專利名稱：轉(zhuǎn)化植物的方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物遺傳工程的基因?qū)爰夹g(shù)，尤其是通過注射手段把外源基因?qū)胧荏w植物的方法和裝置。
目前針對植物的基因?qū)爰夹g(shù)有多種，其中包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，PEG(polyethylene glycol)介導(dǎo)法，電擊法(electroporation)，基因槍法等等。然而，這些技術(shù)受到植物種類的強烈限制，如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法主要只對雙子葉植物有效;有些技術(shù)則受到植物組織培養(yǎng)要求的限制，如PEG介導(dǎo)法和電擊法，要求成熟的植物原生質(zhì)體分離、培養(yǎng)和再生體系;基因槍方法也需要植物愈傷組織的誘導(dǎo)、培養(yǎng)和植物再生技術(shù)的配合。目前擺脫了植物組織培養(yǎng)技術(shù)限制的轉(zhuǎn)化方法有三類，即花粉介導(dǎo)法、花粉管通道法和注射法。然而由于這些方法的受體是整體植株，存在著許多不可控因素，所以不易重復(fù)和驗證，各有缺陷，下面依次說明。
花粉介導(dǎo)法是外源基因與植物花粉共混合，或以顯微注射，基因槍等手段將外源基因?qū)牖ǚ酆?，把受處理的花粉授給相應(yīng)的雌穗，以期得到含有外源基因的種子(Ohta，1986.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83∶715-719)。由于花粉離體后一段時間活力即會下降甚至死亡，受過處理后活力也會下降，而且攜帶的外源基因無論在花粉粒表面還是內(nèi)部，只能以相當(dāng)?shù)偷谋壤ㄟ^花柱而進(jìn)入子房和胚囊。故而迄今具備充分說服力的實驗證據(jù)并不多。
花粉管通道法是指在授粉后的植物花柱柱頭上或柱頭斷面上，涂抹外源DNA溶液，由花粉管通過花柱進(jìn)入胚囊留下的通道，自發(fā)地將外源基因吸收到胚囊中去轉(zhuǎn)化合子，從而得到含有外源基因的種子(龔荼荼等，1988，中國科學(xué)(B輯)，6∶611-614)。由于外源DNA分子在所說的花粉管通道中的運動機制尚不清楚，在進(jìn)入胚囊的過程中受到核酸酶的威脅，能夠進(jìn)入合子的外源基因數(shù)量和完整性都存在問題，所以具有完備證據(jù)的實例也很有限。
注射法是指以注射器將外源基因直接注入植物子房(劉博林等，1989，中國科學(xué)(B輯)，89(7)∶699-705)或幼穗腔(de la Pena等，1987，Nature，325∶274-276)，使外源基因進(jìn)入配子或合子細(xì)胞，發(fā)育成熟后得到含有外源基因的種子。由于常用的注射裝置為一般的醫(yī)用注射器、微量上樣器或略加改裝的裝置，注射過程中對植物子房傷害較大，注射量不易控制，操作不便。而且注射后的子房容易敗育，注射時機和位置要求一定的技巧，所以也受到很大限制。
本發(fā)明的目的在于提供一種通過注射手段轉(zhuǎn)化植物的方法及裝置，克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷，提高轉(zhuǎn)化效率和可重復(fù)性。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施來實現(xiàn)一種轉(zhuǎn)化植物的方法，包括以下步驟a.分離純化目的基因DNA;b.將分離出的目的基因配制成含有20mM/l MgCl21.5mM/l硼酸、5%PEG 6000(w/v)和目的基因DNA的注射緩沖液;c.對受體植物進(jìn)行套袋隔離，人工授粉一段時間后，用注射方法將上述注射緩沖液注入子房;d.在注射創(chuàng)傷處及周圍輕涂凡士林軟膏，以防霉菌侵染;e.重新隔離受注射的子房，直至種子成熟，收獲后進(jìn)行分子驗證。注入每個子房的緩沖液量為2μl。
