專(zhuān)利名稱(chēng)：增加血栓調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的方法
導(dǎo)致凝血酶形成的復(fù)雜的蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)觸發(fā)血凝過(guò)程和血栓形成。凝血酶通過(guò)蛋白水解作用從溶于血漿中的纖維蛋白原Aα和Bβ鏈上除去活化肽，引起不溶性纖維蛋白形成。
目前通過(guò)施用肝素類(lèi)和香豆素類(lèi)獲取抗凝作用。胃腸外給藥的藥理學(xué)控制凝集和血栓形成是基于使用肝素類(lèi)抑制凝血酶而實(shí)現(xiàn)的。肝素類(lèi)通過(guò)促進(jìn)內(nèi)源性抗凝血酶Ⅲ(凝血酶的主要生理抑制劑)的抑制作用間接地作用于凝血酶。由于在血漿中抗凝血酶Ⅲ水平有變化，并且由于表面結(jié)合的凝血酶似乎對(duì)上述間接機(jī)制有抗性，因此肝素可能是無(wú)效的治療。因?yàn)閾?jù)信某些凝集試驗(yàn)關(guān)系到效果和安全，因此一般用凝集試驗(yàn)(特別是活化部分凝血致活酶時(shí)間(APTT)試驗(yàn))監(jiān)測(cè)肝素水平。香豆素類(lèi)通過(guò)阻滯凝血酶原和其它此類(lèi)蛋白質(zhì)合成中轉(zhuǎn)錄后的γ-羧化作用而阻礙凝血酶的生成。由于其作用機(jī)制，香豆素類(lèi)的效果僅能在給藥后6-24小時(shí)才慢慢地呈現(xiàn)。而且它們不是選擇性的抗凝劑。香豆素類(lèi)也需要用凝集試驗(yàn)(特別是凝血酶原時(shí)間試驗(yàn))監(jiān)測(cè)。
為更好地理解本發(fā)明，下文提供了凝固酶系統(tǒng)的簡(jiǎn)要說(shuō)明。有時(shí)被稱(chēng)作“級(jí)聯(lián)反應(yīng)”的凝固系統(tǒng)，最好看作為一種鏈反應(yīng)，該鏈反應(yīng)包括依次將酶原活化為活性絲氨酸蛋白酶，所述蛋白酶最終導(dǎo)致凝血酶的產(chǎn)生。通過(guò)有限的蛋白水解作用，凝血酶使血漿纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘哪z態(tài)纖維蛋白。凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中兩個(gè)關(guān)鍵過(guò)程是通過(guò)凝血因子IXa轉(zhuǎn)化凝血因子X(jué)成為Xa和通過(guò)凝血因子X(jué)a轉(zhuǎn)化凝血酶原成為凝血酶。
上述兩種反應(yīng)均發(fā)生在細(xì)胞表面，特別是血小板內(nèi)皮細(xì)胞表面，并且兩種反應(yīng)都需要輔因子。主要的輔因子，即因子Ⅴ和Ⅶ，作為相對(duì)無(wú)活性的前體循環(huán)，但當(dāng)形成首批少量凝血酶分子時(shí)，凝血酶通過(guò)有限的蛋白水解作用而活化輔因子?；罨蟮妮o因子Ⅴa和Ⅷa以約3個(gè)數(shù)量級(jí)的速度加速凝血酶原向凝血酶的轉(zhuǎn)化以及因子X(jué)向因子X(jué)a的轉(zhuǎn)化。
活化后的蛋白C主要優(yōu)選兩種血漿蛋白底物，該活化后的蛋白C水解及不可逆轉(zhuǎn)地破壞所述血漿蛋白底物。這些血漿蛋白底物是凝血輔因子Ⅴ和Ⅷ的活化形式(分別為輔因子Ⅴa和Ⅷa)。活化后的蛋白C僅最低限度地降解無(wú)活性前體，即凝血因子Ⅴ和Ⅷ。已表明活化后的蛋白C明顯增加狗體內(nèi)主要生理上的纖維蛋白溶酶、組織纖維蛋白溶酶原激活因子的循環(huán)水平。
但是，蛋白C的活化涉及凝血酶，即凝固級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最終的絲氨酸蛋白酶，和內(nèi)皮細(xì)胞膜結(jié)合的糖蛋白，即血栓調(diào)節(jié)蛋白。血栓調(diào)節(jié)蛋白與凝血酶形成緊密的1∶1化學(xué)計(jì)量復(fù)合物。當(dāng)與凝血酶復(fù)合時(shí)，血栓調(diào)節(jié)蛋白實(shí)質(zhì)上改變了凝血酶的功能性質(zhì)。凝血酶在凝固途徑中通常凝集纖維蛋白原、活化血小板，并轉(zhuǎn)化凝血輔因子Ⅴ和Ⅷ成為其活化形式的Ⅴa和Ⅷa。