專利名稱：超聲對比介質、含該介質的對比劑及方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于超聲回波描記術的對比介質及包含攜帶該對比介質的微粒(微氣泡、微氣球或微膠囊)混懸液的可注射的超聲對比劑。除了微粒外，對比劑還包含生理學上可接受的水質載體液，后者包括表面活性劑、添加劑和穩(wěn)定劑。本發(fā)明還涉及制備超聲對比介質和對比劑的方法及使用它們的方法。
背景技術：
一種認識，即可注射的氣體微?；鞈乙河米髟\斷目的的有用的超聲對比劑，引發(fā)了相當多的研究和開發(fā)，旨在改善具有較高穩(wěn)定性的充氣的微氣球或微氣泡的分散性，對壓力變化的抗性變得更好，有較好的回波源性，使其易于制造、實地應用和貯存。關于具有這種混懸液的超聲對比劑已提出過很多建議。例如，WO-A-91/15244(Schneider et.al.)WO-A-92/11873(Beller et.al.)或EP-A-0077752(Schering)公開了水混懸液在超聲回波描記術中用作造影劑。
WO-A-91/15244(Schneider et.al.)公開了含薄片狀和/或層狀成膜表面活性劑及任選地含親水性穩(wěn)定劑的微泡混懸液。將成薄片狀的表面活性劑在與水相混合前或后與空氣或氣體接觸，得到混懸液。成膜表面活性劑轉變成層狀是按各種技術進行的，包括高壓勻漿化或在聲頻或超聲頻率下作聲波處理。已報告的這些混懸液中微泡的濃度在108—109個氣泡/毫升之間。所公開的混懸液在貯存過程中顯示較高的穩(wěn)定性。
在WO-A-94/09829(Schneider et.al.)中，用于制備非常穩(wěn)定的水混懸液的薄片狀和/或層狀磷脂的濃度可低至相當于以單分子層磷脂圍繞混懸液中的微泡。穩(wěn)定的低磷脂含量(低至幾μg/ml)的混懸液曾被長時間貯存而無微泡總數(shù)和回波源性的明顯缺失。
EP-A-0554213(Schneider等)公開了賦予用作超聲對比劑的微氣泡或微氣球混懸液抗壓力變化的穩(wěn)定性。在該專利申請中，證明了如果通常用的空氣、氮氣或其他氣體至少部分地被一些氣體所取代時，該氣體的溶解度(升氣體/升水)在標準條件下除以分子量(道爾頓)其值不超過0.003，則微泡抵抗因注射時壓力變化所致的塌陷的穩(wěn)定性有明顯增強。該申請公開中的滿足上述標準的氣體為SeF6，SF6，CF4，C2F6，C4F10等。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，這些氣體產(chǎn)生持續(xù)時間長、在體內(nèi)很穩(wěn)定的微泡，后者因而能提供高質量的回波描記圖象。
WO-A-92/17212和WO-A-92/17213(Klaveness等)公開了含具有非蛋白質類交聯(lián)或聚合的兩親物質(如磷脂)和交聯(lián)蛋白質(如白蛋白)形成的外殼的微氣泡的超聲對比劑。微氣球系將氣體，如空氣、氧氣、氫氣、氮氣、氦氣、氬氣、CH4、SF6或氣體前體如碳酸氫鈉或銨進行微囊包封而成。
WO-A-93/06869(Mallinckrodt Medical Inc)公開了溫血動物超聲成象方法，其中將藥學上可接受的氣體或氣體混合物給予動物，并用超聲探頭對動物進行掃描。氣體或氣體混合物經(jīng)吸入而給予，因為顯然在吸入混合物幾分鐘時，在溫血動物的血流中會形成微氣泡，組織的回波成象會改變。所公開的氣體和氣體混合物包括氧氣、氧化亞氮、C2H6、SF6、氙氣、全氟化碳等。有用的氣體和氣體混合物是在血液中有形成較大氣泡傾向的那些氣體和氣體混合物，可以氙氣和氧化亞氮及其它弱活性的全身麻醉劑如六氟化硫為典型例子。作為例子的混合物含有20％氧、60—80％六氟化硫和/或20％氮、氙、氧化亞氮或乙烯；或20％氧、20％氮和60％氙或氧化亞氮。該方法的基本點是比較兩次不同掃描時得到的超聲信號。第一次在吸入氣體混合物前，第二次在吸入后某個時間。
WO-A-93/05819(Quay)揭示了一個有趣的概念。該文件公開了液體十二氟戊烷或十氟丁烷和山梨醇的水乳劑，它在注射后形成氣體微泡，這種微泡耐壓力變化，能提供好的回波源信號。乳劑中的物質，雖在室溫時呈液體，但揮發(fā)度高，在體溫下容易揮發(fā)，從而在含添加劑和穩(wěn)定劑如山梨醇的液體載體中形成氣體分散體。注射后，高揮發(fā)度物質滴迅速解聚，產(chǎn)生大量很有持久性的微泡。僅含純凈形式的選定物質如十二氟戊烷、排除空氣或任何其它氣體的微泡被存在于乳劑載體液體中的穩(wěn)定劑如山梨醇、吐溫20和豆油所穩(wěn)定。通過概括，Quay發(fā)現(xiàn)，上述技術可用在大量其他非液體(氣體)化學物質上，這些化學物質通過容積密度、溶解度和擴散系數(shù)(系數(shù)Q)之間的關系所規(guī)定的標準而被引入應用中。該文件要求保護凡系數(shù)Q大于5可作為潛在的回波描記劑之用的任何生物相容性氣體，并列出了滿足此標準的約180對氣體/液體。從該文件得出，為獲得所需性質，必須用系數(shù)Q大于5的物質來制成對比劑。規(guī)定的標準為Q＝4.0×10-7×ρ/CsD，其中ρ為氣體密度，D為氣體在溶液中的擴散系數(shù)，Cs為氣體的水溶解度，而且它已通過一簡單模型的使用而得到了發(fā)展，在該模型中，所用的氣體在水中的擴散系數(shù)和溶解度幾乎是最接近真實的值。