專利名稱：低聚糖在預(yù)防和治療組織老化中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療或預(yù)防老化現(xiàn)象的組合物，它包含在非還原端具有D-半乳糖的低聚糖或低聚糖的衍生物，這些衍生物發(fā)揮成纖維細(xì)胞彈性蛋白酶的合成和/或分泌調(diào)節(jié)劑的作用。
已知在皮膚結(jié)締組織產(chǎn)生具有生物合成活性的成纖維細(xì)胞，它從簡(jiǎn)單的成分合成細(xì)胞外基質(zhì)(Labat—Robert，J.，等，EeseviesScience Pubeisher B.V，248386—393，1990)。
細(xì)胞外基質(zhì)是由四種大分子組成的。這些大分子是構(gòu)成皮膚纖維性物質(zhì)的膠原蛋白和彈性蛋白，提供細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間粘結(jié)力并提供彈性組織微原纖維性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)糖蛋白和提供組織水合作用并控制分子流動(dòng)和相互作用的含蛋白多糖。
彈性蛋白在成纖維細(xì)胞膜上具有復(fù)雜的受體，它包含67KD亞單位，該亞單位包括碳水化合物的結(jié)合部位。
A.Hinek等(Science239)1539—1541 1988)指出，當(dāng)將彈性蛋白受體的67KD亞單位固定在其中配位體是由彈性蛋白或彈性蛋白的肽組成的親合柱上時(shí)，乳酸(1mM)能洗脫該67KD蛋白質(zhì)，并且半乳糖代替67KD蛋白質(zhì)與彈性蛋白結(jié)合是同樣有效的。
另一方面，不含半乳糖的低聚糖不能洗脫結(jié)合到彈性蛋白親和柱上的67KD蛋白質(zhì)。
由此作者推斷彈性蛋白受體是具有與半乳糖苷結(jié)合性質(zhì)的蛋白質(zhì)。
也已知，在溶解或不溶解狀態(tài)的彈性蛋白都易于被內(nèi)蛋白酶，尤其是彈性蛋白酶水解。
不同類的蛋白酶和內(nèi)肽酶已被詳細(xì)說(shuō)明并且有關(guān)這些不同的內(nèi)肽酶及其性質(zhì)的評(píng)論已由Barretl等1977(Barret，A.J.Eds.，North Holland，Amsterdam)公開。
彈性蛋白酶是蛋白酶和內(nèi)肽酶，現(xiàn)開始徹底研究它的性質(zhì)。下列文章(其內(nèi)容引入本文供參考)描述了這些性質(zhì)—Bieth J.(1978)“彈性蛋白酶結(jié)構(gòu)，功能和病學(xué)作用”。Front of Matrix Bioe.Cis1—82和—Homsy，R.等(1988)“人皮膚成纖維細(xì)胞彈性蛋白酶活性的特征”。Journ.Invest.Dermatol.91472—477。
酶的名稱為彈性蛋白酶不表示該蛋白質(zhì)酶是對(duì)彈性蛋白特異性的。事實(shí)上，彈性蛋白酶水解大量蛋白質(zhì)物，并且例如，白細(xì)胞彈性蛋白酶實(shí)際上能夠粘著結(jié)締組織的所有大分子(Rokert，L.1988，Path.Bioe.；361101—1107)。
這些彈性蛋白酶型的蛋白酶能夠降解組織的彈性纖維(此外)和其它組分如膠原纖維或糖蛋白，例如粘連蛋白。這種現(xiàn)象已在細(xì)胞老化現(xiàn)象中描述；大量研究表明，在老化過(guò)程中，這種酶的合成和蓄積增加，并尤其介紹下列研究—Labat—Rokert，J.等人，Ann。New York Acad。Sci.(1992)，67316—22，—Rokert，J.Sang Thrombose Vaisseaux(1991)，3267—330，—Rokert，L.Pathol.Biol.(1988)，361101—1107。
