專利名稱：調(diào)節(jié)細胞分裂素活性的組合物的制作方法
本申請是美國申請08/096，739(1993年7月23日)的部分繼續(xù)申請，后者是美國申請07/974，750(1992年11月10日)的部分繼續(xù)申請，美國申請07/974，750則又是美國申請07/878，188(1992年5月1日)的部分繼續(xù)申請，這些申請的全文公開內(nèi)容引入本文作為參考。
本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)細胞分裂素活性例如，增強或抑制腫瘤壞死因子α(TNF-α)活性的物質(zhì)、含這些物質(zhì)的組合物及方法。更具體地說，本發(fā)明公開了物質(zhì)和可藥用組合物，當給宿主施用有效量的這些物質(zhì)和組合物時，能抑制或增加由宿主細胞產(chǎn)生的活性TNF-α的分泌。通過本發(fā)明的方法可以調(diào)節(jié)由宿主免疫效應細胞(如，宿主被激活的巨噬細胞)產(chǎn)生的活性細胞分裂素，如TNF-α的分泌。
本發(fā)明還涉及預防和/或治療病理過程的方法、或者相反地說，本發(fā)明涉及包括誘導細胞分裂素產(chǎn)生、分泌和/或其活性的、有益的、與免疫系統(tǒng)有關的反應的激發(fā)。本發(fā)明所選擇的組合物含有有效低劑量的低分子量肝素(LMWH)，每隔5到8天給藥一次。其它的組合物含有基本上純凈的羧酸化的和/或硫酸化的寡糖，該糖是從包括LMWH的層析分離和精制、酶降解的肝素和酶降解的胞外基質(zhì)(DECM)的多種主要來源得到的。
這些物質(zhì)，含有這些物質(zhì)的組合物和特別是適于經(jīng)非胃腸道、口服或局部用藥的藥物組合物均能在體外通過靜止的T細胞和/或巨噬細胞應答免疫效應細胞激活因子的激活反應來抑制或增加TNF-α的分泌，免疫應答細胞激活因子包括(但不限于)T細胞特異抗原、T細胞分裂素、巨噬細胞激活因子、殘余胞外基質(zhì)(RECM)、纖維結合素、昆布氨酸(laminin)等。體內(nèi)數(shù)據(jù)，顯示出對實驗性延遲型過敏性(DTH)的抑制，其進一步支持了體外結果。
2.1.腫瘤壞死因子αTNF-α，一種由單核細胞和T淋巴細胞產(chǎn)生的細胞分裂素，是產(chǎn)生炎性應答的一系列因素中的一個關鍵因素，并且作為病情的主要orchestrator它具有許多多效性作用(Beutler，B.和Cerami，A.，Ann.Rev.Immunol.(1989)7625-655)。
TNF-α的生理作用依賴于它的濃度和產(chǎn)生部位低濃度時，TNF-α會產(chǎn)生理想的平衡和防御功能;但高濃度時，在系統(tǒng)或某些組織中，TNF-α能與其它細胞分裂素，特別是白細胞介素-1(IL-1)產(chǎn)生協(xié)同作用而加劇許多炎性應答。
可以看到由TNF-α(與IL-1一起)誘導的下列活動發(fā)熱、慢波睡眠、循環(huán)動力休克、時相蛋白產(chǎn)生增加、白蛋白產(chǎn)生減少、血管內(nèi)皮細胞激活、主要的組織相容性復合(MHC)分子表達減少、脂蛋白脂酶減少、細胞色素P450降低、血漿鋅和鐵降低、成纖維細胞增生、滑液細胞膠原酶增加、環(huán)加氧酶活性提高、激活T細胞和B細胞、并且誘導細胞分裂素、TNF-α自身、IL-1、IL-6和IL-8的分泌。的確，研究表明這些細胞分裂素的生理作用是相互關聯(lián)的(Philip，R.和Epstein，L.B.，Nature(1986)323(6083)86-89;Wallach，D.etal.，J.Immunol.(1988)140(9)2994-2999)。
現(xiàn)在還不知道具體TNF-α是如何發(fā)揮它的作用的，但人們認為它的許多作用與TNF-α激活細胞由細胞膜花生四烯酸產(chǎn)生前列腺素和白細胞三烯的能力有關。
TNF-α，作為多效性作用的結果，與身體許多不同器官的多種病情有關。在血管中，TNF-α激發(fā)出血性休克，抑制內(nèi)皮細胞血栓調(diào)節(jié)素(thrombomodulin)并增強前凝血劑活性。它致使白血球和可能的血小板粘附于血管壁，因此可以激發(fā)動脈粥樣硬化，還有脈管炎。
TNF-α激活血細胞并引起嗜中性白細胞、嗜曙紅細胞、單核細胞/巨噬細胞及T和B細胞的粘著。通過誘導IL-6和IL-8，TNF-α增強了炎性細胞的趨化性及其進入組織的滲透性。因此，TNF-α在自身免疫性疾病、變態(tài)反應和移植排斥的組織損傷中具有一定的作用。
TNF-α也稱為惡病質(zhì)素，因為它調(diào)控脂肪細胞的代謝活性并對伴隨于腫瘤、慢性感染、慢性心臟病和慢性炎癥的消瘦與惡病質(zhì)起作用。TNF-α在增加脂肪組織消耗的同時，也可以通過抑制食欲對食欲缺乏性神經(jīng)質(zhì)起作用。
TNF-α對骨胳和心肌細胞有代謝作用。它對肝臟也具有明顯的作用它抑制白蛋白和細胞色素P450的代謝并增加纖維蛋白原、1-酸糖蛋白和其它時相蛋白的產(chǎn)生。它也能引起腸壞死。
在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，TNF-α穿過血腦屏障并誘發(fā)發(fā)熱，增加睡眠和食欲缺乏。增高的TNF-α濃度與多種硬化癥有關。它還引起腎出血并影響甾體激素的產(chǎn)生，增進皮膚中的膠原酶和PGE-2，還通過激活破骨細胞引起骨和軟骨的破裂。
總之，TNF-α涉及自身免疫性疾病、移植排斥、脈管炎和動脈粥樣硬化中許多令人不快的炎性癥狀的發(fā)病機理。它在心臟病和癌癥的應答中也起著作用。由于這些原因，人們探索調(diào)節(jié)活性形式的TNF-α的產(chǎn)生、分泌或有效性的途徑，以此作為控制各種疾病的手段。
免疫系統(tǒng)的主要作用是抵抗外來入侵物如微生物引起的感染，保護機體。然而，它也可能會進攻機體的自身組織導致稱為自身免疫性疾病的病癥。一個機體的免疫系統(tǒng)對源于其它機體的組織的主動反應是被移植器官排斥后的有害原因。該系統(tǒng)對外來物質(zhì)的高反應性引起了有癥狀的變態(tài)反應，象哮喘，鼻炎和濕疹。
控制這些反應的細胞是淋巴細胞，主要是被激活的T淋巴細胞，并且這些細胞主導的病理炎癥應答直接依賴于它們轉運通過血管壁到達其靶組織和從靶組織轉運通過細胞壁的能力。因此，降低淋巴細胞粘附和通透血管壁的能力可以防止自身免疫性進攻，移植排斥和變態(tài)反應。這將代表一種新的、可能會產(chǎn)生與目前所用治療方法相比療效較好、付作用小的治療原則。
動脈粥樣硬化和脈管炎是血管發(fā)炎的慢性和急性病例。動脈粥樣硬化包括動脈內(nèi)膜增厚和發(fā)硬，導致冠心病、心肌梗塞、腦梗塞和外周血管疾病，并代表了西方發(fā)病率和死亡率的主要原因。從病理學上看，動脈粥樣硬化是逐漸和緩慢發(fā)展成的一種由脂肪和鈣質(zhì)沉淀引起的得體損害。纖維性組織的增多最終導致產(chǎn)生血管腔突然閉塞的急性癥狀。
人們已經(jīng)看到，TNF-α便于和促進人類免疫缺陷性病毒(HIV)在體外的復制(Matsuyama，T.etal.，J.Virol.(1989)63(6)2504-2509;Michihiko，S.etal.，Lancet(1989)1(8648)1206-1207)并能激發(fā)HIV-1基因表達，因此，它可能激發(fā)感染了HIV-1后的機體潛在的臨床AIDS發(fā)展(okamoto，T.etal.，AIDSRes.Hum.Retroviruses(1989)5(2)131-138)。
因此，TNF-α，象其中部分是TNF-α的炎性應答一樣，是一種好壞兼有的事?；蛟S在明白了它的生理功能之后，人們可以更好地理解炎癥作為一個整體的目的并洞悉在“TNF-α不足”和“TNF-α過量”下的情況。于是，如何最佳地設計一種合理而具體的涉及這種激素產(chǎn)生的疾病治療方案便唾手可得了。
2.2.肝素肝素是一種葡萄糖胺聚糖、一種多聚陰離子型硫酸化多糖，在臨床上作為一種抗血栓劑預防血凝。在動物模型中，肝素表現(xiàn)出降低自自免疫性T細胞到達其靶位的能力(Lider，O.etal.，Eur.J.Immunol.(1990)20493-499)。肝素以每天注射一次(小鼠5μg，大鼠20μg)的低劑量使用時，還顯示出抑制大鼠的實驗性自身免疫性疾病并在皮膚移植小鼠模型中延長同種移植鼠的存活(Lider，O.etal.，J.Clin，Invest.(1989)83752-756)。
在觀察了其作用后，認為其機理涉及到通過T淋巴細胞抑制對穿透血管壁所必需的酶，主要是乙酰肝素酶的釋放，所說的乙酰肝素酶能特異地進攻排列于血管的內(nèi)皮下胞外基質(zhì)(ECM)的葡萄糖胺聚糖部分(Naparstek，Y.etal.，Nature(1984)310241-243)。乙酰肝素酶的表達與自身免疫T淋巴細胞穿透血管壁的能力和在實驗性自身免疫性腦脊髓炎的疾病模型(EAE)中攻擊大腦的能力有關。
歐洲專利申請EP0114589(Folkman等)記述了一種抑制哺乳動物血管生成的組合物，該組合物中的活性藥劑基本上由(1)肝素或六聚糖(hexasaccharide)或更大的肝素碎片和(2)可的松或氫化可的松或氫化可的松的11-α異構體組成。根據(jù)該公開文本，肝素自身和氫化可的松自身是不起作用的;只有當二者結合時才給出所需的效果。雖然在該文獻中沒有證據(jù)表明血管生成與自身免疫性疾病之間存在聯(lián)系，但第5頁描述了血管生成與牛皮癬和關節(jié)炎是相關的，并指導使用每天25，000單位到47，000單位高劑量的肝素(即約160到310mg/每天)。
Horvath，J.E.等人(Aust.N.Z.J.Med.(1975)5(6)537-539)描述了亞抗凝血劑量的皮下肝素對早期腎的同種移植功能的效果。每日劑量較高(5000u或約33mg)，該研究的結果是亞抗凝血劑量的肝素對早期移植功能或移植存活沒有效果，然而它可能與增加的出血性并發(fā)癥有關。
Toivanen，M.L.等人(Meth.andFind.Exp.Clin.Pharmacol.(1982)4(6)359-363)測定了高劑量(1000u/鼠或約7mg/鼠)肝素對抑制大鼠的佐劑關節(jié)炎的效果，發(fā)現(xiàn)肝素加劇大鼠的佐劑關節(jié)炎。
申請?zhí)朠CT/AU88/00017、公開號為WO88/05301(Parish等人)的PCT專利申請描述了阻斷或抑制內(nèi)糖基酶活性，如乙酰肝素酶活性的硫酸化多糖類，該類糖用作抗(腫瘤)轉移和抗炎劑。肝素和肝素衍生物如過碘酸氧化的肝素和還原型肝素的使用劑量在每只大鼠每天1.6～6.6mg范圍，連續(xù)輸注給藥(對應于成年患者每人每天75～308mg)時具有微不足道的抗凝血活性，卻顯示出抗腫瘤轉移和抗炎活性。
肝素和乙酰肝素硫酸酯是密切相關的葡萄糖胺聚糖大分子物質(zhì)。這些多聚高分子的降解產(chǎn)物，被稱作低分子量肝素(LMWH)，它們在血液凝固系統(tǒng)中有著與其母體大分子物質(zhì)相同或更大的藥理作用。進一步說，因為它的范圍之廣盡管多聚物的基本雙糖亞單元、葡萄糖醛酸和N-乙?；咸烟前返牟煌耆蠛铣煞椒?，LMWH無論在大小上還是化學組成上它都將是一種異質(zhì)混合物(見Goodman和Gilman的ThePharmacologicalBasisofTherapeutics，8thEd.，(PergamonPress，NewYork，1990)pp.1313-1315)。本領域描述了由肝素獲得低分子產(chǎn)物的方法，該產(chǎn)物用作抗凝血劑。這些方法的探索使人們對這類產(chǎn)物在體內(nèi)的存留或其出血性付作用的程度操樂觀態(tài)度(見，如，Alpino，R.R.，等的美國專利5，010，063;Choay，J.，等的美國專利4，990，502;Lopez，L.L.等的美國專利4，981，955)。其它的文獻指出使用親和層析方法來獲得低分子量產(chǎn)物(見，如Rosenberg，R.D.等的美國專利4，539，398和Jordan，R.E.等的美國專利4，446，314)。
Psuja，P.(FolioHaematol.(Leipz)，(1987)114429-436)研究了異質(zhì)肝素與細胞表面之間相互作用的影響。Psuja報道發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞上有中等親和性LMWH(Dδ＝5.6μm)受體，但他斷定與受體結合的LMWH部分的上限量小于LMWH總量的1%。
其它的研究者證明了LMWH對各種類型的培養(yǎng)細胞的代謝的影響。Asselot-Chapel，C.等(Biochem.Pharmacol.(1989)38895-899和Biochem.Biophys，Acta，(1989)993240-244)報道LMWH引起培養(yǎng)的平滑肌細胞降低Ⅲ型膠原與Ⅰ型膠原之比率并減少纖維結合素的合成。Rappaport，R.等在美國專利4，889，808中教導LMWH能導致人的二倍體肺纖維細胞在沒有血清培養(yǎng)時通過促進組織血漿酶原激活因子和相關蛋白的分泌與LMWH作用。
已有報道LMWH對復合多細胞系統(tǒng)有影響。Folkman等和Lider等人在EPO申請0114589和J.clin.Invest.(1989)83752-756中對此進行了說明。另外，在公開的國際申請WO90/03791中Diferrante，N.教導了LMWH在變形的人淋巴細胞C8166(ALL)的培養(yǎng)物中抑制HIV再生的用途。然而，在本領域以前所作的LMWH對細胞代謝的作用的實驗研究中還沒有實驗認為異質(zhì)LMWH會產(chǎn)生拮抗作用。進一步地說，沒有研究表明或提出由于基本純的寡糖物質(zhì)的作用對細胞分裂素活性有調(diào)節(jié)作用。
本發(fā)明中公開了能夠調(diào)節(jié)哺乳動物的細胞分裂素活性的物質(zhì)，該物質(zhì)為大體上純的羧酸化的和/或硫酸化的寡糖，特別是，該物質(zhì)顯示出一致值(a)約為200，000%×(μg/gm)-1或更高的抑制性“R”值，該值是通過測定小鼠的實驗性DTH反應的相對抑制性的體內(nèi)生物分析法測得的，所說的小鼠是用從約0到2μg/mg小鼠的不同劑量的上述物質(zhì)處理過的;或(b)約為0.03%×(pg/ml)-1或更高的增加“R”值，該值是通過測定TNF-α相對活性的體外生物分析法測得的，TNF-α在有0至約1×107pg/ml不同濃度的上述物質(zhì)存在下由活性人體CD4+T細胞分泌的。優(yōu)選的物質(zhì)顯示的體外抑制性“R”值選自300，000、400，000、500，000、600，000%×(μg/gm)-1或更高。
進一步講，對活性TNF-α的分泌具有抑制作用的本發(fā)明的物質(zhì)另外可以顯示出至少約0.4%×(pg/ml)-1的抑制性R值，該值是通過測定TNF-α相對活性的體外生物分析法測得的，TNF-α是在有0到約1×107pg/ml不同濃度的上述物質(zhì)的存在下由活性人體CD4-T細胞分泌的。
在本發(fā)明的一種實施方式中，羧酸酯或寡糖的分子量不大于3000道爾頓，優(yōu)選范圍在約400到約2000道爾頓，最優(yōu)選的在約400到約1100道爾頓之間。通常抑制TNF-α活性(通過生物分析法測定，下文有更全面的描述)的本發(fā)明的物質(zhì)含有活性基本單元與雙糖有關的不同糖單元分子。然而，高達約10個糖單元(含有活性的基本雙糖單元)的較大的寡糖鏈也能抑制TNF-α的活性。另一方面，本發(fā)明的物質(zhì)，當它們起增加TNF-α觀測活性作用時，通常有兩種類型(ⅰ)分子量較高的低分子量分子凝集物，這些低分子量分子在非凝集狀態(tài)時顯示出抑制活性;和(ⅱ)失去了硫酸基團的雙糖或單糖亞單元(即至少發(fā)生了某些脫硫酸作用)。
當純化時，這些物質(zhì)或含有這些物質(zhì)的組合物基本上不含有產(chǎn)生相反或拮抗作用的其它物質(zhì)。因此，大體上純的顯示出抑制活性(“向下”調(diào)節(jié))的物質(zhì)不僅基本上不含其它物質(zhì)，而且通常也不含那些使能“向下”調(diào)節(jié)劑增高或延遲抑制活性的其它物質(zhì)。這種情況，當然與有增加力的物質(zhì)(即“上”調(diào)節(jié)劑)的情況相反，在后一種情況中則基本上不含其它的物質(zhì)，特別是那些“向下”調(diào)節(jié)或與增加相拮抗的物質(zhì)。
短語“調(diào)節(jié)作用”包括對影響細胞分裂素的體內(nèi)或體外有效性或導致的活性的向上調(diào)節(jié)或向下調(diào)節(jié)兩方面作用，細胞分裂素通常包括IL-1、IL-6、IL-8和特別是TNF-α。因此，本發(fā)明的組合物能對宿主的TNF-α的產(chǎn)生、分泌、TNF-α的胞外有效性、或宿主中TNF-α的活性形式發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。例如，但不希望受到理論的限制，本發(fā)明可用于誘導一種物質(zhì)、如蛋白質(zhì)的分泌，這種物質(zhì)可與TNF-α結合，改變它的構象并隨之影響其生物活性。在透過被激活的T細胞或巨噬細胞時，本發(fā)明的組合物可與特異的低聚核苷酸序列結合并影響轉運或翻譯過程，最終改變蛋白合成，這種情況也是可能的。該組合物也可通過與細胞表面受體結合來發(fā)揮作用。
為簡化以下討論，將作一些解釋，其中，對“活性TNF-α的分泌”或“TNF-α的活性”的調(diào)節(jié)的更廣泛意義上的理解是依附于包括導致它們的實際機理或本發(fā)明的物質(zhì)或組合物影響觀測的TNF-α活性的增高或抑制的實際方式的這些短語。
本發(fā)明的物質(zhì)包括可以從天然資源獲得的羧酸化的和/或硫酸化的寡糖，該天然資源包括活有機體。例如，從低分子肝素(LMWH)部分，以及被酶，如由動物(哺乳動物)或微生物(細菌)得到的乙酰肝素酶的作用降解的胞外基質(zhì)分離和精制出的活性物質(zhì)。還有，活性物質(zhì)的其它來源是酶處理的肝素(如，內(nèi)糖基化酶降解的肝素)。
因此，術語“大體上純的形式”意味著采用具體步驟從寡糖物質(zhì)中除去非活性組份或具有相反作用的組份，并從混合物或上清液(如從酶降解得到的)分離活性部分或多個活性部分。具體地說，本發(fā)明權利要求的物質(zhì)是從嚴格的層析方法得到的，在此層析方法中低壓篩分凝膠層析(即Sephadex柱層析)只是精制流程圖中的起始步驟。隨后用低壓分離、高壓液相層析(HPLC)技術分離各個組份的寡糖。在各個活性物質(zhì)的精制中，優(yōu)選的這些步驟得到了基本上單一的組份。
這樣一種優(yōu)選的精制步驟可以包括，例如使含有活性物質(zhì)的混合物(如，從低壓凝膠層析得到的餾份)通過凝膠滲透HPLC或強陰離子交換(SAX)HPLC柱。這樣，就能觀察到和分離出含有選自雙、三、四、五或六糖，優(yōu)選雙糖的寡糖物質(zhì)。本發(fā)明的寡糖被羧酸化和/或硫酸化，因此，帶有負電荷。本發(fā)明特定的實施方式優(yōu)選包括含有三個負電荷基團的雙糖。那些顯示出特異性抑制活性的雙糖擁有的分子量范圍為約400到約2000，優(yōu)選約400到1100。
本發(fā)明也提供一種生物分析法，該方法用于定量測定測試物質(zhì)對活性TNF-α分泌的影響。該生物分析法包括如下步驟在含有不同濃度的測試物質(zhì)的培養(yǎng)基中預先培養(yǎng)人體CD4+T細胞，加入一恒定量的激動劑，該激動劑在沒有上述測試物質(zhì)的存在下能通過T細胞有效地誘導TNF-α的分泌，在足夠的一段時間后收集該培養(yǎng)物，并測定培養(yǎng)物中TNF-α的活性。優(yōu)選的人體CD4+T細胞是從外周血中單核白血球得到的。適宜的免疫效應細胞激動劑包括T細胞特異抗原、分裂素、巨噬細胞激動劑、殘余胞外基質(zhì)(RECM，在下面的第四部分中定義)、昆布氨酸、纖維結合素等，但不局限于這些。
本發(fā)明依賴于通過下文中更具體描述的體外和體內(nèi)生物方法測定的特定物質(zhì)的特異調(diào)節(jié)活性。簡要地說，用于本發(fā)明的物質(zhì)顯示出調(diào)節(jié)(或抑制或增強)與劑量依賴的活性TNF-α分泌的誘導有關的活性。就是說，百分抑制或增加對劑量(如，pg/ml物質(zhì))的圖給出了鐘形曲線，由此很容易看出最大百分抑制率(Inhmax)或增加率(Augmax)。因此，對這樣的圖上的每一點，都可以算出百分抑制或增加和其濃度或劑量之間的“比率”。在這種情況下，從最大百分抑制率或增加率(即Inhmax或Augmax)和測試物質(zhì)的濃度或劑量的比率得出“特異調(diào)節(jié)活性”或“R”值，它們給出了這種最大百分調(diào)節(jié)數(shù)值。更進一步地講，每次生物分析能夠得出一個“R”值。因此，“R”值可與體外小鼠脾細胞分析、離體內(nèi)(ex vivo)小鼠脾分析、體外人PBL分析和基于實驗性DTH反應的體內(nèi)分析相聯(lián)系。如果未測得影響，指定“R”值為零。