從按上述標準選出的純的即非混合的物質得到的對比劑顯示了令人鼓舞的結果。在實驗犬上的試驗報導了對比劑經(jīng)外周靜脈注射后在心肌的回波描記上提供有希望的結果(見Beppu S.etal.in Proceedings from 66th Scientific Session of the AmericanHeart Association，Atlanta，October 1993)。已發(fā)現(xiàn)十二氟戊烷的2.2％乳劑的注射能在長達85分鐘內(nèi)產(chǎn)生中等的乳濁化作用，視劑量而異。但是，在能使左心的乳濁化成為均勻的劑量下，觀察到了動脈血氧飽和度降低及肺動脈收縮壓升高。
現(xiàn)有技術組合物中很多有其長處，很多正在作深入的臨床試驗。很多處于開發(fā)的各種階段。然而，從很多報告看來，至今只有很少數(shù)對比劑有開發(fā)成為基本上由超聲回波描記術提供的全方位診斷可能性。事實上，只有少量對比劑是真正有用的，它們幫助醫(yī)學同行得益于該診斷技術，后者代表著分析人體內(nèi)器官的最好的非侵襲性方法之一。并非很多對比劑都能允許超聲概念的全部潛能的開發(fā)，這阻礙了該技術和/或造影劑的較廣泛的使用。用已知的回波描記劑的實驗法證明，其中某些不能提供足夠的反散射以確保好的強度和對比度，或只以一定的百分比提供有用的圖象，這限制了它們作為一般用途診斷工具的應用，另一些由于對壓力變化耐力差而壽命短，不能提供有意義的測量或有用的圖象。有代表性的是，其微氣泡或微氣球被高水溶性的氣體所充填的對比劑抗壓力變化性差。外殼由堅固物質組成的微氣球的混懸液也是無效的，因為它們在對聲波的響應上共振不足。對壓力變化抗力高的值得注意的對比劑是使用在水載體中溶解度低的氣體的對比劑。溶解度低的直接后果是消溶率低，從體內(nèi)消除慢。這種難溶氣體制的造影劑在血循環(huán)中長時間保留，引起氣體微泡回復或再循環(huán)，對試驗初始階段產(chǎn)生的圖象引起干擾。這樣的對比劑一般對于左心造影有用，但因消溶和消除緩慢，它們不能有效地用于灌注測量。灌注測量通常是由回波描記響應曲線積分而進行的，這是在造影劑“單次通過”后出現(xiàn)的典型的高斯函數(shù)。因此“單次通過”后的回復或再循環(huán)是不合需要的，因為重復會使最終結果迭加和受損。因此，一般承認，賦予高的壓力抗性的微氣泡或微氣球的經(jīng)歷一定時間的存留是擾亂大于幫助。具有很長存留時間的微泡的回波描記對比劑僅僅對某此研究，如血管多普勒(Doppler)研究，是有用的。用于左心和心肌造影的對比劑應當提供清晰的圖象，且應對壓力變化有高的抗性，但不應持續(xù)過長時間，并且不干擾注射后即刻建立的圖象。對于擬用于復蓋各種應用范圍并有清晰圖象的對比劑而言，再循環(huán)不是這類對比劑合乎需要的特征。顯然，非常合乎需要的是在注射后調節(jié)對比劑的壓力抗性或存留時間，即，使用設計成對壓力有足夠抗性但在循環(huán)中有效時間受到控制的氣泡(或微氣球)的混懸液。這一要求在下面的本發(fā)明中得到了滿足。
發(fā)明概述簡言之，本發(fā)明涉及微氣泡或微氣球形式的可注射的超聲對比劑，包含至少兩種形成混合物的生物相容性的、在體溫下為氣體的物質A和B，當其與通常的表面活性劑、添加劑和穩(wěn)定劑形成混懸液時，成為有用的超聲對比劑?；旌衔镏械闹辽僖环N組分(B)是氣體，其分子量＞80道爾頓，標準狀態(tài)下的在水中的溶解度低于0.0283ml氣體/ml水。在整個本申請文件中，氣體溶解度指相應于本生系數(shù)，分子量大于80道爾頓被認為相對較高，而分子量小于80道爾頓被認為相對較低。因此，本發(fā)明的混合物可定義為這樣的混合物，即其中混合物的大部分由“相對較低”分子量的一種或幾種氣體組成，而混合物的小部分由“相對較高”分子量的氣體或氣體混合物組成。對比介質中的這“小部分”或活性組分(B)的量實際上總是在0.5—41體積％之間。超聲對比介質的另一組分(A)可以是氣體或氣體混合物，它在水中的溶解度大于氮(在標準狀態(tài)下為0.0144ml/ml水)，它在混合物中的量實際上總是在59—99.5體積％之間。這“大部分”或占優(yōu)勢的組分最好是分子量相對較低(通常在80道爾頓以下)的一種或幾種氣體，且選自諸如氧氣、空氣、氮氣、二氧化碳或其混合物之類的氣體。
在本發(fā)明的超聲對比介質中，分子量＞80道爾頓的氣體可以是氣體混合物或在體溫下為氣體、在室溫下為液態(tài)的物質的混合物。只要每一種這樣的物質的分子量大于80道爾頓，在標準狀態(tài)下，每種物質的水中溶解度低于0.0283ml氣體/ml水，這樣的氣體或液體物質就可能在本發(fā)明的對比介質中是有用的。
