專利名稱：減少和抑制局部缺血和再灌注損傷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)了一組已知的三肽精氨醛衍生物可用于減少和抑制由于組織遭到局部缺血和再灌注而引起的損傷。作為抑制在發(fā)展中的心肌梗塞形成和再灌注時(shí)引起的局部缺血損傷的心臟保護(hù)劑，本方法特別有用。
當(dāng)某細(xì)胞區(qū)域的血流不足以支持正常的新陳代謝活動(dòng)時(shí)即出現(xiàn)局部缺血。假如這種情況持續(xù)了一段時(shí)間，局部缺血區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞就會(huì)死亡。再灌注是用于描述對局部缺血組織重新建立血流行為所使用的術(shù)語。因此，再灌注對于局部缺血區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞繼續(xù)存活是十分重要的。但是眾所周知，再灌注本身對許多幸免于局部缺血的細(xì)胞會(huì)引起不可彌補(bǔ)的損傷。因此，能夠減少和抑制局部缺血和再灌注損傷的化合物是十分重要的治療劑。這些化合物特別有用于制備藥物和藥物制劑以便治療受折磨的病人。
再灌注損傷主要是炎癥過程的結(jié)果，再灌注的局部缺血組織吸引能釋放蛋白水解酶和氧化劑的白細(xì)胞，這又促進(jìn)了進(jìn)一步發(fā)炎并帶來最終治愈和疤痕。因?yàn)榘准?xì)胞衍生的蛋白水解酶和氧化劑是非選擇性的，它們能夠降解正常的組織及可逆轉(zhuǎn)的損傷組織。因此，在炎癥過程中減弱炎癥反應(yīng)或抑制最有害的物質(zhì)對于減小和抑制再灌注損傷是合理的方法。
發(fā)展中的心肌梗塞形成是一種進(jìn)行性過程，此時(shí)心肌層不能接受足夠的血液供應(yīng)以便支持正常的新陳代謝活動(dòng)，并且一般是由冠狀動(dòng)脈閉塞引起的。因?yàn)樾呐K穩(wěn)定的、相對高的新陳代謝活動(dòng)及許多緩解冠狀動(dòng)脈閉塞的療法，發(fā)展中的心肌梗塞形成對于再灌注損傷大概是最通常并且是最嚴(yán)重的后果。
許多治療措施如血管成形術(shù)，外科分流術(shù)及溶解血栓的方法能使閉塞的冠狀動(dòng)脈通暢并導(dǎo)致心肌和再灌注損傷。參見Lucchesi等人“白細(xì)胞和局部缺血引發(fā)的心肌損傷”(Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.36159-163，1985)及Engler，R.L，“自由基和在心肌局部缺血及再灌注期間的粒性白細(xì)胞介導(dǎo)的損傷”(Am.J.Cardiol.6319E-23E，1989)。
因?yàn)榛謴?fù)的白細(xì)胞是和由冠狀動(dòng)脈閉塞及再灌注引起的擴(kuò)展中的心肌梗塞形成有關(guān)的，因此中性白細(xì)胞的介入對于減少和抑制進(jìn)展中的心肌梗塞形成是一種合乎邏輯的方法。這種中性白細(xì)胞的介入包括中性白細(xì)胞減少誘導(dǎo)、抗粘連分子單克隆抗體及氧化劑清除劑。參見Romson等人“在狗體內(nèi)由于中性白細(xì)胞排除導(dǎo)致的局部缺血性心肌損傷程度的降低”(Circulation 671016-1023，1983);Mullane等人;“在已麻醉的狗體內(nèi)在急性心肌梗塞形成中白細(xì)胞的作用與使用抗炎藥對心肌搶救的關(guān)系(J.Pharmacol.Exp.Ther.228510-522，1984);Mitson等人“在狗體內(nèi)中性白細(xì)胞排除后N-2-巰基丙?；拾彼釋π募≡俟嘧p傷的保護(hù)作用細(xì)胞內(nèi)衍生的自由基作用的證實(shí)”(Circulation 731077-1086，1986);Mitson等人“犬的心肌再灌注損傷自由基清除劑N-2-巰基丙酰基甘氨酸的保護(hù)作用(J.Cardiovasc.Pharmacol.8978-988，1986);Jolly等人“犬心肌再灌注損傷超氧化物歧化酶和過氧化氫酶聯(lián)合用藥引起的損傷降低(Circ.Res.54277-285，1984);Simpson等人;“通過抑制白細(xì)胞粘連的單克隆抗體(Anti-Mol)使實(shí)驗(yàn)的犬心肌局部缺血和再灌注損傷的減少(Circulation 76AO799，1987)及Jolly等人”中性白細(xì)胞排除使心肌梗塞大小減小閉合時(shí)間效應(yīng)(Am.Heart J.112682-690，1986)。
現(xiàn)在驚異地發(fā)現(xiàn)，一組已知抑制幾種蛋白酶活性的化合物能夠抑制并減少由于局部缺血和再灌注引起的組織損傷。在一種新的方法中，這些化合物對于減少在心肌梗塞形成和再灌注期間引起的心臟損傷效應(yīng)是特別有用的。
本發(fā)明是一種減少和抑制再灌注損傷的方法，它包括對需要這種治療的哺乳動(dòng)物給有效無毒量的如下通式的化合物
其中A是1或2個(gè)
并且對A，其手性中心為DL，優(yōu)選D;對于Pro，手性中心為L;對于Arg，手性中心是L;
Z是C1-C4烷基或H;
X是NH2、NHZ、叔丁氧羰基-NH、乙?；?NH或三氟乙酰基-NH;
R是H、OH、鹵素、C1-C4烷氧基、CF3、C1-C4烷基、NO2或NH2以及q是CH2或CO。
用于本發(fā)明方法中的化合物一般是本技術(shù)領(lǐng)域公知的。參見U.S.4703036及其參考文獻(xiàn)以及EP-A-0479489，以及Bajusz等人“高活性及選擇性抗凝血?jiǎng)〥-Phe-Pro-Arg-H，易于自發(fā)失活的游離三肽醛及其穩(wěn)定的N-甲基衍生物D-MePhe-Pro-Arg-H(J.Med.Chem.331729-1735，1990)。