本發(fā)明的另一個目的是一種調(diào)節(jié)哺乳動物體內(nèi)細胞分裂素活性的方法，該方法包括給上述動物施用能有效抑制或增加上述動物體內(nèi)細胞分裂素活性的量的物質(zhì)，上述物質(zhì)含有基本上純凈的羧酸化的和/或硫酸化的寡糖，并且該物質(zhì)顯示出一致值(a)非零的抑制性“R”值，該值是通過如下列方法測得(ⅰ)由體外生析分析法測得，即在0-約1×107pg/ml不同濃度的上述物質(zhì)存在下，測定由活性人體CD4+T細胞分泌的TNF-α的相對活性，和/或(ⅱ)由體內(nèi)生物分析法測得，即測定小鼠的實驗性DTH反應的相對抑制性，所說的小鼠是用從約0至2μg/m小鼠的不同劑量的上述物質(zhì)處理過的;或(b)非零的增加性R值，該值由體外生物分析測得，即在0-約1×107pg/ml不同濃度的上述物質(zhì)存在下，測定由活性人體CD4+T細胞分泌的TNF-α的相對活性。
本發(fā)明還有另外一個目的是使用該活性物質(zhì)制備用于治療宿主的藥物制劑的方法，該方法包括將該物質(zhì)與藥用載體混合得到單位劑量、優(yōu)選低劑量的藥劑，該藥劑含有有效量的該物質(zhì)。該藥物制劑也可以含有穩(wěn)定劑，如魚精蛋白，穩(wěn)定劑的量應足以使該物質(zhì)在較長的一段時間后仍保持絕大部分起始活性(即使不是幾乎全部的話)，如約3天后仍為約100%。保存溫度應低于室溫，如約-10到約10℃，優(yōu)選4℃，此溫度下，更高的起始活性得以保持，時間長達約4個月。
由于考慮到本發(fā)明的藥物組合物施用于人類，故該藥物組合物優(yōu)選無菌的。通過本領域普通技術人員已知的方法來完成滅菌，這些方法包括使用無菌組份、加熱滅菌或使該組合物通過無菌過濾器。
有一點是明顯的，這就是本發(fā)明的一個主要目的提供一種治療宿主，如哺乳動物體的方法，該宿主患有病癥，該癥狀的嚴重程度能影響宿主的細胞分裂素的活性，上述治療方法包括給這類宿主施用有效量的含有大體上純的本發(fā)明的寡糖的活性物質(zhì)或由此制得的藥物組合物。根據(jù)具體宿主的病癥，可以施用或者降低TNF-α的有效性或活性，或者相反地促進TNF-α的誘導或提高其活性的物質(zhì)或組合物。這類組合物或藥物制劑可以以低劑量、間隔5-8天施用一次，優(yōu)選一周一次。依方便和有效及普通專業(yè)人員用常規(guī)實驗法很容易確定的劑量，可以每天使用含寡糖(如，單、雙、三、或四糖，優(yōu)選含有雙糖)物質(zhì)的藥物組合物，該組合物用于經(jīng)非胃腸道使用、口服或局部給藥。
本發(fā)明還涉及用于預防和/或治療涉及誘導活性TNF-α分泌的疾病的藥物制劑，該制劑含有可藥用載體和以用于間隔5-8天服用的低有效劑量存在的低分子肝素(LMWH)，該LMWH能通過靜止的T細胞和/或巨噬細胞對T細胞特異抗原、分裂素、巨噬細胞活激因子、殘余胞外基質(zhì)(RECM)、昆布氨酸、纖維結合素等的應答反應來體外抑制活性TNF-α的分泌。
在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，其藥物制劑中的LMWH的平均分子量為約3，000到6，000，并且可以在每個第五天或第七天施用一次。
提供一種間隔5-8天使用的藥物制劑來預防和/或治療涉及誘導活性TNF-α分泌的疾病，這也是本發(fā)明的一個目的，該藥物制劑含有可藥用載體，和以低有效劑量存在的低分子量肝素(LMWH)。
本發(fā)明的活性物質(zhì)和組合物能抑制因使用抗原而引起的實驗性滯后型過敏反應(DTH)，將在對皮膚施用該物質(zhì)或其藥物組合物后約5到7天施用抗原觀察到的皮膚硬化的減輕與對皮膚未施用或施用該物質(zhì)或其組合物但藥效已過后再施用抗原的情況進行比較，結果證實了這一點。使用的抗原的例子包括破傷風、髓磷脂基蛋白、精制的蛋白衍生物、噁唑酮等，但不能限于這些。
進一步地說，本發(fā)明的目的是提供一種可以根據(jù)具體應用已知的任何方式施用的組合物或藥物制劑，這些方式包括內(nèi)服(包括口服或直腸給藥)或經(jīng)非胃腸道施用(包括局部或在霧化劑的協(xié)助下吸入給藥)。優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的藥物組合物是口服、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥。
因此，本發(fā)明用于例如延遲或預防同種移植排斥反應以及治療或預防多種疾病，例如那些與免疫性相關的疾病，變態(tài)反應性疾病，炎癥(特別是炎性腸疾病)、或后天免疫缺陷綜合癥(AIDS)。還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明可用于治療Ⅰ型糖尿病、牙周病、皮膚病、肝病、葡萄膜炎、風濕性疾病(特別是風濕性關節(jié)炎)、動脈粥樣硬化、脈管炎或多出血癥。
更進一步地，本發(fā)明通過施用本發(fā)明的物質(zhì)來增加活性TNF-α的分泌而在腫瘤、病毒感染和細菌感染中發(fā)揮作用。腫瘤治療的實例包括乳腺、結腸和前列腺癌，還有淋巴癌和其它基底細胞癌的治療，但不限于這些。細菌感染治療包括白喉、鏈球菌(感染)、肺炎、淋病、麻風病和結核的治療，但不限于此。相似地，能用本發(fā)明治療的病毒感染包括流感、肝炎、胃腸炎、單核細胞增多癥、細支氣管炎和腦膜炎，但不限于這些。
本發(fā)明特定的藥物組合物中存在有低有效劑量的指定的LMWH活性物質(zhì)。典型的，該藥物組合物含有少于5mg這樣一個低的劑量單位的LMWH活性物質(zhì)，優(yōu)選約0.3到約3mg，更優(yōu)選含有1到1.5mg的一個低劑量單位。
本發(fā)明也泛泛地考慮到一種使用低分子量肝素(LMWH)來制備藥物組合物的方法，該低分子量肝素能通過靜止的T細胞和或巨噬細胞對免劑效應細胞激動劑的應答來抑制體外活性TNF-α的分泌，上述藥物組合物以間隔達約5～8天給藥一次，用于預防和/或治療涉及誘導TNF-α分泌的病癥，該方法包括將低有效量的LMWH與可藥用載體混合。
本發(fā)明的另外一個目的涉及提供本發(fā)明的活性物質(zhì)來源的方法，該方法包括分餾低分子量肝素、酶降解天然肝素(DH)或酶降解胞外基質(zhì)(DECM)。
本發(fā)明還有另外的目的就是提供一種治療主體或宿主所患與誘導活性TNF-α分泌有關的病癥的方法，該方法包括給此類主體或宿主施用如上述的藥物組合物，以間隔約5-8天，優(yōu)選一周給藥一次。如上進一步所述，含有活性寡糖的藥物組合物也可以每天給藥或最多每周間隔給藥。
本發(fā)明也提供一種抑制活性TNF-α產(chǎn)生的藥物組合物，它含有式(Ⅰ)的雙糖或其可藥用鹽以及可藥用載體，
其中X1為氫或硫酸基(sulfate);X2為氫或硫酸基;且X3為硫酸基或乙酰基，假如X3為硫酸基，則X1或X2的至少一個為硫酸基，并且如果X3是乙?；?，則X1和X2均為硫酸基。特別是，該藥物組合物可以含有一種雙糖，該雙糖為2-O-硫酸基-4-脫氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-硫酸葡糖胺、4-脫氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-硫酸基-6-O-硫酸葡糖胺、2-O-硫酸基-4-脫氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-硫酸基-6-O-硫酸葡糖胺、或2-O-硫酸基-4-脫氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-乙?；?6-O-硫酸葡糖胺。
本發(fā)明還構思一種增加活性TNF-α產(chǎn)生的藥物組合物，該組合物含有4-脫氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-乙酰葡糖胺或其可藥用鹽及可藥用載體。這類藥物組合物當然可以采用各種給藥方式，這些給藥方式包括經(jīng)非胃腸道給藥、口服給藥或局部給藥，但不限于這些。
更進一步地說，提供了一種抑制活性TNF-α產(chǎn)生的藥物組合物，它含有一種N-硫酸化或N-乙酰化的4-脫氧-4-烯-葡糖醛酸葡糖胺或其可藥用鹽。此類化合物，如果是N-硫酸化的，在另外至少具有另一個硫酸基團，如果是N-乙酰化的，應至少具有兩個硫酸基團。應注意的是，由于令人感興趣的雙糖中特定的“糖醛”酸部分的不飽和性(即在C-4與C-5間的雙鍵，所以不存在與六元環(huán)平面中所必需的C-6羧基相關立體化學問題。因此，當C-4和C-9間有雙鍵存在時，艾杜糖醛酸與葡糖醛酸相同。因而，術語“糖醛”酸的意義包含葡糖醛酸或艾杜糖醛酸。同樣地，“糖酮”(“urono”)基可以理解為艾杜糖酮(idurono)或葡萄糖酮基(glucurono)。
還有，本發(fā)明的另一方面涉及一種用于增加活性TNF-α產(chǎn)生的藥物組合物，它含有非硫酸化的N-乙?；?-脫氧-4-烯-葡糖醛酸葡糖胺或其可藥用鹽及可藥用載體。
本發(fā)明還考慮到了一種抑制主體中活性細胞分裂素產(chǎn)生的方法，該方法包括給該主體，例如哺乳動物(象人類患者)施用有效量的式(Ⅰ)的雙糖或其可藥用鹽，
其中X1為氫或硫酸基;X2為氫或硫酸基;且X3為硫酸基或乙?；?，假如X3為硫酸基，則X1或X2的至少一個為硫酸基，并且如果X3是乙酰基，則X1和X2均為硫酸基。另一種涉及增加主體中活性細胞分裂素產(chǎn)生的方法包括給該主體施用有效量的雙糖，該雙糖為4-脫氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-乙?；咸前坊蚱淇伤幱名}。與本發(fā)明的目的相一致，這類方法包括每天或優(yōu)選每周施用各個化合物或其可藥用鹽。
也可以用上述方法來抑制或增加主體中活性細胞分裂素的產(chǎn)生，該方法包括給該主體施用有效量的本發(fā)明藥物組合物。
本發(fā)明也想到了使用N-硫酸化或N-乙?；?-脫氧-4-烯-葡糖醛酸葡糖胺或其可用鹽來制備預防或治療由TNF-α的不適當產(chǎn)生所致或與TNF-α的不適量產(chǎn)生有關的疾病的藥物組合物的方法，所說的化合物如果是N-硫酸化的應另外至少具有一個硫酸基團，如果是N-乙酰化的則應至少具有兩個硫酸基團。
還想到了使用非硫酸化的4-乙?；?-脫氧-4-烯-葡糖醛酸葡糖胺或其可藥用鹽來制備用于治療TNF-α過量產(chǎn)生而引起的病癥的藥物組合物。
同樣地，也提供了預防或治療由主體的活性細胞分裂素的不適當產(chǎn)生引起或與此有關的病癥的方法，該方法包括給該主體施用有效量的N-硫酸化或N-乙?；?-脫氧-4-烯-葡糖醛酸葡糖胺或其可藥用鹽，該化合物如果是N-硫酸化的，另外應至少具有一個硫酸基團;如果是N-乙?；膽辽倬哂袃蓚€硫酸基團。
還提供了治療主體中活性細胞分裂素產(chǎn)生增高導致的病癥的方法，該方法包括給該主體施用有效量的非硫酸化的N-乙?；?-脫氧-4-烯-葡糖醛酸葡糖胺或其可藥用鹽的化合物。此類治療在涉及自身免疫性疾病、腫瘤或某些形式的感染情況中特別有利，所說的感染包括由細菌、病毒或真菌誘導的那些感染。
本發(fā)明的其它目的涉及保護主體免受暴露于放射的有害影響的方法，該方法包括給該主體施用有效量的N-硫酸化或N-乙?；?-脫氧-4-烯-葡糖醛酸葡糖胺或其可藥用鹽，該化合物如果是N-硫酸化的應另外至少具有一個硫酸基團，如果是N-乙?；模瑧辽倬哂袃蓚€硫酸基團。典型地，給該主體在放射暴露前施用本發(fā)明的化合物。更為有利地，在放射治療期間可以利用該類公開化合物的放射保護性質(zhì)。
并且，考慮到了抑制同種移植排斥的方法，該方法包括給該主體施用有效量的N-硫酸化或N-乙?；?-脫氧-4-烯-葡糖醛酸葡糖胺或其可藥用鹽，該化合物如果是N-硫酸化的應另外至少具有一個硫酸基團，如果是N-乙酰化的，應至少具有兩個硫酸基團。同種移植當然包括器官移植，器官移植包括以及、肝、腎或骨髓移植，但不限于此。該公開的方法也可用于皮膚移植。
還有，另一個目的涉及一種抑制主體中粘合分子的表達的方法，該方法包括給該主體施用有效量的N-硫酸化或N-乙?；?-脫氧-4-烯-葡糖醛酸葡糖胺或其可藥用鹽，該化合物如果是N-硫酸化的應另外至少具有一個硫酸基團，如果是N-乙?；?，應至少具有兩個硫酸基團。這類粘合分子的實例包括ICAM-1或ELAM-1，但不限于此。
還分開了一種用于定量測定測試物質(zhì)對活性TNF-α分泌的影響的生物分析方法，該生物分析法包括如下步驟在含有不同濃度的測試物質(zhì)的培養(yǎng)基中預先培養(yǎng)人體CD4+T細胞，加入一恒量的激動劑，該激動劑在沒有上述測試物質(zhì)的存在下能通過T細胞有效地誘導TNF-α的分泌，在足夠的一段時間后收集該培養(yǎng)物，并測定培養(yǎng)物中TNF-α的活性。
對本領域專業(yè)人員來說，在進一步閱讀了下列公開內(nèi)容后，本發(fā)明另外的目的就十分清楚了，下文的公開內(nèi)容包括對本發(fā)明具體實施方式
的詳細描述。


圖1說明了由用不同劑量的Fragmin治療的大鼠組與僅接受磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的對照組比較得到的佐劑關節(jié)炎(AA)評分。
圖2說明了由以不同服法(包括單次治療、每日治療、間隔五天和每周一次的治療)接受不變的20mg劑量的Fragmin的大鼠組得到的AA評分。
圖3比較了每周施用Fragmin與肝素的有效性和對照組(PBS)兩者的有效性。
圖4說明了每天施用Fragmin、肝素或PBS的效果。
圖5說明了由以不同低分子量肝素(包括Fraxiparin、Fraxiparine和Lovenox)每周或每天治療的小鼠組得到的AA評分。
圖6描繪了進行同種異體心臟移植并接受每周施用Fragmin或PBS的大鼠存活率的百分比。
圖7表示了說明兩組NOD小鼠的血糖水平的棒條圖，其中一組接受Fragmin，另一組則僅接受PBS。
圖8說明了包括人類自愿者的一次DTH實驗結果。
圖9描述了“鐘狀”劑量對用活性Fragmin表示的反應曲線。
圖10說明了以失活的Fragmin表示的抑制活性的喪失。
圖11顯示了由凝膠過濾失活的Fragmin得到的不同餾份(包括餾份F2、F8、F10和F15)在206納米處的吸收。
圖12，12A和12B分別描述了不同劑量的活性Fragmin、餾份F15和餾份F10對于小鼠對DTH反應的敏感性的影響。
圖14說明了從Sepharose4B柱分離Fragmin和乙酰肝素酶降解的ECM得到的多種餾份，其組號與在206納米的吸收的關系。
圖13和15比較了由Sepharose4B柱分離Fragmin和乙酰肝素酶降解的ECM得到的餾份的洗脫曲線。
圖16表示一種寡糖產(chǎn)物(圖13中的餾份5)，其在其抑制活性TNF-α分泌的能力中證明了相似的鐘狀劑量/反應曲劑。
圖17表示抗TNF-α作用的最大面積在5.65和5.8間的亞級餾分。
圖18A和18B分別描述了從HPLC分離Fragmin和乙酰肝素酶降解的ECM得到的層析譜。
圖19描述了由Sepharose4B柱分離乙酰肝素酶降解得到的兩組餾份F5和F8在206納米的吸收。
圖20A和20B分別在另一方面描述通過HPLC分離餾份F5得到的一個峰(餾份)在206和232納米的吸收。
圖21A和21B說明了從餾份F5得到的其它HPLC餾份的UV吸收。
圖22描述了由Sepharose4B柱分離乙酰肝素酶降解的ECM得到的餾份F7和F8的UV吸收。
圖23描述了從混合的餾份F7和F8的SAX-HPLC層析得到的大體上純的峰L餾份)。
圖24描述了脫鹽制備圖23中標志為“1”的峰餾份得到的另一個峰標志“A23/4”的峰。
圖25A、25B和25C分別描述了由Sigma標志的H-0895、H-1020和H-9267的雙糖標準物經(jīng)SAX-HPLC柱分離得到的層析譜。
圖26說明了從用乙酰肝素酶(MM5)處理的肝素提到的混合物的Sepharose4B柱的分離，得到餾份F7和F8。
圖27說明了從單獨的PC3乙酰肝素酶和肝素+PC3的Sepharose4B層析得到的各種餾份在206納米的吸收。
圖28A和28B描述了HPLC分離圖26中的餾份F7得到的其它餾份。
圖29描述了從HPLC分離Fragmin得到的餾份F90。
圖30在另一方面描述了SAX-HPLC分離陳放的A23/4樣品得到的層析譜。
圖31描述了從HPLC層析(如圖23所示)得到的ECM-衍生的雙糖的20微克樣品的質(zhì)子NMR圖譜。
圖32描述了圖31的樣品的二維Cos圖譜。
圖33描述了圖31NMR圖譜的放大部分，它顯示了異頭質(zhì)子的信號。
圖34和35描述了兩種分離的樣品的FTIR光譜，其中一個樣品表明有硫酸化化合物(圖34)，另一個表明存在有部分脫硫的類似物(圖35)。
圖36A描述了得自圖23的樣品的甲基化衍生物在包含DTT∶硫甘油(1∶1)的溶劑系統(tǒng)中的質(zhì)譜。
圖36B描述了僅僅有溶劑系統(tǒng)的質(zhì)譜。
圖37A和圖37B描述了相同的樣品在不同的溶劑中的質(zhì)譜，該溶劑為甲基硝基苯甲醇，圖37A為該樣品加該溶劑的質(zhì)譜，圖378為僅有該溶劑的質(zhì)譜。
圖38說明了比較雙糖9392和1020對提高患實驗誘導的佐劑關節(jié)炎的雌性Lewis大鼠的AA評分的影響的實驗結果。
圖38A說明了雙糖0895對患實驗誘導的AA的大鼠與對照鼠(PBS)的AA評分的影響比較。
圖38B說明了在不同劑量下的葡糖胺處理對提高Lewis大鼠的AA評分的影響。
圖38C相似地顯示了不同劑量的葡糖胺對Lewis鼠的AA評分的影響。
圖38D和38E說明了用雙糖9392進行的進一步的實驗結果，該實驗中每周或每天施用雙糖，在第0天(即，開始誘導AA時)或第12天(即，大鼠已患AA時)開始給藥。
圖38F和38G說明了一系列不同的有比較性的實驗結果，該實驗是用Lewis大鼠組測定每周施用的雙糖9392對實驗誘導的佐劑關節(jié)炎的抑制效果，并將該結果與已知的抗炎劑、磷酸地塞米松對實驗誘導的佐劑關節(jié)炎的抑制效果進行比較。
圖39說明皮下注射二糖1020對脂多糖(LPS)誘導的大鼠角膜炎的效果。
圖39A表示了涉及不同劑量葡糖胺的放射保護作用與對照(PBS)比較的實驗結果。
圖39B表示了相似的放射實驗，該實驗包括施用不同劑量的雙糖9392與對照(PBS)相比較。
圖40和40A說明了描述本發(fā)明所選擇的物質(zhì)對同種異體排斥的抑制能力的實驗結果。圖40所示結果顯示在移植前一天和移植后每周皮下注射了毫微克的雙糖9392，5天能延滯50%的皮膚移植排斥水平。然而，300毫微克劑量的相同的雙糖在5%的排斥中與對照(PBS)相比沒有產(chǎn)生明顯的差異。
圖41說明了分別以雙糖9392、葡糖胺或鹽水治療雌性NOD小鼠IDDM的效果。
圖41A表示分別用雙糖9392，葡糖胺或鹽水處理過的雌性NOD小鼠的死亡率。需要注意，在圖41和41A中，所有的雌性NOD小鼠均大約3個半月齡，就是說作為一個試樣組的小鼠已經(jīng)耐受了IDDM20%的發(fā)生率。
圖42表示了對用霧化的抗原刺激的六只已免疫的大鼠經(jīng)(B1、B2和B3)和不經(jīng)(A1、A2和A3)H-9392處理的呼吸抑制(RD)評分。詳見說明書。
圖43代表了由實施例6.23中合成路線制備的4-O-(2-脫氧)-6-O-硫-2-硫代氨基-α-D-吡喃型葡糖基)-(2-O-硫-β-D-吡喃葡糖苷)糖醛酸。
一方面，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)用低分子量肝素(LMWHs)治療抑制了的T細胞和巨噬細胞分泌活性TNF-α的能力。另一方面，本發(fā)明描述了大體上純的含有羧酸化和/或硫酸化的寡糖的其它物質(zhì)集中代表了一種調(diào)節(jié)宿主中細胞分裂素，如TNF-α生物活性的方法。為簡便起見，除非另有說明，用術語“物質(zhì)”或“活性物質(zhì)”來表示在本文公開的治療方法中所用LMWHs，以及本文中分離出的基本上純的羧酸化和/或硫酸化寡糖的物質(zhì)。