當充填了本發(fā)明的對比介質并分散在含有用的表面活性劑、添加劑和穩(wěn)定劑的水性載體中時，所形成的微氣泡提供了對壓力變化的抗性受到控制，注射后存留時間得到調整的，用于超聲成象的可注射的對比劑。除含微氣泡外，本發(fā)明的對比劑還可含有表面活性劑，它們穩(wěn)定短暫的氣/液外殼，還可任選地含有親水性試劑和其它添加劑。添加劑可包括聚氧丙烯和聚氧乙烯(聚氧單體)的嵌段共聚物、聚氧乙烯-脫水山梨醇、山梨醇、甘油-聚硬脂酸亞烷基酯、甘油-聚蓖麻醇酸亞乙酯、聚二醇、豆油及氫化衍生物的均聚和共聚物、蔗糖或其他碳水化合物與脂肪酸、脂肪醇的醚和酯、豆油、葡聚糖、蔗糖和碳水化合物的甘油酯。表面活性劑可以是成膜的和不成膜的，可包括亞油酰卵磷脂或聚十二酸亞乙酯。表面活性劑最好包括一種或幾種選自磷脂酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、心磷脂、鞘磷脂及其混合物的層狀或片狀成膜表面活性劑。
本發(fā)明還包括制備超聲對比劑的方法，即在含有用的表面活性劑和穩(wěn)定劑的生理學上可接受的載體中混懸含氣體混合物的充氣微氣泡或微氣球，氣體混合物中至少有一種氣體其在混合物中的最小有效量可按下式確定Bc％＝K/ebMwt＋C其中Bc％(體積)是混合物中組分B的總量，K、C和b是數(shù)值分別為140、-10.8和0.012的常數(shù)，Mwt表示超過80的組分B的分子量。按本發(fā)明方法制得的對比劑包含對壓力變化抗性極好、消溶率受到控制的微氣泡或微氣球的混懸液。
本發(fā)明還包括一種試劑盒，它包含通常貯存在氣體和/或液體的混合物下的，可在體溫下被轉變?yōu)闅怏w的干制劑。當分散在生理學上可接受的載體液中時，含有氣體和/或液體混合物的干制劑就產(chǎn)生本發(fā)明的超聲對比劑。本發(fā)明還揭示了在超聲對比劑存在下凍干的干制劑的貯存方法。
本發(fā)明進一步包括具有含超聲對比介質的微氣泡的對比劑的制備方法，以及它們在人或動物體內(nèi)器官的造影方面的用途。
附圖的簡要說明

圖1是按本發(fā)明的超聲對比介質的示意圖。
圖2是對比介質的臨界壓力(Pc)作為所選氣體在混合物中的量的函數(shù)所作的圖。
圖3表示以八氟環(huán)丁烷(C4F8)(圖3B)和十二氟戊烷(C5F12)(圖3A)制成的對比介質的臨界壓力(Pc)作為混合物中氣體量的函數(shù)所作的圖。
圖4是混合物中氣體最小量作為分子量的函數(shù)所作的圖。
圖5(小豬靜脈注射后左心乳濁化)是靜脈注射含各種濃度SF6的對比介質后小豬左心中得到的體內(nèi)回波描記響應作為時間的函數(shù)所作的圖。
圖6(家兔主動脈內(nèi)注射后心肌乳濁化)表示用含各種濃度C4F8的對比介質得到的體內(nèi)回波描記響應作為時間的函數(shù)所作的圖。
發(fā)明的詳述本發(fā)明建立在如下意想不到的發(fā)現(xiàn)的基礎上包含充有至少兩種生物相容性氣體或在體溫下為氣體的物質A(大部分或相對較低的分子量)和B(活性化的或相對較高的分子量)的混合物的氣泡的超聲對比介質，在含通常的表面活性劑、添加劑和穩(wěn)定劑的混懸液中時，提供了可注射的超聲對比劑；它既有合乎要求的對壓力的抗性，在循環(huán)中存在時間又較短，這兩個參數(shù)均可隨意控制。只要在混合物中的(活性)物質或組分中至少一種，其分子量大于80道爾頓(相對較高的分子量)，以某一最小比例存在，只要它在標準狀態(tài)下在水中的溶解度低于0.0283ml氣體/ml水，超聲對比介質就能提供與單用純物質時所得到的同樣好的回波描記性質。所謂“活性化”，是指將其物理性質賦予混合物中其他組分的物質或組分，使混合物在回波源性和對壓力變化的抗性上與單一該物質或組分(純的形式)表現(xiàn)相同或幾乎相同。在大多數(shù)情況下，對比介質中活性化或高分子量的第一種組分的量從低至0.5體積％(對于高分子量和低水溶性的物質而言)到41體積％。實驗證明，分子量低于80道爾頓(低分子量)的物質不適于作為活性化組分，而分子量的上限難以確定，因為只要它們的分子量相對較高，即＞80，所有受試化合物均有效。因而發(fā)現(xiàn)，分子量約240道爾頓的化合物如十氟丁烷或分子量290道爾頓的化合物如全氟戊烷是有效的活性化組分。還有跡象表明，分子量略高于500道爾頓的物質，如1，2，3-十九烷三羧酸、2-羥基-三甲酯也可用作活性化的高分子量組分。另一相應地以59—99.5體積％的量存在的“大部分”的組分，可以是其水中溶解度大于氮(在標準狀態(tài)下為0.0144ml/ml水)的一種或幾種氣體。第二種組分以氧氣、空氣、氮氣、二氧化碳或其混合物為佳，而以氧氣或空氣為更佳。但是，對于組分A，其他較不常用的氣體如氬、氙、氪、CHClF2或氧化亞氮也可使用。這些較不常用的氣體中有些分子量高于O2、N2、空氣、CO2等，例如＞80道爾頓，但即使這樣的話，它們在水中的溶解度仍將超過B類氣體，即＞0.0283ml/ml水。
相當令人意想不到的是，發(fā)現(xiàn)由少至0.5體積％的諸如十二氟戊烷或0.8體積％的十氟丁烷之類的物質與空氣混合形成的混合物在水質載體中會生成微氣泡，它在體內(nèi)產(chǎn)生極好的回波描記圖象，且對壓力變化有抗性。這是特別令人驚奇的，因為迄今認為，為了得到好的左心和心肌回波描記圖象，這些物質及就此而言的其他很多物質，必須使用100％濃度，即純的形式(無空氣)。用含不同量的這些低水溶性物質和空氣的混合物進行的實驗證明，其回波描記圖象和只用純物質制的回波描記劑在同樣條件下得到的回波描記圖象一樣好。