凝血酶單獨(dú)作用可活化蛋白C，但僅是很緩慢的作用并且效率低。相反，當(dāng)與血栓調(diào)節(jié)蛋白形成1∶1復(fù)合物時(shí)，凝血酶不能凝集纖維蛋白原，不能活化血小板，并且不能轉(zhuǎn)化凝血因子Ⅴ和Ⅷ成為其活化形式。這種凝血酶血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物促進(jìn)蛋白C的活化，對(duì)于凝血酶血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物，其蛋白C活化的速度常數(shù)是凝血酶單獨(dú)的速度常數(shù)的20000倍。
因此，活化后的蛋白C是一種抗血栓形成劑，與其它抗凝劑例如肝素和口服羥基香豆素類(lèi)抗凝劑(如華法令)比較，活化后的蛋白C具有更寬的治療指數(shù)。在一些局部位點(diǎn)產(chǎn)生凝血酶之前，蛋白C和活化后的蛋白C都是無(wú)效的。沒(méi)有凝血酶，活化后的蛋白C實(shí)質(zhì)上無(wú)效，因?yàn)閷?duì)于使凝血因子Ⅴ轉(zhuǎn)變成Ⅴa和使Ⅷ轉(zhuǎn)變成Ⅷa，凝血酶是必須的。如上文所述，上述兩種輔因子的活化形式是活化后的蛋白C的優(yōu)選底物。當(dāng)給患者輸注后，蛋白C酶原保持無(wú)活性，直至產(chǎn)生了凝血酶。若沒(méi)有血栓調(diào)節(jié)蛋白凝血酶復(fù)合物，蛋白C酶原以很慢的速率轉(zhuǎn)變成活化后的蛋白C。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了下述定義的本發(fā)明化合物增加血栓調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，并具有口服生物利用度。
本發(fā)明提供了增加血栓調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的方法，該方法包括給需要這種治療的人施用有效量的式Ⅰ化合物及其藥學(xué)上適用的鹽和溶劑化物， 其中R1和R3各自獨(dú)立地是氫、-CH3、 (C1-C6烷基)或 ，這里Ar為任意取代的苯基;
R2系選自吡咯烷子基(pyrrolidino)、六亞甲基亞氨基和哌啶子基。
本發(fā)明還包括一種抑制血栓病或血栓形成過(guò)程的方法，該方法包括給需要這種治療的人施用有效量的式Ⅰ化合物。
本發(fā)明還包括一種增加蛋白C活化速率的方法，該方法包括施用式Ⅰ化合物。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)選自2-苯基-3-芳酰苯并噻吩類(lèi)(苯并噻吩類(lèi))的式Ⅰ化合物可用于增加血栓調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)。本發(fā)明提供的使用方法是通過(guò)給需要所述治療的人或哺乳動(dòng)物施用增加血栓調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)有效劑量的式Ⅰ化合物或其藥學(xué)上適用的鹽或溶劑化物而實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)適當(dāng)時(shí)，本發(fā)明包括治療和/或預(yù)防治療。
抑制是指包括其通常已被接受的意義，包括緩延、預(yù)防、遏制、減慢或逆轉(zhuǎn)。
雷洛昔芬為本發(fā)明的一個(gè)化合物，是其中R1和R3為氫并且R2為1-哌啶基的式Ⅰ化合物的鹽酸鹽。
一般來(lái)講，本發(fā)明化合物可以與常用的賦形劑、稀釋劑或載體進(jìn)行配制并且可壓制成片劑，或者也可以配制成方便口服給藥的酏劑或溶液劑，或者通過(guò)肌內(nèi)或靜脈途徑給藥。本發(fā)明的化合物還可以經(jīng)皮給藥，并且可以配制成緩釋劑型等。
可以按照已有方法制備本發(fā)明方法中的化合物，如按美國(guó)專(zhuān)利4，133，814，4，418，068和8，380，635所述方法進(jìn)行制備，所有這些文獻(xiàn)均收編在本發(fā)明中作為參考。一般來(lái)講，該方法從帶有6-羥基和2-(4-羥基苯基)基團(tuán)的苯并[b]噻吩開(kāi)始。起始化合物被保護(hù)、烷基化或酰化，并且進(jìn)行脫保護(hù)，生成式Ⅰ化合物。以上美國(guó)專(zhuān)利敘述了制備上述化合物的實(shí)施例。術(shù)語(yǔ)“任意取代的苯基”包括苯基和用C1～C6烷基、C1～C4烷氧基、羥基、硝基、氯、氟或三(氯或氟)甲基一次或二次取代的苯基。
