖4顯示用九肽Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Val(SEQ ID NO2)獲得的結(jié)果。
下文稱之為SEQ ID NO2的這個肽相當于SEQ ID NO1中所示酪氨酸酶之cDNA順序的殘基1129-1155。HLA-A2與該肽的復合物由CTL克隆CTL IVSB識別。
在平行實驗中，由病人LB24得到的CTL克隆CTL210/9并不識別HLA-A2和SEQ ID NO2之肽的復合物，盡管它識別HLA-A2和酪氨酸酶衍生之肽的復合物。因此，酪氨酸酶至少被加工成一種附加肽，當后者因HLA-A2分子的存在而呈現(xiàn)時即被CTL克隆所識別。
實施例7在一項更深入的實驗中，使用不編碼SEQ ID NO2所示肽的第二個基因片段。該片段由SEQ ID NO1的堿基1處開始并終止在堿基1101處(即EcoRI-SphI片段)。以上文所述的同樣方法對用該片段轉(zhuǎn)染的COS-7細胞試驗上述的細胞溶解性T細胞克隆CTL 210/9。還試驗了CTL IVSB。這些結(jié)果顯示LB24-CTL210/9可識別被該片段轉(zhuǎn)染的HLA-A2細胞表面上的抗原，但CTL IVSB則不能。因此，第二種腫瘤排斥抗原肽衍生于酪氨酸酶。
實施例8為了進一步限定由LB24-CTL 210/9識別的腫瘤排斥抗原，進行了下列實驗。
將相當于SEQ ID NO1的堿基451-1158的第二個片段連同HLA-A2的基因轉(zhuǎn)染到COS細胞中，并進行TNF釋放分析。該順序引發(fā)從克隆SK29-CTL IVSB(20pg/ml)，但不能從LB24-CTL 210/9(3.8pg/ml)釋放TNF。這些結(jié)果進一步證實兩個CTL克隆識別不同的肽，而且由LB24-CTL 210/9識別的肽必須是由1-451區(qū)域編碼的。
實施例9分析由cDNA片段1-451編碼的酪氨酸酶衍生肽，看其是否為已知結(jié)合HLA-A2的相符順序。合成相當于這些相符順序的肽，并檢驗它們致敏HLA-A2呈現(xiàn)細胞的能力。為此目的，使用兩個酪氨酸酶陰性黑素瘤細胞系(即NA8-MEL和用HLA-A2轉(zhuǎn)染的MZ2-MEL 2.2)，以及Salter等人(Immunogenetics 2123 5-246(1985))所述的細胞系T2。
將細胞與51Cr和對HLA-A2特異的單克隆抗體MA.2.1于37℃一起保溫50分鐘，然后洗細胞(參見Bodmer et al.，Nature 342443-446(1989)，其全文引入本文作為參考文獻)。將靶細胞與各種濃度的肽，以及LB24-CTL克隆210/5或210/9一起保溫。保溫4小時后檢測鉻釋放的百分數(shù)。
發(fā)現(xiàn)肽Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu Leu (SEQID NO3)是有活性的。
在本文總結(jié)的進一步的實驗中，已顯示CTL-IVSB可識別YMNGTMSQV，而不識別SEQ ID NO3的肽。
結(jié)果總結(jié)于下列表2-4中表2肽YMNGTMSQV MLLAVLYCLL(1120-1155) (25-54)SK29-CTL-IVSB + -LB24-CTL-210/5 - +LB24-CTL-210/9 - +
表3
＊用Cr51和單-Ab MA2.1(抗-HLA-A2)與靶細胞一起保溫50min，然后洗滌3次。
再用各種濃度的肽與上述物質(zhì)一起保溫30min。
按所指定(ET)的比率加入CTL細胞。
在保溫4小時后測定特定的Cr51的百分釋放率。
表4
實施例10使用CTL克隆22/31完成進一步的實驗。前已顯示該克隆溶解衍生于自體黑素瘤細胞MZ2-MEL的亞細胞系MZ2-MEL.43，但不溶解其他亞系如MZ2-MEL3.0和MZ2-MEL61.2，它也不溶解自體EBV轉(zhuǎn)化的B細胞，或殺傷細胞系K562(參見Van den Eynde et al.，Int.J.Cancer 44634-640(1989))。由MZ2-MEL.43呈現(xiàn)的抗原被稱是抗原C。
在以前的包括本申請的在先申請中報導的工作中，發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶基因編碼由大多數(shù)HLA-A2黑素瘤細胞上的自體CTLs識別的抗原。用PCR擴增法檢驗該基因在細胞系MZ2-MEL的亞系上的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)克隆MZ2-MEL.43是陽性的，而其他MZ2-MEL克隆如MZ2-MEL.3.0是陰性的。酪氨酸酶基因的表達與抗原MZ2-C的相互關系提示，MZ2-C可能是一種由酪氨酸酶衍生的、并由MZ2-MEL表達的HLA分子呈現(xiàn)的腫瘤排斥抗原。該細胞系不表達HLA-A2，這將表明如果一種酪氨酸酶衍生的肽是作為TRA呈現(xiàn)的，則可能還有第二種HLA分子卷入。