早期的研究證明，在循環(huán)中空氣微泡發(fā)生迅速消除，因為這個另外方面在生理學上較佳的氣體由于稀釋而快速消溶，還證明了微氣泡的消散可通過各種表面活性劑、添加劑和穩(wěn)定劑的使用而減少。在開發(fā)的早期，作為消散問題的對策，曾提出過有形物質作壁的微氣球或微氣泡。有人曾提出用天然或合成聚合物如脂質雙層(脂質體)或變性蛋白質如白蛋白作壁的充以空氣或CO2而制成的微氣泡。較老的對比劑對壓力變化的抗性差及由此而產(chǎn)生的回波源性喪失促使尋找對存在于血流中的壓力變化有較大抗性的氣體粒子。因而提出了如六氟化硫或新近提出的十二氟戊烷之類的氣體。用這些氣體所作的實驗表明，注射后，單獨用這些氣體制得的微泡懸液在血循環(huán)中確實對塌陷有很大抗性。作為這些初始發(fā)現(xiàn)的結果，鑒定出了近200種不同的氣體對于制備超聲對比劑是潛在有用的，從而令人意想不到地發(fā)現(xiàn)，將氧氣或空氣與這些對壓力有抗性的氣體中某些氣體混合，人們可得到比純六氟化硫或十二氟戊烷具有生理學上更好的耐受性和/或較短的消溶半衰期的超聲劑，而仍保留這些氣體單獨使用時好的壓力抗性。假定本發(fā)明的超聲介質如此驚人的性能是出自如下事實即在含氣體混合物的微泡中，由于存在一種或幾種氣體大分子，其水溶性與空氣或氧氣大致相同或低一些，因而空氣向周圍液體中的擴散減慢。盡管這種驚人的行為的理由尚未被解釋，但可以假定，高分子量氣體的分子，即使很少量，實際上確實“堵住微泡邊界上的孔”，從而阻止低分子量氣體通過跨膜擴散而逃逸。此模式的圖示見圖1，其中，含與分子量＞80道爾頓的氣體(2)混合的空氣(1)的微泡懸浮在水介質(3)中。用表面活性劑(如磷脂)穩(wěn)定的短暫的外層(4)使氣體混合物保留在給微泡定界的包容容積內(nèi)。均勻分散在整個微泡容積中的活性或小量氣體B會較慢的擴散，最終阻塞在水溶液中自發(fā)形成的表面活性劑樣的外殼的孔，從而阻止較小的及典型地較易溶解的多量組分A的迅速離散。另一方面，活性或小量組分氣體(B)比氧或空氣顯示對用于穩(wěn)定短暫外殼的表面活性劑的磷脂部分更大的親和力。因此按照另一假說，這些氣體有在膜附近濃縮的趨勢，從而阻止或減緩較小氣體跨膜擴散。即使如此，收集到的實驗資料提示，為制備本發(fā)明的回波描記介質，混合物中活性氣體的需要量相當于阻塞給定的膜材料的孔的量或相當于在微泡內(nèi)壁形成單分子層所需的量。因此，需要的最小量是阻塞孔或復蓋膜內(nèi)表面以阻止低分子量組分逃逸和消溶所需要的量。
還認為，本發(fā)明的超聲對比介質的優(yōu)良性能來自氮氣、二氧化碳、氧氣或空氣(主要為一種氧氣/氮氣混合物)與其它氣體的聯(lián)合使用。從功能上來說，這些生物學上和生理學上相容的氣體提供所述介質以重要的特性，從而確保其優(yōu)越的性質。盡管本發(fā)明的超聲對比介質可用很多起大量或組分A作用的其它氣體制成，但以氧氣和空氣為佳。在本文件的上下文中，將空氣作為一種“一組分”氣體。
按照本發(fā)明，使用分子量＞80道爾頓的一種或幾種氣體，與水中溶解度＞0.0144ml/ml水、分子量通常＜80道爾頓的一種或幾種氣體混合，可得到對壓力變化抗性高，又相對快速消溶即在體內(nèi)清除的超聲對比介質。諸如氧氣或空氣之類的氣體與在體溫下為氣體而在室溫下可為液態(tài)的物質混合，可提供具有混合物中各氣體的所有優(yōu)點的回波描記介質。換言之，這些混合物以微泡懸浮液形式注射時，會提供有鮮明對比的清晰和干凈利落的圖象(對于對壓力變化抗性好的微泡來說尤為典型)，同時基本上象只充填空氣或氧氣那樣容易地被消溶。從而，通過將空氣、氮氣、二氧化碳或氧氣與一定控制量的在體溫下為氣體的任何已知生物相容性高分子量物質合用，可得具有重大的、完全意想不到的優(yōu)點的超聲對比介質。如上所述，這些介質提供了每一組分的優(yōu)點，即從一個組分得到對壓力變化的好的抗性，從另一個組分得到相對快速的消溶，與此同時，消除了介質中每一組分單用時的各自缺點。這是特別令人驚奇的，因為人們原本意料到的是分開使用的組分的性質平均起來的性質。
只要這些生物相容性物質(B)的分子量＞80道爾頓，在標準狀態(tài)下它們在水中的溶解度＜0.0283ml氣體/ml水，則這些氣態(tài)或液態(tài)物質對于本發(fā)明的對比介質都是有用的。雖然和合適的表面活性劑和穩(wěn)定劑合用，在B類中可使用如下的氣體，如六氟化硫、四氟甲烷、氯代三氟甲烷、二氯二氟甲烷、溴代三氟甲烷、溴代氯代二氟甲烷、二溴二氟甲烷、二氯四氟乙烷、氯代五氟乙烷、六氟乙烷、六氟丙烯、八氟丙烷、六氟丁二烯、八氟-2-丁烯、八氟環(huán)丁烷、十氟丁烷、全氟環(huán)戊烷、十二氟戊烷、較佳的為六氟化硫和/或八氟環(huán)丁烷。本發(fā)明的介質宜含選自如下氣體的氣體B六氟化硫、四氟甲烷、六氟乙烷、六氟丙烯、八氟丙烷、六氟丁二烯、八氟-2-丁烯、八氟環(huán)丁烷、十氟丁烷、全氟環(huán)戊烷、十二氟戊烷，較好的是含六氟化硫和/或八氟環(huán)丁烷。
本發(fā)明的另一個意想不到的驚人的特征是這樣一個事實當WO93/05819的標準應用于本發(fā)明的介質時，用本氣體混合物所得的Q系數(shù)低于5。這是令人震驚的，因為按照WO93/05819，Q系數(shù)低于5的介質是被排除在適于制備有用的超聲對比介質的氣體之外的。然而，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的均勻氣體混合物雖然Q系數(shù)遠遠低于5，仍為超聲成象提供了有用的對比劑。
