專(zhuān)利名稱(chēng)：血纖維蛋白封閉劑組合物及其使用方法
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本發(fā)明涉及血纖維蛋白封閉劑。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種血纖維蛋白封閉劑的應(yīng)用，其中一種包含血纖維蛋白單體的組合物或一種包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物作為該血纖維蛋白封閉劑的成分。
哺乳動(dòng)物的止血即防止血液流失的一種機(jī)理是形成血液凝塊。在人體中凝塊的形成即血液凝結(jié)的發(fā)生是由于一個(gè)復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程，其最終的階段是利用凝血酶、鈣離子和活性因子ⅩⅢ將血纖維蛋白原-一種單體最終轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白Ⅱ聚合物，該聚合物是血纖維蛋白凝塊。
交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅱ聚合物的形成是通過(guò)用凝血酶將血纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成血纖維蛋白Ⅰ單體來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這種單體自發(fā)地聚合形成血纖維蛋白Ⅰ聚合物，該聚合物有時(shí)被稱(chēng)為可溶性血纖維蛋白Ⅰ，因?yàn)橥ㄟ^(guò)利用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)處理，血纖維蛋白Ⅰ聚合物能夠再轉(zhuǎn)變?yōu)檠w維蛋白Ⅰ單體。然后利用凝血酶可將血纖維蛋白Ⅰ聚合物轉(zhuǎn)變?yōu)檠w維蛋白Ⅱ聚合物，該聚合物有時(shí)被稱(chēng)為可溶性的血纖維蛋白Ⅱ，因?yàn)橥ㄟ^(guò)利用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法處理，該血纖維蛋白Ⅱ聚合物能夠轉(zhuǎn)變?yōu)檠w維蛋白Ⅱ單體。在因子ⅩⅢa-稱(chēng)為活性因子ⅩⅢ-的作用下，血纖維蛋白Ⅱ聚合物被交聯(lián)形成交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅱ，這種交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅱ是血纖維蛋白凝塊。因子ⅩⅢ在鈣離子存在的條件下被凝血酶激活。交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅱ有時(shí)被稱(chēng)為不溶性的血纖維蛋白Ⅱ，因?yàn)樗荒鼙晦D(zhuǎn)變?yōu)檠w維蛋白Ⅱ單體。
應(yīng)當(dāng)指出，凝血酶是由凝血酶原形成的。在存在鈣和其它輔助物質(zhì)的條件下，利用因子X(jué)2可將凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟浮?br> 每升血漿蛋白提供大約2到4克凝血酶原。血纖維蛋白原是一種單體，它是由三對(duì)用(Aα)2、(Bβ)2、r2命名的二硫化物連接的多肽鏈構(gòu)成的?！癆”和“B”表示兩個(gè)小的末端為氨基的肽，分別稱(chēng)為血纖維蛋白肽A和血纖維蛋白肽B。在利用凝血酶轉(zhuǎn)變血纖維蛋白原的過(guò)程中，血纖維蛋白肽A從血纖維蛋白原解離導(dǎo)致產(chǎn)生血纖維蛋白Ⅰ化合物以及其次發(fā)生的血纖維蛋白肽B的解離導(dǎo)致產(chǎn)生血纖維蛋白Ⅱ化合物。血纖維蛋白肽A和B的這種解離使血纖維蛋白原的分子量減小的極為少，大約從340000道爾頓中失去6000道爾頓，但是卻暴露了聚合作用的位置。要評(píng)述血液凝固的機(jī)理和血纖維蛋白原的結(jié)構(gòu)，參閱Ann.Rev、Biochem 49765-811(1980)上C.M.Jackson的文章以及在“Cell(細(xì)胞)”53∶505-518(1988)上B.Furie和B.C.Furie的文章。
血纖維蛋白封閉劑是一種生物粘接劑，它的作用仿效凝結(jié)的最后階段，借此導(dǎo)致產(chǎn)生血纖維蛋白凝塊。常規(guī)的血纖維蛋白封閉劑是由濃縮的人體血纖維蛋白原、牛抑膚酶和因子ⅩⅢ用為第一種成分以及牛的凝血酶和氯化鈣作為第二種成分組成。其施加一般利用雙筒(裝)的注射器，該注射器使之能夠同時(shí)將兩種成分施加到使用者想形成血纖維蛋白凝塊的部位。抑膚酶是一種附加的血纖維蛋白溶解的抑制劑，用以改進(jìn)血纖維蛋白封閉劑的穩(wěn)定性。
血纖維蛋白封閉劑的血纖維蛋白原成分是由匯集的人的血漿制備的。利用各種試劑例如，聚乙二醇、乙醚、乙醇、硫酸銨或甘氨酸，借助低溫沉淀和沉淀可以由人的血漿中濃縮出血纖維蛋白原，要更好地評(píng)述血纖維蛋白封閉劑，參閱M.Brennan的文章，在“血液評(píng)論”(BloodReviews)5∶240-244(1991);J.M.Gibble和P.M.Ness的文章在“輸血”(Transfusion)，30∶741-747(1990);H.Matras的文章在J.OralMaxillofacSurg，43∶605-611(1985)以及外科研究雜志(J.ofSurgicalResearch)48∶165-181(1990)上R.Lerner和N.Binur的文章。
近來(lái)，人們已經(jīng)關(guān)注利用自身固有的血纖維蛋白制備血纖維蛋白封閉劑。自身固有的血纖維蛋白封閉劑是這樣一種血纖維蛋白封閉劑其中的血纖維蛋白封閉劑的血纖維蛋白原成分是從病人本身的血液中提取的。自身固有的血纖維蛋白封閉劑的使用是優(yōu)選的，因?yàn)樗溯斞獋魅舅鶐?lái)的危險(xiǎn)。例如，B型肝炎、非A非B型肝炎以及后天免疫缺陷綜合癥(AIDS)(愛(ài)茲病)，否則它們可能存在于從匯集的人的血漿所提取的血纖維蛋白原成分中。參閱L.E.Silberstein等人在“輸血(Transfusion)”28319-321(1988)上的文章;K.Laitakari和J.Luotonen在“Laryngocope”99∶974-976(1989)上的文章以及A.Dresdale等人在胸部手術(shù)年刊(AnnalsofThoracicSurgery)40∶385-387(1985)上的文章。
血纖維蛋白封閉劑之所以能夠帶來(lái)傳染，不僅是由于血纖維蛋白原而且還由于牛抑膚酶和牛凝血酶成分。人們已經(jīng)了解牛凝血酶攜帶牛海綿狀組織腦炎(BSE)傳染病原體以及其它使哺乳動(dòng)物致病的病毒。此外，牛凝血酶是一強(qiáng)抗原，它能在人體中引起各種免疫反應(yīng)。因此，牛凝血酶的使用能導(dǎo)致對(duì)牛凝血酶的接受者具有不良的影響。參閱“醫(yī)院傳染年刊”(J.ofHospitalInfection)18(增補(bǔ)SupplementA)141-146(1991)上D.M.Taylor的文章S.B.Prusiner等人在CornellVet，81No2∶85-96(1991)上的文章以及D.Matthews在J.Roy、Soc“Health”3-5(1991年2月)上的文章。
因此，需要一種血纖維蛋白封閉劑提供給病人而不會(huì)帶來(lái)病毒感染的危險(xiǎn)或其它有害影響。
本發(fā)明涉及一種使用血纖維蛋白封閉劑的方法。其包括(a)用包含血纖維蛋白單體的組合物接觸一預(yù)期的位置;以及(b)與所述接觸步驟同時(shí)，將所述血纖維蛋白單體轉(zhuǎn)變?yōu)檠w維蛋白聚合物，借此形成血纖維蛋白凝塊。
本發(fā)明還提供各種制備方法，以制備包含這種血纖維蛋白單體的這樣一種和多種組合物以及藥盒。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及使用血纖維蛋白封閉劑的方法，其包括(a)用包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物接觸一預(yù)期的位置;以及(b)與所述接觸步驟同時(shí)，將所述非交聯(lián)的血纖維蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白，借此形成血纖維蛋白凝塊。
本發(fā)明還提供各種制備方法，以制備包含這種非交聯(lián)的血纖維蛋白的這樣一種和多種組合物以及藥盒。
對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，使用如下定義血纖維蛋白(Fibrin)-Fibrin指任何形式的血纖維蛋白。血纖維蛋白的非限定實(shí)例包括血纖維蛋白Ⅰ、血纖維蛋白Ⅱ和desBB血纖維蛋白。該血纖維蛋白可以呈單體形式或聚合物形式，其中的聚合物形式或者是非交聯(lián)的或者是交聯(lián)的。
血纖維蛋白單體-血纖維蛋白單體包括任何形式的血纖維蛋白，例如血纖維蛋白Ⅰ、血纖維蛋白Ⅱ和desBB血纖維蛋白，其中的血纖維蛋白呈單體形式和低聚物形式，其能夠溶解在包含血纖維蛋白單體的組合物中，并且其中的血纖維蛋白單體能夠轉(zhuǎn)變?yōu)檠w維蛋白聚合物。
血纖維蛋白聚合物-血纖維蛋白聚合物包括任何形式的血纖維蛋白，例如血纖維蛋白Ⅰ、血纖維蛋白Ⅱ和desBB血纖維蛋白，其中所述的血纖維蛋白呈聚合物形式，或者是非交聯(lián)的或者是交聯(lián)的。
非交聯(lián)的血纖維蛋白-非交聯(lián)的血纖維蛋白包括任何形式的血纖維蛋白。例如血纖維蛋白Ⅰ、血纖維蛋白Ⅱ或desBB血纖維蛋白，其中所述的血纖維蛋白是非交聯(lián)的并且能夠轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白。該非交聯(lián)的血纖維蛋白可以是血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白聚合物。
交聯(lián)的血纖維蛋白-交聯(lián)的血纖維蛋白包括任何形式的血纖維蛋白，例如血纖維蛋白Ⅰ、血纖維蛋白Ⅱ或desBB血纖維蛋白，其中血纖維蛋白是一種被交聯(lián)的血纖維蛋白聚合物。
本發(fā)明涉及一種使用血纖維蛋白封閉劑的方法，其包括(a)用包含血纖維蛋白單體的組合物與一預(yù)期的位置相接觸;以及(b)與所述接觸步驟同時(shí)，將所述血纖維蛋白單體轉(zhuǎn)變?yōu)檠w維蛋白聚合物，借此形成血纖維蛋白凝塊。
本發(fā)明還提供各種制備方法，以制備包含這種血纖維蛋白單體的這樣一種和多種組合物以及藥盒。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及使用血纖維蛋白封閉劑的方法，其包括(a)用包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物接觸一預(yù)期的位置;以及(b)與所述接觸步驟同時(shí)，將所述非交聯(lián)的血纖維蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白，借此形成血纖維蛋白凝塊。
本發(fā)明還提供各種制備方法，以制備包含這種非交聯(lián)的血纖維蛋白的這樣一種和多種組合物以及藥盒。
4.1.包含血纖維蛋白單體的組合物本發(fā)明的包含血纖維蛋白單體的血纖維蛋白組合物是這樣一種組合物其包含任何形式的能夠轉(zhuǎn)變?yōu)檠w維蛋白聚合物的血纖維蛋白單體。血纖維蛋白單體的非限定實(shí)例包括血纖維蛋白Ⅰ單體、血纖維蛋白Ⅱ單體或desBB血纖維蛋白單體，血纖維蛋白Ⅰ單體是優(yōu)選的。當(dāng)然，該血纖維蛋白單體的混合物是存在的。此外，對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，血纖維蛋白聚合物包括任何由于聚合物的血纖維蛋白單體而形成的聚合物。因此，舉例來(lái)說(shuō)，將血纖維蛋白Ⅰ單體轉(zhuǎn)變?yōu)檠w維蛋白聚合物能夠形成血纖維蛋白Ⅰ聚合物、交聯(lián)的或非交聯(lián)的和/或血纖維蛋白Ⅱ聚合物，是交聯(lián)的還是非交聯(lián)的取決于轉(zhuǎn)變步驟怎樣進(jìn)行。
血纖維蛋白Ⅰ單體是優(yōu)選的，因?yàn)樗鄬?duì)于血纖維蛋白原易于轉(zhuǎn)變成血纖維蛋白聚合物而無(wú)需使用凝血酶或因子ⅩⅢ。實(shí)際上，血纖維蛋白Ⅰ單體能夠自發(fā)地形成血纖維蛋白Ⅰ聚合物，該聚合物能夠起血纖維蛋白凝塊的作用，而不必考慮血纖維蛋白Ⅰ聚合物是否是交聯(lián)的還是非交聯(lián)的或者是否還要轉(zhuǎn)變?yōu)檠w維蛋白Ⅱ聚合物。因此，由于從血纖維蛋白Ⅰ單體形成血纖維蛋白Ⅰ聚合物是自發(fā)的，所以血纖維蛋白Ⅰ聚合物能夠無(wú)需凝血酶和因子ⅩⅢ而形成，以此避免了因牛凝血酶所帶來(lái)的問(wèn)題。(應(yīng)當(dāng)指出，假如血纖維蛋白Ⅰ單體被使用，使得血纖維蛋白Ⅰ單體與病人的血液，例如與傷口處的血液接觸，那么病人的凝血酶和因子ⅩⅢ可以將血纖維蛋白Ⅰ聚合物轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白Ⅱ聚合物。)包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物是包含任何形式的非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物。非交聯(lián)的血纖維蛋白的非限定實(shí)例是非交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅰ、非交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅱ和desBB血纖維蛋白，非交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅰ是優(yōu)選的。當(dāng)然，非交聯(lián)的血纖維蛋白的混合物是存在的。此外，對(duì)于本發(fā)明“交聯(lián)的血纖維蛋白”包括將非交聯(lián)的血纖維蛋白向交聯(lián)的血纖維蛋白轉(zhuǎn)變所產(chǎn)生的任何形式的血纖維蛋白。因此，舉例來(lái)說(shuō)，將非交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅰ向交聯(lián)的血纖維蛋白轉(zhuǎn)變所產(chǎn)生的交聯(lián)的血纖維蛋白可能是交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅰ和/或交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅱ，其取決于如何進(jìn)行轉(zhuǎn)變步驟。