這些相同的蛋白酶和內(nèi)肽酶也能降解其它器官的基質(zhì)組分，例如肺的彈性蛋白，因此導(dǎo)致肺氣腫，或者能降解動(dòng)脈的彈性層和靜脈的彈性蛋白和膠原蛋白，因此促進(jìn)血管性疾病的發(fā)展動(dòng)脈粥樣硬化和動(dòng)脈硬化以及靜脈曲張。所有這些病變，其發(fā)病率和嚴(yán)重性隨著年齡增大而增加。
其它同種內(nèi)肽酶(Zn金屬內(nèi)肽酶)能將不活潑的血管緊張肽I激活為血管緊張肽II，它能觸發(fā)嚴(yán)重的動(dòng)脈高血壓。
最后，腦啡肽酶(相同種類的其它Zn內(nèi)肽酶)干擾腦啡肽的功能并且依賴其過(guò)剩的程度可導(dǎo)致腦動(dòng)能紊亂。
所有這些內(nèi)肽酶對(duì)不同底物發(fā)揮作用和導(dǎo)致形形色色病變的共同特性是它們具有含Zn的活性部位并都結(jié)合在細(xì)胞膜上。
在下面說(shuō)明中，將討論皮膚成纖維細(xì)胞彈性蛋白酶的情況，但將要介紹的病理生理機(jī)理和治療原則對(duì)上述非限定性列舉的其它內(nèi)肽酶和其它病變同樣有效。
本發(fā)明涉及治療或預(yù)防結(jié)締組織老化現(xiàn)象的組合物，其特征是它們至少含一種具有2—5個(gè)糖苷殘基的低聚糖，或在非還原端含半乳糖的這種低聚糖苷的衍生物。
本發(fā)明涉及一組合物，其特征是當(dāng)?shù)途厶腔蚱溲苌锱c一種與化妝品相容的載體結(jié)合并且優(yōu)選局部給藥時(shí)，該組合物可用于治療或預(yù)防皮膚老化現(xiàn)象。
本發(fā)明也涉及治療或預(yù)防與結(jié)締組織的成纖維性基質(zhì)有關(guān)的加速老化現(xiàn)象的組合物，這種加速老化現(xiàn)象伴隨某種病變，尤其是心血管病變和肺氣腫，所述組合物含有在非還原端具有半乳糖的低聚糖或其衍生物。
參與組合物的治療或預(yù)防皮膚老化現(xiàn)象或與皮膚結(jié)締組織纖維性基質(zhì)有關(guān)的加速老化現(xiàn)象的低聚糖優(yōu)選為乳糖，蜜二糖，水蘇糖或這些糖中一種的衍生物或這些糖的混合物。
參與本發(fā)明組合物的低聚糖衍生物在非還原端都含有半乳糖殘基；它們都屬于下述范疇，其中低聚糖苷符合下列通式半乳糖-n(α或β)-(Hex)n’其中n代表1，2，3，4或6位，Hex代表以α或β構(gòu)型連接的戊糖或己糖，n’為1和5之間的數(shù)；a)—符合下式的糖苷(I)低聚糖苷1-O-R，其中R為具有1—18個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，(II)低聚糖苷1-O-R-O-1-低聚糖苷，其中R＝(CH2)n’，n為2和10之間的數(shù)，b)—符合下式之一的?；匣?，其中低聚糖苷優(yōu)選為乳糖，蜜二糖或水蘇糖—符合下式之一的?；匣?III)低聚糖苷1-NH-CO-R，其中R為具有2—18個(gè)碳原子并包含0，1，或2個(gè)雙鍵的烷基，(IV)低聚糖苷1-NH-CO-R-CO-NH-1-低聚糖苷，其中R-(CH2)n，n為2和8之間的數(shù)，C)—通過(guò)低聚糖苷氧化作用得到的醛糖酸酰化的烷基胺，(V)低聚糖苷-CO-NH-R；其中R的含義與式(HI)相同，