當充填了本發(fā)明的對比介質并分散在含通常的表面活性劑、添加劑和穩(wěn)定劑的水質載體中而形成的微泡為超聲成象提供了有用的對比劑。除了微泡外，本發(fā)明的對比劑還將含有表面活性劑、添加劑和穩(wěn)定劑。可包含一種或幾種層狀或片狀形式的成膜表面活性劑的表面活性劑被用于穩(wěn)定微泡的短暫氣/液外殼。還可使用水合劑和/或親水性穩(wěn)定劑化合物如聚乙二醇，碳水化合物如乳糖或蔗糖、葡聚糖、淀粉及其它多糖類，或其它常規(guī)添加劑，如聚氧丙二醇和聚氧乙二醇；脂肪醇和聚氧亞烷基二醇的醚；脂肪酸和聚氧烷基化脫水山梨醇的酯；皂類；甘油-聚亞烷基硬脂酸酯；甘油-聚氧乙烯蓖麻酸酯；聚亞烷基二醇的均聚和共聚物；聚乙氧基化豆油和蓖麻油及氫化衍生物；蔗糖或其他碳水化合物與脂肪酸、脂肪醇的醚和酯，它們是任意地聚氧烷基化的；飽和或不飽和脂肪酸的甘油一酯、二酯和三酯；豆油和蔗糖的甘油酯類。表面活性劑可以是成膜和不成膜的，可包括亞油?；蚜字惪删酆系膬捎H化合物或聚十二烷酸亞乙基酯。表面活性劑以成膜的為宜，選自磷脂酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、心磷脂、鞘磷脂及其混合物的磷脂類則更好。
應該理解，本發(fā)明并不限于只用微泡作本發(fā)明超聲對比介質的載體的對比劑。任何合適的充有超聲對比介質的粒子，如具有合成或天然聚合物或蛋白質制的外殼的脂質體或微氣球，均可方便地被使用。因此，現(xiàn)已被確定，填充了本發(fā)明的超聲對比介質的用白蛋白、或脂質體囊或膽影酸乙酯多孔粒子制成的微氣球提供了好的回波描記對比劑。與單用純物質制成的原制劑的混懸液相比，其中微泡用山梨醇或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物(市售品稱作Pluronic)之類非離子型表面活性劑穩(wěn)定的混懸液表明有同樣好的造影能力，因此相信，本發(fā)明提供了更有概括性的超聲介質概念，提供了對超聲成象問題的更深入的洞悉以及對比劑性能的更好的控制。因此，本發(fā)明的介質和含介質的對比劑被認為是使該技術在其發(fā)展中更進一步的產(chǎn)品。
本發(fā)明還包括制備超聲對比劑的方法，該超聲對比劑中至少含兩種組分的氣體混合物混懸在含通常的表面活性劑和穩(wěn)定劑的生理學上可接受的水質載體液中以便形成充氣微氣泡或微氣球，方法的特征在于，按如下標準確定在所述氣體混合物中至少一種氣體組分(B)的最小有效比例Bc％＝K/ebMwt＋C其中Bc％(體積)為混合物中組分B的總量，K和C分別為數(shù)值為140和-10.8的常數(shù)，Mwt表示超過80的組分B的分子量，b的量是操作溫度和穩(wěn)定微氣泡的膜(脂質膜)的厚度的復合函數(shù)；然而，因為體溫是基本恒定的，穩(wěn)定劑膜結構基本上不依賴脂質濃度，因此b值保持在0.011—0.012的間距中，可認為是常數(shù)。按本方法制得的對比劑包含對壓力變化具有極好抗性和相對快速消溶的微氣泡或微氣球的混懸液。這兩種性質被控制到實際上現(xiàn)在可能按顧客要求定制回波描記劑的程度。用上面的標準，從在體溫下為氣體，其分子量和水中溶解度如上所述的任何可購得的無毒(“架子上的”)物質出發(fā)，可制得具有合乎需要的特性的對比劑。
本發(fā)明還包括含表面活性劑、添加劑和穩(wěn)定劑的干制劑，它貯存在這樣一些物質的混合物下即它們在體溫下是氣體，其中至少一種是分子量大于80道爾頓、在標準狀態(tài)下其在水中的溶解度低于0.0283ml/ml水的氣體。在注射前，將含凍干的成膜表面活性劑和任選地含聚乙二醇或其它常規(guī)親水物質之類水合劑的制劑與生理學上可接受的載體液混合，以制得本發(fā)明的超聲對比劑。成膜表面活性劑較佳地為選自磷脂酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、心磷脂、鞘磷脂及其混合物的磷脂。
在一種變體中，通過非離子型表面活性劑如聚氧乙烯和聚氧丙烯的共聚物和成膜表面活性劑如二棕櫚酰磷脂酰甘油合用可保證微氣泡短暫的氣/液外殼的穩(wěn)定性。如前所述，水質液體載體可進一步包含親水性添加劑，如甘油、PEG、山梨醇等。此外，可用含吐溫20、山梨醇、豆油和任選地含其他添加劑的鹽水溶液制備本發(fā)明的有用的對比劑。
本發(fā)明還公開了一種兩組分試劑盒，包括貯存于氣體混合物下的表面活性劑、添加劑和穩(wěn)定劑的干制劑作為第一組分，生理學上可接受的載體液為第二組分，當其與第一組分接觸時便產(chǎn)生超聲對比介質。試劑盒可包括兩個分開的小瓶的體系，每個小瓶含一種組分，兩瓶靠近放，以便可在使用對比劑前方便地將兩組分合并。顯然，含干制劑的小瓶將可同時含本發(fā)明的超聲介質。方便的做法是，試劑盒可以是預先充滿的兩個分隔空間的注射器形式，也可進一步包括裝在其兩端之一上的一根針作為連通時用的工具。
本發(fā)明還包括具有含超聲對比介質的微泡的對比劑的制備方法，以及它們在人或動物體中器官造影上的應用。
