專利名稱：用于殺死酵母和孢子微生物的殺真菌方法和組合物的制作方法
本申請(qǐng)為1991年2月21日遞交的美國(guó)專利申請(qǐng)No.07/660，994的接續(xù)申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及殺死酵母和微生物的孢子形式的方法和組合物。特別地，本發(fā)明涉及使用一種抗菌活性增強(qiáng)劑和鹵代過氧化物酶的結(jié)合物以增強(qiáng)體系的殺微生物性能的方法和組合物。
正如PCT申請(qǐng)公開WO92/14484中所揭示的，諸如髓過氧化物酶和嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶這樣的鹵代過氧化物酶可被用來選擇性地與靶微生物結(jié)合并在過氧化物和鹵化物的存在時(shí)抑制靶微生物的生長(zhǎng)，而不會(huì)消滅所需微生物或嚴(yán)重?fù)p害培養(yǎng)基中的其它成份，諸如靶微生物環(huán)境中的宿主細(xì)胞或正常菌群。已知當(dāng)髓過氧化物酶和嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶在自然體系中存有適當(dāng)?shù)柠u化物輔因子(X-)或過氧化氫作為底物時(shí)具有殺死微生物的能力(Klebanoff，1968，J.Bacteriol.952131—2138)。然而最近才認(rèn)識(shí)到鹵代過氧化物酶的結(jié)合選擇性以及該體系在治療、研究和工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。因?yàn)樾陆l(fā)現(xiàn)的鹵代過氧化物酶的選擇結(jié)合性，當(dāng)諸如致病微生物這樣的靶微生物與鹵代過氧化物酶的結(jié)合能力大于所需微生物如那些正常菌群時(shí)，靶微生物會(huì)選擇性地與鹵代過氧化物酶結(jié)合，而所需微生物與鹵代過氧化物酶結(jié)合得很少或沒有結(jié)合。當(dāng)過氧化物和鹵化物存在時(shí)，與靶結(jié)合的鹵代過氧化物酶便催化鹵化物氧化，并促使過氧化物歧化，在靶微生物表面產(chǎn)生單分子氧(1O2)，從而導(dǎo)致選擇性地殺死靶微生物，而僅對(duì)所需微生物或生理培養(yǎng)基產(chǎn)生最輕微的附帶性的損害。因此，正如PCT申請(qǐng)公開WO92/14484所揭示的，髓過氧化物酶和嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶可用作人類或動(dòng)物體的治療或預(yù)防性治療中的消毒劑，其選擇性地與致病微生物結(jié)合并殺死致病微生物而僅對(duì)宿主細(xì)胞和宿主的正常菌群產(chǎn)生最輕微的附帶性損害。
該體系也可用于消毒或滅菌制劑中以在體外抑制靶微生物的生長(zhǎng)，尤其是應(yīng)用于要進(jìn)行消毒處理諸如繃帶，外科手術(shù)用器具，縫合器具，導(dǎo)管，牙科器具，隱形眼鏡等等的生物醫(yī)療器械中，以抑制靶微生物的生長(zhǎng)，而當(dāng)該生物醫(yī)療器械隨后用于體內(nèi)時(shí)不會(huì)損害宿主細(xì)胞。雖然已發(fā)現(xiàn)PCT申請(qǐng)公開WO92/14484中揭示的鹵代過氧化物酶滅菌體系在處理致病微生物時(shí)具有高度的有效性，但酵母和一些形成孢子的微生物仍對(duì)鹵代過氧化物酶抗菌活性具有相對(duì)的免疫性。
微生物生活周期中的孢子期的特征是代謝休眠，并對(duì)外界環(huán)境因素具有抵御性，這些因素會(huì)傷害營(yíng)養(yǎng)期的微生物。孢子萌發(fā)的最早期的特征是膨脹并從休眠狀態(tài)向活躍代謝狀態(tài)轉(zhuǎn)變，隨后是營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)如出芽，并隨后最終完成生殖。
細(xì)菌內(nèi)生孢子和真菌孢子的萌發(fā)與增強(qiáng)的代謝和減弱的對(duì)熱及化學(xué)物質(zhì)的抗性相關(guān)。為了萌發(fā)，孢子必須感知所處環(huán)境足以維持營(yíng)養(yǎng)和繁殖。據(jù)報(bào)道l—丙氨酸這種氨基酸能刺激細(xì)菌孢子的萌發(fā)(Hills，1950，J.Gen.Microbiol 438；Halvorson and Church，1957，Bacteriol Rev 21112)。也有報(bào)道說，l—丙氨酸和l—脯氨酸能激發(fā)真菌孢子的萌發(fā)(Yanagita，1957，Arch Mikrobiol 26329)。
簡(jiǎn)單的α—氨基酸，如甘氨酸和l—丙氨酸在代謝中占據(jù)中心位置。α—氨基酸的轉(zhuǎn)氨基作用或脫氨基作用產(chǎn)生代謝和生長(zhǎng)中所需的生糖的和生酮的碳水化合物和氮。例如，l—丙氨酸的轉(zhuǎn)氨基作用或脫氨基作用產(chǎn)生丙酮酸鹽，其為糖酵解代謝(恩伯頓—邁耶霍夫—帕納斯Embden—Meyerhof—Parnas途徑)的終產(chǎn)物，丙酮酸脫氫酶復(fù)合物使丙酮酸鹽氧化產(chǎn)生乙酰—CoA，NAdH，H+和CO2。乙?！o酶A是三羧酸循環(huán)(Kreb’s循環(huán))的起始底物，其反過來為線粒體電子傳遞鏈提供電子。乙?！狢oA也是脂肪酸合成和固醇合成的最終碳源。簡(jiǎn)單α—氨基酸可提供孢子萌發(fā)及隨后代謝活動(dòng)所需的氮、CO2、生糖和/或生酮的等效物。
Zgliczxnski等(1968，European J.Biochem 4540—547)報(bào)道說，髓過氧化物酶通過過氧化氫催化氨基酸的依賴于氯化物的氧化，產(chǎn)生相應(yīng)于脫羧基、脫氨基的氨基酸的氨、二氧化碳和醛。Strauss等人(1970，J.Reticuloendothel Soc.7754—761)推論說，如此產(chǎn)生的醛可用作殺微生物劑。然而，Paul等人(1970，InfectImmun 2414—418)報(bào)道說，向髓過氧化物酶—過氧化氫—氯化物測(cè)試體系中加入α—氨基酸甘氨酸和l—丙氨酸，實(shí)際上抑制大腸肝菌的死亡。另外，Klebanoff(1975，Semin Hemat 12117—142)報(bào)道說，需100mM乙醛殺滅細(xì)菌，與這些公開數(shù)據(jù)相反，現(xiàn)在我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過結(jié)合使用鹵代過氧化物酶和某些用作抗菌活性增強(qiáng)劑的α—氨基酸來處理微生物，可顯著增強(qiáng)鹵代過氧化物酶對(duì)于酵母和孢子形式微生物的滅菌作用。
按照本發(fā)明，提供了殺死酵母或孢子微生物或者抑制其生長(zhǎng)的方法和組合物，包括在過氧化物和氯化物或溴化物存在時(shí)以鹵代過氧化物酶和至少一種抗菌活性增強(qiáng)劑與微生物接觸。適宜的抗菌活性增強(qiáng)劑包括某些α—氨基酸，并優(yōu)選下式化合物 其中R1是氫，未被取代的或者羥基或氨基取代的具有1至6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，或者是未被取代的或者羥基或氨基取代的具有7至12個(gè)碳原子的芳烷基，R2為氫或具有1至6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可被用于體外殺死酵母和孢子微生物，以對(duì)醫(yī)療產(chǎn)品或材料進(jìn)行滅菌或消毒。在其它實(shí)施方案中，該方法和組合物可被用于人或動(dòng)物體的抗真菌和抗酵母的治療中，而不會(huì)消滅所需的微生物或嚴(yán)重?fù)p害宿主細(xì)胞。我們還發(fā)現(xiàn)，在某些α—氨基酸存在時(shí)鹵代過氧化物酶的抗酵母和抗真菌孢子的活性可顯著提高。當(dāng)還有過氧化物和氯化物存在時(shí)，靶結(jié)合的鹵代過氧化物酶催化鹵化物氧化并在有孢子形成的微生物表面促使過氧化物歧化為單分子氧，從而導(dǎo)致靶微生物的死亡。雖然看來鹵代過氧化物酶的活性會(huì)催化加入的部分α氨基酸的脫氨基、脫羧基作用產(chǎn)生醛，但是這類醛在如此低的濃度下不可能對(duì)滅菌作用具有很大貢獻(xiàn)?？磥硎沁@些α氨基酸通過消耗產(chǎn)生次氯酸和單分子氧的一部分鹵代過氧化物酶表現(xiàn)出對(duì)滅菌作用溫和的濃度依賴性的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。然而，這些α—氨基酸對(duì)酵母出芽、孢子微生物萌發(fā)以及可能對(duì)營(yíng)養(yǎng)期微生物的代謝加速的刺激作用似乎活化了如此處理的微生物對(duì)鹵代過氧化物酶的作用，并由此大大增強(qiáng)了滅菌作用。
顯著增強(qiáng)的鹵代過氧化物酶的抗酵母和抗孢子活性使得本發(fā)明的方法和組合物在人或動(dòng)物體的治療或預(yù)防性滅菌處理中以及在體外用于對(duì)營(yíng)養(yǎng)微生物、酵母、細(xì)菌及真菌孢子的消毒和滅菌中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
用于本發(fā)明的方法和組合物中的鹵代過氧化物酶包括嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶(EPO)和髓過氧化物酶(MPO)。本發(fā)明具有代表性的抗菌活性增強(qiáng)劑包括α—氨基酸，選自甘氨酸和丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的l或d對(duì)映體及其烷基酯。
本發(fā)明廣義上是指使用一種鹵代過氧化物酶和一種抗菌活性增強(qiáng)劑殺死或抑制酵母和已形成孢子的微生物的方法和組合物，抗菌活性增強(qiáng)劑活化鹵代過氧化物酶對(duì)酵母和微生物的孢子的殺微生物活性。在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，微生物與一定量鹵代過氧化物酶和一種抗菌活性增強(qiáng)劑如某些α—氨基酸接觸以殺死或抑制酵母和微生物的孢子，鹵代過氧化物酶和滅菌活性增強(qiáng)劑的用量為在過氧化物和溴化物或氯化物存在時(shí)能有效地抑制微生物的生長(zhǎng)或殺死微生物。
在一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物被用作滅菌劑，對(duì)包括細(xì)菌和真菌的廣泛圍的致病微生物呈現(xiàn)出增強(qiáng)的鹵代過氧化物酶抗孢子和抗酵母活性。當(dāng)用于與宿主組織接觸的情況時(shí)，該滅菌體系基于二氧化鹵代過氧化物酶的使用，其對(duì)致病微生物具有選擇親合性。因此，高效的殺微生物作用可直接針對(duì)靶微生物，而不會(huì)造成相關(guān)宿主組織的損害或正常菌群的破壞，即滅菌作用是選擇性的并限于靶微生物。
經(jīng)適當(dāng)配制，鹵代過氧化物酶—增強(qiáng)劑制劑可用來對(duì)材料和器具進(jìn)行消毒甚至滅菌。高效鹵代過氧化物酶—增強(qiáng)劑制劑可用作體外消毒或滅菌制品。通過限制過氧化氫可得性的期限，在材料或器具與宿主組織接觸之前，可使鹵代過氧化物酶—增強(qiáng)劑制劑具有足夠的效力以確保其對(duì)材料或器具的消毒甚至滅菌作用。當(dāng)過氧化物被用完時(shí)，便不存在由于使用該高效制劑對(duì)正常菌群和宿主組織產(chǎn)生的任何潛在毒性，并且由此經(jīng)制劑處理的材料或器具可用于與宿主組織接觸，而不必再經(jīng)洗滌來解毒。