(VI)低聚苷CO-NH-R-NH-CO-低聚糖苷，其中R的含義與式(III)相同，d)—或Schiff堿還原的產(chǎn)物，它是由低聚糖苷與脂族單或二胺形成的，并符合下式之一·(VII)Gal-(Hex)n-XH-HN-R，·(VIII)Gal-(Hex)n-X-HN-R-NH-X-(Hex)n-Gal，其中Hex為己糖或戊糖，n＝0，1或2，X＝1-NH2-己糖酸，并且R的含義與(III)相同。
上述所有這些低聚糖或其衍生物都有共同的特征，即在培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中，彈性蛋白酶的合成和/或分泌至少減少20％。
測(cè)得的這些細(xì)胞的培養(yǎng)基中及細(xì)胞本身中酶的活性減小證明了該作用。
所用的方法在于在標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下培養(yǎng)人皮膚成纖細(xì)胞和通過(guò)比色法，用合成的底物(N-琥珀酰三丙氨酰-對(duì)-硝基苯胺)來(lái)測(cè)定培養(yǎng)物的彈性蛋白酶的活性。
使用這種合成的底物時(shí)，也可能顯示出，彈性蛋白酶型的內(nèi)肽酶的生物合成在成纖維細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)中增加，因此構(gòu)成符合Hayfeick模型(1980，Cell Adding In.〔sic〕Annual Review ofGerontology and Geriatrics；Springer，New York 126—67)的體外老化系統(tǒng)；Labat—Robert J.等(1988，Expert Gerontol.235—18)。
實(shí)質(zhì)上，酶的活性與細(xì)胞膜有關(guān)并且當(dāng)成纖維細(xì)胞在可溶性成分中受胰蛋白酶作用后能重新恢復(fù)。
在培養(yǎng)基中能恢復(fù)總活性的2—10％并且剩余部分與細(xì)胞殘余物有關(guān)并能用洗滌劑加溶。
本發(fā)明涉及使用上述低聚糖或其衍生物通過(guò)存在于人成纖維細(xì)胞，特別是皮膚成纖維細(xì)胞上的彈性蛋白受體，來(lái)控制從成纖維細(xì)胞來(lái)生物合成和分泌彈性蛋白酶型的蛋白酶，這種控制具有預(yù)防或治療皮膚老化現(xiàn)象，或(尤其)因含過(guò)量的內(nèi)肽酶引起病變所導(dǎo)致的加速老化現(xiàn)象的作用。
結(jié)果，如上所述，彈性蛋白受體的67KD亞單位具有特異性地與乳糖或在末端含半乳糖的低聚或多糖結(jié)構(gòu)反應(yīng)的結(jié)構(gòu)(Labat—Robert，J.等，如上引用，和Mecham，R.P.等1989，Biochem.283716—3722)。
如后面實(shí)施例中所述，也可以按化學(xué)方法來(lái)合成參與本發(fā)明組合物中的低聚糖衍生物，或從生物基質(zhì)，特別是奶，血液或胎盤中提取，或者作為可供選擇的替代方式從天然產(chǎn)物如含半乳糖苷的蜂蜜中提取，這些都是制備本發(fā)明組合物的補(bǔ)充內(nèi)容(R.Siddiqui，in Advance in Carbohydrate Chemistry andBiochemistry，EdD.Horton，Vol，49，PP.285—309)。
因此可以按標(biāo)準(zhǔn)方法(Frontiers of Matrix Biology(1985)，Vol.10，S.Kargar Edition)來(lái)提取多糖或其衍生物，然后經(jīng)過(guò)酶降解或化學(xué)水解，最后通過(guò)鹽析或離子交換色譜法或瓊脂糖凝膠色譜法，或通過(guò)任何適宜的方法來(lái)分離有關(guān)的化合物。
