專利名稱：犬用口服狂犬病疫苗及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及狂犬病疫苗，特別是涉及采用口服途徑免疫犬的狂犬病疫苗，制備該疫苗的病毒株的方法，及以該病毒株為毒種，生產(chǎn)犬用口服狂犬病疫苗的方法。
狂犬病是一種由狂犬病病毒引起的人畜共患的烈性病毒性疾病，目前尚無特效治療措施，一經(jīng)感染發(fā)病，死亡率幾乎達(dá)百分之百。
中國(guó)自本世紀(jì)六十年代以來，狂犬病的發(fā)病率不斷上升，三十年來累計(jì)死亡總數(shù)已達(dá)15萬人。家畜(馬、牛、羊、豬、梅花鹿等)患狂犬病死亡，每年以千計(jì)。狂犬病不僅威脅人民健康，危及生命，而且給國(guó)際往來、旅游開發(fā)、農(nóng)牧業(yè)發(fā)展以及公共衛(wèi)生等帶來嚴(yán)重影響。
世界上很多國(guó)家，如瑞典、葡萄牙、英國(guó)和日本等國(guó)已消滅了狂犬病，但在發(fā)展中國(guó)家(含中國(guó))通過家犬傳播而患狂犬病者占患病總?cè)藬?shù)的95%?？袢蕉?，狂犬病患例也相應(yīng)增加。瑞士、加拿大等國(guó)由于采取對(duì)動(dòng)物接種疫苗等綜合性防治措施，已基本控制了狂犬病的流行。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)報(bào)告，目前全世界有87個(gè)國(guó)家存在狂犬病，而且大部分屬于發(fā)展中國(guó)家。這些國(guó)家的狂犬病死亡人數(shù)，占全球狂犬病例總數(shù)的99%。中國(guó)每年被狂犬咬傷及狂犬病死亡人數(shù)僅次于印度，居世界第二位。國(guó)外經(jīng)驗(yàn)表明，當(dāng)狂犬病在一特定地區(qū)連續(xù)流行時(shí)，強(qiáng)調(diào)以控制動(dòng)物傳染源作為基本預(yù)防措施。有人曾報(bào)道用口服疫苗免疫狐貍(參見G、M、Baeretal.，Develop.Biol.Standar.33:417，1976)，但涉及家犬口服狂犬病疫苗的研究尚未見報(bào)道。
在中國(guó)，家犬注射狂犬病疫苗已收到一定成效(參見黑龍江省綏化地區(qū)衛(wèi)生防疫站等生物制品通訊9(2)59，1980郭一德等家畜傳染病421，1984)，然而以胃腸道外途徑(如肌肉注射)大量免疫家犬，需動(dòng)員和組織大量人力，而且在實(shí)際操作中咬傷防疫人員的事例屢有發(fā)生。因此，迫切需要開發(fā)一種使用方便、能有效地預(yù)防犬的狂犬病病毒感染，以切斷犬-人之間狂犬病傳播，從而有效地預(yù)防人狂犬病的新型狂犬病疫苗。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種制備犬用口服狂犬病減毒活病毒株的方法，該方法包括從死于狂犬病患者尸體的新鮮腦組織中分離到的狂犬病病毒，在小鼠腦內(nèi)連續(xù)傳50～60代，獲得毒力明顯降低但免疫原性良好的疫苗毒株，然后將此毒株轉(zhuǎn)移到人胚肺二倍體細(xì)胞株中連續(xù)傳40～50代，再回傳到小鼠腦內(nèi)傳2～10代，即得到本發(fā)明的犬用口服狂犬病疫苗毒株，該毒株定名為22號(hào)毒種。