本發(fā)明典型的組合物含有(1)嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶(EPO)和/或髓過氧化物酶(MPO)，(2)過氧化氫(H2O2)或等效的過氧化物，或產(chǎn)生H2O2的氧化酶，(3)氧化酶的底物和(4)抗菌活性增強(qiáng)劑，如甘氨酸或l—丙氨酸。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了體外抑制酵母和孢子微生物生長(zhǎng)的方法和組合物，尤其是用于諸如繃帶、外科用器具、縫合用具、導(dǎo)管、牙科用具、隱形眼鏡等生物醫(yī)療器械需要消毒或滅菌時(shí)以及這些用具隨后要與宿主組織進(jìn)行接觸的情形。本發(fā)明的方法和組合物還可用來治療或預(yù)防由酵母或孢子形式微生物在體內(nèi)引起的感染。
用于本發(fā)明的鹵代過氧化物酶定義為鹵化物過氧化氫氧化還原酶(如EC No.1.11.1.7和EC No.1.11.1.10，國(guó)際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)命名)其中，鹵化物即氯化物或溴化物是電子供體或還原劑，過氧化物為電子受體或氧化劑。任一鹵代過氧化物酶其催化來自過氧化氫的鹵化物依賴性的單分子氧的產(chǎn)生并選擇性結(jié)合靶微生物，均可用于本發(fā)明中。這里特別優(yōu)選鹵代過氧化物酶，正如所描述的包括嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶(EPO)，髓過氧化物酶(MPO)及其結(jié)合物。這里所詳述的抗菌活性增強(qiáng)劑的存在大大提高了氧化酶—鹵代過氧化物酶體系對(duì)酵母和孢子微生物的滅菌能力，因?yàn)樗芑罨u代過氧化物酶體系對(duì)這些形式的微生物的滅菌作用。
本發(fā)明的抗菌活性增強(qiáng)劑是增強(qiáng)鹵代過氧化物酶滅菌體系對(duì)酵母和孢子微生物的滅菌活性的物質(zhì)，其使用濃度為不對(duì)體系的鹵代過氧化物酶活性產(chǎn)生副作用或不對(duì)使用該方法和組合物的環(huán)境產(chǎn)生不良效果。這里優(yōu)選本發(fā)明的活性增強(qiáng)劑包括下式的α氨基酸化合物 其中R1為氫，具有1至6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，或者為未被取代的或者羥基或氨基取代的具有7至12個(gè)碳原子的直鏈或支鏈芳烷基，R2為氫或具有1至6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，正如此處所用的，氨基酸可如上所示呈其酸的形式或可以如下式呈其兩性離子的形式， 其中R1和R2定義同上，氨基酸可以是l或d—對(duì)映體構(gòu)型。典型的烷基R1包括，如甲基，羥甲基，異丙基，2—異丁基，1—異丁基，羥乙基和氨基丁基。典型的芳烷基R1包括，如甲苯基和羥基甲苯基。這里特別優(yōu)選烷基R2包括甲基和乙基。本發(fā)明典型的抗菌活性增強(qiáng)劑包括α氨基酸，選自甘氨酸和丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酸賴氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的l或d—對(duì)映體及其烷基酯。這里最優(yōu)選的抗菌活性增強(qiáng)劑為甘氨酸和l—丙氨酸。
孢子的壁的性質(zhì)和厚度使其保護(hù)自身不受單分子氧和次氯酸的致死性作用。對(duì)于真菌孢子，α氨基酸誘使孢子萌發(fā)產(chǎn)生對(duì)氧化劑更敏感的營(yíng)養(yǎng)體形式。此外，已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的滅菌活性增強(qiáng)劑還可增強(qiáng)氧化酶—鹵代過氧化物酶殺死酵母營(yíng)養(yǎng)體的能力，包括白色假絲酵母(Candida albicans)(見下面表1)。這一現(xiàn)象可能與酵母生長(zhǎng)和出芽的α氨基酸依賴性加速以及這種代謝活性形式對(duì)鹵代過氧化物酶殺菌作用具有增加的敏感性有關(guān)。一種可選擇的可能性是α氨基酸或其代謝產(chǎn)物作為能產(chǎn)生H2O2的真菌氧化酶的底物。另一可選擇的可能性是鹵代過氧化物酶介導(dǎo)的α—氨基酸脫氨基-脫羧基作用的產(chǎn)物醛可誘導(dǎo)萌發(fā)和出芽或影響其它一些關(guān)鍵性過程。
因?yàn)楸景l(fā)明的鹵代過氧化物酶組合物的滅菌活性涉及過氧化物和溴化物或氯化物形成次鹵酸鹽的反應(yīng)，以及過氧化物和次鹵酸鹽形成單分子氧的反應(yīng)，所以本發(fā)明的組合物的活性依賴于合適的過氧化物和鹵化物在滅菌活性位點(diǎn)的存在。在一些情況下，如由于自然產(chǎn)生的菌群的活性，過氧化物(如過氧化氫)可存在于滅菌活性位點(diǎn)，并且有足夠量的氯化物存在于生理環(huán)境中作為轉(zhuǎn)化反應(yīng)中的輔因子。在這些情況下，不必再使用另外的過氧化物或鹵化物或在本發(fā)明的組合物中再包含另外的過氧化物或鹵化物。在其它情況下，可能需要在進(jìn)行微生物處理的地方再提供另外的過氧化氫和/或鹵化物。因此，如果需要，本發(fā)明的組合物還可包含過氧化物或能在體內(nèi)或體外產(chǎn)生過氧化物的試劑和鹵化物。
用于本發(fā)明的方法和組合物的過氧化物包括過氧化氫，下式的烷基過氧化物R—OOH其中R是氫或具有1至3個(gè)碳原子的短鏈烷基，和無機(jī)過氧化物，如過氧化硼或過氧化脲。有機(jī)過氧化物的氧化劑活性通常隨著R鏈的增長(zhǎng)而減弱，如下所示R＝H＞＞CH3＞CH3CH2＞CH3(CH2)2用于本發(fā)明組合物的優(yōu)選的過氧化物為過氧化氫。也可通過在組合物中包含能在體內(nèi)或體外產(chǎn)生過氧化氫的試劑這一方式而在滅菌活性位點(diǎn)獲得過氧化氫。用于此目的的特別有用的試劑包括如氧化酶，象膽固醇氧化酶，葡萄糖氧化酶和半乳糖氧化酶。
當(dāng)過氧化氫直接包含于本發(fā)明組合物中用于體內(nèi)時(shí)，優(yōu)選用量設(shè)計(jì)為可獲得最大滅菌活性的量。在產(chǎn)生高濃度H2O2期間通過避免與宿主細(xì)胞、組織和正常菌群的直接接觸從而避免對(duì)宿主細(xì)胞、組織和正常菌群的損害。因此，當(dāng)液體制劑中含有組合物時(shí)，本發(fā)明組合物每ml液體組合物中可含有約1nmol至約10μmol的過氧化氫，更為優(yōu)選的是每ml液體組合物中含有約5nmol至約5μmol的過氧化氫，最為優(yōu)選的是每ml液體組合物中含有約10nmol至約1μmol的過氧化氫。能在體內(nèi)產(chǎn)生過氧化氫的試劑，如產(chǎn)生過氧化物的氧化酶，特別用于滅菌活性位點(diǎn)的過氧化氫用量的動(dòng)態(tài)控制。這種試劑通過提供并保持穩(wěn)定的、低濃度水平的H2O2使組合物的滅菌活性達(dá)到最大。因此，所要采用的這種試劑的量會(huì)高度依賴于試劑的性質(zhì)和所期望的效果，但是根據(jù)滅菌活性位點(diǎn)可得到的鹵化物的類型和濃度優(yōu)選能產(chǎn)生穩(wěn)定水平的量，即每ml液體每分鐘約1pmol至約1μmol的過氧化氫。當(dāng)制劑用來作消毒—滅菌溶液時(shí)，可調(diào)節(jié)氧化酶和其底物以能持續(xù)地為所需滅菌期提供相對(duì)高度穩(wěn)定濃度的H2O2。消毒—滅菌過程以氧化酶底物的耗盡為終點(diǎn)、或與氧化酶降解的速率有關(guān)。
用于抗真菌目的時(shí)，特別優(yōu)選使用如得自紅粉諾卡氏菌(No-cardia erythropolis)的膽固醇氧化酶作為生成H2O2的氧化酶。與原核細(xì)菌不同，真菌合成甾醇。事實(shí)上，兩性霉素B的抗真菌活性至少部分依賴于與真菌膜類固醇的結(jié)合，如麥角甾醇。麥角甾醇是多數(shù)真菌的主要甾醇成份，但其它甾醇也存在(Weete，1973，Phytochemistry 121843)。來自紅粉諾卡氏菌的膽固醇氧化酶選擇性氧化Δ5-3β—ols和5α—3β—ols產(chǎn)生酮(Smith and Brooks，1974，J.Chromatography 101373)；如，膽固醇＋O2→膽固醇氧化酶→膽甾烯酮＋H2O2麥角甾醇＋O2→膽固醇氧化酶→麥角甾烯酮＋H2O2該諾卡氏屬氧化酶是相對(duì)熱穩(wěn)定的，并在50℃保持催化活性。其在pH4至9具有活性，在pH7具有最大活性。其米氏常數(shù)(Km)為1.4×10-5mol/l(Richmond，1973，Clin Chem.191350)。
當(dāng)鹵代過氧化物酶與H2O2一起存在或與產(chǎn)生H2O2的氧化酶偶聯(lián)時(shí)，具有殺真菌活性。然而，用膽固醇氧化酶作為氧化酶，氧化酶—鹵代過氧化物酶的殺真菌能力高于僅產(chǎn)生H2O2的情況。這種依賴于膽固醇氧化酶的殺真菌作用的增強(qiáng)部分上可能與真菌膽固醇的氧化酶耗盡而導(dǎo)致的完整真菌膜的破壞有關(guān)。真菌可能還會(huì)合成一種內(nèi)源性的產(chǎn)生H2O2的甾醇氧化酶。
用于本發(fā)明的方法和化合物的適宜的鹵化物可以是溴化物或氯化物。用于特定用途的鹵化物的使用、選擇和用量依賴于各種因素，如用于滅菌組合物中的鹵代過氧化物酶，所期望的治療效果，過氧化物的獲得及其它因素。當(dāng)鹵代過氧化物酶為髓過氧化物酶時(shí)，鹵化物可以是溴化物或氯化物。因?yàn)槁然镆圆蛔璧K其作為鹵化物輔因子的足夠量存在于多數(shù)生理環(huán)境中，所以通常不需外源的氯化物。當(dāng)需要內(nèi)源氯化物時(shí)，采用的氯化物的量?jī)?yōu)選范圍為每ml溶液約10μmol的氯化物至約150μmol的氯化物，形成近似的生理?xiàng)l件。當(dāng)鹵代過氧化物酶為嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶時(shí)，氯化物作為輔因子相對(duì)而言效果較差，因此，優(yōu)選的鹵化物為溴化物。當(dāng)包含于液體組合物中時(shí)，本發(fā)明組合物在每ml液體組合物中可包含約1nmol溴化物至約20μmol溴化物，更為優(yōu)選的是每ml液體組合物中含約10nmol溴化物至約10μmol溴化物，最為優(yōu)選的是每ml液體組合物含約100nmol的溴化物至約1μmol溴化物。
在形成一種有效的殺微生物環(huán)境時(shí)，鹵化物與過氧化物的比例是一個(gè)重要的考慮因素。因此，除了確保微生物侵襲位點(diǎn)的鹵化物和過氧化物如上所述的有效水平之外，優(yōu)選實(shí)施本發(fā)明方法時(shí)采用提供最佳殺微生物活性的鹵化物過氧化物的比例。例如，當(dāng)鹵代過氧化物酶為MPO和鹵化物為Cl-時(shí)，優(yōu)選Cl-與過氧化物的比例范圍保持為在具有殺微生物活性的環(huán)境中約1至約40,000，更為優(yōu)選的是約50至40,000，最為優(yōu)選的是約200至40,000。當(dāng)鹵化物為Br-時(shí)，優(yōu)選Br-與過氧化物的比例范圍為在具有殺微生物活性的環(huán)境中約0.1至約4,000，更為優(yōu)選的為約0.5至約2,000，最為優(yōu)選的為約1至約1,000。
本發(fā)明的方法和組合物是用來抑制廣譜的孢子微生物，優(yōu)選對(duì)正常菌群具有最小程度的損害，這里所用的“孢子微生物”是指包括細(xì)菌或真菌的孢子體。形成孢子的微生物是公知的并且包括諸如芽孢桿菌屬(Bacillus sps.)和梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium sps.)這樣的細(xì)菌以及諸如曲霉屬(Aspergillus sps.)鐮孢屬(Fusariumsps.)，發(fā)癬菌屬(Trichophyton sps.)這樣的真菌等。