本發(fā)明也涉及制備用于預(yù)防或治療皮膚老化的組合物的方法，其特征是將適于局部給藥的賦形劑與在非還原端含乳糖的2—5個(gè)糖苷殘基的低聚糖，或這種低聚糖的衍生物合并，在所述組合物中，其含量為0.5—6％重量/體積。
在皮膚病和/或整容術(shù)方面，該組合物可有效地用于治療或預(yù)防皮膚的老化作用。
同樣，本發(fā)明涉及制備一組合物的方法，該組合物用于預(yù)防或治療與結(jié)締組織纖維基質(zhì)有關(guān)的加速老化現(xiàn)象，這種加速老化現(xiàn)象伴隨著與異常的彈性蛋白酶合成相關(guān)的病變，尤其是肺氣腫，動(dòng)脈粥樣硬化和動(dòng)脈硬化及靜脈曲張，或者最后，當(dāng)彈性蛋白酶型的內(nèi)肽酶將血管緊張肽I激活為血管緊張肽II時(shí)，該組合物用于治療或預(yù)防動(dòng)脈高血壓；這種使用的特征是將在非還原端含半乳糖苷的低聚糖或低聚糖衍生物與可藥用的賦形劑一起并入組合物中。
當(dāng)?shù)途厶茄苌锖杷鶗r(shí)，有利的賦形劑可由脂質(zhì)體組成，它使得衍生物糖苷部分存在于脂質(zhì)體表面。
在下列詳述的實(shí)施例中，顯示了乳糖，蜜二糖，水蘇糖及其衍生物對(duì)經(jīng)過(guò)15—25次培育的人成纖維細(xì)胞合成和分泌彈性蛋白酶的作用經(jīng)過(guò)如此處理的細(xì)胞符合Hayflick模型(見(jiàn)上述參考)的進(jìn)入衰老階段的細(xì)胞并因此構(gòu)成體外老化模型。
在該系統(tǒng)中，通過(guò)施用本發(fā)明低聚糖衍生物可以觀察到彈性蛋白酶的合成和分泌減少，這是這些抗衰老化合物作用的標(biāo)志，因?yàn)槿缟峡芍?，增加彈性蛋白酶的合成和分泌是與這些成纖維細(xì)胞老化相關(guān)的現(xiàn)象。
這此實(shí)施例不限制于對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞的作用，而且可以推廣到任何型的成纖維細(xì)胞和其它在其細(xì)胞膜上具有彈性蛋白受體的內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞和白細(xì)胞，這種受體含有與半乳糖苷有親和力的67KD亞單位。
—材料和方法在年令為16—24歲之間的女性乳房整形手術(shù)中采集皮膚活組織檢查，并從中獲得人皮膚成纖維細(xì)胞。
在90/10％氧氣/氮?dú)猸h(huán)境下，在35×10mmNUNCLON—KELTA塑料瓶中，用含10％胎牛血清，200ug/毫升青霉素和200單位/毫升鏈霉素的Duebecco′s改良Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)細(xì)胞。
在第18和第21傳代之間進(jìn)行試驗(yàn)，因?yàn)檎窃谶@個(gè)水平，彈性酶活性增大并反映細(xì)胞衰老的狀態(tài)。
在試驗(yàn)開始前24小時(shí)，提取培養(yǎng)基并在1毫升新鮮DMEM培養(yǎng)基中加入乳糖使其最終濃度為10mM。
在指定的時(shí)間間隔后，除去培養(yǎng)基并用加到培養(yǎng)基中的1毫升PBS(磷酸鹽緩沖的鹽水)清洗細(xì)胞層兩次。
然后，在37℃下，用濃度為每毫升PBS含20μg胰蛋白酶(Worthington)的新鮮溶液處理細(xì)胞層5分鐘，接著在4℃下在100g離心5分鐘。
傾去上清液并用1毫升PBS清洗后，將細(xì)胞殘余物懸浮在1毫升，PH＝7.4，含0.1％Triton x—100的0.1M TRIS—HCl緩沖劑中并在Potter均化器中攪均。