非交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅰ之所以是優(yōu)選的，是因?yàn)榕c血纖維蛋白原相比，它更易于轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白。實(shí)際上可以認(rèn)為，血纖維蛋白Ⅰ能夠形成起血纖維蛋白封閉劑作用的交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅰ。因此，從非交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅰ形成交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅰ無(wú)需凝血酶就能進(jìn)行，以此避免了由于使用牛凝血酶所帶來(lái)的問(wèn)題，使活性因子ⅩⅢ可能還是需要的。(應(yīng)當(dāng)指出，假如非交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅰ被使用，使得非交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅰ與病人的血液，例如與傷口處的血液接觸，那么病人的凝血酶和因子ⅩⅢ可以將血纖維蛋白Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白Ⅱ。)
此外，非交聯(lián)的血纖維蛋白可以是聚合物、低聚物或單體。即使低聚物或單體即血纖維蛋白是優(yōu)選的。這是由于呈聚合形式的非交聯(lián)的血纖維蛋白一般是一種凝膠，因而將其輸送到預(yù)期位置是十分困難的并且在預(yù)期位置與細(xì)胞直接接觸較少。與此相反，呈低聚物或單體形式的所形成的非交聯(lián)的血纖維蛋白是可溶解的。并且因此能夠更易于輸送到預(yù)期位置以及與細(xì)胞具有更直接密切的接觸。當(dāng)然，該組合物可以包含這些形式的非交聯(lián)的血纖維蛋白的混合物。
包含血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物的來(lái)源可以是任何已知或待開(kāi)發(fā)的來(lái)源，只要該血纖維蛋白單體能夠轉(zhuǎn)變?yōu)檠w維蛋白聚合物或非交聯(lián)的血纖維蛋白能夠轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白。包含血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物的非限定來(lái)源是血液，優(yōu)選的是哺乳動(dòng)物的血液，更優(yōu)選的是人的血液以及各細(xì)胞培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物分泌血纖維蛋白原和重組體血纖維蛋白原，其中血液在兩者中優(yōu)先。該血液可以是包括例如全血或所制備的血纖維蛋白原制劑的任何形式的血液。此外，血液可以用來(lái)制備一種自身固有的血纖維蛋白封閉劑。
人們已經(jīng)觀(guān)察到，由下文所介紹的由全血所制備的包含非交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅰ(或者是血纖維蛋白Ⅰ單體或者是血纖維蛋白Ⅰ聚合物)的組合物能夠被轉(zhuǎn)變成交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅱ，而無(wú)需加入凝血酶、因子ⅩⅢ和其它用于血液凝固的必要物質(zhì)！可以認(rèn)為，這是由于由全血制備的包含非交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅰ的組合物保留了足夠數(shù)量的凝血酶原、因子ⅩⅢ和來(lái)自血漿的這樣一些其它必要物質(zhì)，使得非交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅰ能夠被轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白Ⅱ，而無(wú)需加入外源的凝血酶和因子ⅩⅢ。這種外源的凝血酶原和因子ⅩⅢ能夠被用在本發(fā)明的血纖維蛋白封閉劑中，作為包含血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物的成分。
然而，應(yīng)當(dāng)指出，不能保持這種足夠數(shù)量的外源的凝血酶和因子ⅩⅢ，以便按照適合于血纖維蛋白封閉劑的反應(yīng)速率將血纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白Ⅱ。人們認(rèn)為，在相同的反應(yīng)速率下，將血纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白Ⅱ比將非交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白Ⅱ需要更多的凝血酶。
這三種來(lái)源中的每一種都包含血纖維蛋白原，其能被轉(zhuǎn)變?yōu)檠w維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白。除了這樣的轉(zhuǎn)變步驟以外，所生成的包含血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物還必須呈濃縮形式。優(yōu)選的是，血纖維蛋白單體的濃度不小于大約10毫克/毫升，更優(yōu)選的是從大約20毫克/毫升到大約200毫克/毫升，甚優(yōu)選的是從約20毫克/毫升到大約100毫克/毫升，而最優(yōu)選的是從大約25毫克/毫升到大約50毫克/毫升。
此外，優(yōu)選的是，血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白都是非動(dòng)態(tài)的。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的一種非動(dòng)態(tài)的組合物意指這種組合物中的非交聯(lián)的血纖維蛋白在這種組合物制備后至少大約1.5分鐘，優(yōu)選地是至少大約3分鐘，更優(yōu)選地是至少大約30分鐘不發(fā)生交聯(lián)。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，包含血纖維蛋白單體的非動(dòng)態(tài)的組合物意指這種組合物中的血纖維蛋白單體在該組合物制備以后至少大約1.5分鐘，優(yōu)選地是至少大約3分鐘，更優(yōu)選地是至少大約30分鐘，甚優(yōu)選地是至少大約2小時(shí)不發(fā)生聚合。實(shí)際上，應(yīng)當(dāng)指出，在組合物制備以后，包含血纖維蛋白單體的組合物可以至少幾天即大約72小時(shí)呈非動(dòng)態(tài)的形式。
包含血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物可以由血液制備。該方法能夠最終產(chǎn)生一種氫鍵接的血纖維蛋白聚合物，該聚合物是非交聯(lián)的血纖維蛋白的一種形式。這種聚合物然后能夠用作血纖維蛋白封閉劑的一種成分或用一種被稱(chēng)為增溶的方法將其轉(zhuǎn)變?yōu)檠w維蛋白單體，所有這一切將在下文介紹。此外，優(yōu)選的是，在無(wú)菌的環(huán)境中制備包含血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物。
包含血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物可以通過(guò)抽取供血者的血并且最好在具有防凝劑的條件下由全血制備。任何防凝劑都可使用。防凝劑的非限定實(shí)例是肝素、EDTA、水蛭素、黃晶或者任何其它能夠直接或間接防止凝血酶形成的試劑，使用黃晶是優(yōu)選的。
含有血纖維蛋白原的血漿然后由全血中分離出來(lái)。任何分離技術(shù)都可以采用，例如，沉積法、離心法或過(guò)濾法。離心法可以按照10分鐘左右大約3000克進(jìn)行。然而，假如希望獲得富集血小板的血漿，離心法可以按照較低的克強(qiáng)度例如大約20分鐘500克的方式進(jìn)行。包含血漿的上清液能夠利用常規(guī)技術(shù)除去。
過(guò)濾法能夠?qū)⑷ㄟ^(guò)一個(gè)適當(dāng)?shù)倪^(guò)濾器進(jìn)行，該過(guò)濾器將血細(xì)胞與血漿分離。優(yōu)選的是，該過(guò)濾器是一個(gè)具有良好的蛋白質(zhì)透過(guò)性的微孔薄膜。
最終形成的血漿然后進(jìn)行處理，以便將血纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白。這種轉(zhuǎn)變能夠利用任何已知的或待開(kāi)發(fā)的技術(shù)來(lái)完成。
一種用于制備血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白的優(yōu)選技術(shù)是借助于一種類(lèi)似凝血酶的酶來(lái)進(jìn)行，其中也包括凝血酶。類(lèi)似凝血酶的酶是任何一種能夠催化由血纖維蛋白原形成血纖維蛋白的酶。一種通用的類(lèi)似凝血酶的酶的來(lái)源是蛇毒。由蛇毒提練類(lèi)似凝血酶的酶是優(yōu)選的。根據(jù)所選擇的類(lèi)似凝血酶的酶，這種類(lèi)似凝血酶的酶可以釋出構(gòu)成血纖維蛋白Ⅰ的血纖維蛋白肽A，構(gòu)成desBB血纖維蛋白的血纖維蛋白肽B或者是構(gòu)成血纖維蛋白Ⅱ的血纖維蛋白肽A和B。應(yīng)當(dāng)指出，那些釋出血纖維蛋白肽A和B的類(lèi)似凝血酶的酶可以按不同的速率進(jìn)行。因此，舉例來(lái)說(shuō)，最終形成的組合物可能是血纖維蛋白Ⅱ和血纖維蛋白Ⅰ的混合物或是血纖維蛋白Ⅱ與desBB血纖維蛋白的混合物。
表Ⅰ是在本發(fā)明中能夠使用的蛇毒來(lái)源、類(lèi)似凝血酶的酶的名稱(chēng)以及通過(guò)用酶處理所釋出的血纖維蛋白肽的非限定一覽表。
表1
＊()意指低的活性為了評(píng)述從蛇毒得到的各種類(lèi)似凝血酶的酶，參閱H.Pirkle和K.Stocker在ThrombosisandHaemostasis65(4)444-450(1991)上的文章。
優(yōu)選的類(lèi)似凝血酶的酶是巴特羅酶(Batroxobin)，特別是由B.Moojeni、BMaranhao和B.atrox所得到的，以及安克洛酶(Ancrod)，特別是由A.rhodostoma所得到的。
血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白可以通過(guò)將血漿與類(lèi)似凝血酶的酶相接觸而制備，借此使得血漿中的血纖維蛋白原被轉(zhuǎn)變成為血纖維蛋白單體。然而，最終形成的血纖維蛋白單體自發(fā)地聚合形成呈凝膠狀的氫鍵接的聚合物，該聚合物從剩余的血清溶液中分離出來(lái)。凝膠是包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物的一種形式。
這種非交聯(lián)的血纖維蛋白凝膠可通過(guò)各種方法收集，例如用離心法(10分鐘3000克)、由血清中直接人工分離非交聯(lián)的血纖維蛋白。然后用過(guò)濾法，直接或在壓力之下，除去被分離的血清。(可以使用一種1-100微米孔型過(guò)濾器，例如由Porex.Inc生產(chǎn)的20微米孔型燒結(jié)的聚丙烯過(guò)濾器，由Fluorotechniques.Inc生產(chǎn)的20-70微米孔型聚四氟乙烯過(guò)濾器，或者由Costar.Inc生產(chǎn)的22-46微米孔型的尼龍66過(guò)濾器)。
這種收集方式將非交聯(lián)的血纖維蛋白凝膠從血清溶液中分離出來(lái)，并且因此使非交聯(lián)的血纖維蛋白凝膠相對(duì)于血漿而加濃。應(yīng)當(dāng)指出，非交聯(lián)的血纖維蛋白凝膠至少保留了某些凝血酶原，因子ⅩⅢ以及來(lái)自血漿的這樣其它一些必要物質(zhì)，使得非交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅰ能夠被轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白Ⅱ，而無(wú)需加入外源的凝血酶或因子ⅩⅢ。這種外源的凝血酶原和因子ⅩⅢ能夠作為包含血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物的成分用在本發(fā)明的血纖維蛋白封閉劑中。