這里所用的術(shù)語“正常菌群”是指以共生水平存在于健康宿主體內(nèi)或表面的細(xì)菌。正常菌群包括，例如存在于人口腔、腸道或陰道的乳酸科細(xì)菌，如存在于口腔中的鏈球菌(Streptococcus)(viridans)，存在于母乳哺育的嬰兒的腸道中、外生殖器中、前尿道和陰道中的乳酸桿菌屬(如Tissier’s桿菌和doderlein’s桿菌)。構(gòu)成宿主正常菌群的微生物是眾所周知的(如參見前述Principlesand Practice of Infectious diseases，New York，pp.34—36和161)。已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的鹵代過氧化物酶選擇性地與許多致病細(xì)菌和真菌結(jié)合，不與正常菌群結(jié)合。用于體內(nèi)時(shí)，優(yōu)選使用鹵代過氧化物酶處理宿主，用量為不會(huì)從宿主中消滅正常菌群。用于體外消毒—滅菌時(shí)，可采用足夠高濃度的鹵代過氧化物酶，以確保完全殺死所有的營(yíng)養(yǎng)體和酵母。這種情況下，通過在與宿主組織接觸之前消耗H2O2或產(chǎn)生H2O2的體系，而避免對(duì)宿主組織和正常菌群的損害。
本發(fā)明的組合物通常含有一定量的鹵代過氧化物酶和抗菌活性增強(qiáng)劑，其足以在過氧化物和鹵化物存在時(shí)殺死酵母或孢子微生物或抑制其生長(zhǎng)。組合物可方便地以液體載體形式提供。只要載體不會(huì)嚴(yán)重干擾鹵代過氧化物的選擇性結(jié)合能力或酶活性，通?？蔀榇四康氖褂萌魏我后w載體?？蛇x擇地，組合物可以溶于液體時(shí)具有活性的固體形式提供。
本發(fā)明的組合物還可含有過氧化物或能產(chǎn)生過氧化物的試劑，如氧化酶，正如前面詳述的。氧化酶—過氧化物酶體系自身可構(gòu)成二元制劑。二元制劑的一部分包括含有氧化酶、鹵代過氧化物酶和抗菌活性增強(qiáng)劑如甘氨酸或l—丙氨酸的溶液。二元制劑的第二部分包括氧化酶的底物，如膽固醇氧化酶情況時(shí)的膽固醇或者分子氧O2。例如，底物可以固體片的形式提供。對(duì)物品如隱形眼鏡進(jìn)行消毒時(shí)，膽固醇片和要滅菌的物品一起置于滅菌室中。加入膽固醇氧化酶—鹵代過氧化物酶和甘氨酸或l—丙氨酸溶液以開始滅菌。該組合物還可包含乙醇以便于膽固醇溶解和被氧化酶利用。只要有足夠的膽固醇存在推進(jìn)反應(yīng)，該體系將形成持續(xù)的滅菌作用。
體內(nèi)應(yīng)用時(shí)，該抗菌組合物可以任意有效的藥物上可接受的形式給藥于溫血?jiǎng)游?，包括人和?dòng)物體，例如以表面、灌洗、口服或栓劑形式作為一種表面、頰或鼻腔、噴霧劑或以可有效地對(duì)微生物感染位點(diǎn)釋放活性鹵代過氧化物酶的任何其它形式。給藥途徑優(yōu)選使抗菌組合物與感染微生物直接接觸。
表面應(yīng)用時(shí)，藥物上可接受的載體可呈液體、膏、泡沫、洗液或凝膠形式，并且可附加含有有機(jī)溶劑，乳化劑，膠凝劑，濕潤(rùn)劑，穩(wěn)定劑，表面活性劑，浸濕劑，防腐劑，時(shí)間釋放劑和少量的濕潤(rùn)劑，螯合劑、染料，香料和其它常用于表皮給藥的藥物組合物中的成份。
口腔或表皮給藥的固體劑型包括膠囊、片劑、丸劑、栓劑、粉末和顆粒。呈固體劑型時(shí)，組合物可與至少一種隋性稀釋劑混合，如蔗糖，乳糖或淀粉，并可附加含有潤(rùn)滑劑，緩沖劑，腸包衣和其它本技術(shù)領(lǐng)域熟知的成份。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可特別設(shè)計(jì)用于體外，如對(duì)醫(yī)療器械、隱形眼鏡等進(jìn)行滅菌或消毒，尤其是該器械或隱形眼鏡要用在與病人或配帶者接觸的情況下。對(duì)于這種形式的應(yīng)用，組合物可以方便地以液體或泡沫形式提供，并可以與乳化劑、表面活性劑、緩沖劑、浸濕劑、防腐劑和其它常用于該類型組合物中的成份一起使用。本發(fā)明的組合物可浸滲入吸收材料中，如縫合線、繃帶和紗布，或組合物可涂布在固相材料表面，如纖維，帶和導(dǎo)管以將組合物施送于預(yù)防微生物感染的位點(diǎn)。這種類型的其它傳送體系對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
可改變本發(fā)明組合物中鹵代過氧化物酶和抗菌活性增強(qiáng)劑的實(shí)際用量，以獲得在治療位點(diǎn)能有效殺死營(yíng)養(yǎng)體及酵母和孢子微生物的鹵代過氧化物酶和抗菌活性增強(qiáng)劑的用量。因此，所選擇的量依賴于自然性質(zhì)、治療位點(diǎn)、所期望的反應(yīng)、所期望的殺微生物作用的時(shí)間期限和其它因素。通常，當(dāng)鹵代過氧化物酶為髓過氧化物酶時(shí)，本發(fā)明的液體組合物每ml液體組合物含至少0.01皮摩爾(pmol)的髓過氧化物酶，更為優(yōu)選的是每ml液體組合物含約0.1pmol至約500pmol的髓過氧化物酶，最為優(yōu)選的是每ml液體組合物含約0.5pmol至約50pmol的髓過氧化物酶。可選擇地，在某些應(yīng)用中可期望在組合物中包括嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶和髓過氧化物酶。本發(fā)明的液體組合物通常含有至少0.005μmol/ml的抗菌活性增強(qiáng)劑，即α—氨基酸，如甘氨酸和丙氨酸，更為優(yōu)選地含0.05μmol/ml至50μmol/ml這樣的抗菌活性增強(qiáng)劑。
若需要的話也可包含其它組分，如產(chǎn)生過氧化物的氧化酶，氧化酶的底物和鹵化物，正如上面所詳述的。另外，組分可配制成單一制劑，或需要特殊使用時(shí)可分成二元制劑用于以后混合。對(duì)于單一制劑，在施用位點(diǎn)可獲得的一種所需體系組分，如鹵化物、氧化酶、氧化酶的輔基，氧化酶的還原底物或單分子氧優(yōu)先不考慮入制劑中，以預(yù)防超前反應(yīng)及體系組分的耗盡。
作為一說明性實(shí)例，適用作隱形眼鏡溶液的組合物含有1至20pmol/ml的嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶和/或髓過氧化物酶，0.1至1μmol/ml的甘氨酸，0.01至10個(gè)單位的葡萄糖氧化酶，50至500mEq/L的氯化物和0.1至1mEq/L溴化物。上述組合物在厭氧條件下和1至10μmol/ml的葡萄糖結(jié)合，完整的制劑保存于厭氧條件下直至用作液體滅菌或消毒溶液時(shí)為止。暴露于空氣即分子氧中就會(huì)激活制劑的消毒—滅菌活性。
結(jié)合下述典型實(shí)施例可更好地理解上述內(nèi)容，實(shí)施例目的在于說明而不是限定發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1l—丙氨酸對(duì)氧化酶—鹵代過氧化物酶殺死細(xì)菌、酵母和真菌孢子的影響效果根據(jù)下述方法確定l—丙氨酸對(duì)氧化酶—鹵代過氧化物酶殺死細(xì)菌、酵母和真菌孢子的影響效果。從含0.1單位(即4μg)來自紅粉諾卡氏菌的膽固醇氧化酶(根據(jù)Richmond.W.，“Preparationand Properties of a Cholesterol Oxidase From Nocardia sp.andIts Application to the Enzymatic Assay of Total Cholesterol inSerum”，Clin.Chem.19(12)1350—1356(1973)的方法制備)，20pmol(2.8μg)的豬MPO(ExOxEmis，Inc.，San Antonio，Tex-as，U.S.A.，Lot#1899201)或20pmol(1.5μg)豬EPO(ExOxEm-is，Inc.，San Antonio，Texas，U.S.A.，Lot#1929201)，100mEq/L Cl-和1mEq/L Br-的50mM的乙酸鹽緩沖液制備溫育培養(yǎng)基。用1×107細(xì)胞的金黃色葡萄球菌(Staph.aureus)，白色假絲酵母(Cand.albicans)和煙曲霉(Asperg.fumigatus)接種于培養(yǎng)基上制得溫育混合物。用50mM MOPS緩沖液調(diào)節(jié)溫育混合物的pH為7。向該保溫混合物中加入8.5％乙醇中的膽固醇至終濃度為7mM(7μmol/ml)。保溫混合物的終體積為1ml?；旌衔镉?2℃保溫4小時(shí)，然后將微生物鋪平板(金黃色葡萄球菌鋪平板于酪蛋白胰蛋白酶解物大豆瓊脂；白色假絲酵母和煙曲霉鋪平板于沙氏葡糖瓊脂)。約24小時(shí)后(煙曲霉約72—96小時(shí)后)，計(jì)數(shù)菌落形成單元(CFU)，作為微生物活力的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果見表1。
表1l—丙氨酸對(duì)膽固醇氧化酶—鹵代過氧化物酶抗金黃色葡萄球菌、白色假絲酵母和煙曲霉孢子的殺微生物作用的影響效果膽固醇鹵代過微生物氧化酶 氧化物酶CFU金黃色葡萄球菌 無無 19,400,000金黃色葡萄球菌0.1單位 無 29,000,000金黃色葡萄球菌0.1單位 無 29,200,000金黃色葡萄球菌0.1單位 20pmol MPO 0金黃色葡萄球菌0.1單位20pmol MPO 0金黃色葡萄球菌0.1單位 20pmol EPO 0金黃色葡萄球菌0.1單位20pmol EPO 0白色假絲酵母無無1,460,000白色假絲酵母 0.1單位 無1,380,000白色假絲酵母 0.1單位 無1,580,000白色假絲酵母 0.1單位 20pmol MPO 800,000白色假絲酵母 0.1單位 20pmol MPO0白色假絲酵母 0.1單位 20pmol EPO 680,000白色假絲酵母 0.1單位 20pmol EPO0煙曲霉 無無1,260,000煙曲霉0.1單位 無1,020,000煙曲霉0.1單位 無 880,000煙曲霉0.1單位 20pmol MPO 550,000煙曲霉0.1單位 20pmol MPO0煙曲霉0.1單位 20pmol EPO 840,000煙曲霉0.1單位 20pmol EPO0 表示50mM乙酸鹽緩沖液含1mM l—丙氨酸正如表1所示，膽固醇氧化酶加上MPO或EPO可提供一有效的殺微生物體系。該結(jié)合物在1mMl—丙氨酸存在或不存在時(shí)殺死107金黃色葡萄球菌。然而，在膽固醇氧化酶—鹵代過氧化物酶體系中含有L—丙氨酸對(duì)徹底殺滅白色假絲酵母的酵母和煙曲霉的孢子來說是必要的。
實(shí)施例2潛在的氨基酸抗菌活性增強(qiáng)劑對(duì)鹵代過氧化物酶抗煙曲霉孢子的殺微生物作用的影響效果各種潛在的氨基酸用作鹵代過氧化物酶殺微生物作用的增強(qiáng)劑的效果由實(shí)施例1所述方法來確定，不同的是，每次實(shí)驗(yàn)含有下表2—8中所示的一定量的葡萄糖氧化酶(代替實(shí)施例1中的膽固醇氧化酶)，在pH6下在50mM乙酸鈉緩沖液中的5.6mM葡萄糖的溫育培養(yǎng)基中含100mEq/L的氯化物和0.1mEq/L的溴化物。下表2—8中所示的潛在的氨基酸活化劑被加入到混合物中至終濃度為0，5，0.5或0.05μmol/ml，保溫混合物用約1×107個(gè)煙曲霉孢子接種?；旌衔镌谑覝叵卤?0分鐘，然后根據(jù)實(shí)施例1所述鋪平板。平板在35℃下過夜生長(zhǎng)，再生長(zhǎng)2天。計(jì)數(shù)菌落形成單元，作為對(duì)微生物活力的測(cè)定。
如上所述測(cè)試脂族氨基酸甘氨酸、l—丙氨酸、l—纈氨酸、l—亮氨酸和l—異亮氨酸。結(jié)果示于下表2。