脯氨酸和精氨酸殘基的α-碳原子是L-構(gòu)型以及取代基A的α-碳原子是DL構(gòu)型，優(yōu)選D。
在本方法中，式Ⅰ化合物的可藥用的鹽也可用于制備藥劑及藥物，包括和無機(jī)酸及羧酸形成的酸加成鹽。形成鹽的無機(jī)酸例如是氫鹵酸，特別是鹽酸和氫溴酸，磷酸及硫酸。使用如醋酸、丙酸、丙二酸、馬來酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、苯甲酸、富馬酸等羧酸形成羧酸鹽。酸加成鹽按常規(guī)的方法制備，例如用酸來中和游離堿形式的式Ⅰ化合物。優(yōu)選的酸加成鹽是硫酸鹽和鹽酸鹽。
本發(fā)明還提供了在上述治療方法中使用的藥物。本發(fā)明的藥物制劑包括再灌注損傷減少有效量的以式Ⅰ表示的化合物及可藥用的載體。對于口服給藥，可將式Ⅰ化合物配制成明膠膠囊劑或壓成片劑，它們可以含有可藥用的賦形劑如粘合劑、潤滑劑、崩解劑等。該化合物也可制備成持續(xù)釋放的制劑。例如，該化合物可在各種水凝膠基質(zhì)的任何一種中制備成藥劑，以便在不同時(shí)間周期內(nèi)釋放該化合物。對于非腸道給藥，本化合物能在例如生理食鹽水(0.9%)、5%葡萄糖及Ringer′s溶液等可藥用的稀釋劑中配制。
式Ⅰ表示的化合物可以用已知的肽偶聯(lián)法制備，參見一般文獻(xiàn)及Dugas和PenneyBioorganic Chemistry 13-82(1981)。按照上述的一個(gè)方法，使羧酸AcooH(其中A有和式Ⅰ定義中的相同含意)和羧基已保護(hù)的脯氨酸偶聯(lián)形成二肽(當(dāng)A是氨基酸時(shí))或形成N-酰基脯氨酸酯(當(dāng)A不是氨基酸時(shí))。產(chǎn)品中脯氨酸部分中的保護(hù)羧基的酯基被除去后，其游離酸形式的二肽再和內(nèi)酰胺形式的精氨酸偶聯(lián)，上述反應(yīng)過程可用以下反應(yīng)流程說明
其中P代表氨基保護(hù)基。
已偶聯(lián)的Arg(P)內(nèi)酰胺產(chǎn)品(C)在惰性溶劑中與氫化鋰鋁反應(yīng)以打開內(nèi)酰胺環(huán)，得到以下式表示的精氨酸醛形式的三肽
其中Arg(P)-H表示氨基已被保護(hù)的精氨酸醛。
內(nèi)酰胺形式的精氨酸可通過氨基已被保護(hù)的精氨酸(Agr-OH)的分子內(nèi)偶聯(lián)得到。例如，以下式
表示的Boc-Arg(Cbz)OH，其中Boc為叔丁氧羰基及Cbz為芐氧羰基，被首先用氯甲酸酯如氯甲酸乙酯至氯甲酸異丁酯轉(zhuǎn)化成活性酯形式，例如活性混合酸酐。酯的形成在叔胺例如N-甲基嗎啉存在下進(jìn)行。加入更強(qiáng)的叔胺堿如三乙胺可完成內(nèi)?；磻?yīng)，得到內(nèi)酰胺形式的雙氨基已被保護(hù)的精氨酸，如下所示
在用于與A(C＝0)-Pro-OH偶聯(lián)之前(如上面反應(yīng)流程所示)，用三氟乙酸選擇性地除去Boc保護(hù)基，以便得到必要的游離氨基基團(tuán)。
當(dāng)A是氨基酸殘基時(shí)，ACOOH化合物和脯氨酸酯的偶聯(lián)首先要保護(hù)該氨基酸的氨基?？刹捎猛ǔＳ糜跁簳r(shí)保護(hù)或阻礙氨基時(shí)所使用的常規(guī)氨基保護(hù)基。這種保護(hù)基的例子包括烷氧基、鏈烯氧基、環(huán)烷氧基及芳氧羰基如乙氧羰基、叔丁氧羰基、環(huán)己氧羰基、金剛烷氧羰基、三氯乙氧羰基、芐氧羰基、二苯基甲氧羰基等。
在偶聯(lián)反應(yīng)過程中保護(hù)脯氨酸羧基所采用的酯基可以是任何通常使用的易于除去的酯基，如叔丁基、芐基、對硝基芐基、對甲氧芐基、二苯甲基、三氯乙基、苯甲酰甲基或三烷基甲硅烷基酯，在完成偶聯(lián)反應(yīng)中，對于脯氨酸我們采用在氨基保護(hù)基能夠保留的條件下而易于除去的酯基。因此在其后的與精氨酸內(nèi)酰胺化合物偶聯(lián)形成A-(C＝0)-Pro-Arg(P)內(nèi)酰胺的反應(yīng)過程中，?；酇-COOH的氨基保護(hù)基可以保留在氨基保護(hù)的位置。
上述偶聯(lián)反應(yīng)在較低的溫度下優(yōu)選在-20°-15℃之間進(jìn)行。偶聯(lián)反應(yīng)在惰性有機(jī)溶劑中進(jìn)行，例如二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氫呋喃、二氯甲烷、氯仿等普通溶劑。一般來說，當(dāng)使用?；岬幕钚怎r(shí)，在偶聯(lián)反應(yīng)中應(yīng)采用無水操作條件。
本發(fā)明化合物優(yōu)選以酸加成鹽形式分離出來。式Ⅰ化合物和酸(例如上面提到的酸)所形成的鹽可用作可藥用的鹽，它們可用作再灌注損傷減少劑給藥及用于制備這些藥物制劑。在分離和純化上述肽時(shí)，也可以制備和使用其它酸加成鹽，例如和磺酸如甲磺酸、正丁磺酸、對甲苯磺酸及萘磺酸形成的鹽也可被采用。
在制備所需的穩(wěn)定的鹽形式的同時(shí)，分離和純化式Ⅰ表示的化合物的方法是本技術(shù)領(lǐng)域公知的。按照一種這樣的方法，通過用C18反相色譜法制備提純，可得到穩(wěn)定的無機(jī)酸鹽，包括硫酸鹽和鹽酸鹽。水相含有硫酸或鹽酸，其濃度約為0.01%-0.05%，并且含有乙腈、THF(四氫呋喃)、甲醇或其它適當(dāng)溶劑作為有機(jī)組份。酸洗脫液的pH值調(diào)節(jié)在約pH4-pH6之間，精確的pH值和具體的肽及羥基形式的堿性樹脂(如Bio-Rad AG-1×8)有關(guān)。調(diào)節(jié)pH后，將三肽鹽溶液(例如硫酸鹽或鹽酸鹽)冷凍干燥，即可得到干粉形式的純凈的鹽。
在本發(fā)明中特別有用的最優(yōu)選的式Ⅰ化合物是化合物1D-3-Piq-L-脯氨酰-L-精氨醛(硫酸鹽)
化合物2D-7-羥基-1，2，3，4-Tiq-3-羰氧基-L-脯氨酰-L-精氨醛(雙鹽酸鹽)