當用于人或動物體中器官的造影時，以在上述生理學上可接受的載體液中的水混懸液形式對患者投與本發(fā)明的超聲對比介質，用超聲探頭對患者進行掃描，由此得到被造影的器官或身體部分的圖象。
下面的實施例進一步闡明本發(fā)明。
實施例1將120mg二花生酰磷脂酰膽堿(DAPC，購自Avanti PolarLipids)和5mg二棕櫚酰磷脂酸(DPPA酸型，購自Avanti PolarLipids)溶于25ml己烷/乙醇(8/2，v/v)，然后用旋轉式蒸發(fā)器在圓底燒瓶中將溶劑蒸發(fā)至干，制成多層囊泡(MLVs)。在真空干燥器中使殘留的脂質膜干燥，加入水(5ml)后，在攪拌下將混合物90℃保溫30分鐘。將所得溶液于85℃擠壓通過0.8μm聚碳酸酯濾器(Nucle-pore)。將制得物加到45ml葡聚糖10,000 MW(Fluka)水溶液(167mg/ml溶液)中。充分混合該溶液，轉入500ml圓底燒瓶，冷凍于-45℃并在13.33Nt/m2(0.1乇)下凍干。過夜，達到冰的完全升華。將所得凍干物每份100mg裝入20ml玻璃小瓶。用橡皮塞蓋緊小瓶，真空抽吸除去小瓶中的空氣。經(jīng)針頭通過塞子將含各種量的六氟化硫的空氣混合物注入小瓶。
通過在每個小瓶中注入10ml 3％甘油水溶液，接著劇烈混合，得到氣泡混懸液。用血球計數(shù)計對所得微氣泡混懸液計數(shù)。平均氣泡大小為2.0μm。在臨界壓力(Pc)的體外測量(如EP-A-0554213所設定的)中，完成對各種樣品的回波源性(即反散射系數(shù))測量和氣泡計數(shù)。
如可從結果中看到的那樣，含100％空氣(樣品A)的微氣泡對壓力的抗性低。但是，僅含5％SF6時，對壓力的抗性有相當程度的增加，含25％SF6時，對壓力的抗性幾乎與100％SF6的相同。另一方面，氣泡濃度、平均氣泡大小和反散射系數(shù)幾乎與SF6的百分率無關。
表1

以0.5ml/10kg的劑量將所得混懸液靜脈注射到小豬體內(nèi)，在視頻信號記錄器上記錄左心室腔的圖象。用Acuson×P128超聲系統(tǒng)(Acuson Corp.USA)和7MHz扇形傳感器進行體內(nèi)回波描記測量。采用視頻顯象測密術，用圖象分析儀(Dextra Inc.)測量對比劑的密度。圖5表示在小豬左心的視頻顯象測密記錄。在100％空氣的實例(樣品A)和95％空氣的實例(樣品B)之間又觀察到相當大的差異。特別是，有5％SF6時，早已幾乎達到最大密度，在循環(huán)中的半衰期也顯示非?？斓脑黾?。有10％SF6時，密度不再增加而僅有半衰期的延長。從本實施例可以推斷，在氣體混合物中用大于10％—25％的SF6，并不能提供實際的好處。可以很有趣地注意到，從所用混合物得到的Q系數(shù)都遠遠低于WO-A-93/05819規(guī)定的臨界值。
實施例2將按實施例1(用PEG4000代替葡聚糖10,000)所得的PEG/DAPC/DPPA凍干物的等分樣品(25mg)加到10ml玻璃小瓶中。將兩只Tedlar樣品袋分別充以空氣和八氟環(huán)丁烷(C4F8)。用各注射器從袋中抽出一定體積并經(jīng)三通活栓系統(tǒng)混合其中內(nèi)容物。然后將選定的氣體混合物引入(預先抽空過的)玻璃小瓶。然后將凍干物混懸在2.5ml鹽水(0.9％NaCl)中。下面給出的結果顯示混懸液對壓力的抗性、氣泡濃度和反散射系數(shù)。在100％C4F8的情況下，對壓力的抗性達到225mmHg(與空氣的情況下的43mmHg相比)。再次說明，僅5％C4F8就已可觀察到壓力抗性的相當大的增加了(Pc＝117-mmHg)。
給家兔主動脈內(nèi)注射對比劑(0.03ml/kg)后，含有2％C4F8時就已可注意到對比劑效應在心肌中的略微延長了(與空氣相比較)。然而含有5％C4F8時，對比劑的持續(xù)時間增加很多，好象在對壓力抗性的閾值之上，氣泡的存留時間極大地增加(見圖6)。
表2


此處又證明，混合物中氣體B占5％的這種氣體混合物能產(chǎn)生很好的圖象，而用含≤25％八氟環(huán)丁烷的氣體混合物則可得到極好的左心圖象。
臨界壓力作為C4F8在與空氣所組成的混合物中的百分率的函數(shù)所作的相關圖示于圖2中。本實施例再次表明，使用氣體混合物時僅僅通過加入小百分率的高分子量/低溶解度的氣體就可相當大程度地改善空氣泡對壓力的抗性。附圖還表明，通過氣體混合物的適當選擇，任何合乎需要的對壓力的抗性都將是可能的。
實施例3使用如實施例5所述同樣的凍干物。氣相由十二氟戊烷(C5F12和空氣組成。C5F12在室溫下是液體，沸點29.5℃。將每瓶含有按實施例5所述而獲得的50mg PEG/DSPC/DPPG凍干物的24ml玻璃小瓶置于真空下，在真空下密封，然后45℃加熱。通過塞子將小體積(幾微升)C5F12注入仍置于45℃下的小瓶中。然后在小瓶中引入空氣以恢復大氣壓。于室溫下冷卻后，通過塞子注入鹽水(5ml)，并劇烈振搖小瓶。計算在氣相中的C5F12的實際百分率，假定引入的液體完全揮發(fā)。這是一個過高估計，因為在此溫度下，部分液體不呈氣態(tài)。如圖3所示，在空氣中僅含0.5％C5F12時已可檢出對壓力的抗性的增加。在含1.4％C5F12時，對壓力的抗性超過130mmHg。還將這些混懸液靜脈注入小豬體內(nèi)(0.5ml/15kg)。如實施例1所述，用視頻測密術測量密度。如表3所示，含1.4％C5F12時已達到最大密度，較高百分率的C5F12導致半衰期延長，AUC增加。半衰期 定為注射和密度降至其最大值的50％之間過去的時間。曲線下面積(AUC)測至 表3 *估計實施例1—3還證明，與WO-A-93/05819中所述相反，從Q值較小、有時遠小于5的氣體混合物可得到優(yōu)異的對比增強劑。
