專利名稱：麥芽糖/海藻糖轉(zhuǎn)化酶及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的酶及其制備和應(yīng)用。更具體地說，本發(fā)明涉及將麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖或?qū)⒑Ｔ逄寝D(zhuǎn)化為麥芽糖的酶(下文稱之為麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶)及其制備。本發(fā)明還涉及能產(chǎn)生該酶的微生物，用該酶制備的海藻糖，含海藻糖的糖類組合物以及含海藻糖或糖類組合物的組合物。
海藻糖或α，α-海藻糖是已知由葡萄糖組成的非還原糖。正如Advance in Carbohydrate Chemistry Vol.18 PP.201-225(1963，Academic Press，USA出版)和Applied and Environmental Microbiology，Vol.56 PP.3213-3215(1990)所述，海藻糖廣泛存在于微生物，菌類植物、昆蟲等內(nèi)，盡管含量相當(dāng)?shù)?。因?yàn)楹Ｔ逄鞘欠沁€原糖，這樣它既不與含氨基物質(zhì)例如氨基酸和蛋白質(zhì)反應(yīng)，誘導(dǎo)氨基-羰基反應(yīng)，也不會(huì)使氨基酸物質(zhì)變質(zhì)。這樣可使用海藻糖而不必?fù)?dān)擾引起令人不滿意的變黃和變質(zhì)的弊病。因此，極需要建立工業(yè)規(guī)模制備海藻糖的方法。
常規(guī)制備海藻糖的方法例如是日本專利予公開No.154485/75中描述的方法-該方法中使用微生物，和日本專利予公開號(hào)216695/83中描述的方法，該方法通過結(jié)合使用麥芽糖-和海藻糖-磷酸酶將麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖。但是前者不適于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，因?yàn)楹Ｔ逄窃谧鳛槌跏荚系奈⑸镏械暮?，以干燥固體計(jì)(d.s.b)，通常低于15W/W%(除非特別指明，本說明書中將“W/W%”簡(jiǎn)寫為“%”)，而且提取和提純步驟復(fù)雜。后者有下述缺點(diǎn)(ⅰ)因?yàn)楹Ｔ逄鞘峭ㄟ^葡萄糖-1-磷酸酯而形成的，那么作為底物的麥芽糖濃度不可能達(dá)到令人滿意的高水平;(ⅱ)磷酸酶酶反應(yīng)體系是可逆反應(yīng)，而且其目的產(chǎn)物海藻糖的產(chǎn)率相當(dāng)?shù)?(ⅲ)保持該反應(yīng)體系穩(wěn)定并順利進(jìn)行酶促反應(yīng)是非常困難的。因此，前面所述常規(guī)制備方法不可能作為工業(yè)規(guī)模的制備方法。
已知從淀粉物質(zhì)、例如液化淀粉、糊精和麥芽低聚糖制備的淀粉部分水解物，因其具有還原末端基團(tuán)而表現(xiàn)出還原力。其還原力一般以“右旋糖當(dāng)量(DE)值”來表示(按其干重量計(jì))。已知還原性淀粉部分水解物中，具相對(duì)高DE值的一般都有相當(dāng)?shù)偷姆肿恿亢驼扯?，以及相?duì)高的甜度及反應(yīng)活性，并容易與含氨基物質(zhì)，例如氨基酸和蛋白質(zhì)反應(yīng)，引起不希望的變黃、變味及變質(zhì)現(xiàn)象。因?yàn)檫€原性淀粉部分水解物的性質(zhì)隨其DE值而變化，所以還原性淀粉部分水解物與其DE值之間的關(guān)系是很重要的。曾確信該領(lǐng)域中不可能打破這種關(guān)系。
有關(guān)海藻糖的制備，在“Food Chemicals”，No.88，PP.67-72(1992年8月)，“Current Status of Starch Application，Development and Related Problens”一章中，于“Oligosaccharides”通欄標(biāo)題下曾報(bào)道“盡管海藻糖有廣泛的實(shí)用性，但通過直接糖-轉(zhuǎn)變反應(yīng)或水解反應(yīng)的酶促制備，已有報(bào)道認(rèn)為在該領(lǐng)域科學(xué)上說來幾乎是不可能的。”因此，使用淀粉作為原料，通過酶促反應(yīng)制備海藻糖，科學(xué)上視為極為困難的事。
然而本發(fā)明人改變了該傳統(tǒng)觀念，并成功地建立了如日本專利申請(qǐng)No.362131/92中所公開的海藻糖制備方法，其中通過使葡萄糖淀粉酶與能夠形成非還原糖(具海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元，并且有3或更高的葡萄糖聚合度)的非還原糖形成酶一起，作用于由淀粉原料制備的，葡萄糖聚合度為3或更高的還原性淀粉部分水解物，而從非還原性淀粉部分水解物直接制備海藻糖。但是該方法需要2種以上的酶，并且要采用葡萄糖聚合度3或更高，而且粘度相當(dāng)高的，分子量相對(duì)高的淀粉糖作為原料。而且，所得產(chǎn)物的糖類組合物相當(dāng)復(fù)雜，并使得生產(chǎn)成本很高。因此，建立一種新的海藻糖制備方法，其中海藻糖由麥芽糖和葡萄糖聚合度為2的淀粉部分水解物形成，是適合于工業(yè)生產(chǎn)，穩(wěn)定供給和市場(chǎng)銷售的。
本發(fā)明的目的是提供麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶，它能將可工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)和穩(wěn)定供給的麥芽糖轉(zhuǎn)化成海藻糖，并提供海藻糖的新的制備和應(yīng)用，以及含有用該酶制備的海藻糖的糖組合物。
為此目的，本發(fā)明人廣泛地篩選能產(chǎn)生新型糖轉(zhuǎn)化酶(該酶能從麥芽糖形成海藻糖)的微生物。結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)從日本Okayama的Okayama市土壤中分離出的Pimelobacter屬微生物，即Pimelobacter SP.R48，從日本Hyogo的Nishinomiya市土壤中分離出的Pseudomonas屬微生物，即Pseudomonas Putida H262以及Thermus屬的微生物能形成轉(zhuǎn)化麥芽糖為海藻糖的新型麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶，并且還建立了海藻糖的制備方法和含海藻糖的糖組合物，以及含海藻糖或該糖組合物的食品、化妝品和藥物之類的組合物。這樣，我們便完成了本發(fā)明。
附圖的簡(jiǎn)要說明

圖1顯示溫度對(duì)從Pimelobacter SP.R48衍生的本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶之酶活性的影響。
圖2顯示pH值對(duì)于從Pimelobacter SP.R48衍生的本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶酶活性的影響。
圖3顯示溫度對(duì)從Pimelobacter SP.R48衍生的本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶穩(wěn)定性的影響。
圖4顯示pH值對(duì)從Pimelobacter SP.R48衍生的本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶穩(wěn)定性的影響。
圖5顯示溫度對(duì)從Pseudomonas Putida H262衍生的本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶酶活性的影響。
圖6顯示pH值對(duì)從Pseudomonas Putida H262衍生的本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶酶活性的影響。
圖7顯示溫度對(duì)從Pseudomonas Putida H262衍生的本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶穩(wěn)定性的影響。
圖8顯示pH值對(duì)從Pseudomonas Putida H262衍生的本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶穩(wěn)定性的影響。
圖9顯示溫度對(duì)從Thermus aquaticus(ATCC 33923)衍生的本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶酶活性的影響。
圖10顯示pH對(duì)從Thermus aquaticus(ATCC 33923)衍生的本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶酶活性的影響。
圖11顯示溫度對(duì)從Thermus aquaticus(ATCC 33923)衍生的本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶穩(wěn)定性的影響。
圖12顯示pH值對(duì)從Thermus aquaticus(ATCC 33923)衍生的本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶穩(wěn)定性的影響。
本發(fā)明涉及麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶及其制備和應(yīng)用。更具體地說，本發(fā)明涉及能將麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖或?qū)⒑Ｔ逄寝D(zhuǎn)化為麥芽糖的新的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶及其制備方法。本發(fā)明還涉及能產(chǎn)生該酶的微生物，用該酶制備的海藻糖，含海藻糖的糖組合物，以及含海藻糖或該糖組合物的組合物。
Pimelobacter屬微生物即Pimelobacter SP.R48和Pseudomonas Putida H262的鑒定試驗(yàn)，根據(jù)本發(fā)明給出下述結(jié)果。該試驗(yàn)根據(jù)由Takeji Hasegawa編著，由日本Seientific Societies Press，Tokyo，Japan(1985)出版的“Biseibutsu-no-Bunrui-to-Dotei”(微生物的分類和鑒定)一書所述方法進(jìn)行。Pimelobacter SP.R48的結(jié)果如下A，形態(tài)學(xué)(1)于27℃營(yíng)養(yǎng)瓊脂中培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞特征通常以0.5-0.9×1.5-4.0μm的棒形存在;以單個(gè)存在，而不通常以V型對(duì)存在或以連接形式存在;不具游動(dòng)性并且是無孢子的;非抗酸的;革蘭氏染色陽性。
(2)于27℃在補(bǔ)充有酵母提取物和麥芽提取物的瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞特征培養(yǎng)1天之后大小為0.6-1.0×1.3-4.2μm，而培養(yǎng)3天之后以大小為0.6-1.0×1.0-2.5μm的近球菌的形式存在;表現(xiàn)多態(tài)性;以單個(gè)存在而不常以V型對(duì)或連接形式存在。
B，培養(yǎng)性質(zhì)(1)當(dāng)于27℃在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿上培養(yǎng)時(shí)所形成的菌落特征形狀培養(yǎng)24小時(shí)后為直徑0.5mm的環(huán)狀菌落，而培養(yǎng)3天之后直徑為1.5-2mm;
邊緣如耳樣;
投影半球形;
光澤無;
表面皺褶樣;
顏色奶油色不透明菌落;
(2)于27℃在補(bǔ)充有酵母提取物和麥芽提取物的瓊脂板上培養(yǎng)時(shí)所形成之菌落的特征形狀培養(yǎng)3天之后直徑約1-1.5mm的環(huán)狀菌落;
邊緣如耳狀;
投影半球形;
光澤無;
表面皺褶樣;
顏色奶油色不透明菌落;
(3)于27℃在斜面營(yíng)養(yǎng)瓊脂中培養(yǎng)所形成的菌落的特性生長(zhǎng)滿意;
形狀如線狀;
(4)27℃于營(yíng)養(yǎng)明膠中穿刺培養(yǎng)時(shí)無液化明膠。
C，生理學(xué)性質(zhì)(1)硝酸鹽還原作用陽性;
(2)脫氮反應(yīng)陰性;
(3)甲基紅試驗(yàn)陰性;
(4)VP試驗(yàn)陰性;
(5)吲哚形成陰性;
(6)硫化氫形成陽性;
(7)淀粉水解作用陰性;
(8)檸檬酸利用陽性;
(9)無機(jī)氮源利用利用銨鹽和硝酸鹽;
(10)色素形成陰性;
(11)脲酶陰性;
(12)氧化酶陰性;
(13)催化酶陰性;
(14)生長(zhǎng)條件生長(zhǎng)于pH值5-9范圍內(nèi)，溫度在15-40℃范圍內(nèi);
(15)氧氣要求需氧;
(16)碳源的利用和酸形成
碳源 利用 酸形式D-葡萄糖 + -D-半乳糖 - -D-果糖 + -D-甘露糖 + -L-阿拉伯糖 + -D-木糖 + -L-鼠李糖 + -麥芽糖 + -不勝其煩+ -乳糖 - -海藻糖 + -棉子糖 + -甘露糖醇 - -糊精 + -半乳糖醇 - -(17)對(duì)氨基酸的脫羧酶試驗(yàn)，對(duì)L-賴氨酸，L-精氨酸和L-鳥氨酸為陰性;
(18)氨基酸利用利用L-谷氨酸鈉和L-天冬氨酸鈉;
(19)DNase陰性;
(20)3-酮乳糖形成陰性;
(21)DNA的鳥嘌呤(G)加胞嘧啶(C)的Mol%72%;
(22)細(xì)胞壁的主要二氨基酸LL-二氨基庚二酸Pseudomonas Putida H262的結(jié)果如下A，形態(tài)學(xué)(1)于27℃在營(yíng)養(yǎng)瓊脂中培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞的特征通常以0.5-0.7×1.0-2.0μm棒形存在，并且有不生孢子性;具有鞭毛游動(dòng)性;非抗酸性;革蘭氏染色陰性。
(2)于27℃在添加有酵母提取物和麥芽糖提取物的瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞的特征培養(yǎng)1天之后大小為0.6-0.8×2.0-4.0μm。
B，培養(yǎng)性質(zhì)(1)于27℃在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿上培養(yǎng)時(shí)所形成的菌落特征形狀培養(yǎng)24小時(shí)后為直徑1-2mm的環(huán)形菌落，而培養(yǎng)3天之后直徑為3.5-4mm;
邊緣完整;
投影半球形;
光澤濕性光澤;
表面光滑;
顏色乳油色或白色不透明菌落;
(2)當(dāng)于27℃在補(bǔ)充有酵母提取物和麥芽提取物的瓊脂平皿上培養(yǎng)時(shí)所形成的菌落的特征形狀培養(yǎng)3小時(shí)之后直徑為4-5mm的環(huán)狀菌落;
邊緣完整;
投影半球形;
光澤濕性光澤;
表面光滑;
顏色奶油色或白色不透明菌落;
(3)于27℃在斜面營(yíng)養(yǎng)瓊脂中培養(yǎng)所形成之菌落的特征生長(zhǎng)滿意;
形狀線狀。形成有光滑表面的相對(duì)濕性光澤、不透明黃奶油色的相對(duì)薄的投影;并且(4)于27℃在營(yíng)養(yǎng)明膠中穿刺培養(yǎng)時(shí)無液化明膠。
C，生理學(xué)性質(zhì)(1)在琥珀酸培養(yǎng)基中的硝酸鹽還原作用陽性;
(2)脫氮反應(yīng)陰性;
(3)甲基紅試驗(yàn)陰性;
(4)VP試驗(yàn)陰性;
(5)吲哚形成陰性;
(6)硫化氫形成陰性;
(7)淀粉水解作用陰性;
(8)聚-β-羥丁酸酯聚集作用陰性;
(9)原兒萘酸鹽分解作用原形;
(10)檸檬酸利用陽性;
(11)無機(jī)氮源利用利用銨鹽和硝酸鹽;
(12)色素形成淺性色色素;
(13)螢光色素形成陽性;
(14)脲酶陽性;
(15)氧化酶陽性;
(16)催化酶陽性;
(17)生長(zhǎng)條件生長(zhǎng)在pH值5-90范圍，溫度10-37℃范圍內(nèi);
(18)對(duì)氧的要求需氧;
(19)碳源利用及酸形成
碳源 利用 酸形成能力D-葡萄糖 + -D-半乳糖 - -D-甘露糖 + +D-果糖 + -L-阿拉伯糖 + -D-木糖 + -L-鼠李糖 + -麥芽糖 + -蔗糖 + -乳糖 - -海藻糖 + -棉子糖 + -甘露糖醇 - -山梨糖醇 - -半乳糖醇 - -甘油 + +(20)對(duì)氨基酸的脫羧酶試驗(yàn)對(duì)L-賴氨酸和L-鳥氨酸為陰性，對(duì)L-精氨酸為陽性;