在小鼠和人的滯后型過敏反應(DTH)抑制中能看到該作用的功能性表達，T細胞依賴于炎性反應，該反應可以是包括巨噬細胞和其它炎性細胞激發(fā)的。用能影響活性TNF-α產(chǎn)生的劑量的活性物質(zhì)治療能夠抑制一種稱作佐劑關節(jié)炎(AA)的自身免疫性關節(jié)炎?；钚晕镔|(zhì)治療還延長了同種異體心臟移植鼠和取消了胰島素依賴的糖尿病metillus(IDDM)的NOD小鼠的存活。并且，類似的治療防止了通過T細胞和巨噬細胞對損傷的或殘余的內(nèi)皮下胞外基質(zhì)(RECM)，刺激物應答而誘導活性TNF-α產(chǎn)生。這種引起發(fā)出TNF-α誘導開始信號并導致炎癥的殘余內(nèi)皮下胞外基質(zhì)(RECM)與酶降解的胞外基質(zhì)(DECM)可顯著區(qū)別，本文中分離了酶降解的胞外基質(zhì)中的選擇組份，且看到這些組份或制止TNF-α活性或增加該活性。
因為血管損傷部位的TNF-α可能會在動脈粥樣硬化過程中發(fā)揮作用，所以抑制損傷的內(nèi)皮下ECM部位的TNF-α活性將改善動脈粥樣硬化的發(fā)病過程。用LMWH活性物質(zhì)進行治療的最令人吃驚的方面是此類治療當以低劑量隔周給藥時最有效。高劑量的LMWH活性物質(zhì)或每天給藥劑量的LMWH活性物質(zhì)對抑制TNF-α的分泌或免疫反應無效。
通過肝素的分餾或抑制解聚生產(chǎn)的低分子量肝素與肝素相比表示出增加的抗凝血作用和不同于肝素的藥代動力學特性就它們皮下注射后的抗凝血作用而言，其半衰期為肝素的二倍，且生物利用度較高(Bratt.G.等，ThrombosisandHaemostasis(1985)53208;Bone，B.等，ThrombosisResearch(1987)46845)。
依據(jù)本發(fā)明，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)LMWH活性物質(zhì)以亞抗凝血劑量隔數(shù)天給藥能對預防和/或治療與活性TNF-α的誘導有關的病癥有效。并且，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)能夠鑒別出含有1-10個糖單位，優(yōu)選2-4個糖單位的寡糖的分離的物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠抑制或增加TNF-α的活性。這些分離的物質(zhì)能夠從例如一個活有機體的組織如酶作用的胞外基質(zhì)的可溶性降解產(chǎn)物得到。
4.1.活性物質(zhì)的來源本發(fā)明使用的LMWH是從平均分子量為3000～6000的LMWH衍生來的，分子量為3000～6000的LMWH例如歐洲專利EP0014184中公開的LMWH。某些LMWH可以不同商標名如，F(xiàn)ragmin，F(xiàn)raxiparin
，F(xiàn)raxiparine
，Lovenox
/Clexane
商購。
LMWH可以用幾種不同的方式生產(chǎn)通過用乙醇分餾和/或分子篩如凝膠過濾或膜過濾存在于標準肝素中的LMWH和控制的化學(用亞硝酸、β-消除或高碘酸氧化)和酶(用肝素酶)的解聚法來富集?？梢孕⌒牡乜刂平饩鄣臈l件以獲得所需分子量的產(chǎn)物。通常使用亞硝<p>它含有鈣、鐵、鋅、銅、磷多種微量元素;
它還含有天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸賴氨酸等多種氨基酸。
本發(fā)明食品采用物理方法制成，其制作工藝流程是清洗葛根并去皮→破碎→清洗分離→一次沉淀→加水攪拌過濾→二次沉淀→
本發(fā)明食品經(jīng)湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)測試中心、武漢產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所、以及日本前忠株式會社檢測分析，其感觀指標、理化指標、衛(wèi)生指標均達到和超過類似食品的技術指標和質(zhì)量要求，它富含淀粉、蛋白、全糖和鈣、鐵、銅、鋅、磷等微量元素，以及十多種氨基酸，是一種營養(yǎng)豐富的滋補保健食品，據(jù)《本草綱目》和《中藥學》記載及臨床驗證，對頭痛發(fā)熱、口鼻生瘡、咽喉疼痛、脾虛瀉痢、祛風發(fā)散都具有較好的食療效果，它無污染、無藥害，鮮美可口，是一種很好的純凈天然保健食品。
本發(fā)明食品制作工藝合理，它不僅有效地從葛根中分離出其豐富的營養(yǎng)成份，使本發(fā)明食品達到和超過了類似食品的技術標準和質(zhì)量要求，而且工效高，勞動強度及生產(chǎn)成本較低，浪費也較少。
以下詳細說明本發(fā)明食品及其制作工藝過程。
本發(fā)明食品是以天然葛根為原料，分離制取葛根淀粉，經(jīng)湖北省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)測試中心分析，其感觀、理化、衛(wèi)生特性分別為表1、表2、表3所列
另一種用于分析本發(fā)明所用LMWH有效性的試驗是實驗性滯后型過敏(DTH)皮膚反應抑制實驗，所述反應為一種T淋巴細胞依賴的對多種抗原的反應(例如，破傷風抗原、髓磷脂基蛋白(MBP)、精制的蛋白衍生物(PPD)，和噁唑酮)。LMWH還抑制T細胞對ECM及其蛋白組份的粘著。
將依據(jù)本發(fā)明有效的LMWH引入藥物組合物，如可形成水溶液，該水溶液中可能含有氯化鈉、穩(wěn)定劑和其它適宜的非活性組份。優(yōu)選的給藥方式為注射、皮下或靜脈給藥，但本發(fā)明也包括其它任何適宜的給藥方式，包括口服給藥。
依據(jù)本發(fā)明，LMWH間約以多至約五到八天的間隔給藥，優(yōu)選每周給藥一次。本發(fā)明的其它物質(zhì)，特別是低分子量(低于2000)寡糖，可以以包括每天或每周給藥的劑量服法用任何方便、有效的方式(如、經(jīng)注射、口服或局部)給藥。
4.2.LMWH制劑隨時間的失活及加入穩(wěn)定劑的影響本發(fā)明人研究的時間過程實驗表明LMWH樣品如Fragmin，在室溫下72小時內(nèi)和低溫(如4℃)幾個月內(nèi)會喪失其抑制TNF-α活性的能力。
下面的6.1.部分中表Ⅺ說明在室溫一天后，F(xiàn)ragmin活性的53%喪失掉了。約二天后，其活性的87%喪失，約三天后，顯<claim>1、一種抑制活性TNF-α產(chǎn)生的藥物組合物，含有式(Ⅰ)的雙糖或其可藥用鹽以及可藥用載體，
其中X1為氫或硫酸基；X2為氫或硫酸基；且X3為硫酸基或乙?；?，假定X3是硫酸基，則X1或X2中的至少一個為硫酸基并且如果X3是乙?；?，則X1和X2均為硫酸基。</claim><claim>2、權利要求1的藥物組合物，其中所述的雙糖是2-O-硫酸基-4-脫氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-硫酸葡糖胺。</claim><claim>3、權利要求1的藥物組合物，其中所述的雙糖是4-脫氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-硫酸基-6-O-硫酸葡糖胺。</claim><claim>4、權利要求1的藥物組合物，其中所述的雙糖為2-O-硫酸基-4-脫氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-硫酸基-6-O-硫酸葡糖胺。</claim>10)。然而通過用Sapharose 4B固體載體的低壓篩分凝膠層析法(見圖11，206nm時吸收率與餾分組號關系圖)分離該失活物質(zhì)揭示了具有抑制(F-15)和增強(F8、F2)作用(見圖11和表ⅩⅢ)的活性餾份。失活的Fragmin中的抑制作用餾份(F-15)還抑制DTH反應(參見涉及活性Fragmin
的圖12;涉及餾份F15的圖12A和涉及餾份F10的圖12B)。餾份F10對TNF-α產(chǎn)生及DTH反應性沒有影響。
對由用乙酰肝素酶處理以含36S的硫酸基團標記的ECM得到的降解產(chǎn)物進行Sapharose 4B篩分凝膠層析分離。在此觀察中使用幾種類型的乙酰肝素酶。這些酶包括MM5(從Rad-Chemicals，Weizmann Industrial Park，Ness Ziona，Isreal購得，由人胎盤得到的哺乳動物乙酰肝素酶)，PC3(細菌的內(nèi)切糖苷酶，如文獻Shoseiov O.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.(1990).169667-672)的酶和一種得自細菌來源的酶，該細菌從IBEX Technologies，Quebec，Canada得到。圖13中表示了放射活性(CPM)對餾份組號的圖。另一個分餾Fragmin和分餾ECM-乙酰肝素酶的疊加的洗脫曲線圖可以在圖14中看到。下表Ⅰ中列出了Sapharose 4B低壓分離的條件。
表ⅠSepharose4B層析條件柱:Sepharose4B(35cm×0.7cmID)載量:1-1.5ml流速:5ml/hr溶劑:PBS(PH=7.4)餾分:0.2-0.5ml/管檢測器吸收設置:206nm,280nm分析各種餾份對TNF-α產(chǎn)生的影響，這些結果如下表ⅩⅤ所示。令人感興趣的是，發(fā)現(xiàn)從兩種來源得到的具有相似洗脫特性的餾分對TNF-α的產(chǎn)生和/或活性具有相似的定性生物效果。
圖15和13分別描述了一種代表從LMWH(Fragmin)和36S-硫酸酯標記的ECM寡糖的Sepharose 4B柱得到的洗脫曲線，后者是通過精制MM5乙酰肝素酶生產(chǎn)的。圖13中可以看到，ECM的乙酰肝素硫酸鹽被酶降解產(chǎn)生具有與分餾的LMWH可比的洗脫特性的乙酰肝素硫酸鹽碎片。
圖16顯示了一種寡糖產(chǎn)物(圖13，Sepharose4B餾份＃5)，該產(chǎn)物是由ECM+乙酰肝素酶“湯”(即，由乙酰肝素酶降解的ECM得到的混合物)，它在其對活性TNF-α的分泌的影響中同LMWH具有基本相似的劑量/反應特性就是說，二者都表現(xiàn)出鐘形劑量/反應曲線并且二者在約1pg/ml的濃度下顯示最大抑制都約為90%，且在更低或更低濃度時均表現(xiàn)出較低活性。這樣是十分有利的，即這些活性物質(zhì)的給藥包括了落在很容易確定的生理效果的“窗”內(nèi)的劑量。
圖17表示在圖13的第5號峰的碎片的亞級餾分(在約5.65到約5.80之間)范圍內(nèi)，ECM降解的產(chǎn)物具有最高的抗TNF-α作用。
因此，乙酰肝素硫酸鹽可以象LMWH通過乙酰肝素酶產(chǎn)生降解產(chǎn)物，該產(chǎn)生反饋于T細菌和巨噬細胞來阻斷活性TNF-α的產(chǎn)生，結果導致TNF介導的炎癥。
還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用內(nèi)切糖苷酶處理完整肝素得到的低分子量寡糖碎片對TNF-α活性表現(xiàn)出的調(diào)節(jié)作用。
4.4.由DECM和DH得到的LMWH餾分和碎片的HPLC分離利用高壓液相技術(“HPLC”)以從LMWH(如Fragmin)、降解的ECM和降解的肝素試樣獲得較好分離的餾分。開始時，使用兩種類型的HPLC條件。在第一組HPLC條件下，分離和離析多種單一的餾分;然后檢測這些餾分調(diào)節(jié)活性TNF-α分泌的能力。令本發(fā)明者感到極為吃驚的是發(fā)現(xiàn)所選的餾分能增加宿主中TNF-α的活性，而其它餾分抑制了TNF-α的活性。然后使用第二組HPLC條件，依據(jù)各組份的分子量來更好地分離各種組份。
細胞分裂素調(diào)節(jié)表
在第一種HPLC條件中，使用裝備有Guardcolumn Oligo(4cm×6mm I.D.)一根TSK-GEL G-Oligo-PW柱(30cm×7.8mm I.D.)。下表Ⅱ中給出了該條件(“HPLC I”)。在圖18A和18B中分明說明了用HPLC I分離Fragmin和ECM+MM5乙酰肝素酶的具有代表意義的層析。
表ⅡHPLC層析條件柱:TSK-GELG-oligo-PW30cm×7.8mmID保護柱:Guardcolumnoligo4cm×6.0mmID循環(huán)(LOOP)200μl流速:0.5ml/min展開溶劑:0.2M磷酸鹽緩沖液(PH=7.0)餾分:0.5ml/管檢測器吸收設置:190nm～400nm下表Ⅲ中描述了第二種HPLC條件(“HPLCⅡ”)，且采用的條件與Pice，K.G.等在AnalyticalBiochem.((1985)150325-331)中描述的那些條件相似。因此，在系統(tǒng)中使用兩根串聯(lián)連結的柱一根ToyoSodaTSK-GELG3000SW(7.5mm×50cm)柱與一根G2000SW(7.5mm×50cm)柱相連。這些柱從Phenomenex公司得到的，它們與一根7.5mm×10cm的保護柱一起和G2000柱的入口端相連。在下面的6.11、6.14和6.15中描述了進一步實驗的細節(jié)。
表ⅢHPLCⅡ層析條件柱:串聯(lián)的ToyoSodaTSK-GELG3000SW(50cm×7.5mm)ID)和G2000SW(50cm×7.5mmID)保護柱:Guardcolumn(10cm×7.5mmID)循環(huán):20或100μl流速:1ml/min展開溶劑:脫氣的0.5MNaCl餾份:0.5ml/管檢測器吸收設置:205nm,232nm在這些條件下，較小分子的停留時間比較大分子的長。
在另一種HPLC條件下(“HPLCⅢ”)，在有強陰離子交換(SAX)HPLC柱的協(xié)助下檢測了選擇的脫鹽HPLC餾分的純度。此類SAX-HPLC柱已知是根據(jù)分子中存在的帶負電荷基團數(shù)目來分離相似大小的分子。在物質(zhì)中帶負電荷基團數(shù)目越多，它在柱中停留的時間越長。下表Ⅳ中列出了HPLCⅣ條件。
表ⅣHPLCⅢ層析條件柱:SAX-HPLC柱(25cm×4.6mmID,用Spherisorb裝填,顆粒大小為5μm)循環(huán)1ml流速:1.5ml/min展開溶劑:線性梯度,下餾分:1ml/管檢測器吸收定位:205nm,232nm線性梯度(見下面的6.15部分)在考慮了本文的公開內(nèi)容后，對本領域普通專業(yè)人員來說，考慮并應用其它HPLC條件來分離和精制本發(fā)明的活性物質(zhì)，這一點也是顯而易見的。特別是，也可以采用十分有利的反相條件。例見Rice.K.G.等人的supra。
再次，不囿于理論，猜測TNF-α活性的增加是由于增加胞內(nèi)活性TNF-α的產(chǎn)生、提高由宿主免疫應答細胞分泌的活性TNF-α的量或通過興奮劑的作用增加發(fā)細胞分裂素的活性。
還認為通過相反的過程可以抑制TNF-α的生物活性，該過程不僅包括活性抑制物質(zhì)產(chǎn)生的對TNF-α受體的競爭(如，用作或誘導其他用作TNF-α拮抗劑的物質(zhì)產(chǎn)生的抑制性物質(zhì))而且還包括TNF-α和抑制性物質(zhì)的復合物的形成，所說的抑制性物質(zhì)的活性低于游離的TNF-α。另外，認為TNF-α和增加性物質(zhì)的“燴合”復合物或許是TNF-α活性增加的原因。
4.5.活性測定本發(fā)明的能抑制TNF-α活性的和能增加TNF-α活性的活性物質(zhì)，都能從含有它們的混合物分離和純化出來。在某些情況下，這些活性物質(zhì)經(jīng)本文所述的有力的HPLC技術提純?yōu)榛旧蠁我坏某煞荨?br> 作為對這些物質(zhì)純度的進一步說明，測定了各種物質(zhì)的特定調(diào)節(jié)活性。然而，起初采用咔唑分析法來測定在給定樣品中的寡糖物含量(如糖的存在量)，該咔唑分析法以相似于Carney，S.L.在ProteoglycanAnalysis，APracticalApproach及Chaplin，M.F.和Kenneday，J.F.(Eds.)IRLPress，Oxford，Washington，D.C.(1986)P.129中公開的方式進行。以該方式可以測定微微克糖量。該分析法的過程如下面的第5部份所述。
下一步是用一種生物分析法來測定與該物質(zhì)量相關的表觀活性而得到劑量/反應圖，所述分析方法在下文第5部分中有更詳細的描述。這些生物方法可以在體外或體內(nèi)條件下進行。
于是發(fā)現(xiàn)觀察到的對TNF-α活性的抑制或增加依賴于測試樣品中存在的此類物質(zhì)的濃度或劑量，TNF-α活性的增加或抑制表示為沒有本發(fā)明的物質(zhì)存在下的TNF-α活性百分數(shù)。由此得到的表觀活性輪廓圖大約象圖9和16中描述的鈴狀。觀察到的每種物質(zhì)的百分抑制或增加的最大值可以用Inhmax或Augmax表示，視情況而定。
如下文進一步所述，用于建立“理想”單位劑量(即，對應于Inhmax或Augmax的劑量)的生物分析法可以以體外或小鼠體內(nèi)抑制或增加TNF-α活性或DTH分析為基礎。另外，可以使用基于人細胞(如下文詳述)的體外分析法。如本文定義的，特定的抑制活性或“R”值是Inhmax或Augmax與產(chǎn)生最大百分抑制或增加的“理想”劑量的比率。對體外分析法，該“R”值典型地以%×(pg/ml)-1表示。
如上所述，特定抑制活性也可以在體內(nèi)條件下通過測定對小鼠或人的實驗性DTH反應的抑制來建立。發(fā)現(xiàn)特定劑量的一種抑制性組合物抑制活性TNF-α分泌的能力與它抑制滯后型過敏反應的能力成正比，盡管同樣的組合物在一種分析方法中比另一種方法中即在體外和體內(nèi)分析方法間可能表現(xiàn)出更強的效力。在這種體內(nèi)細胞介導的炎性反應中，抑制或增加的活性是十分重要的，因為DTH反應是包括在自身免疫性疾病、移植排斥、某些類型的血管炎癥和過敏過程中的反映。因此，該測試的活性表示了它在這些類型和可能的其它疾病中的有效性，如下文詳述。
而且，新的定量的特定調(diào)節(jié)活性可用于區(qū)分本發(fā)明的新的活性物質(zhì)和那些已知的本文分開的但并未被本領域認為是具有細胞分裂素調(diào)節(jié)活性的物質(zhì)，特定的抑制活性定義為Inhmax或Augmax與產(chǎn)生最大百分值的物質(zhì)量或濃度(“理想”劑量)間的比率。簡單地說，該特定比率在本文是指“R”值。因此，可以以術語最低“R”值可能通過表觀活性與劑量曲線來計算，并且參考本公開文本的教導，該“R”值將超出與已知組合物相關的“R”值。
4.6.受益于本發(fā)明的疾病種類依據(jù)本發(fā)明能預防或治療與涉及活性TNF-α分泌的誘導的病理過程相關的所有疾病，包括動脈粥樣硬化和脈管炎及與此有關的病理過程;自身免疫性疾病，如類風濕關節(jié)炎，Ⅰ型糖尿病(胰島素依賴的糖尿病metillous或IDDM)、多出血癥、紅斑狼瘡、雷格夫斯病;過敏癥;移植排斥;急性和慢性炎性疾病、如葡萄膜炎、腸炎、神經(jīng)性厭食癥(anorexianervosa);由敗血癥引起的出血性休克及AIDS中的HIV感染。在AIDS中，活性物質(zhì)將抑制HIV的復制，由此來預防涉及AIDS的并發(fā)癥(ARC)的發(fā)展。其它受益于調(diào)節(jié)細胞分裂素活性的治療的疾病包括(但不限于這些)牛皮癬、天皰痤氣管炎、腎病、肝病、骨髓疾病、白斑、脫發(fā)和肌炎。
并且，活性TNF-α的增加還可用于治療腫瘤、細菌感染和病毒感染。本發(fā)明的增加活性TNF-α產(chǎn)生的物質(zhì)在可藥用載體中經(jīng)非胃腸道、口服或局部給藥也可幫助治療皮膚癌，例如基礎細胞癌、鱗狀細胞癌或黑素瘤。
在本發(fā)明活性物質(zhì)的臨床應用中，應該記住的是對某些類型疾病的成功治療在很大程度上是在于體內(nèi)平衡的恢復。對內(nèi)分泌學家而言，這就暗示了應謹慎給藥或有特定激素的拮抗作用。例如，胰島素依賴型的糖尿病可以通過胰島素替換療法得到有效治療;格雷夫斯患者可以通過抑制甲狀腺釋放的藥理方法而受益。只有很少的疾病可以通過服用本來并不缺乏的激素而得到緩解。
細胞分裂素，例如TNF-α作為抗腫劑的用途提供了一種此類例子。對癌癥病人，施用的免疫調(diào)節(jié)劑的比率是微不足道的。許多細胞分裂素，如TNF-α，在達到治獲目的很久前就表現(xiàn)出具有劑量限制的毒性。在這種情況下，提高內(nèi)源性產(chǎn)生的TNF-α的活性可以提供一種比以前想到的治療方案更好且更有效的途徑。