化合物3D-3-Tiq-L-脯氨酰-L-精氨醛(硫酸鹽)
化合物4D-1，2，3，4-Tiq-1-羰基-L-脯氨酰-L-精氨醛(鹽)
化合物5N-甲基-D-苯基丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨醛(鹽)
化合物6Na-叔丁氧羰基-D-苯基丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨醛(鹽)
通過對哺乳動(dòng)物給藥式Ⅰ化合物，以便大約在重新建立足夠的血流流向細(xì)胞局部缺血區(qū)域時(shí)血流中含有有效濃度的該化合物，由此實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。尤其是，在重新建立令人滿意的血流流向局部缺血區(qū)域時(shí)，血流中應(yīng)當(dāng)含有有效量的該化合物。但在局部缺血區(qū)域被再灌注之后即獲得本化合物有效的血藥水平也是同本方法一致的。
本化合物可口服、非腸道給藥，例如靜脈輸注或注射或者將注射和輸注(iv)結(jié)合給藥，也可肌內(nèi)給藥(im)或皮下給藥(sc)。優(yōu)選靜脈輸注。依賴于本化合物的相對效力及局部缺血區(qū)域的范圍，本化合物的有效血藥濃度應(yīng)在再灌注后維持至少1小時(shí)至數(shù)天。
有效劑量范圍從約5mg至約1000mg，該劑量依給藥方式而有所不同。對于口服，im及sc方式，最好需要在重新建立血流達(dá)到局部缺血組織之前給藥，以便使本化合物進(jìn)到血液中。
在一優(yōu)選的方式中，輸注速度范圍為約0.2-5.0mg/kg/小時(shí)維持1-10小時(shí)，更優(yōu)選1-10小時(shí)內(nèi)約0.5-2.0mg/kg/小時(shí)。在閉塞性血栓引起的心肌梗塞情況下，本發(fā)明化合物可以和血栓溶解治療一起施用或者隨后立即進(jìn)行血栓溶解治療。
在本發(fā)明的另一方式中，式Ⅰ化合物可以和氧化劑清除劑一起給藥。不以任何方式限制本發(fā)明的范圍的氧化劑清除劑的具體例子包括超氧化物歧化酶及N-巰基丙?；拾彼帷τ诒景l(fā)明的目的，聯(lián)合給藥是包括在用式Ⅰ化合物給藥之前或之后的短時(shí)間內(nèi)給藥。聯(lián)合給藥還意味著，在血液中含有有效量的聯(lián)合給藥的化合物，也含有有效量的式Ⅰ化合物。
在本發(fā)明的又一方式中，式Ⅰ化合物與β-阻斷劑一起給藥。不以任何方式限制本發(fā)明范圍的β-阻斷劑的具體實(shí)例包括心得安、甲氧乙心安和氨酰心安。本發(fā)明的另一方式包括式Ⅰ化合物和阿斯匹林一起給藥。本發(fā)明還包括將式Ⅰ化合物和氧化劑清除劑，β-阻斷劑或阿斯匹林以某種結(jié)合方式聯(lián)合給藥。
提供下述實(shí)施例以便有助于說明如何實(shí)現(xiàn)本發(fā)明以及說明所請求保護(hù)的方法的預(yù)期優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在實(shí)施例中使用的縮寫字有以下含意氨基酸Arg＝精氨酸;Pro＝脯氨酸Boc＝叔丁氧羰基Bzl＝芐基
Cbz＝芐氧羰基DCC＝二環(huán)己基碳二亞胺DMF＝二甲基甲酰胺DMSO＝二甲亞砜FAB-MS＝快原子轟擊質(zhì)譜FD-MS＝場解吸質(zhì)譜THF＝四氫呋喃TLC＝薄層色譜Tiq＝四氫異喹啉D-1-Tiq＝D-1，2，3，4-四氫異喹啉-1-羧酸D-3-Tiq＝D-1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸D-3-Tiq＝D-1，2，3，4，5，6，7，8-全氫異喹啉-3-羧酸Arg-H＝精氨醛＝
下述實(shí)施例中的Rf值用硅膠薄層色譜法測定(Kieselgel 60F-254)，使用以下體系(A)氯仿-甲醇-乙酸，135∶15∶1(B)乙酸乙酯-乙酸-無水乙醇，90∶10∶10(C)氯仿-甲醇-乙酸，90∶30∶5實(shí)施例1D-1，2，3，4-四氫異喹啉-1-羰基-L-脯氨酰-L-精氨醛的合成
DL-1，2，3，4-四氫-1-異喹啉羧酸(1)于60psi下在帕爾振蕩器中使1-異喹啉羧酸(12.5g，0.072mol)在冰醋酸(185ml)中的溶液和氫氣在氧化鉑(2g)上室溫反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)混合物用硅藻土墊過濾，真空濃縮濾液，固體用水研制，過濾，干燥得純的標(biāo)題化合物(8g，63%)。FD-MS178(MH+);1HNMR(DMSO)δ2.80-3.00(m，3H)，3.10-3.20(m，1H)，3.30-3.40(m，2H)，7.05-7.25(m，4H)，7.65-7.75(m，1H)。
叔丁氧羰基-DL-1，2，3，4-四氫-1-異喹啉羧酸DCHA(2)將1，2，3，4-四氫-1-異喹啉羧酸(1)(7.08g，0.040mol)的溶液溶于2N NaOH(40ml，0.080mol)及叔丁醇(40ml)中，然后往該反應(yīng)混合物中加重碳酸二叔丁基酯(10.5g，0.048mol)。于室溫反應(yīng)24小時(shí)之后，蒸掉大部分叔丁醇，所得水溶液用乙醚萃取一次，分離水層并用2N HCl酸化至pH2.0，再用乙酸乙酯萃取，有機(jī)溶液用硫酸鎂干燥并真空濃縮至干，將所得油狀物溶在乙醚中，隨后往該溶液中加二環(huán)己基胺(7.9ml，0.040mol)，于4℃靜置4小時(shí)后，過濾沉淀，用乙醚洗，真空干燥，得純產(chǎn)品(15.7g，86%)。FD-MS 459(MH+);元素分析計(jì)算值C27H42N2O4C，70.71;H，9.23;N，6.11。
測定值C，71.07;H，9.37;N，5.87.