(21)氨基酸利用利用L-谷氨酸鈉，L-天冬氨酸鈉，L-精氨酸鈉，L-組氨酸，L-纈氨酸和D-丙氨酸，但不利用L-色氨酸;
(22)DNase陰性;
(23)3-酮乳糖形成陰性;
(24)DNA的鳥嘌呤(G)加胞嘧啶(C)的Mol%63%。
根據(jù)上述結(jié)果，將其細(xì)菌學(xué)性質(zhì)與文獻(xiàn)，Bergey的Manual of Systematic Bacteriology，Ist edition(1984)記載的相比較，結(jié)果表明微生物被鑒定為Pseudomonas Putida種微生物。
本發(fā)明人命名該微生物為“Pseudomonas Putida H262”，并于1994年2月23日保存于National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology，Ibaraki，Japan。該微生物在該日由該機(jī)構(gòu)接收并保存，其保藏號(hào)為FERM BP-4579。
除了上面鑒定的微生物，Pseudomonas屬的其它菌株及其突變體均可適用于本發(fā)明，只要它們產(chǎn)生本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖酶即可。
而且，Thermus屬微生物，例如Thermus aquaticus(ATCC 25104)、Thermus aqunticus(ATCC 33923)，Thermus filibormis(ATCC 43280)、Thermus ruber (ATCC 35948)、Thermus SP.(ATCC 43814)及Thermus SP.(ATCC 43815)等均適用于本發(fā)明。
任何營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基均可用于本發(fā)明，只要該微生物可在其中生長(zhǎng)并產(chǎn)生本發(fā)明的酶例如合成的和天然的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基均可任意采用。任何含碳物質(zhì)均可在本發(fā)明中作為碳源使用，只要它能被微生利用即可，這類碳源的例子是葡萄糖，果糖，糖蜜，海藻糖，乳糖，蔗糖，甘露糖醇，山梨糖醇，淀粉部分水解物等糖類以及檸檬酸和琥珀酸及其鹽等有機(jī)酸。這些碳源在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度可適當(dāng)選擇。例如，在使用葡萄糖情況下，就微生物生長(zhǎng)和繁殖而言較宜濃度通常為40W/V%或更低，優(yōu)選10W/V%或更低(d.s.b)。本發(fā)明中也使用氮源，例如銨鹽和硝酸鹽等無機(jī)氮化合物，以及尿素，玉米浸泡液，酪蛋白，胨，酵母提取物及肉提取物等含氮有機(jī)化合物。本發(fā)明中使用的無機(jī)成分例如是鈣鹽、鎂鹽、鉀鹽、鈉鹽、磷酸鹽以及錳、鋅、鐵、鋼、鉬和鈷的其他鹽。
本發(fā)明所使用的培養(yǎng)條件是微生物可以生長(zhǎng)和產(chǎn)生本發(fā)明的酶的條件，例如溫度4-80℃范圍的需氧條件，優(yōu)選溫度范圍為約20-75℃，pH值范圍為5-9，優(yōu)選6-8.5。本發(fā)明采用的適當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為比引發(fā)微生物生長(zhǎng)所需時(shí)間較長(zhǎng)的時(shí)間，優(yōu)選10-100小時(shí)。對(duì)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中溶解氧(DO)的濃度并無特別限制，通常DO值約為0.5-20ppm即可滿足要求。可通過控制通氣速度，攪拌營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，向通氣中補(bǔ)充氧，和提高發(fā)酵罐的內(nèi)壓，使DO水平保持在上述范圍內(nèi)。該培養(yǎng)可采用批量方式或連續(xù)方式進(jìn)行。
培養(yǎng)完成后，即可回收本發(fā)明的酶。因?yàn)楸景l(fā)明的酶活性既在細(xì)胞中也在無細(xì)胞上清液中存在，因而它們均可作為粗制酶回收和利用。新生產(chǎn)的培養(yǎng)物可整個(gè)作為粗制酶。本發(fā)明中可采用常規(guī)的液-固分離法從培養(yǎng)物中除去細(xì)胞。例如直接離心處理生成的培養(yǎng)物，用予涂層過濾器過濾細(xì)胞，或加入助濾劑過濾細(xì)胞，以及使用平板過濾器或空心纖維通過膜過濾分離細(xì)胞均是適用的。所得無細(xì)胞濾液可整個(gè)作為酶溶液使用，或可在使用前以常用方式加以濃縮。本發(fā)明所用的濃縮方法，例如采用硫酸銨鹽析，使用丙酮和乙醇沉降，使用平板過濾器，空心纖維膜過濾等。
在本發(fā)明酶為胞內(nèi)酶情況下，可用常規(guī)技術(shù)從細(xì)胞中提取，并將所得提取物作為粗制酶使用。為獲得此種提取物，可使用超聲波碎法，使用玻璃珠或氧化鋁的機(jī)械破碎法、french壓力破碎法等粉碎細(xì)胞，接著將所得物離心處理或膜過濾獲得澄清的粗酶溶液。
可用常規(guī)技術(shù)固定無細(xì)胞濾液及其濃縮物，以及細(xì)胞提取物。此類固定技術(shù)的例子是使用離子交換劑結(jié)合法，使用樹脂及膜的共價(jià)連接和吸附，以及使用高分子物質(zhì)的包含法。從所得培養(yǎng)物分離的完整細(xì)胞可以作為粗制酶使用，或可在使用前固定之。例如將細(xì)胞與海藻酸鈉混合加以固定，并將該懸浮液滴入氯化鈣溶液中，使該液滴膠凝成顆粒。在其使用前，可用聚乙烯亞胺或戊二醛固定所得顆粒。
由此獲得的粗制酶溶液可整個(gè)地使用，或在使用前以常規(guī)方法提純。例如電泳顯示單譜帶的純化酶制劑，可通過透析粗酶制劑(該粗酶制劑是通過用硫酸銨鹽析來自破碎細(xì)胞的提取液，并加以濃縮而得到的)，并以采用“DEAE-TOYOPEARL”(一種陰離子交換劑)的陰離子交換層析，使用“BUTYL-TOYOPEARL”(一種疏水樹脂)的疏水柱層析(它們均為Tosoh Corporation，Tokyo，Japan的產(chǎn)品)，使用“MONO Q HR5/5”(一種由瑞典Uppsala的Pharmacia LKB Biotechnology AB出售的陰離子交換劑)的陰離子交換柱層析，以及使用“TOYOPEARL HW-55”(一種由Tosoh Corporation，Tokyo，Japan出售的樹脂)的凝膠過濾柱層析等連續(xù)純化經(jīng)過透析的溶液而制得。經(jīng)這些處理程序提供電泳顯示一單譜帶的酶。
由此獲得的本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶有如下的物理化學(xué)性質(zhì)(1)作用將麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖，反之亦然;
(2)分子量以十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)測(cè)得為約57，000-120，000道爾頓;
(3)等電點(diǎn)(PI)使用兩性電解質(zhì)以等電電泳法測(cè)得約為3.8-5.1;
(4)活性抑制作用被1mM Cu++、Hg++和Tris-HCl緩沖劑抑制;
(5)來源來源于微生物。
更具體地說，本發(fā)明酶的物理化學(xué)性質(zhì)正如下面所示隨其來源的不同而異。
來源于Pimelobacter SP.R48的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶有下述物理化學(xué)性質(zhì)(1)作用將麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖，反之亦然。從1mole麥芽糖生成約1mole海藻糖，或從1mole海藻糖生成約1mole麥芽糖;
(2)分子量用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺明膠電泳法(SDS-PAGE)測(cè)得為大約57，000-67，000道爾頓;
(3)等電點(diǎn)(PI)使用兩性電解質(zhì)以等電電泳法測(cè)得約為4.1-5.1;
(4)活性抑制作用被1mM Cu++、Hg++和Tris-HCl緩沖劑抑制;
(5)最適溫度當(dāng)于pH7.0保溫60分鐘時(shí)約為20℃;
(6)最適pH值當(dāng)于25℃保溫60分鐘約為7.0-8.0;
(7)熱穩(wěn)定法當(dāng)于pH7.0保溫60分鐘時(shí)直到約30℃是穩(wěn)定的;
(8)pH穩(wěn)定性當(dāng)于20℃保溫60分鐘時(shí)，pH約為6.0-9.0條件下是穩(wěn)定的。
來自Pseudomonas Putida H262的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶有如下物理化學(xué)性質(zhì)(1)作用轉(zhuǎn)化麥芽糖成為海藻糖，反之亦然;從1mole麥芽糖生成約1mole海藻糖，或從1mole海藻糖生成約1mole麥芽糖;
(2)分子量由SDS-PAGE測(cè)得為大約110，000-120，000道爾頓;
(3)等電點(diǎn)(PI)使用兩性電解質(zhì)以等電電泳法測(cè)得為大約4.1-5.1;
(4)活性抑制作用被1mM Cu++、Hg++和50mM Tris-HCl緩沖劑所抑制;
(5)最適溫度于pH7.0保溫60分鐘時(shí)約為37℃;
(6)最適pH值于pH7.0保溫60分鐘時(shí)pH約為7.3-8.3條件下是穩(wěn)定的;
(7)熱穩(wěn)定性于pH7.0保溫60分鐘時(shí)直到40℃是穩(wěn)定的;
(8)pH穩(wěn)定性于35℃保溫60分鐘時(shí)pH為約6.0-9.0條件下是穩(wěn)定的;
來自Thermus aquaticus(ATCC 33923)的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶有如下的物理化學(xué)性質(zhì)(1)作用轉(zhuǎn)化麥芽糖成為海藻糖，反之亦然;從1mole麥芽糖生成約1mole海藻糖或從1mole海藻糖生成約1mole麥芽糖;
(2)分子量以SDS-PAGE法測(cè)得約為100，000-110，000道爾頓;
(3)等電點(diǎn)(PI)使用兩性電解質(zhì)以電泳法測(cè)得為約3.8-4.8;
(4)活性抑制作用被1mM Cu++、Hg++和50mM Tris-HCl緩沖劑所抑制;
(5)最適溫度于pH7.0保溫60分鐘時(shí)約為65℃;
(6)最適pH值于60℃保溫60分鐘時(shí)pH約為6.0-6.7是穩(wěn)定的;
(7)熱穩(wěn)定性于pH7.0保溫60分鐘時(shí)直到80℃是穩(wěn)定的;
(8)pH穩(wěn)定性于60℃保溫60分鐘時(shí)，pH為5.5-9.5是穩(wěn)定的。
按下述方法測(cè)定本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶的活性將1ml酶溶液加入到在10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中之作為底物的1ml20W/V%麥芽糖中，將該混合物溶液于25℃、35℃或60℃保溫60分鐘，接著于100℃加熱溶液10分鐘中止該酶促反應(yīng)。用50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)將所得反應(yīng)混合物精確地稀釋11倍，并將0.4ml稀釋溶液與0.1ml海藻糖酶溶液(每毫升1單位海藻糖酶)混合。將所得溶液于45℃保溫120分鐘，接著用葡萄糖-氧化酶法測(cè)定葡萄糖量。使用海藻糖和于100℃予加熱10熱分鐘使酶失活的酶溶液作為對(duì)照，該酶溶液的活性測(cè)定同上。借助上述檢測(cè)法，由本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶所生成的海藻糖含量是根據(jù)所形成的葡萄糖量測(cè)定的，并且將1單位酶活性定義為每分鐘形成1μmole海藻糖的酶量。所述反應(yīng)溫度，對(duì)于Pimelobacter屬微生物的酶是25℃，對(duì)于Pseudomonas屬微生物的酶是35℃，而對(duì)于Thermus屬微生物的酶為60℃。
因?yàn)楸景l(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶能轉(zhuǎn)化麥芽糖為海藻糖，反過來也可以轉(zhuǎn)化海藻糖為麥芽糖，所以可用麥芽糖或者海藻糖作為底物滿足其最后使用。麥芽糖被用作制備海藻糖的底物。
任何麥芽糖均可用于本發(fā)明中，只要當(dāng)受到本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶的作用能轉(zhuǎn)化為海藻糖即可。一般來說，具有最高可能純度的高麥芽糖含量產(chǎn)物最好，優(yōu)選純度70%或更高(d.s.b)者。市售麥芽糖產(chǎn)物，和使用常規(guī)淀粉糖化技術(shù)所制得的麥芽糖也可使用。
從淀粉制備麥芽糖的例子如日本專利公開No.11437/81和17078/81中所公開的方法，其中使β-淀粉酶作用于膠凝和液化的淀粉，形成麥芽糖，然后將其從高分子糊精中分離出來，并以高麥芽糖含量產(chǎn)物回收之。其他例子如日本專利公開No.13089/72和3938/79中所公開的方法，其中使β-淀粉酶作用于加有淀粉脫支酶例如異淀粉酶和支鏈淀粉酶的膠凝和液化淀粉，形成麥芽糖，然后以高麥芽糖含量產(chǎn)物回收之。
將日本專利公開No.28153/81、3356/82和28154/81中所公開的酶，加入到按前述方法制備的，存在于所得高麥芽糖含量產(chǎn)物中的付產(chǎn)糖類如麥芽三糖中，以增加麥芽糖含量。在采用日本專利予公開No.23799/83中所述強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂的層析柱上除去付產(chǎn)物糖類，可更大地增加高麥芽糖含量產(chǎn)物中的麥芽糖含量。
對(duì)本發(fā)明中所使用的底物濃度并無特殊限制。本發(fā)明酶的酶促反應(yīng)甚至在0.1%-50%原料麥芽糖的溶液中也能進(jìn)行，從而形成海藻糖。含不溶性底物的懸浮液也可用于本發(fā)明。本發(fā)明酶促反應(yīng)所使用的溫度可定在不至使用酶失活的溫度，即直到約80℃，優(yōu)選溫度范圍為0-70℃。本發(fā)明酶促反應(yīng)所使用的pH值定為大約5.5-9.0，優(yōu)選pH約為6.0-8.5。本發(fā)明酶促反應(yīng)所用時(shí)間根據(jù)反應(yīng)條件而適當(dāng)選擇，通常當(dāng)酶的用量約0.1-100單位/每克底物(d.s.b)時(shí)，時(shí)間約為0.1-100小時(shí)。
本發(fā)明的酶促反應(yīng)能以相當(dāng)高的轉(zhuǎn)化率將麥芽糖原料轉(zhuǎn)化為海藻糖，即最大值約為70-85%。
由此獲得的反應(yīng)混合物，按通常的方法過濾和離心處理以除去不溶性物質(zhì)，并用活性炭脫色，用H-和OH-型離子交換樹脂脫鹽，并濃縮成糖漿狀產(chǎn)物。假如必要，可將該糖漿產(chǎn)物任意地干燥成粉末產(chǎn)物或制成結(jié)晶產(chǎn)物。
另外，采用一種或多種方法加以提純，很容易將粉末狀產(chǎn)物加工成高純度海藻糖產(chǎn)物，例如用離子交換柱層析和用活性炭或硅膠柱層析進(jìn)行分級(jí)分離，以及用堿處理分解并除去剩余的還原糖。經(jīng)上述柱層析分離出的麥芽糖可用作通過本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶將麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖的底物。
假如必要，可以用葡萄糖淀粉酶和α-葡萄糖苷酶水解本發(fā)明的含海藻糖糖類組合物，或使用環(huán)麥芽糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶和/或葡糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行糖轉(zhuǎn)移反應(yīng)，以控制其甜度、還原力及粘度。另外，生成的海藻糖產(chǎn)物中的還原糖類，可用堿處理使其分解并用酵母使其發(fā)酵，而任意除去，或者氫化成糖醇。由此消除其還原力。利用上述純化法，例如離子交換柱層析法，可將葡萄糖從所得物中除去，獲得高海藻糖含量餾分。由此獲得的餾分很容易純化和濃縮成糖漿狀產(chǎn)物，并且假如必要，可將該糖漿產(chǎn)物進(jìn)一步濃縮成超飽和溶液和結(jié)晶成含水和無水結(jié)晶海藻糖。