用于本發(fā)明方法的化合物可以與多種有機(jī)和無(wú)機(jī)酸、堿生成藥學(xué)上適用的酸和堿加成鹽，藥學(xué)上適用的酸和堿加成鹽包括通常用于藥物化學(xué)上的生理上適用的鹽。所述鹽也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。用于生成上述鹽的典型的無(wú)機(jī)酸包括鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、硫酸、磷酸、連二磷酸等?？梢詰?yīng)用由有機(jī)酸生成的鹽，有機(jī)酸例如有脂肪族一或二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸和羥基鏈烷二酸，以及芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸。因此所述藥學(xué)上適用的鹽包括有乙酸鹽、苯基乙酸鹽、三氟乙酸鹽、丙烯酸鹽、抗壞血酸鹽、苯甲酸鹽、氯代苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、鄰-乙酰氧基苯甲酸鹽、萘-2-苯甲酸鹽、溴化物、異丁酸鹽、苯基丁酸鹽、β-羥基丁酸鹽、丁炔-1，4-二酸鹽、己炔-1，4-二酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、氯化物、肉桂酸鹽、檸檬酸鹽、甲酸鹽、富馬酸鹽、羥基乙酸鹽、庚酸鹽、馬尿酸鹽、乳酸鹽、蘋(píng)果酸鹽、馬來(lái)酸鹽、羥基馬來(lái)酸鹽、丙二酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、煙酸鹽、異煙酸鹽、硝酸鹽、草酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、對(duì)苯二甲酸鹽、磷酸鹽、磷酸一氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、丙炔酸鹽、丙酸鹽、苯基丙酸鹽、水楊酸鹽、癸二酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、焦硫酸鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磺酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)溴苯磺酸鹽、氯代苯磺酸鹽、乙烷磺酸鹽、2-羥基乙烷磺酸鹽、甲磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽、萘-2-磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、二甲苯磺酸鹽、酒石酸鹽等。優(yōu)選的鹽是鹽酸鹽。
藥學(xué)上適用的酸加成鹽一般可通過(guò)式Ⅰ化合物與等摩爾或過(guò)量的酸反應(yīng)制得。反應(yīng)物通常于互溶劑如乙醚或苯中進(jìn)行反應(yīng)。鹽一般在約1小時(shí)～10天內(nèi)從溶液中析出，并且可以經(jīng)過(guò)濾分離，或者按常規(guī)方法除去溶劑。
通常用于生成鹽的堿包括氫氧化銨、堿金屬和堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽，以及脂肪族的伯、仲、叔胺，脂肪族二胺。用于制備加成鹽的堿尤其包括氫氧化銨、碳酸鉀、甲胺、二乙胺、乙二胺和環(huán)已胺。
與化合物(由該化合物衍生得到鹽)相比較，藥學(xué)上適用的鹽一般具有提高溶解度的性質(zhì)，因此它們通常更適用于配制液劑或乳劑。