Boc-D-1-Tiq-Pro-OH (3)將Boc-DL-1-Tiq-ODCHA(2)(73.4g，160mmol)懸浮于EtOAc(200ml)中，用1.5N檸檬酸洗，再用水洗，然后用硫酸鎂干燥。于真空中將EtOAc濃縮至干。油狀物溶于EtOAc中，冷至0℃，加2，4，5-三氯苯酚(31.6g，160mmol)，再加DCC(33g，160mmol)。反應(yīng)混合物于0℃攪拌1小時(shí)后溫?zé)嶂潦覝夭⒃贁嚢?.5小時(shí)。反應(yīng)混合物被冷至0℃，過濾沉淀，真空下將母液濃縮至干，所得油狀物溶于吡啶(100ml)中。將脯氨酸(18.42g，160mmol)和三乙胺(22.3ml，160mmol)加到反應(yīng)混合物中，室溫反應(yīng)24小時(shí)后，真空中將溶劑濃縮至干。將所得殘留物溶在EtOAc/水中，用2N NaOH把pH調(diào)到9.5，分離水層，用2N HCl酸化至pH2.0。將己酸化的水層用乙酸乙酯萃取，有機(jī)溶液用硫酸鎂干燥并真空濃縮至干，所得油狀物溶于二氯甲烷及EtOAc中，該溶液于4℃放置4小時(shí)。過濾沉淀，用EtOAc洗滌，從二氯甲烷/EtOAc中重結(jié)晶一次，固體于真空中干燥，得純產(chǎn)品(19.6g，33%)。TLC Rf(A)0.44;FAB-MS，375(MH+);元素分析計(jì)算值C20H26N2O5C，64.15;H，7.00;N，7.48。
測定值C，63.26;H，6.98;N，7.52;[a]D＝+43.140 C＝0.5 MeOHBoc-Arg(CBZ)-OH (4)在3頸圓底燒瓶中，將Boc-Arg(HCl)-OH(82.1g，250mmol)溶于5N NaOH(240ml)中。反應(yīng)物被冷至-5℃，當(dāng)在55分鐘內(nèi)滴加氯甲酸芐酯(143ml，1.0mol，4eq)時(shí)，用5N NaOH(250ml)使pH維持在13.2-13.5之間。于-5℃再攪拌反應(yīng)1小時(shí)，用100ml水和500ml Et2O稀釋。分離水層并用Et2O(500ml)萃取兩次，水層用3N H2SO4(560ml)酸化至ph3.0，再用EtOAc(550ml)萃取。分離水層，用EtOAc萃取一次。合并的有機(jī)層用水洗滌后用硫酸鎂干燥，有機(jī)層于真空中濃縮至干，得66.1g標(biāo)題化合物(理論產(chǎn)量的65%)。TLCRf(C)0.43;FD-MS 408(M+);1HNMR(CDCl3)δ1.42(s，9H)，1.61-1.91(m，4H)，3.23-3.41(m，2H)，4.17(d，1H)，5.21(s，2H)，5.62(d，1H)，7.30-7.42(m，6H)，8.37(m，1H)。
Boc-Arg(z)-內(nèi)酰胺(5)將Boc-Arg(Z)-OH(4)(66.0g，0.162mol)溶于無水THF(230ml)中并在冰-丙酮浴上冷至-10℃。往溶液中加三乙胺(23.5ml，1.05eq)，再加氯甲酸異丁酯(22.5ml，1.05eq)。于-10℃將反應(yīng)攪拌5分鐘，隨后加入N-甲基嗎啉(18.7ml，1.05eq)。于-10℃攪拌反應(yīng)1小時(shí)，再于室溫?cái)嚢?小時(shí)，將反應(yīng)物倒入冰水(1L)中，過濾所得沉淀，用冷水洗，然后真空中干燥。產(chǎn)品從EtOAc中重結(jié)晶，得到38.05g(理論量的60%)標(biāo)題化合物。TLC Rf(A)0.77;FD-MS 391(MH+);1HNMR(CDCl3)δ1.48(s，9H)，1.78-1.98(m，2H)，2.50(m，1H)，3.41(m，1H)，4.43(m，1H)，4.90(m，1H)，5.16(s，2H)，5.27(m，1H)，7.28-7.45(m，6H)，9.41(m，1H)，9.68(m，1H)。
TFA·Arg(Z)-內(nèi)酰胺(6)將Boc-Arg(Z)-內(nèi)酰胺(5)(38.0g，0.097mol)加到含三氟乙酸(200ml)和苯甲醚(20ml)混合物的圓底燒瓶中，于0℃攪拌反應(yīng)混合物1小時(shí)，不加熱而在真空中濃縮反應(yīng)物，加乙醚(400ml)，過濾所得固體，用乙醚洗滌，然后真空干燥得40.5g標(biāo)題化合物(理論量的103%)。TLC Rf(C)0.29;FD-MS 291(MH+)Boc-D-1-Tiq-Pro-Arg(Z)-內(nèi)酰胺(7)在燒瓶1中，將Boc-D-1-Tiq-Pro(3)(17.8g，47.5mmol)溶解于DMF(100ml)中，冷至-15℃。然后加N-甲基嗎啉(5.3ml，52.3mmol)，再加氯甲酸異丁基酯(6.2ml，47.5mmol)，于-15℃將反應(yīng)混合物攪拌2分鐘。
在燒瓶2中，將TFA·Arg(Z)-內(nèi)酰胺(6)(19.2g，47.5mmol)溶于DMF(40ml)中，并冷卻至0℃。往該溶液中加N-甲基嗎啉(5.3ml，52.3mmol)，反應(yīng)混合物于0℃攪拌2分鐘。
將燒瓶2中的反應(yīng)物加到燒瓶1中，將反應(yīng)混合物于-15℃攪拌4小時(shí)，反應(yīng)混合物被慢慢溫?zé)嶂潦覝剡^夜，隨后加5%NaHCO3(5ml)。真空中除去反應(yīng)溶劑并將EtOAc(175ml)在水(150ml)中的溶液加到油狀物中。分離出有機(jī)層，然后連續(xù)用5% NaHCO3、水、0.1N HCl及水洗滌。有機(jī)溶液用硫酸鎂干燥，真空濃縮至干，得到標(biāo)題化合物的無定形固體(24.3g，理論量的79%)。