收集過(guò)程中的離心力和過(guò)濾壓力決定了有多少血清從非交聯(lián)的血纖維蛋白凝膠中除去，使用的離心力或壓力越高，最終形成的非交聯(lián)的血纖維蛋白凝膠越濃。然而，優(yōu)選的是這種力或壓力并沒(méi)有大到使凝血酶原和因子ⅩⅢ從非交聯(lián)的血纖維蛋白凝膠中被除去。
此刻非交聯(lián)的血纖維蛋白凝膠已準(zhǔn)備以包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物的形式作為血纖維蛋白封閉劑的一種成分。人們已經(jīng)觀(guān)察到，當(dāng)這種組合物由全血制備時(shí)，原有的血纖維蛋白原的大約60%到大約90%存在于該組合物中，當(dāng)然，是以非交聯(lián)的血纖維蛋白的形式。
包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物能夠在其制備后立即使用。實(shí)際上，當(dāng)該組合物是自身固有的時(shí)，在其制備之后立即使用這樣的組合物是特別優(yōu)選的。假如該組合物在制備后沒(méi)有立即使用，那么可將組合物貯藏起來(lái)。組合物的貯藏要求例如通過(guò)冷凍或冷凍干燥該組合物或?qū)⒃摻M合物保持在4℃下來(lái)保存。處于冷凍或冷凍干燥的組合物在幾個(gè)月的時(shí)間內(nèi)將是穩(wěn)定的。當(dāng)組合物保持在4℃下時(shí)，可以認(rèn)為該組合物在至少幾天的時(shí)間內(nèi)是穩(wěn)定的。
假如組合物被冷凍，那么在使用之前該組合物必須先解凍融化。
這種導(dǎo)致形成非交聯(lián)的血纖維蛋白凝膠的技術(shù)將血纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)榉墙宦?lián)的血纖維蛋白凝膠以及基本上在一個(gè)步驟中濃縮這樣的凝膠。另一方面，用常規(guī)技術(shù)濃縮血纖維蛋白原是略欠優(yōu)選的，這些技術(shù)是例如使用各種試劑聚乙二醇、乙醚、乙醇、硫酸銨或甘氨酸的冷凍沉淀和沉淀技術(shù)。被濃縮的血纖維蛋白原然后能夠利用上述的技術(shù)或優(yōu)選地使用該技術(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)榉墙宦?lián)的血纖維蛋白凝膠，由于血纖維蛋白原已被濃縮，那么該血纖維蛋白原就能被轉(zhuǎn)變?yōu)榘w維蛋白單體的組合物，而無(wú)需首先形成非交聯(lián)的血纖維蛋白凝膠。這一反應(yīng)能夠通過(guò)將被濃縮的血纖維蛋白原與離液序列高的介質(zhì)相接觸而實(shí)施以得到一種血纖維蛋白原溶液。
該離液序列高的介質(zhì)對(duì)防止血纖維蛋白單體自發(fā)地聚合是必要的，該血纖維蛋白單體是在類(lèi)似凝血酶的酶同血纖維蛋白原接觸的過(guò)程中形成的。該離液序列高的介質(zhì)與這種血纖維蛋白原組合物混合，然后，例如用上述類(lèi)似凝血酶的酶或者用如下文介紹的固著在一個(gè)載體上的類(lèi)似凝血酶的酶將血纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)檠w維蛋白單體。
合適的離液序列高的介質(zhì)包括尿素、溴化鈉、鹽酸胍、KCNS、碘化鉀和溴化鉀。離液序列高的介質(zhì)的優(yōu)選濃度為從大約0.2摩爾到大約6.0摩爾。最優(yōu)選的是從大約0.3摩爾到2.0摩爾。優(yōu)選的是使用可能的最少數(shù)量的離液序列高的介質(zhì)，仍然可以防止血纖維蛋白單體自發(fā)地聚合。
應(yīng)當(dāng)指出，優(yōu)選的是，直到希望將血纖維蛋白單體轉(zhuǎn)變?yōu)檠w維蛋白聚合物時(shí)，才將鈣離子源添加到離液序列高的介質(zhì)中，如下所述。這就保證了血纖維蛋白單體并不由于任何內(nèi)源的血液凝固因子的激活而發(fā)生交聯(lián)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，類(lèi)似凝血酶的酶被固著在載體上。這個(gè)實(shí)施例是優(yōu)選的，原因在于能夠容易地將固著的酶從血漿中分離，以此防止包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物被酶所污染。
能夠附著類(lèi)似凝血酶的任何載體均可用于本發(fā)明。適合的載體的非限定實(shí)施例是纖維素、多葡聚糖、瓊脂糖、聚苯乙烯、硅石、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、玻璃珠、聚四氟乙烯、膠原、聚碳酸脂纖維、纖維素衍生物、特氟隆及它們的組合物，而且硅石聚苯乙烯和瓊脂糖是優(yōu)選的，瓊脂糖是最優(yōu)選的。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，類(lèi)似凝血酶的酶附著到某一載體上，該載體是過(guò)濾器或在過(guò)濾器的一側(cè)上并附著在另一個(gè)載體例如一個(gè)小球上。另外，類(lèi)似凝血酶的酶將通過(guò)過(guò)濾器。因此過(guò)濾器的孔型應(yīng)當(dāng)是這樣的所固著的類(lèi)似凝血酶的酶不能通過(guò)過(guò)濾器，而非交聯(lián)的血纖維蛋白能夠通過(guò)過(guò)濾器。非交聯(lián)的血纖維蛋白的制備通過(guò)將血漿與在過(guò)濾器一側(cè)上的類(lèi)似凝血酶的酶相接觸以形成血纖維蛋白單體，非交聯(lián)的血纖維蛋白與其余的血漿一起通過(guò)過(guò)濾器。因此，最終形成的包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物必須與類(lèi)似凝血酶的酶分離。血纖維蛋白單體在通過(guò)過(guò)濾器以后，自發(fā)地聚合形成一種非交聯(lián)的血纖維蛋白聚合體。
為了將類(lèi)似凝血酶的酶固著在一載體上，該載體必須被活化。利用任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)都能夠?qū)崿F(xiàn)這一點(diǎn)。例如適合用于衍生載體的各種活化化學(xué)物質(zhì)是重氮類(lèi)、異氰酸酯類(lèi)、酸性氯化物類(lèi)、酸酐類(lèi)、氯化磺酰類(lèi)、二硝基氟苯類(lèi)、異硫氰酸鹽類(lèi)、羥基類(lèi)、氨基類(lèi)、羥基丁二酸酰胺類(lèi)、三嗪類(lèi)、肼基類(lèi)、碳化二亞胺類(lèi)、硅烷類(lèi)和溴化氰。參閱(a)Pentapharm專(zhuān)利DT2440254A;(b)P.D.G.Dean、W.S.Johnson和F.A.Middle(編輯)1991.IRLPressOxford(情報(bào)檢索圖書(shū)館出版.牛津)-親合色譜法(AffinityChromatography)-“一種實(shí)用研究”-第二章-活化過(guò)程，其公開(kāi)內(nèi)容結(jié)合本案可供參考。
優(yōu)選的活化化學(xué)反應(yīng)是利用酰肼類(lèi)。使用活化載體的酰肼導(dǎo)致形成最大百分率的類(lèi)似凝血酶的酶(利用S2238檢定法檢測(cè)出至少約30%至約50%的酶-參閱AxelssonG等人在Thromb.Haemost36∶517(1976)上的文章)，該酶保持載體的活化基本上沒(méi)有酶的浸漏。此外，為了防止酶分解，對(duì)于酶的偶聯(lián)可以采用低的PH值例如4-6。
一般情況下，載體利用高活性的化合物來(lái)活化，該載體其次和配位基例如-OH、-NH2、-SH、-COOH、-CHO中的一個(gè)宮能團(tuán)反應(yīng)以形成一個(gè)共價(jià)鍵。在本發(fā)明中所使用的優(yōu)選活化化學(xué)反應(yīng)是(a)利用三嗪類(lèi)并且優(yōu)選鹵化三嗪類(lèi);
(b)利用氯化-tresyl類(lèi);
(c)利用羥基二咪唑類(lèi);
(d)利用溴化氰類(lèi);以及(e)利用酰肼或氨基類(lèi)。
在(a)-(d)中，蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)反應(yīng)與-NH2、-SH或-OH偶聯(lián)，而在(e)中，蛋白質(zhì)借助被氧化的碳水化合物部分即-CHO進(jìn)行偶聯(lián)。利用這些化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致形成最大百分率的類(lèi)似凝血酶的酶(用S2238檢定法測(cè)出至少約30%到50%的酶)，該酶保持載體的活化基本上沒(méi)有酶浸漏。
采用過(guò)兩種不同的方法用于三嗪活化。第一種方法包括將三嗪環(huán)直接連接到表面的羥基上。這與所采用的CNBr活化法相似，其中表面的二元醇與CNBr進(jìn)行反應(yīng)。為了活化三嗪，瓊脂糖的羥基與三嗪發(fā)生反應(yīng)(氰尿酰氯)。
一般情況下，載體利用一種高活性的化合物活化以形成一個(gè)共價(jià)鍵，其次該載體和配位基例如-OH、-NH2、-SH、-CHO中的一個(gè)官能團(tuán)反應(yīng)。剩余的沒(méi)有附著類(lèi)似凝血酶的酶的活性基團(tuán)可以而不是必需用非活性的化合物例如乙醇胺、乙酸酐或甘氨酸封阻。
在本發(fā)明中所采用的優(yōu)選活化化學(xué)反應(yīng)是(a)溴化氫活化，隨后借助于蛋白質(zhì)上的氨基直接偶聯(lián)酶。
(b)利用單氯三嗪活化載體，隨后借助于-NH2、-OH或-SH偶聯(lián)酶。
(c)利用雙氯三嗪活化載體，隨后借助于-NH2、-OH或-SH偶聯(lián)該酶。
(d)tresyl chloride活化載體，隨后借助于-NH2、-OH或-SH偶聯(lián)該酶。
(e)利用脂肪酸酰肼或酰肼活化載體，隨后借助于-CHO偶聯(lián)被氧化的酶。
(f)利用氨配位基活化載體，接著借助于-CHO偶聯(lián)被氧化的酶。所有上述優(yōu)選操作法都采用瓊脂糖作為載體，然而，采用硅石也是可能的。當(dāng)采用這種載體時(shí)，優(yōu)選的活化化學(xué)反應(yīng)是(a)r-縮水甘油丙氧三甲氧基硅烷(Gammaglycidoxypropyltrimethoxysilane)活化，其借助于蛋白質(zhì)上的-NH2直接偶聯(lián)類(lèi)似凝血酶的酶。
(b)溴化氰活化，隨后借助于蛋白質(zhì)上的-NH2直接偶聯(lián)酶。
(c)r-縮水甘油氧代三甲氧基硅烷(Gammaglycidoxytrimethoxysilane)活化，隨后打開(kāi)環(huán)氧環(huán)以形成一個(gè)二元醇，其次能利用溴化氰活化。借助于蛋白質(zhì)上的-NH2能夠?qū)崿F(xiàn)直接偶聯(lián)該酶。
(d)r-縮水甘油丙氧三甲氧基硅烷活化，隨后通過(guò)利用氨液處理制備氨基-硅石。氨基-硅石其次能夠利用氰尿酰氯(三嗪)活化，并且利用-NH2、-OH或-SH偶聯(lián)酶。
將酶偶聯(lián)到被活化的載體上必須在一定的PH值下緩沖，以便得到最佳的酶鍵接。在一般情況下，利用常規(guī)的活化技術(shù)例如r-縮水甘油丙氧三甲氧基硅烷將酶偶聯(lián)到被活化的載體上和溴化氰將蛋白質(zhì)偶聯(lián)到活性基團(tuán)上都需要在酶的一級(jí)和二級(jí)胺的PKa要高1-2單位的PH值下緩沖。然而，使用氯化氰作為活化劑應(yīng)該采用更低的PH緩沖劑(最佳偶聯(lián)PH值為4-6)。另一偶聯(lián)糖蛋白例如將巴特羅酶(batroxobin)偶聯(lián)到一惰性載體上的方法是借助于它們的碳水化合物部分。這包括首先將糖基氧化成-CHO，接著在酸性PH值下直接偶聯(lián)到一氨基例如酰肼上。許多偶聯(lián)緩沖劑都可以使用。例如參閱表2。
表2 用于將酶固著到硅石和瓊脂糖載體上的偶聯(lián)緩沖劑的實(shí)
在活化后，載體將具有比用于酶偶聯(lián)所需的更多的活化位置。這些位置假如沒(méi)有去活化，可能以共價(jià)鍵的方式鍵接污染的蛋白質(zhì)，其可能影響被固著的酶的生物功能。
過(guò)剩的活化基可以借助小的不相干擾的胺例如乙醇胺的共價(jià)偶聯(lián)來(lái)去活化。
假如活化載體的酰肼或胺被采用，隨后酶偶聯(lián)的剩余活化基的封阻可以利用乙酸酐而實(shí)現(xiàn)。
根據(jù)固著的方法和所采用的載體，在固著過(guò)程中產(chǎn)生酶的去活化。采用具有最希望的活化化學(xué)物質(zhì)(例如溴化氰)的硅石載體，高達(dá)80-90%的酶活性被失去。然而，采用瓊脂糖作為載體用氰尿酰氯活化導(dǎo)致酶的活性損失較少。
為了表征在載體上所固著的酶的功效，可以采用兩種方法評(píng)估固著在載體上的活性酶的數(shù)量;“凝結(jié)時(shí)間檢定法”，參閱Clauss.A.在A(yíng)ctaHae-matol，17237(1957)上的文章和S2238檢定法-參閱AxelssonG等人在“凝血酶、止血?jiǎng)?Thromb.Haemost)36517(1976)上的文章。
為了評(píng)估酶從載體中的浸漏，可以采用如下的檢定法。
通過(guò)利用放射性標(biāo)記類(lèi)似凝血酶的酶例如I
巴特羅酶(batroxobin)，可以測(cè)定浸漏。然而，在進(jìn)行浸漏測(cè)定之前，必須除去任何未鍵合的放射性標(biāo)記物。實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)可以利用如下試劑依次沖洗該載體50毫升PH值5.5的50毫摩爾的乙酸鈉;100毫升50毫摩爾甘氨酸/1摩爾的氯化鈉，PH值3.0;100毫升50毫摩爾碳酸鈉/1摩爾氯化鈉，PH值10.0;100毫升50毫摩爾磷酸鈉/1摩爾的氯化鈉，PH值7.0;100毫升水和100毫升50毫摩爾磷酸鉀/1摩爾的氯化鈉，PH值7.0;在這樣的清洗過(guò)程之后，在洗滌液中不再有可檢測(cè)的放射性標(biāo)記物，≥50%的最初被放射性標(biāo)記的酶偶聯(lián)到載體上。