藥物制劑可以按本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法制備。例如，將化合物與常用的賦形劑、稀釋劑或載體一起配制，并可配制成片劑、膠囊劑、混懸液劑、粉劑等。適用于上述制劑的賦形劑、稀釋劑和載體包括填充劑和增量劑如淀粉、糖、甘露糖醇以及硅衍生物;粘合劑如羧甲基纖維素和其他的纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮;濕潤(rùn)劑如甘油;崩解劑如碳酸鈣和碳酸氫鈉;阻滯溶解劑如石蠟;吸收促進(jìn)劑如季銨化合物;表面活性劑如鯨蠟醇、單硬脂酸甘油酯;吸附載體如高嶺土和膨潤(rùn)土;以及潤(rùn)滑劑如滑石、硬脂酸鈣和硬脂酸鎂以及固體聚乙二醇。
本發(fā)明化合物也可以配制成方便口服的酏劑或溶液劑，或者配制成適于非經(jīng)胃腸道(如經(jīng)肌內(nèi)、皮下或靜脈途徑)給藥的溶液劑。另外，本發(fā)明化合物還非常適用于配制成緩釋劑型等。緩釋制劑可以這樣構(gòu)成，以使它們僅僅或最好在腸道的特定部位并可能在一定時(shí)間內(nèi)釋放活性成分。包衣材料、包袋材料和保護(hù)材料可以由例如聚合物質(zhì)或蠟制得。
為增加血栓調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)、抑制血栓病或血栓形成過(guò)程、或者增加蛋白C的活化速率，需應(yīng)用的本發(fā)明式Ⅰ化合物的具體劑量將取決于由主治醫(yī)師決定的病癥的嚴(yán)重性和性質(zhì)、給藥途徑以及有關(guān)的因素。一般來(lái)講，每天接受的有效劑量為約0.1～1000mg，更一般的是約50～200mg。該劑量每天將對(duì)需要這種治療的患者一次或分大約三次、或根據(jù)需要分更次施用，以便有效地增加血栓調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)、增加蛋白C活化、或者抑制血栓病。
正如施用帶有堿性基團(tuán)(如哌啶子基環(huán))的藥物時(shí)慣用其酸加成鹽一樣，以酸加成鹽的形式施用式Ⅰ化合物通常是優(yōu)選的。通過(guò)口服途徑施用這類(lèi)化合物也是有益的。為此，可利用下述口服劑型的藥物。
制劑在下述制劑中“活性成分”是指式Ⅰ化合物。
制劑1明膠膠囊劑硬明膠膠囊劑按下面方法制備成分量(mg/膠囊)活性成分0.1-1000淀粉,NF0-650可流動(dòng)的淀粉粉末0-650聚硅氧烷流體(350厘沲)0-15
將上述成分混合，通過(guò)美國(guó)45號(hào)篩并將其裝入硬明膠膠囊。
已經(jīng)制備的雷洛昔芬的具體膠囊劑實(shí)施例包括下述制劑制劑2雷洛昔芬膠囊劑成分量(mg/膠囊)雷洛昔芬1淀粉,NF112可流動(dòng)的淀粉粉末225.3聚硅氧烷流體(350厘沲)1.7制劑3:雷洛昔芬膠囊劑成分量(mg/膠囊)雷洛昔芬5淀粉,NF108可流動(dòng)的淀粉粉末225.3聚硅氧烷流體(350厘沲)1.7制劑4:雷洛昔芬膠囊劑成分量(mg/膠囊)
雷洛昔芬10淀粉,NF103可流動(dòng)的淀粉粉末225.3聚硅氧烷流體(350厘沲)1.7制劑5:雷洛昔芬膠囊劑成分量(mg/膠囊)雷洛昔芬50淀粉,NF150可流動(dòng)的淀粉粉末397聚硅氧烷流體(350厘沲)3.0按照合理的改變,還可以將上述具體的制劑進(jìn)行變化。
用下述成分制備片劑:
制劑6:片劑成分量(mg/片)活性成分0.1-1000微晶纖維素0-650煅制的二氧化硅0-650硬脂酸0-15
將上述成分混合并壓制成片劑。
另外,每片含0.1～1000mg活性成分的片劑可以按下法制備:
制劑7:片劑成分量(mg/片)活性成分0.1-1000淀粉45微晶纖維素35聚乙烯吡咯烷酮(為10%的水溶液)4羧甲基纖維素鈉4.5硬脂酸鎂0.5滑石1將活性成分、淀粉和纖維素通過(guò)美國(guó)45號(hào)篩，并充分地混合。使聚乙烯吡咯烷酮溶液與得到的粉末混合，然后再通過(guò)美國(guó)14號(hào)篩。得到的顆粒于50～60℃干燥并通過(guò)美國(guó)18號(hào)篩。將預(yù)先通過(guò)美國(guó)60號(hào)篩的羧甲基纖維素鈉、硬脂酸鎂和滑石加到顆粒中，在混合以后將其在壓片機(jī)上壓制成片劑。
每5ml劑量含0.1-1000mg藥物的各個(gè)混懸液劑可按下法制備制劑8混懸液劑成分量(mg/5ml)活性成分0.1-1000mg羧甲基纖維素鈉50mg糖漿1.25mg苯甲酸溶液0.10ml調(diào)味劑適量著色劑適量純水加至5ml將藥物通過(guò)美國(guó)45號(hào)篩并與羧甲基纖維素鈉和糖漿混合，得到調(diào)勻的糊狀物。用一些水將苯甲酸溶液、調(diào)味劑、著色劑稀釋?zhuān)缓笥跀嚢柘录尤搿Ｔ偌尤胱懔康乃了梵w積。