本發(fā)明所用離子交換柱層析包括例如日本專利予公開Nos.23799/83和72598/83中所述，采用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂的層析法。使用柱層析很容易除去含在粗海藻糖產(chǎn)物中的付產(chǎn)物糖類，獲得高海藻糖含量餾分。在這種情況下，可任意采用固定床法，移動(dòng)床法和半移動(dòng)法之中的一種。
為制備含水結(jié)晶海藻糖，將純度為60%或更高的65-90%海藻糖溶液放入結(jié)晶器中，在存在或不存在約0.1-20%晶種的情況下，溫度95℃或更低，優(yōu)選10-90℃溫度范圍，攪拌下逐漸冷卻，獲得含水合結(jié)晶海藻糖的糖膏?？扇我獠捎眠B續(xù)結(jié)晶法，該方法是使目的產(chǎn)物糖類于真空中濃縮而達(dá)到結(jié)晶。本發(fā)明可采用常規(guī)方法，例如分離、團(tuán)塊粉碎、流動(dòng)床造粒及噴霧干燥來對(duì)糖膏水合結(jié)晶海藻糖或含海藻糖的結(jié)晶糖類進(jìn)行處理。
在進(jìn)行分離時(shí)，通常是對(duì)糖膏進(jìn)行籃式離心，使含水結(jié)晶海藻糖從母液中分離出來，假如必要，用少量冷水噴淋洗滌所得含水結(jié)晶海藻糖，以利于制備高純度的含水結(jié)晶海藻糖。
如用噴霧干燥法，通過高壓泵噴嘴噴霧濃度約為60-85%(d.s.b)、結(jié)晶度約20-60%(d.s.b)的糖膏很容易制備出沒有或基本上沒有吸水性的結(jié)晶糖;以不至于熔化所得結(jié)晶粉末的約60-100℃的熱空氣干燥之;將所得粉末陳化1-20小時(shí)，同時(shí)吹入約30-60℃熱空氣。
若用團(tuán)塊粉碎法，則將濕度約為10-25%，結(jié)晶度為10-60%(d.s.b.)的糖膏放置幾小時(shí)至3天左右，使其結(jié)晶并使整個(gè)固化形成塊狀，將所得團(tuán)塊磨碎或切碎并干燥，便很容易制得不含水或基本不含水的結(jié)晶糖。
雖然無水結(jié)晶海藻糖可通過干燥含水結(jié)晶海藻糖使其轉(zhuǎn)化為無水形式而制得，但一般是這樣制備提供濕度小于10%的高海藻含量溶液，置于結(jié)晶器中，在晶種存在下和攪拌條件下保持在溫度50-160℃，優(yōu)選80-140℃，以獲得含無水結(jié)晶海藻糖的糖膏，用常規(guī)方法例如團(tuán)塊粉碎法、流化床制粒法結(jié)晶和粉碎該無水結(jié)晶海藻糖，并在干燥和相對(duì)高的溫度條件下噴霧干燥。
由此獲得的本發(fā)明海藻糖是穩(wěn)定的并且基本上無還原力。可以與別的原料，特別是氨基酸和寡聚肽及蛋白質(zhì)之類的含氨基酸物質(zhì)混合并加工，而無需顧慮會(huì)引起這些物質(zhì)變黃、變味、變質(zhì)等令人生厭的問題。海藻糖本身具有令人滿意的高質(zhì)量和甜度。因?yàn)楹Ｔ逄侨菀子珊Ｔ迕杆鉃槠咸烟?，所以?dāng)口服時(shí)它容易被活的機(jī)體消化、吸收或作為能源利用。而且，海藻糖基本上不被誘發(fā)齲齒的微生物發(fā)酵，這就使之可用作甜味劑而基本上不會(huì)引起齲齒。
本發(fā)明的海藻糖是穩(wěn)定的甜味劑，特別是當(dāng)與粘合劑例如支鏈淀粉，羥乙基淀粉或聚乙烯吡咯烷酮結(jié)合使用時(shí)，結(jié)晶海藻糖可任意被用作糖衣片劑。此外，海藻糖還具有控制滲透壓能力，賦予填充劑能力，賦予光澤能力，保持濕潤(rùn)能力，賦予粘性能力，基本上無發(fā)酵能力，避免膠凝淀粉退化能力以及避免其它糖類結(jié)晶的能力。
因此，本發(fā)明的海藻糖及其含海藻糖的糖組合物可以任意地作為甜味劑、調(diào)味劑、質(zhì)量改善劑、穩(wěn)定劑和填充劑，用于各種組合物例如食品、香煙、煙草、飼料、化妝品及藥物中。
本發(fā)明的海藻糖和糖組合物，可以整個(gè)地用作增甜調(diào)味劑。假如必要，它們可與適量的一種或多種其它甜味劑，例如粉末狀糖蜜、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、異構(gòu)糖、蜂蜜、槭糖、山梨糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、二氫查爾酮、斯替維甙、α-葡糖基斯替維甙、雷巴二糖苷(rebaudioside)、甘草皂甙、L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯、糖精、甘氨酸和丙氨酸，和/或糊精、淀粉及乳糖等填充劑結(jié)合使用。
含本發(fā)明海藻糖的粉末狀結(jié)晶產(chǎn)物，或者糖組合物可以整個(gè)地使用，假如必要，使用之前它們可與賦形劑、填充劑、稀釋劑和粘合劑等混合，并形成顆粒、球、短條、片狀、方塊和片劑。
本發(fā)明的含低還原力海藻糖的糖組合物及從水中分離的海藻糖可與能很好地與帶有酸味、咸味、苦味、強(qiáng)烈味道和美味的其他材料相調(diào)和，并具有相當(dāng)高的酸耐受性及抗熱性。因此，它們一般作為甜味劑，口味改良劑和質(zhì)量改善劑有利地應(yīng)用于食品中。
本發(fā)明的海藻糖和含海藻糖的糖類組合物可被用于調(diào)味品例如醬油、固體醬油、“miso”、“funmatsu-miso”(一種粉狀miso)、“moromi”(一種精制米酒)、“hishio”(一種精制醬油)、“furikake”(一種調(diào)味魚飯)、蛋黃醬、加味料、醋、“sanbaizu”(一種糖醬油、醬油和醋)、“funmatsu-sushi-su”(sushi用的粉狀醋)、“chuka-no-moto”(一種做中國(guó)菜用的配制好的混合物)、“tentsuyu”(一種日本油炸食品用的醬)、“mentsuyu”(一種日本細(xì)面條用的醬)、果醬、蕃茄醬、“takuan-zuke-no-moto”(用于腌蘿卜的予制混合物)，“hakusai-zuke-no-moto”(用于新鮮的白油菜腌制的予制混合物)，“yakiniku-no-tare”(日本烤肉用的醬)、咖喱乳酪糊、配制好的煨制混合物、速容溶料混合物、“dashi-no-moto”(速溶原汁混合物)、混合調(diào)料、“mirin”(甜米酒)、“shin-mirin”(一種合成的mirin)、佐餐糖和咖啡糖。
本發(fā)明的海藻糖和含海藻糖的糖組合物也可任意用于增甜“wagashi”(日本糕餅)，例如“senbei”(稻米餅干)、“arare-mochi”(稻米糕餅塊)、“okoshi”(小米和稻米糕餅)、“mochi”(稻米糊)、“manju”(帶有豆醬的小園面包)、“uiro”(甜米凍)、“an”(豆醬)“yokan”(豆甜果子凍)、“mizu-yokan”(軟adzuki豆果子凍)、“kingyoku”(一種yokan)、果子凍、pao de castella及“amedama”(一種日本太妃糖);增甜糖果，例如小園面包、餅干、薄脆餅、曲奇、餡餅、布丁、黃油乳脂、牛奶蛋糊奶油、奶油松餅、蛋奶烘餅、蛋糕、面包圈、巧克力、口香糖、焦糖和糖塊;凍甜食，例如凍其淋和冰糕;糖汁，例如“kajitsu-no-srrup-zuke”(一種糖水水果)和“korimitsu”(一種刨冰用的糖汁);糊例如面粉糊、花生糊、水果糊和涂抹糊;加工水果和蔬菜，例如果醬、馬菜蘭，“syrup-zuke”(一種腌制水果)和“toka”(一種蜜餞);腌菜和腌制品，例如“fukujin-zuke”(紅色蘿卜腌菜)、“bettara-zuke”(一種整個(gè)腌制的鮮蘿卜)、“senmai-zuke”(一種切片腌制的鮮蘿卜)和“rakkyo-zuke”(腌菜蔥);肉制品，例如火腿和香腸;魚肉制品，如魚火腿，魚香腸，“kamaboko”(一種蒸魚醬)，“shikuwa”(一種魚醬)和“tenpura”(一種日本油炸魚醬);“chinmi”(一種開胃食品)例如“umi-no-shiokara”(一種海膽的咸內(nèi)臟)、“ika-no-shikara”(一種魷魚的咸內(nèi)臟)，“su-konbu”(經(jīng)加工的海帶)，“saki-surume”(干魷魚條)和“fugu-no-mirin-boshi”(一種干的mirin調(diào)味的河豚);“tsukudani”(醬油中熬濃的食品)，例如紫菜類食用野菜、干魷魚、魚和貝殼類的“tsukudani”;家常菜例如“nimame”(一種烹制豆)、土豆沙拉和“konbu-maki”(海帶卷);奶制品，例如牛奶飼料，酸乳酪和乳酪;罐頭和瓶裝產(chǎn)品例如肉、魚肉、水果和蔬菜罐頭;酒精飲料、例如合成米酒、果酒和白酒;軟飲料，例如咖啡、茶、可可茶、果汁、碳酸飲料、酸牛奶飲料和含乳酸菌飲料;配制好的食品，例如配制好的布丁混合物、配制好的熱糕餅混合物和“sukuseki-shiruco”(一種配制好的adzuki豆湯與稻米糕餅)和速溶湯料混合物;以及嬰兒食品、治療食品及補(bǔ)充有營(yíng)養(yǎng)素的飲料;還可用于改善味道及上述所有食品的質(zhì)量。
本發(fā)明的海藻糖及含海藻糖的糖組合物也用于飼料和寵物食品中供給動(dòng)物，例如家養(yǎng)動(dòng)物、家禽、蜜蜂、絲蠶和魚，以改善它們的口味。本發(fā)明的海藻糖和糖組合物也可任意用于糊狀和液體狀的其它產(chǎn)品中作為甜味劑、口味改善劑和質(zhì)量改善劑、穩(wěn)定劑，例如用于煙草、香煙、牙膏、口紅、胭脂、唇油、內(nèi)用藥、藥片、錠劑、液滴劑型的魚肝油、軟糖、口服清涼劑、含瀨劑、化妝品及藥品中。
本發(fā)明的海藻糖及含海藻糖的糖組合物可用在易于失去有效成分和活性的生物活性物質(zhì)中作為品質(zhì)改進(jìn)劑和穩(wěn)定劑，以及用于保健食品和含生物活性物質(zhì)的藥物組合物中。此類生物活性物質(zhì)的例子是淋巴激活素如α-，β-，γ-干擾素，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，腫瘤壞死因子-β(TNF-β)，巨噬細(xì)胞遷移抑制因子、集落刺激因子，轉(zhuǎn)移因子及白細(xì)胞介素2(IL-2);激素，例如胰島素、生長(zhǎng)激素、催乳激素、促紅細(xì)胞生成素、卵泡刺激激素和胎盤激素;生物學(xué)制劑，例如BCG疫苗、日本腦炎疫苗、麻疹疫苗、活脊髓灰質(zhì)炎疫苗、天花疫苗、破傷風(fēng)類毒素、竹葉青屬蛇抗毒素及人免疫球蛋白，抗生素，例如青霉素、紅霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素及硫酸卡那霉素;維生素，例如維生素B1、維生素B2、維生素C、魚肝油，類胡蘿卜素、麥角甾醇、維生素E;酶，例如脂酶、彈性蛋白酶、尿激酶、蛋白酶、β-淀粉酶、異淀粉酶、葡聚糖酶及乳糖酶;提取物，例如人參提取物、海龜提取物、藻類提取物、蘆薈提取物及蜂膠提取物;存活的微生物，例如病毒、乳酸菌、及酵母;以及其他生物活性物質(zhì)如蜂王漿等。通過加入本發(fā)明海藻糖及其糖組合物，很容易將前面所述的生物活性物質(zhì)制備成有高穩(wěn)定性和高品質(zhì)、不會(huì)丟失或失活活性物質(zhì)及有效成分的保健食品及藥物組合物。
如前所述，將本發(fā)明的海藻糖及其糖組合物摻入上述物質(zhì)和組合物中的方法包括常規(guī)方法，例如混合、揉合、溶解、熔融、浸漬、滲透、噴啉、涂覆、噴霧、注射、結(jié)晶和固化。海藻糖和糖組合物通常以0.1%或更高的量，優(yōu)選1%或更高量(d.s.b)摻入前述物質(zhì)及組合物中。
下述實(shí)驗(yàn)更詳述地解釋本發(fā)明實(shí)驗(yàn)1酶的產(chǎn)生將由2.0W/V%葡萄糖、0.5W/V%多蛋白胨、0.1W/V%酵母提取物、0.06W/V%磷酸氫二鈉、0.1W/V%磷酸氫鉀、0.05W/V%七水合硫酸鎂、0.5W/V%碳酸鈉和水組成的液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基100ml的各等分樣各放入500ml錐形燒瓶，并于115℃高壓滅菌30分鐘，冷卻，并用Pimelobacter SP.R48(FERM BP-4315)種子培養(yǎng)物接種，接著于200rpm攪拌條件下，27℃培養(yǎng)24小時(shí)。將所得培養(yǎng)物匯集在一起，作為種子培養(yǎng)物使用。
將約20l上述培養(yǎng)物所用的同樣液體營(yíng)養(yǎng)基的新鮮制劑放入30l發(fā)酵罐中，滅菌、冷卻至27℃，并用1V/V%種子培養(yǎng)物接種，接著于27℃、pH6.0-8.0攪拌和通氣條件下培養(yǎng)約40小時(shí)。
積聚于所得培養(yǎng)物中的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶活性為0.55單位/ml。將培養(yǎng)物一部分用離心分離成細(xì)胞和上清液，并將細(xì)胞懸浮于50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，使其體積與該部分的原體積相等，然后檢測(cè)細(xì)胞懸浮液和上清液中的酶活性，得出結(jié)果分別為0.5單位/ml和0.05單位/ml。該酶活性是在25℃測(cè)定得的值。
實(shí)驗(yàn)2
酶的純化將實(shí)驗(yàn)1獲得的培養(yǎng)物離心處理得到約0.5kg濕細(xì)胞，然后將其懸浮于10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中。將該細(xì)胞懸浮液經(jīng)“VIBROGEN-ZELLMUHLE”(一種由Edmund Bü hler Tubingen，Germany出售的細(xì)胞破碎裝置)處理，所得混合物以15000xg離心30分鐘獲得約4.51上清液。加入硫酸銨于該上清液中，使其溶解得到飽和度為0.3的溶液，將該溶液于4℃放置4小時(shí)，并離心獲得上清液。
再加入硫酸銨到所得上清液中，溶解后得到飽和度為0.8的溶液，將該溶液于4℃放置過夜并離心獲得沉降物。
將該沉淀物溶解于10mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，對(duì)同一緩沖液的新鮮制劑透析24小時(shí)，并離心除去不溶性物質(zhì)。將400ml所得透析溶液分成2部分，分別進(jìn)行柱層析，其中用300ml“DEAETOYOPEARL GEL”(一種由Tosoh Corporation，Tokyo，Japan市售的離子交換劑)裝柱。
將吸附于離子交換劑上的本發(fā)明麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶用添加有鹽的上述緩沖液的新鮮制劑從柱上洗脫下來。回收柱上洗脫的含酶活性的餾份，合并后對(duì)添加有1M硫酸鈉的上述緩沖劑的新配液透析。將透析溶液離心后除去不溶物，對(duì)其進(jìn)行疏水柱層析，所用柱填充物為300ml“BUTYL-TOYOPEARL 650 GEL”(一種Tosoh corporation，Tokyo，Japan實(shí)現(xiàn)商品化的疏水凝膠)。用1M-OM硫酸銨的線性梯度緩沖液，將吸附于凝膠上的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶從柱上洗脫下來，然后回收含酶活性的餾份。
合并餾份后進(jìn)行離子交換柱層析，所用柱填充物為10ml“MONOQ HR5/5”(一種由瑞典Uppsala的Pharmacia LKB BiotechnologyAB出售的凝膠)。各純化步驟的總活性、比活性及產(chǎn)率列于表1中。
表1純化步驟總酶*活性比活性產(chǎn)率(單位) (單位/mg蛋白) (%)細(xì)胞破碎后的上清液 7,310 0.25 100鹽析后的透析溶液 2,730 0.31 37.3離子交換柱洗脫物 2,290 1.35 31.3疏水柱洗脫物 1,160 10.8 15.9離子交換柱洗脫物 819 33.6 11.2注符號(hào)＊表示為本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶。
將由上述純化程序所獲得的純化酶制劑用7.5%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，給出單一蛋白譜帶，這表明它是一種純度相當(dāng)高的制劑。
實(shí)驗(yàn)3酶的性質(zhì)對(duì)按實(shí)驗(yàn)2方法制得的純化麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶制劑的一部分，使用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。所測(cè)分子量經(jīng)與同時(shí)進(jìn)行電泳的標(biāo)志蛋白質(zhì)(由日本東京Japan Bio-Rad Laboratories商品化)進(jìn)行比較，確定為約57，000-67，000道爾頓。