(a)所需酶的數(shù)量用于處理30-70毫升血漿(由60-150毫升全血得到)所需酶的數(shù)量在混合大約10-15分鐘之后為30-200單位。
假如采用瓊脂糖作為載體基質(zhì)，30-200單位(U)的巴特羅酶(batroxobin)在大約7-20分鐘后導(dǎo)致非交聯(lián)的血纖維蛋白的形成。這一系統(tǒng)采用酰肼活化和0.25克-1.0克的干燥瓊脂糖。在這種情況下，剩余的活性基團(tuán)的非封阻狀態(tài)是需要的。
(b)被固著的酶與血漿血纖維蛋白原的反應(yīng)在一般情況下，被固著的酶與血漿中的血纖維蛋白原的反應(yīng)如下進(jìn)行大約30-70毫升的血漿被添加到包含有被固著的類(lèi)似凝血酶的酶的已知數(shù)量的干燥載體上。該懸浮液平緩地混合持續(xù)大約7-20分鐘(在一個(gè)旋轉(zhuǎn)式混合器上旋轉(zhuǎn)或手動(dòng)混合)。在此期間，在血漿中的血纖維蛋白原被固著的酶所分解，以釋出血纖維蛋白肽A和/或血纖維蛋白肽B，導(dǎo)致形成氫鍵接的血纖維蛋白Ⅰ聚合物，氫鍵接的desBB血纖維蛋白聚合物或氫鍵接的血纖維蛋白Ⅱ聚合物，其中每一種聚合物都與固著的酶相連。
如上所述，氫鍵接的血纖維蛋白聚合物呈凝膠形態(tài)并且能夠例如通過(guò)離心法(3000克/10分鐘)或過(guò)濾法(經(jīng)過(guò)1-50微米的薄膜型過(guò)濾器)而收集。這種收集方式將氫鍵接的血纖維蛋白聚合物從血清中分離出來(lái)，因而濃縮了該聚合物。
應(yīng)當(dāng)指出，假如在血漿中使用類(lèi)似凝血酶的酶，導(dǎo)致因子ⅩⅢ的激活，那么優(yōu)選的是，該血漿組合物被改變，此時(shí)類(lèi)似凝血酶的酶被使用以便防止非交聯(lián)的血纖維蛋白例如非交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅰ或Ⅱ形成交聯(lián)的血纖維蛋白例如交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅰ或Ⅱ。當(dāng)然，假如在血纖維蛋白原已經(jīng)被轉(zhuǎn)變成非交聯(lián)的血纖維蛋白之后，血漿組合物被立即用作血纖維蛋白封閉劑，那么改變?cè)撗獫{組合物就可能不是必要的。
為了防止非交聯(lián)的血纖維蛋白發(fā)生交聯(lián)，血漿組合物可以利用任何已知的或待開(kāi)發(fā)的技術(shù)來(lái)改變。通過(guò)封阻內(nèi)源性的凝血酶(該凝血酶能夠激活因子ⅩⅢ)，例如用水蛭素或凝血酶抑制劑封阻;或者封阻活性因子ⅩⅢ的作用，例如用重金屬(Hg)、乙基汞硫代水楊酸鈉或抑制抗體封阻。血纖維蛋白Ⅰ或Ⅱ的交聯(lián)需要鈣離子的存在。因此，假如鈣由血漿組合物中被除去，血纖維蛋白Ⅰ或Ⅱ的交聯(lián)就能被抑制。參閱Carr等人在“生物化學(xué)雜志”(J.Biochem)239513(1986)上的文章;Kaminski等人在“生物、化學(xué)雜志”(J.Biol.Chem)25810530(1983)上的文章以及Kanaide等人在13229(1982)上的文章。鈣螯合劑可添加到該組合物中，以防止血纖維蛋白Ⅰ或Ⅱ的交聯(lián)。這種螯合劑鍵接到鈣上，借此防止交聯(lián)。任何鈣螯合劑都可使用。鈣螯合劑的非限定性實(shí)例包括檸檬酸、糖精酸、乙二胺四乙酸(EDTA)，次氮基三乙酸(NTA)、羥基乙二胺三乙酸(HEEDTA)、乙二胺二(鄰羥基苯基)乙酸(EDDHA)、乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、1.2-二氨基環(huán)己烷四乙酸(DCTA)、N-N-雙羥乙基甘氨酸、4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷-磺酸(HEPES)、N-羥乙基亞胺基-二乙酸(HIMDA)以及它們的鹽類(lèi)，其中檸檬酸鹽是優(yōu)選的。
任何能夠分泌血纖維蛋白原的細(xì)胞培養(yǎng)物都可用在本發(fā)明中，利用上述關(guān)于血漿的相同技術(shù)可以將細(xì)胞培養(yǎng)物中的血纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)檠w維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白。然而，在這樣的轉(zhuǎn)變之前，最好先除去細(xì)胞碎片。
可以采用的方法如下培養(yǎng)HEPG2細(xì)胞并且按照關(guān)于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)物的常規(guī)教程所描述的維持其生長(zhǎng)。此外，參閱Liu等人在“細(xì)約工藝學(xué)”(Cvtotechnology)5129-139(1991)上的文章。將細(xì)胞在含10%牛血清的最低基本介質(zhì)中以1∶4到1∶8的分裂比殖入燒瓶中并用5%CO2來(lái)緩沖。
在37℃下生長(zhǎng)24-36小時(shí)之后，介質(zhì)被除去并用不含介質(zhì)而含適當(dāng)?shù)牡鞍酌敢种苿┖?國(guó)際單位(IU)/毫升肝素的血清代換。該培養(yǎng)物質(zhì)再持續(xù)生長(zhǎng)24小時(shí)，在此期間不含介質(zhì)的血清發(fā)生三次連續(xù)的變化。
滿(mǎn)足條件的介質(zhì)按照3000克/10分鐘進(jìn)行離心處理，以除去任何細(xì)胞碎片并且包含血纖維蛋白原的被凈化的上清液然后與類(lèi)似凝血酶的酶平緩地混合4-5小時(shí)。最好類(lèi)似凝血酶的酶被固著。每500毫升介質(zhì)含有大約1毫升到大約50毫升澄清體積的瓊脂糖-類(lèi)似凝血酶的酶的比例是適當(dāng)?shù)?。如上所述，除瓊脂糖之外的載體也可采用。所形成的血纖維蛋白單體自發(fā)地聚合并圍繞在固定載體周?chē)?br> 現(xiàn)已不含血纖維蛋白原的上清液被從載體/血纖維蛋白凝膠中輕輕倒出，然后連續(xù)地用4種不同體積的Nacl清洗，變化率為每1.0毫升原來(lái)的澄清體積的載體加入大約10毫升到大約100毫升0.15摩爾的Nacl。被清洗的凝膠然后在真空下用被燒結(jié)的玻璃漏斗進(jìn)行半脫水。
當(dāng)包含血纖維蛋白單體的組合物被使用時(shí)，能夠分泌血纖維蛋白原的細(xì)胞培養(yǎng)物的利用是特別優(yōu)選的。這是因?yàn)榭梢哉J(rèn)為這樣的組合物能夠用來(lái)形成用作血纖維蛋白封閉劑的血纖維蛋白聚合物，而不考慮該血纖維蛋白聚合物最終是否交聯(lián)。因此，由于這種細(xì)胞培養(yǎng)物不包含對(duì)交聯(lián)來(lái)說(shuō)是必不可少的因子ⅩⅢ，所以無(wú)需外源性的因子ⅩⅢ加入以制成一種有效的血纖維蛋白封閉劑。
非交聯(lián)的血纖維蛋白組合物還能由重組體血纖維蛋白原制備。只有在最近血纖維蛋白原才由重組體DNA技術(shù)制成。參閱S.Roy等人文章“生物化學(xué)雜志”2664758-4763(1991)，其內(nèi)容結(jié)合本案可供參考。Roy等人似乎是第一批表述血纖維蛋白原的所有3個(gè)鏈結(jié)構(gòu)并且指出COS(碳硫化物)細(xì)胞壓出、裝配和分泌呈某一形式的鏈，其能夠形成止血酶誘導(dǎo)的凝塊。形成的血纖維蛋白原組合物然后能夠利用本文上述關(guān)于分泌血纖維蛋白原的細(xì)胞培養(yǎng)物的相同技術(shù)來(lái)制備包含血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物。然而，優(yōu)選的是，在形成包含血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物以前，利用上述有關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)物的相同技術(shù)將細(xì)胞碎片除去。該細(xì)胞碎片能夠利用離心法或過(guò)濾法除去。
當(dāng)包含血纖維蛋白單體的組合物被使用時(shí)，重組體血纖維蛋白原的使用是特別優(yōu)選的。這是因?yàn)榭梢哉J(rèn)為這種組合物可以被用來(lái)形成用作血纖維蛋白封閉劑的血纖維蛋白聚合物，而無(wú)需考慮該血纖維蛋白聚合物最終是否交聯(lián)。由于該重組體血纖維蛋白原細(xì)胞培養(yǎng)物不包含對(duì)交聯(lián)來(lái)說(shuō)是必不可少的因子ⅩⅢ，所以無(wú)需加入外源性的因子ⅩⅢ，以便制備一種有效的血纖維蛋白封閉劑。
利用例如類(lèi)似凝血酶的酶使血纖維蛋白原向非交聯(lián)的血纖維蛋白的轉(zhuǎn)變導(dǎo)致形成呈氫鍵接的血纖維蛋白聚合物形式的血纖維蛋白。然而，正如以上所述，優(yōu)選的是，包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物呈低聚物或單體形式，這種組合物對(duì)包含血纖維蛋白單體的組合物來(lái)說(shuō)是必不可少的。通過(guò)使包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物增溶可以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。
當(dāng)非交聯(lián)的血纖維蛋白是利用固著在載體上的類(lèi)似凝血酶的酶形成的時(shí)候，增溶是特別優(yōu)選的。這是由于固著在載體上的類(lèi)似凝血酶的酶的使用一般會(huì)導(dǎo)致形成與這種固著的酶相連的氫鍵接的非交聯(lián)血纖維蛋白聚合物。因此，由于優(yōu)選的是，載體沒(méi)有包含在形成的組合物中，所以增溶還使人們能夠?qū)⑤d體與被固著的酶一道從包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物中排除。
增溶能夠利用任何導(dǎo)致生成血纖維蛋白單體的已知的或待開(kāi)發(fā)的技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。增溶可以利用將包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物與一種適當(dāng)?shù)乃嵝跃彌_液相接觸而實(shí)現(xiàn)，最好酸性緩沖劑的PH值小于5左右，最好是從大約1到大約5。適合的酸性緩沖液的非限定實(shí)例包括乙酸、琥珀酸、乙四醇醛酸、磺基丙氨酸、巴豆酸、甲叉丁二酸、谷氨酸、甲酸、天冬氨酸、己二酸以及它們的鹽類(lèi)并且琥珀酸、天冬氨酸、己二酸和乙酸鹽是優(yōu)選的，最優(yōu)選的是乙酸鈉。人們已經(jīng)注意到，優(yōu)選的酸性緩沖劑其功能遠(yuǎn)比其它用于試驗(yàn)的酸性緩沖劑更有效。
酸性緩沖劑的優(yōu)選濃度是從大約0.02摩爾到大約1摩爾，最優(yōu)選的是從大約0.1摩爾到大約0.3摩爾。這種優(yōu)選的濃度使組合物的離子強(qiáng)度在生物學(xué)上更相容。
優(yōu)選的是使用可能的最少體積的酸性緩沖劑，仍能溶解非交聯(lián)的血纖維蛋白以形成一個(gè)包含血纖維蛋白單體的水溶液。這會(huì)形成一種包含血纖維蛋白單體的水溶液，該溶液含有高濃度的血纖維蛋白單體。一般情況下，要求每一毫升包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物有大約1毫升到大約4毫升酸性緩沖劑。
酸性緩沖劑與非交聯(lián)的血纖維蛋白相混合，然后有力地?cái)嚢杓s1到2分鐘以保證增溶是完全的。
增溶還可以在中性的PH值下借助于一種離液序列高的介質(zhì)來(lái)完成。合適的離液序列高的介質(zhì)包括尿素、溴化鈉、鹽酸胍、KCNS、碘化鉀和溴化鉀。優(yōu)選的離液序列高的介質(zhì)濃度是從大約0.2到大約6.0摩爾，最優(yōu)選的是從大約3.5到大約5.0摩爾。
當(dāng)使用酸性緩沖劑時(shí)，優(yōu)選的是使用可能的最少量的離液序列高的介質(zhì)而仍能使非交聯(lián)的血纖維蛋白增溶。在一般情況下，要求每1毫升包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物要有大約1.0毫升到大約1.5毫升的離液序列高的介質(zhì)。
該離液序列高的介質(zhì)與這種組合物混合，然后有力地?cái)嚢璐蠹s1到2分鐘，以保證增溶是完全的。
因此，增溶會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生一種包含血纖維蛋白單體的組合物，特別是一種包含血纖維蛋白單體的水溶液。優(yōu)選的是，水溶液中的血纖維蛋白單體濃度不小于大約10毫克/毫升，更優(yōu)選的是大約20毫克/毫升到大約200毫克/毫升，甚優(yōu)選的是大約20毫克/毫升到大約100毫克/毫升，最優(yōu)選的是大約25毫克/毫升到大約50毫克/毫升。
假如固著在載體上的類(lèi)似凝血酶的酶被使用，導(dǎo)致這種酶存在于包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物中，那么在增溶以后，固著的酶能夠從包含血纖維蛋白單體的組合物中除去。利用例如過(guò)濾法，通過(guò)任何可以分離酶的適當(dāng)過(guò)濾器可以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。適當(dāng)?shù)倪^(guò)濾器包括燒結(jié)的聚丙烯20微米孔型、PorexInc的過(guò)濾器、一種特氟隆20-70微米孔型、FlrorotechniquesInc的過(guò)濾器或者22-46微米孔型尼龍66由Costar，Inc制的過(guò)濾器。