很明顯，我們對TNF-α作用的理解是逐漸加深的，并且，毫無疑問，還將發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)節(jié)其活性的激素和物質(zhì)的新的、有益的用途。具體想到的那些減輕疾病癥狀、預防疾病發(fā)作或提供治病的用途都在本發(fā)明范圍之內(nèi)，更不用說權利要求的組合物和藥物制劑的全部用途了。
4.7.本發(fā)明的低聚糖物質(zhì)的局部應用本發(fā)明的物質(zhì)在局部給藥的組合物中也找到了用途，例如用于水腫或炎癥治療的那些制劑中。的確在遠超出單純的治療應用之外，本發(fā)明的物質(zhì)在化妝品組合物的增補保護作用方面也找到了利用性，例如用在防曬液或曬黑液之類的化妝品組合物中。幾乎沒有防曬制液在阻隔存在于電磁光譜的紫外區(qū)域的所有有害波長(例如290-320nm)方面完全有效。因此，過度地暴露于太陽中常導致形成太陽紅斑的急性病，并且延長、重復的暴露當然可以導致革質(zhì)皮膚或更嚴重可導致皮癌。
這樣，在化妝品制劑中，摻和本發(fā)明的活性物質(zhì)特別考慮到是用于防護和保護皮膚，以及緩和醫(yī)療狀況例如太陽紅斑。在防曬或曬黑制劑中，包含本發(fā)明的有效量的低聚糖和一般的防曬劑是有利的。通常，活性物質(zhì)的用量為給每公斤使用者提供約1μg-約100mg的劑量，優(yōu)選約0.01mg-約10mg，最優(yōu)選約0.1mg-約1mg。
所述化妝品組合物可包含本領域內(nèi)普通技術人員熟知的一些通用的組分，如Kirk-othmer，在EncyclopediaofChemicalTechnology，第三版(1979)，卷7，PP.143-176中所述的。在防曬制劑中，添加本發(fā)明的活性物質(zhì)提高了紅斑產(chǎn)生的最小劑量(MED)，因而提高了太陽保護因子(SPF)。具體組分包括典型的防曬劑在Kirk-othmer見上在PP.153-154中列出。此外，局部制劑和化妝品配制劑可以如U.S.專利4199576號，4136165號和4248861號描述的來制備，上述文獻本文將其全文引入作為參考。但是，本美容領域內(nèi)的普通技術人員會明白，得到的組合物可為各種各樣的形態(tài)，這些形態(tài)包括但不限于溶液、洗液、霜、膏、乳劑、噴灑劑或氣溶膠。
4.8.代表性的劑量用法按照本發(fā)明確立，造成TNF-α抑制、DTH活性產(chǎn)生或抑制至少達50%的每Kg施用LMWH的最低劑量，被認為構成12個鼠抑制單位/Kg(12u/Kg)。由于鼠與人體在表面積和新陳代謝方面的差別，人體應當用LMWH的較低劑量治療，所建立的鼠的12u/Kg相對應于人體的1u/Kg。例如，對TNF-α分泌和DTH反應性都能抑制的Fragmin
批號38609的有效劑量是每周施用5μg/鼠。由于每只鼠重約25g，相當于12u/Kg的Fragmin
38609的劑量是200μg/Kg鼠。因此，適用于人體的1u/Kg的劑量為200μg/Kg÷12＝16.67μg/Kg。那么，體重約70公斤的人，將要以約1.2mg劑量治療，每7天皮下注射一次該單一劑量。由于每個人的生物活性不同，因此最佳劑量可與約1.2mg有差別，一般低于5mg，優(yōu)選在0.3-3mg的范圍內(nèi)。
因此，將鼠的劑量用法轉換成人體劑量的粗略公式如下人體劑量/Kg＝鼠劑量/Kg÷10或12
大鼠(rat)的有效的LMWH劑量可按如下事實所導出，即每公斤大鼠的LMWH劑量是每公斤小鼠(mouse)的劑量的一半，即6u/Kg。例如，如果Fragmin 批38609的12u是200μg/Kg，那么適宜于大鼠的6u劑量就是100μg/Kg或20μg/200g大鼠，一周施用一次。
對本發(fā)明的大多數(shù)低聚糖物質(zhì)來說(它們已經(jīng)從LMWH、降解的肝素和降解的ECM分離出來)，下面是通過活體內(nèi)DTH生物測定來預計這些低聚糖物質(zhì)用于人體的有效劑量的一種方法。
圖12A示出了在活體內(nèi)分離出的部分(F15)，它以0.1-5.0μg/鼠/周的范圍抑制鼠體內(nèi)的DTH。由于我們的鼠體重25g，在活體內(nèi)的劑量大約是(0.1÷0.025Kg)4-200μg/Kg鼠/周(在活體外相當于0.01-10pg/mL)。
為了修正鼠類與人體之間表面積的差別，我們必須將鼠劑量/Kg除以12。
4-200μg/Kg鼠→0.33-16.67μg/Kg人體。
這樣，一個體重70Kg的人接受高達約1.2mg(約1200μg)的劑量。為確保我們能覆蓋各個人之間的差別，我們可以將這一劑量提高到約5mg，這個劑量值大大低于用來對凝固或血栓形成產(chǎn)生影響的類肝素(heparinoids)的任何劑量。因此，體重為70Kg的人的劑量將大約為5mg或少于5mg，優(yōu)選約3mg或少于3mg，更優(yōu)選1.5mg或少于1.5mg，而最優(yōu)選1mg或少于1mg。
實際上，對高度凈化過的本發(fā)明的材料來說，這包括已經(jīng)由HPLC色譜法制備的那些材料，優(yōu)選的劑量可能甚至更低。例如，二糖(下文將更詳細地描述)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)顯示出了抑制活性，當以約0.1μg-約0.5μg/Kg老鼠注射施用時。因此，對人體來說，使用純化的二糖估計該劑量大約為0.01μg-約0.05μg/Kg人體重，或對體重為70Kg的人劑量為約0.7μg-約3.5μg。那么，對體重為70Kg的人的劑量的一般范圍約是0.1μg-約100μg，優(yōu)選約1μg-約10μg，使用的是二糖。對已知的二糖“標記物”，劑量可以稍高，下文會進一步討論。
上述的有關劑量，可以每日施用數(shù)次或每天、每周一次，或甚至可以更大的間隔來施用，這取決于每個人的響應值。但是，對LMWHs來說，劑量間隔優(yōu)選是每周，如上所述的。
本發(fā)明將通過下面非限制性實施例來進一步描述。
5.僅使用LMWH(Fragmin)的實驗5.1.利用老鼠的脾臟細胞進行抑制活性TNF-α分泌的生物測定對在LMWH存在下、或無LMWH的情況下培養(yǎng)的脾臟細胞的上清液，或者在活體內(nèi)用LMWH處理鼠或未處理鼠來得到的脾臟細胞，分析它們分泌活性TNF-α的能力。TNF-α生物測定是根據(jù)TNF-α對放線菌酮(CHI)-敏感的細胞的細胞毒性的影響和通過中性紅吸收測定對它的定量分析來進行，參見WallachD.的描述，J.Immunol.(1984)1322464-2469。粗略地講，測量了由在細胞的上清液中存在的TNF-α殺死的CHI-敏感的海拉(HeLa)細胞的量，就可與外源添加TNF-α的滴定曲線相比較來確定上清液中TNF-α的濃度。細胞的(生)活(能)力按如下方式來確定，即用中性紅培養(yǎng)兩小時，洗去過剩的染料，被細胞吸收的中性紅用Sorenson's檸檬酸鹽緩沖劑-乙醇混合物來提取，并且用MicroelisaAutoreader在570nm處量熱法來定量它。
用LMWH處理過的鼠細胞按如下方式獲得BALB/C種的雌鼠(25克，2月齡)，每組至少5只，皮下注射不同劑量的LMWH，一般在0.5-20μg/鼠范圍。五天后，通過頸部錯位將鼠殺死，移出脾臟，放盡紅血細胞，脾臟細胞的懸浮液測定通過殘留的外細胞基質(zhì)(RECM)、伴刀豆球蛋白A(ConA)或脂多糖(LPS)誘導響應而產(chǎn)生的TNF-α。
5.2.在活體內(nèi)實驗DTH反應性抑制的生物測定鼠的近交的BALB/C(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)族或遠交(outbred)CD1(Weizmann Institute Animal Breeding Center，Rehovot，Israel)族用100μl的2%噁唑酮的丙酮/橄欖油(4/1，V/V)溶液局部涂敷刮過的腹部皮膚，使其敏感。五天后按如下方式得到DTH的敏感度鼠用20μl 0.5%OX(10μl局部施加到耳朵的每一側)的丙酮/橄欖油溶液進行免疫處理。在免疫前當時和24小時及48小時后，用Mitutoyo工程的測微計測量耳朵的一恒定區(qū)域。測量耳朵的腫脹的人不知鼠的組別。耳朵腫脹的增值(△)以10-2mm或10-4英寸(+SE)為單位的平均值來表示，這取決于所使用的測微計。抑制的百分數(shù)按下式計算%抑制＝1-( (處理過的-陰性對照)/(陽性對照-陰性對照) )鼠按實施例5.1用LMWH處理，在初步對OX敏感的前一天注射，在對OX敏感的第五天對鼠免疫以誘導產(chǎn)生DTH反應，如上所述。
陽性對照是免疫鼠沒有用LMWH處理所得的DTH反應。陰性對照是通過初次實驗(非免疫的)鼠的抗原產(chǎn)生的“底”腫脹。
5.3.活體外T細胞和巨噬細胞的TNF-α分泌的誘導Microtiter板制備如下將纖維蛋白(FN)或海帶氨酸(Laminin)(LN)(sigma)加入平底96-孔板(Contar)中，其濃度為每孔1μg/50μlPBS，在16小時后移出。保留的結合位置通過向孔中加入2小時的BSA/PBS(10mg/ml)封閉，然后清洗掉。
涂ECM的孔的制備如下牛的角膜的內(nèi)皮細胞在平底96-孔板中培養(yǎng)。內(nèi)皮細胞的融合層溶解，CM整體與細胞碎屑分離(Gospodarowicz，D.等.，J.Biol.Chem.(1978)2533736)。通過用27G注射器針頭輕輕地劃剌ECM三次來制備破裂的或殘余的ECM(RECM)，隨后暴露的部位用BSA/PBS涂敷。休止的克隆鼠CD4+T細胞(稱為K1)(它識別髓磷脂堿性蛋白(MBP))在培養(yǎng)液繁殖并維持，然后加入到孔中，每孔105個細胞，含或不含3×105同基因的脾的巨噬細胞，在每孔RPMI1640的100μl中，補加1%BSA和抗菌素。
利用專門的單克隆抗菌素(mAb)通過除去T和B細胞來凈化脾巨噬細胞。從Genzyme(Cambridge.MA)得到抗-鼠性的TNF-αmAb，并稀釋300倍。將這種稀釋溶液的10μl部分加入每個孔中。將MBP(100μg/ml)、conA(2.5μg/ml)、LPS(1μg/ml)、FN(5μg/ml)和LN(5μg/ml)加入指定的孔中。
板在37℃在一增濕培養(yǎng)器中培養(yǎng)三小時。隨后，收集孔中(每實驗組4個孔)的內(nèi)容物，離心分離，按5.1部分中的實施例所描述的對介質(zhì)進行活性TNF-α分泌的測定即將培養(yǎng)巨噬細胞和淋巴細胞的上清液加入海拉細胞的培養(yǎng)液中，海拉細胞對被TNF-α的殺死是敏感的，在試驗介質(zhì)存在下通過與添加外源TNF-α的滴定曲線比較來測定這些死細胞。通過預培養(yǎng)的海拉細胞釋出的中性紅染料檢查死細胞。這里示出了試驗結果代表了由產(chǎn)生基本上相似結果的六個試驗所得到的數(shù)據(jù)。
表Ⅴ表示通過與專門的抗原MBP(組4)、促細胞分裂劑ConA(組6)或LPS(組8)接觸，T細胞與巨噬細胞一起培養(yǎng)可以誘導分泌TNF-α。但是在缺乏抗原或有絲分裂刺激下，通過殘余的外細胞基質(zhì)(RECM;組10)或通過ECM組分、纖維蛋白(FN;組12)或海帶氨酸(LN組14)也可以誘導分泌TNF-α。完整ECM是TNF-α-弱的誘導劑(組16)。
表Ⅴ.通過專門的抗原MBP、ConA、LPS、RECM或ECM組分誘導T細胞和巨噬細胞分泌的TNF-α。
TNF-αKI細胞與(有)或沒有分泌的TNF組誘導劑(無)與巨噬細胞一起培育-α(pg/ml)1無無502有653MBP抗原無304有9505ConA無1206有13007LPS無508有15009RECM無3010有90011FN無2012有65013LN無5014有50015ECM無3016有120
5.4.通過LMWHs調(diào)節(jié)TNF-α的分泌按5.3段的描述制備T細胞和輔細胞的培養(yǎng)液。在細胞培養(yǎng)的開始就將LMWH加入孔中。在培養(yǎng)3小時后，檢查TNF-α的量。
表Ⅵ示出了通過專門的抗原(MBP;組4)促細胞分裂劑(ConA和LPS;組6和8)、RECM或ECM組分(組10、12和14)誘導的活性TNF-α的分泌在活體外存在LMWH(Fragmin 批號38609)下受到了抑制。由于被RECM誘導的TNF-α的分泌可能會引起動脈粥樣硬化，因此被LMWH抑制的TNF-α在動脈粥樣硬化中將是有益的。
表Ⅵ.在活體外誘導的TNF-α分泌的誘導由LMWH(Fragmin
批38609)所抑制。
5.5.用LMWH處理BALB/c鼠的活體外(EXvivo)實驗為了檢查將LMWH施用于鼠活體內(nèi)對活體外的脾臟細胞分泌TNF-α的影響，進行如下的實驗。
每組五只BALB/c鼠，用鹽水稀釋的不同劑量的LMWH(Fragmin
批號38609)處理，皮下注射。一周后，殺死受試動物，檢查它們的排盡紅血細胞的脾臟對應無RECM(A)的對照孔或用RECM(B)涂覆的孔的分泌TNF-α的能力。TNF-α分泌量的測量如5.1節(jié)描述的進行。表Ⅶ示出了實驗結果，結果表明7天前一次注射LMWH 5μg，使由RECM誘導的TNF-α的分泌受到了抑制。LMWH較高或較低劑量的效果較差。因此，LMWH的最佳劑量在一周前施用于活體內(nèi)是有效的。
表Ⅶ.對應于殘留的ECM由T細胞介導的TNF-α分泌的活體外(EXvivo)抑制。
由脾臟細胞引起的活體外的TNF-αBALB/c鼠的LMWH分泌(pg/ml),所述細胞培養(yǎng)于:
處理(每周)A.無B.殘留的ECM(%抑制)1無30400-20.5μg50380(5)31μg2590(78)45μg2560(85)510μg30140(65)620μg40320(20)
表Ⅷ示出了在抑制由LPS誘導的TNF-α的分泌中，在活體內(nèi)LMWH Fragmin
批號38609的5μg劑量也有效。BALB/c(每實驗組4只)用以鹽水稀釋的LMWH的標明的量處理，皮下注射。在一周后，給鼠腹膜內(nèi)注射10mg LPS，4小時后殺死，它們的脾臟細胞排盡紅血細胞后，在增濕的培養(yǎng)器中在RECM涂覆的孔中培養(yǎng)三小時。測量培養(yǎng)液的上清液中對應于RECM的TNF-α分泌的量。結果示于表Ⅷ。
表Ⅷ.用LMWH處理鼠來抑制由LPS介導的巨噬細胞活性TNF-α的分泌鼠的LMWH處理對應LPS的巨噬細胞活體外(μg)TNF-α的分泌(pg/ml)%抑制0690--0.15002813505051208220550205.6.利用各種LMWH來源的實驗為檢查不同的LMWH對抑制活性TNF-α分泌和對DTH響應的作用，鼠用標明的LMWH以不同濃度皮下施用處理。一周后，殺死其中的一些鼠，測量活體外應ConA的活性作用而誘導的活性TNF-α分泌(表Ⅸ)。剩余的鼠檢查它們對抗原噁唑酮響應的能力(表Ⅹ)。結果示于表中，以與對應的LMWH未處理的鼠相比較的抑制百分數(shù)給出。
考查表Ⅸ和Ⅹ中所示的結果，可以得出如下兩個結論1.不同批的LMWH，經(jīng)相似的抗凝血效應(因子Ⅹ測定)對每種LMWH檢測，它們對抑制活性TNF-α的分泌有不同的最佳劑量。甚至有些LMWH制劑，例如Clexane
批號4096對活性TNF-α的分泌在任何受試劑量時都沒有抑制效果。因此，可得出結論，LMWH制劑的抗凝血效果與它抑制活性TNF-α分泌的潛力無關。兩次不同的生物測定都是由制劑的不同的因子介導的。
2.特定劑量LMWH抑制活性TNF-α分泌的能力與它抑制DTH反應的能力毫無疑問地一致，抑制活性TNF-α分泌的LMWH制劑的最佳有效劑量也是抑制DTH反應的最佳有效劑量。
表Ⅸ.每周用不同的LMWH處理鼠抑制鼠的DTH的敏感性DTH抑制LMWH批號對應的DTH劑量"R"值(μg/gm mouse) (10-2mm) (%) %×(μg/gm)-1Fragmin批號38609無25(+)對照-2(-)對照-0.022112-0.042310-0.2673(最大)3650.4620-200-批號45389無28(+)對照-2(-)對照-0.004266-0.04489(最大)22250.22413-0.4266-2290-
表IX(續(xù))DTH抑制LMWH批號對應的DTH劑量"R"值(μg/gm mouse) (10-2mm) (%) %×(μg/gm)-1Clexane批號2088無22(+)對照-2(-)對照-0.0041723-0.04387(最大)21750.21341-0.4230-批號2066無23(+)對照-2(-)對照-0.0042013-0.04865-0.2770(最大)3500.4770-批號4096無24(+)對照-2(-)對照-0.0427無效果00.226無效果00.424無效果0
表Ⅹ.每周用不同的LMWH處理鼠抑制活體外(EXVivo)活性TNF-α分泌。利用鼠脾臟細胞的生物測定。
ConA-誘導的LMWH批號劑量TNF分泌抑制"R"值(μg/gm鼠) (pg/ml) (%) %×(μg/gm)-1Fragmin批號38609無450對照-0.024255-0.0440012-0.26885(最大)4250.435022-24358-批號45389無320對照-0.00428013-0.047078(最大)19500.226018-0.429010-23104-Clexane
表X(續(xù))ConA-誘導的LMWH批號劑量TNF分泌抑制"R"值(μg/gm鼠) (pg/ml) (%) %×(μg/gm)-1批號2088無400對照-0.00436010-0.046484(最大)22000.215238-0.43804-批號2066無350對照-0.0043386-0.0418554-0.219257(最大)2850.418655-批號4096無320對照-0.04335無效果00.2325無效果00.4330無效果05.7.用低劑量的LMWH治療老鼠的輔藥性關節(jié)炎(AdjuvantArthritis)(AA)輔藥性關節(jié)炎是在一些老鼠種系中可誘導的一種實驗病，是通過免疫接種結核分支桿菌而產(chǎn)生的(Pearson，C.M.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.(1956)9191)。這種實驗病被認為是人體風濕性關節(jié)炎的模型(Pearson，C.M.，ArthritisRheum.(1964)780)。關節(jié)炎似乎是由T淋巴細胞引起的，而T淋巴細胞認為是結核分支桿菌的一種抗原，該抗原與關節(jié)組織中的結構交叉反應(Cohen，I.R.，等.，ArthritisRheum.(1985)28841)。
Lewis鼠用在油中的結核分支桿菌(1mg)免疫接種，以誘導輔藥性關節(jié)炎(Pearson.C.M.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.(1956)9191)。五天后，這些鼠用標明的LMWH和/或肝素劑量皮下接種，并對關節(jié)炎的發(fā)展按如(Holoshitz，J.，等.，Science(1983)21956)描述的0-16級打分。所有的實驗都是用Fragmin 批號38609進行。
為了研究響應Fragmin 的劑量(圖1)，免疫接種以誘導AA的鼠每周皮下注射，在第五天后開始用0.5μg(○)、1μg(◆)、2μg(●)、10μg(◇)、15μg(△)、20μg(■)、30μg(▲)、40μg(X)注射和PBS對照(□)。20μg劑量在抑制關節(jié)炎中效果最好。
20μg Fragmin 的劑量對AA過程的影響示于圖2PBS對照(□);在第五天處理一次(▲)、每日(●)、每第五天(○)、每周(■)處理。圖中示出了在以五天間隔和在7天間隔施用Fragmin都抑制了關節(jié)炎。
圖3示出每周施用Fragmin (批號38609)與標準肝素相比較對AA的效果。Lewis鼠免疫接種以誘導AA。在五天開始，以每周間隔用20μg劑量的Fragmin (●)、肝素(○)或磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)對照(□)進行皮下接種。在Fragmin 和肝素之間的在效力方面的結果戲劇性的不同F(xiàn)ragmin 完全抑制了關節(jié)炎，而肝素沒有抑制效果。
如圖示(圖4Fragmin (批號38609)(●)、肝素(○)、PBS對照(□))，雖然在每日施用中肝素的抑制效果令人驚奇地高于Fragmin 的，但是發(fā)現(xiàn)每日施用LMWH的20μg劑量對AA沒有抑制效果。