進行研究以鑒定哪種HLA分子可使抗原C出現(xiàn)于CTL22/31上。為此目的，從MZ2-MEL.43cDNA庫中分離已知是細胞表面上的HLA分子，即HLA-A29、HLA-B37、HLA-B44.O2和HLA-C克隆10，然后克隆到表達載體pcDNAI/Amp中。然后再用這些構(gòu)建體之一或含有HLA-Al加上編碼酪氨酸酶之cDNA(SEQ ID NO1)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染受體COS 7細胞。按上述方法進行共轉(zhuǎn)染。1天后加入CTL22/31，24小時后按Traversari等人(文獻同上)所述方法通過檢驗對WEHI-164-13的細胞毒性，以測定TNF釋放率。圖6顯示，只有在用HLA-B44和酪氨酸酶基因轉(zhuǎn)染的細胞存在下才能由CTL22/31釋放TNF。由此可以得出的結(jié)論是，HLA-B44呈現(xiàn)酪氨酸酶衍生的腫瘤排斥抗原。
前述實驗證明，酪氨酸酶被加工作為腫瘤排斥抗原前體，而導致加工產(chǎn)生之腫瘤排斥抗原與至少某些異常細胞如帶有HLA-A2或HLA-B44表型之黑素瘤細胞上的分子的復合物的形成。該復合物可被CTLs識別，并使其呈現(xiàn)細胞溶解。這一觀察結(jié)果具有治療和診斷上的價值，它構(gòu)成了本發(fā)明的特征。就治療應用來說，觀察到產(chǎn)生了對呈現(xiàn)上述復合物的異常細胞特異的CTLs，從而提示了有關的各種治療方法。其中之一是給在組織(issue)上有這種表型之異常細胞的個體使用對復合物特異的CTLs。開發(fā)這些CTSs的體外應用是本領域技術(shù)人員易于實現(xiàn)的。具體的說，使細胞如血細胞的樣品與呈現(xiàn)復合物并能激發(fā)產(chǎn)生對增殖特異之CTL的細胞接觸。靶細胞可以是轉(zhuǎn)染體，如上述這樣類型的COS細胞。這些轉(zhuǎn)染體在其表面上呈現(xiàn)所需的復合物，并且當與所研究的CTL結(jié)合時即刺激其增殖。為使本領域技術(shù)人員能夠制得這些CTL，已按照布達佩斯條約將含有有用基因即pcDNA-1/Ampl(HLA-A2)和p123.B2(人酪氨酸酶)的載體保藏在Institut Pasteur，登記號分別是I1275和I1276。COS細胞，如本發(fā)明所用的這些細胞同其他適用的宿主細胞一樣可從很多途徑得到。
為了詳述稱為繼承性轉(zhuǎn)移的治療方法學(Greenberg，J.Immunol.136(5)1917(1986);Reddel et al.，Science 257238(7-10-92);Lynch et al.，Eur.J.Immunol.211403-1410(1991);Kast et al.，Cell 59603-614(11-17-89))，使呈現(xiàn)所需復合物的細胞與導致對其特異的CTLs增殖的CTLs結(jié)合。然后將已增殖的CTLs輸給具有特征在于某些異常細胞呈現(xiàn)特定復合物之細胞異常性的個體。然后CTLs溶解異常細胞，從而達到預期的治療目的。
上述治療方法是基于設想至少某些個體的異常細胞呈現(xiàn)一種或多種HLA/酪氨酸酶衍生的肽的復合物。這一設想可以很容易地得以確定。例如使用上文討論的轉(zhuǎn)染體鑒定并分離CTLs后，即可與病人的異常細胞樣品一起來確定體外溶解作用。如觀察到細胞溶解，那么在這種療法中即可使用特異性CTLs來緩解與異常細胞相關的病理狀況。一種較少涉及的方法學是使用標準檢測法檢測異常細胞的HLA表型特征，并使用例如PCR法通過擴增來確定酪氨酸酶的表達情況。多數(shù)不同的HLA分子呈現(xiàn)由酪氨酸酶衍生的TRAs這一事實增加了適于進行本文所討論之治療方法的個體的數(shù)目。
繼承性轉(zhuǎn)換(adoptive transfer)并不是僅有的按照本發(fā)明建立的治療方式。也可使用許多方法在體內(nèi)激發(fā)CTLs。已在上文所述工作的基礎上，詳細闡述了使用表達復合物之非增殖性細胞的方法。該方法中使用的細胞可以是正常表達復合物的細胞，例如經(jīng)過照射的黑素瘤細胞或用為呈現(xiàn)復合物所必需的一種或兩種基因轉(zhuǎn)染的細胞。Chen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88110-114(January 1991)舉例說明了這種方法，顯示了表達HPVE7肽的被轉(zhuǎn)化細胞在治療中的應用?？墒褂酶鞣N類型的細胞。同樣，可使用攜帶一種或兩種有用因基的載體。特別可取的是病毒或細菌載體。在這些系統(tǒng)中，例如由牛痘病毒或細菌BCG攜帶有用基因，并由這些材料“感染”宿主細胞。導致呈現(xiàn)有用復合物的細胞被自體CTLs識別，然后增殖。使酪氨酸酶本身與佐劑合用以有利于摻入HLA-A2呈現(xiàn)細胞可獲得相似效果。然后加工該酶以產(chǎn)生作為HLA分子結(jié)合對象的肽。