為了保證沒(méi)有類(lèi)似凝血酶的酶例如巴特羅酶(batroxobin)存在于包含血纖維蛋白單體的組合物中，另外一種方法是在該系統(tǒng)中使用可溶解的類(lèi)似凝血酶的酶并除去該酶，隨后使氫鍵接的血纖維蛋白聚合物增溶。酶的除去可以利用一種親合力基體例如一種鍵接到惰性載體上的配位體來(lái)實(shí)現(xiàn)，該載體對(duì)類(lèi)似凝血酶的酶具有特殊的親合力，或者一種離子交換或者疏水性相互作用載體，或者更有效地使用抗生物素蛋白-生物素系統(tǒng)。生物素-抗生物素蛋白的相互作用顯示了在自然界所看到最強(qiáng)的非共價(jià)鍵合常數(shù)(KDIS＝10-15摩爾)之一。參閱E.A.Bayer和M.Wilchek文章“生物化學(xué)分析方法”26∶1(1980)。
在這個(gè)過(guò)程中，生物素以共價(jià)鍵方式鍵接到例如巴特羅酶上并且生物素-巴特羅酶共軛物(是可溶解的)直接和血漿反應(yīng)，例如10BU加50毫升血漿，在37℃下反應(yīng)持續(xù)10分鐘。所產(chǎn)生的血纖維蛋白Ⅰ聚合物利用離心法或過(guò)濾法收集，并且又溶解在含有30毫摩爾的氯化鈣的大約4毫升0.2摩爾PH值為4.0的乙酸鈉中。一摩爾過(guò)量的偶聯(lián)到一種惰性載體例如瓊脂糖上的抗生物素蛋白被加到血纖維蛋白Ⅰ溶液中。瓊脂糖抗生物素蛋白生物素-巴特羅酶復(fù)合體然后利用離心法或過(guò)濾法從血纖維蛋白Ⅰ中分離，導(dǎo)致形成一種包含基本上沒(méi)有巴特羅酶的血纖維蛋白單體的組合物，該單體能夠如下所述被再聚合以生成一種血纖維蛋白封閉劑。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，包含血纖維蛋白單體的組合物基本上沒(méi)有類(lèi)似凝血酶的酶?！盎旧蠜](méi)有”意指或者所有的類(lèi)似凝血酶的酶已經(jīng)被除去，或者在該組合物中所剩有的任何類(lèi)似凝血酶的酶所處水準(zhǔn)不足以提供不希望有的藥理效果。因此，本發(fā)明的希望用“基本上沒(méi)有”限定的組合物可以包含類(lèi)似凝血酶的酶的數(shù)量在原有酶的大約0-10%之間，優(yōu)選的是在用于制備血纖維蛋白單體組合物的類(lèi)似凝血酶的酶的0-2%之間。
雖然，這些實(shí)施例介紹的組合物，其中類(lèi)似凝血酶的酶已經(jīng)被除去，接著希望轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄缘难w維蛋白，但是剩有大部分或全部類(lèi)似凝血酶的酶的組合物也可認(rèn)為是有用的，因此是本發(fā)明的一部分。
包含血纖維蛋白單體的組合物現(xiàn)在準(zhǔn)備用作血纖維蛋白封閉劑的一個(gè)成分。人們已經(jīng)觀(guān)察到，當(dāng)這種組合物由全血制備時(shí)，大約60%到大約90%的原有的血纖維蛋白原存在于該組合物中，當(dāng)然是以血纖維蛋白單體的形式。
包含血纖維蛋白單體的組合物在其制備之后可以立即使用。事實(shí)上，當(dāng)該組合物是自體固有的時(shí)候，在其制備以后，立即使用這種組合物是特別優(yōu)選的。假如該組合物在其制備以后未被立即使用，該組合物可以貯藏起來(lái)。組合物的貯藏要求該組合物通過(guò)例如冷凍或冷凍干燥該組合物或使組合物保持在4℃下來(lái)保存?？梢哉J(rèn)為以冷凍或冷凍干燥形式貯藏的組合物在幾個(gè)月的期間內(nèi)是穩(wěn)定的。當(dāng)組合物保持在4℃下，可以認(rèn)為該組合物至少在幾天的期間內(nèi)是穩(wěn)定的。
假如組合物被令凍，在使用時(shí)組合物必須解凍融化。假如組合物被冷凍干燥，那么在使用時(shí)最好該組合物通過(guò)添加與增溶步驟中所用的緩沖劑相同的酸性緩沖劑來(lái)重新構(gòu)成，假如該酸是揮發(fā)性的例如乙酸，或者假如通過(guò)加入蒸餾水來(lái)使用離液序列高的介質(zhì)時(shí)。與在增溶步驟中一樣，在重新構(gòu)成過(guò)程中也應(yīng)該使用最少量的酸性緩沖液或蒸餾水而仍然能夠?qū)е卵w維蛋白單體溶解。實(shí)際上，重新構(gòu)成包含血纖維蛋白單體的被冷凍干燥的組合物能夠?qū)е滦纬傻陌w維蛋白單體的水溶液。其中的這種單體濃度高達(dá)200毫克/毫升。在冷凍干燥之前，一種填充劑例如甘露醇或乳糖可以添加到該組合物中。此外，被冷凍干燥的組合物可以冷凍干燥的形式使用。當(dāng)希望添加輔藥例如抗生素到該組合物中時(shí)，這種形式是特別優(yōu)選的。
包含血纖維蛋白單體的組合物實(shí)際上可以呈任何形式，例如一種溶液、懸浮液、乳膠液或固體，并且呈溶液形式是優(yōu)選的。因此，舉例來(lái)說(shuō)，這樣的組合物可以是液體、凝膠、軟膏或油膏。此外，組合物可以呈“顆粒”形式，例如被冷凍干燥的血纖維蛋白單體，它可以但不是必須的，在使用之前立即處理成為液體、乳膠液或懸浮液。
任何適合的溶劑都可使用以形成溶液，不過(guò)優(yōu)選的是，該溶劑是無(wú)毒的。溶劑的非限定性實(shí)例包括水、乙醇、甘油、丙二醇，其中水是優(yōu)選的。
懸浮液的一個(gè)實(shí)例是，包含血纖維蛋白單體的組合物可以和有機(jī)溶劑例如乙醇混合，最終乙醇濃度超過(guò)3.0摩爾并振搖。血纖維蛋白單體將沉淀并可利用離心法回收。沉淀物應(yīng)當(dāng)用有機(jī)相清洗以除去在增溶步驟中所用的水溶液。單體的血纖維蛋白的乙醇懸浮液然后直接使用到繃帶或其他載體或直接敷到傷口位置。允許有機(jī)相蒸發(fā)。在使用繃帶或其它載體的情況下，懸浮液通過(guò)與施用位置接觸或用某些其它方式再水化，使得血纖維蛋白聚合。
此外，在高揮發(fā)相例如乙醚中制備的血纖維蛋白的有機(jī)懸浮液，可以被霧化并以噴霧懸浮方式輸送到所預(yù)期的位置。最好該揮發(fā)相是不可燃的。這種情況是可能的即血纖維蛋白單體的有機(jī)懸浮體可以通過(guò)噴霧或呼吸輸送到耳、鼻、喉或肺，或者通過(guò)注射輸送到某一流血的食管或胃的損傷部位。
本發(fā)明的血纖維蛋白封閉劑的使用是通過(guò)予期的位置與包含血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物相接觸，并且與所述的接觸步驟同時(shí)，將血纖維蛋白單體轉(zhuǎn)變?yōu)檠w維蛋白聚合物，或?qū)⒎墙宦?lián)的血纖維蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白，以此形成血纖維蛋白凝塊。
對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，“預(yù)期的位置”是指希望形成血纖維蛋白凝塊的位置。預(yù)期的位置是什么和在何處取決于本發(fā)明的血纖維蛋白封閉劑的使用。此外，應(yīng)當(dāng)指出，可以認(rèn)為血纖維蛋白封閉劑不僅能夠用于人體而且還可用于其它哺乳動(dòng)物。此外，假如血纖維蛋白封閉劑的來(lái)源是血液，那么這種情況是優(yōu)選的但不是必需的即該血液得自于相同的物種，血纖維蛋白封閉劑也將是用于該物種的。
本發(fā)明的血纖維蛋白封閉劑能夠使用于各種用途，該用途對(duì)血纖維蛋白封閉劑來(lái)說(shuō)可是已知的或是待開(kāi)發(fā)的。本發(fā)明的各種方法，藥盒或血纖維蛋白封閉劑可以用于連接各組織和器官、止血、愈合傷口、封閉手術(shù)傷口，在血管手術(shù)中的使用包括對(duì)末梢冠狀動(dòng)脈吻合術(shù)的縫合孔出血的止血、左心室縫線(xiàn)、主動(dòng)脈切開(kāi)術(shù)和插管手術(shù)部位、在重新手術(shù)中所見(jiàn)的彌散性心外肌膜出血以及靜脈出血部位(例如前心房、腔靜脈或右心室)的滲血。本發(fā)明還可用于在移植之前滌綸動(dòng)脈移植物的封閉、體外組織的封閉，產(chǎn)生用于細(xì)胞生長(zhǎng)的血纖維蛋白排基、受傷的脾臟(借此拯救該器官)、肝臟和其它薄壁組織的器官的止血;封閉氣管和支氣管吻合和肺的空氣泄漏或劃傷處，封閉支氣管的根部、支氣管的瘺管和食管的瘺管;用于無(wú)縫合治愈術(shù)(“拉鎖”技術(shù))以及在大腦內(nèi)的AVM′S，以及肝臟AVM′S的血管放射中的栓塞，結(jié)腸的血管發(fā)育異常、食管的靜脈曲張、消化系統(tǒng)潰瘍繼發(fā)性的“脈動(dòng)(Pumping)”胃腸易出血者等等。本發(fā)明還可用于角膜移植、鼻出血、扁桃體切除術(shù)后、拔牙和其它應(yīng)用場(chǎng)合的止血。參閱G.F.Gestring和R.Lermer的文章“血管手術(shù)(VascularSurgery)”294-304(1983.9-10)。此外，本發(fā)明的血纖維蛋白封閉劑特別適合于具有血凝缺陷的個(gè)體。
包含血纖維蛋白單體的組合物或包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物的劑量決定于該血纖維蛋白封閉劑的特定用途，不過(guò)，該劑量對(duì)要實(shí)現(xiàn)預(yù)定用途的組合物來(lái)說(shuō)應(yīng)當(dāng)是有效量。一般情況下，對(duì)一種包含血纖維蛋白單體的水溶液組合物來(lái)說(shuō)，可以認(rèn)為這種組合物的大約3毫升到大約5毫升足以成為有效的血纖維蛋白封閉劑。然而，根據(jù)該組合物的用途，劑量范圍可以從大約0.05毫升到大約40毫升。此外，假如包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物以聚合物的形式被使用或該組合物以固體形式使用，那么組合物應(yīng)當(dāng)包含與這種水溶液中的量相同的血纖維蛋白的數(shù)量。
對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，血纖維蛋白單體向血纖維蛋白聚合體的轉(zhuǎn)變或者非交聯(lián)的血纖維蛋白向交聯(lián)的血纖維蛋白的轉(zhuǎn)變與所述的接觸步驟“同時(shí)”意指這種轉(zhuǎn)變步驟和這種接觸步驟發(fā)生在每一步驟的一個(gè)時(shí)間階段內(nèi)，以便在預(yù)期的位置形成血纖維蛋白凝塊。因此，“同時(shí)”可以意指在接觸步驟之后，血纖維蛋白單體被轉(zhuǎn)變?yōu)檠w維蛋白聚合體或非交聯(lián)的血纖維蛋白被轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白。通過(guò)將這種含有血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物施加到預(yù)期位置以后，使其與一種能將血纖維蛋白單體轉(zhuǎn)變?yōu)檠w維蛋白聚合物或?qū)⒎墙宦?lián)的血纖維蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白的組合物接觸來(lái)實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。該轉(zhuǎn)變步驟一般應(yīng)當(dāng)在接觸步驟以后大約0.5分鐘的時(shí)間內(nèi)發(fā)生。此外，包含血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物可以從預(yù)期位置流走，特別是假如非交聯(lián)的血纖維蛋白是一種血纖維蛋白單體時(shí)。
“同時(shí)”還可意指接觸步驟和轉(zhuǎn)變步驟同時(shí)發(fā)生。實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)可通過(guò)用包含血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物與預(yù)期位置相接觸，與之同時(shí)，這種組合物與能夠?qū)⒀w維蛋白單體轉(zhuǎn)變?yōu)檠w維蛋白聚合物或?qū)⒎墙宦?lián)的血纖維蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白的組合物相接觸。
最后，“同時(shí)”優(yōu)選地還能意指轉(zhuǎn)變步驟可以在接觸步驟以前開(kāi)始，雖然不是在接觸步驟之前很遠(yuǎn)，但是所有的血纖維蛋白單體已經(jīng)轉(zhuǎn)變成血纖維蛋白聚合體，或者所有的非交聯(lián)的血纖維蛋白已轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白。此外，所有的血纖維蛋白單體將被轉(zhuǎn)變?yōu)檠w維蛋白聚合體或所有的非交聯(lián)的血纖維蛋白將轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白，這發(fā)生在接觸步驟之前，將導(dǎo)致形成非常劣質(zhì)的血纖維蛋白封閉劑。這個(gè)實(shí)施例的實(shí)現(xiàn)是在接觸步驟之前，將包含血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物與能將血纖維蛋白單體轉(zhuǎn)變?yōu)檠w維蛋白聚合體或能將非交聯(lián)的血纖維蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白的組合物相混合。由于完成轉(zhuǎn)變步驟要占用大約30秒，所以在接觸步驟以前，轉(zhuǎn)變步驟不應(yīng)當(dāng)超過(guò)大約30秒并且最好不超過(guò)3秒。本實(shí)施例是優(yōu)選的，因?yàn)樗ＷC最大數(shù)量的包含血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物將保留在預(yù)期位置并還可形成極好的血纖維蛋白凝塊。