在進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療需要抑制血栓病的人或動(dòng)物疾病。血栓病或血栓形成過(guò)程或者血栓栓塞病，包括許多種涉及血管內(nèi)凝血的獲得性疾病，包括深靜脈血栓形成、肺栓塞、心肌缺血、心肌梗死、腦血栓形成、全身高凝狀態(tài)、局部高凝狀態(tài)和由于涉及炎癥過(guò)程的全身性組織損傷、微血管動(dòng)脈血栓形成、外周動(dòng)脈血栓形成、源于血臟或外周動(dòng)脈的栓塞、急性心肌梗死、血栓性中風(fēng)、以及彌散性血管內(nèi)凝血。彌散性血管內(nèi)凝血作為多種疾病的并發(fā)癥發(fā)生，所述疾病包括大創(chuàng)傷、大外科手術(shù)、中暑、敗血癥、急性和慢性肝病、包括實(shí)體瘤、白血病和淋巴瘤的惡性疾病，各種細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)和病毒感染，產(chǎn)科并發(fā)癥、溶血過(guò)程，心原性中風(fēng)、任何原因的循環(huán)性虛脫、嚴(yán)重的進(jìn)行性中風(fēng)、蛇咬、膠原血管疾病、暴發(fā)性紫癜、急性胰腺炎、變應(yīng)性脈管炎、紅細(xì)胞增多癥、血小板增多癥、和潰瘍性結(jié)腸炎等。雖然尚未被發(fā)現(xiàn)，但可以在有血栓調(diào)節(jié)蛋白問(wèn)題的患者身上證明血栓調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)中的先天性缺陷。這類(lèi)患者的急性發(fā)作適用于用式Ⅰ化合物治療。
相信式Ⅰ化合物也可用于治療血栓性中風(fēng)。腦血管中血栓調(diào)節(jié)蛋白水平低，因此在血栓性中風(fēng)中血栓調(diào)節(jié)蛋白的上調(diào)將是重要的。現(xiàn)在，中風(fēng)通常用常規(guī)抗凝劑治療。用肝素或口服抗凝劑治療中風(fēng)，雖然偶然有益，但具有梗塞的腦區(qū)域出血的高度危險(xiǎn)，因此加重伴隨中風(fēng)的神經(jīng)性缺損。
而且，由于有證據(jù)表明，血栓調(diào)節(jié)蛋白及提供的衍生物的主要作用機(jī)制，即蛋白C抗凝途徑的激活，構(gòu)成一種高效的獲取對(duì)循環(huán)動(dòng)脈段(arteriodside)抗血栓形成效果以及減少再灌注損傷的方法，因此，相信本發(fā)明化合物可用于治療急性心肌梗死。目前用溶血栓藥劑在急性心肌梗死中進(jìn)行的試驗(yàn)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，作為輔助治療，作為對(duì)循環(huán)動(dòng)脈段的抗血栓形成藥劑，肝素是相對(duì)無(wú)效的。
相信本發(fā)明化合物還可用于治療彌散性血管內(nèi)凝血(“DIC”)。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，炎性介質(zhì)如IL-1、TNF和LPS內(nèi)毒素明顯下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞上血栓調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白C抗凝途徑的不良活化。在廣泛的臨床試驗(yàn)中，已對(duì)彌散性血管內(nèi)凝血患者施用了肝素和口服抗凝劑，但這些試驗(yàn)的結(jié)果令人失望。彌散性血管內(nèi)凝血患者具有涉及微循環(huán)的周身遍布的血栓特性，并常常伴有嚴(yán)重的出血問(wèn)題，這是因?yàn)樵谥苌砦⒀h(huán)纖維蛋白血栓形成過(guò)程中，重要的凝血因子首先被活化然后使其失活，引起凝血因子的“消耗”。
由于各種炎性介質(zhì)下調(diào)血栓調(diào)節(jié)蛋白，因此優(yōu)選使用本發(fā)明化合物糾正與微血管血栓形成有關(guān)的炎癥。廣義地講，所述病癥包括任何以正如發(fā)生于膿毒病中的功能障礙性血管內(nèi)皮為特征的病癥、涉及大面積組織創(chuàng)傷和外傷的損傷、全身性炎性反應(yīng)綜合征、膿毒病綜合征、膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征，包括DIC。