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一株減毒的活狂犬病病毒株，該毒株已于19年月日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏登記號(hào)CCTCCNO本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種以本發(fā)明的22號(hào)毒種作為犬用口服狂犬病疫苗的毒種，大規(guī)模生產(chǎn)該疫苗的方法。該方法包括將毒種稀釋后接種于小鼠腦內(nèi)，體內(nèi)培養(yǎng)5-7天，待小鼠典型發(fā)病后，以無菌手續(xù)解剖取腦，研磨成腦懸液，加入適當(dāng)保護(hù)劑后，真空冷凍干燥。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種經(jīng)口服途徑免疫犬，使之免于染患狂犬病的免疫方法。該方法包括將預(yù)防狂犬病有效量的本發(fā)明犬用狂犬病疫苗混入半流質(zhì)食物中喂飼處于饑餓狀態(tài)的被免疫犬。
Ⅰ、犬用口服狂犬病疫苗毒株的制備解剖典型狂犬病患者尸體，取腦組織以無菌手續(xù)研成組織勻漿，并以2%牛血清蒸餾水為稀釋液，制成10%腦懸液。取上清液0.03ml腦內(nèi)注射小鼠，待典型發(fā)病后，解剖取腦，制成腦懸液后，再次腦內(nèi)注射小鼠，如此連續(xù)傳50～60代。小白鼠腦內(nèi)接種后至出現(xiàn)典型癥狀之間的潛伏期，由于傳代數(shù)目的增加，潛伏期相應(yīng)縮短，第1～5代為11～14天，傳至第46～53代時(shí)，潛伏期縮短為5～6天。皮下接種毒力隨著腦內(nèi)傳代數(shù)增加，由大約4.20遞減至大約1.50，最終獲得腦內(nèi)毒力穩(wěn)定在5.50至6.34(LogLD50)的減弱毒株。
為了進(jìn)一步培育適合制備犬用口服狂犬病疫苗的毒株，將上述小鼠腦組織內(nèi)適應(yīng)的51～53代毒株，轉(zhuǎn)移至人胚肺二倍體細(xì)胞株KMB-17(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明)，傳至第47代后，再回傳小鼠腦組織內(nèi)傳2～5代，即得到定名為22號(hào)毒種的犬用口服狂犬病疫苗毒種。
將按上述方法獲得的22號(hào)毒種，制成5%小鼠腦懸液，給1個(gè)月齡小狗一次口服4ml，口服前血清抗體為陰性，口服后1個(gè)月，抗體陽轉(zhuǎn)率達(dá)到90%，抗體滴度達(dá)1∶16～1∶32。
Ⅱ、犬用口服狂犬病疫苗的工業(yè)化生產(chǎn)首先取22號(hào)毒種，作為毒種種子液，用2%小牛血清蒸餾水稀釋成1∶200，腦內(nèi)接種體重11～13克小鼠，每只接種量0.03ml(相當(dāng)5000LD50病毒量)，體內(nèi)培養(yǎng)5～7天。經(jīng)潛伏期后選擇出現(xiàn)典型狂犬病癥狀的小鼠，以1‰新潔爾滅浸泡洗滌3次，進(jìn)行皮毛消毒，每次不少于15分鐘。然后以無菌手續(xù)解剖小鼠取腦，用電動(dòng)組織研磨器以每分鐘1萬轉(zhuǎn)的速度將無菌小鼠腦研磨成勻漿，然后加入2%牛血清蒸餾水，制成5%小鼠腦懸液。取樣滴定病毒滴度，要求小鼠腦內(nèi)LogLD50/0.03ml不低于6.0。加入50%(V/V)脫脂牛乳作為凍干保護(hù)劑，分裝后經(jīng)冷凍真空干燥成品，于-10℃保存，有效期1年。
Ⅲ、口服免疫方式向上述工業(yè)化生產(chǎn)的疫苗(凍干制品)內(nèi)加入4ml滅菌蒸餾水，待疫苗充分均勻懸浮后，倒入已煮熟并冷卻的糊狀或半流質(zhì)食物，如玉米粥或大米粥內(nèi)攪拌，使疫苗與食物充分混勻后喂家犬，并須一次喂完。為了避免不能一次吃完，可在喂疫苗前一天，給家犬適當(dāng)造成饑餓狀態(tài)，以達(dá)到一次喂苗成功。
