專(zhuān)利名稱(chēng)：針對(duì)寄生蟲(chóng)的保護(hù)性抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體探針及其在檢測(cè)和純化來(lái)自寄生蟲(chóng)和細(xì)菌的許多保護(hù)性和診斷性抗原中的應(yīng)用。特別是本發(fā)明涉及鑒定和純化普通奧斯脫(線(xiàn)蟲(chóng))、游行毛圓線(xiàn)蟲(chóng)和肝片形吸蟲(chóng)等寄生蟲(chóng)中的抗原，制備含有上述抗原的疫苗以及將這些抗原應(yīng)用于診斷分析中。
在以前的技術(shù)中人們已付出了大量努力來(lái)產(chǎn)生疫苗以便控制包括家畜在內(nèi)的動(dòng)物所遭受的寄生性的、細(xì)菌性的和其它類(lèi)型的感染；然而，在最近五年內(nèi)最終幾乎未曾取得進(jìn)展，盡管在真核生物和原核生物中大量產(chǎn)生外源產(chǎn)物的相關(guān)技術(shù)取得了飛速進(jìn)展。例如，對(duì)動(dòng)物的重要病原體感染中的保護(hù)性抗原的鑒定仍然是疫苗生產(chǎn)中的主要障礙。
在澳大利亞專(zhuān)利No.640364(本文引用其全部說(shuō)明書(shū)以供參考中描述了一種用來(lái)制備與病原體相關(guān)的抗原的方法，這種方法包括在認(rèn)為病原體最易受到攻擊期間的病原體發(fā)育階段獲取病原體樣品、抗體探針含有至少一種抗病原體抗體、用抗體探針探測(cè)病原體樣品和分離檢測(cè)的抗原。
盡管這種方法在本領(lǐng)域中提供了有意義的進(jìn)展，但研究局限于少數(shù)寄生蟲(chóng)性和細(xì)菌性感染。如果這種方法能夠成功地應(yīng)用于其它感染并進(jìn)一步用來(lái)鑒定保護(hù)性抗原，那將是本領(lǐng)域內(nèi)意義重大的進(jìn)步。
普通奧斯脫(Osfertagia Circumcincfa)是一種寄生于羊皺胃(第四胃)的腸道寄生性線(xiàn)蟲(chóng)。O.circumcincfa最近已被重新分類(lèi)定為T(mén)eladorsagia circumcincfa，盡管后一名稱(chēng)還不太常用，皺胃中成熟寄生蟲(chóng)產(chǎn)生的卵隨感染的羊的糞便排放到牧場(chǎng)上。
孵化后，幼蟲(chóng)在牧場(chǎng)上發(fā)育至第三階段(L3)。L3幼蟲(chóng)被吃草的羊咽下并在皺胃中進(jìn)一步發(fā)育。L4階段的發(fā)育在皺胃小囊中進(jìn)行，發(fā)育可能減慢或被控制，這依賴(lài)于羊的免疫狀態(tài)，也依賴(lài)于季節(jié)。在春季發(fā)育成能產(chǎn)生成熟卵的成蟲(chóng)之前，幼蟲(chóng)可以在整個(gè)冬天在皺胃小囊中處于休眠狀態(tài)。寄生蟲(chóng)數(shù)目的突然同步增長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致明顯的羊病態(tài)。由于粘膜上的晚期幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)的攝食而造成的組織損傷會(huì)引起血清滲漏和皺胃內(nèi)膜肥大，隨后干擾皺胃的功能并導(dǎo)致動(dòng)物的生長(zhǎng)不良。相關(guān)的寄生蟲(chóng)O.ostertagii在牛中引起相似的病理癥狀。
盡管奧斯脫屬的種類(lèi)是造成澳大利亞和其它國(guó)家的牛、羊工業(yè)大量經(jīng)濟(jì)損失的重要原因，但背景技術(shù)還沒(méi)有形成成功的疫苗來(lái)抵抗這種寄生蟲(chóng)。
肝片吸蟲(chóng)(Fasciola hepafica)肝吸蟲(chóng)是一種屬于吸蟲(chóng)科的寄生蟲(chóng)，它能感染大量的野生和家養(yǎng)動(dòng)物種類(lèi)并且在牛羊工業(yè)中具有特別的經(jīng)濟(jì)重要性。在研究的種類(lèi)中，大鼠是唯一能對(duì)重新感染產(chǎn)生強(qiáng)大免疫力的宿主(參見(jiàn)Haroun，ETM和GV.Hillyer，Vet Parasifol2063-93，1986)。因此大鼠免疫系統(tǒng)有力識(shí)別的抗原在疫苗生產(chǎn)方案中具有特別重要意義并在本申請(qǐng)中進(jìn)行了描述。澳大利亞專(zhuān)利640364描述了一種針對(duì)肝片吸蟲(chóng)感染的保護(hù)性抗原，它具有大約120至125千道爾頓的分子量。這種抗原能在牛羊中有區(qū)別地被識(shí)別，與本申請(qǐng)所述的抗原完全不同。
毛圓線(xiàn)蟲(chóng)屬寄生蟲(chóng)的感染發(fā)生于羊小腸的前3～4米部位并導(dǎo)致羊毛減產(chǎn)、生長(zhǎng)減慢、不健壯以及腹瀉。嚴(yán)重感染會(huì)導(dǎo)致死亡。它也是一種具有經(jīng)濟(jì)意義的疾病，但在背景技術(shù)中也沒(méi)有形成成功的疫苗來(lái)抵抗這種寄生蟲(chóng)。
因此，本發(fā)明的目的是為了克服或至少減輕與背景技術(shù)有關(guān)的一種或多種困難和缺陷。
因此，首先，本發(fā)明提供了一種抗普通奧斯脫或相關(guān)感染的推定的保護(hù)性抗原或其片段，選自下文所述的具有近似分子量范圍為26～36和95～105千道爾頓的抗原。此抗原也可能出現(xiàn)于寄生蟲(chóng)的其它種類(lèi)或品系中。