TLC Rf(A)0.71;FAB-MS 647(MH+);[a]D＝-32.80 C＝0.5 CHCl3Boc-D-1-Tiq-Pro-Arg(Z)-H (8)在氮?dú)夥障聦oc-D-1-Tiq-Pro-Arg(Z)-內(nèi)酰胺(7)(23.4g，36.2mmol)溶解于無水THF(300ml)中并置之于圓底燒瓶中。反應(yīng)被冷至-70℃。在30分鐘內(nèi)將于THF(37ml，37mmol)中的氫化鋰鋁(1M)滴加到反應(yīng)物中，然后于-70℃攪拌反應(yīng)30分鐘。在10分鐘內(nèi)將THF(20ml)和0.5N H2SO4(20ml)的溶液滴加到反應(yīng)混合物中。反應(yīng)用在水(400ml)中的EtOAc(400ml)溶液稀釋。分離EtOAc層，用水(150ml)洗2次，有機(jī)溶液用硫酸鎂干燥，真空濃縮至干，得21g無定形固體狀的標(biāo)題化合物(理論量的89%)。TLC(Rf(A)0.28。
D-1-Tiq-Pro-Arg-H硫酸鹽(9)將Boc-D-1-Tiq-Pro-Arg(Z)-H(8)(18.1g，27.9mmol)溶于THF(200ml)和水(80ml)的溶液中。然后向反應(yīng)中加入1N H2SO4(28ml)和5% Pd/C(3.0g)，于環(huán)境溫度及壓力下使反應(yīng)氫化5小時(shí)，反應(yīng)用氮?dú)饬鳑_洗并用Hyflo墊過濾除去催化劑。于真空中將濾液濃縮至100ml，隨后將正丁醇(200ml)加到濃縮液中。分離有機(jī)層，水層用正丁醇(100ml)萃取3次，合并萃取的有機(jī)層并于真空中濃縮，殘留物用Et2O/二異丙醚(1∶1)研制，過濾固體，真空干燥，得11.08g粗產(chǎn)品。
將上述固體(10.8g，19.2mmol)溶于水(20ml)和10N H2SO4(20ml)的溶液中，反應(yīng)被加熱到50℃并保持25分鐘。將反應(yīng)冷至室溫，用BioRad AG1-X8樹脂(羥基型)調(diào)溶液的pH值至4.0。濾去樹脂，將溶液凍干，得8.44g粗品標(biāo)題化合物。
將上述粗品標(biāo)題化合物試樣(4.2g)溶在0.01% H2SO4中并上樣至兩支串聯(lián)在一起的5×25cm Vydac C18樹脂柱中。用2%-10% CH3CN進(jìn)行線性梯度洗脫，以便從柱上洗下肽。根據(jù)分析RP-HPLC圖型分段收集柱級份，用羥基型的AG1-X8樹脂(Bio-Rad分析用陰離子交換樹脂50-100目)將合并的級份調(diào)至pH4.0。過濾所得溶液，將濾液凍干，得2.4g純的肽(理論量的57%)。FAB-MS 415(MH+);氨基酸分析Pro，0.92;Tiq，1.00;[α]D＝-76.12°C＝0.5/0.01N H2SO4;元素分析計(jì)算值C21H32N6O7S C，49.21;H，6.29;N，16.29;S，測定值C，51.20;H，6.17;N，16.88;S，5.37。
實(shí)施例2
D-3-Piq-L-Pro-L-Arg-H的合成D-1，2，3，4-四氫-3-異喹啉羧酸(1)將D-苯基丙氨酸(50g，302mmol)和37%甲醛溶液(120ml)及濃HCl(380ml)于回流溫度下反應(yīng)?；亓?0分鐘后，再加50ml甲醛。再使反應(yīng)回流3小時(shí)。反應(yīng)冷卻至-10℃，濾出沉淀，真空干燥固體，得純的標(biāo)題化合物(24.2g，45%)。FD-MS 178(MH+)。
D-1，2，3，4，6，7，8-全氫-3-異喹啉羧酸(2)于2000psi及120℃時(shí)，使D-1，2，3，4-四氫-3-異喹啉羧酸(1)(17g，96mmol)在水(200ml)及20ml 5N HCl中的溶液中用5%R h/Al2O3(8.5g)在高壓釜中反應(yīng)16小時(shí)，用硅藻土墊過濾反應(yīng)混合物，將濾液凍干，得純的標(biāo)題化合物(21g，100%)。FD-MS 184(MH+)。
Cbz-D-1，2，3，4，6，7，8-全氫-3-異喹啉羧酸(3)將D-3-Piq-OH(2)(21.0g，95.8mmol)溶于四氫呋喃(75ml)和水(50ml)中，用5N NaOH調(diào)溶液至pH 10.0，滴加氯甲酸芐酯(16.4ml，115mmol)，并用2N NaOH維持pH在9.5。于室溫再攪拌反應(yīng)混合物1小時(shí)，真空蒸發(fā)有機(jī)溶劑，并將所得殘留物溶在乙醚(100ml)和水(50ml)中，萃取水層，用3N HCl調(diào)pH至3.0。往水溶液中加乙酸乙酯(250ml)，分出有機(jī)層，并用硫酸鎂干燥，真空濃縮濾液，得澄清油狀的純標(biāo)題化合物(25.8g，85%)，F(xiàn)D-MS 318(MH+)，[α]D＝-5.1°C＝0.5 MeOH。
Cbz-D-1，2，3，4，6，7，8-全氫-3-異喹啉羧基-L-脯氨酰-叔丁酯(4)
將Cbz-D-3-Piq(3)(17.2g，54mmol)溶于DMF(50ml)中并冷至0℃，然后將脯氨酸叔丁酯(9.2g，54mmol)、1-羥基苯并三唑(7.3g，54mmol)和DDC(11.1g，54mmol)加入到上述溶液中，于0℃攪拌反應(yīng)3小時(shí)，再于室溫?cái)嚢?4小時(shí)，過濾反應(yīng)沉淀物，真空濃縮濾液得油狀物，將該油狀物溶在EtOAc(200ml)和水(100ml)中，分離有機(jī)層，并連續(xù)用1N NaHCO3、水、1.5N檸檬酸及水洗滌。用硫酸鎂干燥有機(jī)層，蒸發(fā)濾液得油狀物，干燥得標(biāo)題化合物(23.8g，94%)。FAB-MS 471(MH+)，TLC Rf(A)0.73;[α]D＝-40.0°C＝0.5 MeOH。