將幾種其它的LMWH施用于為誘導AA而免疫接種的鼠，觀察到相似的抑制效果。圖5示出注射20μg劑量的Fraxiparin (每日(□)、每周(■));Fraxiparine (每日(△)、每周(▲));Lovenox /CLexane (每日(●)、每周(○))和PBS對照(X)。所有三種不同類型和來源的LMWHs當每周非每日施用時，都顯著地抑制了關節(jié)炎。
5.8.用LMWH處理防止異源移植排斥Wistar鼠進行同種異體BN心臟移植(Ono，K.和Linsay，E.S.，J.Thorac.Cardiovasc Surg.(1969)45225-229)。從移植前的一天起，以7天間隔用20μg的Fragmin 或PBS對照進行皮下注射(圖6，分別為●和○)，并記錄生存率。排斥的日期是確定為移植的心臟停止跳動的那天，通過腹部觸診來檢定。圖6示出每周用LMWH劑量處理的鼠顯著提高了心臟異源移植的成活率。
5.9.LMWH對NOD鼠的胰島素依賴型糖尿病(IDDM)的生物作用
NOD種的鼠本能地發(fā)生一種Ⅰ型胰島素依賴型糖尿病(IDDM)，它是人體IDDM可接受的模型(Castano，L.和Eisenbarth，G.S.，Annu.Rev.Immunol.(1990)8647-679)。在4-5周齡期開始發(fā)病，出現(xiàn)胰島炎癥，胰腺炎(insulitis)。胰腺炎逐漸損傷產(chǎn)生胰島素的β-細胞，而該β-細胞對由TNF-α導致的損傷是敏感的。在大約4-5月齡期，大量的β-細胞遭受破壞，結果糖尿病加重。
為了測試用LMWH處理是否能影響IDDM進程，每組10只雌NOD鼠每周每只鼠皮下注射5μg的Fragmin
(批號38609)，測定的劑量以12只鼠為單位每Kg表示。對照組10只鼠注射鹽水。在5月齡期時，所有鼠放血，利用標準方法(Elias，D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1990)871576-1580)測定IDDM的發(fā)展。圖7示出對照鼠(“無”)有變態(tài)的血葡萄糖(400mg/dl)。與之對比，用LMWH處理的鼠有正常的血糖值(100mg/dl)。因此，用LMWH處理的確可以治愈IDDM病變。
5.10.過敏反應的LMWH處理在許多過敏病人中，用專門抗原或抗-IgE進行真皮內(nèi)免疫立即導致風塊和潮紅反應，接著4-8小時后，會有一段時間持續(xù)腫脹和白血球浸潤，稱為后期皮膚反應。后期反應(LRP)2在皮膚(Solley G.O.等.，J.Clin.Invest.(1976)58408-420)中進行了粗略地描述。但是，現(xiàn)在已經(jīng)明了的是，依賴IgE的反應的后期效應特別包括出血白細胞對反應部位的滲入，也在呼吸道和其它組織的位置上發(fā)生(LemansKi，R.F.和Kaliner，M.，inAllergyPrinciplesandPractice，卷1(1988)，Middeton，Jr.，E.等(Eds.)，PP.224-246)。的確，有說服力的爭論是，在臨床上在皮膚和呼吸系統(tǒng)這兩方面依賴IgE的反應的顯著效應反映了在LPR過程中在這些部位募集的白細胞的作用，而不是在抗原刺激后的早期釋放的介導物的作用(Kay，A.B.J.AllergyClin.Immunol.(1991)87893-910)。
目前廣泛地認為慢性過敏性疾病例如氣喘和特應性皮炎主要是炎癥過程的結果，這主要包括嗜曙紅細胞和T細胞的滲入和活化(Kay，A.B.J.AllergyClin.Immunol.(1991)87893-910)。
幾行證據(jù)支持這種假設，該假設為與LPRs相聯(lián)系的白細胞的滲入是肥大細胞脫粒的結果。在人和實驗動物中，按依賴IgE的某些其它機理誘導皮的肥大細胞脫粒的試劑也可以促進白細胞在反應部位的滲入(Solley，G.O.等.，J.Clin.Invest.(1976)58408-420;LemansKi，R.F.和Kaliner，M.，in Allergy，Principles and Practice，Vol.1(1988)，Middleton，Jr.，E.等.(Eds.)，PP 224-246;Kay，A.B.J.Allergy Clin.Immunol.(1991)87893-910)。對活化肥大細胞可以合成的介導物的一篇綜述揭示出許多介導物，它們有助白細胞滲入LPBs中，它們包括脂質(zhì)介導物，例如LTB4、LTC4、LTD4、PGD2和PAF(血小板活化因子)、以及幾種肽或蛋白向化(chemotactic)因子(Holgate，S.T.等.，in AllergyPrinciples and Practice，Vol.1(1988)，Middleton，Jr.E.等(出版)，PP.135-178)。后幾種試劑的大小范圍是從四肽“過敏性嗜曙紅細胞向化因子”到很高分子量的“中性白細胞向化因子”。
近來，已鑒定出與白細胞滲入相聯(lián)系的介導物的更多的肥大細胞的選擇物，包括與INF-α、IL-1α相似或相同的細胞分裂素(cytokine)，和少量分泌肽的MIP-1基因族的四個成員(Gordon，J.R.等，Immunol.Today(1990)11458-464)。這些細胞分裂素中的四種(TNF-α、IL-1α、MIF-1α和MIP-1β)已證實具有促進白細胞滲入的能力。
最近，(Wershil，B.K.等.，inJ.Clin.Invest.(1991)87446-453，通過使用肥大細胞缺乏的鼠證實，在依賴IgE的LPR期間，白細胞的募集依賴于肥大細胞，并且這種抑制通過局部施用抗TNF-α抗血清而部分阻滯?，F(xiàn)在，可廣泛接受的是，與依賴IgE的LPR有關的細胞的滲入/活化的抑制在緩和各種過敏疾病中是一種決定性的治療方法(Barnes，P.J.N.Eng.J.Med.(1989)3211517-1527)。
令本發(fā)明人驚奇地是，發(fā)現(xiàn)在患被動皮過敏(PCA)鼠的依賴IgE的皮LPB期間，LMWH顯著地抑制了白細胞的滲入。
鼠接受單克隆IgE抗DNP Ab(～20μg)皮下(i.d.)注射(進入雙耳)。一天后，該鼠用DNP30-40-HSA的鹽水靜脈注射。在用DNP-HSA激發(fā)前或之后的不同間隔，通過用測微計測量耳朵的厚度來測定耳朵的腫脹。在所有實驗中，通過頸部錯位殺死鼠后，從PCA反應的部位得到了組織，并進行Giemsa-著色工序處理。LMWH在-2天通過S.C.注射(5μg/鼠)一次。
結果在PCA反應位置腫脹迅速擴大(在15分鐘△為35×10-4英寸。)但是在對照部位(僅用稀釋劑注射的耳朵)沒有。在靜脈內(nèi)(i.v.)抗原刺激后，2-4小時間腫脹顯著地減小。
在靜脈內(nèi)抗原刺激后6-8小時，逐時評價PCA和對照部位。在PCA部位的大部分肥大細胞呈現(xiàn)出廣泛地或適度的脫粒。與上相反，在對照部位＜5%的肥大細胞呈現(xiàn)出明顯的脫粒。在抗原刺激6小時后，僅在PCA部位有顯著的中性白細胞滲入。這種滲入在用LMWH兩天前預處理的鼠中顯著地減少(到60%)。這種藥物對肥大細胞脫粒的數(shù)量沒有影響。這種藥物對這些動物周圍的血中的白細胞的總的和分類的計數(shù)沒有影響。可以得出結論，LMW肝素抑制了與依賴IgE的后期的皮的反應相聯(lián)系的細胞的滲入。此外，申請人還預期，施用LMWH對活性的皮過敏性的動物中的皮的LPR顯示出了有益的效果(專門的IgE生產(chǎn)將是用DNP-HSAAlum來誘導)。還預計到對過敏性肺炎有相似的治療效果(Tarayre，J.P.等.Int.J.Immunopharmacol.(1992)14(5)847-855。
5.11.人體DTH的LMWH處理圖8示出了一個實驗，其中一個40歲自愿受試的男人，體重85Kg，測試破傷風抗原對DTH的反應性(Merieux皮膚試驗申請者)。在24小時和48小時，測量到約18mm的硬結。然后志愿者皮下注射3mg的Fragmin
(批號38609)進行處理。五天后，對志愿者再次測試其DTH對破傷風的響應，硬結抑制到約5mm。三周后(“恢復”)該志愿者再次測試DTH，試驗呈陽性反應(在24小時和48小時硬結為23mm)。然后該志愿者進行如前的Fragmin
處理，7天后再測DTH反應性(“過7天”)。DTH又被抑制到約5mm的硬結。三周后發(fā)現(xiàn)DTH再次恢復。因此，低于5mg的LMWH劑量按5和7天間隔進行處理可以抑制人體中的DTH。
6.利用LMWH(Fragmin)和其它活性物質(zhì)的實驗6.1.LMWH(Fragmin)的TNF-α的抑制活性的穩(wěn)定性研究Fragmin批號38609用標準鹽水稀釋到5μg/0.1ml的濃度。一些管形瓶內(nèi)裝物與等量的魚精蛋白的硫酸鹽(5μg)混合，然后管形瓶在室溫下(21℃)貯存0-72小時(表Ⅺ)或在4℃貯存1-4個月(表Ⅻ)。然后按上述在活體內(nèi)使用含或不含魚精蛋白的硫酸鹽的Fragmin，來抑制在BALB/c鼠中的DTH T細胞反應。對本發(fā)明的實驗來說，陽性對照DTH是17.5±1.2×10-2mm(0%抑制)，完全抑制DTH是2.6±0.5×10-2mm(100%抑制)。
在20℃時LMWH的培養(yǎng)結果列于表Ⅺ中。表Ⅺ證實，在室溫下培養(yǎng)72小時，LMWH失去了對依賴TNF-α、T細胞介導的DTH反應的抑制活性。反之，在室溫下，肝素和LMWH僅慢慢失去其抗凝血藥的活性。
表Ⅺ.Fragmin(批號38609，5μg/0.1ml)的抑制活性的穩(wěn)定性，沒有魚精蛋白硫酸鹽，在20℃針對DTH-反應。
編號小時DTH反應%抗-DTH反應性None 17.5±1.2 對照*0 2.6±0.5 100**249.6±1474815.7±1.6137217±0.80＊不抑制＊＊完全抑制6.2.在低溫下抗-DTH反應性的損失和添加魚精蛋白的穩(wěn)定效果表Ⅻ示出了在4℃在四個月內(nèi)在稀溶液中Fragmin失去了它抑制鼠T細胞DTH反應性的能力。添加相等濃度的魚精蛋白硫酸鹽并不影響DTH反應的抑制，但確實在4℃在四個月后，使這種活性完整保存下來。再者，這一結果與魚精蛋白的正常作用相矛盾，當添加于肝素或Fragmin時，在其中魚精蛋白硫酸鹽中和了似肝素物質(zhì)的抗凝血藥效果。
表Ⅻ.在低溫抗DTH-活性伴隨時間的損失。添加魚精蛋白的穩(wěn)定效果。
Fragmin 月在魚精蛋白 DTH(10-2mm) %抗-DTH(38609)4℃硫酸鹽存在活性無無 無 15±1 對照*有 1 無 2.8±0.5 100**有1有3±0.4100有2無4±0.882有2有2.4±1100有3無9.6±0.855有3有3±0.5100有4無14.8±1.40有4有3±0.4100有0有3±0.5100＊不抑制＊＊完全抑制6.3.涂覆了ECM的板的制備涂ECM的孔的制備如下。
在屠宰后幾小時內(nèi)從屠宰室得到新鮮的切開的牛眼。在一防護罩中切開牛眼以除去角膜。然后用一手術刀將該角膜刺破或刮破，得到角膜的內(nèi)皮細胞。這些細胞在組織培養(yǎng)板上用大約5ml介質(zhì)培養(yǎng)，培養(yǎng)介質(zhì)包括DMEM并添加10%胎牛血清、5%牛血清和抗菌素，例如1%鏈霉素或1%neostatin，和添加1%谷酰胺作為穩(wěn)定劑。在接種大約2天后，這些細胞沉到板底，每4小時加入新鮮介質(zhì)，在37℃在5%CO2增濕的培養(yǎng)器中培養(yǎng)。必要量，還可向介質(zhì)加入一些纖維細胞生長因子，雖然加入FGF不是關鍵的。當細胞群集時(約二周后)，抽出上清液，然后細胞用1-2mls的胰蛋白酶胰蛋白化。
將80%的這些初始細胞(其余20%的初始細胞的處置在下文立即敘述)取出，并分成5份置入平底的96-孔板中。這些細胞在添加了4%葡聚糖T-40、10%胎牛清和5%牛血清的DMEM中培養(yǎng)。在37℃在10%CO2增濕的培養(yǎng)器中培育約7天后，使生成的內(nèi)皮細胞群集層溶解。溶解緩沖劑包括含0.25%TritonX的PBS的0.025M NH4OH，使細胞在其中保持10分鐘，然后傾析該緩沖劑。板上的內(nèi)容物用PBS洗滌三次，并冷卻到4℃。上述的方法使ECM完整牢固地粘附在孔的整個區(qū)域。而且生成的ECM不含核和細胞屑。涂ECM的板可在4℃貯藏至少三個月。
其余的20%初始細胞放置在一個板上，并用約5ml介質(zhì)培養(yǎng)，該介質(zhì)包括添加了10%胎牛血清、5%牛血清和如上述的抗菌素的DMEM。使細胞的這種二級植物變成群集物，并如上述用胰蛋白酶處理。將胰蛋白化的細胞再次分份，80%在5個板中在含4%葡聚糖T-40的生長介質(zhì)中培養(yǎng)，而20%在如上述的一個板中培養(yǎng)。從一個板上這種80/20分份可以再進行一次。
6.4.硫酸鹽化的(Sulfated)粘蛋白的降解35(S)O4標記的ECM用在1ml PBS和100μl 8.2M磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液(PH6.2)中的5μl MM5的肝素酶(heparanase)(4u/ml)在37℃培養(yǎng)48小時。收集介質(zhì)，并以10000g力離心5分鐘(任選)并在瓊脂糖凝膠4B柱上通過凝膠過濾分析。用PBS以5ml/時的流速洗提2ml餾份，利用生物螢光閃爍流體進行放射性計數(shù)。
該35(S)O4-標記實驗表明，ECM實際上是降解了，所生成的降解產(chǎn)物成功地釋放出，而且恰當?shù)赝ㄟ^瓊脂糖凝膠4B柱濾出。硫酸鹽化的粘蛋白降解有關的隨后實驗以非-標記的ECM進行，其降解產(chǎn)物通過它們在206或232nm處的吸收來監(jiān)測。
酶的降解實驗如上述，另外，通過將從瓊脂糖凝膠柱上洗脫的降解粘蛋白負載于HPLC柱上而對降解產(chǎn)物(DECM)進一步純化。瓊脂糖凝膠柱餾分的HPLC分析是以如6.11描述的以及下述一種方式進行。降解產(chǎn)物的檢出是通過在206nm處監(jiān)測它們的吸收而實現(xiàn)的。
其它的酶降解實驗利用PC3酶和從IBEX得到的肝素酶進行，得到了相似的結果。
6.5.人體CD4+T細胞的純化CD4+T細胞是從如下述的健康人供血者得到的周圍血的單核白細胞中獲得的。單核細胞按Ficoll梯度離析，在陪氏培養(yǎng)皿中用含10%PCS和抗菌素的RPMT洗滌，在10%CO2增濕氣氛中在37℃培養(yǎng)。一小時后，移出非粘性的細胞，并在10%CO2增濕氣氛中在37℃在尼龍毛柱(Fenwall，IL)上培養(yǎng)45-60分鐘。洗提非粘性細胞并洗滌。CD4+T細胞通過將洗提的細胞作用于下述單克隆抗體(mAb)的混合物進行陰性選擇，這些mAb是抗-CD8、CD19和與磁球結合的CD14(Advanced Magnetics，Cambridge，MA)。回收未結合的細胞并檢查它們的顯型。得到的純化過的細胞主要(＞90%)是CD3+CD4+，如FACScan分析測定的那樣。
6.6.利用來自PBLS的人體CD4+T細胞生物測定TNF-α的活性。
25萬個人體CD4+T細胞在7%CO2氣氛下在37℃用不同濃度150μl的ECM降解產(chǎn)物預培養(yǎng)1.5小時。然后加入100μl的PHA(Wellcome Co.，England，1μg/ml)在平底96-孔板(Costar)中培養(yǎng)3小時。隨后收集孔中的內(nèi)容物(每實驗組3-6孔)，離心分離，介質(zhì)按前述的5.1節(jié)中描述測定TNF-α分泌。簡要地講，將培養(yǎng)淋巴細胞的上清液加入鼠纖維肉瘤細胞克隆(BALB/c.CL7)的培養(yǎng)液中。BALB/c.CL7細胞細胞在放線菌D(0.75μg/ml)存在下，對由TNF-α產(chǎn)生的殺傷是敏感的。Nophar，Y.等.J.Immunol.(1988)140(10)3456-3460。與添加外源TNF的滴定曲線比較，校正在試驗介質(zhì)中這些細胞的死亡。通過下述過程來測定細胞的變異性，即用MTT四唑鎓(Sigma，Cat.No.M2128)培養(yǎng)2小時，用異丙醇-HCl混合物提取細胞所吸收的染料，用Microelisa Autoreader量熱法(在570nm)定量它。TNF-α分類是通過檢查抗鼠科動物TNF-α mAb(稀釋1/400;Genzyme，MA)的中和作用來進行的。
6.7.肝素降解在1mlPBS中的1mg肝素(Sigma)和100μl的25M磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液(PH6.2)用20μlMM5(5u/ml)在37℃培養(yǎng)48小時。然后在瓊脂糖凝膠4B柱上通過凝膠過濾分析該反應產(chǎn)物。用PBS以5ml/小時的流速洗提2ml餾份。為對降解產(chǎn)物的進一步確定特征，利用ToyoSoda-GelG3000SW和G2000SW高性能液相色譜(HPLC)柱，對從瓊脂糖凝膠柱洗提的波峰進行高性能液相色譜(HPLC)分離，如在6.11節(jié)和如下述的那樣。
利用20μl的PC3進行其它的實驗。用1mg肝素進行PC3的酶化反應，除了反應時間為24小時外，其它條件都與上述MM5相同的條件下進行。然后在瓊脂糖凝膠4B柱上通過凝膠過濾分析反應產(chǎn)物(圖29)。在活體外的生物檢定結果示于下表ⅩⅨ中。
6.8.鼠中DTH響應的誘出和抑制效果的檢查BALB/c鼠(每組至少5只)，用在丙酮/橄欖油中3%4-乙氧亞甲基-2-苯基噁唑酮(OX;BDHChemicals，GB)局部施用于刮過的腹部致敏。五天后誘出的DTH敏感性如下鼠用在丙酮/橄欖油中的0.5%OX激發(fā)免疫反應。在激發(fā)前當時和24小時后，用Mitutoyo工程的測微計(日本)測量鼠耳朵。測量耳朵腫脹的操作者不明確鼠的分組。為影響DTH響應，將在PBS中稀釋的低分子量的免疫調(diào)節(jié)部分在預定的時間表以不同的濃度在皮下施用于處理過的鼠的背部。在處理期間和之后(＞2個月)檢查處理過的鼠，臨床上沒有觀察到大的副作用。
6.9.在篩分(Size)-排阻凝膠色譜柱上(Sepharose4B)分離LMWH(Fragmin)Fragmin(批號38609)和無活性的Fragmin在瓊脂糖凝膠4B(Pharmacia)柱上通過凝膠過濾進行分餾。用PBS以5ml/小時的流速洗提出0.5ml餾分，并在206nm處監(jiān)測吸收情況(在280nm處不吸收)。以餾分數(shù)對在206nm處的吸收值繪圖，表示在圖11。選擇餾分的生物測定結果示于下面的表ⅩⅢ和ⅩⅣ。
表ⅩⅢ.全部Fragmin、Fragmin瓊脂糖凝膠4B餾分和瓊脂糖凝膠4B餾分的HPLC餾分對活性TNF分泌的影響，利用人體PBL生物測定。
濃度TNF活性的"R"值試驗材料 (pg/ml) 生物測定(%) %×(pg/ml)-1活性部分/全體1最大抑制(90%)90惰性部分/全體a無作用0惰性部分/瓊脂糖凝膠.
4B-F155最大抑制(50%)50
表XIII(續(xù))濃度TNF活性的"R"值試驗材料 (pg/ml) 生物測定(%) %×(pg/ml)-1惰性部分/瓊脂糖凝膠.
4B-F10a無作用0惰性部分/瓊脂糖凝膠.
4B-F81000增加最大(60%)0.06惰性部分/瓊脂糖凝膠.
4B-F21000增加最大(30%)0.03部分/HPLC-F90b無作用0a濃度范圍1μg/ml-0.001pg/ml.
b濃度范圍1μg/ml-0.01pg/ml.
表ⅩⅣ.全體Fragmin和Fragmin的瓊脂糖凝膠4B餾分對鼠的DTH敏感性的作用。
抑制劑量對DTH"R"值試驗材料 (μg/gm鼠) (&gt;50%) %×(μg/gm)-1活性部分/全體0.250250惰性部分/全體0.2-0.004沒作用0惰性部分/瓊脂糖凝膠.
4B-F150.0045012,500惰性部分/瓊脂糖凝膠.
4B-F100.2-0.004沒作用06.10.涉及分離Fragmin和肝素酶降解的ECM的其它實驗通過在瓊脂糖凝膠4B柱上的凝膠過濾分餾Fragmin和肝素酶-降解的ECM。0.2ml的餾分用PBS以5ml/小時的流速洗提，在206nm處監(jiān)測吸收情況。(在280nm處沒有檢測出吸收)。用餾分數(shù)對在206nm處的吸收值繪圖，在圖14中給出。所選擇餾分的生物測定結果示于下表ⅩⅤ中。
表ⅩⅤ.DECM和Fragmin的瓊脂糖凝膠4B餾分對活性TNF分泌的影響，利用人體PBL生物測定。
濃度TNF活性生物測定"R"值試驗餾分 (pg/ml) (%) %×(pg/ml)-1餾分/瓊脂糖凝膠.
4B-F39100抑制最大(60%)0.6DEMC/瓊脂糖凝膠.
4B-F3910,000抑制最大(85%)0.0085餾分/瓊脂糖凝膠.
4B-F42a無作用0DECM/瓊脂糖凝膠.
4B-F42a無作用0餾分/瓊脂糖凝膠.
4B-F3210增加最大(55%)5.5DECM/瓊脂糖凝膠.
