專利名稱：治療組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療組合物，更具體地說，涉及一種需要使用人干擾素的組合療法。
動(dòng)物對病毒感染的第一個(gè)也是局部化的反應(yīng)，是產(chǎn)生淋巴因子干擾素。干擾素原來被認(rèn)為是一種單一分子，現(xiàn)在則被公認(rèn)是在進(jìn)化上古老的、廣泛分布于動(dòng)物界的一大蛋白家族。干擾素一般具有種屬特異性，但也會有一些有限的交叉反應(yīng)?，F(xiàn)已鑒定了三種類型的干擾素，這三種類型原來分別稱為白細(xì)胞干擾素、成纖維細(xì)胞干擾素和免疫干擾素，現(xiàn)在則分別定名為干擾素α、β和γ。
人干擾素-α可以由許多不同類型的細(xì)胞產(chǎn)生，HPLC將該類型的干擾素分辨出30多個(gè)亞型，每個(gè)亞型都由不同的基因編碼。通常認(rèn)為人干擾素-β是單一物質(zhì)，是由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的。人干擾素-γ也是單一物質(zhì)，由輔助細(xì)胞誘導(dǎo)亞組的T淋巴細(xì)胞在接觸抗原時(shí)產(chǎn)生，或者由于人白血細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞或T淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞與促有絲分裂劑接觸而產(chǎn)生。
大量生產(chǎn)人干擾素-α的方法是用仙臺病毒刺激Namalwa人淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系，產(chǎn)生最多由22個(gè)亞型的干擾素-α組成的天然混合物，然后用色譜法純化至純度為95%，比活約為100×106國際單位/mg蛋白。這樣一種產(chǎn)物被鑒定為人干擾素α-N1，可以以商品名WELLFERON(Wellcome Foundation Limited的注冊商標(biāo))買到。天然人干擾素-β是由人二倍體成纖維細(xì)胞(通常來自新生組織)得到的，其生產(chǎn)是通過(例如)加入合成雙鏈RNA來誘導(dǎo)的。人干擾素-γ可以由血沉棕黃層來制備，用促有絲分裂劑如葡萄球菌腸毒素A作誘導(dǎo)劑。
人干擾素α、β和γ也可以利用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生，但在通過在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)相關(guān)基因而產(chǎn)生時(shí)，重組干擾素的三級結(jié)構(gòu)與天然分子可能并不相同。同樣，在細(xì)菌細(xì)胞中生產(chǎn)的干擾素不會是糖基化的，雖然這似乎不影響該分子在體外測定時(shí)的生物活性，但會改變構(gòu)象和抗原性，并可能影響在體內(nèi)的分布。這樣一種重組人干擾素優(yōu)選與天然人干擾素有90%以上的氨基酸同源性，更優(yōu)選的是95%同源性，更優(yōu)選的是97%同源性，更優(yōu)選的是98%同源性，更優(yōu)選的是99%同源性，最優(yōu)選的是100%同源性。重組人干擾素可以買到，其實(shí)例有干擾素α-2a(ROFERON-Roche)干擾素α-2b(INTRON-Schering)。這兩種分子僅在23位有一個(gè)氨基酸殘基不同(在ROFERON中為賴氨酸，在INTRON中為精氨酸)。
人干擾素用于治療肝炎已有若干年。最早在七十年代中期所做的試驗(yàn)使用了人白細(xì)胞干擾素，該干擾素是由從捐獻(xiàn)的血液生產(chǎn)血漿后留下的血沉棕黃層生產(chǎn)，這不可避免地限制了可得量。在八十年代早期，由于生產(chǎn)技術(shù)的進(jìn)步，在慢性乙型肝炎的治療中既使用天然的也使用重組人干擾素-α。這種治療在許多病例中都可應(yīng)為是成功的，但一般認(rèn)為，僅用人α-干擾素進(jìn)行治療時(shí)，由病毒標(biāo)記的持續(xù)喪失評定的反應(yīng)率低于50%。也曾研究了人干擾素β和δ在慢性乙型肝炎中的應(yīng)用，但尚未成為成熟的治療方法。
在慢性丙型肝炎的治療中也研究了所有三類人干擾素，但干擾素-β的可得性低，限制了用這類干擾素進(jìn)行的工作。曾用前面提到的α-干擾素(干擾素α-2a、干擾素α-2b和淋巴母細(xì)胞干擾素)進(jìn)行了很廣泛的試驗(yàn)，結(jié)果是令人鼓舞的，因?yàn)榧s有40%的患者發(fā)生完全反應(yīng)。然而，治療6個(gè)月后觀察到約50%的復(fù)發(fā)率，這樣，可能只有20-25%的患者長期受益。
關(guān)于使用干擾素治療肝炎的全面綜述，可參見Eddleston和Dixon所編《干擾素在肝臟慢性病毒感染治療中的應(yīng)用》一書(PenninePress的，1990)。