Cbz-D-1，2，3，4，6，7，8-全氫-3-異喹啉羧基-L-脯氨酸(5)將Cbz-D-3-Piq-Pro-O-t-Bu(4)(31.2g，66.3mmol)置于含三氟乙酸(100ml)、苯甲醚(5ml)的圓底燒瓶中，并于室溫?cái)嚢?小時(shí)，不加熱而于真空中濃縮反應(yīng)，隨后加入乙醚(150ml)和水(100ml)。用5N NaOH調(diào)溶液的pH至9.8。分離水層，用3N HCl調(diào)pH至2.8。往水溶液中加乙酸乙酯(200ml)，分離有機(jī)層，用硫酸鎂干燥，真空濃縮濾液得澄清的油狀物。將該油狀物溶于乙醚(300ml)中，室溫靜置24小時(shí)，過濾所得固體，用乙醚洗滌，干燥，得標(biāo)題化合物(13.5g，49%)。FAB-MS 415(MH+)，[α]D＝-57°C＝0.5 MeOH;元素分析計(jì)算值C23H30N2O5C，66.65;H，7.29;N，6.76。
測定值C，66.90，H，7.33，N，6.81。
實(shí)施例3D-3-Tiq-L-Pro-Arg-醛的合成
D-1，2，3，4-四氫-3-異喹啉羧酸(1)將D-苯基丙氨酸(50g，302mmol)和37%甲醛溶液(120ml)及濃HCl(380ml)于回流溫度下反應(yīng)。回流30分鐘后，再加50ml甲醛，將反應(yīng)回流3小時(shí)。將反應(yīng)冷至-10℃，過濾沉淀。真空中干燥固體，得純的標(biāo)題化合物(24.2g，45%)。FD-MS 178(MH+);元素分析，計(jì)算值C10H11NO2C，67.78;H，6.26;N，7.90。
測定值C，68.05，H，6.42，N，7.88。
Cbz-D-1，2，3，4-四氫-3-異喹啉羧酸(2)將D-3-Tiq-OH(1)(40.0g，225mmol)溶于四氫呋喃(200ml)和水(200ml)中。用5N NaOH調(diào)溶液的pH值至9.5。滴加氯甲酸芐酯(35.4ml，248mmol)同時(shí)用2N NaOH維持pH值為9.5。于室再攪拌反應(yīng)1小時(shí)。真空蒸出有機(jī)溶劑，隨后加入乙醚(200ml)和水(50ml)。分離水層，用5N HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至2.8。往溶液中加乙酸乙酯(250ml)，分離有機(jī)層，用硫酸鎂干燥。真空濃縮濾液，得澄清油狀的純標(biāo)題化合物(70.0g，100%)，F(xiàn)D-MS 312(MH+)。
Cbz-D-1，2，3，4-四氫-3-異喹啉羧基-L-脯氨酰-叔丁酯(3)將Cbz-D-3-Tiq-OH(3)(70.0g，225mmol)溶于DMF(150ml)中并冷至0℃。脯氨酸叔丁酯(38.5g，225mmol)、1-羥基苯并三唑(30.4g，225mmol)及DCC(46.4g，225mmol)被加到反應(yīng)混合物中，于0℃攪拌反應(yīng)3小時(shí)，再于室溫?cái)嚢?4小時(shí)，過濾反應(yīng)沉淀物，真空濃縮濾液得到油狀物。將該油狀物溶于EtOAc(250ml)和水(125ml)中，分出有機(jī)層，連續(xù)用1N NaHCO3、水、1.5N檸檬酸及水洗滌。用硫酸鎂干燥有機(jī)層，蒸發(fā)濾液得油狀物，干燥，得標(biāo)題化合物(93.8g，89%)。FAB-MS 464(M+);TLC Rf(A)0.76;[α]D＝-30.4°C＝0.5 MeOH。
Cbz-D-1，2，3，4-四氫-3-異喹啉羧基-L-脯氨酸(4)將Cbz-D-3-Tiq-Pro-O-t-Bu(3)(93.6g，200mmol)放于含三氟乙酸(150ml)和苯甲醚(7.5ml)的圓底燒瓶中，于室溫?cái)嚢?小時(shí)。不加熱而于真空中濃縮反應(yīng)，加乙醚(150ml)和水(200ml)，用5N NaOH調(diào)溶液的pH值至9.8，分出水層，用5N HCl調(diào)pH至2.5，再加乙酸乙酯(250ml)。分出有機(jī)層，用無水硫酸鎂干燥，真空濃縮濾液得澄清的油狀物，將該油狀物溶在乙醚(300ml)中，然后往該溶液中加二環(huán)己基胺(40ml，200mmol)，室溫靜置所得溶液24小時(shí)，濾出固體，用乙醚洗滌，干燥，得標(biāo)題化合物的DCHA鹽(103.7g，88%)。FAB-MS 409(MH+);[α]D＝-24.5°C＝0.5 MeOH。
最終的合成基本按照實(shí)施例1所述的偶聯(lián)反應(yīng)完成，得到D-1-Tiq-L-Pro-L-Arg-醛。FAB-MS 415(MH+);［α］
＝-13°;元素分析計(jì)算值 C21H30N6O3·H2SO4·2H2OC，46.03;H，6.62;N，15.33測定值C，46.33，H，6.04，N，15.04。
實(shí)施例4D-3-Tiq(7-OH)-Pro-Arg-H·2HCl的合成從Peptides International(Catalog ＃ ADX-5026-PI;Loiusville，KY)購買H-D-3-Tiq(7-OH)-OH，并用作制備標(biāo)題化合物的原料，合成方法和實(shí)施例3的各步驟基本相同。FAB-MS 431(MH+);［α］