4B-F4610增加最大(20%)2a在濃度為1μg/ml-0.001pg/ml。
6.11.利用高性能的液相色譜從Fragmin中分離活性物質(zhì)利用兩組高性能液相色譜條件進行兩組實驗。使用的初始柱型為30cm×7.8mm由經(jīng)(I.D.)TsK-Gel
G-Oligo-PW柱和4cm×6mm(內(nèi)徑)保護柱。該柱用0.2M磷酸鹽緩沖液，PH7.0以0.5ml/分流速洗提。收集的每個餾分的體積為0.5ml。
利用的第二種類型的HPLC是ToyoSodaTSK-GelG3000SW(7.5mm×50cm)和G2000SW(7.5mm×50cm)柱(串聯(lián))和購自于Phenomenex的7.5mm×10cm的保護柱。柱以1ml/分的速度用仔細地脫氣的0.5MNaCl洗提。以每份0.5ml收集餾分。檢測器置于232nm處，用0.02AUFS，而測量停留時間到±0.1秒。通過藍色葡聚糖和疊氮化鈉測量空隙體積和全部體積。收集物還在206nm處在與232nm處相同的條件下進行檢測。
FragminHPLC餾分數(shù)對在206nm處的吸收值繪圖，在圖18A中給出。選擇餾分的生物測定結果示于下表ⅩⅥ。所示結果證明某些物質(zhì)能夠抑制TNF-α的活性，而另一些能增加它的活性。
表ⅩⅥ.Fragmin的全部和HPLC餾分對活性TNF分泌的影響，利用人體PBL生物測定。
Fragmin濃度TNF活性的生物測定"R"值餾分 (pg/ml) (%) %×(pg/ml)-1全部a10 最大抑制(40%) 4HPLC-F1100最大增加(60%)0.6HPLC-F310最大抑制(70%)7HPLC-F1610最大抑制(100%)10HPLC-F2210最大抑制(100%)10HPLC-F26100最大抑制(50%)0.5HPLC-F30100最大抑制(70%)0.7HPLC-F47100最大抑制(55%)0.55a讓全部Fragmin樣品在4℃老化90天。
6.12.利用高性能液相色譜從ECM分離活性物質(zhì)按6.11節(jié)中討論的通過高性能液相色譜進行從ECM中分離活性物質(zhì)。
用ECMHPLC餾分數(shù)對在206nm處的吸收值繪圖，示于圖18B。選擇餾分的生物測定結果示于下表ⅩⅦ。所示的結果證明從肝素酶介導的ECM的降解產(chǎn)物中分離出某些物質(zhì)能抑制TNF-α的活性，而另一些物質(zhì)能增加它的活性。結果還示出了從HPLC分離中得到的某些餾分對TNF的活性沒有影響。
表ⅩⅦ.DECM的HPLC餾分對活性TNF分泌的影響，利用人體PBL生物測定。
DECM濃度TNF活性的生物測定"R"值餾分 (pg/ml) (%) %×(pg/ml)-1HPLC-F1a沒影響0HPLC-F5a沒影響0HPLC-F1010抑制最大(60%)6HPLC-F1410抑制最大(70%)7HPLC-F17a沒影響0HPLC-F251000增加最大(40%)0.04HPLC-F33100增加最大(40%)0.4HPLC-F3710增加最大(100%)10HPLC-F39100,000抑制最大(60%)0.0006HPLC-F42a沒影響0HPLC-F461000增加最大(30%)0.03HPLC-F491000增加最大(30%)0.03HPLC-F61a沒影響0a在濃度為1μg/ml-0.001pg/ml。
6.13.縮(對稱)二氨基脲定量的糖類測定主要是將1500μl硼酸鹽硫酸反應劑在冰浴中冷卻。然后將試驗溶液(250μl，含20μg糖醛酸/ml)小心地鋪加在硼酸反應劑的表面上，并使其擴散10分鐘。之后溶液徹底混合，置于沸水浴10分鐘，然后在冰浴中冷卻。將冷卻的縮(對稱)二氨基脲(50μl)加入混合物中，渦流攪拌(voltexed)，置于沸水浴上15分鐘。冷卻該溶液，并在525nm處記錄吸收值。將試驗結果與校正的溶液比較。
6.14.從ECM降解產(chǎn)物中分離二糖通過HPLC從牛角膜的內(nèi)皮的已經(jīng)過哺乳動物肝素酶(MM5)作用的ECM中分離二糖物質(zhì)。
具體描述涂了ECM的板用20μl的哺乳動物肝素酶(0.5mg/ml)在1mlPBS緩沖液(通過用檸檬酸預先將PH調(diào)為6.2)中的混合液在37℃培養(yǎng)48小時。然后收集介質(zhì)，并置于瓊脂糖凝膠-4B柱上(35cm×0.7cm(內(nèi)徑))。移動相是PBS緩沖液，流速為5ml/小時。收集2.2ml餾份，在206nm處監(jiān)測(圖19)。瓊脂糖凝膠4B餾分no.5(8.8-11ml洗提液體積)的樣品(100μl)注入HPLC柱(ToyoSodaTSK-GelG3000SW(7.5mm×50cm)和G2000SW(7.5mm×50cm)，與購自Phenomenex的7.5mm×10cm的保護柱串聯(lián))。移動相是0.5MNaCl，流速1ml/分。收集1ml餾分，在206nm和232nm處監(jiān)測(圖20A和20B)。no1.峰(P1)物質(zhì)在25ml燒瓶中冷凍干燥。樣品含約20μg的在60mgNaCl中的低聚聚糖(用縮(對稱)二氨基脲測定)。
樣品的洗脫圖形類似于從肝素(Sigma)解聚中工業(yè)上得到的二糖標準物或分子量“標記物”。
所述物質(zhì)的最大抑制值，根據(jù)按相似方法得到的試樣(參見，例如圖21A中峰F73(洗提時間約44分鐘)和進入F5/HPLC-F73在下表ⅩⅧ中)，利用人體PBLs，以濃度為約10pg/ml在一活體外TNF-α的抑制測定中估計為87%。生物測定如上述的進行。該樣品利用SAX-HPLC柱可進一步提純，如下文所述的那樣。
6.15.包括SAX-HPLC色譜法從ECM降解產(chǎn)物中分離二糖涂了ECM的板用20μl的哺乳動物的肝素酶(0.5mg/ml)的1mlPBS緩沖液(用檸檬酸預先將PH調(diào)為6.2)在37℃培養(yǎng)48小時。然后收集介質(zhì)，并置于瓊脂糖凝膠-4B柱上(0.7×35cm)。移動相是PBS緩沖液，流速為5ml/小時。收集1.6ml的餾分并在206nm處監(jiān)測(圖22)。7-8號餾分合并，冷凍干燥，粉末在1/10的原始體積中再懸浮。樣品(100μl)注入HPLC柱(ToyoSodaTSWK-GelG3000SW(7.5mm×50cm和G2000SW7.5×50cm，與購自Phenomenex的7.5mm×10cm的保護柱串聯(lián))，如前述。移動相是0.5MNaCl，流速1ml/分。收集1ml餾分，在206mm和232nm處監(jiān)測(圖23)。收集10個相同運行中標記“1”的峰。合并基本上均勻的餾分并凍干。
物料在2ml兩次去離子水中再懸浮，并在Sephadex G-10柱(26×150mm)上脫鹽，用兩次去離子水(DD)以1.6ml/分的流速洗脫。收集一ml餾分并在232nm處監(jiān)測和測量電導率(以測定NaCl含量)。合并脫鹽餾分，凍干并在1ml DD H2O中再懸浮。將通過合并100μl再懸浮溶液和900μlPH為3.5的0.2MNaCl而制備的1ml樣品注入分析用SAX-HPLC柱(4.6×250mm，用Spberisorb大小為5μm的顆粒裝填)。流速1.5ml/分，采用如下的NaCl線性梯度程序時間/緩沖液(分)A(%)B(%)C(%)01000021000035386204038620450100047010005000100550010058100006010000A＝0.2MNaCl，pH3.5B＝1.5MNaCl，pH3.5C＝H2O在232nm處監(jiān)測柱洗脫液(圖24)，收集峰A23/4并測試對TNF的抑制。發(fā)現(xiàn)這SAX-HPLC餾分的抑制最大在濃度為0.1pg/ml時為60%，得出的“R”值為600%×(pg/ml)-1。
硫酸鹽化程度不同的肝素二糖標準物在同一條件下注入SAX-HPLC柱。這些標準物的洗脫圖形示于圖25A-C。從這些圖中可以看出，二糖標準物給出了不同的停留時間，未硫酸鹽化的二糖(Sigma產(chǎn)品號H-0895)最快洗脫出來(圖25A)，二硫酸鹽化的二糖(Sigma產(chǎn)品號H-1020)在少于20分鐘時洗脫出來(圖25B)，三硫酸鹽化的二糖(Sigma產(chǎn)品號H-9267)最后洗脫出(圖25C)。三硫酸鹽化的二糖標準物H-9267的停留時間與峰A23/4(即分別為23.07分對照和23.10分)所得到的非常相似。
6.16.活體外人體PBL生物測定各種物質(zhì)的結果對由ECM降解得到的產(chǎn)物、包括圖20的“P1”峰，利用人體PBLs對各種活性物質(zhì)和原料“混合物”進行的活體外的生物測定結果示于表ⅩⅧ中。P1所得到的“R”值為10%×(pg/ml)-1，起始DECM“湯”所給出的“R”值為0.000053%×(pg/ml)-1。
表ⅩⅧ.ECM+MM5肝素酶(DECM“湯(Soup)”)，“湯(Soup)”的瓊脂糖凝膠4B餾分和瓊脂糖凝膠4B餾分的HPLC餾分對活性TNF分泌的影響，利用人體PBL生物測定。
濃度TNF活性的生物測定"R"值試驗物料 (pg/ml) (%) %×(pg/ml)-1DECM"Soup" 1×106抑制最大(53%) 5.3×106Seph.4B-F5100抑制最大(50%)0.5Seph.4B-F6100抑制最大(60%)0.6Seph.4B-F7,8100抑制最大(81%)0.8F5/HPLC-F7310抑制最大(87%)8.7F5/HPLC-F6510抑制最大(78%)7.8F5/HPLC-F2210抑制最大(33%)3.3F6/HPLC-F8610抑制最大(43%)4.3P110抑制最大(100%)10.06.17.從肝素的降解產(chǎn)物中分離低聚糖用與上述ECM降解的相似方式，對完整肝素用來自各種各樣來源的肝素酶、本文命名這MM5和PC3(參見Shoseyov，O.等.Biochem.，Biopbys.RES.COMM.(1990)169667-672，PC3酶的制備)進行處理。在瓊脂糖凝膠4B柱上(參見圖26肝素+MM5瓊脂糖凝膠4B餾分F7和F8，和圖27肝素+PC3及只有PC3的瓊脂糖凝膠4B色譜)分離出一些起始的降解混合物。其它的部分通過上述的HPLCⅡ方法進一步分離(參見圖28A和28B的餾分F7/HPLC-F86、-F84和-F90)?！巴暾钡母嗡睾虵ragmin也用HPLCⅡ條件進行處理，而選擇的餾分進行相似的分離(從Fragmin分離出的HPLC-90示于圖29)。在活體外利用人體PBLs對各種活性物質(zhì)和原料“混合物”的生物測定結果示于表ⅩⅨ，包括肝素降解所得到的產(chǎn)物。
表ⅩⅨ.完整的肝素、肝素+MM5或PC3“湯(Soups)”和選擇的瓊脂糖凝膠4B及它的HPLC餾分對活性TNF分泌的影響，利用人體PBL生物測定。
濃度TNF活性的生物測定"R"值試驗物料 (pg/ml) (%) %×(pg/ml)-1完整的肝素a無作用0肝素/HPLC-F90a無作用0其它的肝素餾分F7/HPLC-F860.1抑制最大(26%)260F8/HPLC-F84a無作用0F8/HPLC-F90a無作用0肝素/PC3"Soup" 0.1-10×106無作用 0
表XIX(續(xù))濃度TNF活性的生物測定"R"值試驗物料 (pg/ml) (%) %×(pg/ml)-1瓊脂糖凝膠.
4B-F9100抑制最大(50%)0.5瓊脂糖凝膠.
4B-F8100抑制最大(40%)0.4PC3onlya無作用0瓊脂糖凝膠.
4B-F8a無作用0瓊脂糖凝膠.
4B-F9a無作用0a在濃度為1μg/ml-0.01pg/ml6.18.用不同的物質(zhì)處理的鼠在活體內(nèi)的DTH反應性結果在活體內(nèi)在生物測定條件下，測試各種物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)抑制鼠的實驗DTH敏感性達不到程度取決于這些物質(zhì)的純化情況。鼠用上述5.1和5.2節(jié)的活性物質(zhì)處理。通常，這些物質(zhì)通過高壓液相色譜純化到基本上同質(zhì)，“R”值為數(shù)萬。一組實驗結果示于表ⅩⅩ。
表ⅩⅩ.每周用各種物質(zhì)處理鼠，和這些物質(zhì)對鼠的DTH敏感性的影響DTH抑制劑量響應對DTH"R"值試驗物料 (μg/gm鼠) (10-2mm) (%) %×(pg/ml)-1無-17.2±20-(-)對照2--0.5MNaCl-16.5±1.55-完整肝素a-無作用0Fragmin批號386090.23±185425DECMMM5"湯"a-無作用-Seph.4B-F60.032016.5±55-0.01616±210-0.003214±220-0.00067.1±165(最大)110,000
表XX(續(xù))DTH抑制劑量響應對DTH"R"值試驗物料 (μg/gm鼠) (10-2mm) (%) %×(pg/ml)-1F6/HPLC-F90.03211±240-0.0117±20-0.0026±0.570-0.00066±1.270(最大)120,000F6/HPLC-F110.0217±30-0.0113±125-0.0019.5±2.555-0.00062.8±0.590(最大)150,000F6/HPLC-F120.0218±20-0.0115±215-0.0018.2±1.560-0.00064±180(最大)130,000a在劑量范圍為0.04-0.0004μg/gm鼠。
如表ⅩⅩ所指出的，完整肝素和起始的ECM+MM5“湯(Soup)”在活體內(nèi)沒有抑制效果。在后一種情況下，極可能是由于抑制和增加的因素互相抵銷而導致無作用。與前期的實驗結果相比(參見第一入口，表Ⅸ)，F(xiàn)ragmin(批號38609)的新鮮樣品呈現(xiàn)適宜的“R”值。與在HPLCⅡ條件下得到的相應餾分比較，瓊脂糖凝膠4B餾分表現(xiàn)一稍低的“R”值。
另一系列實驗結果列于表ⅩⅪ中，證實了原始的ECM+MM5“湯Soup”沒有任何影響。值得注意地是，HPLC Ⅱ的餾分no.F5/HPLC-L22當皮下注射入鼠體內(nèi)時(“R”值＝454545%×(μg/gm)-1顯示出了很高的專門調(diào)節(jié)活性，在以高劑量(“R”)值+5000%×(μg/gm)-1)時，也證實有口服活性albeit。在表ⅩⅪ中還表示出從ECM分離出的活性物質(zhì)在活體內(nèi)的專門調(diào)節(jié)活性大于從Fragmin得到的那些物質(zhì)的。因此，明顯的脫硫酸鹽作用降低了本發(fā)明活性物質(zhì)的專門抑制活性。實際上，在活體內(nèi)的生物測定條件下，從這些脫硫酸鹽的二糖中得到了增大的“R”值。
其它的實驗也證實半乳糖胺、單糖或沒有硫酸鹽基的普通的糖都能夠用作本發(fā)明硫酸鹽化的低聚糖的抑制活性的拮抗藥。因此，脫硫酸鹽化的低聚糖可直接用作增大組分或用作羧酸鹽化的和/或硫酸鹽化的低聚糖的專門抑制活性的拮抗藥。本研究者的觀察結果還與某些物質(zhì)(例如三硫酸鹽化的二糖)做為到目前為止仍未鑒別出的活性TNF-α分泌的天然抑制劑的拮抗劑的機理一致。
表ⅩⅪ.用各種物質(zhì)皮下處理的鼠的活體內(nèi)的DTH反應性數(shù)據(jù)DTH抑制劑量響應最大"R"值試驗材料 (μg/gm鼠) (10-2mm) (%) %×(μg/gm)-1ECM+MM5a20.4±0.7Noaffact0"Soup"F5/HPLC-L22 0.008b13.2±1.3 40±12% 5,000F5/HPLC-L220.0001329.7±1.360±17%454,545FRAGMINFR/HPLC-20.000488.5±1.370±20%145,833a劑量范圍為0.04-0.0004μg/gm鼠。
b口服。
陽性對照組的DTH響應為20.0±1.1而陰性對照組的DTH響應為2.0±1.0。
6.19.在活體內(nèi)SAX-HPLC餾分與已知二糖標記物的活性比較在活體內(nèi)的條件下，測試二糖標記物，以確定它們對鼠的有關的DTH反應性的抑制能力。如表ⅩⅫ所示，當將標記物皮下注射入鼠體內(nèi)時，兩種標記物(H-1020和H-9267)顯示出了適度的活性，“R”值為140000-160000%×(μg/gm)-1之間。標記物H-1020再口服測試，還發(fā)現(xiàn)有最中等的活性(“R”值＝531%×(μg/gm)-1)。H-1020標記物是一種O，N-二-硫酸鹽，而H-9267標記物是一種O，O′，N-三-硫酸鹽。它們的結構描述如下。
如表ⅩⅫ中所示的，得到的SAX-HPLC餾分L22/SAX-A23/4(圖24)對F5/HPLC-L22的已經(jīng)較高的專門調(diào)節(jié)活性提供了進一步的改進，與F5/HPLC-L22(表ⅩⅪ)的“R”值454545%×(μg/gm)-1相比，它給出的“R”值為630303%×(μg/gm)-1。但是發(fā)現(xiàn)，通過SAX-HPLC柱的停留時間與H-9267的停留時間幾乎相同的這種二糖物質(zhì)，在室溫下PH3.5的條件下在數(shù)天內(nèi)失去了它的硫酸鹽基團。因此，對通過SAX-HPLC柱的老化樣品的再分析就揭示出了在23.10分鐘時原來峰為三個主峰所代替，命名為2039/1、2039/2和2039/3(圖30)，它們的停留時間都比A23/4短。與H-1020標記物有相似停留時間的峰2039/3極可能已失去了一個N-硫酸鹽基團。峰2039/1和2039/2看起來對應于單硫酸鹽化的或完全脫硫酸鹽化的二糖。(它們的停留時間與二糖標記物、H-0895、沒有硫酸鹽基團的N-乙酰氨基葡糖胺基聚糖(N-acetylglycosaminoglycan)相當。
各個收集這些“脫硫酸鹽化”的物質(zhì)，并在活體內(nèi)DTH生物測定條件下進行測試，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)只具有中等抑制活性或無抑制活性。(參見表ⅩⅫ)。的確，在活體外人體PBL測定條件下，所有三個峰表示出活性TNF-α分泌的增加。在活體外的這些結果示于下表SAX-HPLC濃度增加最大"R"值峰 (pg/ml) (%) %×(pg/ml)-120391/11552039/2135352039/314242
表ⅩⅫ.利用在皮下施用的不同的二糖，在活體內(nèi)的其它試驗結果DTH抑制劑量響應最大"R"值試驗材料 (μg/gm鼠) (10-2mm) (%) %×(μg/gm)-1PBS-18.6±0.7--(陽性.對照)未經(jīng)處理-1.4±0.2--(陰性.對照)SAX-HPLC餾分A23/40.0001323±183680,3032039/30.00053.1±1.183166,0002039/10.00013218.5±1.1沒作用0"標記物"H-10200.00054.7±0.773146,000H-1020 0.128a5.9±0.9 68 531H-92670.00053.5±180150,000a口服施用
6.19.1.選擇的二糖對調(diào)節(jié)活體內(nèi)活性TNF-α產(chǎn)生的能力的其它實驗結果。
進行其它的試驗，其中選擇二糖的分子從SigmaChemicalCo購得并在這里由它們各自的Sigma目錄號來識別，測試它們對在鼠體內(nèi)的試驗DTH反應抑制或增加的能力，并由此提供它們調(diào)節(jié)由這些哺乳動物產(chǎn)生活性TNF-α能力的標度。
具體講，CD1鼠(購自WeizmannInstituteAnimalBreedingCenter，Rehovot，Israel)，每組4-12只，按5.2或6.8節(jié)的描述進行處理。
各種試驗結果匯總于下表ⅩⅩⅢA。從表中可以看出，所測試的11種二糖中的四種響應施用的噁唑酮，對鼠的耳朵腫脹顯示出了抑制效果。T細胞-介導的炎癥的響應的抑制因而被看被是一種標志，即標志顯示非零“R”值的二糖，可以向下調(diào)節(jié)活性TNF-α的產(chǎn)生。從表中所列出的結果知，“R”值的范圍是從較適中的65000%×(μg/gm)-1到約1500000%×(μg/gm)-1內(nèi)。還應指出，高“R”值對感興趣活性化合物不是必須的特征。具體說，在其范圍內(nèi)具體化合物顯示生理效果的劑量“窗”應該是盡可能的寬，使得所施用的劑量落在有效劑量之外的可能性減小。如表ⅩⅩⅢA的腳注中表明的，分子H-9392在測試的化合物中有最寬的劑量窗，為0.000132-0.004μg/gm。
實驗結果同等地證明所測試的11種二糖中的一種對增大由實驗DTHT細胞反應產(chǎn)生的腫脹有令人驚奇的能力。化合物H-0895沒有硫酸鹽基團，它在約1.2μg的二糖/gm鼠的很低的劑量下對腫脹程度顯示出了巨大的影響。產(chǎn)生的“R”值約7670000%×(μg/gm)-1在目前是無可比擬的。
表ⅩⅩⅢA.在活體內(nèi)利用皮下施用的各種二糖標記物的其它試驗結果。
劑量 DTH 抑制max"R"值試驗材料 (μg/gm) (10-2mm) (%) %×(μg/gm)-1H-9392a0.0012 4.2±0.7 78 6.5×104(17.8±0.9)H-1020b0.0004 6.7±1.1 66 1.65×105(19.6±1.2)H-9267c0.0004 7.2±1 64 1.60×109(19.6±1.2)H-9517d0.00004 7.6±1 62 1.55×106(20.4±0.7)H-0895e0.0000012 37.3±0.7 +92 7.67×107(18.9±0.7)H-9017fN.E. 0H-8642gN.E. 0H-9142hN.E. 0
表XXIIIA(續(xù))劑量 DTH 抑制max"R"值試驗材料 (μg/gm) (10-2mm) (%) %×(μg/gm)-1H-8767iN.E. 0H-8892jN.E. 0H-1145kN.E. 0aH-9392是2-O-硫酸鹽基-4-脫氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-硫酸鹽葡糖胺。這一數(shù)據(jù)系列的PBS(陽性對照)值在圓括號內(nèi)給。未經(jīng)處理的(未免疫的)鼠的腫脹為2.0±0.5mm。對上述的所有計算都利用這一值。抑制≥50%對照的有效劑量為0.000132-0.004μg/gm。
bH-1020是4-脫氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-硫酸鹽基-6-O-硫酸鹽葡糖胺。抑制≥50%對照的有效劑量范圍為0.00004-0.0004μg/gm。在該表中示出的“R”值與在表ⅩⅩⅢ中先前給出的“R”值相比是有益的。這些結果表明不同組的CD1種鼠活體內(nèi)測試方法有相當好的再現(xiàn)性。
cH-9267是2-O-硫酸鹽基-4-脫氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-硫酸鹽基-6-O-硫酸鹽葡糖胺。抑制≥50%對照的有效劑量范圍是窄小的。