證據(jù)表明，常規(guī)的抗凝藥特別是華法令，可用于治療侵入性惡性腫瘤。許多腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生觸發(fā)凝集系統(tǒng)活化的物質(zhì)，導(dǎo)致局部纖維蛋白沉積。這些纖維蛋白起“蜂窩”作用，在其中癌細(xì)胞能分裂以形成遷移性損害。一臨床研究結(jié)果表明，為治療肺小細(xì)胞癌，除癌癥化學(xué)療法之外接受華法令的患者比僅接受化學(xué)療法的患者存活時(shí)間更長(zhǎng)，并且適移性損害范圍更小。但是，該研究中利用的癌癥化學(xué)療法其強(qiáng)度比現(xiàn)今臨床腫瘤學(xué)中認(rèn)為的最佳方案小。癌癥化學(xué)療法的更強(qiáng)形式幾乎總是導(dǎo)致血小板數(shù)目的激劇下降，以及引起血小板減少癥，同時(shí)華法令治療使得患者處于嚴(yán)重出血并發(fā)癥的難以接受的高危險(xiǎn)狀態(tài)。
預(yù)期本發(fā)明化合物可用于其它疾病，其中血液凝固可能是第二種病因?qū)W之基本作用過(guò)程或來(lái)源，例如癌癥(包括轉(zhuǎn)移)、炎性疾病(包括關(guān)節(jié)炎)和糖尿病。本發(fā)明抗凝化合物可口服給藥、非胃腸道給藥例如通過(guò)靜脈輸注(ⅳ)、肌內(nèi)注射(im)或皮下(sc)給藥。
本發(fā)明的方法也可與凝塊溶解素如組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)、改性的tPA、鏈激酶或尿激酶組合實(shí)施，以降低再灌注損傷。在凝塊已經(jīng)形成并且部分或完全阻塞了動(dòng)脈或靜脈的情況下，通常使用凝塊溶解素。本發(fā)明化合物可在使用凝塊溶解素之前施用或與之一起施用，或者在施用凝塊溶解素之后單獨(dú)施用或與凝塊溶解素一起施用，進(jìn)一步優(yōu)選與阿斯匹林一起施用，以防止凝塊形成的復(fù)發(fā)。
本發(fā)明方法也可與抑制血小板聚集的血小板糖蛋白Ⅱb-Ⅲa受體拮抗劑組合實(shí)施。本發(fā)明化合物可在使用Ⅱb-Ⅲa受體拮抗劑之后施用或與之一起施用，或者在使用阿斯匹林之后施用，以防止凝塊形成的發(fā)生和復(fù)發(fā)。
本發(fā)明方法還可以與阿斯匹林組合實(shí)施。本發(fā)明化合物可在使用阿斯匹林之前施用或與之一起施用，或者在使用阿斯匹林之后施用，以防止凝塊形成的發(fā)生或復(fù)發(fā)。如上文所述，本發(fā)明化合物優(yōu)選地與凝塊溶解素和阿斯匹林組合施用。
試驗(yàn)方法試驗(yàn)1為進(jìn)一步理解式Ⅰ化合物的作用、內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞及其在增強(qiáng)血液抗凝作用中的功用，需要研究這些類(lèi)型細(xì)胞表面血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)活性的變化。式Ⅰ化合物也可逆轉(zhuǎn)/矯正趨于下調(diào)這些細(xì)胞表面TM活性的介質(zhì)的任何作用。
在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種約40000-80000早期通過(guò)的(earlypassaged)內(nèi)皮(動(dòng)脈、靜脈或微血管的)細(xì)胞或者內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞并生長(zhǎng)至融合。然后用Hank緩沖鹽水溶液(HBSS)或無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)洗滌單層細(xì)胞2-3次。在24小時(shí)期間里，向細(xì)胞中加入變化濃度的式Ⅰ化合物(從微摩爾至微微摩爾)，實(shí)驗(yàn)一式三份，殘存于陰性對(duì)照孔內(nèi)的細(xì)胞用與所有其它孔等量的載體保存于無(wú)血清的培養(yǎng)基上。