26～36kD的普通奧斯脫抗原范圍，可以包括在32～36位置的駢聯(lián)體抗原。這種駢聯(lián)體抗原可能是一種類(lèi)似植物凝血素的結(jié)合β-半乳糖苷的蛋白質(zhì)。該32～36kD駢聯(lián)體抗原可以包含一個(gè)或多個(gè)如下肽段序列1)SAHGPPGQ2)FpHGPSYQHGYA3)IVTHPNR在26～36kD的普通奧斯脫抗原區(qū)域的低帶部位含有與原肌球蛋白和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathionine S-transferase)同源的蛋白質(zhì)。
普通奧斯脫的序列與下列序列同源(A)原肌球蛋白的1.N-末端序列MKAEEVRQALK2.中間序列VEADLERAEERAEAAGENKVVVL
(B)與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶同源的是N-末端序列VQYKLYYFDGRXAAEV本發(fā)明另一優(yōu)選的方面是提供了一種抗游行毛圓線(xiàn)蟲(chóng)或相關(guān)感染的推定的保護(hù)性抗原或其片段，它具有如下文所述的32-35千道爾頓的近似分子量。該保護(hù)性抗原可以是駢聯(lián)體。
游行毛圓線(xiàn)蟲(chóng)抗原在SDS-PAGE電泳中與上述普通奧斯脫駢聯(lián)體抗原處于相同位置，因此，有可能它們是基本相似但具有種特異性抗原決定基的分子，這些抗原決定基最強(qiáng)地被同源的上清抗體探針?biāo)R(shí)別。
本發(fā)明更進(jìn)一步的方面是提供了一種抗肝片形吸蟲(chóng)或相關(guān)感染的推定的保護(hù)性抗原或其片段，選自具有近似分子量范圍為28kD、32kD、37kD、42～100kD、54至55kD和大于200kD的抗原，這正如上文所述。類(lèi)似的抗原可以出現(xiàn)在其它吸蟲(chóng)屬物種，如大片形吸蟲(chóng)和其它寄生吸蟲(chóng)如血吸蟲(chóng)中。
大于200kD的肝片吸蟲(chóng)抗原可以是一種駢聯(lián)體抗原。肝片吸蟲(chóng)抗原只能專(zhuān)一地被來(lái)自免疫、攻擊的大鼠腸系膜淋巴結(jié)(MLN)細(xì)胞的上清所識(shí)別。
32kD抗原可以包含如下N-末端肽鏈序列KPNYKRQFEPFS-DELIHYINLE。
54～55kD抗原可以包含如下N-末端肽序列LEDNGRTH-WAVLVA。
要明白的是，重組蛋白抗原可以用來(lái)替代從寄生蟲(chóng)中提取的天然抗原。
在疫苗和診斷檢測(cè)中含有保護(hù)性抗原決定基的抗原片段和人工合成的含保護(hù)性抗原決定基的多肽可以用來(lái)替代整個(gè)天然的或重組分子。
該抗原可以出現(xiàn)在寄生蟲(chóng)的其它種類(lèi)中，因此在指定的病原體引起疾病之外的其它疾病的接種和診斷中也起作用。
還要明白的是，產(chǎn)生的抗這些抗原的抗體也可用于診斷試驗(yàn)或用作單克隆或多克隆的免疫預(yù)防試劑。
根據(jù)發(fā)明的保護(hù)性抗原可以使用上述澳大利亞專(zhuān)利640364中所描述的方法來(lái)生產(chǎn)。因此本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種制備與選自上文所述的片形吸蟲(chóng)屬、奧斯脫屬和毛圓線(xiàn)蟲(chóng)屬的種類(lèi)及其相近種的病原體相聯(lián)系的抗原的方法，該方法包括提供選自片形吸蟲(chóng)屬、奧斯脫屬和毛圓線(xiàn)蟲(chóng)屬種類(lèi)和其相近種的病原體的樣品；包含至少一種抗各自病原體的抗體的相應(yīng)的抗體探針，其生產(chǎn)方法包括用選自片形吸蟲(chóng)屬、奧斯脫屬和毛圓線(xiàn)蟲(chóng)屬種類(lèi)及其相近種的一種病原體或病原體提取物攻擊免疫動(dòng)物一段短時(shí)間后從免疫動(dòng)物中制備一種生物樣品；從該生物樣品中分離細(xì)胞；在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中體外培養(yǎng)細(xì)胞以及收獲所說(shuō)的細(xì)胞產(chǎn)生的抗體；用相應(yīng)的抗體探針探測(cè)病原體樣品以便檢測(cè)出至少一種抗原；分離被檢測(cè)的抗原。
因此，病原體樣品優(yōu)選一種寄生蟲(chóng)、寄生蟲(chóng)提取物或其寄生蟲(chóng)切片。奧斯脫屬病原體可以是普通奧斯脫(線(xiàn)蟲(chóng))或奧氏奧斯脫。毛圓線(xiàn)蟲(chóng)屬病原體可以是游行毛圓線(xiàn)蟲(chóng)或Trichostronylus axei。片形吸蟲(chóng)屬種類(lèi)可以是肝片形吸蟲(chóng)或大片形吸蟲(chóng)。
在一個(gè)優(yōu)選的方面，病原體樣品可以在被認(rèn)為是最易受到攻擊的發(fā)育階段提取。
據(jù)認(rèn)為，病原體樣品取樣的時(shí)間是重要的，因?yàn)榧纳x(chóng)僅在進(jìn)入宿主后的短時(shí)間內(nèi)是脆弱的，在此之后它可以改變結(jié)構(gòu)并不再易受免疫攻擊且可能不再表達(dá)保護(hù)性抗原。
例如，在病原體肝片形吸蟲(chóng)、普通奧斯脫和游行毛圓線(xiàn)蟲(chóng)的例子中，在幼蟲(chóng)階段取樣可能是合適的。
從中提取生物樣品的動(dòng)物可以是任何合適的類(lèi)型。從中提取生物樣品的動(dòng)物可以是免疫動(dòng)物。生物樣品可以是在用病原體感染攻擊免疫動(dòng)物后短時(shí)間內(nèi)取樣。該動(dòng)物可以是諸如羊或牛的動(dòng)物。