國(guó)外加拿大等國(guó)，研制的狐用口服狂犬病疫苗，將疫苗封熔于塑料片，插入熏雞頭內(nèi)，或嵌入香腸內(nèi)作為誘餌。為適合中國(guó)農(nóng)村實(shí)際情況，必須尋找一種既方便又經(jīng)濟(jì)的喂食方式，我們經(jīng)過反復(fù)摸索，最終確定為每只犬喂4ml(1.3億LD50)劑量及拌食為最佳方式。在服苗后1個(gè)月，家犬的血清抗體陽轉(zhuǎn)率可達(dá)90%以上，1～6個(gè)月抗體滴度(GMT)保持在1∶42～1∶76，至免疫后15個(gè)月仍達(dá)1∶34以上。
迄今為止，我們已使用按本發(fā)明方法工業(yè)化生產(chǎn)的犬用口服狂犬病疫苗，在中國(guó)狂犬病流行地區(qū)(福建省莆田縣、廣西壯族自治區(qū)玉林縣、吉林省農(nóng)安縣)1985～1986年連續(xù)2年共口服免疫家犬19196只，以進(jìn)行流行病學(xué)效果觀察。其中免疫組包括2個(gè)鄉(xiāng)，對(duì)照組包括2個(gè)鄉(xiāng)。免疫鄉(xiāng)于口服免疫后83天，因一外來狂犬竄入，咬傷已口服免疫犬7只，觀察1年7只被咬犬均未出現(xiàn)任何狂犬病癥狀，同期內(nèi)咬傷未免疫豬1頭，后來發(fā)生狂犬病導(dǎo)致死亡。所有免疫鄉(xiāng)家犬在免疫后觀察1年，未見狂犬病發(fā)生。相反，對(duì)照鄉(xiāng)則發(fā)現(xiàn)染患狂犬病家犬20只。繼續(xù)觀察10個(gè)月，對(duì)照鄉(xiāng)出現(xiàn)狂犬37只。上述觀察結(jié)果表明用本發(fā)明的犬用口服狂犬病疫苗給家犬免疫可顯著降低家犬狂犬病發(fā)病率。
Ⅳ、犬用口服狂犬病疫苗的安全性上述流行病學(xué)的有效觀察，為了檢驗(yàn)該疫苗不同地域條件對(duì)疫苗效果的影響，效果觀察的地區(qū)包括中國(guó)狂犬病流行區(qū)的東北吉林省及華南地區(qū)的廣西、福建。合計(jì)觀察19425只家犬除了證明其流行病學(xué)效果外，亦未發(fā)現(xiàn)不安全問題。服用本發(fā)明口服疫苗的家犬，在不圈不拴自由放養(yǎng)的情況下，服苗犬與其它犬、豬、羊等家畜、家禽(雞、鴨、鵝)頻繁接觸中，如搶食豬的食物等，未發(fā)現(xiàn)疫苗毒株接觸感染非服苗動(dòng)物。對(duì)初生1月齡乳犬，口服疫苗后，7只乳犬觀察6個(gè)月，所有被觀察的乳犬全部安全存活，未發(fā)現(xiàn)任何狂犬病癥狀。10只成年家犬在口服本疫苗后1、2、3天用棉拭從口腔取粘膜部位分泌物，未分離到病毒。
綜上所述，用本發(fā)明的犬用口服狂犬病疫苗，在中國(guó)狂犬病流行地區(qū)，經(jīng)1985～1987年三年觀察結(jié)果表明，能降低當(dāng)?shù)厝g狂犬病發(fā)病率，從而阻斷犬→人感染狂犬病，這對(duì)控制狂犬病的流行將起重要作用。
實(shí)施例1、1985年3月將22號(hào)毒種鼠腦，以無菌手續(xù)研磨后稀釋成1200(稀釋液2%牛血清滅菌蒸餾水)接種體重11～13克小鼠495只，腦內(nèi)接種量0.03ml。5～7天選擇發(fā)病癥狀典型、瀕死的小鼠，以無菌手續(xù)取腦，共收獲無菌鼠腦450個(gè)，電動(dòng)組織研磨器研磨后加入稀釋液1800ml，再加入無菌脫脂牛乳1800ml，分裝于青霉素小瓶，每瓶裝4ml，共分裝900瓶，即900頭份犬用口服狂犬病疫苗。取樣進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，結(jié)果為L(zhǎng)ogLD506.5/0.03ml。批號(hào)8503。