另外，曾有人提出將干擾素用于治療多種其他病癥，包括非肝炎病毒性疾病;涉及免疫系統(tǒng)的紊亂，包括自身免疫病癥;以及各種癌癥，包括腎癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、卡波濟(jì)肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和惡性血液病癥。
有某種證據(jù)(特別是關(guān)于HIV)表明，慢性病毒感染可能會引起受感染生物體內(nèi)的氧化緊張。病毒誘發(fā)氧化緊張可能是由多種機(jī)理所致，包括免疫復(fù)合物激活吞噬細(xì)胞、發(fā)炎性細(xì)胞因子(TNFα、IL-6)促進(jìn)自由基形成、以及由于病毒表面糖蛋白和細(xì)胞膜之間的直接相互作用而生成活潑氧。
已知有許多物質(zhì)能在細(xì)胞水平或整個(gè)生物體的水平上起到自由基清除劑的作用。例如，還原型谷胱甘肽是一種存在于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的分布廣泛的非蛋白硫醇，它參與多種代謝功能，包括針對自由基的解毒反應(yīng)。谷胱甘肽是對抗氧化緊張的主要細(xì)胞內(nèi)防御機(jī)制，能增加自由基形成的因素會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽貯存的清耗。谷胱甘肽還在調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞激活和增殖、T細(xì)胞細(xì)胞毒性和巨噬細(xì)胞-淋巴細(xì)胞相互作用方面起到重要的免疫調(diào)節(jié)作用。
N-乙酰半胱氨酸作為粘液溶解劑、角膜創(chuàng)傷藥和撲熱息痛中毒解毒劑為人所知已有多年。該化合物具有相對較為溫和的還原作用，因此認(rèn)為它是通過斷裂粘蛋白中的二硫鍵而起到粘液溶解劑的作用。有許多報(bào)告報(bào)道，在某些慢性病毒病癥特別是HIV感染中，還原型谷胱甘肽水平可能會下降。N-乙酰半胱氨酸是谷胱甘肽的前體，因而也是谷胱甘肽的誘導(dǎo)物，已有人建議將N-乙酰半胱氨酸作為治療劑用于HIV感染病例中。
EP-A-O269017(Cetus)涉及淋巴因子或細(xì)胞毒素與自由基清除劑或代謝抑制劑的組合物，該組合物用于治療哺乳動(dòng)物宿主由于自由基生成引起的生物損傷。雖然該說明書附帶地提到了作為淋巴因子的干擾素，也提到了感染是生物損傷的可能原因，但該說明書基本上涉及的是可能在癌癥治療過程中生成的自由基。說明書中給出的生物學(xué)數(shù)據(jù)完全涉及癌癥，而且主要是有關(guān)在鼠纖維肉瘤中施用TNFα。
本發(fā)明涉及自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物作為用人干擾素進(jìn)行治療的輔助劑的應(yīng)用。
本發(fā)明的一個(gè)方面提供一種對患有對干擾素治療敏感病癥的患者進(jìn)行治療的方法，該方法包括給患者施用有效量的人干擾素，其中在施用人干擾素的全部或部分持續(xù)時(shí)間內(nèi)，還施用一種自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物。
本發(fā)明的另一方面提供人干擾素在制備藥物中的應(yīng)用，該藥物用于治療對用干擾素治療敏感的病癥，在該治療所用的方法中，在施用人干擾素的全部或部分持續(xù)時(shí)間內(nèi)，還施用一種自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物。
本發(fā)明的另一方面提供自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物在制備藥物中的應(yīng)用，該藥物用于治療對用干擾素治療敏感的病癥，該治療方法包括施用人干擾素，其中在施用人干擾素的全部或部分持續(xù)時(shí)間內(nèi)還施用自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物。
對用干擾素治療敏感的病癥可以是人干擾素已成為其成熟治療方法或已建議作為其有效治療方法的任何病癥。這類病癥包括病毒感染，如病毒性肝炎;由人乳頭瘤病毒、細(xì)胞肥大病毒和HIV引起的感染;非病毒性感染，如結(jié)核;象哮喘這樣的病癥。
本發(fā)明特別適用于人干擾素在肝炎治療中的應(yīng)用。如前面已指出的，雖然這種治療在許多病例中療效顯著，但反應(yīng)率相對較低，而且在丙型肝炎的情況下有明顯的復(fù)發(fā)率。因此，迫切需要改進(jìn)用人干擾素治療肝炎的方法，以克服這些問題。
用于本發(fā)明的人干擾素的例子包括前面提到的干擾素。
本發(fā)明的另一方面提供一種通過施用人干擾素治療病毒性肝炎感染的方法，其中在施用人干擾素的全部或部分持續(xù)時(shí)間還施用一種自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物。