表2氨基酸種類和濃度對(duì)鹵代過氧化物酶殺死煙曲霉孢子的影響效果鹵代過氧 葡萄糖 (氨基酸) CFU(脂肪族氨基酸)化物酶氧化酶 μmol/ml(mM) 甘氨酸 l—丙氨酸 l—纈氨酸 l—亮氨酸 l—異亮氨酸0 0 0 920,000 800,000 260,000 920,000 260,0000 0 5 560,000 520,000 380,000 740,000 340,0000 00.5700,000 660,000 460,000 960,000 400,0000 00.05 480,000 520,000 180,000 460,000 460,0000 0.6單位 0 760,000 1,140,000 420,000 740,000 420,0000 0.6單位 5 440,000 980,000 440,000 1,000,000 340,0000 0.6單位 0.5300,000 780,000 300,000 920,000 400,0000 0.6單位 0.05 580,000 760,000 340,000 700,000 520,00020pmol MPO 0.6單位 0 500,000 700,000 300,000 1,640,000 300,00020pmol MPO 0.6單位 5 0 0 34,000 72,000 22,00020pmol MPO 0.6單位 0.5 0 0 2,000 42,000020pmol MPO 0.6單位 0.05 260,000 4,000 16,000 62,000 10,00020pmol EPO 0.6單位 0 780,000 840,000 200,000 1,060,000 200,00020pmol EPO 0.6單位 5 0 0 0 52,000020pmol EPO 0.6單位 0.5 0 0 0 0020pmol EPO 0.6單位 0.05 182,00010,000 28,000 0 30,000
正如表2所示，所測(cè)試的每一個(gè)脂族氨基酸都對(duì)嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶和髓過氧化物酶作用于煙曲霉孢子的鹵代過氧化物酶抗菌活性呈現(xiàn)出顯著的增強(qiáng)效果。而甘氨酸和l—丙氨酸的增強(qiáng)效果最大。
用上述方法測(cè)試二羧基氨基酸和酰胺即l—天冬氨酸，l—天冬酰胺，l—谷氨酸和l—谷氨酰胺以及亞氨基酸l—脯氨酸和l—羥脯氨酸。結(jié)果示于表3。
表3氨基酸種類和濃度對(duì)鹵代過氧化物酶殺死煙曲霉孢子的影響效果鹵代過氧 葡萄糖 (氨基酸) CFU(二羧基氨基酸和酰胺)CFU(亞氨基酸)化物酶 氧化酶 μmol/ml(mM) l—天冬氨酸 l—天冬酰胺 l—谷氨酸 l-谷氨酰胺 l—脯氨酸 l—羥脯氨酸0 00 520,000520,000 920,000 920,000 260,000 860,0000 05 540,000540,000 260,000 420,000 420,000 640,0000 0 0.5 460,000180,000 320,000 660,000 300,000 800,0000 0 0.05 200,000240,000 580,000 300,000 480,000 740,0000 0.6單位0 340,000340,000 740,000 740,000 420,000 740,0000 0.6單位5 420,000340,000 280,000 400,000 240,000 540,0000 0.6單位 0.5 360,000460,000 340,000 360,000 360,000 460,0000 0.6單位 0.05 380,000160,000 640,000 560,000 200,000 720,00020pmol MP00.6單位0 700,000700,0001,640,000 1,640,000 300,000 940,00020pmol MPO0.6單位5 640,000660,000 840,000 1,080,000 540,000 1,000,00020pmol MPO0.6單位 0.5 960,000340,000 820,000 1,000,000 380,000 900,00020pmol MPO0.6單位 0.05 800,000680,000 820,000 750,000 280,000 680,00020pmol EPO0.6單位0 920,000920,0001,060,000 1,060,000 200,000 860,00020pmol EPO0.6單位5 920,000 1,340,0001,100,000 820,000 280,000 840,00020pmol EPO0.6單位 0.51,460,000440,000 540,000 660,000 460,000 1,260,00020pmol EPO0.6單位 0.05 620,000 1,260,000 900,000 400,000 380,000 680,000
正如表3所示，所測(cè)試的二羧基氨基酸或亞氨基酸在任一測(cè)試濃度都沒有顯示出對(duì)鹵代過氧化物酶抗菌活性的顯著增強(qiáng)效果。
根據(jù)上述方法測(cè)試羥基氨基酸l—絲氨酸和l—蘇氨酸及堿性氨基酸l—賴氨酸，l—組氨酸和l—精氨酸。結(jié)果示于下表4
表4氨基酸種類和濃度對(duì)鹵代過氧化物酶殺死煙曲霉孢子的影響效果鹵代過氧葡萄糖(氨基酸) CFU(羥基氨基酸) CFU(堿性氨基酸)化物酶 氧化酶 μmol/ml(mM) l—絲氨酸l—蘇氨酸l—賴氨酸l—組氨酸l—精氨酸0 0 0 800,000 760,000 520,000 760,000 800,0000 0 5 820,000 520,000 520,000 440,000 780,0000 0 0.5 540,000 800,000 460,000 840,000 740,0000 0 0.05 580,000 660,000 460,000 840,000 620,0000 0.6單位 0 1,140,000 400,000 340,000 400,0001,140,0000 0.6單位 5 480,000 800,000 240,000 520,000 580,0000 0.6單位 0.5 620,000 360,000 480,000 740,000 960,0000 0.6單位 0.05 640,000 560,000 520,000 560,0001,020,00020pmol MPO 0.6單位 0 700,000 500,000 700,000 500,000 700,00020pmol MPO 0.6單位 5 700,000 400,000 380,000 720,000 960,00020pmol MPO 0.6單位 0.5 660,00000 640,000 740,00020pmol MPO 0.6單位 0.05 560,000 12,0000 520,000 840,00020pmol EPO 0.6單位 0 840,000 780,000 920,000 780,000 840,00020pmol EPO 0.6單位 5 01,000,000 560,000 740,000 960,00020pmol EPO 0.6單位 0.5 34,0000 620,000 600,000 700,00020pmol EPO 0.6單位 0.05 860,000 40,000 920,000 102,000 900,000
正如表4所示，羥基氨基酸l—絲氨酸和l—蘇氨酸均顯著增強(qiáng)嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶殺死煙曲霉孢子的作用，而l—蘇氨酸和堿性氨基酸l—賴氨酸在增強(qiáng)髓過氧化物酶抗菌活性中有效果。堿性氨基酸l—組氨酸和l—精氨酸未顯示出明顯的抗菌效果。組氨酸易與單分子氧反應(yīng)，因此，其可能產(chǎn)生對(duì)鹵代過氧化物酶作用的有效的竟?fàn)幮砸种?，掩蓋組氨酸刺激孢子萌發(fā)的能力。
如上方法測(cè)試含硫氨基酸l—半胱氨酸和l—蛋氨酸，以及芳族氨基酸l—苯丙氨酸，l—酪氨酸和l—色氨酸。結(jié)果示于下表5
表5氨基酸種類和濃度對(duì)鹵代過氧化物酶殺死煙曲霉孢子的影響效果鹵代過氧 葡萄糖 (氨基酸) CFU(含硫氨基酸) CFU(芳香族氨基酸)化物酶氧化酶 μmol/ml(mM)l—半胱氨酸 l—蛋氨酸 l-苯丙氨酸 l—酪氨酸l—色氮酸00 0380,000 380,000 260,000 760,000 380,00000 5540,000 560,000 360,000 580,000 800,00000 0.5 500,000 540,000 340,000 800,000 640,00000 0.05 380,000 320,000 380,000 560,000 700,0000 0.6單位0460,000 460,000 420,000 400,000 460,0000 0.6單位5580,000 660,000 400,000 840,000 920,0000 0.6單位 0.5 420,000 480,000 460,000 700,000 580,0000 0.6單位 0.05 360,000 460,000 440,000 560,000 280,00020pmol MPO0.6單位0580,000 580,000 300,000 500,000 580,00020pmol MPO0.6單位5580,000 400,000 8,000 640,000 700,00020pmolMPO 0.6單位 0.5 540,000 480,000 4,000 460,000 580,00020pmol MPO0.6單位 0.05 720,000 560,000 2,000 20,0001,040,00020pmol EPO0.6單位0480,000 480,000 200,000 780,000 480,00020pmol EPO0.6單位5680,000 580,000 0 640,000 860,00020pmol EPO0.6單位0.5 800,000 560,000 0 920,000 740,00020pmol EPO0.6單位 0.05 240,000 600,000 00 580,000
正如表5所示，含硫氨基酸對(duì)增強(qiáng)嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶或髓過氧化物酶的抗菌活性沒有效果。芳香族氨基酸l—苯丙氨酸和l—酪氨酸均可顯著增強(qiáng)嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶和髓過氧化物酶殺死煙曲霉的效果，而l—色氨酸未表現(xiàn)出顯著效果。這些含硫和芳香族氨基酸也相對(duì)地可與單分子氧反應(yīng)，并可競(jìng)爭(zhēng)性抑制鹵代過氧化物酶作用，其掩蓋氨基酸刺激孢子萌發(fā)的能力。這就是為什么l—苯丙氨酸和l—酪氨酸在低濃度下測(cè)試時(shí)最有效的可能原因。
根據(jù)上述方法，測(cè)試丙氨酸的對(duì)映體、異構(gòu)體及丙氨酸的衍生物。結(jié)果示于下表6。