＝-1.2°;元素分析計(jì)算值C21H30N6O4·2HCl·H2OC，48.37;H，6.52;N，16.12。
測定值C，48.28;H，6.14;N，15.53。
實(shí)施例5體內(nèi)試驗(yàn)用戊巴比妥鈉(30mg/kg，i.v.)麻醉重約9-14kg的成年雄性小臘兔犬。往氣管內(nèi)插管，用Harvard呼吸器提供室內(nèi)空氣給狗換氣(通氣速度為16次循環(huán)/分，一次呼吸進(jìn)肺部的空氣體積為25ml/kg)，用加熱墊使體溫維持在37°-38℃。導(dǎo)管插入左股動(dòng)脈和靜脈，以便分別測定相(phasic)動(dòng)脈血壓(Statham換能器，P23ID)和進(jìn)行藥物溶液的靜脈灌注。平均動(dòng)脈血壓以舒張血壓加 1/3 的脈沖壓計(jì)算。心率用以收縮壓脈沖觸發(fā)的心率計(jì)監(jiān)測，而壓力和心率的乘積作為心肌氧需求的指數(shù)測定。參見Gobel等人“在心絞痛病人運(yùn)動(dòng)期間心率壓力乘積作為心肌氧消耗指數(shù)”(Circulation 57∶549-556，1978)。用真皮下電極記錄導(dǎo)聯(lián)Ⅱ心電圖，以便評價(jià)ST-段的改變及估計(jì)心律失常的發(fā)生和持續(xù)時(shí)間。直接測得的參數(shù)被連續(xù)記錄在多通道示波器(Beckman Instruments，Inc.，F(xiàn)ullerton CA;model R611)上。
在第五肋間處切開左胸，將心臟懸在心包支架上，左彎曲的冠狀動(dòng)脈(LCX)被剝離，遠(yuǎn)側(cè)至心房分支，近端至任何較大的心室分支。用連接到Carolina流量計(jì)(model FM501)上的有刻度的流量探針(Carolina Medical Electronics，6mm.I.C)測量基線彎曲冠狀動(dòng)脈的血流。最初通過在LCX周圍結(jié)扎及插入18-19表針使每只狗形成臨界冠狀狹窄(critical coronary stenosis)，然后拿掉針使血流過針的徑面。不改變基線血流，通過由于LCX的10秒完全閉合產(chǎn)生的大于70%的增加將臨界狹窄調(diào)節(jié)減弱。已有報(bào)道(Sheehan，F(xiàn)和Epstein，S“由于冠狀動(dòng)脈痙攣引起的心律失常致死的確定先有的冠狀動(dòng)脈狹窄對再灌注心律失常發(fā)生的效應(yīng)”Circ.Res.65∶259-264，1982)以這種方式使用臨界狹窄，以限制再灌注充血和與之有關(guān)的心律失常以及潛在的心室纖維化。設(shè)置臨界狹窄后移去冠狀流探針。
設(shè)置臨界狹窄并平衡一段時(shí)間之后，記錄基線參數(shù)并使用勒除器使LCX完全閉合。使LCX的完全閉合維持1小時(shí)，隨即在除去勒除器后再灌注5小時(shí)，再灌注的最初30分鐘，原位保持臨界狹窄，在LCX閉合期間周期性地測量ST-段偏差，同時(shí)使用半定量方式每小時(shí)評價(jià)心律失常的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間1＝最小，2＝適中，3＝嚴(yán)重。使用預(yù)處理的或者再灌注藥物處理的方式進(jìn)行試驗(yàn)。在預(yù)處理方式中，在LCX閉合之前15分鐘開始靜脈輸注食鹽水或藥物溶液并持續(xù)到5小時(shí)的再灌注期間的最后。在再灌注方式中，先LCX閉合1小時(shí)，再在再灌注之時(shí)，開始連續(xù)5小時(shí)向靜脈輸注食鹽水或藥物溶液。
再灌注后，迅速切除心臟，以便采用Shea提出的、被Hahn改進(jìn)的三苯基四唑鎓/埃文斯(Evans)藍(lán)二元染料涂污方法測定梗塞。(Shea等人“萘氧唑酮(B ay g 6575)對于實(shí)驗(yàn)的冠狀血栓形成的有益效果”，Am Heart.J 107∶629-637，1984;及Shea等人“萘氧唑酮對于局部缺血再灌注的心肌的有益效果”，Eur.J.Pharmacol.102∶63-70，1984);(Hahn等人“白三烯B4受體的拮抗作用不能限制犬心肌梗塞范圍”，J.Pharmacol.Exp.Ther.253∶58-66，1990)。將套管插進(jìn)冠狀口上方的主動(dòng)脈內(nèi)，并在事先閉合的位點(diǎn)處插入LCX內(nèi)。LCX床用20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.4，38℃)中的1.5%三苯基四唑鎓溶液灌注，而心臟的其余部分用食鹽水中的0.1% Evans藍(lán)通過主動(dòng)脈同時(shí)灌注;灌注壓力維持在100mmHg，心肌灌注的時(shí)間約為5分鐘。然后將心臟以垂直于心尖軸的方向切成厚約1cm的六片。將被不彎曲的冠狀動(dòng)脈灌注的心肌染成藍(lán)色，彎曲的動(dòng)脈區(qū)域內(nèi)的活著的左心室(危險(xiǎn)區(qū))染成磚紅色，而危險(xiǎn)區(qū)內(nèi)的梗塞的左心室不染色。每個(gè)橫切的斷面均修整了右心室肌、瓣片及脂肪組織，涂干，然后蓋上一透明塑料蓋，以便測量各區(qū)域的范圍。心肌的每一區(qū)域也被分割并稱重以便進(jìn)行重量分析。分區(qū)的和累積的梗塞范圍以處于危險(xiǎn)的左心室的量的百分比表示。