通過(guò)向按Bieth，J.1978(如上)所述技術(shù)得到的等分試樣的細(xì)胞提取物中加入在二甲基甲酰胺中的濃度為125mM的底物N-琥珀酰三丙氨酰-對(duì)-硝基苯胺或N-琥珀酰三丙氨酰-對(duì)-硝基苯胺鈉進(jìn)行彈性蛋白酶型酶活性的測(cè)定。
將56微升培養(yǎng)基加到890微升0.1M PH＝7.8的Tris—Hcl緩沖劑和10微升底物溶液中。
將50微升胰蛋白(Trypsinate)或細(xì)胞殘余物加到940微升TRIS緩沖劑和10微升底物中。
在37℃下，將培養(yǎng)基孵育3小時(shí)，并將胰蛋白(Trypsinate)和細(xì)胞殘余物孵育1小時(shí)。
在分光光度計(jì)410納米處讀出因酶對(duì)底物的作用顯現(xiàn)的黃色的光密度。
所有的試驗(yàn)都用4—6個(gè)培養(yǎng)物平行進(jìn)行，并用Student t—試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來(lái)比較平均值。
用每小時(shí)，相對(duì)于106個(gè)細(xì)胞，底物水解的nM數(shù)來(lái)表示酶的活性(EA)，如下進(jìn)行計(jì)算 其中—OD為光密度，—N為反應(yīng)容積中細(xì)胞數(shù)，—T為孵育時(shí)間，并且—8.8為摩爾消光系數(shù)，它與在細(xì)胞厚度為1cm的底物摩爾溶液的OD相對(duì)應(yīng)。
在接下來(lái)不同的實(shí)施例中，通過(guò)用彈性蛋白肽kappa—彈性蛋白(KE)測(cè)定彈性蛋白酶活性變化的改變來(lái)研究半乳糖及其衍生物對(duì)成纖維細(xì)胞彈性蛋白酶活性變化的作用；按照Robert L.和Poullain N.所述的技術(shù)，通過(guò)在含水乙醇中加堿水解的方法水解來(lái)自牛頸部韌帶的彈性蛋白，由此得到上述彈性蛋白肽(EtudesSur la structure de l＇elastine et le mode d＇action de l＇elastase.I.Nouvelle méthode de préparation de dérivés solubles de 1＇elastine?！碴P(guān)于彈性蛋白及彈性蛋白酶作用方式的研究。I.制備可溶性彈性蛋白衍生物的新方法〕Bull.Soc.Chin。Biol.45a1317—1326(1963)。
實(shí)際上，該肽具有彈性蛋白受體激動(dòng)劑的性質(zhì)，也就是說(shuō)，它的存在導(dǎo)致培養(yǎng)基中成纖維細(xì)胞彈性蛋白酶活性的增加。
下表1顯示在第20傳代，作為孵育時(shí)間的函數(shù)，1mg/片層的kappa—彈性蛋白對(duì)人成纖維細(xì)胞作用的動(dòng)力學(xué)。
表1KE的孵育時(shí)間0h2h6h24h 48hEA DMEM 0.04 0.04 0.03 0.21 0.99EA TRYPS 0.267 0.2 0.207 0.190 0.123經(jīng)過(guò)24小時(shí)的潛伏期后注意到培養(yǎng)基中彈性蛋白酶的活性大大增加(分泌)。同時(shí)，胰蛋白(trypsinate)膜活性降低。因此可見(jiàn)培養(yǎng)基中酶活性的增加可能與膜酶釋放到培養(yǎng)基中有關(guān)。
—實(shí)施例1乳糖作用的研究所用乳糖的濃度為10mM或3.6mg/ml。下表2顯示10mM的乳糖對(duì)第21傳代人成纖維細(xì)胞彈性酶活性及其在游離形式，膜形式(胰蛋白)和與細(xì)胞有關(guān)的形式之間分布的作用(在作用以后)以水解的底物的光密度與103/小時(shí)相乘來(lái)表示106個(gè)細(xì)胞的活性。