表6氨基酸種類和濃度對(duì)鹵代過氧化物酶殺死煙曲霉孢子的影響效果鹵代過氧 葡萄糖 (氨基酸) CFU(丙氨酸異構(gòu)體和衍生物)化物酶 氧化酶 μmol/ml(mM) l—丙氨酸 d—丙氨酸 β—丙氨酸 l—丙氨酸甲基酯l—丙氮酸—l—丙氨酸0 0 0 800,000 740,000 740,000740,000 740,0000 0 5 520,000 720,000 580,000500,000 660,0000 0 0.5 660,000 760,000 920,000540,000 640,0000 0 0.05 520,000 760,000 740,000540,000 620,0000 0.6單位 0 1,140,000 760,000 760,000760,000 760,0000 0.6單位 5 980,000 660,000 900,000860,000 780,0000 0.6單位 0.5 780,000 700,000 620,000740,000 680,0000 0.6單位 0.05 760,000 600,000 860,000 1,200,000 360,00020pmol MPO0.6單位 0 700,000 820,000 820,000820,000 820,00020pmol MPO0.6單位 5 0 14,000 760,000 0 660,00020pmol MPO0.6單位 0.50 0 900,000 0 500,00020pmol MPO0.6單位 0.05 4,000 10,000 1,116,000440,000 480,00020pmol EPO0.6單位 0 840,000 1,020,000 1,020,000 1,020,0001,020,00020pmol EPO0.6單位 5 0 0 940,000 0 660,00020pmol EPO0.6單位 0.50 0 880,000 01,360,00020pmol EPO0.6單位 0.05 10,000 10,000 720,000580,000 680,000
正如表6所示，丙氨酸的l和d對(duì)映體均可顯著增強(qiáng)髓過氧化物酶和嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶殺死煙曲霉的作用，而β—丙氨酸沒表現(xiàn)出顯著的增強(qiáng)效果。類似地，l—丙氨酸的甲基酯可顯著增強(qiáng)滅菌活性。l—丙氨酸—l—丙氨酸二肽沒表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的活性。
如上述方法測(cè)試蘇氨酸對(duì)映體的效果。結(jié)果示于下表7表7氨基酸種類和濃度對(duì)鹵代過氧化物酶殺死煙曲霉孢子的影響效果CFU(羥基氨基酸鹵代過氧 葡萄糖 (氨基酸) 的對(duì)映體)化物酶 氧化酶 μmol/ml(mM)l—蘇氨酸 d—蘇氨酸00 0 760,000800,00000 5 520,000820,000000.5 800,000760,000000.05 660,000680,0000 0.6單位 0 400,000 1,140,0000 0.6單位 5 800,000460,0000 0.6單位 0.5 360,000720,0000 0.6單位 0.05 560,000720,00020pmol MPO0.6單位 0 500,000700,00020pmol MPO0.6單位 5 400,000420,00020pmol MPO0.6單位 0.5 0 020pmol MPO0.6單位 0.05 12,000280,00020pmol EPO0.6單位 0 780,000840,00020pmol EPO0.6單位 5 1,000,000 020pmol EPO0.6單位 0.5 0 020pmol EPO0.6單位 0.05 40,000520,000
如表7所示，蘇氨酸的l和d對(duì)映體均可顯著增強(qiáng)髓過氧化物酶和嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶殺死煙曲霉的活性。
如上述方法測(cè)試增強(qiáng)氨基酸的α—酮酸形式的效果，使用l—丙氨酸和丙酮酸及甘氨酸和二羥乙酸。結(jié)果示于下表8
表8氨基酸種類和濃度對(duì)鹵代過氧化物酶殺死煙曲霉孢子的影響效果鹵代過氧 葡萄糖 (氨基酸) CFU(氨基酸與α—酮酸的對(duì)比)化物酶 氧化酶μmol/ml(mM)l—丙氨酸丙酮酸 甘氮酸 二羥乙酸0 00 800,000 860,000860,000 860,0000 05 520,000 880,000720,000 600,0000 00.5 660,000 700,000480,000 700,0000 0 0.05 520,000 660,000640,000 560,0000 0.6單位0 1,140,000 740,000740,000 740,0000 0.6單位5 980,000 760,000520,000 560,0000 0.6單位0.5 780,000 600,000760,000 600,0000 0.6單位 0.05 760,000 480,000800,000 660,00020pmol MPO 0.6單位0 700,000 940,000940,000 940,00020pmol MPO 0.6單位5 0 820,000 0 1,060,00020pmol MPO 0.6單位 0.50 880,000 0 860,00020pmol MPO 0.6單位 0.05 4,000 580,000 90,000 580,00020pmol EPO 0.6單位0 840,000 860,000860,000 860,00020pmol EPO 0.6單位5 0 640,000 0 740,00020pmol EPO 0.6單位 0.50 560,000 0 720,00020pmol EPO 0.6單位 0.05 10,000 780,000460,000 740,000
如表8所示，丙酮酸和二羥乙酸均未表現(xiàn)出l—丙氨酸和甘氨酸的活性增強(qiáng)效果。
實(shí)施例3抗菌活性增強(qiáng)劑對(duì)其它抗真菌體系的影響效果為測(cè)定l—丙氨酸對(duì)常用抗真菌化合物制霉菌素和兩性霉素B的滅菌效果的影響，按實(shí)施例2的步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用制霉菌素或兩性霉素B代替實(shí)施例2中的鹵代過氧化物酶—葡萄糖氧化酶，使用0(對(duì)照)或10μmol/ml的l—丙氨酸，以串珠鐮孢(Fusariummoniliforme)作為微生物。結(jié)果示于下表9
表9l—丙氨酸對(duì)制霉菌素和兩性毒素B的抗真菌活性的影響效果抗真菌劑與終濃度 l—丙氨酸 CFU(串珠鐮孢ATCC 38159)無 無 940,000制霉菌素，400μg/ml 無 120,000制霉菌素，40μg/ml無 340,000制霉菌素，4μg/ml 無 500,000無101,020,000制霉菌素，400μg/ml 10 28,000制霉菌素，40μg/ml10 124,000制霉菌素，4μg/ml 10 220,000無無 880,000兩性霉素B，250μg/ml 無 320,000兩性霉素B，25μg/ml 無 500,000兩性霉素B，2.5μg/ml 無 880,000無10 840,000兩性霉素B，250μg/ml 10 340,000兩性霉素B，25μg/ml 10 460,000兩性霉素B，25μg/ml 10 800,000
從表9可見，l—丙氨酸的加入可使制霉菌素依賴型的殺死串珠鐮孢的效果加倍，且對(duì)兩性霉素B依賴型的殺死串珠鐮孢的情況沒有效果。
使用滅菌化合物過氧化氫(H2O2)和次氯酸鈉(NaClO)以及煙曲霉和串珠鐮孢的孢子來重復(fù)前面的步驟。結(jié)果列于下表10
表101—丙氨酸對(duì)過氧化氫和次氯酸鈉抗真菌活性的影響效果CFU CFU抗真菌劑與終濃度1—丙氨酸(煙曲霉 (串珠鐮孢μmol/測(cè)試 ATCC 10894)ATCC 38159)無 無 360,000 460,000H2O2，3mg/ml 無 580,000 0H2O2，0.3mg/ml無 400,000 140,000H2O2，0.03mg/ml 無 440,000 400,000H2O2，0.003mg/ml 無 640,000 500,000無 10 700,000 580,000H2O2，3mg/ml 10 720,000 0H2O2，0.3mg/ml10 280,000 340,000H2O2，0.03mg/ml 10 660,000 300,000H2O2，0.003mg/ml 10 500,000 310,000無無 300,000 284,000NaClO，1mg/ml 無10,00050,000NaClO，0.1mg/ml無26,000 298,000NaClO 0.01mg/ml無 560,000 290,000NaClO，0.001mg/ml 無 640,000 294,000無10 700,000 380,000NaClO，1mg/ml 1026,000 292,000NaClO，0.1mg/ml1054,000 404,000NaClO，0.01mg/ml 10 580,000 404,000NaClO，0.001mg/ml 10 280,000 304,000
和兩性霉素B的情況一樣，與l—丙氨酸結(jié)合使用時(shí)，過氧化氫或次氯酸鹽的效果并未顯著增強(qiáng)。事實(shí)上，l—丙氨酸顯示出抑制過氧化物特別是次氯酸鹽殺死真菌的活性。這種情況下l—丙氨酸可能充當(dāng)一種競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。
實(shí)施例4l—丙氨酸對(duì)鹵代過氧化物酶殺死其它微生物的影響效果根據(jù)實(shí)施例2的步驟，每次使用0(對(duì)照)或10μmol/ml的l—丙氨酸和2，10或50pmol的髓過氧化物酶或嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶作用于這些微生物，測(cè)定l—丙氨酸對(duì)鹵代過氧化物酶作用于串珠鐮孢、深紅色發(fā)癬菌(Tricophyton rubrum)和新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)滅菌活性的影響效果。結(jié)果示于下表11(串珠鐮孢，ATCC#38159)，表12(深紅色發(fā)癬菌，ATCC#28188，18753和18758)和表13(新型隱球酵母，ATCC#14115)
表11鹵代過氧化物酶殺死串珠鐮孢l—丙氨酸串珠鐮孢鹵代過氧化物酶 葡萄糖氧化酶 μmol/測(cè)試 ATCC#38159無 無 101,720,000無 0.6單位 無1,380,000無 0.6單位 101,760,00050pmol MPO 無 101,640,00050pmol MPO 0.6單位 無 010pmol MPO 0.6單位 無 050pmol MPO 0.6單位 10 010pmol MPO 0.6單位 10 8,00050pmol EPO 無 10 8,00050pmol EPO 0.6單位 無 010pmol EPO 0.6單位 無 02pmol EPO0.6單位 無 O50pmol EPO 0.6單位 10 010pmol EPO 0.6單位 10 02pmol EPO0.6單位 10 0
表12鹵代過氧化物酶殺死發(fā)癬菌鹵代過氧 1—丙氨酸 深紅色發(fā)癬菌 深紅色發(fā)癬菌 深紅色發(fā)癬菌化物酶 葡萄糖氧化酶 μmol/測(cè)試 ATCC#28188 ATCC#18753ATCC#18758無 無 10 1,700,000 200,000 1,440,000無 0.6單位10 1,580,000 276,000128,00050pmol MPO 無 10 2,680,000 192,000720,00050pmol MPO 0.6單位無 1,240,000 132,000414,00050pmol MPO 0.6單位10 84,000 18,000 010pmol MPO 0.6單位10184,000 62,000 02pmol MPO 0.6單位10 1,380,000 310,0004,00050pmol EPO 無 10 3,600,000 332,000 1,800,00053pmol EPO 0.6單位無 1,180,000 22,000244,00050pmol EPO 0.6單位10 0 0 010pmol EPO 0.6單位10 0 0 02pmol EPO 0.6單位10 0 0 0