2、1985年6月18日在廣西壯族自治區(qū)玉林市進(jìn)行家犬口服免疫。免疫2個(gè)鄉(xiāng)，對(duì)照觀察2個(gè)鄉(xiāng)。免疫家犬共4456只(含8503批)，對(duì)照鄉(xiāng)觀察家犬3080只。免疫鄉(xiāng)于口服免疫后83天，一外來狂犬竄入，咬傷已免疫犬7只，觀察1年未出現(xiàn)任何癥狀，同時(shí)咬傷豬1頭，后發(fā)狂犬病。免疫鄉(xiāng)在免疫后一年內(nèi)，無狂犬病發(fā)生。免疫后1年，免疫鄉(xiāng)的少數(shù)免疫犬及對(duì)照觀察共發(fā)生狂犬11只、9只。說明口服免疫對(duì)犬起到降低狂犬病發(fā)病率作用。
權(quán)利要求
1.制備犬用口服狂犬病疫苗毒種的方法，該方法包括從死于狂犬病患者尸體的新鮮腦組織中分離到狂犬病病毒，通過小鼠腦內(nèi)連續(xù)傳50～60代，然后將此毒株轉(zhuǎn)移到人胚肺二倍體細(xì)胞株KMB-17中連續(xù)傳代至40～50代，再回傳到小鼠腦內(nèi)傳2～10代。
2.一株按權(quán)利要求1所述方法制得的命名為“22號(hào)毒種”的犬用口服狂犬病減毒活病毒株，其保藏登記號(hào)為CCTCCNO
3.根據(jù)權(quán)利要求1的犬用口服狂犬病病毒株，其腦內(nèi)毒力穩(wěn)定在LogLD50≥6.0。
4.生產(chǎn)犬用口服狂犬病疫苗的方法，該方法包括將按權(quán)利要求1所述方法制備的犬用口服狂犬病毒種稀釋后接種于小鼠腦內(nèi)，體內(nèi)培養(yǎng)5～7天，小鼠典型發(fā)病后解剖取腦，研磨成腦懸液，加入適當(dāng)保護(hù)劑后真空冷凍干燥。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所得小鼠腦組織懸液的病毒滴度為小鼠腦內(nèi)50%感染量不低于6.0/0.03ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所說的保護(hù)劑為50%(V/V)脫脂牛乳。
7.經(jīng)口服給藥途徑免疫犬使之免于染患狂犬病的方法。該方法包括將預(yù)防犬狂犬病有效量的按權(quán)利要求4至6中所述的方法制備的犬用狂犬病疫苗混入半流質(zhì)食物內(nèi)，喂飼處于饑餓狀態(tài)的方法免疫家犬。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株犬用口服狂犬病疫苗病毒株，其分離和培育的方法，以及利用該毒株作為疫苗毒種大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)犬用口服狂犬病疫苗的方法。該疫苗經(jīng)口服途徑免疫家犬后，可有效地防止家犬染患狂犬病，借以阻斷犬—人之間的感染途徑，進(jìn)而阻止狂犬病的大面積流行。
文檔編號(hào)A61K39/205GK1109783SQ9411520
公開日1995年10月11日 申請(qǐng)日期1994年9月21日 優(yōu)先權(quán)日1994年9月21日
發(fā)明者褚菊仁, 嚴(yán)子林, 顧悅翔 申請(qǐng)人:衛(wèi)生部長(zhǎng)春生物制品研究所