實施例4將購自Avanti Polar Lipids(USA)的58mg二花生酰磷脂酰膽堿(DAPC)、2.4mg二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)和購自Siegfried的3.94g聚乙二醇(PEG4000)于60℃下溶于圓底玻璃器皿中的叔丁醇(20ml)中。將澄清的溶液快速冷卻于-45℃并凍干。將所得白色餅狀物的各等分樣品(25mg)裝入10ml玻璃小瓶。
用氣體充填Tedlar氣體取樣袋，一個袋中充以空氣，一個袋中充以六氟化硫(SF6)。用分開的兩個注射器通過隔膜從每個袋中取預定體積的氣體，經(jīng)三通活栓混合兩內(nèi)容物。將得到的氣體混合物注入已抽空并用橡皮塞塞住仍處于真空下的10ml玻璃小瓶中。7個小瓶含不同比例的空氣和SF6的氣體混合物。SF6濃度在0—100％之間。SF6在氣相中的實際百分率用光密度分析法(A.Paar光密度計)確定。然后通過塞子將鹽水(0.9％NaCl)注入每個小瓶(5ml/瓶)，激烈振搖使粉末溶解。體外或體內(nèi)評估形成的微泡混懸液。用濁度測定法測定對壓力的抗性Pc，用脈沖回波裝置測定反散射系數(shù)(均在EP-A-0554213中有描述)。用Coulter Multisizer II(CoulterElectronics Ltd.)分析以確定氣泡濃度和平均氣泡大小。所得結果實際上和實施例1所得者相同。
表4<


*本生系數(shù)實施例5如實施例4所述，用30mg二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)和30mg二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)(均購自瑞士SYGENA公司)，制得PEG/DSPC/DPPG凍干物。將所得餅狀物的各個等分樣品(25mg)裝入10ml玻璃小瓶。從充填各種氣體的Tedlar袋中取出適當體積，在各小瓶中充入不同的氣體混合物。表4列出所研究的氣體，其分子量、溶解度(表示為本生系數(shù))及所得微氣泡的對壓力的抗性。特別有趣的是可以注意到，單獨使用高度溶解的氣體如CO2、氙、CHClF2時，形成穩(wěn)定和有抗性的氣泡的能力很差，而如果加入少量SF6或C4F8等氣體時則產(chǎn)生高度穩(wěn)定的氣泡。
實施例7如WO-A-93/05819所述，用空氣和八氟環(huán)丁烷C4F8混合物得到微泡混懸液。制備含山梨醇(20g)、NaCl(0.9g)、豆油(6ml)、吐溫20(0.5ml)的水溶液并用蒸餾水調節(jié)至100ml。取10ml此溶液于一支10ml注射器中，另一支10ml注射器充以空氣和C4F8的混合物。兩支注射器經(jīng)三通活栓而連接。通過交替操作兩個活塞之一共20次，得到乳狀混懸液。試驗這些混懸液對壓力的抗性。還將各個等分樣品靜脈注射到麻醉家兔體內(nèi)(0.1ml/kg)，記錄左心室的回波圖象。有趣地發(fā)現(xiàn)，用1％或甚至5％C4F8時，在左心室未檢出對比劑。但用1％甚至高于5％C5F12時，得到了左心室的乳濁化作用。
表6

“-”無乳濁化“+”中度乳濁化“++”良好乳濁化實施例8如實施例4所述，用30mg二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)和30mg二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)(均購自瑞士SYGENA公司)制得PEG/DSPC/DPPG凍干物。將所得餅狀物的各個等分樣品(25mg)加入10ml玻璃小瓶中。從充以各種氣體的Tedlar袋中取出適當體積，在各小瓶中充入不同的氣體混合物。表7列出所研究的氣體混合物及所得微泡對壓力的抗性。值得注意的是，高分子量氣體甚至可以是具有高分子量和溶解度(表示為本生系數(shù))低于0.0283的兩種或兩種以上氣體的混合物。
表7

由此可見，也可用兩種或兩種以上活性或小量組分氣體的混合物代替單一的氣體(B)。雖然，在此實施例中，臨界壓力與兩組分中較重者的百分率成正比，但可以認為，另外的氣體組合可能會通過協(xié)同作用而進一步降解混合物中不溶性氣體的總量。
權利要求
1.可注射的超聲對比介質，包含在體溫下為氣體的生物相容性物質，它們在含通常的表面活性劑、添加劑和穩(wěn)定劑的水質載體液中的混懸液中時為超聲回波描記術提供了對比劑，所述超聲對比介質的特征在于介質是氣體(A)和(B)的混合物，其中，氣體中的至少一種(B)以0.5—41％(體積)的量存在，其分子量大于80道爾頓，在標準狀態(tài)下測得的水中溶解度低于0.0283ml氣體/ml水，混合物的剩余部分為氣體A。
2.按權利要求1所述的超聲對比介質，其中氣體(B)為含氟的生物相容性氣體。