動(dòng)物的生物樣品可以是任何合適的類(lèi)型。該生物樣品可以來(lái)自動(dòng)物組織、器官、血液、淋巴或淋巴結(jié)、它也可以從感染動(dòng)物的任何部位提取。然而，優(yōu)選的樣品取自感染的位點(diǎn)或者在某些疾病可能形成的病灶區(qū)域或者接近或通過(guò)該感染的位點(diǎn)或病灶區(qū)域如淋巴結(jié)。優(yōu)選樣品可以從肝淋巴結(jié)、皺胃淋巴結(jié)、或腸系膜淋巴結(jié)中提取。血清/血漿樣品不適于作為生物樣品。已發(fā)現(xiàn)，在血清/血漿樣品中發(fā)現(xiàn)的大部分抗體要么與病原體的保護(hù)或特異性診斷無(wú)關(guān)，要么與病原體無(wú)關(guān)。
與此相反，本發(fā)明使用的探針高度富含病原體特異性抗體，并能選來(lái)限對(duì)保護(hù)性免疫特別重要的病原體階段。
從生物樣品中分離的細(xì)胞可包括B細(xì)胞。細(xì)胞可在包括分泌和或生產(chǎn)抗體期間的時(shí)間同樣地進(jìn)行分離。作為選擇，該細(xì)胞可包括記憶細(xì)胞，它可在某些疾病的后期產(chǎn)生。
因此，細(xì)胞優(yōu)選在體內(nèi)刺激后的短時(shí)間內(nèi)提取，優(yōu)選在其后約2至13天內(nèi)，例如導(dǎo)致形成抗體的細(xì)胞體內(nèi)誘導(dǎo)的相關(guān)寄生階段，這些形成抗體的細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后會(huì)將特異性的抗體分泌到培養(yǎng)基中。不經(jīng)過(guò)預(yù)先體內(nèi)刺激休眠淋巴細(xì)胞就沒(méi)有或幾乎沒(méi)有抗體分泌到培養(yǎng)基中。
經(jīng)過(guò)向培養(yǎng)基中加入輔助因子(helper facfor)可以增強(qiáng)培養(yǎng)基中剛激活的B細(xì)胞的體外抗體分泌。輔助因子可以是單獨(dú)使用或結(jié)合使用的細(xì)胞因子，包括白細(xì)胞介素1、2、3、4、5、6、7和8、集群激活因子、干擾素和任何其它表明對(duì)B細(xì)胞的特異性抗體分泌具有增強(qiáng)效應(yīng)的因子。
生產(chǎn)抗體探針的方法可以包括激活被分離出來(lái)進(jìn)行繁殖并且分泌和/或釋放抗體的細(xì)胞的進(jìn)一步步驟。
細(xì)胞激活步驟可以包括在培養(yǎng)基內(nèi)加入一種細(xì)胞激活劑。細(xì)胞激活劑可以是來(lái)源于寄生蟲(chóng)的或者選自是白細(xì)胞產(chǎn)生的分裂素和輔助因子，或是其人工合成的等價(jià)物或其組合。
分裂素可以選自來(lái)源于商陸(Phytolacca americana)的產(chǎn)物也稱(chēng)作商陸分裂素(PWM)、phorbolmyrisfic acid(PMA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、多聚腺苷酸-多聚尿苷酸(poly(A-u))、純化的蛋白提取物、多聚肌苷酸多聚胞井酸(poly(I-c))、脂多糖(LPS)、葡萄球菌或其產(chǎn)物、Bacfo-sfrepfolysin O reagenf(SLO)、葡萄球菌噬菌體溶胞產(chǎn)物(SPL)、Epsfein-Barr病毒(EBV)、Nocardia水溶分裂素(NWEM)、植物血細(xì)胞凝體素(pHA)、伴刀豆球蛋白A(ConA)和硫酸葡聚糖及其混合物。細(xì)胞繁殖劑可以是任何間接或直接導(dǎo)致B細(xì)胞繁殖和或抗體分泌的試劑如固相抗免疫球蛋白。輔助因子可以是包括白細(xì)胞介素1、2、3、4、5、6、7和8、集群激活因子、干擾素的細(xì)胞因子和任何其它在單獨(dú)或與其它因子或試劑結(jié)合加入時(shí)顯示對(duì)B細(xì)胞繁殖和/或抗體分泌具有增強(qiáng)效應(yīng)的輔助因子。這并不意味著已列完了所有包括輔助因子的分裂素和細(xì)胞激活試劑。
細(xì)胞的體外培養(yǎng)可以是在有或沒(méi)有預(yù)先分離細(xì)胞亞群的情況下進(jìn)行?？赏ㄟ^(guò)收集培養(yǎng)基上清來(lái)收獲抗體。該上清含有體外培養(yǎng)的這些細(xì)胞分泌的抗體也含有人工從B細(xì)胞釋放的(如經(jīng)過(guò)B細(xì)胞溶胞)抗體。已驚奇地發(fā)現(xiàn)，含有抗體的上清可直接用來(lái)檢驗(yàn)病原體的抗原。
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，病原體樣品可以與標(biāo)準(zhǔn)緩沖液混合并放置在諸如SDS-聚丙烯酰胺凝膠的標(biāo)準(zhǔn)支持物上以分離其中所含的蛋白。然后分離的蛋白質(zhì)可以轉(zhuǎn)移動(dòng)硝化纖維素、尼龍膜或其它膜上。
如上所述產(chǎn)生的相應(yīng)的抗體探針可以簡(jiǎn)單地以從培養(yǎng)基收獲的上清形式使用。作為選擇抗體或被分離和純化。
培養(yǎng)基中所含的抗體可被用來(lái)純化抗原。可使用親和純化，優(yōu)選免疫親和純化。
如上所述確定的抗原可利用任何合適的分析技術(shù)來(lái)檢測(cè)。
因此，抗體探測(cè)步驟可進(jìn)一步包括將由此產(chǎn)生的產(chǎn)物用于檢測(cè)分析。
檢測(cè)分析可包括Western印跡技術(shù)。檢測(cè)分析也可以是免疫沉淀分析、放射免疫分析、酶聯(lián)免疫分析或者免疫熒光分析。
因此，抗原可經(jīng)過(guò)包含如下步驟的方法來(lái)純化制備粗制抗原混合物和針對(duì)選自片形吸蟲(chóng)、奧斯脫和毛圓線(xiàn)蟲(chóng)及其相近種的病原體的固定在合適支持物上的抗體；利用被固定的抗體將粗制抗原混合物進(jìn)行親和層析；分離由此純化的抗原。