另一份純化的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶制劑用聚丙烯酰胺凝膠(含2V/V%“AMPHOLINE”，一種由瑞典Uppsala的Pharmacia LKB Biotechnology AB市售的兩性電解質(zhì))進(jìn)行等電電泳。將所得凝膠切成片，然后測(cè)量它們的pH，得出酶的PI約為4.1-5.1。
按照測(cè)定酶活性所用的方法，研究溫度和pH值對(duì)本發(fā)明酶活性的影響。其結(jié)果分別示于圖1(溫度的影響)和圖2(pH的影響)中。當(dāng)于pH7.0培養(yǎng)60分鐘時(shí)該酶的最適溫度為約20℃，而當(dāng)于25℃保溫60分鐘時(shí)其最適pH值約為7.0-8.0。在試管中，于50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)內(nèi)，不同溫度下保溫60分鐘來測(cè)定該酶的熱穩(wěn)定性，用冷水冷卻試管，檢測(cè)各緩沖液中殘留的酶活性。在50mM磷酸鹽緩沖液中，于不同pH值下，20℃保溫60分鐘以檢測(cè)該酶的pH穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)緩沖液至pH7.0，并檢測(cè)各緩沖液中殘留的酶活性。該酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性結(jié)果分別示于圖3和圖4中。該酶在溫度直到約30℃是穩(wěn)定的，而于pH約6.0-9.0時(shí)是穩(wěn)定的。1mM Cu++和Hg++和50mMTris-HCl緩沖液對(duì)該酶有抑制作用。
實(shí)驗(yàn)4對(duì)糖的作用對(duì)各種糖進(jìn)行試驗(yàn)，以確定它們是否可作為本發(fā)明酶的底物使用。將葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖、可溶性淀粉、平均聚合度為18的直鏈淀粉、海藻糖、新海藻糖、龍膽二糖、曲二糖、異麥芽糖、纖維二糖、麥芽糖醇、蔗糖、麥芽寡糖、圖拉糖、泊雷寡糖(paratinose)、海藻寡糖(terhalulose)或乳糖配成溶液。制備葡萄糖和等量α-葡萄糖1-磷酸或β-葡萄糖1-磷酸的溶液。
將該兩溶液分別與按實(shí)驗(yàn)2方法制得的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶按2單位/g底物(d.s.b)的量相混合，調(diào)節(jié)它們的底物濃度到5W/V%，并于20℃、pH7.0進(jìn)行酶促反應(yīng)24小時(shí)。于酶促反應(yīng)前后，用“KIESELGEL 60(20×20cm)”(一種由美國(guó)Rahway的Merk CO.Inc出售的TLC用的鋁板)對(duì)兩溶液進(jìn)行薄層層析(TLC)分析，以測(cè)定本發(fā)明酶是否對(duì)這些糖有作用。使用展層溶劑體系1-丁醇，吡啶和水(＝6∶4∶1體積比)將所得產(chǎn)物在板上一次展開。噴灑20V/V%硫酸的甲醇溶液使板上產(chǎn)物顯色，并于110℃加熱該板10分鐘。其結(jié)果列于表2中。
表2底物 酶的作用 底物 酶的作用葡萄糖 - 龍膽二糖 -麥芽糖 ++ 曲二糖 -麥芽三糖 - 異麥芽糖 -麥芽四糖 - 纖維二糖 -麥芽五糖 - 麥芽糖醇 -麥芽六糖 - 蔗糖 -麥芽七糖 - 麥芽寡糖 -可溶性淀粉 - 松二糖 -直鏈淀粉 - 泊雷寡糖 -(平均聚合度18) 海藻寡糖 -海藻糖 + 乳糖 -新海藻糖 - α葡萄糖1磷酸加葡萄糖 -新海藻糖 - β葡萄糖1磷酸加葡萄糖 -注該表中，符號(hào)“-”表示酶促反應(yīng)前后沒觀察到有變化;符號(hào)“+”表示由于形成其它產(chǎn)物而使底物斑點(diǎn)的大小稍有縮小;符號(hào)“++”表示因?yàn)樾纬善渌a(chǎn)物而使底物斑點(diǎn)的大小明顯縮小。
正如表2所示結(jié)果所證明的，本發(fā)明的酶只作用于麥芽糖和海藻糖，特別顯示出既不作用于含葡萄糖和α-葡萄糖1-磷酸的體系，也不作用于含葡萄和β-葡萄糖1-磷酸的體系。從該結(jié)果可以得出結(jié)論本發(fā)明的酶是一種新酶，它不同于常規(guī)的麥芽糖-和海藻糖-磷酸化酶。
實(shí)驗(yàn)5來自麥芽糖或海藻糖的產(chǎn)物于麥芽糖水溶液中，按2單位/每克作為底物的麥芽糖(d.s.b)的量加入按實(shí)驗(yàn)2方法所制的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶以使最終底物濃度為5W/V%，將所得溶液于20℃，pH7.0條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)24小時(shí)。用氣相色譜法(以下簡(jiǎn)稱為GLC)分析所得反應(yīng)混合物中的糖類組成。將反應(yīng)混合物的一部分干燥，溶于吡啶中并進(jìn)行三甲基硅烷化處理，將獲得之產(chǎn)物作為分析樣品。該氣相色譜所用的裝置和條件是“CG-16A”由日本東京的Shimadzu Corporation出售的氣相色譜儀;直徑3mm且長(zhǎng)2m的不銹鋼柱，填充由日本東京GLSciences Inc.市售的2%“SILICONE OV-17/CHROMORB W”;以氮?dú)庾鬏d氣，流速40ml/分;爐中增溫速率為7.5℃/分，范圍為160℃-320℃。在氫火焰離解檢測(cè)器上分析糖組成。其結(jié)果列于表3中。
表3反應(yīng)混合物中的糖 GLC保留時(shí)間(分) 糖組成(%)葡萄糖 3.87和4.70 4.9麥芽糖 11.93和12.27 22.3X 12.34*72.8注符號(hào)“＊”的值與海藻糖的值一致。
正如表3所示結(jié)果所證明的，產(chǎn)物“X”生成，其保留時(shí)間與市售的海藻糖保留時(shí)間一致。為鑒定“X”產(chǎn)物，進(jìn)行下述確證實(shí)驗(yàn)。將新配制的，與上面所用的相同的麥芽糖水溶液用20mM醋酸鹽緩沖液(pH4.5)稀釋，使麥芽糖濃度為2W/V%，并取其0.5ml與0.1單位由日本東京的Seikagaku-Kogyo Co，Ltd，出售的葡萄糖淀粉酶樣品相混合，然后于40℃使該混合物進(jìn)行酶促反應(yīng)20小時(shí)。
同樣，將新配制的，與上面所用者相同的麥芽糖水溶液用20mM的醋酸鹽緩沖液(pH7.0)稀釋，使麥芽糖濃度為2W/V%，并取其0.5ml與0.5單位海藻糖酶相混合，然后于40℃使混合物進(jìn)行酶促反應(yīng)20小時(shí)。對(duì)未經(jīng)處理的麥芽糖水溶液和用葡萄糖淀粉酶及海藻糖酶處理過的麥芽糖水溶液均進(jìn)行GLC分析，然后研究所得數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)麥芽糖由葡萄糖淀粉酶完全分解成葡萄糖，而產(chǎn)品“X”則完好保留。
當(dāng)用海藻糖酶處理時(shí)，麥芽糖完好保留但產(chǎn)物“X”完全被分解成葡萄糖。該葡萄糖淀粉酶和海藻糖酶的反應(yīng)機(jī)理來看，可得出結(jié)論本發(fā)明酶可從麥芽糖形成一種寡糖，即海藻糖。
并且，將根據(jù)本發(fā)明的純化酶與作為底物的海藻糖反應(yīng)，所用反應(yīng)條件與麥芽糖的情況一樣，并將所得反應(yīng)混合物用GLC法分析，從所得數(shù)據(jù)確證本發(fā)明酶能從海藻糖生成麥芽糖。其結(jié)果示于表4中
表4底物 A B(%) C(%) D(%)葡萄糖 4.9 27.9 78.5麥芽糖 麥芽糖 22.3 0.0 21.5海藻糖 72.8 72.1 0.0葡萄糖 3.2 19.9 83.0海藻糖 麥芽糖 17.2 0.0 16.7海藻糖 79.6 80.1 0.0注該表中，符號(hào)“A”代表反應(yīng)混合物中的糖;符號(hào)“B”表示本發(fā)明酶所生成的反應(yīng)混合物中的各種糖的組成;符號(hào)“C”表示用葡萄糖淀粉酶處理的反應(yīng)混合物中各種糖的組成;符號(hào)“D”表示用海藻糖酶處理各糖類組成。
正如表4結(jié)果所證明的，本發(fā)明的酶能將麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖，反之亦然。本發(fā)明轉(zhuǎn)換反應(yīng)的平衡位置傾向于形成海藻糖，即麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖的轉(zhuǎn)換率為約70%或更高，它要高于海藻糖轉(zhuǎn)化為麥芽糖的轉(zhuǎn)化率。
實(shí)驗(yàn)6麥芽糖濃度對(duì)海藻糖形成的影響將分別含2.5，5，10，20或40W/V%麥芽糖的溶液，以每克麥芽糖2單位(d.s.b)的量與按實(shí)驗(yàn)2方法制得的純化的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶相混合，于20℃和pH7.0條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)。酶促反應(yīng)期間，將反應(yīng)混合物取樣，并于100℃加熱10分鐘使剩余的酶失活。
用蒽酮-硫酸法測(cè)定反應(yīng)混合物的總糖含量。還原糖含量用Somogyi-Nelson方法基于葡萄糖來定量，而還原力則作為還原糖含量與總糖含量之比來確定。
將樣品稀釋得到的糖濃度為約1W/V%，然后進(jìn)行“MOL-CUT ⅡLGC”(Japan Millipore Ltd.，Tokyo，Japan)以除去蛋白質(zhì)，并用高壓液相層析法(以下稱為HPLC)分析其糖組成。所用裝置和條件是“CCPD SYSTEM”(由日本東京的Tosoh Corporation出售的HPLC裝置);“YMC-PACK PA-30”，(直徑4.6mm長(zhǎng)度250mm的柱，由日本東京的YMC CO;Ltd.出售);洗脫系統(tǒng)為乙腈和水(＝78∶22體積比);流速1.2ml/分;用差動(dòng)式折射儀作為檢測(cè)器。其結(jié)果示于表5中。

正如表5所示結(jié)果所證明的，麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖的反應(yīng)不取決于麥芽糖濃度，以約80%的轉(zhuǎn)化率順利進(jìn)行。
實(shí)驗(yàn)7溫度對(duì)海藻糖形成的影響將20W/V%麥芽糖溶液，以每克麥芽糖2單位(d.s.b)的量與按實(shí)驗(yàn)2所述方法制得的純化的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶相混合，并分別于5、10、15、20或25℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)。在酶促反應(yīng)期間，以予定時(shí)間間隔取樣，并將樣品于100℃加熱10分鐘使剩余的酶失活。與實(shí)驗(yàn)6相似，用HPLC分析樣品中糖的組成。在不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間取樣的樣品中的海藻糖含量示于表6中。
表6反應(yīng)時(shí)間 海藻糖含量(%)(小時(shí))5℃ 10℃ 15℃ 20℃ 25℃2 26.1 28.9 32.9 34.6 34.78 49.5 54.3 61.2 62.0 61.123 78.2 79.5 80.9 79.2 76.748 81.8 80.9 80.4 76.6 72.7正如表6所示結(jié)果所證明的，當(dāng)反應(yīng)溫度升高時(shí)，海藻糖形成率趨于提高，并且從麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖的轉(zhuǎn)化反應(yīng)甚至在5℃時(shí)仍以海藻糖轉(zhuǎn)化率約82%的高水平順利進(jìn)行。
實(shí)驗(yàn)8從麥芽糖制備海藻糖將10份重量的日本Okayama的Hayashibara Biochemical Laboratories，Inc出售的麥芽糖溶解于40份重量水中，將該溶液按每克麥芽糖2單位的量(d.s.b)與按實(shí)驗(yàn)2方法制得的純化的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶相混合，于15℃和pH7.0進(jìn)行酶促反應(yīng)48小時(shí)，然后于100℃將反應(yīng)混合物加熱10分鐘使剩余的酶失活。用活性碳使該約含74%海藻糖(d.s.b)的反應(yīng)混合物脫色，用H-型和OH-型離子交換劑脫鹽，濃縮至約78W/V%溶液，然后與0.1%作為晶種的結(jié)晶海藻糖(d.s.b)相混合，然后于室溫放置過夜以使之結(jié)晶。將所得糖膏分離成晶體，用少量水噴淋并洗滌，隨后回收到約3.0份重量的高純度結(jié)晶海藻糖，其純度為99.8%(d.s.b)。
實(shí)驗(yàn)9酶的產(chǎn)生將含2.0W/V%葡萄糖、1.0W/V%硫酸銨、0.1W/V%磷酸氫二鉀、0.06W/V%磷酸二氫鈉、0.05W/V%硫酸鎂、0.3W/V%碳酸鈣和水的液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基100ml的等分樣放入500ml的各錐形燒瓶中，于115℃高壓滅菌30分鐘后冷卻。用Pseudomonas Putida(FERM BP-4579)種子培養(yǎng)物接種后，然后在200rpm攪拌條件下，27℃培養(yǎng)24小時(shí)。所得培養(yǎng)物匯集起來作為種子培養(yǎng)物。
將約20L新配制的，與上面所用者相同的液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基等分樣放入30L的發(fā)酵罐中、滅菌、冷卻至27℃，并接種1V/V%種子培養(yǎng)物，接著在攪拌和通氣條件下于27℃和pH6.5-8.0培養(yǎng)20小時(shí)。
積聚在所得培養(yǎng)物中的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶活性為0.12單位/ml。將一部分培養(yǎng)物離心處理使之分離成細(xì)胞和上清液。將細(xì)胞懸浮于50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，得到的體積與該部分的原體積相同。然后分別檢測(cè)細(xì)胞懸浮液中和上清液中的酶活性，發(fā)現(xiàn)分別為0.11單位/ml和0.01單位/ml。該酶活性是在35℃下檢測(cè)的。
實(shí)驗(yàn)10酶的純化將實(shí)驗(yàn)9中制得的培養(yǎng)物離心處理，得到0.45kg濕細(xì)胞，然后將其懸浮于10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中。將約2L所得細(xì)胞懸浮液用“MINI-RABO”(一種日本東京Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.出售的超壓力細(xì)胞破碎裝置)處理使細(xì)胞破碎，然后將所得混合物以15，000xg離心30分鐘，獲得約1.7L上清液。將硫酸銨加入上清液中，使其溶解飽和度達(dá)到0.7，于4℃放置4小時(shí)，離心得到所形成的沉淀物。
將該沉淀物溶解于10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，將該溶液對(duì)新配制的同樣緩沖液透析24小時(shí)，并離心除去不溶物。將400ml經(jīng)透析的溶液分成2份，分別進(jìn)行離子交換柱層析，其中使用填充有300ml“DEAE-TOYOPEARL GEL”(一種由日本東京的TosohCorporation出售的凝膠)的層析柱。
本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶吸附在凝膠上，用新配制的添加有鹽的相同緩沖液洗脫?；厥蘸富钚缘牟糠荩⒂醚b填有80ml“DEAE-TOYOPEARL GEL”的柱對(duì)其進(jìn)行離子交換柱層析。用范圍從0.1M至0.3M的線性鹽梯度洗脫吸附于凝膠上的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶，然后回收含酶活性的部份。
將回收的餾份匯集起來，使用裝填有400ml“TPYO-PEARL HW-55S”(一種由日本東京的Tosoh Corporation出售的凝膠)的層析進(jìn)行凝膠過濾柱層析，回收含酶活性的洗脫份。各純化步驟的總活性、比活性和產(chǎn)率列示在表7中。
表7純化步驟總酶活性*比活性產(chǎn)率(單位) (單位/mg蛋白) (%)細(xì)胞破碎后的上清液 1750 0.04 100鹽析后的透析溶液 1200 0.07 68.5離子交換柱第一次洗脫物 1090 0.53 62.3離子交換柱第二次洗脫物 360 4.5 20.6凝膠過濾柱洗脫物 156 6.5 8.9注符號(hào)“＊”是指本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶。