上述的討論涉及到“異常細胞”和“細胞異常性”。這些術(shù)語是以其最寬的解釋使用的，并且涉及到被研究的細胞至少表現(xiàn)了一種特性(借以表明它們不同于它們的特異類型的正常細胞)的任何狀態(tài)。異常特性的例子包括形態(tài)學和生物化學改變，例如包括黑素、自身免疫病等的腫瘤在內(nèi)的細胞異常性。
本發(fā)明還提供了鑒定CTLs之靶前體的方法。當靶細胞是腫瘤細胞時，這些前體被稱為腫瘤排斥抗原，但必須指出的是，當有異常性特征的細胞不是腫瘤時，也有時將該分子誤稱為腫瘤排斥抗原。該方法主要包括鑒定作為上述類型的細胞溶解性T細胞之靶的細胞。一旦鑒定出這樣的細胞，即將總RNA轉(zhuǎn)化成cDNA庫，然后將此cDNA轉(zhuǎn)染到能夠呈現(xiàn)與相關HLA分子形成復合物之抗原的細胞樣品中。使轉(zhuǎn)染體與上文討論的CTL接觸，然后便可觀察到CTL的擊靶現(xiàn)象(細胞溶解和/或TNF產(chǎn)生)。然后處理這些被溶解的轉(zhuǎn)化體以除去cDNA并進行順序分析，從而能夠以這種方法鑒定出導致異常狀態(tài)的前體，如腫瘤排斥抗原前體。
本發(fā)明的其他方面對于本領域技術(shù)人員來說是很清楚的，在此不必重復。
所用的術(shù)語和措詞是作為說明中的術(shù)語而不是為限制目的使用的，在這些術(shù)語和措詞的使用中，無意排除所顯示并描述的任何等同特征或其部分，應理解到，在本發(fā)明的范圍內(nèi)進行各種形式的改變是可能的。
權(quán)利要求
1.鑒定適于用對HLA分子和由SEQ ID NO∶3的氨基酸順序組成的酪氨酸酶衍生的肽的復合物特異的治療劑進行治療的候選者的方法，該方法包括(i)使得自病人的異常細胞樣品與對所說的復合物特異的細胞溶解性T細胞接觸，并且(ii)確定作為適于進行所說的治療之候選者的特征是至少一部分所述異常細胞樣品的溶解。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的HLA分子是HLA-A2。
3.治療有細胞異常性之病人的方法，包括給所說的病人使用一定量激發(fā)針對在其表面上呈現(xiàn)HLA分子和由SEQ ID NO3中所示氨基酸順序組成的酪氨酸酶衍生的肽的復合物的細胞產(chǎn)生細胞溶解性T細胞反應的制劑，其中所說的量足以激發(fā)對在其表面上的呈現(xiàn)所說之復合物的異常細胞的反應。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所說的HLA分子是HLA-A2。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所說的制劑包含編碼人酪氨酸酶的載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所說的制劑還包含編碼HLA-A2的載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所說的載體還編碼HLA-A2。
8.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所說的制劑是在其表面上呈現(xiàn)所說之復合物的非增殖性細胞的樣品。
9.治療細胞異常性的方法，包括給具有特征在于在異常細胞表面上呈現(xiàn)HLA分子與由SEQ ID NO3的氨基酸順序組成的酪氨酸酶衍生之肽的復合物的細胞異常性的病人施用足以溶解所說的異常細胞的量的對所說的復合物特異的細胞溶解性T細胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所說的HLA分子是HLA-A2。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所說的細胞溶解性T細胞是自體固有的。
12.對HLA-A2和由SEQ ID NO3的氨基酸順序組成之酪氨酸酶衍生的肽的復合物特異的分離的細胞溶解性T細胞。
13.鑒定在其表面上呈現(xiàn)HLA分子與由SEQ ID NO3的氨基酸順序組成之酪氨酸酶衍生的肽的復合物的異常細胞的方法，包括使異常細胞的樣品與對所說復合物特異的細胞溶解性T細胞接觸，并作為檢測呈現(xiàn)所說復合物之細胞的指征確定所說異常細胞的溶解。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所說的HLA分子是HLA-A2。
15.由SEQ ID NO3所示的氨基酸順序組成的分離的肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒定異常細胞表面上的人白細胞抗原分子與酪氨酸酶衍生之肽的復合物。本發(fā)明的主題是這一研究結(jié)果在治療和診斷上的應用。
文檔編號A61K38/00GK1089660SQ9311287
公開日1994年7月20日 申請日期1993年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1992年12月22日
發(fā)明者蒂爾瑞·布恩-法勒爾, 文森特·布里查德, 艾琳·范佩爾, 艾泰恩·德普里, 皮埃爾·庫里, 瓊-克里斯托弗·雷諾, 伯納德·萊斯, 托馬斯·沃夫爾 申請人:路德維格癌癥研究所