dH-9517是2-O-硫酸鹽基-4-脫氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-乙?；?6-O-硫酸鹽葡糖胺。抑制≥50%對照的有效劑量范圍為0.00004-0.00012μg/gm。
eH-0895是4-脫氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-乙?；咸前?。該結果表明DTH反應的增加。增加≥50%對照的有效劑量范圍為0.000001-0.00004μg/gm。
fH-9017是4-脫氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-6-O-硫酸鹽葡糖胺?！癗.E.”表明在試驗劑量范圍為0.000004-4μg/gm鼠時，沒有觀察到有影響。
gH-8642是4-脫氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-乙酰基-6-O-硫酸鹽葡糖胺。
hH-9142是2-O-硫酸鹽基-4-脫氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧葡糖胺。
fH-8767是2-O-硫酸鹽基-4-脫氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-乙?；咸前贰?br> jH-8892是2-O-硫酸鹽基-4-脫氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-6-O-硫酸鹽葡糖胺。
kH-1145是4-脫氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-N-硫酸鹽葡糖胺。
四種抑制性二糖化合物H-9392、H-9517、H-1020和H-9267的結構表示如下抑制化合物
在所測試的11種二糖中，有六種未能顯示出任何一致的作用，因此，它們可以歸為“中性”類。這些中性化合物的結構如下所示。
中性化合物
在11種二糖中，有一種二糖擴大了試驗DTH反應的影響。這種化合物H-0895有如下所示的結構。
因此，能夠提出表征抑制化合物的結構特征的通式。這種通式(H-GENUS)如下所示。
其中，X1是H或SO3-;X2是H或SO3-;和X3是SO3-或COCH3，條件是如果X3是SO3-，那么X1或X2至少之一是SO3-且如果X3是COCH3，那么X1和X2都是SO3-。對于有相當寬的有效劑量窗口的化合物來說，X1是優(yōu)選SO3-，X2優(yōu)選H，和X3優(yōu)選SO3-(即H-9392有最寬的有效抑制劑量窗口)。
人們從上述的結果中可觀察到，對于抑制作用來說，葡糖胺氮的優(yōu)選的取代基是硫酸鹽基團。硫酸鹽基在葡糖胺(X3)的2-N位，而剛好另一個硫酸鹽基或在艾杜糖醛酸基的的2-位或葡糖胺的6-位時觀察到了抑制活性。在羥基的兩個位置都存在硫酸鹽基也有抑制活性，但是缺少任一個其它的硫酸鹽基(如在H-1145中)就產(chǎn)生“中性”化合物。
做為對比，在葡糖胺的2-N位引入乙酰基要求存在二個其它的硫酸鹽基，分別在艾杜糖醛酸(X1)的2-位和葡糖胺(X2)的6-位。在葡糖胺的2-N位缺少任何取代基，產(chǎn)生帶正電荷的銨基，實際上消除了抑制效果，這可由所有測試的化合物H-9017、H-8892和H-9142都是“中性的”的事實來證明。在艾杜糖醛酸的2-位或在葡糖胺的6-位有一個或二個硫酸鹽基沒有明顯的作用。
最后，在X3中有乙?；c在X1和X2中都沒有硫酸鹽基相組合，導致調(diào)節(jié)活性的增加(H-0895)。
人們應當注意，在二糖中存在負電荷與它的抑制TNF-α產(chǎn)生的能力之間高度一致。帶正電荷的銨取代基的存在導致“中性”，而電中性的化合物H-0895增加了活性TNF-α的產(chǎn)生。
表ⅩⅩⅢB.從活體內(nèi)涉及商購二糖的DTH研究結果發(fā)現(xiàn)的經(jīng)驗規(guī)律。
在H-GENUS中的Xn的同一性觀察的X3X2X1活性SO3-SO3-SO3-抑制SO3-SO3-H 抑制SO3-H SO3-抑制SO3-H H 中性COCH3SO3-SO3-抑制COCH3SO3-H 中性COCH3H SO3-中性COCH3H H 擴大劑H2+SO3-SO3-中性H2+SO3-H 中性H2+H SO3-中性6.19.2.選擇的單糖對活體內(nèi)產(chǎn)生活性TNF-α的調(diào)節(jié)能力的結果在進行的其它實驗中，選擇的單糖是從Sigma購得，測試它對活體內(nèi)產(chǎn)生TNF-α的調(diào)節(jié)能力。利用與前節(jié)中所述的基本上相同的方法，每組6只CD1鼠用各種對照和試驗物質(zhì)接種并處理，以測定皮下注射物質(zhì)對試驗動物的實驗DTH反應的任何效果。這些實驗結果示于下表中。
表ⅩⅩⅢC.在活體內(nèi)利用皮下施用的各種單糖的其它試驗結果試驗物料劑量 DTH 抑制max"R"值(μg/gm)-1(μg/gm) (10-2mm) (%) %XGlcNa0.000012 5±0.7 75 6.25×106(19.7±1.2)0.4 2.3±0.9 88 2.2×102(19.7±1.2)GlcN-2SbN.E 0GlcN-3ScN.E. 0GlcN-6SdN.E. 0GlcN-2,3Se0.0012 6.3±1 68 5.67×104(19.7±1.2)
表XXIIIC(續(xù))試驗物料劑量 DTH 抑制max"R"值(μg/gm)-1(μg/gm) (10-2mm) (%) %XGlcN-2,6Sf1.2 7.7±1 61 5.08×10(19.7±1.2)NAc-GlcNgN.E 0GalNh0.00004 8.9±0.6 50 1.25×106(18.9±0.7)0.12 6.5±0.7 67 5.58×102(18.9±0.7)aGlcN是葡糖胺或2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖。抑制≥50%對照發(fā)現(xiàn)有兩種有效劑量范圍0.000004-0.00004μg/gm和0.004-4μg/gm。
bGlcN-2S是D-葡糖胺或-2-N-硫酸鹽?！癗.E.”表明在測試的劑量范圍內(nèi)0.000004-4μg/gm鼠，沒有觀察到任何效果。
cGlcN-3S是D-葡糖胺或-3-硫酸鹽。
dGlcN-6S是D-葡糖胺或-6-硫酸鹽。
eGlcN-2，3S是D-葡糖胺或-2，3-二硫酸鹽，抑制≥50%對照的有效劑量范圍是窄小的。
fGlcN-2，6S是D-葡糖胺或-2，6-二硫酸鹽，抑制≥50%對照的有效劑量范圍是窄小的。
gNAC-GlcN是乙?；咸前?。
hGalN是D-半乳糖胺。抑制≥50%對照的兩個有效的劑量范圍是0.00004-0.00012μg/gm和0.04-4μg/gm。
在單糖的4-位的羥基的立體化學決定糖是葡糖胺(α-面)還是半乳糖胺(β-面)，如下所示。
因此看起來，在單糖中N-乙酰化或有一個硫酸鹽基要影響葡糖胺抑制鼠體中的DTH反應的能力。
6.19.3.用選擇的單糖和二糖治療大鼠的輔藥關節(jié)炎(AA)AA是在6-8周齡如在5.7節(jié)中描述的雌性Lewis大鼠中誘導產(chǎn)生的。每組5-10只大鼠的實驗組在誘導實驗關節(jié)炎前一天通過皮下注射試驗物質(zhì)來處理，此后每周進行重復處理。效果(如果有)如在5.7節(jié)中描述的那樣評分。
在三個試驗的二糖中，H-9392表明相對于僅接收鹽水(0.1ml)的對照組的大鼠來說，對于降低AA記分方面有最明顯的效果。如圖38所示的，H-9392，以120ng/大鼠或0.6ng/gm大鼠施用，在誘導24天后，AA破壞性的炎癥幾乎完全(高達約90%)被抑制了，在24天后，相對于對照組H-1020對AA發(fā)展的抑制為約30%。反之，擴展劑H-0895，在以兩種劑量值0.1和0.4ng/大鼠誘導的約兩周內(nèi)，顯示增加了AA的發(fā)展。但是這種效果此后快速消退直至到24天，AA的記分與對照組的值基本上沒有差別。(參見圖38A)。
另一方面，還發(fā)現(xiàn)某些單糖在這種大鼠模式中顯示出了活體內(nèi)的抑制效果。如圖38B所示，以三種劑量值進行的葡糖胺處理對AA的發(fā)展的抑制達對照值的約60-80%。半乳糖胺也顯示出了抑制效果，但是比葡糖胺的抑制程度小得多。(參見圖38C)。
最有意義的是，用H-9392進行的其它的試驗，其中二糖從0天開始(AA誘導開始)或從第12天開始(大鼠已患AA)每周或每天施用，在所有情況下，對AA的嚴重程度顯示出陽性抑制。這些實驗結果示于圖38D(每周)和38E(每天)。如圖38D所示，從第12天開始每周施用H-9392的結果，即甚至在大鼠已經(jīng)患有AA后，與對照組相比至少與從開始誘導(0天)即進行每周處理同樣有效。圖38E表明雖然對患鼠的每日處理不象在誘導開始即進行每日處理那樣有效，但是與對照組相比對已患有關節(jié)炎的大鼠的每日處理對于降低AA記分仍然高度有效。
這些結果戲劇性地表明本發(fā)明的物質(zhì)不僅在防止嚴重關節(jié)炎的發(fā)展方面有效，而且在治療已患關節(jié)炎方面也有效。此外，本發(fā)明的研究工作還證實了雖然前述的LMWHs僅在每周施用時顯示出了抑制特性，但是本發(fā)明的二糖物質(zhì)當每周或每日施用時，都能夠顯示出有用的抑制活性。
做為對本發(fā)明化合物在治療實驗-誘導AA方面的優(yōu)越性的進一步說明，進行獨立的對比系列實驗，其中Lewis大鼠組(每組5只)用地塞米松磷酸鹽(購自Sigma，已知的消炎藥)或二糖9392皮下注射治療。在輔藥關節(jié)炎(AA)病誘導后12天開始治療，由二個療程組成第一療程包括每日注射已知的消炎藥;第二個療程包括每周注射已知的消炎藥或二糖。在所有情況下，用在0.1ml磷酸鹽緩沖溶液中的100μg已知消炎藥給每只大鼠施用，而也在0.1ml磷酸鹽緩沖溶液中的120ng二糖也給每只大鼠施用。對照組的大鼠僅注射0.1ml的磷酸鹽緩沖溶液。對已知消炎藥的每日劑量療程，在誘導后17天結束治療，對已知消炎藥或二糖的每周劑量療程，在誘導后26天結束治療。
上述實驗的結果示于圖38F和38G。檢查圖38F時，人們看到在第一周治療期間，每周施用二糖9392比每日施用米地塞松磷酸鹽要好。但是值得注意的是，在治療結束后(在26天后)，每日接受米地塞松磷酸鹽的大鼠組開始復發(fā)，而二糖組繼續(xù)改進。在AA的誘導后30天，二糖組遠比米地塞松磷酸鹽組要好。
而且，比較每周米地塞松磷酸鹽與每周二糖9392的效果，如圖38G所示，人們看到在AA誘導后30天，每周施用米地塞松磷酸鹽在AA記分的嚴重程度上僅適度降低。反之，在AA誘導后30天，每周施用二糖9392對實驗誘導的輔藥性關節(jié)炎導致幾乎完全抑制。再者，應特別注意的是，在用米地塞松磷酸鹽的每周治療結束后，大鼠的輔藥關節(jié)炎又復發(fā)。然而如前面所指出的，用二糖9392治療的大鼠既使在二糖的施用停止后，仍繼續(xù)改進。
因此，每周施用二糖9392的效果優(yōu)越于在長期限內(nèi)每日或每周施用米地塞松磷酸鹽。而每日或每周施用米地塞松磷酸鹽的大鼠在治療結束后，疾病復發(fā)，用二糖治療的大鼠繼續(xù)顯示改進AA的記分，反映出在治療后對疾病的繼續(xù)抑制。
6.19.4.有關多脂糖(LPS)-誘導的大鼠角膜炎的實驗結果。
LPS-誘導的角膜炎是依賴于TNF的，如Vanderhagen，C.和其同事(在Netherlands)的研究工作所表明的“KineticsofIntraocularTNF和IL-6inEndotoxin-InducedUveitisintheRat”，提出出版。利用30-標準(gauge)針頭將LPS(5ng)注射入Lewis大鼠的角膜。一天后，每組2只(或每組四只眼)的獨立組的大鼠皮下注射磷酸鹽緩沖鹽水(0.05ml)或H-1020(以50ng/鼠或200ng/鼠劑量)。結果(如果有的話)按如下評分水腫0-3分新血管形成0-3分充血1/0分腫脹1/0分出血1/0分瞳孔縮小1/0分Synaechi1/0分(虹膜粘附到晶狀體或角膜上)眼前房積膿1/0(在前腔的膿和血)模糊的角膜1/0分其中將分的總數(shù)用作總記分。
從(圖39)圖示的結果可以看出，與對照組比較，50ng/大鼠劑量可有效地抑制局部LPS-誘導的炎癥作用。令人感興趣的是，200ng/大鼠的劑量未能提供有意義的效果。
6.19.5有關多脂糖(LPS)-誘導的大鼠的眼色素炎的實驗結果。
眼色素炎是響應系統(tǒng)施用的LPS的眼前腔炎癥。像在局部施用LPS的前節(jié)中產(chǎn)生的炎癥那樣，眼色素炎是依賴于-TNF的。在本實驗中，Lewis大鼠，8-10周齡，每組8只眼，在第一天用H-9392(劑量為32ng/大鼠或500ng/大鼠)或鹽水(0.1ml)處理。在第二天，在每個腳墊注射2mg/ml的LPS溶液(50μl);每只大鼠接收的總劑量為200μgLPS。在第三天，每只眼上開口，測量蛋白質(zhì)的總濃度，做為對炎癥程度的定量評價。這些實驗結果表示如下大鼠治療中值蛋白質(zhì)(mg/ml)無LPS-0.36LPS鹽水18.4LPS32ngH-93925.2LPS500ngH-93924.8因此，以其中的任一劑量單一的施用H-9392可有效地抑制由系統(tǒng)施用LPS在鼠中產(chǎn)生的炎癥，相對對照組抑制為約70%。
6.19.6.選擇物質(zhì)的有關輻射防護效果的實驗結果。
雌BALB/c鼠組，8周齡，每組5-10只，在照射前一天，皮下注射鹽水(0.1ml，對照)、H-9392(30ng/鼠)，或葡糖胺(10000ng/鼠)，以后每周注射，直到在第30天時，實驗結束。所有實驗鼠利用60Coγ放射源照射700拉德的劑量。
然后在30天內(nèi)期間，記下不同鼠組內(nèi)的死亡率。結果表明僅接收鹽水的鼠到30天時，死亡率為100%，而已經(jīng)用H-9392預處理的鼠，在同期內(nèi)死亡率僅為40%。已用葡糖胺注射的鼠組也遠遠好于對照組，在同期內(nèi)的死亡率僅為20%。
因此，用本發(fā)明的試驗物質(zhì)進行預處理，能使得預處理的鼠在經(jīng)過照射歷程后生存下來，而該照射歷程一般對不用本發(fā)明試驗物質(zhì)預處理的鼠組在30天內(nèi)導致100%的死亡率。
在獨立的實驗組中，BALB/c鼠組(一組5只)也經(jīng)受750拉德的γ-射線的照射，不同之處只是這些鼠在照射前一天，在照射后的第6天和在照射后的第13天再一次用試驗物質(zhì)(鹽水0.1ml/鼠、H-93920.3、3、30和300ng/鼠和葡糖胺1、10和100μg/鼠)處理。在第三次即最后施用后全部治療結束。該實驗結果示于圖39X(鹽水和葡糖胺)和圖39Y(鹽水和H-9392)，并表明在照射后的第22天，對照組的所有動物都死亡，但是在30ngH-9392組中至照射后第30天僅有一只鼠死亡。300ngH-9392和1μg葡糖胺治療歷程表明對抑制在照射后的死亡率有適度的活性。
因此這些結果表明在癌癥治療方面感興趣的物質(zhì)的可利用性，其中與照射處理相聯(lián)系的毒性通過預施用本發(fā)明的化合物可被驚人地減少。這種方法也許可能允許提高照射劑量以達更高的有效值而不出現(xiàn)毒性付作用。如上述試驗所述的，本發(fā)明的化合物既使當處理限于三次施用二糖時，在某些很低的劑量下，仍然高度有效。
6.19.7.選擇物質(zhì)抑制同種[異體]移植物排異的能力。
在鼠皮膚移植排異實驗中測試H-9392的作用。具體說，按照Baharav，E.等的方法，J.Immunol.Methods(1986)90143-144將C57BL/6供者鼠(H-2b)的皮膚移植施加于受者BALB/c鼠(H-2d)上。通過移植物的脫落測量出現(xiàn)排異的天數(shù)。對對照組(僅用0.1ml鹽水注射)也測定出現(xiàn)排異的天數(shù)，在移植前一天和移植后每周實驗組通過皮下注射接收3ng或300ng的H-9392。結果圖示地示于圖40和40A，可見3ng/鼠劑量將出現(xiàn)皮膚移植排異50%的值的時間推遲了5天。但是，相同的化合物，以300ng/鼠施用，相對于對照組在50%排異時未能產(chǎn)生有意義的差別。這些結果是很有意義的，完全地異體皮膚移植的排異被認為是已知的最有力地免疫響應。
6.19.8.選擇物質(zhì)對NOD鼠中IDDM發(fā)育的抑制能力。
眾所周知，NOD鼠用作人類糖尿?、裥偷馁N切的模型。的確，在我們鼠群中所有的雌性NOD鼠中，在4-5月齡期，都自發(fā)地得了糖尿病。由于Ⅰ型的糖尿病或胰島素依賴型糖尿病毒(mellitus)(IDDM)被認為是一種可由自動反應的T細胞沉淀的自免疫疾病，因此對本發(fā)明的選擇化合物測試調(diào)節(jié)這種T細胞-介導的自免疫反應的能力。
這樣，雌性的NOD鼠組，一組6-10只，用鹽水(0.1ml)、H-9392(30ng/鼠)或葡糖胺(10000ng/鼠)皮下注射處理。所有的鼠都是約3.5月齡，如圖41所示，表明一個組的鼠已經(jīng)持續(xù)了20%的IDDM發(fā)病率。通過鼠的血液中的葡糖值可以監(jiān)測IDDM發(fā)病率。非糖尿病鼠顯示出血液中的平均葡萄糖值為140±10mg/ml。如果一只鼠的血液中的葡萄糖值等于或超過200mg/ml(即是大于“正?！敝档臉藴势畹募s三倍)的話，那么該鼠被認為是得了糖尿病。為了更簡便，利用ClnstixTM測試片(Ames)測量葡萄糖尿值。這個試驗提供的記分為0-+3，在兩個獨立時間其記分為+2或更大就認為是是糖尿病的陽性象征。
這樣人們驚奇地發(fā)現(xiàn)，H-9392和葡糖胺對在NOD鼠中糖尿的出現(xiàn)有抑制作用，在4.5月齡時，當所有對照組的鼠被認為患了糖尿病時，葡糖胺處理的鼠的僅約65%開始患糖尿病，而在H-9392處理的鼠中受這種病影響的少于50%。
換言之，圖41A表明到5月齡，所有對照組的鼠由于患糖尿病都死了。反之，在同一期間內(nèi)，用10000ng的葡糖胺處理的鼠僅約一半死亡。相當驚人的是，在相同的時間內(nèi)，用30ngH-9392處理的鼠無一只死亡，即H-9392的結果圖形與X-軸重合。
6.19.9.選擇的二糖對內(nèi)皮細胞(EC)產(chǎn)生的由TNF-α-誘導的粘性分子ICAM-1和ELAM-1的表達的影響粘性分子如ICAM-1和ELAM-1在涉及炎癥響應的白細胞的識別和隨后的“滾動”(即粘附到內(nèi)皮上和通過內(nèi)皮的遷移)是關鍵的。在響應活性TNF-α中，內(nèi)皮細胞(EC)表達ICAM-1和ELAM-1。這樣，通過上調(diào)白細胞粘附和遷移的信號TNF-α就可以擴大炎癥。為測定本發(fā)明的二糖物質(zhì)對TNF-α-誘導的EC對ICAM-1和ELAM-1的表達的影響，進行如下的實驗。
新鮮分離的人體臍靜脈EC在含10%FCS、8%人體血清、抗生素和50μg/ml內(nèi)皮細胞生長因子(EC-GM;Sigma，St.Louis，MO)的M-199(Gibco實驗室)中生長。通過將0.1ml EC-GM介質(zhì)(3.5×105細胞/ml)加到平底96-孔板中(NunK RosKilde，DenmarK)來種植EC。
匯集的單層培養(yǎng)物進行洗滌并用各種濃度選擇的二糖化合物在50μl的M-199中在37℃下培養(yǎng)一小時。然后洗去該化合物，培養(yǎng)物在預制的在EC-GM中的TNF-α200IU/ml培養(yǎng)過夜。細胞在37℃用含1%FCS(HanK's1%)HanK's溶液洗滌三次，用在PBS中的2%的戊二醛固定。所述細胞然后用1%的HanK's洗滌三次，用在PBS中的2.5%BSA封閉，再用1%的HanK's洗滌二次。抗-ICAM-1和ELAM-1mAb(Genzyme，CambridgeMA;在PBS中稀釋1/1000)與細胞在22℃培養(yǎng)一小時，然后用1%的HanK's徹底洗滌三次。過氧化酶-結合的山羊抗-鼠Ab(Sigma，稀釋1/1000)與細胞培養(yǎng)一小時，隨后洗掉。在加入通過將OPD氫氯化物片溶于水(OPD是用于過氧化酶的一種作用物，可從Sigma，Cat.No.P9187得到)來制備的O-亞苯基二胺(OPD)，在ELISA閱讀器中在492nm處檢測吸收率。樣品分三份測定，對至少三次不同的測定計算平均值。
表ⅩⅩⅢD.二糖對由響應預制TNF-α的內(nèi)皮細胞對粘性分子的表達的影響。
EC的TNF-α抑制化合物重組的人體TNF-α誘導的的處理 [pg/ml] 粘性分子(O.D 492)*:
無無0.12±0.010.18±0.01有無1.2±0.12.2±0.2有9392[50]0.6±0.11.0±0.04有9392[100]0.9±0.071.4±0.03有1020[50]0.7±0.051.2±0.1有1020[100]0.9±0.031.5±0.07＊ELAM-1和ICAM-1的表達是通過專門的單克隆抗體的ELISA粘接來檢定。
上述的實驗證實EC用二糖化合物9392及1020預處理賦予了EC顯著的耐預制TNF-α的能力。由TNF-α誘導的粘性分子的EC表達的上調(diào)被抑制達50%。這些結果意味著本發(fā)明的化合物可以影響TNF-α(例如EC)的靶細胞、以及產(chǎn)生TNF-α(例如T細胞、巨噬細胞)的細胞，不僅抑制活性TNF-α的產(chǎn)生，而且也抑制響應TNF-α(即細胞分裂素周邊接收的調(diào)節(jié))的靶細胞的傾向。因此，某些病理通過施用本發(fā)明的物質(zhì)會產(chǎn)生有利影響，即賦予TNF-α的靶細胞一種對抗該細胞誘導的炎癥響應能力，所述的響應是由活性T-細胞和原噬細胞誘發(fā)的。
6.19.10.H-9392物質(zhì)對抑制大鼠中實驗過敏性氣喘的病癥的能力實驗過敏性支氣管氣喘是鼠的一種直接型的過敏性反應，該鼠已經(jīng)過免疫然后通過吸入一種刺激性抗原的氣溶膠化溶液來再激發(fā)。(Edelman，等.，Am，Rev.Resp.Dis.(1988)1371033-37)。這種實驗疾病的病因學和病理學非常相似于自然出現(xiàn)的人體對應物。
為了評價H9392物質(zhì)對阻止支氣管氣喘攻擊的能力，6只雄性的BrownNorway大鼠通過皮下注射1mg OVA與200mg AlOH/ml的0.9%鹽水懸浮液用卵白蛋白(OVA)刺激，并在當天在腹膜內(nèi)注射含6×166加熱殺死的Bordetella百日咳菌(Pasteur Merieux，S.V.)的1ml溶液。后續(xù)激發(fā)為吸入在Devilbiss Nebulizer中的以6L/分的空氣流操作的氣溶膠化OVA(1mg/ml溶液)5分鐘。呼吸窘迫的響應(RD)記分為0級，沒有窘迫的病癥;一級，呼吸急促;二級，中度呼吸困難;三級，嚴重呼吸困難，張開咀;四級，意識喪失和肌肉緊張。初次免疫后第十六天，所有動物經(jīng)受起始的氣溶膠化劑的激發(fā)以建立陽性對照。將動物編號，使得觀察者不熟悉受試動物的歷史。所有的大鼠對OVA敏感，在所有動物中都均勻地誘發(fā)出氣喘。