利用傳統(tǒng)方法可從上述培養(yǎng)上清探針中獲取抗體。例如可使用常用來(lái)從血清或血漿中純化免疫球蛋白的方法，如硫酸銨沉淀、辛酸分級(jí)分離、離子交換層析、或經(jīng)結(jié)合并從固定的G蛋白或A蛋白中洗脫。
然后，如此獲得的抗體可偶聯(lián)到合適的支持物上，如CNBr-活化的Sepharose 4B(Pharmacia)、AAi-凝膠(Bio-Rad)或其它能結(jié)合蛋白質(zhì)的親和層析支持物。
固定的抗體可用來(lái)從復(fù)雜的寄生蟲(chóng)提取物中經(jīng)親和層析對(duì)特異性抗原進(jìn)行分級(jí)分離和純化。抗原與固定的抗體結(jié)合后，用諸如含有1.5M NaCl的緩沖液可將未結(jié)合的大分子種類(lèi)從固體支持物中洗去。隨后，用諸如低pH或高pH值的緩沖液或含離液序列高的離子，如0.5～3.0M硫氰酸鈉的緩沖液可將該抗原從親和柱中洗脫下來(lái)。
分離或確定的抗原用于單克隆抗體的制備。
因此，本發(fā)明進(jìn)而提供了一種用來(lái)生產(chǎn)抗上述病原體抗原的單克隆抗體的方法，該方法包括(1)提供一種能產(chǎn)生抗所說(shuō)保護(hù)性抗原或其片段的抗體的B細(xì)胞，并且該細(xì)胞從用針對(duì)上述病原體的保護(hù)性抗原免疫過(guò)的動(dòng)物中獲??；一種骨髓瘤細(xì)胞；(2)將B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合；(3)繁殖由此形成的雜交瘤細(xì)胞(4)收獲由所說(shuō)的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。
單克隆抗體可形成上述疾病的被動(dòng)治療的基礎(chǔ)。
該抗原優(yōu)選肝片形吸蟲(chóng)抗原。
由此形成的單克隆抗體可選自由下文所述的FY4-7-12、FY3-3-1、FY3-3-2、FY3-5、FY4-7-6和FY1-6組成的組中。
在鑒定抗原后，可使用分子生物學(xué)技術(shù)或化學(xué)技術(shù)(如克隆技術(shù))來(lái)生產(chǎn)大量的該抗原作為選擇人工合成的對(duì)應(yīng)于鑒定抗原的不同片段的多肽可用作生產(chǎn)疫菌的工具。
因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是，它提供了一種制備針對(duì)選自片形吸蟲(chóng)屬、奧斯脫屬和毛圓線(xiàn)蟲(chóng)屬種類(lèi)和其相近種的病原體的合成的抗原性多肽，該方法包括(1)提供一種來(lái)源于選自片形吸蟲(chóng)屬、奧斯脫屬和毛圓線(xiàn)蟲(chóng)屬種類(lèi)及其相近種病原體的樣品的cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)；一種相應(yīng)的抗體探針，該探針包括至少一種抗各自病原體的，以包括提供一種用選自片形吸蟲(chóng)屬、奧斯脫屬和毛圓線(xiàn)蟲(chóng)屬種類(lèi)及其相近種的病原體或病原體提取物攻擊感染免疫動(dòng)物之后短時(shí)間內(nèi)從免疫動(dòng)物中提取的生物樣品，或者一種由此而來(lái)的相應(yīng)的單克隆抗體、或者一種在注射純化抗原后產(chǎn)生的多克隆或單克隆抗體的方法生產(chǎn)的抗體；(2)從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)產(chǎn)生合成的多肽；(3)用抗體探針探測(cè)合成的多肽；(4)分離由此檢測(cè)的合成的抗原多肽。
可使用cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)。cDNA或基因組文庫(kù)可組裝成適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，該載體能在原核宿主(如細(xì)菌)或真核宿主(如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中轉(zhuǎn)錄并隨后表達(dá)DNA克隆。用于篩選文庫(kù)的探針優(yōu)選選自(i)以上述已鑒定并純化的抗原的氨基酸序列為基礎(chǔ)的合成寡聚核苷酸探針；(ii)從合成的寡聚核苷酸探針產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物；(iii)以來(lái)自已鑒定的抗原的氨基酸序列資料的合成多肽為基礎(chǔ)的抗體；(iv)從上述生產(chǎn)的培養(yǎng)基中獲得的抗體；
(v)產(chǎn)生的抗上述鑒定和純化的抗原的單克隆或多克隆抗體；(vi)對(duì)該抗原具有特異性的重組或人工合成的單克隆抗體或多肽，例如在Ward ef al 1989，Nafure 241，第544至546中所描述的。
cDNA文庫(kù)優(yōu)選來(lái)源于普通奧斯脫的樣品；相應(yīng)的抗體探針是產(chǎn)生的抗32～36kD駢聯(lián)體抗原的單克隆抗體。
還有一個(gè)方面是提供了一種上述制備的人工合成的抗原多肽。
人工合成的抗原多肽可選自克隆3～2和5-2b，它具有如下氨基酸序列M.A.FETNYP IPYRSKLTEP FEPGQTLTVK GKTGEDSVRF TINLHNSSADFSGNDVPLHV SVRFDEGKIV CNSFAKGEWGKEERKSNPYKKGDDIDIRIRAHDSKFQIFV DQKELKEYEH RLPLSSITHF SIDGDVLITH IHWGGKYYPVPYESGLAGEG LSPGKSLYLY GMPEKKGKRF HINILKKNGD IALHFNPRFDEKAWRNSLI SNEWGNEERE GKMPFEKAVG FDLEIKNEDY PFQIMVNGERFASYSHRLEP HELNGLQIGG DVEITGIQLH這正如下文所描述的。