計(jì)算對(duì)4不同培養(yǎng)物平行測(cè)定的平均值。
以總活性百分?jǐn)?shù)來(lái)表示活性在三個(gè)隔離室之間的分布，并且類似地，以不含乳酸時(shí)相當(dāng)活性的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示乳糖的抑制作用。
表2對(duì)照乳糖活性總活性的活性 總活性的 百分?jǐn)?shù)百分?jǐn)?shù) 百分?jǐn)?shù)總活性 588.1 100 262.2 10055培養(yǎng)基 56.1±7.6 10 18.8±1.1 7 66胰蛋白 359.5±41.7 61 91.9±31.7＊35 74細(xì)胞172.5±16.8 29 151.5±28.858 12*對(duì)照與乳糖相比較P＜0.05。
該表顯示總活性減小55％及酶活性在三個(gè)部分分布的變化。
與對(duì)照培養(yǎng)相比，在培養(yǎng)基中測(cè)定的游離酶的活性減小66％并且能由胰蛋白酶釋放的，與膜有關(guān)的酶減小74％，而殘余物(細(xì)胞)的活性與對(duì)照相比來(lái)顯示出顯著區(qū)別。
這種與膜有關(guān)并釋放到基質(zhì)中的活性的選擇性抑制作用改變了總活性的分布。
在對(duì)照培養(yǎng)中，大部分總活性與細(xì)胞膜有關(guān)(61％)并可由胰蛋白酶釋放；在用乳糖處理的培養(yǎng)中，只有35％的總活性由胰蛋白酶釋放；58％與細(xì)胞殘余物有關(guān)。
因此可見(jiàn)，乳糖具有減小酶合成和釋放的作用。
—實(shí)施例2蜜二糖對(duì)彈性蛋白酶合成作用的研究在與乳糖相同的培養(yǎng)條件下，以10mM；即3.4mg/ml的濃度將蜜二糖加到培養(yǎng)基中。
與對(duì)照相比，蜜二糖引起基質(zhì)中酶活性減少60％并引起胰蛋白(trypsinatl)中酶活性減少80％及細(xì)胞顆粒中酶活性略有減少。
酶總活性減小50％—實(shí)施例3水蘇糖的作用水蘇糖是按Methods of Carbohydrate Chemistry I.P.368—369.Academic Press，1962中所述的M.L.Woefrom和A.Thompson技術(shù)制備的四糖。
以10mM，即6.6mg/ml的濃度將水蘇糖加到培養(yǎng)基中。
與對(duì)照相比，胰蛋白中酶活性減小30％，而培養(yǎng)基中酶活性略有減小。
與單獨(dú)kappa—彈性蛋白酶的作用相比，以1mg/ml的濃度含kappa—彈性蛋白酶時(shí)，基質(zhì)中酶活性顯著減小(52％)再與單獨(dú)kappa—彈性蛋白酶的作用相比，可見(jiàn)胰蛋白中酶活性增加32％細(xì)胞顆粒中酶活性未顯著變化。
—實(shí)施例4油酰乳糖基酰胺的作用油酰乳糖基酰胺是符合式X的化合物，并且其合成是新的。
a)油酰乳糖基酰胺的合成將1-氨基乳糖與油酰氯反應(yīng)得到下式乳糖酰-油酰胺
在80℃下，將3.3g乳糖酰胺溶解在30ml甲醇中并加入1.2g二乙胺。在不超過(guò)30℃的溫度下，在攪拌下，向該溶液中加入4g油酰氯。
通過(guò)加HCl將混合物的PH調(diào)至3。通過(guò)用庚烷萃取除去油酸。讓甲醇的水相連續(xù)通過(guò)酸和堿離子交換柱并真空除去溶劑。
得到的產(chǎn)品仍含約20％乳糖。用辛基-瓊脂糖柱可純化油酰乳糖酰胺。