用于上述轉(zhuǎn)化的注射裝置，包括微針、微針固定旋紐、針筒和推進(jìn)旋紐，該裝置是通過旋轉(zhuǎn)推進(jìn)取樣和注射的。
本發(fā)明的優(yōu)點在于1.與其他轉(zhuǎn)化技術(shù)相比，本發(fā)明的應(yīng)用范圍不受植物種類和基因型的限制，可對任何感興趣的作物品系實施，有利于目的基因在農(nóng)業(yè)育種和大田生產(chǎn)上的應(yīng)用;本技術(shù)不需要組織培養(yǎng)和植株再生過程，縮短了工作周期。
2.與其他的注射技術(shù)相比，本發(fā)明中特殊的注射緩沖液配方使目的基因受到保護，免受植物細(xì)胞內(nèi)核酸酶的降解;注射裝置使注射針對子房的傷害大大降低，并可以定量控制注射量;有效的保護手段(凡士林軟膏涂抹)使注射后的子房不易受霉菌侵染，種子得率大大提高，從百分之幾提高到百分之五十左右，轉(zhuǎn)化率也隨之提高。
3.簡單易行，易于重復(fù)和驗證。


圖1是本發(fā)明轉(zhuǎn)化用注射裝置的立體圖;
圖2是圖1所示裝置的剖視圖;
圖3是圖1所示裝置的組裝示意圖;
圖4是轉(zhuǎn)基因植株葉片DNA Southern雜交結(jié)果;
圖5是轉(zhuǎn)化植株的自交后代葉片DNA經(jīng)PCR擴增結(jié)果;
圖6是丁4號植株葉片DNA PCR擴增結(jié)果;圖7是丁4號植株葉片DNA多酶切Southern雜交結(jié)果;
圖8是轉(zhuǎn)基因植株葉片DNA Southern雜交結(jié)果;
圖9是轉(zhuǎn)Bar基因植株葉片DNA Southern雜交結(jié)果;
圖10是田間噴施除草劑Basta的情況，大部分植株枯死，只有轉(zhuǎn)基因植株存活;
圖11是敏感植株與轉(zhuǎn)基因植株(綠色)在噴施了除草劑Basta的對比情況。
下面將結(jié)合附圖和實施例詳細(xì)介紹本發(fā)明實施例1將Bt基因?qū)胗衩鬃越幌礟136采用本發(fā)明中敘述的方法將蘇云金桿菌的毒蛋白基因(Bacillus thuringiensis.簡稱Bt)注入了玉米自交系P136的胚囊，將收獲到的種子播種，對長出的小苗進(jìn)行PCR擴增和分子雜交鑒定，結(jié)果表明在檢測的種子中有一株為轉(zhuǎn)基因植株，并在其后代植株中也檢出了Bt基因序列。說明本方法能夠有效地將外源基因?qū)胫参?，而且?dǎo)入的外源基因能夠遺傳到后代，參見圖4和圖5。
實施例2將Bt基因?qū)胗衩讍谓环N農(nóng)大60為了進(jìn)一步驗證本發(fā)明的效果，再一次以Bt基因作為目的基因進(jìn)行玉米子房注射，從得到的種子中經(jīng)PCR擴增和分子雜交鑒定，又鑒定出一株轉(zhuǎn)基因玉米，定名為丁4號。
圖7是丁4號植株葉片DNA經(jīng)PCR擴增的結(jié)果，圖8是丁4號植株葉片DNA經(jīng)EcoR I，Bgl Ⅱ和Acc I三種酶分別酶切后的Southern雜交結(jié)果，不僅證實了Bt基因已整合在玉米染體上，而且只有一個拷貝，結(jié)果見圖6和圖7。
實施例3將Bt基因?qū)胗衩鬃越幌礟138為了擴大轉(zhuǎn)基因植株群體，以Bt基因?qū)τ衩鬃越幌礟138進(jìn)行了子房注射。經(jīng)篩選鑒定出三株轉(zhuǎn)基因植株，同時在丁4號的子代植株中也檢出了Bt基因，結(jié)果如圖8所示。
上圖所示的結(jié)果表明，經(jīng)注射進(jìn)入丁4號的Bt基因傳遞到了后代;Bt基因同樣能夠進(jìn)入玉米自交系P138中。