因此，本發(fā)明的另一方面是，它提供了針對(duì)選自片形吸蟲(chóng)屬、奧斯脫屬和毛圓線(xiàn)蟲(chóng)屬種類(lèi)及其相近種的病原體的被推定的保護(hù)性抗原，制備它的方法包括提供一種選自片形吸蟲(chóng)屬、奧斯脫屬和毛圓線(xiàn)蟲(chóng)屬種類(lèi)及其相近種的的病原體樣品；(2)一種抗體探針，該探針包括至少一種以上述方法產(chǎn)生的抗選自?shī)W斯脫屬和毛圓線(xiàn)蟲(chóng)屬種類(lèi)及其相近種的病原體的抗體；用相應(yīng)的抗體探針探測(cè)病原體樣品；分離檢測(cè)到的保護(hù)性抗原。
保護(hù)性抗原可作為如下所討論的疫苗和或診斷試劑。
本發(fā)明的另一方面是提供了一種抗針對(duì)選自片形吸蟲(chóng)屬、奧斯脫屬和毛圓線(xiàn)蟲(chóng)屬種類(lèi)及其相近種病原體的保護(hù)性抗原或其片段的單克隆或多克隆抗體。
另一方面本發(fā)明提供了抗針對(duì)片形吸蟲(chóng)種類(lèi)及其相近種的上文所述的保護(hù)性抗原或其片段的單克隆或多克隆抗體。
另一方面本發(fā)明提供了一種防止由選自片形吸蟲(chóng)屬、奧斯脫屬和毛圓線(xiàn)蟲(chóng)屬種類(lèi)及其相近種的病原體所引起的動(dòng)物感染的方法，該方法包括給動(dòng)物服用有效劑量的至少一種上述保護(hù)性抗原。
保護(hù)性抗原優(yōu)選來(lái)自本文所述的肝片形吸蟲(chóng)或游行毛圓線(xiàn)蟲(chóng)的抗原。
本發(fā)明的另一方面是提供了一種治療由選自片形吸蟲(chóng)屬、奧斯脫屬和毛圓線(xiàn)蟲(chóng)屬種類(lèi)及其相近種引起的動(dòng)物感染的方法，該方法包括給動(dòng)物服用治療上有效量的抗上述保護(hù)性抗原的單克隆或多克隆抗體。
本發(fā)明還提供了一種疫苗或獸藥組合物，它包括上述預(yù)防上有效量的至少一種針對(duì)選自片形吸蟲(chóng)屬、奧斯脫屬和毛圓線(xiàn)蟲(chóng)屬種類(lèi)及其相近種的病原體的抗原。疫苗組合物優(yōu)選包含多種針對(duì)許多病原體的保護(hù)性抗原。
本發(fā)明還提供了一種疫苗或獸藥組合物，它包括治療上有效量的至少一種抗上述保護(hù)性抗原的單克隆或多克隆抗體。該疫苗組合物優(yōu)選含有多種單克隆或多克隆抗體。
在優(yōu)選的形式，通過(guò)單一處理給動(dòng)物提供多重保護(hù)。
根據(jù)本發(fā)明的疫苗或獸藥組合物可經(jīng)口服用藥也可徑非腸道用藥(如肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射和靜脈內(nèi)注射)。
所需劑量將隨著活性成分的抗原性而變化，且所需的量?jī)H足以誘導(dǎo)對(duì)存在疫苗的曲型免疫應(yīng)答。
反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)容易形成所需的劑量。疫苗或獸藥組合物的典型初始劑量可以是大約0.001～1毫克活性組分/千克體重。根據(jù)需要可提高劑量頻率或者使用多重劑量以便提供滿(mǎn)意的保護(hù)水平。
根據(jù)本發(fā)明的疫苗或獸藥組合物還可包括獸藥上可接受的載體，稀釋劑或其賦形劑?；钚猿煞謨?yōu)選懸浮或溶解于載體中。載體可以是任何對(duì)動(dòng)物無(wú)毒且與活性組分相配伍的固體或溶劑。合適的載體包括液體載體，如生理鹽水或其它等于或接近生理濃度的無(wú)毒鹽，和固體載體，如滑石(falc)或蔗糖。如果需要的話(huà)，可加入佐劑(如Freund完全的或不完全的佐劑)或免疫調(diào)節(jié)劑(如細(xì)胞因子)以增加抗原的抗原性。當(dāng)通過(guò)支氣管用藥時(shí)，疫苗應(yīng)適于以氣溶膠的形式提供。
根據(jù)本發(fā)明的疫苗或獸藥組合物可摻入到活性載體中(如牛痘病毒、沙門(mén)氏菌)或以DNA或RNA形式藥，正如Tang et al.，Nafure356152，1992中所述。
本發(fā)明還有一個(gè)方面是提供了一種含有針對(duì)上述鑒定和純化的病原體的診斷性抗原及其片段的診斷分析試劑盒。
該診斷試劑盒可用于檢測(cè)由選自普通奧斯脫、肝片形吸蟲(chóng)、游行毛圓線(xiàn)蟲(chóng)或其相近寄生蟲(chóng)的病原體所引起的動(dòng)物感染。
診斷分析試劑盒的使用可接合診斷分析。診斷分析可包括West-ern印跡技術(shù)，也可以是診斷性免疫分析。免疫分析可以是免疫沉淀分析、放射免疫分析、酶聯(lián)免疫分析、免疫熒光分析或者化學(xué)發(fā)光分析。
參考下面的實(shí)施例，本發(fā)明會(huì)得到更全面的描述。然而應(yīng)明白的是下面的描述僅是解釋性的，不應(yīng)以任何方式理解為對(duì)上述發(fā)明普通性的限制。
在附圖中

圖1a普通奧斯脫用以實(shí)驗(yàn)免疫的Suffolk小羊中的淋巴(稀釋1/1000)探測(cè)普通奧斯脫L3幼蟲(chóng)提取物的SDS-PAGE(12.5％凝膠)和Western)印跡分析。檢測(cè)到了兩簇具有表觀(guān)分子量為26～36kD和95～105kD的免疫反應(yīng)種類(lèi)。用以攻擊感染過(guò)的綿羊的皺胃淋巴結(jié)培養(yǎng)物上清也鑒定到了同樣范圍的種類(lèi)。