通過(guò)兩步(two-phase)酰胺分解實(shí)驗(yàn)來(lái)完成本發(fā)明測(cè)量細(xì)胞表面TM活性的方法。在實(shí)驗(yàn)的第一步期間，在用HBSS或SFM沖洗細(xì)胞后，向單層細(xì)胞中加入0.4ml含入蛋白C(最終濃度11.2μg/ml)和人α-凝血酶(最終濃度0.1NIHU/ml)的SFM，并于37℃和5%CO2中培養(yǎng)。在15、30和45分鐘時(shí)間時(shí)，從每孔轉(zhuǎn)移100μl培養(yǎng)基并加至各微滴孔中的50μl過(guò)量水蛭素(20抗凝血酶μ/ml內(nèi)，于37℃維持5分鐘，以進(jìn)一步抑制凝血酶活性。如上文所述，在不存在細(xì)胞時(shí)，SFM加蛋白C和α-凝血酶用作陰性對(duì)照并按同樣的方法處理。
實(shí)驗(yàn)的第二步中，向條件培養(yǎng)基/水蛭素混合物中加入50μl3mM2366(蛋白C的一種色原性底物)，并通過(guò)自動(dòng)平板讀數(shù)器測(cè)量OD405以監(jiān)測(cè)4分鐘內(nèi)TM活性的動(dòng)力學(xué)。一旦完成該動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，用BCA法完成全部蛋白的測(cè)定。最終TM活性以%增加表示?；衔顰是其中R1和R3是氫并且R2是1-吡咯烷基的式Ⅰ化合物。
C化合物A濃度(μm)TM活性(%增加)1×10-4141×10-2151×10-1151.001710.0017試驗(yàn)2用如美國(guó)專(zhuān)利5，009，889(本文收編該文獻(xiàn)作為參考)所述的大腸桿菌誘發(fā)的狒狒膿毒病模型，闡述式Ⅰ化合物作為抗血栓形成藥的作用及其矯正炎癥誘發(fā)的內(nèi)皮功能障礙的能力。
由上述任何實(shí)驗(yàn)呈現(xiàn)的本發(fā)明化合物對(duì)血栓調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)、血栓病、或蛋白C活化速率的正性效果，表明了本發(fā)明化合物的效用。
權(quán)利要求
1.適于增加血栓調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的藥物組合物，該組合物含有式I化合物或其藥學(xué)上適用的鹽或溶劑化物作為活性成分， 其中R1和R3各自獨(dú)立地是氫、-CH3、 (C1-C6烷基)或 ，這里Ar為任意取代的苯基；R2選自吡咯烷子基、六亞甲基亞氨基和哌啶子基。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述化合物為下式化合物或其鹽酸鹽，
3.適于抑制血栓病或血栓形成過(guò)程的藥物組合物，該組合物含有式Ⅰ化合物或其藥學(xué)上的適用的鹽或溶劑化物作為活性成分， 其中R1和R3各自獨(dú)立地是氫、-CH3、 (C1-C6烷基)或 ，這里Ar為任意取代的苯基;R2選自吡咯烷子基、六亞甲基亞氨基和哌啶子基。
4.權(quán)利要求3的藥物組合物，其中所述化合物為下式化合物或其鹽酸鹽，
5.適于增加蛋白C活化的藥物組合物，該組合物含有式Ⅰ化合物或其藥學(xué)上適用的鹽或溶劑化物作為活性成分， 其中R1和R3各自獨(dú)立地是氫、-CH3、 (C1-C6烷基)或 ，這里Ar為任意取代的苯基;R2選自吡咯烷子基、六亞甲基亞氨基和哌啶子基。
6.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述化合物為下式化合物或其鹽酸鹽，
全文摘要
本發(fā)明提供了增加血栓調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)、抑制血栓病或血栓形成過(guò)程、以及增加蛋白C活化速率的方法，該方法包括給需要這種治療的人施用有效量的式I化合物或其藥學(xué)上適用的鹽或溶劑化物，其中RR
文檔編號(hào)A61K31/40GK1108932SQ94119739
公開(kāi)日1995年9月27日 申請(qǐng)日期1994年12月19日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月21日
發(fā)明者D·S·卡爾內(nèi)克, B·W·格林奈爾 申請(qǐng)人:伊萊利利公司