本發(fā)明的另一方面提供人干擾素在制備藥物中的應(yīng)用，該藥物用于治療病毒性肝炎感染，在所用治療方法中，在施用人干擾素的全部或部分持續(xù)時(shí)間還施用自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物。
本發(fā)明的另一方面提供自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物在制備藥物中的應(yīng)用，該藥物用于治療病毒性肝炎感染，所用治療方法包括施用人干擾素，其中在施用人干擾素的全部或部分持續(xù)時(shí)間還施用自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物。
本發(fā)明的另一方面提供人干擾素和自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物的增效組合物(也稱為協(xié)同組合物)，該組合物用于治療對用干擾素治療敏感的病癥。本發(fā)明增效組合物的活性成分，可以作為彼此獨(dú)立的制劑同時(shí)或依次施用，也可以作為單一的混合制劑施用。如果是依次施用，則第二種活性成分施用時(shí)間的延遲不應(yīng)使活性成分組合物的增強(qiáng)療效的優(yōu)點(diǎn)喪失。
本發(fā)明適用于治療所有形式的病毒性肝炎，目前公認(rèn)有五種類型的肝炎，分別定名為甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎。
甲型肝炎是一種急性病毒感染，潛伏期為40天以下，由排泄物一途口徑傳染。該病毒是細(xì)小核糖核酸病毒科的一個(gè)成員，由27nm的球形無被膜顆粒組成。該病毒基因組已經(jīng)過測序，包含含約7480個(gè)堿基的單鏈RNA。
乙型肝炎是一種多發(fā)性的嚴(yán)重病毒性疾病，全世界估計(jì)有兩億多病毒攜帶者。該疾病在被稱為血清肝炎時(shí)，是根據(jù)輸血、注射人血漿各部或使用未經(jīng)消毒的注射針頭2-3個(gè)月后出現(xiàn)癥狀來診斷的。對乙型肝炎血清標(biāo)志的認(rèn)識已證實(shí)了皮膚滲透特別是血液在病毒傳染中的重要性。該疾病的急性期過后，大多數(shù)成年患者在數(shù)周內(nèi)自發(fā)康復(fù)，但是一定比例的患者在許多月過后仍不清除病毒，成為慢性病毒攜帶者。乙型肝炎病毒屬于肝DNA病毒科，其基因組由一個(gè)小的不完全雙鏈環(huán)形DNA組成，該DNA在復(fù)制時(shí)，先將其DNA拷貝成RNA，再用反轉(zhuǎn)錄酶將RNA重新拷貝成DNA。
非甲非乙型肝炎逐漸被分認(rèn)為是日益嚴(yán)重的國際衛(wèi)生問題。已證明至少有80%的慢性輸血后非甲非乙型肝炎病例是由現(xiàn)已鑒定為丙型肝炎的病毒所致，在從血液制品中篩除乙型肝炎的臨床條件下，幾乎所有的輸血后肝炎病例可能都是由這種病毒造成的。大致有半數(shù)的急性丙型肝炎感染病例在數(shù)月內(nèi)自動(dòng)消退，而其余病例則轉(zhuǎn)為慢性，并且在許多(如果不是全部)病例中接著出現(xiàn)慢性活動(dòng)性肝炎，并有產(chǎn)生肝硬變和肝細(xì)胞癌的可能。最近已闡明了丙型肝炎病毒基因組的結(jié)構(gòu)，并已將該病毒鑒定為與黃病毒有些類似的單鏈RNA病毒。
丁型肝炎病毒最初是在1977年在鑒定出某些乙型肝炎病毒攜帶者體內(nèi)的一種新抗原后被識別出來的。該病毒的復(fù)制需要乙型肝炎病毒(或密切相關(guān)的肝DNA病毒)作為輔助病毒，但這種復(fù)制卻十分有效，致使它能夠在血清中達(dá)到比輔助病毒更高的滴度。丁型肝炎病毒其因組由共價(jià)閉合的環(huán)狀RNA組成，并與在植物中發(fā)現(xiàn)的某些環(huán)狀類病毒或病毒樣因子有某種結(jié)構(gòu)相似性。丁型肝炎感染與侵襲性肝病相關(guān)，并且在嚴(yán)重疾病(慢性活動(dòng)性肝炎或肝硬變)患者中比在慢性持續(xù)性肝炎患者中更為常見。
戊型肝炎病毒與引起甲型肝炎的病毒有關(guān)(Reyes等，Science2471335-1339，1990)，并產(chǎn)生無慢性期的急性肝炎。該病毒是水源性腸道病毒，通常由排泄物/口途徑傳染。它在印度次大陸特別流行，并在孕婦中造成高死亡率。
本發(fā)明還適用于治療人乳頭瘤病毒，該病毒是非生殖器疣、青少年喉乳頭瘤和尖銳濕疣的致病因子，并在宮頸癌中有作用。本發(fā)明還適用于治療其他病毒性感染，如由人細(xì)胞肥大病毒和HIV引起的感染。本發(fā)明還適用于治療非病毒性感染如結(jié)核，以及象哮喘這樣的病癥。