圖1b至1e通過(guò)斑點(diǎn)免疫分析用抗-駢聯(lián)體mAb或羊血清進(jìn)行的克隆反應(yīng)將取自各克隆平板的IPTG濾紙切成碎片并與抗體反應(yīng)。用結(jié)合抗小鼠IgM＋I(xiàn)gG或抗綿羊IgG的堿性磷酸酶進(jìn)行檢測(cè)。濾紙與如下物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)抗-駢聯(lián)體mAb(圖1b)、陰性對(duì)照的IgM mAb(圖1c)、用純化的駢聯(lián)體抗原產(chǎn)生的羊血清(圖1d)、陰性對(duì)照羊血清(圖1e)。所示的克隆是7-1、7-2、5-2b(2個(gè)分離物)、3-2、8-2(2個(gè)不同的稀釋度)或陰性對(duì)照斑。圖1f用從克隆中親和純化的抗體探測(cè)普通奧斯脫L3提取物的West-em印跡L3幼蟲(chóng)的液體提取物樣品在12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，然后電印跡。與如下物質(zhì)進(jìn)行Western印跡反應(yīng)從斑點(diǎn)免疫分析中洗脫的親和純化抗體、mAb、羊血清或來(lái)自重復(fù)感染免疫的羊的皺胃淋巴，并用結(jié)合抗小鼠IgM＋I(xiàn)gG或抗羊IgG的堿性磷酸酶進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)。泳道1陰性對(duì)照mAb；2抗駢聯(lián)體mAb，從3洗脫的親和純化抗體克隆7-1；4克隆7-2；5和6克隆5-2b(2種分離物)；7克隆3-2；8克隆8-2；9陰性對(duì)照斑；10苯抗駢聯(lián)體血清；11陰性對(duì)照血清；12免疫羊的淋巴；M預(yù)先標(biāo)記的分子量標(biāo)記物(Biorad)。駢聯(lián)體的位置用箭頭指示。圖1g克隆3-2和5-2b的核苷酸序列及其預(yù)測(cè)的氨基酸序列氨基酸以三字母代碼形式表示。圖1h普通奧斯脫克隆3-2和5-2b預(yù)測(cè)的氨基酸序列與旋盤(pán)屬絲蟲(chóng)和C.elegans的GBP的序列對(duì)比。
利用ANGIS從數(shù)據(jù)庫(kù)中把GBP的氨基酸序列調(diào)出來(lái)(旋盤(pán)屬絲蟲(chóng)來(lái)自GenPep數(shù)據(jù)庫(kù)，登記號(hào)UO 4046-1，C.elegans來(lái)自PIR數(shù)據(jù)庫(kù)，登記號(hào)S27798)。氨基酸以單字母代碼表示。圖1i證實(shí)駢聯(lián)體抗原是類(lèi)似植物凝血素的GBP用緩沖液提取普通奧斯脫L3幼蟲(chóng)，樣品通過(guò)asialofetuin-Af-figel 15柱。洗滌后，用100mM乳糖洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。泳道M分子量標(biāo)記；1L3提取物；2來(lái)自柱的分級(jí)分離的最后沖洗液。3-7乳糖洗脫的餾分(fraction)。駢聯(lián)體抗原的位置用箭頭標(biāo)示。(12.5％SDS-PAGE，考馬斯蘭染色)。圖1j和1k
重組抗原在大腸桿菌中的表達(dá)圖1j和1kCTAB可溶性?xún)?nèi)含體在13％凝膠中電泳，然后電印跡。一半Western印跡與抗駢聯(lián)體mAb進(jìn)行反應(yīng)并用結(jié)合抗鼠IgG＋I(xiàn)gM(圖1j)的堿性磷酸酶檢測(cè)，另一半與純化駢聯(lián)體的羊抗血清反應(yīng)并用結(jié)合抗羊IgG(圖1k)的堿性磷酸酶檢測(cè)。泳道1克隆7-1；2克隆7-2；3克隆3-2，4克隆8-2；5克隆5-2b，6pMOSELOX對(duì)照。圖2a-2c普通奧斯脫(線(xiàn)蟲(chóng))三次不同試驗(yàn)中感染L3幼蟲(chóng)后接種過(guò)的羊(·-·)和對(duì)照羊(。-。)的每克糞便平均卵數(shù)(epg)。圖2d在第三次奧斯脫屬接種試驗(yàn)中用捻轉(zhuǎn)血矛進(jìn)行異源感染后對(duì)照羊和接種過(guò)的羊的平均糞便卵數(shù)。圖3游行毛圓線(xiàn)蟲(chóng)用感染了游行毛圓線(xiàn)蟲(chóng)的羊MLN上清探測(cè)三種L3線(xiàn)蟲(chóng)幼蟲(chóng)抗原的Western印跡。泳道1Bio-Rad預(yù)染的分子量標(biāo)記；泳道2普通奧斯脫L3抗原；泳道3捻轉(zhuǎn)血矛L3抗原；泳道4游行毛圓線(xiàn)蟲(chóng)L3抗原。括號(hào)＝游行毛圓線(xiàn)蟲(chóng)的抗原。圖4肝片形吸蟲(chóng)用200Mc口服攻擊預(yù)先受過(guò)感染并已治愈的大鼠7天后分別用來(lái)自肝淋巴結(jié)(1)、腸系膜淋巴結(jié)(2)和脾(3)的上清探測(cè)NEF吸蟲(chóng)抗原的Western印跡。泳道4Bio-Rad預(yù)染的分子量標(biāo)記。箭頭表示僅被MLN上清識(shí)別的大于200kD的抗原位置。圖5肝片形吸蟲(chóng)用經(jīng)400Mc攻擊感染的二次免疫并治愈的大鼠肝淋巴結(jié)(5)、腸系膜淋巴結(jié)(6)和脾(7)上清探測(cè)NEJ抗原的Western印跡。泳道4Bio-Rad預(yù)染的分子量標(biāo)記箭頭表示僅被MLN上清識(shí)別的抗原的位置。圖6a-6d肝片形吸蟲(chóng)用抗羊MHC II類(lèi)(陰性對(duì)照)×40的mcAb38.27(圖6a)對(duì)NEJ吸蟲(chóng)的間接過(guò)氧化物酶免疫染色。用mcAb FY3-5和FY1-6、mcAb FY3-3-2，×40(圖6b)，mcAb FY3-3-2，×100(圖6c)和mcAb FY3-3-1，×100(圖6d)觀(guān)察到類(lèi)似的陰性染色。注意將圖6b和6c中的高度網(wǎng)狀型染色與圖6d中的更限定的斑點(diǎn)型染色進(jìn)行比較。箭頭指向NEJ吸蟲(chóng)的口吸盤(pán)。