實施例4將Bar基因?qū)胗衩鬃越幌礟138由以上三例可見，用注射手段能夠?qū)t基因分別導(dǎo)入玉米自交系P136和P138及單交種農(nóng)大60，證實本技術(shù)不受植物種系的限制;而且注入植物的目的基因可以傳遞到后代。為了驗證其他基因的效果，還將抗除草劑基因Bar基因?qū)胗衩鬃越幌礟138，檢出了Bar基因的序列，如圖9所示，而且得到的植株對除草劑具有明顯的抵抗力，進(jìn)一步證實采用本發(fā)明技術(shù)導(dǎo)入植物的外源基因是完整的，可以正常發(fā)揮功能，如圖10、11所示。
參見圖1、2、3，用于轉(zhuǎn)化的注射裝置，包括微針(1)、微針固定旋紐(2)、針筒(6)和推進(jìn)旋紐(7)，通過旋轉(zhuǎn)推進(jìn)取樣和注射，微針(1)是用毛細(xì)玻璃管加熱拉制而成，微針固定旋紐(2)中央設(shè)有放置微針的孔，針筒(6)兩端內(nèi)壁設(shè)有螺紋，用于安裝微針固定旋紐(2)和推進(jìn)旋紐(7)，在安裝微針一端的內(nèi)壁還設(shè)有一凸緣，推進(jìn)旋紐(7)推桿的端頭部分有一凹槽，用于安裝密封圈(5)，針筒的前端設(shè)有彈性墊圈(3)和剛性墊圈(4)。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)化植物的方法，包括以下步驟a.分離純化目的的基因DNA；b.將分離出的目的基因配制成含有20mM/l MgCl21.5mM/l硼酸、5%PEG 6000(w/v)和目的基因DNA的注射緩沖液；c.對受體植物進(jìn)行套袋隔離，人工授粉一段時間后，用注射方法將上述注射緩沖液注入子房；d.在注射創(chuàng)傷處及周圍輕涂凡士林軟膏，以防霉菌侵染；e.重新隔離受注射的子房，直至種子成熟，收獲后進(jìn)行分子驗證。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所用目的基因是蘇云金桿菌的毒蛋白基因Bt基因。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所用目的基因是抗除草劑基因Bar基因。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于受體植物是玉米自交系P136、P138或玉米單交種農(nóng)大60。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于注入每個子房的注射緩沖液為2μl。
6.一種用于轉(zhuǎn)化的注射裝置，包括微針(1)、微針固定旋紐(2)、針筒(6)和推進(jìn)旋紐(7)，該裝置是通過旋轉(zhuǎn)推進(jìn)取樣和注射的。
7.如權(quán)利要求6所述的裝置，其特征在于所述微針(1)是用毛細(xì)玻璃管加熱拉制而成，微針固定旋鈕(2)中央設(shè)有放置微針的孔。
8.如權(quán)利要求6所述的裝置，其特征在于針筒(6)兩端內(nèi)壁設(shè)有螺紋，用于安裝微針固定旋鈕(2)和推進(jìn)旋鈕(7)，在安裝微針一端的內(nèi)壁還設(shè)有一凸緣。
9.如權(quán)利要求6所述的裝置，其特征在于推進(jìn)旋鈕(7)推桿的端頭部分有一凹槽，用于安裝密封圈(5)。
10.如權(quán)利要求6所述的裝置，其特征在于針筒的前端設(shè)有彈簧墊圈(3)和剛性墊圈(4)。
全文摘要
一種轉(zhuǎn)化植物的方法及裝置，屬于植物遺傳工程的基因?qū)爰夹g(shù)，該方法如下將分離出的目的基因配制成含有20mM/1MgCl
文檔編號A61M5/178GK1110320SQ9410339
公開日1995年10月18日 申請日期1994年4月7日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月7日
發(fā)明者丁群星, 謝友菊 申請人:丁群星