Rf＝在硅膠上(甲醇薄層)，0.8(氯仿/甲醇1∶1v/v)。
b)對(duì)開始衰老的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的作用以0.5mM的濃度加入油酰乳糖酰胺。
在該濃度下，引起胰蛋白中酶活性略增加并且在細(xì)胞顆粒中酶活性下降約20％。
—實(shí)施例5蜜二糖酰二氨基己烷的作用a)二蜜二糖酰二氨基己烷的制備按下述新技術(shù)來(lái)合成該產(chǎn)品。
將374mg蜜二糖(1.1mM)和116mg(0.5mM)二氨基己烷溶解在5ml 0.2M pH＝8的磷酸鹽緩沖劑中并沖入270mg氰基硼氫化鈉(4.4mM〔sic〕)。將混合物在室溫下靜置11天并在37℃加熱2天。將溶液通過(guò)酸離子交換柱〔H+〕并用水洗滌柱子。
用0.5M氨溶液來(lái)洗脫并冷凍干燥溶液。產(chǎn)物為200mg二蜜二糖酰二氨基己烷(dimeeibionity ldiaminohexane)。硅膠上的Rf＝0.2(丁醇/乙酸/水，h＝1∶1)。


圖1顯示產(chǎn)生二蜜二糖酰二氨基己烷衍生物的反應(yīng)流程式。
b)二蜜二糖酰二氨基己烷對(duì)人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物酶活性的作用可見(jiàn)與對(duì)照相比，在基質(zhì)中酶活性增加及在胰蛋白中酶活性減小40％。
在含kappa—彈性蛋白酶時(shí)，在基質(zhì)中酶活性減小71％，在胰蛋白中酶活性不增加。
對(duì)比之下，與單獨(dú)kappa—彈性蛋白酶的作用相比，在細(xì)胞顆粒中恢復(fù)的酶活性略有增加。
c)各種作用的比較下列表3概述各種半乳糖苷衍生物對(duì)人成纖維細(xì)胞彈性蛋白酶活性作用所得到的全部結(jié)果表4對(duì)彈性蛋白酶活性的作用底物 總活性 DMEM胰蛋白 C.顆粒乳糖 ↓27％ ↓30％ ↓70％ ↓30％乳糖 +KE↑13.5％↑20％ ↑50％ ↓30％蜜二糖 ↓58％ ↓60％ ↓80％ ↓30％蜜二糖+KE↑15％ ↓27％ ↑31％ ↑9％水蘇糖 ↓17％ ↑14％ ↓35％ -水蘇糖+KE↓17％ ↓56％ ↑32％ -角叉菜膠 ↑28％ - ↑66％ ↑30％角叉菜膠 +KE - ↓28％ ↑29％ -L.O.胺 ↓15％ ↑44％ ↑61％ ↓19％L.O.胺+KE↓27％ - ↑41％ ↓32％M.L.胺 ↑13％ ↓10％ ↓15％ ↑50％M.L.胺+KE↑40％ ↑11％ ↑17％ ↑50％
MBA ↓23％ ↑67％ - ↓35％MBA＋KE ↓7％ ↓60％ ↓20％ ↓23％DMDAH - ↑67％ ↓53％-DMDAH＋KE ↑23％ ↑70％ ↓18％ ↑34％MDH ↑58％ ↓60％ ↑37％ ↑60％MDH＋KE ↑54％ ↓80％ ↑14％ ↑56％LOAMENE＝乳糖?；王０稭LAMINE＝肉豆蔻酰乳糖基酰胺MBA＝MELIBIONIC ACID(蜜二糖酸)DMDAH＝二蜜二糖酰二氨基己烷MDH＝DIMELIBIITYLDIAMINOHEXANE劃線的衍生物為上述實(shí)施例中提到的那些。
—實(shí)施例6在先天無(wú)胸腺鼠中，乳糖和蜜二糖的作用兩組鼠中，一種用乳糖或蜜二糖，另一組用空自對(duì)照劑處理并比較。
然后用3MED的劑量(最小紅斑劑量)來(lái)照射鼠。
按原料和方法項(xiàng)下所述的方法，用從受照射的鼠上采到的活組織來(lái)測(cè)定彈性蛋白酶的活性。
權(quán)利要求
1.治療或預(yù)防結(jié)締組織老化現(xiàn)象的組合物，其特征是該組合物至少含一種由2—5個(gè)糖苷基組成的低聚糖或含疏水基的該低聚糖的衍生物，條件是半乳糖基處在低聚糖的非還原端。