實(shí)施例1普通奧斯脫寄生蟲(chóng)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物普通奧斯脫的第三階段幼蟲(chóng)(L3)從實(shí)驗(yàn)感染寄生蟲(chóng)的供體羊糞便培養(yǎng)物中收集。用普通奧斯脫幼蟲(chóng)重復(fù)感染羊并隨后監(jiān)測(cè)糞便中蟲(chóng)卵的排放情況來(lái)獲得免疫動(dòng)物。當(dāng)攻擊感染劑量在糞便中很少或不產(chǎn)生蟲(chóng)卵時(shí)，我們就說(shuō)該動(dòng)物已被免疫。羊一旦被免疫，就要灌用IVERMECTIN，之后要間隔至少四周方能用60000L3幼蟲(chóng)攻擊感染，攻擊后五至八天處死動(dòng)物。培養(yǎng)上清的制備按上述澳大利亞專(zhuān)利No.640364的描述取出皺胃淋巴結(jié)(ALN)并制備細(xì)胞懸液。在DME＋10％胎牛血清中以0.5～1.0×107個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度在培養(yǎng)瓶中建立10～50ml的批量培養(yǎng)物。初始實(shí)驗(yàn)表明培養(yǎng)上清的大多數(shù)抗體是由體內(nèi)刺激的淋巴結(jié)中的抗體分泌細(xì)胞產(chǎn)生，并且用商陸分裂素(PWM)刺激不再增加其分泌量。因此PWM沒(méi)有加到后續(xù)培養(yǎng)物中，在含5％CO2的空氣中37℃下培養(yǎng)細(xì)胞五天后收獲培養(yǎng)上清，然后在-20℃下儲(chǔ)存直至使用。皺胃淋巴結(jié)的插管和淋巴的收集如上所述讓羊(Suffolk羊)轉(zhuǎn)變成免疫狀態(tài)，用60000 L3幼蟲(chóng)攻擊感染，攻擊后第四天給皺胃總淋巴導(dǎo)管插管。插管幾天后收集淋巴，將無(wú)細(xì)胞的淋巴儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩９㏒DS-PAGE和Western印跡使用的抗原制備在含有約0.5％NaHOCl的富含CO2的空氣中37℃下處理普通奧斯脫的第三階段幼蟲(chóng)20分鐘以除去其第二階段的鞘。然后反復(fù)沖洗幼蟲(chóng)，并在磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)pH7.4中3000g離心1 0分鐘。第六次沖洗后，將它們轉(zhuǎn)移到含有200U/ml青霉素和0.2μg/ml鏈霉素的500ml DME培養(yǎng)基(pH6.8)中，并在含20％CO2空氣中39℃下培養(yǎng)3天。將培養(yǎng)液在20℃下以3000g離心15分鐘，將沉淀的體外轉(zhuǎn)變的L4幼蟲(chóng)貯于-70℃。
通過(guò)冷凍解凍三次。然后用多用勻漿器(Kinematica GmbH，瑞士)勻漿，在50mM Tris-HCl pH 8.0、150mM NaCl中過(guò)夜提取，并在50,000xg下離心30分鐘從去鞘的L3幼蟲(chóng)、體外變成的L4幼蟲(chóng)、體內(nèi)的L4幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)中提取抗原。含已溶解抗原的上清在-70℃下保存。
提取的抗原在非還原條件下在12.5％(W/V)SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，并Western印跡到PVDF膜(Immobilon，Millipore)或硝化纖維膜上。用于接種試驗(yàn)的抗原制備。
在富含CO2的空氣中37℃下處理普通奧斯脫第三階段幼蟲(chóng)2至3小時(shí)以除去其第二階段鞘。去鞘的L3幼蟲(chóng)冷凍解凍三次，然后用基底玻璃勻漿器勻漿，接著在含有2％(W/V)十六烷基三甲基溴化銨(CTAB，Sigma)的150mM NaCl、50mM Tris pH8.0的溶液中過(guò)夜提取。在300g下離心30分鐘以除去其它物質(zhì)。再將上清在15，000xg下離心30分鐘，將溶解的提取物貯存于-20℃。
已提取的抗原在非還原條件下(沒(méi)有煮沸)在10％CTAB-丙烯酰胺凝膠上電泳。Western印跡凝膠兩端的2條帶并將這些帶與陽(yáng)性淋巴反應(yīng)來(lái)鑒定凝膠的合適區(qū)域。將相應(yīng)于免疫反應(yīng)區(qū)域的凝膠區(qū)切下、搗碎并在2％CTAB溶液中培養(yǎng)過(guò)夜以被動(dòng)洗脫抗原。用Dowex樹(shù)脂在2M尿素pH10中培養(yǎng)15分鐘以除去CTAB，然后在PBS中透析過(guò)夜以除去尿素。在Centriprep濃縮器(Amicon)中濃縮抗原，用BCA分析法(Pierce)確定蛋白質(zhì)濃度并用于免疫羊。當(dāng)在SDS-PAGE凝膠上電泳時(shí)該抗原制品表明含有26～36kD的免疫反應(yīng)區(qū)段?？乖b定用從感染的羊的ALN體外培養(yǎng)上清和從插管皺胃淋巴結(jié)中收集的淋巴來(lái)檢測(cè)Western印跡過(guò)的抗原制品。培養(yǎng)上清和淋巴都集中顯示分子量為26～36kD和95～105kD的兩區(qū)段(見(jiàn)圖1)。