表1冠狀動(dòng)脈閉合和再灌注后受試化合物對于心肌梗塞范圍的影響治療 方式 輸注速度 梗塞范圍a(mg/kg/hr)食鹽水 - - 42.4±4.0b化合物6 預(yù)處理 2.0 25.1±5.9c食鹽水 - - 40.1±4.1化合物6 再灌注 2.0 26.5±4.7c食鹽水 - - 38.4±3.4化合物5 再灌注 0.5 24.1±6.3c食鹽水 - - 48.3±5.8化合物5 再灌注 1.0 28.9±3.5c食鹽水 - - 38.4±3.4
化合物3 再灌注 1.0 19.0±2.6c食鹽水 - - 48.3±5.8化合物4 再灌注 1.0 26.0±5.5c食鹽水 - - 44.0±4.4b化合物1 再灌注 1.0 17.5±2.7c食鹽水 - - 45.9±6.6b化合物2 再灌注 1.0 21.8±4.3ca 梗塞范圍單位＝%梗塞總量/危險(xiǎn)區(qū)總量b 8-9只狗的平均值c 對于食鹽水對照有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.5)表1的數(shù)據(jù)指出，當(dāng)以臨床相關(guān)的方式用藥時(shí)，每一個(gè)受試的試驗(yàn)化合物都能抑制由于冠狀動(dòng)脈閉合及再灌注產(chǎn)生的心肌梗塞的范圍。因?yàn)楣跔顒?dòng)脈閉合和再灌注是用機(jī)械的勒除器方式產(chǎn)生的，梗塞抑制效率并不是由于在梗塞有關(guān)的動(dòng)脈內(nèi)防止了大量閉塞的血栓。用每個(gè)上述化合物搶救心室組織幾乎不出現(xiàn)或不明顯出現(xiàn)心血管的、心電圖的及出血的傾向。
式1化合物抑制局部缺血損傷的準(zhǔn)確的機(jī)理是不清楚的。這種生理活性可能與這些化合物的蛋白酶抑制的性質(zhì)有關(guān)。抑胰肽酶是一種已知的至少拮抗血漿酶、胰蛋白酶和激肽釋放酶的絲氨酸蛋白酶抑制劑，它顯示了能抑制與冠狀動(dòng)脈閉合有關(guān)的心肌局部缺血損傷(Diaz等人“激肽釋放酶抑制劑抑胰肽酶對于狗體內(nèi)由于冠狀動(dòng)脈閉合引起的心肌局部缺血損傷的影響”，Am.J.Cardiol.40541-549，1977)。我們還指出，抑胰肽酶能明顯減少由于冠狀動(dòng)脈閉合和再灌注而引起的心肌梗塞范圍。在作為對照的狗中，梗塞范圍是壞死危險(xiǎn)的左心室總量的37.9±5.4%，在用抑胰肽酶輸注的狗中是24.8±2.4%(P＜0.05%)。人們還不清楚抑胰肽酶和式1化合物的作用機(jī)理是否是類似的或者是相同的。
上述研究還包括估計(jì)在造成發(fā)展中的心肌梗塞形成中白細(xì)胞(中性白細(xì)胞)的分布。沒有任何一個(gè)式Ⅰ化合物能明顯地改變在局部缺血反應(yīng)中體系白細(xì)胞的增多以及在局部缺血及梗塞的心肌內(nèi)白細(xì)胞的累積。
總之，式Ⅰ的有代表性的化合物全都能夠減少和抑制由于局部缺血和再灌注引起的組織損傷。由于所有試驗(yàn)化合物都表明能夠抑制由于冠狀動(dòng)脈閉合和再灌注引起的心肌梗塞形成，因而確立了這種重要的治療性質(zhì)。式Ⅰ化合物在減少和抑制對組織的再灌注損傷的新方法中也是有用的。更重要的是，式Ⅰ化合物特別有用于治療人的心肌梗塞形成。
權(quán)利要求
1.用于治療再灌注損傷的下述通式化合物其中A是1或2個(gè)
并且對A，其手性中心為DL，優(yōu)選D；對于Pro，手性中心為L；對于Arg，手性中心是L；Z是C1-C4烷基或H；X是NH2、NHZ、叔丁氧羰基-NH、乙酰基-NH或三氟乙?；?NH；R是H、OH、鹵素、C1-C4烷氧基、CF3、C1-C4烷基、NO2或NH2以及q是CH2或CO。
2.權(quán)利要求1所請求保護(hù)的化合物，其中再灌注損傷是心肌梗塞形成。
3.與氧化劑清除劑一起使用的權(quán)利要求1-2中任何一項(xiàng)所請求保護(hù)的化合物。
4.與β-阻斷劑一起使用的權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)所請求保護(hù)的化合物。
5.與阿斯匹林一起使用的權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)所請求保護(hù)的化合物。
6.權(quán)利要求1所規(guī)定的化合物，選自D-3-Piq-L-脯氨酰-L-脯氨醛、D-7-羥基-1，2，3，4-Tiq-3-羰氧基-L-脯氨酰-L-精氨醛、D-3-Tiq-L-脯氨酰-L-精氨醛、D-1，2，3，4-Tiq-1-羰基-L-脯氨酰-L-精氨醛、N-甲基-D-苯基丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨醛以及Na-叔丁氧羰基-D-苯基丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨醛，用于減少和抑制再灌注損傷。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種減少和抑制當(dāng)組織遭到局部缺血和再灌注時(shí)引起的損傷的方法。本方法包括當(dāng)重新建立血流流向局部缺血組織的同時(shí)或其后立即用某些衍生的三肽精氨醛化合物給藥。該方法特別有用于減少和抑制發(fā)展中的心肌梗塞形成期間對心臟的損傷。
文檔編號A61K38/06GK1092780SQ9311299
公開日1994年9月28日 申請日期1993年12月23日 優(yōu)先權(quán)日1992年12月23日
發(fā)明者R·A·漢, R·T·舒曼, B·R·麥克唐納, G·F·史密夫 申請人:伊萊利利公司