2.權(quán)利要求1的組合物，其特征是當(dāng)?shù)途厶腔蚱溲苌锱c適于化妝的載體結(jié)合并優(yōu)先局部給藥時(shí)，該組合物可用于治療皮膚老化現(xiàn)象。
3.權(quán)利要求1的組合物，用于治療或預(yù)防與結(jié)締組織纖維狀基質(zhì)有關(guān)的伴隨某種病變引起的加速老化現(xiàn)象，其特征是低聚糖或其衍生物與可藥用載體結(jié)合。
4.權(quán)利要求1—3的組合物，其特征是低聚糖符合下式半乳糖-n(α或β)-(x)n＇，其中n代表1，2，3，4，或6位，x代表以α或β構(gòu)型連接的戊糖或己糖，n＇是1—5之間的數(shù)字，尤其，該低聚糖可能是乳糖或蜜二糖或水蘇糖或其化合物。
5.權(quán)利要求1—3的組合物，其特征是低聚糖衍生物選自下列類型之一a)—符合下式之一的糖苷，其中，低聚糖優(yōu)選是乳糖，蜜二糖或水蘇糖的低聚糖苷(I)低聚糖苷1-O-R，其中R為具有1—18個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，(II)低聚糖苷1-O-R-0-1低聚糖苷，其中R＝(CH2)n，n為2和10之間的數(shù)。b)—或符合下式之一的乙酰化的糖基胺，其中優(yōu)選低聚糖苷為乳糖，蜜二糖或水蘇糖(III)低聚糖苷1-NH-CO-R，其中R為具有2—18個(gè)碳原子的烷基，它包含0，1或2個(gè)雙鍵，.(IV)低聚糖苷-NH-CO-R-CO-NH-1-低聚糖苷，其中，R＝(CH2)n，n為2和8之間的數(shù)，c)—通過(guò)低聚糖苷氧化作用得到的醛糖酸?；耐榛?(V)低聚糖苷-CO-NH-R，其中R具有與式(III)相同的含義，.(VI)低聚糖苷CO-NH-R-NH-CO-低聚糖苷，其中R具有與式(III)相同的含義，d)—或schiff′s堿還原的產(chǎn)物，它是由低聚糖苷與脂肪族單或二胺形成的并符合下式之一.(VII)Gal-(Hex)n-X-HN-R，.(viii)Gal-(Hex)n-X-HN-R-HN-X-(Hex)n-Gal，其中，Hex是己糖(或戊糖)基，n＝0，1或2，X＝己糖醇(或戊糖醇)基，并且R具有(III)中相同的含義。
6.制備權(quán)利要求1—3中任一組合物的方法，其特征是通過(guò)化學(xué)合成得到低聚糖衍生物。
7.制備權(quán)利要求1—3中任一組合物的方法，其特征是該方法包括下列步驟a)從生物基質(zhì)，尤其是奶，血液或胎盤中提取糖，b)所提取的糖進(jìn)行酶降解或化學(xué)水解，c)分離需要的化合物。
8.制備用于預(yù)防或治療老化作用的組合物的方法，其特征是該方法包括加入適宜的載體，該載體適于局部給予在非還原端含半乳糖的具有2—5個(gè)糖苷基的低聚糖或這種低聚糖的衍生物，該低聚糖或其衍生物為所述組合物的0.5％—6％并且優(yōu)選1—4％重量/體積。
9.在皮膚學(xué)方面使用權(quán)利要求1—4中任一組合物和可透皮給藥的載體。
全文摘要
治療或預(yù)防結(jié)締組織老化癥的組合物，其特征是它包含一個(gè)或多個(gè)具有2-5個(gè)低聚糖基的低聚糖或含疏水基的上述低聚糖的衍生物，假設(shè)在上述低聚糖的非還原端含一半乳糖基。
文檔編號(hào)A61K8/00GK1131389SQ9419345
公開日1996年9月18日 申請(qǐng)日期1994年8月16日 優(yōu)先權(quán)日1993年8月17日
發(fā)明者L·羅伯特, A·羅伯特, E·馬克茲爾 申請(qǐng)人:羅克有限公司