用于本發(fā)明的人干擾素可以是上述三種類型中的任何一種，即干擾素-α、干擾素-β或干擾素-γ。一般來說，人干擾素應(yīng)是干擾素-α或干擾素-γ。人干擾素優(yōu)選人干擾素-α，更為優(yōu)選的是由培養(yǎng)的人細(xì)胞系得到的人干擾素-α或重組人干擾素-α。按照一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，人干擾素是重組干擾素α-2α或干擾素α-2b，例如以商品名ROFERON和INTRON銷售的產(chǎn)品之一。按照另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，人干擾素是人淋巴母細(xì)胞干擾素(干擾素αN1)，例如由TheWellcomeFoundationLtd.以商品名WELLFERON銷售的產(chǎn)品。
術(shù)語“人干擾素”包括來自人的已測定了順序的任何野生型干擾素，以及它的基本保留了相應(yīng)野生型順序的活性并與相應(yīng)野生型順序有80%以上順序同源性的任何等位體、變異體或突變體。
人干擾素可以按與單獨(dú)用于治療有關(guān)病癥(如肝炎)時(shí)相同的方式配成制劑，以便按本發(fā)明施用。因此，干擾素一般是非腸道施用，例如注射，優(yōu)選皮下注射。干擾素優(yōu)選配成含水制備物，或配成打算用合適媒液(如注射用水)復(fù)原的冰凍干燥產(chǎn)品。制劑還可以含有合適的載體、稀釋劑或穩(wěn)定劑，例如另一種人蛋白如人血清清蛋白。
人干擾素一般將按照有關(guān)產(chǎn)品已建立的治療方案來施用。例如，不論淋巴母細(xì)胞的還是重組的人干擾素-α，都可以每天1-10兆單位干擾素的劑量來施用?？梢悦恐苁┯迷搫┝?天或更多天，優(yōu)選每周3次。優(yōu)選的劑量范圍是每天2-6兆單位干擾素，每周3天或更多天，優(yōu)選每周3次，特別優(yōu)選的干擾素劑量是5兆單位，最優(yōu)選的是每天3兆單位，每周3天或更多天，優(yōu)選每周3次。在治療肝炎時(shí)，施用干擾素的持續(xù)時(shí)間通常是若干周，例如12-30周，特別是約24周，但在某些病例中，最多為一年或更長時(shí)間的更長的治療期也可能是適當(dāng)?shù)摹?br> 本文所用的術(shù)語“自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物”是指在施用于宿主后能降低宿主內(nèi)的自由基水平(也稱為氧化緊張)的任何物質(zhì)。該物質(zhì)可能是通過直接清除自由基，也可能是通過誘導(dǎo)(不論是否作為直接生物前體)宿主內(nèi)具有自由基清除作用的物質(zhì)的生成，從而產(chǎn)生上述的降低自由基水平的作用。另外，該物質(zhì)也可能是通過對生成自由基的過程施加抑制作用而降低自由基水平。
優(yōu)選的自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物包括谷胱甘肽及其前體，例如天然存在的氨基酸半胱氨酸的衍生物。一種特別優(yōu)選的谷胱甘肽前體是N-乙酰半胱氨酸。如前面所指出的，N-乙酰半胱氨酸已有成熟的作為粘液分解劑的藥物應(yīng)用，并可以買到該化合物的藥物制劑。其它自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物包括維生素A、維生素C(抗壞血酸)、維生素E、尿酸、丁硫氨酸硫肟(buthioninesulphoxime)、馬來酸二乙酯2-甲基-5-硝基-1-咪唑基乙醇、超氧化物岐化酶、甲硫氨酸。抑制自由基生成的物質(zhì)包括黃嘌呤氧化酶抑制劑如別嘌呤醇，并被認(rèn)為是本文所指的“自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物”。
自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物，應(yīng)以使其能在宿主體內(nèi)減少自由基生成和/或減輕自由基生成作用(氧化緊張)的形式和劑量施用?？梢愿鶕?jù)物質(zhì)的本質(zhì)而以任何方便的途徑給藥，例如口服或腸胃外給藥。可能情況下優(yōu)選口服給藥。
N-乙酰半胱氨酸優(yōu)選配成片劑或粒劑，或配成液體制劑如糖漿劑，以供口服。N-乙酰半胱氨酸的適當(dāng)劑量在每劑量200mg至4g范圍，每天最多給藥4次，例如400-800mg，每天給藥4次，優(yōu)選600mg，每天給藥4次。
雖然本發(fā)明提供的治療方法(例如病毒性肝炎的治療方法)是組合施用人干擾素和自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物，但這兩種藥物一般將作為獨(dú)立的制劑施用。然而在某些情況下，將這兩種組分作為混合制劑施用可能有好處，本發(fā)明延伸到這種混合制劑。
因此，本發(fā)明的另一方面提供一種藥物組合物，該組合物包含一種人干擾素及一種自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物。
一般來說，任何這類混合制劑都將是準(zhǔn)備供腸胃外施用(如注射)的形式。這樣一種混合制劑可以呈液態(tài)或固態(tài)，固態(tài)時(shí)人干擾素是冰凍干燥的并適于復(fù)原成液態(tài)。