血纖維蛋白單體向血纖維蛋白聚合體的轉(zhuǎn)變或非交聯(lián)的血纖維蛋白向交聯(lián)的血纖維蛋白的轉(zhuǎn)變利用任何已知的或待開(kāi)發(fā)的技術(shù)都能實(shí)現(xiàn)。然而，轉(zhuǎn)變步驟怎樣實(shí)施取決于包含血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物的來(lái)源例如全血或重組體血纖維蛋白原、血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白的形式例如血纖維蛋白Ⅰ或desBB血纖維蛋白以及在較低程度上取決于在使用血纖維蛋白封閉劑的時(shí)候預(yù)期位置是包含病人的血液還是包含其它體液。
另外，假如一種單獨(dú)的組合物，例如一種堿性緩沖劑用(如下所述)于轉(zhuǎn)變步驟，那么本發(fā)明的方法可使用例如一種雙筒注射器來(lái)實(shí)施。該雙筒注射器可以呈丫形，借此使得包含血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物與要在轉(zhuǎn)變步驟中使用的組合物混合，以在接觸之前實(shí)現(xiàn)混合。另外，除了丫形的雙筒注射器之外，一種帶兩個(gè)開(kāi)口的雙筒注射器也可采用。它可使預(yù)期位置的接觸和向血纖維蛋白聚合體或交聯(lián)的血纖維蛋白的轉(zhuǎn)變同時(shí)發(fā)生。此外，雙筒注射器中的組合物可以噴射到預(yù)期位置上。參閱H.B.Kram等人的文章，在“美國(guó)外科(TheAmericanSurgeon)”57∶381(1991)。
假如包含血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物的來(lái)源是血液，那么如上所述，可以認(rèn)為，該組合物將含有足夠的凝血酶原、因子ⅩⅢ和其它必要的物質(zhì)(例如凝血酶原活化劑)，用以將這樣的血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白。假如非交聯(lián)的血纖維蛋白是一種血纖維蛋白聚合物即非交聯(lián)的血纖維蛋白沒(méi)有被增溶，那么非交聯(lián)的血纖維蛋白能夠利用這種組合物的凝血酶原和因子ⅩⅢ的激活轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白以形成交聯(lián)的血纖維蛋白。這種激活可以通過(guò)將該組合物與鈣離子源相接觸而實(shí)現(xiàn)。鈣離子的非限定來(lái)源包括氯化鈣，最好濃度為30毫摩爾。此外，略欠優(yōu)選的是，鈣離子由預(yù)期位置上的血液來(lái)提供。
假如非交聯(lián)的血纖維蛋白已經(jīng)被增溶即是一種血纖維蛋白單體，那么，血纖維蛋白單體怎樣被轉(zhuǎn)變成交聯(lián)的血纖維蛋白取決于增溶是怎樣實(shí)現(xiàn)的。假如非交聯(lián)的血纖維蛋白利用酸性緩沖劑增溶，那么交聯(lián)的血纖維蛋白可以通過(guò)提高包含血纖維蛋白單體的組合物的PH值來(lái)實(shí)現(xiàn)，以便血纖維蛋白單體能夠聚合。實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)可以通過(guò)將這樣的組合物與任何適當(dāng)?shù)膲A性緩沖劑相接觸。適合的堿性緩沖劑的非限定實(shí)例包括HEPES、NaOH、KOH、Ca(OH)2碳酸氫鹽沖劑例如碳酸氫鈉和碳酸氫鉀、檸檬酸三金屬鹽、乙酸鹽和硫酸鹽。優(yōu)選的堿性緩沖劑包括0.5-0.75摩爾碳酸鈉/碳酸氫鹽，PH值10-10.5;0.5-0.75摩爾碳酸氫鈉/NaOH，PH值10.0;1.5摩爾甘氨酸/NaOH，PH值10.0;0.5-1.0摩爾雙羥乙基氨基乙烷磺酸(BES)，PH值7.5;1摩爾羥乙基哌嗪丙烷磺酸(EPPS)，PH值8.5;0.5摩爾麥黃酮，PH值8.5;1摩爾嗎啉代丙烷磺酸(MOPS)，PH值8.0;1摩爾三羥甲基氨基乙烷磺酸(TES)，PH值8.0以及0.5摩爾環(huán)乙基氨基乙烷磺酸(CHES)，PH值10.0;并且0.5-0.75摩爾碳酸鈉/碳酸氫鹽，PH值10-10.5;0.5-1摩爾雙羥乙基氨基乙烷磺酸(BES)，PH值7.5;1摩爾羥乙基哌嗪丙烷磺酸(EPPS)，PH值8.5以及1摩爾三羥甲基氨基乙烷磺酸(TES)，PH值8.0是最優(yōu)選的。
所使用的堿性緩沖劑的數(shù)量應(yīng)當(dāng)足以聚合非交聯(lián)的血纖維蛋白。優(yōu)選的是大約10份到大約1份包含血纖維蛋白單體的組合物與大約1份堿性緩沖劑相混合。優(yōu)選的是該比例大約為9∶1。應(yīng)當(dāng)指出，優(yōu)選的比例取決于所選擇的緩沖劑和所希望的血纖維蛋白聚合物的“強(qiáng)度”。當(dāng)然，所希望的血纖維蛋白聚合物的強(qiáng)度取決于該血纖維蛋白封閉劑的最終用途。
假如增溶是利用離液序列高的介質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)，那么血纖維蛋白單體可以通過(guò)稀釋包含血纖維蛋白單體的組合物例如用蒸餾水稀釋來(lái)轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白。稀釋?xiě)?yīng)當(dāng)這樣進(jìn)行以使用最少量的稀釋劑。一般情況下，在稀釋之后，所形成的離液序列高的介質(zhì)的濃度應(yīng)當(dāng)為大約0.5到大約1摩爾。
除了提高PH值或稀釋包含血纖維蛋白單體的組合物的離液序列高的介質(zhì)以外，優(yōu)選的是，這樣的組合物凝血酶原和因子ⅩⅢ要被激活以形成交聯(lián)的血纖維蛋白。通過(guò)使組合物與鈣離子源接觸可以實(shí)現(xiàn)這種激活。鈣離子源可以是在增溶步驟中所使用的堿性緩沖劑的一部分或者為酸性緩沖劑的一部分。鈣離子的非限定來(lái)源包括氯化鈣、優(yōu)選濃度為3毫摩爾。此外，略欠優(yōu)選的是預(yù)期位置的血液可以提供鈣離子源。
應(yīng)當(dāng)指出，假如堿性緩沖劑是碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖劑，那么鈣離子源在增溶步驟過(guò)程中必須添加到酸性緩沖劑中。這是由于氯化鈣在碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖劑中是不溶解的。優(yōu)選的是，鈣離子在酸性緩沖液中的濃度是從大約5毫摩爾到大約150毫摩爾，更優(yōu)選的是從大約5毫摩爾到大約50毫摩爾。
可以認(rèn)為，最終形成的血纖維蛋白凝塊將是交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅱ，而不必考慮存在的是哪一種形式的非交聯(lián)的血纖維蛋白，即是血纖維蛋白單體還是血纖維蛋白聚合物。然而，假如非交聯(lián)的血纖維蛋白的形式是desBB血纖維蛋白，那么可以認(rèn)為，還可能需要加入一種額外的凝血酶源以便將desBB血纖維蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白。這種凝血酶源例如可以是來(lái)自病人的血漿，其中這種血漿被加到包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物中。
假如預(yù)期位置含血并且使用包含血纖維蛋白單體的組合物，即非交聯(lián)的血纖維蛋白已被增溶，那么該血液可以用作離液序列高的介質(zhì)的稀釋劑或者用來(lái)提高包含血纖維蛋白單體的組合物的PH值。因此，不需要使用稀釋劑或堿性緩沖劑。在該實(shí)施例中，優(yōu)選的是，鈣離子源被包含在增溶步驟中所使用的酸性緩沖劑或離液序列高的介質(zhì)之中。此外，在該實(shí)施例中，包含血纖維蛋白單體的組合物可以放在將與預(yù)期位置接觸的固體載體上，例如繃帶、縫合線(xiàn)、假肢或敷料上。這種載體然后放在與預(yù)期位置接觸的部位上直到例如血纖維蛋白凝塊的形成。
然而應(yīng)當(dāng)指出，假如包含血纖維蛋白單體的組合物不含有足夠的凝血酶原和因子ⅩⅢ以形成交聯(lián)的血纖維蛋白，那么這種組合物還是可以用作血纖維蛋白封閉劑，因?yàn)檠w維蛋白單體本身的聚合對(duì)形成血纖維蛋白凝塊是有用的。此外，這種組合物通過(guò)添加鈣離子源和活性因子ⅩⅢ(或者活性因子ⅩⅢ的前體)以及可供選擇的凝血酶仍然可用來(lái)形成交聯(lián)的血纖維蛋白。這樣的鈣離子源，活性因子ⅩⅢ和凝血酶可以添加到包含血纖維蛋白單體的組合物中?；钚砸蜃英罂梢员惶砑拥桨w維蛋白單體的組合物中，最終濃度為每毫升包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物中含有大約1.0到大約20單位的因子ⅩⅢ。此外，因子ⅩⅢ可以由預(yù)期位置的血液或體液供給或者通過(guò)添加自體固有的血漿到包含血纖維蛋白單體的組合物中而得到。鈣離子的非限定來(lái)源包括氯化鈣，優(yōu)選濃度為30毫摩爾。此外，略欠優(yōu)選的是，鈣離子可以由預(yù)期位置的血液或體液來(lái)提供。每毫升包含血纖維蛋白單體的組合物可以添加大約4單位到大約500單位的凝血酶或者凝血酶可以由預(yù)期位置提供。
假如，包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物的來(lái)源是分泌血纖維蛋白原或重組體血纖維蛋白原的細(xì)胞培養(yǎng)物，以及非交聯(lián)的血纖維蛋白是一種血纖維蛋白聚合物即該非交聯(lián)的血纖維蛋白沒(méi)有被增溶，那么鈣離子源和活性因子ⅩⅢ(或因子ⅩⅢ的前體)必須使用以形成交聯(lián)的血纖維蛋白因子ⅩⅢ必須使用是因?yàn)檫@些非交聯(lián)的血纖維蛋白的來(lái)源不包含任何因子ⅩⅢ?；钚砸蜃英罂商砑拥桨墙宦?lián)的血纖維蛋白的組合物中，最終濃度為每毫升包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物中有大約1.0到大約20單位的因子ⅩⅢ。此外，因子ⅩⅢ可以由預(yù)期位置的血液或體液提供或者通過(guò)將自體固有的血漿添加到包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物中而得到。鈣離子的非限定來(lái)源包括氯化鈣，優(yōu)選濃度為30毫摩爾。此外，略欠優(yōu)選的是，鈣離子可以由預(yù)期位置的血液或體液來(lái)提供。另外，作為一種選擇，為了保證形成交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅱ，可以將凝血酶添加到這種組合物中，每毫升包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物可以添加大約4單位到大約500單位的凝血酶，或者凝血酶可以由預(yù)期位置提供。
假如非交聯(lián)的血纖維蛋白已經(jīng)被增溶即是一種血纖維蛋白單體，該血纖維蛋白單體怎樣轉(zhuǎn)變成血纖維蛋白聚合體取決于增溶是怎樣實(shí)現(xiàn)的，即用酸性緩沖劑還是用離液序列高的介質(zhì)。血纖維蛋白聚合物的形成可以使用與上述相同的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。假如希望的話(huà)，可以通過(guò)添加鈣離子源和因子ⅩⅢ(或活性因子ⅩⅢ的前體)以及如上所述可供選擇地將凝血酶加到包含血纖維蛋白單體的組合物中，使這種血纖維蛋白聚合物轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白。活性因子ⅩⅢ可以加到包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物中，最終濃度是每毫升包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物中有大約1.0到大約20單位的因子ⅩⅢ。此外，因子ⅩⅢ可以由預(yù)期位置的血液或體液來(lái)提供，或者利用添加自體固有的血漿到包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物中來(lái)得到。鈣離子的非限定來(lái)源包括氯化鈣，優(yōu)選濃度為30毫摩爾。此外，略欠優(yōu)選的是，鈣離子可以由預(yù)期位置的血液或體液來(lái)提供。每毫升包含血纖維蛋白單體的組合物可以添加大約4單位到大約500單位的凝血酶，或者凝血酶由預(yù)期位置提供。