表13鹵代過氧化物酶殺死新型隱球酵母l—丙氨酸 CFU(新型隱球酵母)鹵代過氧化物酶葡 萄糖氧化酶 μmol/測(cè)試ATCC#14115)無 無10960,000無0.6單位 無680,000無0.6單位 10480,00050pmol MPO 無10480,00050pmol MPO 0.6單位 無480,00050pmol MPO 0.6單位 10440,00010pmol MPO 0.6單位 10860,0002pmol MPO0.6單位 10220,00050pmol EPO 無10660,00050pmol EPO 0.6單位 無460,00050pmol EPO 0.6單位 10 010pmol EPO 0.6單位 10 02pmol EPO 0.6單位 10640,000
如表11所示，存在或不存在l—丙氨酸時(shí)，髓過氧化物酶和嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶均能高效地殺死串珠鐮孢。事實(shí)上，已發(fā)現(xiàn)EPO在沒有葡萄糖氧化酶時(shí)是有效的。如表12所示，在l—丙氨酸存在時(shí)用嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶可徹底殺死發(fā)癬菌，而用髓過氧化物酶殺菌可獲得顯著的增強(qiáng)效果。
如表13所示，l—丙氨酸也可顯著增強(qiáng)嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶殺死新型隱球酵母的效果，而對(duì)髓過氧化物酶的活性有一些增強(qiáng)效果。
實(shí)施例5膽固醇氧化酶濃度對(duì)氧化酶—鹵代過氧化物酶抗白色假絲酵母的滅菌作用的影響效果根據(jù)實(shí)施例1的方法步驟測(cè)定膽固醇氧化酶濃度對(duì)氧化酶—鹵代過氧化物酶抗白色假絲酵母的滅菌作用的影響效果，不同的是，每次試驗(yàn)含有所示出的來自紅粉諾卡氏菌(0.1單位＝4μg)不同量的膽固醇氧化酶，50mM乙酸鹽緩沖液中的10pmol(1.4μg)的豬MPO(ExOxEmis，Inc.，San Antonio，Texas，U.S.A.，Lot#1899201)或10pmol(0.7μg)豬EPO(ExOxEmis，Inc.，San Anto-nio，Texas，U.S.A.，Lot#1929201)，緩沖液中含100mEq/LCl-，1mEq/L Br-和1mM l—丙氨酸。以50mM MOPS作為緩沖液，pH為6.7。最終懸浮液含8.5％乙醇中的7mM(7μmol/ml)膽固醇。終體積為1ml。37℃保溫2小時(shí)后，微生物在沙氏葡糖瓊脂上鋪平板。計(jì)數(shù)菌落形成單元(CFU)，結(jié)果示于表14。
表14膽固醇氧化酶的濃度對(duì)氧化酶—鹵代過氧化物酶的抗白色假絲酵母的殺微生物作用的影響效果膽固醇 鹵代過氧微生物 氧化酶化物酶 CFU白色假絲酵母無無 400,000白色假絲酵母 0.1 單位無 480,000白色假絲酵母 0.1 單位 10pmol MPO 420,000白色假絲酵母 0.1 單位 10pmol MPO 0白色假絲酵母 0.05 單位 10pmol MPO 0白色假絲酵母 0.025單位 10pmol MPO 0白色假絲酵母 0.013單位 10pmol MPO 76,000白色假絲酵母無 10pmol MPO 560,000白色假絲酵母 0.1 單位 10pmol EPO 400,000白色假絲酵母 0.1 單位 10pmol EPO 0白色假絲酵母0.05 單位 10pmol EPO 0白色假絲酵母 0.025 單位 10pmol EPO 200白色假絲酵母 0.013 單位 10pmol EPO 180,000白色假絲酵母無 10pmol EPO 360,000表示50mM乙酸鹽緩沖液不含l—丙氨酸如表14所示，使用0.025單位的膽固醇氧化酶加上10pmolMPO和1mM l—丙氨酸能完全殺死白色假絲酵母。當(dāng)l—丙氨酸不存在時(shí)，觀察到不能用0.1單位的膽固醇氧化酶和10pmol MPO殺死酵母。當(dāng)用鹵代過氧化物酶替代EPO時(shí)，可得到類似的結(jié)果。
實(shí)施例6膽固醇氧化酶濃度對(duì)氧化酶—鹵代過氧化物酶抗細(xì)菌的殺微生物作用的影響效果使用大腸桿菌代替實(shí)施例5中的白色假絲酵母，根據(jù)實(shí)施例5的步驟進(jìn)行試驗(yàn)。每次試驗(yàn)含有所示量的來自紅粉諾卡氏菌(0.1單位＝4μg)的膽固醇氧化酶，10pmol(1.4μg)的豬MPO(ExOx-Emis，Inc.，San Antonio，Texas，U.S.A.，Lot#1899201)或10pmol(0.7μg)豬EPO(ExOxEmis，Inc.，San Antonio，Texas，U.S.A.，Lot#1929201)的50mM乙酸鹽緩沖液，緩沖液中含100mEq/L Cl-，1mEq/L Br-和1mMl—丙氨酸。以50mM MOPS作緩沖液，pH為6.7。終懸浮液含7mM(7μmol/ml)膽固醇的8.5％乙醇溶液。終體積為1ml。37℃保溫2小時(shí)后，微生物在酪蛋白胰蛋白酶解物大豆瓊脂上鋪平板。計(jì)數(shù)菌落形成單元(CFU)，結(jié)果示于下表15。
表15膽固醇氧化酶的濃度對(duì)氧化酶—鹵代過氧化物酶抗大腸桿菌殺微生物作用的影響效果膽固醇鹵代過氧微生物氧化酶化物酶 CFU大腸桿菌無無 13,500,000大腸桿菌0.1 單位 無 2,300,000大腸桿菌0.1 單位 10pmol MPO 0大腸桿菌0.1 單位 10pmol MPO 0大腸桿菌0.05 單位 10pmol MPO 0大腸桿菌0.025單位 10pmol MPO 0大腸桿菌0.013單位 10pmol MPO大腸桿菌無 10pmol MPO 14,000,000大腸桿菌0.1 單位 10pmol EPO 0大腸桿菌0.1 單位 10pmol EPO 0大腸桿菌0.05 單位 10pmol EPO 0大腸桿菌0.025單位 10pmol EPO 0大腸桿菌0.013單位 10pmol EPO 0大腸桿菌 無 10pmol EPO 8,200,000表示50mM乙酸鹽緩沖液中不含l—丙氨酸正如表15所示，在1mM l—丙氨酸不存在或存在時(shí)所有測(cè)試的膽固醇氧化酶濃度(0.0125至0.1單位)均可觀察到MPO和EPO將大腸桿菌完全殺死。對(duì)金黃色葡萄球菌觀察到類似結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)。
實(shí)施例7使用膽堿氧化酶進(jìn)行氧化酶—鹵代過氧化物酶殺死細(xì)菌、酵母和真菌孢子采用實(shí)施例1的步驟，所不同的是采用0.2單位的膽堿氧化酶作為產(chǎn)生H2O2的氧化酶。如所示，反應(yīng)含有0.2單位(即20μg)的來自產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes sp.)的膽堿氧化酶，20pmol(2.8μg)豬MPO(ExOxEmis，Inc.，San Antonio，Texas，U.S.A.，Lot#1899201)或20pmol(1.5μg)豬EPO(ExOxEmis，Inc.，San Anto-nio，Texas，U.S.A.，Lot#1929201)的50mM乙酸鹽緩沖液，緩沖液中含100mEq/L Cl-和1mEq/L Br-。以50mM MOPS作為緩沖液，pH為7。膽堿終濃度為150mM(150μmol/ml)。終體積為1ml。22℃保溫4小時(shí)后，對(duì)微生物鋪平板(金黃色葡萄球菌鋪于酪蛋白胰蛋白酶解物大豆瓊脂；白色假絲酵母和煙曲霉鋪平板于沙氏葡糖瓊脂)。計(jì)數(shù)菌落形成單元(CFU)，結(jié)果示于表16。
表16l—丙氨酸對(duì)膽堿氧化酶—鹵代過氧化物酶殺死金黃色葡萄球菌、白色假絲酵母和煙曲霉孢子的影響效果膽堿氧鹵代過氧微生物 化酶 化物酶CFU金黃色葡萄球菌 無 無 19,400,000金黃色葡萄球菌0.2單位 無 13,800,000金黃色葡萄球菌0.2單位無 15,400,000金黃色葡萄球菌0.2單位20pmol MPO 0金黃色葡萄球菌0.2單位 20pmol MPO 0金黃色葡萄球菌0.2單位20pmol EPO 0金黃色葡萄球菌0.2單位 20pmol EPO 0白色假絲酵母 無 無1,460,000白色假絲酵母 0.2單位 無1,200,000白色假絲酵母 0.2單位無1,180,000白色假絲酵母 0.2單位20pmol MPO 1,120,000白色假絲酵母 0.2單位 20pmol MPO 0白色假絲酵母 0.2單位20pmol EPO640,000白色假絲酵母 0.2單位 20pmol EPO 0煙曲霉 無 無1,260,000煙曲霉0.2單位 無1,260,000煙曲霉0.2單位無1,300,000煙曲霉0.2單位20pmol MPO800,000煙曲霉0.2單位 20pmol MPO 0煙曲霉0.2單位20pmol EPO740,000煙曲霉0.2單位 20pmol EPO 0表示50mM乙酸鹽緩沖液含1mMl-丙氨酸實(shí)施例8使用乳酸氧化酶進(jìn)行氧化酶—鹵代過氧化物酶殺死細(xì)菌、酵母和真菌孢子除了采用0.2單位的乳酸氧化酶作為產(chǎn)生H2O2的氧化酶外，按實(shí)施例7的方法步驟進(jìn)行試驗(yàn)。如所示，反應(yīng)含有0.2單位(即5μg)的來自片球菌屬(Pediococcus sp.)的乳酸氧化酶，20pmol(2.8μg)豬MPO(ExOxEmis，Inc.，San Antonio，Texas，U.S.A.，Lot#1899201)或20pmol(1.5μg)豬EPO(ExOxEmis，Inc.，SanAntonio，Texas，U.S.A.，Lot#1929201)的50mM乙酸鹽緩沖液，緩沖液含100mEq/L Cl-和1mEq/L Br-。以50mM MOPS作為緩沖液，pH為7。乳酸終濃度為150mM(150μmol/ml)。終體積為1ml。保溫4小時(shí)(22℃)后，對(duì)微生物鋪平板。金黃色葡萄球菌鋪于酪蛋白胰蛋白酶解物大豆瓊脂，白色假絲酵母和煙曲霉鋪于沙氏葡糖瓊脂。計(jì)數(shù)菌落形成單元(CFU)，結(jié)果示于表17。
表17l—丙氨酸對(duì)乳酸氧化酶—鹵代過氧化物酶殺死金黃色葡萄球菌、白色假絲酵母和煙曲霉孢子的影響效果乳酸氧鹵代過氧微生物 化酶 化物酶CFU金黃色葡萄球菌 無 無 19,400,000金黃色葡萄球菌0.2單位 無 23,400,000金黃色葡萄球菌0.2單位無 24,400,000金黃色葡萄球菌0.2單位20pmol MPO 0金黃色葡萄球菌0.2單位 20pmol MPO 0金黃色葡萄球菌0.2單位20pmol EPO 0金黃色葡萄球菌0.2單位 20pmol EPO 0白色假絲酵母無 無1,460,000白色假絲酵母 0.2單位 無1,480,000白色假絲酵母 0.2單位無1,020,000白色假絲酵母 0.2單位20pmol MPO 1,380,000白色假絲酵母 0.2單位 20pmol MPO 1,500,000白色假絲酵母 0.2單位20pmol EPO 1,400,000白色假絲酵母 0.2單位 20pmol EPO 1,180,000煙曲霉 無 無1,260,000煙曲霉0.2單位 無 860,000煙曲霉0.2單位無 760,000煙曲霉0.2單位20pmol MPO740,000煙曲霉0.2單位 20pmol MPO400,000煙曲霉0.2單位20pmol EPO760,000煙曲霉0.2單位 20pmol EPO 18,000表示50mM乙酸鹽緩沖液中含1mM l—丙氨酸實(shí)施例9使用乙醇氧化酶進(jìn)行氧化酶—鹵代過氧化物酶殺死細(xì)菌、酵母和真菌孢子除了將0.2單位的乙醇氧化酶用作產(chǎn)生H2O2的氧化酶外，根據(jù)實(shí)施例7的方法步驟進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)所示，反應(yīng)含有0.2單位(即21μg)的來自博伊丁氏假絲酵母(Candida boidinii)的乙醇氧化酶，20pmol(2.8μg)豬MPO(ExOxEmis，Inc.，San Antonio，Texas，U.S.A.，Lot#1899201)或20pmol(1.5μg)豬EPO(ExOxEmis，Inc.，San Antonio，Texas，U.S.A.，Lot#1929201)的50mM乙酸鹽緩沖液，緩沖液含100mEq/L Cl-和1mEq/L Br-。以50mMMOPS作為緩沖液，pH為7。乙醇的終濃度為150mM(150μmol/ml)。終體積為1ml。22℃保溫4小時(shí)后，將微生物鋪平板。金黃色葡萄球菌鋪于酪蛋白胰蛋白酶解物大豆瓊脂，白色假絲酵母和煙曲霉鋪于沙氏葡糖瓊脂。計(jì)數(shù)菌落形成單元(CFU)，結(jié)果示于表18。