也可以以適于分別施用的形式將這兩種藥物放在一起。本發(fā)明的另一方面提供一種配對包裝，該包裝包含為分別施用而合放在一起的一種人干擾素和一種自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物。
本發(fā)明特別適用于乙型肝炎或丙型肝炎的治療。如前面已指出的，施用人干擾素特別是重組或淋巴母細(xì)胞干擾素-α已經(jīng)是乙型肝炎的成熟治療方法。此外，許多試驗(yàn)表明，該治療方法對丙型肝炎也有顯著療效。按照本發(fā)明，用干擾素對肝炎特別是乙型肝炎或丙型肝炎患者進(jìn)行的治療，將基本按照成熟方案進(jìn)行，此外在用人干擾素治療的全部或部分持續(xù)時(shí)間用自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物進(jìn)行治療。
血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平是肝功能障礙的高度敏感的標(biāo)志。乙型肝炎和丙型肝炎感染的特點(diǎn)都是ALT水平升高，因此該疾病的進(jìn)展通常是通過測定血清ALT來監(jiān)測的。如前面所指出的，只有約50%或更少的乙型肝炎或丙型肝炎患者對人干擾素-α治療有反應(yīng)，這種反應(yīng)就是由病毒標(biāo)志的顯著清除或ALT水平的顯著下降證實(shí)的。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案特別適用于治療乙型肝炎或丙型肝炎，最適用于治療丙型肝炎，按照該實(shí)施方案，用人干擾素特別是人干擾素-α進(jìn)行的治療以通常方式進(jìn)行若干周，例如12-30周，特別是約24周。如果患者未能對這個(gè)用人干擾素進(jìn)行的初始療程作出反應(yīng)，即血清ALT水平未出現(xiàn)顯著降低，則繼續(xù)用人干擾素進(jìn)行治療，并用自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物，優(yōu)選谷胱甘肽或其前體或誘導(dǎo)物，最優(yōu)選的是N-乙酰半胱氨酸，進(jìn)行進(jìn)一步的治療。用人干擾素和自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物進(jìn)行的治療，可以再持續(xù)若干周，例如12至30周，特別是約24周。按照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，該治療方案應(yīng)用于用人淋巴母細(xì)胞干擾素(人干擾素α-N1)治療丙型肝炎。
如前面也已經(jīng)指出的，某些乙型肝炎或丙型肝炎患者可能最初對用人干擾素特別是人干擾素-α治療有反應(yīng)，但隨后又復(fù)發(fā)。上述的用人干擾素和自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物進(jìn)行的組合療程對這些患者也會有療效。
應(yīng)該理解，人干擾素和自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物的劑量將隨患者和患者所患的具體病癥而變化。這種治療最終將由主治醫(yī)生來控制并由他來負(fù)責(zé)。
本發(fā)明由下列探索實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步說明，該實(shí)驗(yàn)決不應(yīng)被誤認(rèn)為是限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1.概述乙型肝炎病毒(HCV)是大多數(shù)輸血后和單發(fā)性非甲非乙型肝炎病例的病因。該感染轉(zhuǎn)為慢性是很常見的，進(jìn)而導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬變，最終導(dǎo)致惡性變性。若干受控實(shí)驗(yàn)表明，α-干擾素(IFN)可用于治療慢性丙型肝炎(CHC)，但反應(yīng)率平均為50%，IFN停用后的復(fù)發(fā)率可達(dá)到30-40%。因此，停用IFN后維持正常轉(zhuǎn)氨酶水平的慢性丙型肝炎患者的比例在所治療的所有病例中只占20-40%左右。
還原型谷胱甘肽是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中一種重要的抗氧化劑，參與多種細(xì)胞功能?，F(xiàn)已表明，GSH的消耗可能在某些慢性病毒性疾病如艾滋病中起致病作用。在該實(shí)驗(yàn)中，對用IFN治療至少4個(gè)月后仍沒有反應(yīng)的慢性丙型肝炎患者，測定了血漿和外周血單核細(xì)胞(PBMC)中的GSH水平。還評定了N-乙酰半胱氨酸(谷胱甘肽的前體)對GHS水平的影響以及對IFN治療的臨床和病毒學(xué)反應(yīng)的影響。