本發(fā)明的血纖維蛋白封閉劑還可以包含輔藥，例如抗生素如慶大酶素、頭孢噻肟、nebacetin和西索米星、組胺H2-對(duì)抗劑如雷尼替丁以及抗癌藥如OK-432。通過(guò)添加所希望的抗生素到包含血纖維蛋白單體或非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物中可以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。參閱M.C.HGersdorff和T.A.J.Robillard的文章在“喉鏡(Larygoscope)”951278-80(1985);A.Ederle等人的文章在意大利雜志“腸胃病學(xué)”(Ital.J.Gastroenterol)23354-56(1991);V.Ronfard等人文章在“燒傷”(Burns)17181-84(1991);T.Sakurai等人文章在J.ControlRelease1839-43(1992);T.Monden等人文章在“癌癥”69636-42(1992);F.Greco文章在“生化材料研究雜志”25∶39-51(1991)以及H.B.Kram等人文章在“外科研究雜志”50∶175-178(1991)，這些文章的內(nèi)容結(jié)合本案可供參考。其它輔藥例如纖維結(jié)合素、溶解原纖維的抑制劑如抑肽酶、α-2抗血漿素、PAI-1、PAI-2.6-氨基已酸、4-氨甲基環(huán)己酸、膠原蛋白或角質(zhì)化細(xì)胞也可被加入?？梢哉J(rèn)為這種輔藥的劑量是與在常規(guī)血纖維蛋白封閉劑中所使用的劑量相同。
本發(fā)明還提供了血纖維蛋白封閉劑藥盒。這種藥盒的第一成分是包含血纖維蛋白單體的組合物以及第二成分是能夠聚合血纖維蛋白單體的堿性緩沖劑還是蒸餾水取決于增溶步驟是怎樣進(jìn)行的。第二成分可選擇性地包含一個(gè)鈣離子源。此外，第一成分可是包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物而第二成分可以是鈣離子源。假如用于制備包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物的血纖維蛋白原的來(lái)源是來(lái)自分泌血纖維蛋白原和重組體血纖維蛋白原的細(xì)胞培養(yǎng)物，那么第一成分可以是包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物，第二成分可以是鈣離子源以及第三成分是活性因子ⅩⅢ。
5.1由全血制備血漿將全血(100毫升)匯集到商業(yè)上可得到的、裝有抗凝劑例如檸檬酸/磷酸/葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)血袋中，在室溫下以3000克/10分鐘離心。干凈的上清液血漿(大約50毫升)被輕輕倒出，細(xì)胞組分被棄掉。
由全血制備血漿的另一種方法是利用過(guò)濾法。還將100毫升全血匯集到裝有適當(dāng)?shù)目鼓齽├鐧幟仕?磷酸/葡萄糖的袋中。然后利用螺旋泵使血液通過(guò)具有良好的蛋白透過(guò)性的過(guò)濾器進(jìn)行再循環(huán)。通過(guò)薄膜的壓力降迫使血漿通過(guò)，細(xì)胞組分殘存在再循環(huán)血液中。匯集血漿(50毫升)以便進(jìn)一步處理。
5.2巴特羅酶固著在珠狀的瓊脂糖上珠狀的瓊脂糖<藥劑(Pharmacia)>用在固定研究之中，所用瓊脂糖是4%交聯(lián)的，45-165微米(顆粒的90%)。當(dāng)水合時(shí)，這種材料體積膨脹5倍。巴特羅酶在一復(fù)蓋的閃爍瓶中在室溫下，首先用0.1摩爾高碘酸鈉進(jìn)行氧化。巴特羅酶通過(guò)一個(gè)葡萄糖凝膠PD-10凝膠滲透柱而被純化。被氧化的巴特羅酶然后被連接到一個(gè)酰肼活化的瓊脂糖凝膠上，在含有50毫摩爾、PH值5.5的乙酸鈉和10毫摩爾氫硼化鈉(每1.75克濕凝膠含有30-200單位)的條件下，在室溫下過(guò)夜。通過(guò)清洗，非鍵接的反應(yīng)物被從凝膠中除去，使用的清洗劑是50毫升毫摩爾、PH值5.5的乙酸鈉;100毫升50毫摩爾甘氨酸/1摩爾氯化鈉、PH值3.0;100毫升50毫摩爾碳酸鈉/1摩爾氯化鈉、PH值10.0;100毫升50毫摩爾磷酸鈉/1摩爾氯化鈉、PH值7.0;100毫升水、100毫升50毫摩爾磷酸鈉/1摩爾氯化鈉、PH值7.0;100毫升50毫摩爾PH值7.0的磷酸鈉。
5.3被固著的酶與血漿血纖維蛋白原反應(yīng)形成一種包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物。
被固著的酶(350毫克)加到大約50毫升的被離心或過(guò)濾的血漿中并平緩地混合7到20分鐘，直到非交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅰ聚合物凝塊形成。
然后匯集血纖維蛋白Ⅰ聚合物和所結(jié)合的固著的酶，或利用a)按3000克持續(xù)10分鐘離心分離，接著通過(guò)輕輕倒出除去上清液血清，或利用b)過(guò)濾分離，通過(guò)一個(gè)適當(dāng)?shù)牡偷鞍捉Y(jié)合性過(guò)濾器，接著棄掉被過(guò)濾的血清并保留血纖維蛋白Ⅰ聚合物和固著的酶，以便進(jìn)一步處理。這種血纖維蛋白Ⅰ聚合物是包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物的一個(gè)實(shí)施例。
5.4血纖維蛋白Ⅰ聚合物的增溶以形成血纖維蛋白單體血纖維蛋白Ⅰ聚合物的增溶的實(shí)現(xiàn)是通過(guò)添加含有30毫摩爾的氯化鈣緩沖劑的大約1-4毫升0.2摩爾、PH值4.0的乙酸鈉，用以收集血纖維蛋白Ⅰ聚合物和被固著的酶。接著有力地?cái)嚢柽@個(gè)試樣，例如在一個(gè)旋轉(zhuǎn)混合器上持續(xù)2分鐘。然后通過(guò)過(guò)濾，使血纖維蛋白Ⅰ溶液通過(guò)一個(gè)1到20微米的低蛋白結(jié)合性的過(guò)濾器，可以除去固著的酶。瓊脂糖酶將被過(guò)濾器所保留，因此使得它從該系統(tǒng)中除去。所剩的溶液、一種包含血纖維蛋白Ⅰ單體的組合物，由一種濃縮的血纖維蛋白Ⅰ單體溶液組成，該溶液與其它血漿蛋白相結(jié)合。在一般情況下，大約100毫升全血導(dǎo)致形成大約4毫升或5毫升的包含血纖維蛋白單體的組合物，其中血纖維蛋白單體的濃度是大約25毫克/毫升到大約35毫克/毫升?，F(xiàn)在，這種藥劑準(zhǔn)備交付病人使用或者是單獨(dú)的或者與重新聚合的緩沖劑一起共同擠壓以形成一種血纖維蛋白封閉劑。
5.5包含血纖維蛋白Ⅰ單體的組合物的重新聚合通過(guò)同時(shí)將9份包含血纖維蛋白Ⅰ單體的溶液與1份適當(dāng)?shù)闹匦戮酆系木彌_劑例如0.75摩爾碳酸鈉/碳酸氫鈉、PH值10.0相混合實(shí)現(xiàn)重新聚合?；旌系谋壤梢愿淖?然而，9∶1的比例使血纖維蛋白在最終制品中具有高濃度。在共同擠壓時(shí)，血纖維蛋白Ⅰ自發(fā)地重新聚合并轉(zhuǎn)變成血纖維蛋白Ⅱ，接著在大約30分鐘時(shí)間內(nèi)血纖維蛋白進(jìn)行交聯(lián)。
本發(fā)明并不局限于所述特定實(shí)施例的范圍，它試圖對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面做單一介紹。的確，由上述介紹對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，除了本文所表示和敘述的那些內(nèi)容以外對(duì)本發(fā)明所做的各種變型將是顯而易見(jiàn)的。這些變型都在所提出的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
5.6瓊脂糖的酰肼活化以及與酶的碳水化合物部分的偶聯(lián)為了使巴特羅酶的碳水化合物部分與酰肼活化的載體起反應(yīng)，糖必須首先被氧化以提供游離的-CHO基。這一反應(yīng)如下所述。
巴特羅酶1-7毫升溶解在2毫升水和0.2毫升0.1摩爾高碘酸鈉中。該混合物在室溫下保溫1小時(shí)，然后在一葡萄糖凝膠G-25凝膠過(guò)濾柱上脫鹽。該被氧化的活性巴特羅酶用0.9%W/V的氯化鈉從柱中洗脫出來(lái)。
商業(yè)上可得的常規(guī)酰肼活化的瓊脂糖(Bio-radLaboratoriesLtdUK)或者任何末端帶有游離氨基的基團(tuán)都可以使用以便直接偶聯(lián)游離的醛基(-CHO)。假如使用酰肼-瓊脂糖，那么偶聯(lián)過(guò)程如下所述。
1-5克酰肼-瓊脂糖凝膠懸浮在4毫升50毫摩爾、PH值5.5的乙酸鈉中。預(yù)期數(shù)量的被氧化的巴特羅酶(一般情況每克濕凝膠含有100-200BU的該酶)和1毫升10毫摩爾氫硼化鈣一起被添加到該懸浮液中。
試樣被混合，在室溫下過(guò)夜并且隨后在一個(gè)繞結(jié)的玻璃漏斗上用下列溶液依次清洗50毫升50毫摩爾PH值5.5的乙酸鈉;100毫升50毫摩爾甘氨酸/1摩爾氯化鈉，PH值3.0;100毫升50毫摩爾碳酸鈉/1摩爾氯化鈉，PH值10.0;100毫升50毫摩爾磷酸鈉/1摩爾氯化鈉，PH值7.0;100毫升水和100毫升50毫摩爾磷酸鈉/1摩爾氯化鈉，PH值7.0以及最后是100毫升50毫摩爾磷酸鈉，PH值7.0。
被固著的巴特羅酶與血漿反應(yīng)的方法如下所述。
通過(guò)加入乙酸使血漿(50毫升)的PH值降到5.5。將等量的100-200BU的被固著到大約1.75克(濕凝膠重)的瓊脂糖上的巴特羅酶添加到血漿中。血漿在37℃下保溫10-15分鐘，隨后通過(guò)加入氫氧化鈉使其PH值增到7.4。血纖維蛋白Ⅰ的聚合幾乎立即發(fā)生。血纖維蛋白Ⅰ聚合物利用離心法(以3500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘)收集并重新溶解在含有30毫摩爾氯化鈣的3-4毫升0.2摩爾PH值4.0的乙酸鈉中。然后通過(guò)離心法或過(guò)濾法可以將瓊脂糖-酶從血纖維蛋白Ⅰ中分離出來(lái)。血纖維蛋白Ⅰ然后重新聚合以形成血纖維蛋白封閉劑，這是通過(guò)將9份血纖維蛋白Ⅰ溶液加到1份0.75摩爾碳酸鈉/碳酸氫鈉、PH值10.0中而實(shí)現(xiàn)的。
5.7利用生物素-抗生物素蛋白的酶俘獲系統(tǒng)酶俘獲的實(shí)現(xiàn)是通過(guò)首先使巴特羅酶生物素化以及用固著的抗生物素蛋白(抗生物素蛋白偶聯(lián)到6%交聯(lián)的瓊脂糖上)俘獲生物素-酶。
使用一定量的試劑可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的生物素化。在該例中，使用N-羥基丁二酰胺-生物素(不溶于水的)(商業(yè)上可由Amersham購(gòu)得)。NHS-生物素(50微升)添加到1毫克PH值為8.6的巴特羅酶中并且溶液在室溫下保溫1小時(shí)。過(guò)量的生物素化試劑的除去是通過(guò)在SephadexG-25柱上利用凝膠過(guò)濾實(shí)現(xiàn)的并且以0.1摩爾PH7.5的磷酸鉀作為洗脫劑。
將等量的10BU(生物素-巴特羅酶)添加到50毫升血漿中并在37℃下保溫10分鐘。血纖維蛋白Ⅰ聚合物的收集是利用離心法(3500轉(zhuǎn)/分鐘，持續(xù)10分鐘)并且重新溶解在含有30毫摩爾氯化鈣的3-4毫升PH值為4.0的乙酸鈉中。按照每毫升血纖維蛋白Ⅰ含0.2克(濕凝膠)的方式，將抗生物素蛋白-瓊脂糖(商業(yè)上可由SigmaChemicalCO購(gòu)到)添加到血纖維蛋白Ⅰ中。將樣品在室溫下保溫10分鐘并以2000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心10分鐘。所產(chǎn)生的血纖維蛋白Ⅰ基本上從巴特羅酶中游離出來(lái)。如在實(shí)例5.6.中所描述的來(lái)實(shí)現(xiàn)血纖維蛋白的重新聚合以形成血纖維蛋白封閉劑。
權(quán)利要求
1.一種使用血纖維蛋白封閉劑的方法，其包括(a)用包含血纖維蛋白單體的組合物接觸一預(yù)期位置；以及(b)與所述接觸步驟同時(shí)，將所述血纖維蛋白單體轉(zhuǎn)變?yōu)檠w維蛋白聚合物，以此形成所述的血纖維蛋白封閉劑。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的血纖維蛋白單體是從由非交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅰ、desBB血纖維蛋白和非交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅱ構(gòu)成的組合中選擇的。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的血纖維蛋白單體是血纖維蛋白Ⅰ。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的血纖維蛋白聚合物是血纖維蛋白Ⅱ聚合物。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的血纖維蛋白聚合物是交聯(lián)的。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的組合物基本上不含有類(lèi)似凝血酶的酶。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的組合物是由以血液、細(xì)胞培養(yǎng)物組成的組合中所選擇的來(lái)源而形成的，該細(xì)胞培養(yǎng)物分泌血纖維蛋白和重組體血纖維蛋白原。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的來(lái)源是血液。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的組合物進(jìn)一步包括凝血酶原、凝血酶原的激活劑以及因子ⅩⅢ。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的血液是自體固有的血液。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)變步驟利用堿性緩沖劑或蒸餾水而實(shí)現(xiàn)。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的堿性緩沖劑或蒸餾水進(jìn)一步包含鈣離子源。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的堿性緩沖劑是從由氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、碳酸氫鹽緩沖劑、檸檬酸的三金屬鹽、乙酸鹽和硫酸鹽構(gòu)成的組合中選擇的。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的堿性緩沖劑是從一個(gè)組合中選擇的，該組合的組成是0.5-0.75摩爾碳酸鈉/碳酸氫鹽，PH值10-10.5;0.5-0.75摩爾碳酸氫鈉/NaOH，PH值10.0;1.5摩爾甘氨酸/NaOH，PH值10.0;0.5-1.0摩爾雙羥乙基氨基乙烷磺酸(BES)，PH值7.5;1摩爾羥乙基哌嗪丙烷磺酸(EPPS)，PH值8.5;0.5摩爾麥黃酮，PH值8.5;1摩爾嗎啉代丙烷磺酸(MOPS)，PH值8.0;1摩爾三羥甲基氨基乙烷磺酸(TES)，PH值8.0和0.5摩爾環(huán)己基氨基乙烷磺酸(CHES)，PH值10.0。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的堿性緩沖劑是從一個(gè)組合中選擇的，該組合物的組成是0.5-0.75摩爾碳酸鈉/碳酸氫鹽，PH值10-10.5;0.5-1.0摩爾雙羥乙基氨基乙烷磺酸(BES)，PH值7.5;1摩爾羥乙基哌嗪丙烷磺酸(EPPS)，PH值8.5以及1摩爾三羥甲基氨基乙烷磺酸(TES)，PH值8.0。