使用7.5W/V%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，對(duì)提純的酶制劑進(jìn)行凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)為單一蛋白質(zhì)譜帶，這表明該制劑純度相當(dāng)高。
實(shí)驗(yàn)11酶的性質(zhì)使用7.5%(W/V)十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠對(duì)按實(shí)驗(yàn)10所述方法制得的純化的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶制劑的一部分進(jìn)行電泳，并將其與同時(shí)進(jìn)行電泳的日本東京Bio-Rad Laboratories市售的標(biāo)志蛋白質(zhì)進(jìn)行比較，確定其分子量為大約110，000-120，000道爾頓。
使用含有2%(W/V)“AMPHOLINE”(一種由Pharmacia LKB Biotechnology AB，Uppsala，Sweden推向市場(chǎng)的兩性電解質(zhì))的聚丙烯酰胺凝膠對(duì)另一部分純化的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶制劑的蛋白質(zhì)進(jìn)行等電聚焦電泳。其后將所得到的凝膠切成小片，測(cè)定它們的pH顯示酶的pI約為4.1-5.1。
按照分析酶活性所用的方法，研究溫度和pH對(duì)該酶活性的影響。結(jié)果分別示于圖5(溫度的影響)和圖6(pH的影響)。當(dāng)在pH7.0保溫60分鐘時(shí)，酶的最適溫度約為20℃;當(dāng)在35℃保溫60分鐘時(shí)最適pH約為7.3-8.3。在含有50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)的容器內(nèi)，在不同溫度下將酶保溫60分鐘，用冷水冷卻所得到的容器內(nèi)的緩沖液并分析各緩沖液內(nèi)的殘留酶活性，以確定酶的熱穩(wěn)定性。在有不同pH的50mM磷酸鹽緩沖液中，將酶35℃保溫60分鐘，將所得緩沖液調(diào)到pH7.0，并檢測(cè)各緩沖液中的殘留酶活性以確定酶的pH穩(wěn)定性。所測(cè)得的酶的熱和pH穩(wěn)定性分別示于圖7和8中。酶在高至約40℃的溫度和pH約6.0-9.5時(shí)是穩(wěn)定的。1mM Cu++或HgH以及50mM Tris-HCl緩沖液對(duì)該酶有抑制作用。
實(shí)驗(yàn)12對(duì)糖的作用按照實(shí)驗(yàn)4中所述方法(不同的是將反應(yīng)溫度定在35℃)，試驗(yàn)多種糖以確定它們是否可用作本發(fā)明實(shí)驗(yàn)10中制得的來自臭味假單胞菌(pseudomonas Putida)H262之酶的底物。與來自臭味假單胞菌H262的酶相似，來自脂肪桿菌菌種R48(Pimelobacter SPR48)的酶也特異性作用于麥芽糖和海藻糖，即可將麥芽糖轉(zhuǎn)化成海藻糖，且反之亦然。已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的平衡位置偏向于形成海藻糖，即麥芽糖轉(zhuǎn)化成海藻糖的轉(zhuǎn)化率高達(dá)約70%。
實(shí)驗(yàn)13麥芽糖濃度對(duì)海藻糖生成的影響向含有5、10、20和30%麥芽糖的溶液中以2單位/克麥芽糖(d.s.b)的量加入按實(shí)驗(yàn)10所述方法制得的純化麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶，并使溶液在35℃和pH7.0條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，同時(shí)以預(yù)定的時(shí)間間隔從反應(yīng)混合物中取樣。在100℃將樣品加熱10分鐘以失活殘留的酶。
按實(shí)驗(yàn)6中所述相似方法確定樣品的還原力及糖組成。結(jié)果示于表8中。

從表8中所示結(jié)果可以看出，本發(fā)明的酶使麥芽糖以大約70%的產(chǎn)率形成海藻糖，不取決于作底物的麥芽糖的濃度。
實(shí)驗(yàn)14從麥芽糖制備海藻糖將10份重量的麥芽糖(Hayashibara Biochemical Laboratories，Inc.，Okayama，Japan市售)溶解在40份重量的水中，再將該溶液按2單位/克麥芽糖量(d.s.b)與本發(fā)明純化的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶混合，并在35℃和pH7.0條件下使酶促反應(yīng)進(jìn)行48小時(shí)，然后將所得反應(yīng)混合物于100℃加熱10分鐘以滅活剩余的酶。用活性炭使含有約69%海藻糖(d.s.b)的反應(yīng)混合物脫色，用H-和OH-形式的離子交換劑脫鹽，并濃縮成約78%(W/V)溶液，然后與作為種晶的0.1%結(jié)晶海藻糖(d.s.b)混合，并于室溫下將其放置過夜以結(jié)晶。將所得糖膏分離出晶體，用少量水噴淋并沖洗，然后回收約2.3份重量，純度為99.7%(d.s.b)的高純度結(jié)晶海藻糖。
實(shí)驗(yàn)15酶的產(chǎn)生將100ml由0.5W/V%多胨、0.1W/V%酵母浸膏、0.07W/V%硝酸鈉、0.01W/V%磷酸氫二鉀、0.02W/V%硫酸鎂、0.01%W/V%氯化鈣和水組成的液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基等分樣調(diào)到pH7.5，放在500ml錐瓶中，于120℃高壓滅菌20分鐘，冷卻并接種Thermus aquaticus CATCC33923)的菌種培養(yǎng)物，然后在200rpm攪拌條件下60℃培養(yǎng)24小時(shí)。匯集所得培養(yǎng)物并用作菌種培養(yǎng)物。
將大約20升如上述培養(yǎng)中所用的同樣液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的新鮮制劑等分樣放入兩個(gè)30升發(fā)酵罐中，滅菌，冷卻到60℃并接種1V/V%種子培養(yǎng)物，然后在60℃和pH6.5-8.0的攪拌和通氣條件下培養(yǎng)約20小時(shí)。
所得培養(yǎng)物中積聚的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶的活性為0.35單位/ml。離心一部分培養(yǎng)物分離出細(xì)胞和上清液，將細(xì)胞懸浮在50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中達(dá)到該部分同樣的體積，然后檢測(cè)細(xì)胞懸浮液和上清液中的酶活性，表明分別為0.33單位/ml和0.02單位/ml。于60℃檢測(cè)該酶活性。
實(shí)驗(yàn)16酶的純化離心實(shí)驗(yàn)15中制得的培養(yǎng)物以得到0.28kg濕細(xì)胞，然后將其懸浮在10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中。用“MODEL US300”(由Nippon Seiki Co.，Ltd.，Niigate，Japan市售的超聲波粉碎機(jī))處理所得細(xì)胞懸浮液以破碎細(xì)胞。以15，000xg離心所得混合物30分鐘，得到約1.8L上清液。向上清液中加入硫酸銨并使之溶解在其中，以達(dá)到0.7飽和度，將此溶液4℃放置4小時(shí)，并離心得到沉積物。
將沉積物溶解在10ml磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，將溶液以新制備的相同緩沖液透析24小時(shí)，并離心除去不溶性物質(zhì)。將經(jīng)過透析的1，560ml溶液分成三份，分別使用填有530ml“DEAE-TOYOPEARL 650 GEL”(Tosoh Corporation，Tokyo，Japan市售)的柱進(jìn)行離子交換柱層析。
本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶吸附到凝膠上，因此用添加有鹽的新制備的相同緩沖液洗脫之。
回收具有酶活性的餾分，以加有1M硫酸銨的新制備的相同緩沖液透析，并使用裝填有380ml“BUTYL-TOYOPEARL 650 GEL”(一種由Tosoh Corporation，Tokyo，Japan市售的疏水凝膠)的柱進(jìn)行疏水柱層析。用1M至OM鹽的線性梯度液洗脫吸附到凝膠上的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶，然后回收含酶活性的餾分。
合并各餾分并使用裝填380ml“TOYOPEARL HW-55S”(一種由Tosoh Corporation，Tokyo，Japan市售的凝膠)的柱進(jìn)行凝膠過濾柱層析，然后回收洗脫的含酶活性餾分。
合并各部分并使用裝填1.0ml“MONO Q HR5/5”(Pharmacia LKB Biotechnology AB，Uppsala，Sweden市售)的柱進(jìn)行離子交換層析。用0.1M至0.35M鹽的線性鹽梯度液從柱上洗脫酶，然后回收含酶活性的餾分。下列表9中總結(jié)了各純化步驟的總活性、比活性和產(chǎn)率。
表9純化步驟總酶活性*比活性產(chǎn)率(%)(單位) (單位/mg蛋白)細(xì)胞破碎后的上清液 8,800 0.10 100鹽析后的透析溶液 8,710 0.16 99.0離子交換柱的洗脫物 5,690 2.5 64.7疏水柱的洗脫物 2,050 17.6 23.3凝膠過濾柱的洗脫物 937 113 10.6離子交換柱的洗脫物 467 135 5.3注符號(hào)“＊”代表本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶。
用5W/V%十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠將純化的酶制劑進(jìn)行凝膠電泳，顯示出單一的蛋白帶。這意味著其為相對(duì)高純度的制劑。
實(shí)驗(yàn)17酶的性質(zhì)在含有7.5W/V%十二烷基磺酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠上將按實(shí)施16中所述方法制得的一部分純化的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶制劑進(jìn)行電泳，并將其與也同時(shí)進(jìn)行電泳的標(biāo)志蛋白質(zhì)(Japan Bio-Rad Laboratories，Tokyo，Japan市售)進(jìn)行比較，確定其分子量約為100，000-110，000道爾頓。
在含有2W/V%“AMPHOLINE”(一種由Phramacia LKB Biotechology AB，Uppsala，Sweden市售兩性電解質(zhì))的聚丙烯酰胺凝膠上將另一部分純化的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶制劑進(jìn)行等電聚焦電泳。之后將所得凝膠切成小片，并檢測(cè)它們的pH，顯示酶的pI約為3.8-4.8。
按照檢測(cè)酶活性的方法研究溫度和pH對(duì)本發(fā)明酶活性的影響。結(jié)果分別示于圖9(溫度的影響)和圖10(pH的影響)中。當(dāng)在pH7.0保溫60分鐘時(shí)，最適溫度約為65℃，當(dāng)于60℃保溫60分鐘時(shí)最適pH約為6.0-6.7。將酶放入含50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)的試管中于不同溫度下保溫60分鐘，用冷水冷卻試管，并檢測(cè)各緩沖液中的殘留酶活性，以確定酶的熱穩(wěn)定性。將酶加在有不同pH的50mM磷酸鹽緩沖液中60℃保溫60分鐘，將所得緩沖液調(diào)到pH7.0，并檢測(cè)各緩沖液中的殘留酶活性，以確定酶的pH穩(wěn)定性。酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性的結(jié)果分別示于圖11和12中。在溫度高至80℃以及pH約為5.5-9.5時(shí)酶是穩(wěn)定的。1mM Cu++或Hg++以及50mM Tris-HCl緩沖液對(duì)該酶有抑制作用。
實(shí)施18對(duì)糖類的作用試驗(yàn)各種糖以確定它們是否可用作按實(shí)驗(yàn)4中所述方法(不同的是反應(yīng)溫度定在50℃)得到的來自Thermas aquaticus(ATCC 33923)的本發(fā)明酶的底物。與來自Pimelobacter SP.R48和臭味假單胞菌(Pseudomonsa Putida)H262的酶相似，來自Thermus aquaticus(ATCC 33923)的酶也特異地作用于麥芽糖和海藻糖，即它將麥芽糖轉(zhuǎn)化成海藻糖且反之亦然。已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)和平衡位置偏向于生成海藻糖，即麥芽糖轉(zhuǎn)化成海藻糖的轉(zhuǎn)化率約為70%或更高。
實(shí)驗(yàn)19麥芽糖濃度對(duì)海藻糖生成的影響向含有2.5、5、10、20或40%麥芽糖的溶液中以2.5單位/g麥芽糖(d.s.b)的量加入按實(shí)驗(yàn)16所述方法制得的來自Thermus aquaticus(ATCC 33923)的純化的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶，并在60℃和pH6.5條件下使之發(fā)生酶促反應(yīng)。酶促反應(yīng)開始后72小時(shí)取反應(yīng)混合物樣品，并于100℃加熱30分鐘以滅活余留的酶。與實(shí)驗(yàn)6中所述方法相似，測(cè)定樣品還原力和糖的組成。結(jié)果示于表10中。

從表10所示結(jié)果可以看出，本發(fā)明以大約70%的產(chǎn)率從麥芽糖生成海藻糖，不取決于作為底物的麥芽糖的濃度。
實(shí)驗(yàn)20溫度對(duì)海藻糖生成的影響向20%pH6.5的麥芽糖溶液中以2.5單位/g麥芽糖(d.s.b)的量加入按實(shí)驗(yàn)16所述方法制得的來自Thermus aquaticus(ATCC 33923)的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶，并于40、50、60或70℃下使混合物進(jìn)行酶促反應(yīng)，同時(shí)以預(yù)定的時(shí)間間隔取樣。將樣品于100℃加熱30分鐘以失活剩余的酶。按實(shí)驗(yàn)6中所述相似的方法在HPLC上分析所得反應(yīng)混合物的糖組成。表11中顯示了在不同溫度和反應(yīng)時(shí)間的海藻糖含量。
表11反應(yīng)時(shí)間 海藻糖含量(%)(小時(shí))40℃ 50℃ 60℃ 70℃4 45.0 55.7 56.8 50.38 61.0 67.3 64.3 58.524 79.1 76.5 71.1 64.348 80.7 76.9 70.2 62.872 80.0 76.4 68.5 60.2從表11所示結(jié)果可以看出，酶促反應(yīng)溫度越低，麥芽糖至海藻糖的轉(zhuǎn)化率越高。該酶以大約80%的轉(zhuǎn)化率將麥芽糖轉(zhuǎn)化成海藻糖。
實(shí)驗(yàn)21來自不同微生物的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶的產(chǎn)生及其性質(zhì)按實(shí)驗(yàn)15中所述方法，在錐形瓶中將已證實(shí)常見微生物中有生成本發(fā)明麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶之能力的微生物加以保溫。分析酶活性后，按實(shí)驗(yàn)16所述用細(xì)胞破碎裝置處理所得培養(yǎng)物。從所得混合物中分離上清液并透析，以得到部分純化的酶，然后按實(shí)驗(yàn)17中所述分析酶的特性。結(jié)果示于表12中。

按實(shí)驗(yàn)18中所述方法，研究表12中所示的從Thermus屬已知微生物衍生的部分純化的酶對(duì)各種糖的作用。結(jié)果表明，與從Thermus aquaticus(ATCC 33923)衍生的酶相似，這些部分純化的酶可特異地作用于麥芽糖和海藻糖，并從麥芽糖生成了海藻糖。