2.患者和方法2.1患者進(jìn)入該實(shí)驗(yàn)的有14名患者(13名男性，1名女性，平均年齡51歲，年齡范圍27-71歲)，這些患者經(jīng)組織學(xué)和血清學(xué)診斷患有慢性丙型肝炎，其中有兩名還伴有肝硬變。所有患者都已經(jīng)過至少4個(gè)月的α-淋巴母細(xì)胞干擾素(Wellferon)治療(每周15±1.6兆單位，范圍為每周9-21兆單位);所有患者在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)時(shí)都顯示異常ALT值(30國際單位/升以上)。大多數(shù)對IFN有反應(yīng)的慢性丙型肝炎患者，在治療的頭三個(gè)月內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶水平恢復(fù)正常，而在治療四個(gè)月后仍維持高ALT值的患者可認(rèn)為是無反應(yīng)者。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)中的所有患者都被認(rèn)為是對IFN無反應(yīng)者。本實(shí)驗(yàn)中的患者繼續(xù)采用與他們前已采用過的基本相同的IFN治療方案，但加上每天口服N-乙酰半胱氨酸(NAC)，每8小時(shí)600mg。增加口服NAC后患者不增加干擾素劑量，但在3個(gè)病例中干擾素的量略有減少(增加NAC前15±1.8兆單位/周，增加NAC后11.5±1.3兆單位/周)。
此外，給10名新近診斷為患慢性丙型肝炎但從未接受抗病毒治療的患者(8名男性，2名女性，平均年齡32歲，年齡范圍24-63歲)口服相同劑量的NAC一個(gè)月，但不服用干擾素。
以26名健康人(14名男性，12名女性，平均年齡43歲，年齡范圍25-79歲)作對照組。所有患者都以書面通知形式表示同意，而且該實(shí)驗(yàn)得到了地方道德委員會(LocalEthicsCommittee)的批準(zhǔn)。
2.2PBMC和血漿中GSH的測定從每個(gè)患者體內(nèi)取血樣供同時(shí)測定PBMC中的GSH(L-GSH)和貧血小板血漿中的GSH(P-GSH)。在Lymphoprep(NycomedPharmaAS，Oslo，Norway)上離心分離PBMC，并洗滌5次。將分離出的細(xì)胞用20%高氯酸(2%終濃度)殺死，離心(1200g×10分鐘，4℃)后，上清液于-40℃下貯存?zhèn)溆?。?0%高氯酸加到貧血小板血漿中(2%終濃度)，離心后將上清液于-40℃下貯存以備進(jìn)行GSH測定。
使貯存的樣品融化，按Brigellus等人所述(Biochem.Pharmacol.，32∶2529-2534，1983)、經(jīng)Ferrer等人修改(Biochem.J.，264∶531-534，1990)的酶法測定GSH。在GSH-S-轉(zhuǎn)移酶存在下使GSH與1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)(SIGMA)結(jié)合，并用Perkin-Elemerλ2型分光光度計(jì)測定該復(fù)合物在340nm處的光吸收。利用9.6×103的摩爾消光系數(shù)求得GSH的絕對值。
2.3RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)基本上如Ruiz等人(Hepatology，16∶637-643，1992)和Cheng等人(J.Hepatol.，印刷中，1992)所述，進(jìn)行血清中丙型肝炎病毒RNA(HCV-RNA)的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，以及PBMC中HCV-RNA正鏈或負(fù)鏈的RT-PCR。嚴(yán)格采用Kwoks和Higuchi(Nature，339∶237-238，1989)推薦的減少污染危險(xiǎn)的方法。所有提取和反應(yīng)都在陽性和陰性對照中同時(shí)進(jìn)行。還包括一個(gè)從最后一次洗滌PBMC得到的試樣，在這些樣品中PCR總是陰性的。
2.4統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)都以平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)表示。利用MannWhitney和Wilcoxon檢驗(yàn)進(jìn)行成對數(shù)據(jù)和不成對數(shù)據(jù)的比較。
3.附圖結(jié)果參照附圖來敘述。附圖中

圖1顯示IFN(-4至0個(gè)月)及IFN加NAC(0至6個(gè)月)對進(jìn)入實(shí)驗(yàn)的14名患者ALT水平的影響;
圖2顯示在用IFN和IFN加NAC治療過程中PBMC中HCV-RNA正鏈和負(fù)鏈的檢測;
圖3顯示在IFN治療中增加NAC之前和之后，在1∶10的血清稀釋度下血清中HCV-RNA的檢測。