16.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的接觸步驟的實(shí)施借助于一個(gè)雙筒注射器，其中一個(gè)筒裝有所述的組合物，另一個(gè)筒裝有所述的堿性緩沖劑或蒸餾水。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的組合物是一含水的組合物并且其PH值為從大約1到大約5，或者包含一種離液序列高的介質(zhì)。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的組合物進(jìn)一步包含一種從一組合中選擇的酸性緩沖劑，該組合的組成是乙酸、琥珀酸、乙四醇醛酸、磺基丙氨酸、巴豆酸、甲叉丁二酸、谷氨酸、甲酸、天冬氨酸、己二酸以及它們的鹽類(lèi)。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的酸性緩沖劑是從一組合中選擇的，該組合的組成是琥珀酸、天冬氨酸、己二酸以及乙酸鹽。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的酸性緩沖劑是乙酸鈉。
21.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的酸性緩沖劑的濃度從大約0.02摩爾到大約1摩爾。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的濃度從大約0.1摩爾到大約0.3摩爾。
23.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的離液序列高的介質(zhì)是從一組合中選擇的，該組合的組成是尿素、溴化鈉、鹽酸胍、KCNS、碘化鉀和溴化鉀。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的離液序列高的介質(zhì)的濃度從大約0.2摩爾到大約6.0摩爾。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的濃度從大約3.5摩爾到大約5.0摩爾。
26.如權(quán)利要求17所述的方法，其中在所述水溶液中的血纖維蛋白單體的濃度從大約10毫克/毫升到大約200毫克/毫升。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述的濃度從大約20毫克/毫升到大約100毫克/毫升。
28.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的含水的組合物進(jìn)一步包含鈣離子源。
29.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的預(yù)期位置是在哺乳動(dòng)物身上。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物是人。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中的預(yù)期位置是從一組合中選擇的，該組合的組成是皮膚、血循環(huán)系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)、肺部系統(tǒng)、耳、鼻、喉、眼、肝、脾、頭顱、脊髓、頜-面部、骨骼、腱、胰、生殖-泌尿系統(tǒng)和消化系統(tǒng)。
32.一種由血纖維蛋白原制備包含血纖維蛋白單體的組合物的方法，包括(a)將包含血纖維蛋白原的組合物與類(lèi)似凝血酶的酶相接觸，以將所述血纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成一種非交聯(lián)的血纖維蛋白聚合物;(b)將所述非交聯(lián)的血纖維蛋白聚合物與所述的包含血纖維蛋白原的組合物分離;以及(c)使所述的非交聯(lián)的血纖維蛋白聚合物增溶，以形成一種包含血纖維蛋白單體的組合物。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的類(lèi)似凝血酶的酶固著在一載體上，并且所述的接觸步驟導(dǎo)致所述的類(lèi)似凝血酶的酶與所述的非交聯(lián)的血纖維蛋白聚合物相連，并且進(jìn)一步包括將所述的類(lèi)似凝血酶的酶與所述的包含血纖維蛋白單體的組合物相分離。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述的載體是從一組合中選擇的，該組合的組成是纖維素、多葡聚糖、瓊脂糖、聚苯乙烯、硅石、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、玻璃珠、聚碳酸酯、膠原、纖維素衍生物、聚四氟乙烯以及它們的組合物。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述的載體是從以瓊脂糖和硅石組成的組合中選擇的。
36.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的類(lèi)似凝血酶的酶固著在過(guò)濾器上或所述的類(lèi)似凝血酶的酶固著在一載體上并且在過(guò)濾器的一側(cè)上以及在所述的接觸步驟之后，所生成的血纖維蛋白單體通過(guò)所述過(guò)濾器。
37.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的增溶步驟的實(shí)施是利用PH值小于5的酸性緩沖液或一種離液序列高的介質(zhì)。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述的酸性緩沖液是從一組合中選擇的，該組合的組成是乙酸、琥珀酸、乙四醇醛酸、磺基丙氨酸、巴豆酸、甲叉丁二酸、谷氨酸、甲酸、天冬氨酸、己二酸以及它們的鹽類(lèi)。
39.如權(quán)利要求37所述的方法，其中的酸性緩沖液或離液序列高的介質(zhì)進(jìn)一步包含鈣離子源。
40.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的分離步驟通過(guò)過(guò)濾法實(shí)施。
41.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的類(lèi)似凝血酶的酶能夠?qū)⒀w維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)檠w維蛋白Ⅰ。
42.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的類(lèi)似凝血酶的酶是從以安克洛酶(Ancrod)和巴特羅酶(Batroxobin)組成的組合中選擇的。
43.如權(quán)利要求32所述的方法，其進(jìn)一步包括通過(guò)使所述的類(lèi)似凝血酶的酶生物素以及將包含血纖維蛋白單體的組合物與固著的抗生物素蛋白相接觸使所述的類(lèi)似凝血酶的酶從所述的包含血纖維蛋白單體的組合物中除去，以此使所述類(lèi)似凝血酶的酶從所述包含血纖維蛋白單體的組合物中除去。
44.一種使用血纖維蛋白封閉劑的方法，包括(a)使包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物與預(yù)期的位置接觸;以及(b)與所述的接觸步驟同時(shí)，將所述的非交聯(lián)的血纖維蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)的血纖維蛋白。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的非交聯(lián)的血纖維蛋白是從一組合中選擇的，該組合的組成是非交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅰ、desBB血纖維蛋白和非交聯(lián)的血纖維蛋白Ⅱ。
46.如權(quán)利要求45的所述的方法，其中所述的非交聯(lián)的血纖維蛋白是血纖維蛋白Ⅰ。
47.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的組合物由血液、分泌血纖維蛋白原或重組體血纖維蛋白原的細(xì)胞培養(yǎng)物形成。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其中所述的血液是自體固有的血液。
49.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)變步驟的實(shí)施是通過(guò)使所述的組合物與鈣離子源相接觸來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
50.一種包含非交聯(lián)的血纖維蛋白單體的含水組合物，其中所述的血纖維蛋白單體的濃度為從大約10毫克/毫升到大約200毫克/毫升并且所述的組合物的ph值從大約1到大約5。
51.如權(quán)利要求50所述的含水組合物，其中所述的濃度為從大約20毫克/毫升到大約100毫克/毫升。
52.如權(quán)利要求50所述的含水組合物，其中所述的血纖維蛋白單體是從一組合中選擇的，該組合的組成是血纖維蛋白ⅠdesBB血纖維蛋白和血纖維蛋白Ⅱ。
53.如權(quán)利要求52所述的含水組合物，其中所述的血纖維蛋白單體是血纖維蛋白Ⅰ。
54.一種包含血纖維蛋白單體的含水組合物，其中所述的血纖維蛋白單體的濃度為從大約20毫克/毫升到大約200毫克/毫升。
55.如權(quán)利要求54所述的含水組合物，其中所述的濃度為從大約20毫克/毫升到大約100毫克/毫升。
56.如權(quán)利要求54所述的含水組合物，其中所述的血纖維蛋白單體是從一組合中選擇的，該組合的組成是血纖維蛋白Ⅰ、desBB血纖維蛋白和血纖維蛋白Ⅱ。
57.如權(quán)利要求56所述的含水組合物，其中所述的血纖維蛋白單體是血纖維蛋白Ⅰ。
58.一種含水的組合物，包括(a)血纖維蛋白單體;以及(b)鈣離子源其中所述鈣離子的濃度為從大約5毫摩爾到大約200毫摩爾。
59.一種包含血纖維蛋白單體的組合物，其中所述的組合物呈固體形式。
60.如權(quán)利要求59所述的組合物，其中所述組合物是通過(guò)將包含血纖維蛋白單體的水溶液凍干而形成的。
61.一種包含血纖維蛋白單體的組合物和一種從一組合中選擇的化合物，該組合的組成是抗生素、組氨H2對(duì)抗劑、一種抗癌藥、纖維結(jié)合素和溶解原纖維抑制劑。
62.一種藥盒，包括(a)包含血纖維蛋白單體的組合物;以及(b)從以堿性緩沖劑和蒸餾水組成的組合中選擇的組合物。
63.如權(quán)利要求62所述的藥盒，其中所述的堿性緩沖劑或所述的蒸餾水進(jìn)一步包含鈣離子源。
64.一種藥盒，包括(a)一包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物;以及(b)一包含鈣離子源的組合物。
65.如權(quán)利要求64所述的藥盒，其進(jìn)一步包含活性因子ⅩⅢ。
66.一種固體載體，在其表面上具有一種包含血纖維蛋白單體的組合物。
67.如權(quán)利要求66所述的固體載體，其中所述的固體載體是從一組合中選擇的，該組合的組成是繃帶、縫線(xiàn)、假肢和敷料。
68.如權(quán)利要求66所述的固體載體，其中所述的單體是從一組合中選擇的，該組合的組成是血纖維蛋白Ⅰ、desBB血纖維蛋白和血纖維蛋Ⅱ。
69.如權(quán)利要求68所述的固體載體，其中所述的單體是血纖維蛋白Ⅰ。
70.如權(quán)利要求66所述的固體載體，其中所述的組合物為固體形式。
71.如權(quán)利要求70所述的固體載體，其中所述的組合物的形成是通過(guò)將包含血纖維蛋白單體的水溶液凍干。
全文摘要
本發(fā)明涉及血纖維蛋白封閉劑，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種血纖維蛋白封閉劑的應(yīng)用，其中一種包含血纖維蛋白單體的組合物或一種包含非交聯(lián)的血纖維蛋白的組合物作為該血纖維蛋白封閉劑的成分。
文檔編號(hào)A61K38/39GK1091315SQ93114438
公開(kāi)日1994年8月31日 申請(qǐng)日期1993年9月30日 優(yōu)先權(quán)日1992年10月8日
發(fā)明者P·A·D·愛(ài)德華森, J·E·費(fèi)爾布拉達(dá), R·S·加德納, D·A·霍林斯比, S·A·塞達(dá)霍爾姆-威廉斯 申請(qǐng)人:E·R·斯奎布父子公司