表明從Thermus ruber(ATCC 35948)衍生的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶比從Thermus aquaticus(ATCC 33923)的酶有較低的最適溫度和較低穩(wěn)定溫度，而從Thermus屬各種微生物得到的酶與得自Thermus aquaticus(ATCC 33923)的酶具有差不多相同的特性，并且有相對(duì)高的熱穩(wěn)定性。
實(shí)驗(yàn)22麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶的部分氨基酸序列用蒸餾水透析一部分按實(shí)驗(yàn)2所述方法得到的衍生于Pimelobacter SP.R48的、按實(shí)驗(yàn)10所述方法得到的衍生于Pseudomonas Putida H262的、或按實(shí)驗(yàn)16所述方法得到的衍生于Thermus aquaticus(ATCC 33923)的純化的酶制劑，使用所得到物中的約80μg蛋白質(zhì)作為樣品分析含有酶之N末端的部分氨基酸序列。在Applied Biosystems Inc.(Foster City，USA)市售的蛋白質(zhì)序儀“PROTELIN SEQUENCER MODEL 473A”上分析N末端。表13中顯示了含有各酶之N末端的部分氨基酸序列。
表13微生物 含有N末端的部分蛋白質(zhì)序列Gly-Lys-Try-Pro-Arg-Pro-Ala-Ala-Phe-Ile-Pseudomonas putida 1 5 10H262 AspSer-Thr-Val-Leu-Gly-Glu-Glu-Pro-Glu-Trp-Pimelobacter sp. 1 5 10R48 Phe-Arg-Thr-Ala-Val-Phe-Tyr-Glu15Met-Asp-Pro-Leu-Try-Try-Lys-Asp-Ala-Val-Thermus aquaticus 1 5 10ATCC 33923 Ile-Try-Gln注表中各數(shù)字是指從各部分氨基酸序列的N末端計(jì)數(shù)的氨基酸序號(hào)。
從表13所示的結(jié)果可以看出，從Pimelobacter SP.R48、Pseudomonas Putida H262和Thermus aquaticus(ATCC 33923)衍生的酶具有高同源性的部分氨基酸序列。從中可見從Pimelobac-ter菌屬微生物衍生之酶的第10個(gè)氨基酸“Trp”至第16個(gè)氨基酸“Phe”與從Pseudomonas菌屬微生物衍生之酶的第3個(gè)氨基酸“Trp”至第9個(gè)氨基酸“Phe”的部分氨基酸序列間有相當(dāng)高的同源性?？捎肨rp-X1-Arg-X2-Ala-X3-Phe代表該部分氨基酸序列(其中符號(hào)“X1”是指“Phe”或“Pro”;符號(hào)“X2”是指“Thr”或“Pro”;且符號(hào)X3是指“Val”或“Ala”)。發(fā)現(xiàn)從Pimelobacter菌屬的微生物衍生的從第14個(gè)氨基酸“Ala”到第17個(gè)氨基酸“Tyr”與從Thermus菌屬的微生物衍生的從第9個(gè)氨基酸“Ala”到第12個(gè)氨基酸“Tyr”的部分氨基酸序列之間有相當(dāng)高的同源性?？葾la-Val-X4-Try(其中符號(hào)“X4”是指“Phe”或“Ile”)表示該部分氨基酸序列。
實(shí)驗(yàn)23海藻糖的物理化學(xué)性質(zhì)研究按實(shí)驗(yàn)8中所述方法制備的高純度海藻糖的樣品的物理化學(xué)性質(zhì)。結(jié)果測(cè)得熔點(diǎn)為97.0℃，比旋光度為[α]20D+199℃(C＝5)，融合熱為57.8KJ/mole，無水海藻糖在水中25℃的溶解度為77.0g。這些結(jié)果與一起進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)的購(gòu)自Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，Tokyo，Japan的商品含水結(jié)晶海藻糖的數(shù)據(jù)完全一致。
實(shí)驗(yàn)24體內(nèi)利用試驗(yàn)按照H.Atsuji等人在J.Clinical Nutrition，Vol.41，No，2，PP.200-208(1972)中報(bào)導(dǎo)的方法，將實(shí)驗(yàn)8中制得的30g純度為99.8%(d.s.b)的高純度海藻糖樣品，制成20W/V%水溶液，然后將其口服給予3個(gè)年齡分別為26、27和30歲的男性健康自愿者，以預(yù)定的時(shí)間間隔采集其血液樣品，然后測(cè)定血糖和胰島素水平。使用葡萄糖作為對(duì)照。結(jié)果可見海藻糖與葡萄糖有相似的行為，而且在服用后約0.5-1小時(shí)觀察到血糖和胰島素水平的最大值。這一結(jié)果表明該海藻糖易被活體消化，吸收和代謝，并作為能源被利用。因此，該海藻糖和含有該糖的組合物適于用作補(bǔ)充能量的糖。
實(shí)驗(yàn)25
急性毒性試驗(yàn)給小鼠口服實(shí)驗(yàn)8中制備的純度為99.8%，(d.s.b)的高純度海藻糖樣品以進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。結(jié)果表明海藻糖是毒性相當(dāng)?shù)偷奈镔|(zhì)，即使給小鼠服用可服劑量的最高水平也未見小鼠死亡。雖然不很準(zhǔn)確，但測(cè)得LD50可達(dá)50g/kg或更高。
實(shí)驗(yàn)例A中舉例說明了用本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶制得的海藻糖和含有該糖的糖組合物，以及它們的制劑。實(shí)施例B中舉例說明了含有海藻糖的本發(fā)明組合物或含海藻糖的糖組合物的本發(fā)明組合物實(shí)施例A-1按照實(shí)驗(yàn)1中所述方法，使用同樣的，但其中葡萄糖濃度調(diào)整到4.0W/V%的新制備的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，在通氣和攪拌條件下，用發(fā)酵罐將Pimelobacter SP.R48菌種的微生物(FERM BP-4315)種子培養(yǎng)物培養(yǎng)60小時(shí)。所得培養(yǎng)物中麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶的活性為0.75單位/ml。將一部分培養(yǎng)物離心分離成細(xì)胞和培養(yǎng)物上清液后檢測(cè)它們的酶活性。結(jié)果觀察到細(xì)胞中的酶活性約占65%，培養(yǎng)物上清液中的酶活性約占35%。用“MINI-BABO”-一種由Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.，Tokyo，Japan市售的超高壓細(xì)胞破碎裝置處理約35L含細(xì)胞的培養(yǎng)物以破碎細(xì)胞。離心所得細(xì)胞懸浮液得到上清液，用UF-濾膜過濾之，然后回收約含有15單位/ml本發(fā)明麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶的約1.2L濃縮物。
向10W/V%馬鈴薯淀粉懸浮液(pH5.5)中以2單位/g淀粉(d.s.b)的量加入由Nagase Biochemicals Ltd.，Kyoto，Japan市售的α淀粉酶樣品-“SPITASE HS”，在攪拌和加熱條件下使所得混合物膠凝化并液化，然后立即將混合物于120℃放置20分鐘并將所得產(chǎn)物調(diào)整到50℃和pH5.0。將如此得到的混合物按2單位/g淀粉(d.s.b)的量與Nagase Biochemicals Ltd.，Kyoto，Japan市售的β-淀粉酶樣品和按500單位/g淀粉(d.s.b)的量與Hayashibara Biochemical Laboratories Inc.，Okayama，Japan市售的異淀粉酶樣品混合，并使所得混合物進(jìn)行24小時(shí)酶促反應(yīng)，以得到含有約92W/V%麥芽糖的糖溶液。于100℃將反應(yīng)混合物加熱20分鐘，再加熱至10℃，調(diào)到pH7.0，按1單位/g干物質(zhì)的量與按上述方法制備的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶混合，并使酶促反應(yīng)進(jìn)行96小時(shí)。
將反應(yīng)混合物在95℃保持10分鐘，冷卻，并用活性碳按常規(guī)方法脫色并過濾。用H-和OH-型離子交換劑脫鹽純化濾液并濃縮，并以約95%的產(chǎn)率(d.s.b)得到濃度約70W/V%的糖漿。
含有約69%海藻糖(d.s.b)并有低至DE18.2還原力的產(chǎn)物，具有中等甜度及適當(dāng)?shù)恼扯群捅啬芰?，因此可在各種組合物如食品、化妝品和醫(yī)藥中適當(dāng)?shù)赜米魈鹞秳?、口味改良劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、賦形劑和充填劑。
實(shí)施例A-2將其中麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化的酶促反應(yīng)已暫停的按實(shí)施例A-1的方法制備的反應(yīng)混合物，按10單位/g的量與由Nagase Biochemicals，Ltd.，Kyoto，Japan市售的葡糖淀粉酶“GLUCOZYME”混合，在pH5.0和50℃下使酶促反應(yīng)進(jìn)行24小時(shí)。加熱處理所得反應(yīng)混合物以失活剩余的酶，脫色、脫鹽并純化得到作進(jìn)料溶液的糖溶液。使用由Tokyo Organic Chemical Institute，Ltd.，Tokyo，Japan市售的“XT-1016(N+a型，聚合度40%)”，將該溶液進(jìn)行離子交換柱層析。將樹脂裝填入系列串連的，內(nèi)徑為5.4cm的4夾套不銹鋼柱內(nèi)，使達(dá)到總凝膠床濃度為20m。保持柱內(nèi)溫度為60℃，以5V/V%的量向柱內(nèi)加入糖溶液，以SV(空間速度)0.15供入60℃熱水進(jìn)行分級(jí)分離以除去葡萄糖，然后回收高海藻糖含量餾分。合并各餾分、純化、濃縮、真空干燥并研磨，以大約55%(d.s.b)的產(chǎn)率得到高海藻糖含量粉末。
含有約97%海藻糖(d.s.b)并具有滿意的低還原力及中度和高質(zhì)量甜度的產(chǎn)物，可在各種組合物如食品、化妝品和醫(yī)藥中任意用作甜味劑、口味改良劑、質(zhì)量改善劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、賦形劑和充填劑。
實(shí)施例A-3用活性碳以常規(guī)方法使按實(shí)施例A-2所述方法制得的高海藻糖含量餾分脫色，并用離子交換劑脫鹽和純化。將濾液濃縮成約70W/V%的溶液，然后放入混有作為晶種之約2%含水結(jié)晶海藻糖的結(jié)晶器內(nèi)，并逐漸冷卻以得到結(jié)晶度約為45%的糖膏。將此糖膏從頂端裝有噴嘴的干燥塔中以150kg/cm2的高壓噴霧。在此噴霧步驟中，同時(shí)以從干燥塔頂部送入的85℃熱空氣給糖膏換氣，在裝于干燥塔底部的金屬絲網(wǎng)輸運(yùn)裝置上收集所得結(jié)晶粉末，并隨通過金屬絲網(wǎng)上行的45℃氣流從干燥塔中逐步除去之。將所得結(jié)晶粉末注入熟化塔并熟化10小時(shí)，以完成結(jié)晶和干燥，然后以相當(dāng)于高海藻糖含量級(jí)分原料(d.s.b)大約90%的產(chǎn)率回收所得的含水結(jié)晶海藻糖粉末。
該產(chǎn)物實(shí)質(zhì)上是不吸濕的和易于處理的，這樣就可使之隨意地作為甜味劑、口味改良劑、質(zhì)量改善劑及穩(wěn)定劑用于各種組合物如食品、化妝品和醫(yī)藥中。
實(shí)施例A-4按實(shí)施例A-3中所述的相似的方法純化按實(shí)施例A-2所述方法制得的高海藻糖含量級(jí)分，將所得純化產(chǎn)物放入蒸發(fā)器中，真空下煮沸得到濕含量約為3.0%的糖漿。將所得糖漿放在結(jié)晶器中，與按糖漿來說為1%(d.s.b)的無水結(jié)晶海藻糖混合，在攪拌條件下于120℃結(jié)晶，將所得混合物放入鉛制簡(jiǎn)易容器中，并于100℃熟化6小時(shí)以使之成塊。
將所得到的塊用切割器切碎，用流化床干燥機(jī)干燥，以相當(dāng)于高海藻糖含量級(jí)分原料約85%的產(chǎn)率(d.s.b)得到含濕量約0.3%的無水結(jié)晶海藻糖粉末。
該產(chǎn)物可在食品、化妝品和藥物中任意地用作干燥劑，它們的原料和中間產(chǎn)物也可在食品、化妝品和醫(yī)藥等各種組合物中用作白色粉末狀甜味劑。
實(shí)施例A-5根據(jù)實(shí)驗(yàn)1的方法，將Pimelobacter SP.R48(FERM BP-4315)的種子培養(yǎng)物接種并培養(yǎng)在營(yíng)養(yǎng)基中，離心所得培養(yǎng)物，得到具大約該酶800單位活性的100g濕細(xì)胞，然后與其中有已預(yù)先溶在10mM磷酸鹽緩沖液內(nèi)，由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，Tokyo，Japan市售的粘度為300-400cp之2.5%海藻酸鈉的100ml10mM磷酸鹽緩沖液揑合。將所得含有細(xì)胞的淤漿從溶液表面上方約20cm處連續(xù)滴入用磁攪拌器攪拌的0.1M氯化鈣溶液中，以形成直徑約2mm的球形凝膠。將凝膠在溶液中于室溫靜止約2小時(shí)并用Buchner瓷漏斗過濾，然后回收用海藻酸鹽固定的細(xì)胞。將所得固定化細(xì)胞裝入帶套管的玻璃柱(直徑30mm，長(zhǎng)度200mm)中，加熱柱并保持在20℃。以SV0.2向柱內(nèi)供入40%麥芽糖溶液(pH6.8)，使之向下流出得到約含70%海藻糖(d.s.b)的糖溶液。純化并濃縮如此制得的糖溶液，以大約95%(d.s.b)的產(chǎn)率得到濃度約為70%的糖漿。
該產(chǎn)物具有相當(dāng)?shù)偷倪€原力和中等甜度及適當(dāng)?shù)谋衲芰Γ虼丝梢匀鐚?shí)施例A-1中所述產(chǎn)物一樣用于各種組合物中。
實(shí)施例A-6將33%玉米淀粉懸浮液與碳酸鈣混合達(dá)到0.1%的終濃度，將此混合物調(diào)到pH6.5后，按0.2單位/g淀粉(d.s.b)的量加入“TERMAMYL 60L”(一種由Novo Industri A/S Copenhagen Denmark市售的α-淀粉酶)混合，并使酶促反應(yīng)在95℃下進(jìn)行15分鐘。于120℃將反應(yīng)混合物高壓滅菌30分鐘，冷卻到55℃，按500單位/g淀粉(d.s.b)的量與異淀粉酶樣品(Hayashibara Biochemical Laboratories，Inc.，Okayama，Japan市售)，以及按30單位/g淀粉(d.s.b)的量與β-淀粉酶樣品(Nagase Biochemicals，Ltd.，Kyoto，Japan市售)混合，并進(jìn)行48小時(shí)酶促反應(yīng)，然后回收麥芽糖含量約為84%(d.s.b)的糖溶液。將該糖溶液再在100℃放置10分鐘，冷卻到15℃，并以1.5單位/g淀粉(d.s.b)的量與按實(shí)施例A-1所述方法制得的本發(fā)明的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶混合，并使酶促反應(yīng)進(jìn)行72小時(shí)。于100℃將所得反應(yīng)混合物加熱15分鐘，以滅活剩余的酶，用活性碳按常規(guī)方法脫色，用離子交換劑脫鹽并純化，然后濃縮所得產(chǎn)物，以大約95%(d.s.b)的產(chǎn)率得到濃度約70%的糖漿。
該產(chǎn)物含有約64%海藻糖(d.s.b)，具有相對(duì)低的還原力和中等甜度及適當(dāng)?shù)谋衲芰?，因此可將其如?shí)施例1中所述產(chǎn)物一樣用于各種組合物中。
實(shí)施例A-7將按實(shí)施例A-5中所述方法制得的糖漿濃縮成約82%糖漿后放入結(jié)晶器中，與大約1%晶種混合，移入簡(jiǎn)易容器中，并于20℃放置4天使之結(jié)晶。用切刀將結(jié)晶切碎并干燥，以大約95%的產(chǎn)率(d.s.b)得到糖膏型含水結(jié)晶海藻糖粉末。
該產(chǎn)物基本上沒有表現(xiàn)出吸濕性并且易于處理，因此它們?nèi)鐚?shí)施例A-1產(chǎn)物一樣任意地用于各種組合物中。
實(shí)施例A-8將按實(shí)施例A-6所述方法制得的糖漿濃縮成約80%糖漿后放入結(jié)晶器內(nèi)，與大約1%作為晶種的含水結(jié)晶海藻糖混合，然后在攪拌條件下使之冷卻以形成結(jié)晶。用籃式離心機(jī)分離得到的結(jié)晶體，然后用小量冷水噴淋，以大約20%的產(chǎn)率(d.s.b)得到高純度含水結(jié)晶海藻糖。