表18l—丙氨酸對(duì)乙醇氧化酶—鹵代過氧化物酶殺死金黃色葡萄球菌、白色假絲酵母和煙曲霉孢子的影響效果乙醇氧 鹵代過氧微生物化酶化物酶CFU金黃色葡萄球菌 無 無 19,400,000金黃色葡萄球菌0.2單位 無 21,200,000金黃色葡萄球菌0.2單位 無 19,400,000金黃色葡萄球菌0.2單位 20pmol MPO840,000金黃色葡萄球菌0.2單位 20pmol MPO760,000金黃色葡萄球菌0.2單位 20pmol EPO 0金黃色葡萄球菌0.2單位 20pmol EPO 0白色假絲酵母 無 無 1,460,000白色假絲酵母 0.2單位 無 1,100,000白色假絲酵母 0.2單位 無 1,460,000白色假絲酵母 0.2單位 20pmol MPO 1,180,000白色假絲酵母 0.2單位 20pmol MPO 1,280,000白色假絲酵母 0.2單位 20pmol EPO 1,220,000白色假絲酵母 0.2單位 20pmol EPO 1,160,000煙曲霉 無 無 1,260,000煙曲霉0.2單位 無620,000煙曲霉0.2單位 無700,000煙曲霉0.2單位 20pmol MPO 1,560,000煙曲霉0.2單位 20pmol MPO320,000煙曲霉0.2單位 20pmol EPO 1,040,000煙曲霉0.2單位 20pmol EPO 16,000表示50mM乙酸鹽緩沖液中含1mM l—丙氨酸在l—丙氨酸存在或不存在時(shí)，膽固醇氧化酶(表1)，膽堿氧化酶(表16)和乳酸氧化酶(表17)與MPO或EPO結(jié)合均可將金黃色葡萄球菌完全殺死。乙醇氧化酶和EPO結(jié)合可將微生物完全殺死，但和MPO結(jié)合時(shí)，無論有無l—丙氨酸只部分殺死微生物。
以膽固醇氧化酶(表1)可完全殺死白色假絲酵母，以膽堿氧化酶(表16)加MPO或EPO僅在l—丙氨酸存在時(shí)才可完全殺死。l—丙氨酸不存在時(shí)，殺微生物作用限于約50％的殺死率。在l—丙氨酸存在或不存在時(shí)，乳酸氧化酶(表17)和乙醇氧化酶(表18)在促使MPO或EPO殺滅白色假絲酵母中均無效果。
在l—丙氨酸存在時(shí)，膽固醇氧化酶(表1)和膽堿氧化酶(表16)幫助MPO或EPO完全殺死煙曲霉孢子。但是，在l—丙氨酸不存在時(shí)僅部分殺死。雖然不完全，但在l—丙氨酸存在時(shí)，乳酸氧化酶(表17)和乙醇氧化酶(表18)與EPO可產(chǎn)生大于90％的孢子殺死率，與MPO可產(chǎn)生大于50％的孢子殺死率。在l-丙氨酸不存在時(shí)，乳酸氧化酶和乙醇氧化酶均不幫助MPO或EPO殺死煙曲霉孢子。
實(shí)施例10潛在激活物對(duì)膽固醇氧化酶—鹵代過氧化物酶殺死細(xì)菌和曲霉孢子的影響效果微生物文獻(xiàn)中描述了一些可充當(dāng)孢子萌發(fā)和形成營(yíng)養(yǎng)體的激活劑的物質(zhì)。已有報(bào)道說分生孢子的萌發(fā)需要葡萄糖、磷酸鹽和氨基酸。l—脯氨酸或l—丙氨酸符合這種對(duì)氨基酸的要求。其它氨基酸和維生物的效果要差些(Yanigita，1957，Arch Mikrobiol 26329)。
已報(bào)道一些其它有機(jī)化合物能刺激萌發(fā)。這些化合物包括苯乙醇(Lingappa等，1970，Arch Mikrobiol 7297)，香豆素(Weber和Hess，1974，The Fungal Spore，P.178，Wiley—Interscience)和糠醛衍生物(Sussman等，1959，Mycologia 51237)。
l—丙氨酸和l—脯氨酸對(duì)膽固醇氧化酶—鹵代過氧化物酶殺死蠟狀芽孢桿菌(Baccillus Cereus)內(nèi)生孢子的影響效果含0.1單位(即4μg)來自紅粉諾卡氏菌的膽固醇氧化酶，20pmol(2.8μg)豬MPO(ExOxEmis，Inc.，San Antonio，Texas，U.S.A.，Lot#1899201)或20pmol(1.5μg)豬EPO(ExOxEmis，Inc.，San Anto-nio，Texas，U.S.A.，Lot#1929201)和所示量的l—丙氨酸或l-脯氨酸的50mM乙酸鹽緩沖液，緩沖液含100mEq/L Cl-和1mEq/L Br-。加入50mM MOPS緩沖液，調(diào)pH為7。膽固醇的終濃度為在8.5％乙醇中5mM(5μmol/ml)。終體積為1ml。所示保溫(22℃下)時(shí)間后，將存活的微生物在酪蛋白胰蛋白酶解物大豆瓊脂上鋪平板。計(jì)數(shù)菌落形成單元(CFU)，結(jié)果示于表19。
表19l—丙氨酸和l—脯氨酸對(duì)膽固醇氧化酶—鹵代過氧化物酶抗蠟狀芽孢桿菌孢子的殺微生物作用的影響效果存活的蠟狀芽孢桿菌處理 CFU(暴露后的時(shí)間，以小時(shí)計(jì))鹵代過氧 活化物化物酶 0.5小時(shí) 1小時(shí) 1.5小時(shí) 2小時(shí)3小時(shí)無 無 900,000 460,000 720,000 720,000 520,000無 l—丙氨酸，10μmol 860,000 660,000 560,000 520,000 400,000無 l—脯氨酸，10μmol 820,000 760,000 620,000 320,000 540,000MPO，20pmol 無 00000MPO，20pmol l—丙氨酸，10μmol00000MPO，20pmol l—脯氨酸，10μmol00000EPO，20pmol 無 2,0002,000000EPO，20pmol l—丙氨酸，10μmol2,0000000EPO，20pmol l—脯氨酸，10μmol02,000000
保溫30分鐘后，以l—丙氨酸或l—脯氨酸作活化劑時(shí)，帶MPO(20pmol)的膽固醇氧化酶(0.1單位)可將蠟狀芽孢桿菌完全殺死。然而，不加任何增強(qiáng)物質(zhì)也可全部殺死微生物。雖然需要一更長(zhǎng)的保溫期，使用帶EPO的膽固醇氧化酶也能獲得類似的結(jié)果。在不存在鹵代過氧化物酶時(shí)，加入l-丙氨酸或l-脯氨酸不會(huì)顯著提高膽固醇氧化酶的滅菌活性。這些細(xì)菌內(nèi)生孢子對(duì)于氧化酶—鹵代過氧化物酶滅菌的直接敏感性很強(qiáng)，以致于在早期30分鐘所觀察到的全部殺死情況中l(wèi)—丙氨酸或l—脯氨酸的任何效果均被遮掩掉了。
根據(jù)前述方法步驟測(cè)定l—丙氨酸，l—脯氨酸、香豆素和苯乙醇對(duì)膽固醇氧化酶—鹵代過氧化物酶殺死煙曲霉孢子的影響效果，所不同的是在反應(yīng)中含有0.1單位(即4μg)來自紅粉諾卡氏菌的膽固醇氧化酶，20pmol(2.8μg)的豬MPO(ExOxEmis，Inc.，San An-tonio，Texas，U.S.A.，Lot#1899201)或20pmol(1.5μg)豬EPO(ExOxEmis，Inc.，San Antonio，Texas，U.S.A.，Lot#1929201)和所示量的要測(cè)試物質(zhì)的50mM乙酸鹽緩沖液，緩沖液含100mEq/L Cl-和1mEq/L Br-。加入50mM MOPS緩沖液調(diào)節(jié)pH為7。膽固醇的終濃度為在8.5％乙醇中5mM(5μmol/ml)。終體積為1ml。經(jīng)所示的保溫(37℃)時(shí)間后，將煙曲霉在沙氏葡糖瓊脂上鋪平板。計(jì)數(shù)菌落形成單元(CFU)，結(jié)果示于表20。PEA為苯乙醇的縮略語。在所測(cè)試的4個(gè)潛在的活化物質(zhì)時(shí)，只有l(wèi)—丙氨酸增強(qiáng)帶EPO或MPO的膽固醇氧化酶的殺菌能力。鹵代過氧化物酶不存在時(shí)，這些活化劑都不能增強(qiáng)膽固醇氧化酶的殺菌能力。
表20l—丙氨酸、l—脯氨酸、香豆素和苯乙醇對(duì)膽固醇氧化酶—鹵代過氧化物酶抗煙曲霉孢子的殺微生物作用的影響效果存活的煙曲霉處理CFU(暴露后的時(shí)間，以小時(shí)計(jì))鹵代過氧 活化物化物酶 1小時(shí) 1.5小時(shí) 2小時(shí) 3小時(shí) 4小時(shí)無 無 710,000 760,000 530,000 340,000 240,000無 l—丙氨酸，10μmol780,000 720,000 500,000 340,000 340,000無 l—脯氨酸，10μmol900,000 540,000 560,000 400,000 200,000無 香豆素， 1μmol320,000 700,000 480,000 240,000 500,000無PEA，5μmol 380,000 600,000 360,000 440,000 480,000MPO，20pmol無 520,000 940,000 500,000 410,000 550,000MPO，20pmol l—丙氨酸，10μmol 00 0 00MPO，20pmol l—脯氨酸，10μmol860,000 880,000 760,000 700,000 260,000MPO，20pmol 香豆素， 1μmol740,000 620,000 500,000 620,000 660,000MPO，20pmol PEA，5μmol 500,000 600,000 420,000 420,000 520,000EPO，20pmol無 920,000 690,000 840,000 710,000 760,000EPO，20pmol l—丙氨酸，10μmol 00 0 00EPO，20pmol l—脯氨酸，10μmol 1,100,000 840,000 1,000,000 500,000 520,000EPO，20pmol 香豆素， 1μmol760,000 780,000 420,000 340,000 300,000EPO，20pmol PEA，5μmol 780,000 600,000 480,000 460,000 320,000
在制劑中加入l—丙氨酸能大大增加氧化酶—鹵代過氧化物酶抗孢子和營(yíng)養(yǎng)體的殺真菌作用。l—丙氨酸顯示出可提供萌發(fā)和生長(zhǎng)所需的胺氮，CO2，乙酰—CoA和還原的等效物，并因此激活真菌對(duì)鹵代過氧化物酶的作用。如前所述的以鹵代過氧化物酶—葡萄糖氧化酶殺死微生物的情況(表3)，l—脯氨酸沒有作為增強(qiáng)物的效果。
實(shí)施例11由(1)膽固醇氧化酶—鹵代過氧化物酶和(2)固體形式的膽固醇組成的二元滅菌組合物膽固醇氧化酶—鹵代過氧化物酶體系由一種二元制劑構(gòu)成，含有(1)含膽固醇氧化酶—鹵代過氧化物酶加上抗菌活性增強(qiáng)劑l—丙氨酸的溶液和(2)固體片型的膽固醇。膽固醇片的制備是通過將膽固醇溶于醚，將該膽固醇溶液噴于表面上，并使醚揮發(fā)。將得到的膽固醇片切成合適大小的約10mg的長(zhǎng)方形。