圖4顯示上述圖1中所述患者在接續(xù)到開始IFN加NAC治療后11個(gè)月時(shí)的ALT水平。
4.結(jié)果進(jìn)入該實(shí)驗(yàn)的14名患者的平均血清ALT水平示于下表，該表還顯示了L-GSH和P-GSH。
表月數(shù)平均ALTL-GSHP-GSH(IU/L) (毫微摩爾/106個(gè)細(xì)胞) (μM)-4139±24--0124±241.45±0.270.77±0.21+1-287±9--+3-453±73.32±0.182.40±0.20+5-637±3--對照組的L-GSH和P-GSH值如下
L-GSH 3.43±0.89毫微摩爾/106個(gè)細(xì)胞P-GSH18.1±4.08μM.
在從未接受抗病毒治療的慢性丙型肝炎患者(n＝10)中，血漿中的GSH水平(0.63±0.07μM)和PBMC中的GSH水平(1.02±0.09毫微摩爾/106個(gè)細(xì)胞，P＜0.01)相比，似乎受到嚴(yán)重抑制。施用NAC一個(gè)月顯著提高了PBMC中的GSH水平(2.22±0.38毫微摩爾/106個(gè)細(xì)胞，P＜0.05)，但血漿中的GSH沒有明顯變化(0.99±0.22μM，無顯著性差異)。此外，血清ALT水平(128±32國際單位/升;用NAC治療一個(gè)月后為110±29國際單位/升)也沒有明顯變化。
在未對干擾素作出反應(yīng)的患者中，PBMC中的GSH水平(1.45±0.27毫微摩爾/106個(gè)細(xì)胞)和血漿中的GSH水平(0.77±0.21μM)與對照值相比似乎也明顯受到抑制(P＜0.01)。在這些患者中，與干擾素一起施用NAC3-4個(gè)月使單核細(xì)胞中的GSH(3.32±0.18毫微摩爾/106個(gè)細(xì)胞，P＜0.05)和血漿中的GSH(2.40±0.20μM，P＜0.05)明顯上升。
圖1和上表表明，在進(jìn)入該實(shí)驗(yàn)的患者(對干擾素?zé)o反應(yīng)者)中，ALT水平在4個(gè)月的IFN治療過程中沒有顯著變化(139±24變?yōu)?24±17國際單位/升，無顯著性差異)。然而，增加口服NAC導(dǎo)致ALT的迅速而明顯的下降，甚至在組合治療只一個(gè)月后，ALT值就已明顯下降(87±9國際單位/升，p＜0.05)。另外，持續(xù)施用IFN和NAC5-6個(gè)月使所有病例的ALT值都進(jìn)一步下降(37±4國際單位/升)，41%的病例達(dá)到正常值，其余的接近正常值(有一個(gè)病例最高，為56國際單位/升)。在以前歸入對IFN治療無反應(yīng)者的患者中，在IFN治療中增加NAC明顯改善對IFN的反應(yīng)。由圖4可見，ALT值的這種下降一直持續(xù)到最晚的患者分析，即開始組合治療11個(gè)月后。
IFN和NAC組合所致的ALT水平的下降同時(shí)還伴有對病毒復(fù)制的影響。在歸入對IFN無反應(yīng)者的9名患者中，在治療中增加NAC之前和之后，檢測了PBMC中HCV基因組鏈(RNA正鏈)和病毒復(fù)制中間體(RNA負(fù)鏈)的存在。如圖2所示，在患者只用IFN治療時(shí)，在7個(gè)病例中可檢測到基因組鏈(77%)，而在3名患者中檢測到復(fù)制中間體(33%)。但是，在用IFN和NAC組合治療4-6個(gè)月后，只在2個(gè)病例中檢測到正鏈(22%)，在所有病例中都檢測不到HCV-RNA負(fù)鏈。
在IFN治療中增加NAC還伴有血清中HCV-RNA水平的下降。如圖3所示，在治療中增加NAC后，需要提高血清濃度才能檢測到HCV。例如，在增加NAC之前，用1∶10的血清稀釋度可以在100%的病例中檢測到HCV-RNA，而在治療中增加NAC之后，在相同的血清稀釋度下只在70%的患者中檢測到病毒。
權(quán)利要求
1.一種增效組合物，該組合物包含一種人干擾素和一種自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中人干擾素是人干擾素-α。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中人干擾素-α是重組的。
4.權(quán)利要求2的組合物，其中人干擾素-α是天然的。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中天然人干擾素-α是淋巴母細(xì)胞干擾素。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的組合物，其中自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物是谷胱甘肽或其前體或誘導(dǎo)物。