該產(chǎn)物表現(xiàn)出如實(shí)驗(yàn)23中所示同樣物理化學(xué)性質(zhì)，并任意在食品、化妝品和醫(yī)藥等各種組合物中用作甜味劑、口味改善劑、質(zhì)量改良劑、穩(wěn)定劑，以及用作工業(yè)試劑和化學(xué)材料。
實(shí)施例A-9將Pseudomonas Putida H262(FERM BP-4579)的種子培養(yǎng)物接種在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，并按照實(shí)驗(yàn)9中所述方法，在攪拌和通氣的條件下用發(fā)酵罐發(fā)酵約20小時(shí)。離心約18L所得到的培養(yǎng)物得到約0.4kg濕細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸浮在4L10mM磷酸鹽緩沖液中，用Nippon Seiki Co.，Ltd.，Niigata，Japan市售的“MODEL US300”超聲波粉碎機(jī)處理以破碎細(xì)胞。離心所得混合物得到上清液并用UF濾膜濃縮之，然后回收到約400ml含有3.8單位/ml的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶的濃縮酶溶液。將10%馬鈴薯淀粉懸浮液(pH5.5)，按2單位/g淀粉(d.s.b)的量與“SPITASE HS”(一種Nagase Biochemicals，Ltd.，Kyoto，Japan市售的α淀粉酶樣品)混合，在攪拌條件下加熱使之膠凝并液化，然后在120℃高壓滅菌20分鐘，冷卻到50℃并調(diào)到pH5.5。向所得混合物中按500單位/g淀粉(d.s.b)的量加入由Hayashibara Biochemical Laboratories，Inc.，Okayama，Japan市售的支鏈淀粉酶樣品和以20單位/g淀粉(d.s.b)的量加入由Nagase Biochemicals，Ltd.，Kyoto，Japan市售的β-淀粉酶樣品，使酶促反應(yīng)進(jìn)行24小時(shí)，然后回收約含92%麥芽糖的糖溶液。將該糖溶液于100℃加熱20分鐘，再調(diào)到40℃和pH7.0，按1.5單位/g的量與上述方法制得的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶混合，并使酶促反應(yīng)進(jìn)行72小時(shí)。將反應(yīng)混合物于95℃加熱10分鐘，冷卻后用活性碳以常規(guī)方法脫色并過濾，然后用H-和OH-型離子交換劑脫鹽并純化，濃縮所得溶液后以約97%的產(chǎn)率(d.s.b)得到濃度約為70W/V%的糖漿。該產(chǎn)物約含有65%海藻糖(d.s.b)，并具有相當(dāng)?shù)偷倪€原力(低至DE16.2)，其具有中低甜度和足夠的粘度以及保濕能力，因此其可在食品、化妝品及醫(yī)藥等多種組合物中被任意地用作甜味劑、口味改良劑、穩(wěn)定劑、填充劑、稀釋劑和賦形劑。
實(shí)施例A-10將按實(shí)施例A-9方法得到的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶的反應(yīng)后混合物于95℃加熱10分鐘以失活剩余的酶，調(diào)到pH5.0和55℃，按10單位/g淀粉(d.s.b)的量與“GLUCOZYME”(一種由NagaseBiochemicals，Ltd.，Kyoto，Japan市售的葡糖淀粉酶)混合并使酶促反應(yīng)進(jìn)行24小時(shí)。以常規(guī)方法加熱反應(yīng)混合物以失活剩余的酶。脫色、脫鹽、純化、并濃縮成55%糖溶液。按實(shí)施例A-2中所述的同樣方法，使用“DOWEX 99(Ca++型，聚合度6%)-一種由Dou Chemical Co.，Midland，Michigan，USA市售的堿土金屬?gòu)?qiáng)酸陽離子交換劑，對(duì)所得糖溶液進(jìn)行柱層析，然后回收高海藻糖含量餾分。合并這些餾分，純化并連續(xù)結(jié)晶同時(shí)濃縮，同籃式離心機(jī)分離所得糖膏后，用少量水噴淋所得結(jié)晶，以大約25%的產(chǎn)率(d.s.b)得到高純度含水結(jié)晶海藻糖。該產(chǎn)物表現(xiàn)有如實(shí)驗(yàn)23之產(chǎn)物的同樣物理化學(xué)性質(zhì)，并與實(shí)施例A-8的產(chǎn)物一樣，其可被任意地用于食品，化妝品和醫(yī)藥各種組合物中，以及用作工業(yè)試劑和化學(xué)原料。
實(shí)施例A-11在實(shí)驗(yàn)9的相同營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)Pseudomonas Putide H262(FERM BP-4579)的種子培養(yǎng)物，離心回收所得細(xì)胞，得到有大約400單位麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶活性的100g濕細(xì)胞，然后與其中已溶解了的粘度為300-400cp之2.5%海藻酸鈉的100ml 10mM磷酸鹽緩沖液揑合。將含細(xì)胞的淤漿在溶液表面上方約20cm高度連續(xù)添加到用磁力攪拌器攪拌的0.1MCaCl2溶液中，以形成直徑約2mm的球形凝膠。將凝膠在CaCl2溶液中，在室溫下保持約2小時(shí)，用布氏漏斗過濾得到海藻酸鈉固定化的細(xì)胞。將固定化細(xì)胞裝填入直徑30mm，長(zhǎng)200mm的帶套層的玻璃柱內(nèi)并保持35℃。以SV 0.1的速率向柱內(nèi)加入向下流動(dòng)的40%麥芽糖溶液(pH6.8)，得到67%海藻糖溶液。按照實(shí)施例A-9中所述方法，純化、濃縮、結(jié)晶并噴霧干燥該海藻糖溶液，以大約90%的產(chǎn)率(d.s.b)得到糖膏型含水結(jié)晶海藻糖粉末。該產(chǎn)物具有相當(dāng)?shù)偷倪€原力，中等甜度和足夠的保濕能力，因此與實(shí)驗(yàn)A-9中的產(chǎn)物一樣可任意地用于多種組合物中。
實(shí)施例A-12將Thermus aquaticus(ATCC 33923)和種子培養(yǎng)物接種于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，并按照實(shí)驗(yàn)15中所述方法在攪拌-通氣條件下培養(yǎng)約20小時(shí)。培養(yǎng)物具有約0.32單位/ml的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶活性。將從大約18L培養(yǎng)物中回收的0.18kg濕細(xì)胞懸浮在10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中。用超聲波破碎器處理約1.5L細(xì)胞懸浮液使細(xì)胞破碎。離心所得細(xì)胞碎片并回收上清液，然后用UF膜濃縮以得到約500ml有大約10單位/ml之麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶活性的濃縮物。向15%玉米淀粉懸浮液(pH5.5)中按2單位/g淀粉的量加入“SPITASE HS”(一種由Nagase Biochemicals，Ltd.，Kyoto，Japan市售的α淀粉酶樣品)，并在攪拌和加熱條件下膠凝并液化。之后立即于120℃將混合物高壓滅菌20分鐘，冷卻到55℃，并調(diào)到pH5.0。向所得混合物中按300單位/g淀粉的量加入由Hayashibara Biochemical Laboratories，Inc.，Okayama，Japan市售的異淀粉酶，和按20單位/g淀粉的量加入由Nagase Biochemicals，Kyoto，Japan市售的β淀粉酶，經(jīng)24小時(shí)酶促反應(yīng)后得到約92%麥芽糖溶液。于100℃加熱所得溶液20分鐘，冷卻到50℃，調(diào)pH到7.0，按1.5單位/g干重的量與上面所制得的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶混合后進(jìn)行酶促反應(yīng)72小時(shí)。然后，將所得培養(yǎng)物于95%加熱10分鐘，冷卻并以慣用方法用活性碳脫色并過濾，然后用H-和OH-型離子交換劑脫鹽并純化所得溶液。將所得到的溶液濃縮后形成70%糖漿產(chǎn)率約為95%(d.s.b)。該產(chǎn)物含有大約64%海藻糖(d.s.b)并有DE18.0的低還原力，以及中等甜度、足夠的粘度和令人滿意的保濕能力，因此其可在食品、化妝品和醫(yī)藥等多種組合物中被任意地用作甜味劑、口味改善劑、穩(wěn)定劑、填充劑、稀釋劑和賦形劑。
實(shí)施例A-13將實(shí)施例A-12中制得的糖漿濃縮成約80%糖漿，然后放入結(jié)晶器中，并按實(shí)施例A-8中所述相似的方法結(jié)晶并分離得到產(chǎn)率約為20%(d.s.b)的高純度含水結(jié)晶海藻糖。該產(chǎn)物表現(xiàn)與實(shí)驗(yàn)23中所述產(chǎn)物相似的物理化學(xué)性質(zhì)，并如實(shí)施例A-8中所述產(chǎn)物一樣在多種組合物如食品、化妝品和醫(yī)藥中被任意地用作工業(yè)試劑、工業(yè)材料和化學(xué)材料。
實(shí)施例A-14將Thermus aquaticus(ATCC 33923)的種子培養(yǎng)物接種在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，并按實(shí)驗(yàn)15中所述方法培養(yǎng)，然后將所得培養(yǎng)物離心而得到約有1，500單位麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶活性的50g濕細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮在100ml粘度為300-400cp的2.5%海藻酸鈉(一種由Wako Chemical Industries，Ltd.，Tokyo，Japan市售的試劑)中。將所得淤漿在溶液表面上方約20cm高度連續(xù)滴入用磁力攪拌器攪拌的0.1M CaCl2溶液中，以形成直徑約2mm的球形凝膠。使凝膠在溶液中室溫放置約2小時(shí)，然后用Buchmer漏斗過濾得到用海藻酸鹽固定的細(xì)胞。將固定化細(xì)胞裝填入帶套層的直徑30mm，長(zhǎng)度為200mm的玻璃柱中，并加熱到60℃。柱內(nèi)供入以SV0.2速率向下流動(dòng)的40%麥芽糖溶液(pH6.5)以得到約66%海藻糖溶液，然后以常規(guī)方法純化、濃縮并噴霧干燥以到產(chǎn)率約為90%(d.s.b)的粉末海藻糖。該粉末有相對(duì)低的還原力和中等甜度，因此可如實(shí)施例A-12的產(chǎn)物一樣被任意地用在多種組合物如食品、化妝品及醫(yī)藥中。
實(shí)施例B-1甜味劑向1份重量的按實(shí)施例A-8中所述方法制備的含水結(jié)晶海藻糖粉末中均勻地加入0.01分重量的“αG SWEET”-一種由Toyo Sugar Refining CO.，Ltd.，Tokyo，Japan市售的α-糖基卡哈苡苷產(chǎn)品，和0.01份重量的由Ajinomoto Co.，Ltd.，Tokyo，Japan市售的L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸產(chǎn)品-“ASPARTAME”，然后將所得混合物加入造粒機(jī)中得到顆粒甜味劑。
該產(chǎn)品具有令人滿意的甜度并比蔗糖甜度大約高2.5倍，并且其熱量值約為蔗糖的2/5。
因?yàn)樵摦a(chǎn)品具有令人滿意的穩(wěn)定性并且不破壞其他與之混合的甜味劑，故可作為低熱量食品的低熱量甜味劑，適用于肥胖者和限制熱量攝入的糖尿病人。
當(dāng)誘發(fā)齲齒微生物作用于該產(chǎn)品時(shí)，它基本上不生成酸和不溶性葡聚糖，因此可將其用于甜味食品以預(yù)防齲齒。
實(shí)施例B-2硬糖果將100份重量約55W/V%蔗糖溶液與按實(shí)施例A-1中所述方法制得的30份重量的海藻糖糖漿加熱混合，并真空濃縮所得溶液直到濕含量低至2%以下。將此濃縮物與1份重量的檸檬酸和足夠量的檸檬香料和著色劑混合，以常規(guī)方法將所得混合物制成所需產(chǎn)品。
該產(chǎn)品具有令人滿意的味道和咬嚼性質(zhì)，并且無引起蔗糖結(jié)晶之弊病的高質(zhì)量硬糖果。
實(shí)施例B-3口香糖加熱3份重量的膠質(zhì)使之軟化，并與3份重量的結(jié)晶麥芽糖醇和4份重量的按實(shí)施例A-3中所述方法制得的含水結(jié)晶海藻糖粉末混合，再與足夠量的香料和著色劑混合。按照常規(guī)方法用滾壓器揑合所得混合物，制成并包裝得到所需產(chǎn)品。
該產(chǎn)品是有令人滿意的質(zhì)地和口味的口香糖，并適于用作相當(dāng)?shù)突蚧旧喜灰瘕x齒的口香糖。
實(shí)施例B-4粉末果珍將經(jīng)過噴霧干燥制成的33份重量的桔汁粉末與50份按實(shí)施例A-7中所述方法制得的糖膏型高海藻糖含量粉末、10份重量的蔗糖、0.65份重量的無水檸檬酸、0.1份重量的蘋果酸、0.1%份重量的L-抗壞血酸、0.1份重量的檸檬酸鈉、0.5份重量的支鏈淀粉和足夠量的粉末香料均勻混合。研磨所得混合物并用流化床造粒機(jī)造粒30分鐘以得到顆粒，同時(shí)噴淋作為粘結(jié)劑的按實(shí)施A-6所述方法制得的海藻糖糖漿，并以150cm3的流速通入40℃空氣。將如此得到的顆粒稱重并包裝后得到所需產(chǎn)品。
含有30%桔汁(d.s.b)的該產(chǎn)品可相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間保持其高質(zhì)量，而沒有令人不快的味道和氣味。
實(shí)施例B-5乳酸菌飲料將175份重量的脫脂奶粉、130份重量的按實(shí)施例A-9所述方法制得的海藻糖糖漿、50份重量的日本專利預(yù)公開No.281795/92中所述的高乳蔗糖(lactosucrose)粉末溶解在1，150份重量的水中，將溶液于65℃加熱30分鐘除菌，冷卻到40℃，以常規(guī)方法與30份重量作為起酵物的乳酸菌混合，并于37℃保溫8小時(shí)以得到有令人滿足的口味和香味的所需產(chǎn)品。因該產(chǎn)品含有寡糖，因此可穩(wěn)定地保留乳酸菌并促進(jìn)生長(zhǎng)。
實(shí)施例B-6乳蛋糕乳脂充分混合100份重量的玉米淀粉、100份重量的按實(shí)施例A-6中所述方法制得的海藻糖糖漿、80份重量的麥芽糖、20份重量的蔗糖和1份重量的鹽。將此混合物與280份重量的雞蛋混合，并逐步與1，000份重量的煮沸牛奶混合。在加熱條件下持續(xù)攪拌所得混合物，當(dāng)混合物中的玉米淀粉完全膠凝而使整個(gè)內(nèi)容物顯示半透明時(shí)即停止加熱，然后冷卻所得物并向其中加入足夠量的香草香料。將所得混合物稱重，注射成形并包裝后得到所需產(chǎn)品。
該產(chǎn)品具有平滑的表面和光澤，以及適當(dāng)?shù)目谖逗吞鸲葘?shí)施例B-7“Uiro-no-moto”(甜稻米凍的預(yù)混合物)均勻混合90份重量的稻米粉和20份重量的玉米淀粉、40份重量的蔗糖、80份重量的按實(shí)施例A-11所述方法制得的糖膏型含水結(jié)晶海藻糖、以及4份重量的支鏈淀粉，以制備Uiro-no-moto。將產(chǎn)物與水和足夠量的matcha(粉末茶)摻合，并將所得混合物放入容器中通蒸汽60分鐘以得到Uiro。該產(chǎn)品具有令人滿意的光澤，咀嚼性質(zhì)、香味和味道，并且因?yàn)槠渲兴矸鄣睦匣饔帽怀浞忠种贫哂邢鄬?duì)長(zhǎng)的貨架保存期限。
實(shí)施例B-8粉末肽將1份重量的“HINUTE S”-一種由Fuji Oil Co.，Ltd.Tokyo，Japan市售的含有40%可食大豆的肽溶液與2份重量的按實(shí)施例A-10所述方法制得的含水結(jié)晶海藻糖混合，將所得混合物放入塑料容器中，于50℃真空干燥，并磨碎得到粉末狀肽。該具有令人滿意之味道和香味的產(chǎn)品可任意地被用作糖食如預(yù)混合物、冰糕和冰淇淋的材料，以及用作嬰兒食品和以口服或插管喂飼形式用作治療營(yíng)養(yǎng)物。
實(shí)施例B-9粉末狀miso向1份重量的akamiso(一種miso)中加入3份重量的按實(shí)施例A-4中所述制得的粉末狀無水結(jié)晶海藻糖，并將混合物倒入在其表面有半球型坑的金屬平板中，室溫放置過夜以得到各約4g重的miso固體物，然后將其研成粉末即得到所需產(chǎn)品。
該產(chǎn)品可任意地用作方便面和湯的調(diào)味料，以及miso糖食。
實(shí)施例B-10蛋黃粉在平板加熱器上于60-64℃加熱滅菌從新鮮雞蛋制備的蛋黃，并將1份重量的所得液體與相對(duì)于1份重量液體來說的4份重量的粉末狀無水結(jié)晶海藻糖(按實(shí)施例A-4所述方法制備)混合。將所得混合物轉(zhuǎn)入容器內(nèi)放置過夜以形成塊，同時(shí)使無水結(jié)晶海藻糖轉(zhuǎn)變成含水結(jié)晶海藻糖。用切刀將如此得到的塊切碎得到蛋黃粉。