膽固醇片(約10mg/片)被置于含煙曲霉孢子的試管中。含或者不含MPO或EPO的膽固醇氧化酶加入該試管以引發(fā)殺真菌作用。用和不用l—丙氨酸，用和不用乙醇進(jìn)行體系測(cè)試。加入乙醇以測(cè)定其促使膽固醇溶解的能力。增大的膽固醇溶解性意味著可獲得增多的作為氧化酶底物的膽固醇。一旦引發(fā)反應(yīng)，使體系保溫于室溫(22℃)，時(shí)間間隔從30分鐘至4小時(shí)。反應(yīng)含0.1單位(即4μg)的來自紅粉諾卡氏菌的膽固醇氧化酶，10pmol(1.4μg)豬MPO(Ex-OxEmis，Inc.，San Antonio，Texas，U.S.A.，Lot#1899201)或10pmol(0.7μg)豬EPO(ExOxEmis，Inc.，San Antonio，Texas，U.S.A.，Lot#1929201)的50mM乙酸鹽緩沖液，緩沖液含100mEq/L Cl-和1mEq/L Br-。加入50mM MOPS緩沖液調(diào)節(jié)pH為7。底物膽固醇呈固體片型式(約10mg)。如所示，反應(yīng)含10μmol/mll—丙氨酸和10％乙醇。終體積為1ml。經(jīng)所示保溫(22℃)時(shí)間后，將煙曲霉在沙氏葡糖瓊脂上鋪平板。結(jié)果用所計(jì)數(shù)的菌落形成單元(CFU’s)表示。Nd表示未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果示于表21。
表21l—丙氨酸對(duì)膽固醇氧化酶—鹵代過氧化物酶抗煙曲霉孢子的殺微生物作用的影響效果，使用固體膽固醇作為底物，乙醇存在和不存在處理 存活的煙曲霉鹵代過氧 CFU(暴露后的時(shí)間，以小時(shí)計(jì))化物酶1—丙氨酸乙醇 0.5小時(shí)1小時(shí) 2小時(shí) 4小時(shí)無 無 10％ 960,000 1,900,000 960,000800,000無 10μmol 10％1,180,000 1,220,000 820,000158,000MPO，10pmol 無 10％ 920,000 1,540,000 1,120,000 1,020,000MPO，10pmol10μmol 10％ 82,000 0 0 0EPO，10pmol 無 10％1,120,000 3,000,000 3,040,000940,000EPO，10pmol10μmol 10％0 0 0 0無 無 無 ND 2,300,000 ND 980,000無 10μmol無 ND 1,980,000 ND1,900,000MPO，10pmol 無 無 ND 2,380,000 ND1,860,000MPO，10pmol10μmol無 ND 1,640,000 ND 10,000EPO，10pmol 無 無 ND 2,620,000 ND1,340,000EPO，10pmol10μmol無 ND 1,340,000 ND0
如表21所示，在乙醇和l—丙氨酸存在時(shí)，膽固醇氧化酶—MPO制劑在30分鐘時(shí)可殺死10倍的孢子，在1，2和4小時(shí)可將孢子全部殺死。在有效的MPO依賴型滅菌作用中需要l—丙氨酸。在乙醇和l—丙氨酸存在而鹵代過氧化物酶不存在時(shí)，膽固醇氧化酶效果和緩，但僅在保溫4小時(shí)之后顯示出來。最有效的制劑是有乙醇和l—丙氨酸的膽固醇氧化酶—EPO。在所有測(cè)試間隔期均可全部殺死孢子。
乙醇的參與大大增加了所測(cè)試的所有制劑的有效性。存在10％乙醇時(shí)自發(fā)作用較快且更強(qiáng)。乙醇的這種效果可來自于固體膽固醇增加的溶解性，導(dǎo)致增大的膽固醇氧化酶活性。結(jié)果還顯示出10％的乙醇對(duì)膽固醇氧化酶—鹵代過氧化物酶的作用沒有不利影響。制劑中含有足量的乙醇或其它無毒溶劑還可在沒有膽固醇時(shí)幫助體系保持無菌狀態(tài)并改善反應(yīng)混合物的貯存期限。
根據(jù)前述內(nèi)容，對(duì)本發(fā)明方法和組合物的各種修改和變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。除了現(xiàn)有技術(shù)的范圍外，任一這樣的修改和變化均認(rèn)為屬于附加權(quán)利要求的范圍。
權(quán)利要求
1.一種殺死酵母或孢子微生物或抑制其生長(zhǎng)的方法，它包括，在一種過氧化物和氯化物或溴化物存在時(shí)將微生物與一種鹵代過氧化物酶和至少一種下式抗菌活性增強(qiáng)劑接觸 其中，R1為氫，未被取代的或者羥基或氨基取代的具有1至6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，或者是未被取代的或者羥基或氨基取代的具有7至12個(gè)碳原子的芳烷基，R2為氫或具有1至6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中鹵代過氧化物酶選自髓過氧化物酶，嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶及其結(jié)合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中抗菌活性增強(qiáng)劑是一種α—氨基酸，選自甘氨酸和丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的l或d對(duì)映體及其烷基酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中鹵代過氧化物酶為髓過氧化物酶，鹵化物為氯化物或溴化物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中鹵代過氧化物酶是嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶，鹵化物為溴化物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中微生物與含有至少0.01pmol/ml的鹵代過氧化物酶和至少0.005μmol/ml的抗菌活性增強(qiáng)劑的液體溶液接觸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中液體溶液含0.1pmol/ml至500pmol/ml的鹵代過氧化物酶和0.05μmol/ml至50μmol/ml的抗菌活性增強(qiáng)劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中每ml溶液含有0.5pmol至50pmol的鹵代過氧化物酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中液體溶液還含有一種過氧化物或一種能產(chǎn)生過氧化物的試劑。
10.一種殺死酵母或孢子微生物或者抑制其生長(zhǎng)的組合物，包含一種鹵代過氧化物酶和至少一種下式的抗菌活性增強(qiáng)劑 其中，R1為氫，未被取代的或者羥基或氨基取代的具有1至6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，或者是未被取代的或者羥基或氨基取代的具有7至12個(gè)碳原子的芳烷基，R2為氫或具有1至6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的組合物，其中鹵代過氧化物酶為髓過氧化物酶或嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的組合物，其中抗菌活性增強(qiáng)劑為一種α—氨基酸，選自甘氨酸和丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，賴氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸的l或d對(duì)映體及其烷基酯。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的組合物，其中鹵代過氧化物酶為髓過氧化物酶。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其在液體載體中含有至少0.01pmol/ml的髓過氧化物酶。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的組合物，其含有0.1pmol/ml至500pmol/ml的髓過氧化物酶。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的組合物，其含有0.5pmol/ml至50pmol/ml的髓過氧化物酶。
17.根據(jù)權(quán)利要求12的組合物，其在液體載體中含至少0.005μmol/ml的抗菌活性增強(qiáng)劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的組合物，其含有0.05μmol/ml至50μmol/ml的抗菌活性增強(qiáng)劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求11的組合物，其中鹵代過氧化物酶為嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶，鹵化物為溴化物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其在液體載體中含至少0.01pmol的嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其在液體載體中含0.1pmol至500pmol/ml的嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的組合物，其含有0.5pmol/ml至50pmol/ml的嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶。
23.根據(jù)權(quán)利要求20的組合物，其還含有10nmol/ml至10μmol/ml的溴化物。
24.根據(jù)權(quán)利要求10的組合物，其還含有過氧化氫或一種在氧化酶的底物存在時(shí)能產(chǎn)生過氧化物的氧化酶。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的組合物，其含有產(chǎn)生過氧化物的氧化酶，當(dāng)存在一種氧化酶的底物時(shí)，氧化酶每分鐘能產(chǎn)生每ml100pmol至50μmol的過氧化物。
26.一種消毒—滅菌溶液，其含有權(quán)利要求10的一種組合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的消毒—滅菌溶液，其在液體載體中含有0.1pmol/ml至500pmol/ml的髓過氧化物酶，嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶或其結(jié)合物，一種0.005μmol/ml至50μmol/ml的α—氨基酸，選自甘氨酸和丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的l或d對(duì)映體及其烷基酯。
28.一種眼藥溶液，其含有權(quán)利要求10的組合物。
29.權(quán)利要求8的眼藥溶液，其在液體載體中含0.1pmol/ml至500pmol/ml的髓過氧化物酶，嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶或其結(jié)合物，一種0.005μmol/ml至50μmol/ml的α—氨基酸，選自甘氨酸和丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的l或d對(duì)映體及其烷基酯。
全文摘要
本文提供了在過氧化物和氯化物或溴化物存在時(shí)，用一種鹵代過氧化物酶和至少一種抗菌活性增強(qiáng)劑殺死酵母或孢子微生物或者抑制其生長(zhǎng)的方法和組合物。適宜的抗菌活性增強(qiáng)劑包括某些α-氨基酸，并優(yōu)選式(I)所示的化合物，其中R
文檔編號(hào)A61L2/18GK1128044SQ94192969
公開日1996年7月31日 申請(qǐng)日期1994年8月1日 優(yōu)先權(quán)日1993年8月2日
發(fā)明者R·C·艾倫 申請(qǐng)人:埃歐艾米斯公司