3.按權利要求2所述的超聲對比介質，其中含氟氣體選自SF6、CF4、C2F6、、C3F6、C3F8、C4F6、C4F8、C4F10、C5F10、C5F15及其混合物。
4.按權利要求3所述的超聲對比介質，其中含氟氣體為六氟化硫或八氟環(huán)丁烷。
5.按權利要求1所述的超聲對比介質，其中氣體A選自空氣、氧氣、氮氣、二氧化碳及其混合物。
6.一種可注射的超聲對比劑，包括在含通常的表面活性劑、添加劑和穩(wěn)定劑的生理學上可接受的水質載體中的充氣微氣泡或微氣球的混懸液，其特征在于氣體是至少兩種生物相容性氣體A和B的氣體混合物，其中至少一種氣體(B)以0.5—41％(體積)的量存在，其分子量大于80道爾頓，在標準狀態(tài)下的水中溶解度低于0.0283ml/ml水，混合物的剩余部分是氣體A。
7.按權利要求6所述的超聲對比劑，其中氣體(B)是含氟生物相容性氣體。
8.按權利要求7所述的超聲對比劑，其中含氟氣體選自SF6、CF4、C2F6、C3F6、C3F8、C4F6、C4F8、C4F10、C5F10、C5F12及其混合物。
9.按權利要求6或7所述的超聲對比劑，其中氣體A選自氧氣、氮氣、二氧化碳或其混合物。
10.按權利要求6所述的超聲對比劑，其中表面活性劑包括至少一種以層狀和/或片狀存在的成膜表面活性劑，以及，任選地，包括親水性穩(wěn)定劑。
11.按權利要求10所述的超聲對比劑，其中成膜表面活性劑為磷脂。
12.按權利要求11所述的超聲對比劑，其中磷脂選自磷脂酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、心磷脂、鞘磷脂及其混合物。
13.按權利要求11所述的超聲對比劑，其中除磷脂外，水質載體還包括聚氧乙烯和聚氧丙烯的共聚物及甘油。
14.按權利要求6所述的超聲對比劑，其中表面活性劑為豆油、吐溫和/或山梨醇。
15.一種干制劑，包含表面活性劑、添加劑和穩(wěn)定劑，貯存于在體溫下為生物相容性氣體的物質的混合物下，該混合物中至少一種是分子量大于80道爾頓、標準狀態(tài)下的水中溶解度低于0.0283ml/ml水的氣體。
16.按權利要求15所述的干制劑，其中的氣體為含氟生物相容性氣體。
17.按權利要求16所述的干制劑，其中含氟氣體在混合物中的量為0.5—41％(體積)，剩余的58—99.5％(體積)部分為空氣、氧氣、氮氣、二氧化碳及其混合物。
18.一種兩組分試劑盒，包括貯存于在體溫下為氣體的物質的混合物下的表面活性劑、添加劑和穩(wěn)定劑的干制劑作為第一組分，以及生理學上可接受的載體液作為第二組分，當其與第一組分混合時，便產(chǎn)生超聲對比劑，是一種兩組分的混懸液，該試劑盒的特征在于混合物中至少一種氣體是分子量大于80道爾頓、在標準狀態(tài)下的水中溶解度低于0.0283ml氣體/ml水的氣體。
19.按權利要求18所述的兩組分試劑盒，其中氣體是以0.5—41％(體積)的量存在于混合物中的含氟生物相容性氣體，剩余部分為空氣、氧氣、氮氣、二氧化碳或其混合物。
20.按權利要求18或19所述的兩組分試劑盒，其中含氟氣體選自SF6、CF4、C2F6、C3F6、C3F8、C4F6、C4F8、C4F10、C5F10、C5F12及其混合物。
21.制備權利要求6的超聲對比劑的方法，該超聲對比劑中至少含兩種生物相容性組分(A和B)的氣體混合物混懸在含通常的表面活性劑和穩(wěn)定劑的生理學上可接受的水質載體液中以便形成充分微氣泡或微氣球，方法的特征在于，按如下標準確定在所述氣體混合物中至少一種氣體組分(B)的最小有效比例Bc％＝K/ebMwt＋C其中Bc％(體積)為混合物中組分B的總量，K、C及b分別為數(shù)值為140、-10.8和0.012的常數(shù)，Mwt表示超過80的組分B的分子量。
22.按權利要求21所述的的制備超聲對比劑的方法，其中表面活性劑為選自磷脂酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、心磷脂、鞘磷脂及其混合物的磷脂。
23.權利要求1的超聲對比介質在人或動物體的超聲成象上的應用。
24.權利要求1的超聲對比介質在超聲對比劑制造上的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及以微氣泡或微氣球形式用于超聲回波描記術的可注射的介質，它包含至少兩種生物相容性的物質A和B(在體溫下是氣體)，形成混合物，當其與通常的表面活性劑、添加劑和穩(wěn)定劑形成混懸液時產(chǎn)生有用的超聲對比劑?；旌衔镏兄辽俳M分之一(B)是分子量＞80道爾頓，標準狀態(tài)下的水中溶解度＜0.0283ml/ml水的氣體，超聲對比介質中第一組分(B)的量可在0.5-41體積％之間變化，另一組分(A)為分子量＜80道爾頓的氣體或氣體混合物。第二組分以59-99.5體積％的比例存在，且可較佳地選自氧氣、空氣、氮氣、二氧化碳或其混合物。所述氣體混合物作為超聲對比介質被證明為非常有效。本發(fā)明還包括制備超聲對比介質、對比劑和超聲試劑盒的方法。
文檔編號A61B8/13GK1117713SQ94191154
公開日1996年2月28日 申請日期1994年12月1日 優(yōu)先權日1993年12月15日
發(fā)明者顏峰, M·施奈德, J·布羅肖 申請人:勃勒柯研究有限公司