該產(chǎn)品可任意用作糖食如預(yù)混和物、冰糕、冰淇淋和乳化劑的材料，以及用作嬰兒食品和口服或插管喂飼的治療用營(yíng)養(yǎng)品。該產(chǎn)品也可用作皮膚保養(yǎng)劑和生發(fā)劑。
實(shí)施例B-11An(豆糊)將10份重量作為原料的adzuki豆按常規(guī)方法與水混合并煮沸，然后除去豆中的辛澀味和水溶性雜質(zhì)得到大約21份重量的“adzuki-tsubu-nama-an”將其中加入14份重量的蔗糖、5份重量的按實(shí)施例A-12所述方法制得的海藻糖糖漿、5份重量的水，并將所得混合物煮沸，與小量沙拉油混合并小心揑合的不致于糊住豆。如此即得到大約35份重量的所需產(chǎn)品。
該產(chǎn)品沒有因煮沸而脫色并且有令人滿意的口味和香味，因此可見用作豆沙甜點(diǎn)心、帶豆沙餡的甜面包、湯團(tuán)、填加豆沙的薄酥餅、冰糕和冰淇淋的材料。
實(shí)施例B-12面包制品按常規(guī)方法將100份重量的面粉、2份重量的酵母、5份重量的糖、1份重量的按實(shí)施例A-14所述方法制得的粉末狀含水結(jié)晶海藻糖、0.1份重量的無機(jī)酵母食品與水揑合，于26℃發(fā)酵2小時(shí)，熟化30分鐘并焙烤。
該產(chǎn)品是具有令人滿意的色澤和膨松性及令人滿意的彈性和適當(dāng)甜度的高質(zhì)量面包制品。
實(shí)施例B-13火腿向1，000份重量的切成片的火腿肉中加入15份重量的鹽和3份重量的硝酸鉀并研磨至均質(zhì)狀態(tài)，將火腿肉片堆碼好并在冷藏室中放置過夜。然后，先將所得肉片放在由500份重量水、100份重量鹽、3份重量硝酸鉀、40份重量按實(shí)施例A-3所述方法制得的含水結(jié)晶海藻糖粉末和足夠量胡椒薄荷組成的鹽溶液中于冷藏室內(nèi)浸泡7天，按常規(guī)方法用冷水洗、用線捆扎、熏制、蒸煮、冷卻并包裝而得到所需產(chǎn)品。
該產(chǎn)品是具有令人滿意的光澤、味道和香味的高質(zhì)量火腿。
實(shí)施例B-14甜煉乳在100份重量作為原料的新鮮牛奶中溶入3份重量按實(shí)施例A-5中所述方法制得的海藻糖糖漿和1份重量蔗糖，并在平板加熱器上加熱滅菌，濃縮成70%糖漿(d.s.b)，然后無菌裝罐得到所需產(chǎn)品。
因?yàn)樵摦a(chǎn)品具有中等甜度和香味，故可任意地給幼兒和兒童食品、水果、咖啡、可可和茶等作調(diào)料。
實(shí)施例B-15潤(rùn)膚霜按常規(guī)方法加熱溶解2份重量的聚乙二醇單硬脂酸酯、5份重量的甘油單硬脂酸酯(自身乳化的)、2份重量的按實(shí)施例A-7中所述方法制得的糖膏型高海藻糖含量粉末、1份重量的α-糖基蕓香苷、1份重量的液體凡士林、10份重量的三-2-乙基已酸甘油酯和足夠量的防腐劑。使所得溶液與2份重量的L-乳酸、5份重量的1，3-丁二醇和66份重量的精制水混合，并用勻漿器乳化所得混合物，然后與足夠量的香料在攪拌條件下混合以得到潤(rùn)膚霜。
該產(chǎn)品具有相對(duì)高的穩(wěn)定性，可任意地用作高質(zhì)量防曬霜、皮膚保護(hù)劑和皮膚增白劑。
實(shí)施例B-16粉末人參提取物將半份重量的人參提取物與1.5份重量的按實(shí)施例A-4所述方法制得的無水結(jié)晶海藻糖粉末混合，將所得混合物移入簡(jiǎn)易容器放置2天，以使無水結(jié)晶海藻糖轉(zhuǎn)變成含水結(jié)晶海藻糖并形成塊狀，然后將其切碎并將其篩分成粉末狀人參提取物。
將該產(chǎn)品與足夠量的維生素B1和B2用造粒機(jī)處理而得到含有維生素的粉末狀人參提取物。
如此得到的產(chǎn)品可任意用作補(bǔ)藥、疲勞緩解劑和活力增進(jìn)劑。該產(chǎn)品也可用作生發(fā)劑。
實(shí)施例B-17固體藥劑將由Hayashibara Biochemical Laboratories，Inc.，Okayama，Japan生產(chǎn)，由Cosmo Bio，Tokyo，Japan推向市場(chǎng)的天然人α干擾素制劑，以常規(guī)方式加入固相抗人α干擾素抗體柱上，使吸附α干擾素，并在柱頂加入含牛血清白蛋白作為穩(wěn)定劑的緩沖液，然后除去過量的白蛋白。繼之用含5%按實(shí)施例A-2所述方法制得的高海藻糖含量粉末的生理鹽水，隨生理鹽水的pH改變而從柱上洗脫α干擾素。用濾膜過濾所得洗脫物，并加入約20倍體積的由Hayashibara Shoji，Inc.，Okayama，Japan市售的無水結(jié)晶體麥芽糖粉末-“FINETOSE”，以使濾液脫水，然后將所得經(jīng)脫水的產(chǎn)物研成粉末，并用壓片機(jī)將所得粉末壓片以得到每片約含150單位天然人α干擾素的片劑(每片約200mg重)。
該產(chǎn)品可作為舌下含片，以每天每成年人1-10片的劑量給病人服用，并任意用于治療病毒性疾病、過敏反應(yīng)、風(fēng)濕病、糖尿病和惡性腫瘤。特別是，該產(chǎn)品可適用于作目前病人數(shù)目正在顯著增加之愛滋病和肝炎的治療劑。摻入該產(chǎn)品中的海藻糖和麥芽糖可作為天然人α干擾素的穩(wěn)定劑，使之即使在室溫下亦將長(zhǎng)時(shí)間保留活性。
實(shí)施例B-18糖衣片劑用由40份重量按實(shí)施例A-3所述方法制得的粉末狀含水結(jié)晶體海藻糖粉末、2份重量有平均分子量200，000的支鏈淀粉、30份重量水、25份重量滑石粉、3份重量氧化鈦組成的溶液包涂150mg重的粗制片核，直到總重量達(dá)到約230mg，再進(jìn)一步用由65份重量的同一粉末狀含水結(jié)晶海藻糖的新鮮制劑、1份重量的支鏈淀粉和34份重量的水組成的溶液包涂，并用液體石蠟使其具光澤，以得到具有令人滿意的光澤和外觀的糖衣片劑。
該產(chǎn)品具有相對(duì)高的休克耐受性并可相對(duì)長(zhǎng)時(shí)間地保持其高質(zhì)量。
實(shí)施例B-19牙膏按常規(guī)方式混合下列成分制備牙膏磷酸氫鈣 45.0%支鏈淀粉 2.95%十二烷基磺酸鈉 1.5%甘油 20.0%
聚氧乙烯山梨糖醇十二烷基酯 0.5%防腐劑 0.05%按實(shí)施例A-14所述方法制備的粉狀含水結(jié)晶體海藻糖 12.0%Maltitol 5.0%水 13.0%該產(chǎn)品因具有足夠甜度而適用作小兒的牙膏。
實(shí)施例B-20插管喂飼用的固體制劑制備由下列組分組成的組合物500份重量的按實(shí)施例A-8所述方法制備的含水結(jié)晶體海藻糖、270份重量的研成粉末的蛋黃、209份重量的脫脂乳、4.4份重量的氯化鈉、1.8份重量的氯化鉀、4份重量的硫酸鎂、0.01份重量的硫胺素、0.1份重量的抗壞血酸鈉、0.6份重量的乙酸維生素E和0.04份重量的尼克酰胺。將25g組合物的等分樣注入帶防潮壓層的小袋內(nèi)，熱封后得到所需產(chǎn)品。
將1袋產(chǎn)品溶解在大約150～300ml水中制成流食，經(jīng)口服或插管喂飼輸入病人鼻腔、胃或小腸內(nèi)以補(bǔ)充活體能量。
實(shí)施例B-21超營(yíng)養(yǎng)制劑(hyperalimentation)將按實(shí)施例A-10所述方法制備的高純度含水結(jié)晶海藻糖溶解在水中制成約10W/V%的含水海藻糖溶液，然后以常規(guī)方式用濾膜過濾除去致熱原，無菌注入塑料瓶中，封口后即得到所需產(chǎn)品。
該產(chǎn)品是一種令人滿意的放置后基本沒有改變的穩(wěn)定的超營(yíng)養(yǎng)制劑，可適于靜脈內(nèi)和腹腔內(nèi)注射使用。該產(chǎn)品的10W/V%溶液是與血液等滲的，因此可以比葡萄糖高出2倍的濃度給活體補(bǔ)充能量。
實(shí)施例B-22超營(yíng)養(yǎng)制劑將按實(shí)施例A-13所述方法制得的高純度含水晶體海藻糖和由下列成分組成的氨基酸組合物攪拌下溶解在水中，以分別達(dá)到5W/V%和30W/V%的濃度，然后按實(shí)施例B-10的相似方法純化所得溶液得到無熱原溶液，將其注入塑料瓶中并密封即制成所需產(chǎn)品。
氨基酸組合物的成分成分 mg/100mlL-異亮氨酸 180L-亮氨酸 410L-賴氨酸單鹽酸化物 620L-蛋氨酸 240L-苯丙氨酸 290L-蘇氨酸 180L-色氨酸 60L-纈氨酸 200L-天冬氨酸鹽酸化物 270L-組氨酸單鹽酸化物 130甘氨酸 340雖然該產(chǎn)品是含有海藻糖和氨基酸的多成分超營(yíng)養(yǎng)制劑，但其在放置后基本上沒有改變，因此是相當(dāng)穩(wěn)定的，并可適于經(jīng)靜脈和腹腔內(nèi)使用于活體。該產(chǎn)品可任意地用于為活體補(bǔ)充能量及氨基酸。
實(shí)施例B-23治療創(chuàng)傷的軟膏將200份重量的按實(shí)施A-2所述方法制備的高海藻糖含量粉末和300份重量的麥芽糖與50份重量的含3份重量碘的甲醇溶液混合，并將所得溶液與200份重量的10W/V%支鏈淀粉水溶液混合以制得具有令人滿意的伸展性和粘附性的所需產(chǎn)品。
該產(chǎn)品中所含的碘可發(fā)揮殺菌活性，并且其中的海藻糖可作對(duì)活細(xì)胞的能量補(bǔ)充劑，因此該產(chǎn)品可縮短傷口愈合時(shí)間并能很好地愈合傷口表面。
從上面的描述可以看出，本發(fā)明的新的麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶可以令人滿意的高產(chǎn)率將麥芽糖轉(zhuǎn)化成海藻糖。通過本發(fā)明酶促反應(yīng)制得的本發(fā)明海藻糖和含有該糖的糖組合物，具有相對(duì)高的穩(wěn)定性和質(zhì)量及令人喜歡的甜度。當(dāng)口服后它們可被機(jī)體同化、吸收并作為能源被利用。因此，它們可在食品、化妝品和藥品等多種組合物中任意被用作甜味劑、口味改善劑、質(zhì)量改良劑、穩(wěn)定劑、賦形劑、稀釋劑和填充劑。
據(jù)此，本發(fā)明旨在提供一種從麥芽糖制備海藻糖(其中麥芽糖則可從廉價(jià)和實(shí)質(zhì)上豐富的天然來源的淀粉制得)，以及在工業(yè)規(guī)模上并以相對(duì)低的成本制備含海藻糖之糖組合物的新技術(shù)。因此，本發(fā)明對(duì)淀粉、酶和生物化學(xué)科學(xué)等領(lǐng)域，以及特別是食品、化妝品和醫(yī)藥工業(yè)、林業(yè)、漁業(yè)、農(nóng)業(yè)、家畜飼養(yǎng)業(yè)和化學(xué)工業(yè)等其他工業(yè)領(lǐng)域具有深遠(yuǎn)的影響?？梢哉f本發(fā)明對(duì)各領(lǐng)域的作用都是相當(dāng)大的。
雖然已對(duì)本發(fā)明優(yōu)選方案作了描述，但應(yīng)明確的是，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)，而這些將包括在本發(fā)明待批權(quán)利要求內(nèi)，并落入本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)和范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.使麥芽糖轉(zhuǎn)化成海藻糖并且也使海藻糖轉(zhuǎn)化為麥芽糖的酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的酶，從微生物衍生而來。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的酶，其中所說的微生物是Pimelobacter、Pseudomonas或Thermus屬的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的酶，其中所說的微生物是Pimelobacter，SP.R48(FERM BP-4315)、Pseudomonas Putida H262(FERM BP-4579)或Thermus aquaticus(ATCC 33923)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的酶，具有下列物理化學(xué)性質(zhì)(1)根據(jù)十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測(cè)得分子量約57，000-120，000道爾頓。(2)使用兩性電解質(zhì)進(jìn)行等電聚焦電泳測(cè)得等電點(diǎn)(pI)約為3.8-5.1;(3)其活性受1mM Cu++、50mM Tris-HCl緩沖液的抑制。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的酶，具有選自由下列一組序列組成的部分氨基酸序列(1)Trp-X1-Arg-X2-Ala-X3-Phe(其中X1是指“Phe”或“Pro”;X2是指“Thr”或“Pro”;X3是指“Val”或“Ala”);(2)Ala-Val-X4-Tyr(其中X4代表“phe”或“Ile”)。
7.制備權(quán)利要求1的酶的方法，包括(a)在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠產(chǎn)生該酶的微生物，以生成該酶;并且(b)從所得培養(yǎng)物中回收所說的酶。
8.選自Pimelobacter SP.R48(FERM BP-4315)和Pseudomonas Putida H262(FERM BP-4579)組成的一類能夠生成權(quán)利要求1之酶的微生物。
9.降低麥芽糖之還原力的方法，其包括使權(quán)利要求1的酶在溶液中作用于麥芽糖的步驟。
10.制備含海藻糖之糖組合物的方法，包括(a)使權(quán)利要求1的酶在溶液中作用于麥芽糖以生成海藻糖，并且(b)回收含有海藻糖的所得糖組合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所說的麥芽糖是使β淀粉酶用于加有或不加有淀粉脫支鏈酶的淀粉物質(zhì)的溶液而制備的。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述的海藻糖是含水結(jié)晶海藻糖或無水結(jié)晶海藻糖。
13.制備海藻糖的方法，包括(a)使權(quán)利要求1的酶作用于溶液中的麥芽糖以生成海藻糖;(b)純化所得溶液中的海藻糖，并(c)回收被純化的海藻糖。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中步驟(b)包括一個(gè)使該溶液經(jīng)受葡糖淀粉酶的作用以增加海藻糖的含量并使用強(qiáng)酸型陽離子交換劑柱對(duì)所得海藻糖溶液進(jìn)行柱層析的步驟。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所說的麥芽糖是使β淀粉酶作用于加有或不加有淀粉脫支酶的淀粉類物質(zhì)的溶液而制備的。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所說的海藻糖是含水結(jié)晶海藻糖或無水結(jié)晶海藻糖。
17.含有按權(quán)利要求10的方法制備的糖組合物的食品。
18.含有按權(quán)利要求10的方法制備的糖組合物的化妝品組合物。
19.含有按權(quán)利要求10的方法制備的糖組合物的藥物組合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的藥物組合物，其被用于為活的機(jī)體補(bǔ)充能量。
21.含有按權(quán)利要求13的方法制備的海藻糖的食品。
22.含有按權(quán)利要求13的方法制備的海藻糖的化妝品組合物。
23.含有按權(quán)利要求13的方法制備的海藻糖的藥物組合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的藥物組合物，其被用于為活的機(jī)體補(bǔ)充能量。
全文摘要
一種以SDS-PAGE測(cè)得分子量為約57,000—120,000道爾頓，以兩性電解質(zhì)進(jìn)行等電電泳測(cè)得PI為3.8—5.1的酶，該酶能將麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖，反之亦然。該酶從Pimelobacter、Pseudomonas和Thermus屬微生物中分離出來。使用該酶，可以很容易地以低成本從市售麥芽糖工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)海藻糖。以該酶制備的海藻糖及其含海藻糖的糖類組合物，適于在食品，化妝品組合物和藥物組合物中使用。
文檔編號(hào)A61K8/365GK1106065SQ9411615
公開日1995年8月2日 申請(qǐng)日期1994年7月20日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月20日
發(fā)明者西本友之, 茶圓博人, 杉本利行, 三宅俊雄 申請(qǐng)人:株式會(huì)社林原生物化學(xué)研究所