在30天時，動物分成兩組，給予鹽水(對照組A)或30ngH-9392物質(zhì)，S.C.，(組B)，如上述在35天激發(fā)。結果示于圖42。如圖42所示，在30天時僅接受鹽水的動物產(chǎn)生3或4級呼吸窘迫。用H-9392物質(zhì)處理的動物僅表現(xiàn)為呼吸急促。結果表明，施用H-9392物質(zhì)(在第二次激發(fā)前5天)于已建立了過敏感性的動物，阻塞了氣喘的攻擊。
6.20.對市售衍生于肝素的低原糖的活體外的人體PBL生物測定結果對衍生于肝素的二糖和多糖的分子量為1800-18000的商購樣品測試生物活性。結果示于表ⅩⅩⅢ。如所得數(shù)據(jù)證明的，所有的測試樣品，除一個外，均為無作用或無規(guī)律性的影響。如表的腳注中說明的，如果對所有三次生物測定試驗沒有得到相同的定量結果，那么對該入口的實驗結果就標明為無規(guī)律性。(在本文表示生物測定結果的所有表中的每個入口，都是至少三次試驗的結果。在人體PBL生物測定中，每次試驗所使用的血是從不同的個體抽取的。)表ⅩⅩⅢ.商購的肝素二糖對活性TNF分泌的影響，利用人體PBL生物測定。
濃度TNF活性生物測定"R"值試驗材料a(pg/ml) (%) %×(pg/ml)-1H 9517 b 無規(guī)律性c-H8642b無規(guī)律性-H8767b無規(guī)律性-H0895b無規(guī)律性-H8892b無作用0H9017b無作用0H9142b無規(guī)律性-
表XXIII(續(xù))濃度TNF活性生物測定"R"值試驗材料a(pg/ml) (%) %×(pg/ml)-1H9267b無規(guī)律性-H1020l25%至35%25至35H9392b無規(guī)律性-MW 1,800de 無規(guī)律性 -MW2,400e無規(guī)律性-MW3,000e無規(guī)律性-MW3,600e無規(guī)律性-MW4,200e無規(guī)律性-MW4,800e無規(guī)律性-MW5,400e無作用0MW6,000e無作用0MW9,000e無作用0MW16,000e無規(guī)律性-MW18,000e無規(guī)律性-a見于SigmaChemicalCo.ProductCatalog(1992)的產(chǎn)品號。
b在1μg/ml-0.01pg/ml濃度范圍。
c利用從三個獨立的個體得到的PBLs對每種試驗材料進行三次生物測定。對某一試驗材料的試驗結果標明“無規(guī)律性”，如果所有三次生物測定沒有得到相同結果(即抑制、擴大或沒作用)。
d各種肝素低聚糖部分的分子量的表示，如在SerbioProductCatalog(1991，12，26)。
e在濃度為1μg/ml-0.01pg/ml范圍。
6.21.在活體外人體PBL生物測定相對根據(jù)mAb的kit測定的結果將在活體外按照本文描述的人體PBLs生物測定所得活性數(shù)據(jù)與基于通用單克隆抗體的kit測試結果相比較表明，在被測試的介質(zhì)的蛋白質(zhì)比通過人體生物測定的“活性”TNF要多得多。結果示于表ⅩⅩⅣ。例如，在“對照”量(約274pg/ml)中的T細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)量和當FragminHPLC-F16存在(約200Pg/ml)時，T細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量間的差別不象對同樣的樣品(活性約100%的改變)在通過人體PBL測定的活性檢定中那樣存在有戲劇性的差別。因此，人們從這些結果就得出結論，雖然活化免疫效應基因細胞可分泌顯著量的TNF蛋白質(zhì)，但是甚至在有本發(fā)明的活性物質(zhì)存在的條件下，僅少量比率分泌的蛋白質(zhì)對殺死TNF-敏感細胞是有足夠活性的。這一結論支持了產(chǎn)生的TNF有活性和無活性兩種形態(tài)的想法。
表ⅩⅩⅣ.通過人體生物測定檢定的TNF活性對通過mAb免疫測定工具檢定的蛋白質(zhì)量的比較。
TNF活性的mAbkit測定生物測定TNF試驗材料(%殺死)(pg/ml)無45control273.9對照FragminHPLC-F1 72 增加max(60%) 284.5 增加max(3.8%)HPLC-F3 13.5 抑制max(70%) 224 抑制max(17.9%)HPLC-F16 0 抑制max(100%) 199 抑制max(27%)DECMHPLC-F10 18 抑制max(60%) 225 抑制max(17.5%)HPLC-F14 13.5 抑制max(70%) 232 抑制max(15%)HPLC-F25 63 增加max(40%) 292 增加max(6.5%)HPLC-F37 90 增加max301 增加max(10%)6.22.衍生于ECM的二糖的結構特征的初步研究結果如上所述，在HPLC Ⅱ色譜法提純(圖23)和脫鹽后，得到ECM衍生的二糖的20μg樣品。在SAX-HPLC條件下進行后續(xù)純化后證實該樣品的純度為90%以上(圖24，在23.10分處有峰A23/4。)。該樣品的質(zhì)子NMR譜(圖31)表明存在帶有重復脂族-CH2-基的雜質(zhì)。不過值得注意的是，在活體內(nèi)和外的生物測定的條件下，SAX-HPLC純化的測試結果為陽性抑制。
在D20，500MHz 23℃下，記錄下質(zhì)子NMR譜。還記錄2-維的COSY譜。最終的基體大小為512×512，預飽和的N-COSY，1536掃描(圖32)。典型的糖信號確證存在于一維和2-D光譜中在3-5.5ppm之間。對異頭物的(anomeric)質(zhì)子的雙重信號發(fā)現(xiàn)是在5.39ppm，有一3Hertz的偶合因子(圖33)，與在α構型中存在的葡糖胺糖單元相一致。
異頭物質(zhì)子的化學位移與被認為是胎盤肝素酶的β-半乳糖專一性一起導致了試驗性的結論是二糖在非還原端有一葡糖胺，為α-構型，在還原端連接1→4葡糖醛酸基。而且，在6ppm時沒有信號表明二糖是飽和的(即在葡糖胺基的C4-C5處沒有雙鍵)。因此，肝素酶不是一消除酶(eliminase)，而好象是一種水解酶。
FTIR光譜用設置發(fā)射膜檢測器的Mattson Galaxy 6020來記錄;DIGS分辨率為2cm-1;利用ZnSe窗口128掃描。圖34-35表明各自存在硫酸鹽化的化合物和部分脫硫酸鹽的類似物。具體講，圖34在3500-3000(羧基和羥基的特征)、1594(羰基)、1394、1121、1107、1074、1005、993、936和852cm-1顯示出吸收，至少在其中的一些處，特別是最后，是與硫酸鹽相聯(lián)系的。
失去一些硫酸鹽的甲基衍生物的質(zhì)譜按JeolJMSHX/110AFAB得到。在E＝6KV，發(fā)射電流＝10mA，加速電壓為10KVF，來利用Xe射線。首先，在乙酸介質(zhì)中用重氮甲烷處理低聚糖樣品來制備甲基衍生物。其次甲基化了的產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取。在背景上觀察到特征離子有M/Z(M+H+)＝531。因此，人們相信，對甲基化的衍生物，數(shù)據(jù)與分子量為約530一致。為了檢驗這些結果，利用兩種不同的基質(zhì)DTT∶硫甘油(1∶1)和甲基硝基芐基醇(分別為圖36A-B和37A-B)?！癆”光譜與樣品+基質(zhì)相對應，而“B”光譜僅與具體基質(zhì)有關。
根據(jù)這樣的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，對甲基化的(部分脫硫酸鹽的)衍生物可以提出試驗性的化學式C13H23NO17S2，MW＝529.47。
4-O-(2-脫氧-6-O-硫代-2-硫氨基-α-D-吡喃(型)葡糖基)-(2-O-硫代-β-D-吡喃葡糖苷)糠醛酸是按照下面的規(guī)定合成的。
6.23.4-O-(2-脫氧-6-O-硫代-2-硫氨基-α-D-吡喃(型)葡糖基)-(2-O-硫代-β-D-吡喃葡糖苷)糠醛酸的合成6.23.1.6-O-乙?；?2-重氮基-3，5-二-O-芐基-2-脫氧-β-D-吡喃(型)葡糖基氯化物的制備從1，6-脫水-μ-D-吡喃(型)葡糖基[1]制備2-O-甲苯磺?；?1，6∶3，4-二脫水-β-D-吡喃半乳糖[2]，按照Cerny等(1961)Coll.Chech.Chem.Cos.262547。從2-O-甲苯磺?；?1，6∶3，4-二脫水-β-D-吡喃(型)葡萄糖[2]制備2-O-甲苯磺?；?1，6-脫水-β-吡喃(型)葡萄糖[3]，按照Cerny等，(1965)，Coll.Chech.Chem.Soc.301151。
從2-O-甲苯磺?；?1，6-脫水-β-D-吡喃葡萄糖[3]制備1，6∶2，3-二脫水-β-D-吡喃甘露糖[4]，按照Stanek和Cerny(1972)SYNTHeSISP.698。從1，6∶2，3-二脫水-β-D-吡喃甘露糖[4]制備6-O-乙?；?2-重氮-3，4-二-O-芐基-2-脫氧-β-D-吡喃[型]葡糖基氯化物[A]，按照Paulsen和Slenzel(1978)Chem.Ber.1112334。
6.23.2.(芐基-2-O-乙?；?3-O-芐基-β和α-L-吡喃[型]葡糖苷)糖醛酸甲酯的制備按Stevens(1978)，MethodsCarbohydr.Chem.6124，從D-葡萄糖[5]制備1，2∶5，6-二-O-異亞丙基-α-D-呋喃[型]葡萄糖[6]。按照Whistler和Lake(1972)，MethodsCarbohydr.Chem.6286，從1，2∶5，6-二-O-異亞丙基-α-D-呋喃[型]葡萄糖[6]制備3-O-芐基-1，2-O-異亞丙基-α-D-呋喃[型]葡萄糖[7]。
按照Jacquinet等，(1984)，Carbohydr.Res.130221，從3-O-芐基-1，2-O-異亞丙基-D-呋喃[型]葡萄糖[7]制備(芐基-2-O-乙酰基-3-O-芐基-β和α-L-吡喃[型]葡糖苷)-糠醛酸甲酯。
6.23.3.6.23.1和6.23.2產(chǎn)物的縮合按照Jacquinet等，(1988)，Carbohydr.Res.174253使上述6.23.1和6.23.2節(jié)的產(chǎn)物進行縮合反應。按照Jacquinet等(1984)(supra)進行O-脫乙?；磻?、水解反應、O-硫酸鹽化作用、還原反應和脫芐基化作用，制得4-O-(2-脫氧-6-O-硫代-2-硫氨基-α-D-吡喃[型]葡糖基)-(2-O-硫代-β-D-吡喃葡糖苷)糠醛酸，按照Rice等，(1985)，Anal.Biochem.150325通過SAX-HPLC將其進一步純化。在圖43中示出了這種產(chǎn)物的結構，人們認為與本文上述的其它化合物相比較，它具有相同的生物活性。
本領域內(nèi)的普通技術人員十分清楚，由此還可預見到在本說明書中沒有具體敘述的其它的組合物及方法。這些其它的組合物及方法都被認為是在本發(fā)明的范圍和實質(zhì)內(nèi)容內(nèi)的。因而，本發(fā)明不應該受本文公開的一些特征實施方案的限制，而僅受后述的權利要求書的限制。
本文引述的所有參考文獻公開的內(nèi)容本文都結合作為參考。
權利要求
1.一種抑制活性TNF-α產(chǎn)生的藥物組合物，含有式(Ⅰ)的雙糖或其可藥用鹽以及可藥用載體，
其中X1為氫或硫酸基；X2為氫或硫酸基；且X3為硫酸基或乙酰基，假定X3是硫酸基，則X1或X2中的至少一個為硫酸基并且如果X3是乙?；?，則X1和X2均為硫酸基。
2.權利要求1的藥物組合物，其中所述的雙糖是2-O-硫酸基-4-脫氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-硫酸葡糖胺。
3.權利要求1的藥物組合物，其中所述的雙糖是4-脫氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-硫酸基-6-O-硫酸葡糖胺。
4.權利要求1的藥物組合物，其中所述的雙糖為2-O-硫酸基-4-脫氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-硫酸基-6-O-硫酸葡糖胺。
5.權利要求1的藥物組合物，其中所述的雙糖為2-O-硫酸基-4-脫氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-乙?；?6-O-硫酸葡糖胺。
6.一種用于增加活性TNF-α產(chǎn)生的藥物組合物，含有4-脫氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-乙酰葡萄糖胺或其可藥用鹽以及可藥用載體。
7.權利要求1或6的藥物組合物適于經(jīng)非胃腸道給藥。
8.權利要求1或6的藥物組合物適于口服給藥。
9.權利要求1或6的藥物組合物適于局部給藥。
10.一種用于抑制活性TNF-α產(chǎn)生的藥物組合物，含有一種化合物和一種可藥用載體，該化合物為N-硫酸化的或N-乙?；?-脫氧-4-烯-糖醛葡糖胺或其可藥用鹽，上述化合物如果是N-硫酸化的，應另外至少具有一個硫酸基團，上述化合物如果是N-乙?；膽辽倬哂袃蓚€硫酸基團。
11.一種用于增加活性TNF-α產(chǎn)生的藥物組合物，含有非-硫酸化的N-乙酰化的4-脫氧-4-烯-葡糖醛葡糖胺或其可藥用鹽以及可藥用載體。
12.一種抑制主體中活性細胞分裂素產(chǎn)生的方法，包括給上述主體施用有效量的式(Ⅰ)的雙糖或其可藥用鹽;
(Ⅰ)的化合物，其中X1為氫或硫酸基;X2為氫或硫酸基;且X3為硫酸基或乙?；?，假定X3是硫酸基，則X1或X2中的至少一個為硫酸基，并且如果X3是乙?；瑒tX1和X2均為硫酸基。
13.一種增加主體中活性細胞分裂素的產(chǎn)生的方法，包括給該主體施用有效量的雙糖或其可藥用鹽，上述雙糖為4-脫氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-乙?；咸前?。
14.權利要求12或13的方法，其中所述化合物或其可藥用鹽是每日給藥的。
15.權利要求12或13的方法，其中所述化合物或其可藥用鹽是每周給藥的。
16.權利要求12或13的方法，其中所述化合物或其可藥用鹽是經(jīng)非胃腸道、口服或局部給藥的。
17.一種抑制主體中活性細胞分裂素產(chǎn)生的方法，包括給上述主體施用有效量的權利要求10的藥物組合物。
18.一種增加主體中活性細胞分裂素產(chǎn)生的方法，包括給上述主體施用有效量的權利要求11的藥物組合物。
19.一種用化合物來制備用于預防或治療由TNF-α的不當產(chǎn)生引起的或與此有關的病癥的藥物組合物的方法，上述化合物為N-硫酸化的或N-乙酰化的4-脫氧-4-烯-糖醛葡糖胺或其可藥用鹽，上述化合物如果是N-硫酸化的，應另外至少具有一個硫酸基團，且上述化合物如果是N-乙酰化的應具有兩個至少硫酸基團。
20.一種用非-硫酸化的N-乙酰化的4-脫氧-4-烯-糖醛葡糖胺化合物或其可藥用鹽制備用于治療與增加TNF-α產(chǎn)生有關的病癥的藥物組合物的方法。
21.一種預防或治療由于受治療者中的活性細胞分裂素的不當產(chǎn)生引起的或與此有關的病癥的方法，包括給上述受治療者施用有效量的化合物，該化合物為N-硫酸化的或N-乙?；?-脫氧-4-烯-糖醛葡糖胺或其可藥用鹽，上述化合物如果是N-硫酸化的，應另外至少具有一個硫酸基團，且上述化合物如果是N-乙?；膽辽倬哂袃蓚€硫酸基團。
22.一種治療與受治療者中活性細胞分裂素的產(chǎn)生增多有關的病癥的方法，包括給上述受治療者施用有效量的非硫酸化的N-乙酰化的4-脫氧-4-烯-糖醛葡糖胺或其可藥用鹽。
23.權利要求19或21的方法，其中所述化合物為2-O-硫酸基-4-脫氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-硫酸葡糖胺。
24.權利要求19或21的方法，其中所述化合物為4-脫氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-硫酸基-6-O-硫酸葡糖胺。
25.權利要求19或21的方法，其中所述化合物為2-O-硫酸基-4-脫氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-硫酸基-6-O-硫酸葡糖胺。
26.權利要求19或21的方法，其中所述的化合物為2-O-硫酸基-4-脫氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-乙?；?6-O-硫酸葡糖胺。
27.權利要求20或22的方法，其中所述的化合物是4-脫氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脫氧-2-N-乙酰基葡糖胺。
28.權利要求19或21的方法，其中所述的病癥為自身免疫性疾病。
29.權利要求19或21的方法，其中所說的病癥選自胰島素依賴的糖尿病、牙周病、炎性腸疾病、皮膚病、葡萄膜炎、類風濕疾病、慢性炎癥、多出血癥、紅斑狼瘡、動脈粥樣硬化、關節(jié)炎、脈管炎和過敏癥。
30.權利要求20或22的方法，其中所說的病癥是腫瘤、病毒感染、細菌感染或真菌感染。
31.權利要求20或22的方法，其中所說的病癥是基礎皮膚癌，鱗狀細胞癌或黑素瘤。
32.權利要求12、13、17、18、21或22的方法，其中所說的細胞分裂素選自IL-1、IL-6、IL-8或TNF-α。
33.一種治療受治療者疾病的方法，包括給上述受治療者施用有效量的化合物，該化合物為N-硫酸化的或N-乙?；?-脫氧-4-烯-糖醛葡糖胺或其可藥用鹽，上述化合物如果是N-硫酸化的，應另外至少具有一個硫酸基團，且上述化合物如果是N-乙?；膽辽倬哂袃蓚€硫酸基團;上述疾病選自胰島素依賴的糖尿病、牙周病、炎性腸疾病、皮膚病、葡萄膜炎、類風濕疾病、慢性炎癥、多出血癥、紅斑狼瘡、動脈粥樣硬化、關節(jié)炎、脈管炎和過敏癥。
34.一種用于治療疾病的藥物組合物，含有化合物和可藥用載體，該化合物為N-硫酸化的或N-乙酰化的4-脫氧-4-烯-糖醛葡糖胺或其可藥用鹽，上述化合物如果是N-硫酸化的，應另外至少具有一個硫酸基團，且上述化合物如果是N-乙?；膽辽倬哂袃蓚€硫酸基團;上述疾病選自胰島素依賴的糖尿病、牙周病、炎性腸疾病、皮膚病、葡萄膜炎、類風濕疾病、慢性炎癥、多出血癥、紅斑狼瘡、動脈粥樣硬化、關節(jié)炎、脈管炎和過敏癥。
35.權利要求34的藥物組合物是單劑量形式的。
36.一種抑制受治療者同種異體移植排斥的方法，包括給上述受治療者施用有效量的化合物，該化合物為N-硫酸化的或N-乙?；?-脫氧-4-烯-糖醛葡糖胺或其可藥用鹽，上述化合物如果是N-硫酸化的，應另外至少具有一個硫酸基團，且上述化合物如果是N-乙酰化的應至少具有兩個硫酸基團。
37.權利要求36的方法，其中所述的同種異體移植為器官移植。
38.權利要求37的方法，其中所說的器官為心臟、肝臟、腎臟或骨髓。
39.權利要求36的方法，其中所說的同種異體移植為皮膚移植。
40.一種抑制受治療者粘著分子表達的方法，包括給上述受治療者施用有效量的化合物，該化合物為N-硫酸化的或N-乙?；?-脫氧-4-烯-糖醛葡糖胺或其可藥用鹽，上述化合物如果是N-硫酸化的，應另外至少具有一個硫酸基團，且上述化合物如果是N-乙?；膽辽倬哂袃蓚€硫酸基團。
41.權利要求40的方法，其中所說的粘著分子是ICAM-1或ELAM-1。
42.一種用于定量測定被測試物對活性TNF-α分泌影響的體外生物分析法，該生物分析法包括如下步驟在含有不同濃度的測試物質(zhì)的培養(yǎng)基中預先培養(yǎng)人體CD4+T細胞，加入一恒量的激動劑，該激動劑在沒有上述測試物質(zhì)的存在下能通過T細胞有效地誘導TNF-α的分泌，在足夠的一段時間后收集該培養(yǎng)物，并測定培養(yǎng)物中TNF-α的活性。
43.一種用于調(diào)節(jié)受治療者中細胞分裂素活性的藥物組合物，含有有效抑制或增加上述受治療者中細胞分裂素活性的物質(zhì)，上述物質(zhì)含有羧酸化和/或硫酸化的寡糖或其可藥用鹽和可藥用載體，并且上述物質(zhì)表現(xiàn)出非零的如由測定小鼠的相應的實驗性DTH反應的體內(nèi)分析方法測定的“R”值，所述的小鼠是以范圍從0到約2μg/gm小鼠的不同劑量的上述物質(zhì)處理過的。
44.權利要求43的藥物組合物，其中所說的物質(zhì)能有效抑制上述受治療者中細胞分裂素的活性，所述的物質(zhì)表現(xiàn)出非零的抑制性“R”值。
45.權利要求43的藥物組合物，其中所說的物質(zhì)能有效增加上述受治療者中細胞分裂素的活性，所述的物質(zhì)表現(xiàn)出非零的抑制性“R”值。
46.權利要求43、44或45的藥物組合物，其中所述的寡糖是雙糖。
47.權利要求43、44或45的藥物組合物，其中所述的寡糖是羧酸化的雙糖。
48.權利要求43、44或45的藥物組合物，其中所述的寡糖是羧酸化和硫酸化的雙糖。
49.權利要求45的藥物組合物，其中所述的寡糖是羧酸化的但非硫酸化的雙糖。
50.權利要求43、44或45的藥物組合物，其中所述的細胞分裂素選自IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α。
51.權利要求46的藥物組合物，其中所述的細胞分裂素是TNF-α。
52.權利要求44的藥物組合物，其中所述的物質(zhì)為H-1020或其可藥用鹽。
53.權利要求44的藥物組合物，其中所述的物質(zhì)為H-9517或其可藥用鹽。
54.權利要求44的藥物組合物，其中所述的物質(zhì)為H-9392或其可藥用鹽。
55.權利要求44的藥物組合物，其中所述的物質(zhì)為H-9267或其可藥用鹽。
56.權利要求44的藥物組合物，其中所述的物質(zhì)為H-0895或其可藥用鹽。
全文摘要
本文公開了含基本上是純化狀的羧基化的和/或硫酸化的低聚糖的物質(zhì)，包括含該物質(zhì)的組合物和使用該物質(zhì)的方法，本文公開的物質(zhì)能夠用來調(diào)節(jié)宿主中細胞分裂素的活性。例如，Tumor Nccrosis Fac-tor Alpha(TNF-α)的分泌可以通過給宿主施用有效量的含有基本上為純化狀的專門的低聚糖的物質(zhì)或它們的組合物來抑制或增加。因此，本發(fā)明也是關于藥物組合物和它們在防止和/或治療涉及活性細胞分裂素例如TNF-α分泌的誘導的病理過程的應用。本發(fā)明還是關于誘發(fā)宿主對存在的包括病原體的活化劑的所需的有關免疫系統(tǒng)的響應。本發(fā)明的物質(zhì)和醫(yī)藥組合物可以很低的有效劑量每日施用，一般低于0.1mg/kg人體，或以高達約5—8天的間隔使用，優(yōu)選每周一次施用。
文檔編號A61P3/08GK1093904SQ93121328
公開日1994年10月26日 申請日期1993年11月10日 優(yōu)先權日1992年11月10日
發(fā)明者I·R·科恩, O·里德, L·卡哈龍, O·索塞耶夫, R·馬加力特 申請人:耶達研究及發(fā)展有限公司