7.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的組合物，其中自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物是N-乙酰半胱氨酸。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的組合物，該組合物用于治療對用干擾素治療敏感的病癥。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中病癥是乙型肝炎或丙型肝炎感染。
10.一種人干擾素在制備藥物中的應(yīng)用，該藥物用于治療患有對用人干擾素治療敏感的病癥的患者，在治療方法中，在用人干擾素治療過程中還施用一種自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物。
11.一種自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物在制備藥物中的應(yīng)用，該藥物用于治療患有對用人干擾素治療敏感的病癥的患者，治療方法包括用人干擾素和自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物進(jìn)行治療。
12.權(quán)利要求10或11的應(yīng)用，其中人干擾素是人干擾素-α。
13.權(quán)利要求12的應(yīng)用，其中人干擾素-α是重組的。
14.權(quán)利要求12的應(yīng)用，其中人干擾素-α是天然的。
15.權(quán)利要求14的應(yīng)用，其中天然人干擾素-α是人淋巴母細(xì)胞干擾素。
16.權(quán)利要求10-15中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物是谷胱甘肽或其前體或誘導(dǎo)物。
17.權(quán)利要求10-15中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物是N-乙酰半胱氨酸。
18.權(quán)利要求10-17中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中病癥是乙型肝炎或丙型肝炎感染。
19.一種人干擾素在制備藥物中的應(yīng)用，該藥物用于治療患有對用人干擾素治療敏感的病癥但未能對用人干擾素治療作出反應(yīng)的患者，治療方法中，在用人干擾素治療過程中還施用自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物。
20.一種自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物在制備藥物中的應(yīng)用，該藥物用于治療患有對用人干擾素治療敏感的病癥但未能對用干擾素治療作出反應(yīng)的患者，治療方法包括用人干擾素和自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物進(jìn)行治療。
21.權(quán)利要求19或20的應(yīng)用，其中患者以前曾對用人干擾素治療作出反應(yīng)。
22.權(quán)利要求19-21中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中人干擾素是人干擾素-α。
23.權(quán)利要求22的應(yīng)用，其中人干擾素-α是重組的。
24.權(quán)利要求22的應(yīng)用，其中人干擾素-α是天然的。
25.權(quán)利要求24的應(yīng)用，其中天然人干擾素-α是人淋巴母細(xì)胞干擾素。
26.權(quán)利要求19-25中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物是谷胱甘肽或其前體或誘導(dǎo)物。
27.權(quán)利要求19-25中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物是N-乙酰半胱氨酸。
28.權(quán)利要求19-27中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中病癥是乙型肝炎或丙型肝炎感染。
29.一種藥物制劑，該制劑包含如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的組合物及可藥用的載體。
30.一種配對包裝，該包裝包含放在一起的需要施用以產(chǎn)生如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的組合物的組分。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療組合物，更具體地說，涉及一種需要使用人干擾素的組合療法。該療法包括用人干擾素與自由基清除劑或其前體或誘導(dǎo)物的組合物治療對用人干擾素治療敏感的病癥。
文檔編號A61K45/06GK1094642SQ9312128
公開日1994年11月9日 申請日期1993年12月21日 優(yōu)先權(quán)日1992年12月22日
發(fā)明者J·普里艾托瓦圖恩納, O·貝羅奎盧伊茲 申請人:惠爾康基金會集團(tuán)公司