印跡的抗原與植物凝血素連接物的培養(yǎng)表明該抗原能結(jié)合一些植物凝血素。這表明一些抗原是糖基化的。用Western印跡鑒定26～36kD抗原的蛋白質(zhì)序列用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并接著用CAPS緩沖液電轉(zhuǎn)移到ProBlott測(cè)序膜上后，測(cè)定該區(qū)段內(nèi)抗原的N-末端氨基酸序列。用考馬斯亮藍(lán)染色確定轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)在膜上的位置并將其切下。在裝有印跡膠片的Applied Biosystems 476A蛋白質(zhì)測(cè)序儀中測(cè)定其序列。經(jīng)過(guò)用澳化氰消化CTAB純化的抗原，用SDS-PAGE分離其片段，印跡到ProBlot上并測(cè)序(如上)獲取進(jìn)一步的中間序列資料。蛋白質(zhì)測(cè)序結(jié)果歸納如下。位于26～36kD區(qū)段的上端部分的兩條帶沒(méi)有給出任何序列并假定其N(xiāo)-末端被封閉。32～36kD區(qū)段的上端兩條帶進(jìn)一步稱(chēng)為“駢聯(lián)體(doublet)”，因?yàn)楫a(chǎn)生的抗該區(qū)段的單克隆抗體同時(shí)識(shí)別這兩條帶(見(jiàn)圖1f)，這表明它們是相似的分子。
使用FASTA程序，在澳大利亞國(guó)家基因組信息服務(wù)中心可得到的序列數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選26-36kD區(qū)段下端帶獲得的序列。結(jié)果如下所示。根據(jù)它們與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列有高度同源性的特征可鑒定其中的兩個(gè)分子。同源序列是原肌球蛋白和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶。
普通奧斯脫序列與它們的同源情況是(A)與原肌球蛋白1.N-末端序列MKAEEVRQALK2.中間序列VEADLERAEERAEAAGENKVVVL(B)與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶
N-末端VQYKLYYFDGRXAAEV為了獲知含有駢聯(lián)體帶的區(qū)段序列，制備了勻漿的普通奧斯脫第3階段幼蟲(chóng)的含水提取物，并在還原條件下經(jīng)SDS-PAGE分離提取物中的蛋白質(zhì)。從考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠上切下駢聯(lián)體帶，然后經(jīng)電洗脫從切下的膠段上擺取蛋白質(zhì)。分離的蛋白質(zhì)用胰蛋白酶消化，因此產(chǎn)生的多肽經(jīng)高效反向液相色譜(HPLC)分離。利用Ed-man降解法在Applied Biosystems 476A蛋白質(zhì)測(cè)序儀中測(cè)序純化的多肽。確定了如下多肽序列1)SAHGPPGQ2)FpHGPSYQHGYA3)IVTHPNR編碼駢聯(lián)體抗原的cDNA克隆文庫(kù)制備從新鮮收獲的L3幼蟲(chóng)中提取RNA，該幼蟲(chóng)已在液氮中驟然冷凍過(guò)(Chomczynski 80 Sacchi，1987，Anal.Biochem.，162，156-159)。在mAP紙(Amershan Australian)上用寡聚dT親和層析分離信使RNA(mRNA)使用cDNA Synthesis System Plus盒(AmershamAustralian)用帶有寡聚dT或者隨機(jī)引物的2μg mRNA制備雙鏈互補(bǔ)DNA(cDNA)。匯集寡聚dT和隨機(jī)引物產(chǎn)生的cDNA并加入EcoR1連接物(cDNA快速連接物連接元件，Amersham Australia)，將銜接的cDNA連接到EcoR1剪切的、脫磷酸化的噬菌表達(dá)載體λMOSELOX臂(Amersham Australia)上并用λ-DNA體外包裝元件(AmershamAastralia)將其包裝上。獲得了一個(gè)1.4×106噬菌斑形成單位(pfu)/ml的初始文庫(kù)，其中9％以上是重組體。該文庫(kù)在使用前在大腸桿菌ER1647細(xì)胞中擴(kuò)增。文庫(kù)篩選5×105pfu的擴(kuò)增的cDNA文庫(kù)以5×104pfu/板涂布于大腸桿菌BL21(DE3)pLys E細(xì)胞上。當(dāng)針刺大小的噬菌斑出現(xiàn)(在37℃培養(yǎng)4-6小時(shí))后，在平板上鋪上硝化纖維素濾紙(該濾紙應(yīng)已用10mM異丙基硫代-β-半乳糖(IPTG)浸泡過(guò))并在37℃下再培養(yǎng)6小時(shí)。然后平板在4℃下保存過(guò)夜。從平板上取出濾紙，在TNT(10mM tris-HCl，pH8，150mM NaCl，0.05％Tween 20)中沖洗，在BLOTTO(5％W/V低脂肪奶粉的TNT)中封閉，并與產(chǎn)生的抗駢聯(lián)體抗原的IgM小鼠單克隆抗體(mAb)(未釋稀的培養(yǎng)上清于室溫下培養(yǎng)2小時(shí)。在TNT中洗過(guò)后，將濾紙與結(jié)合有免抗-小鼠IgG＋I(xiàn)gM(Jackson Immunoresearch)的以15000在BLOTTO中稀釋的堿性磷酸酶在室溫培養(yǎng)1小時(shí)。再次在TNT中洗過(guò)后，用0.165mg/ml的5-澳-3-氯-4-碘磷酸鹽(BCIP)和0.33mg/ml的氮藍(lán)四唑(NBT)在堿性磷酸酶緩沖液(0.1M tris-HCl，pH9.5，0.1MNaCl，5mM MgCl2)中顯色。選出了15個(gè)被推定的陽(yáng)性噬菌斑(其中一些是很不明顯的)，再用如上所述的單克隆抗體重新篩選之后5個(gè)噬菌斑仍呈陽(yáng)性。這些噬菌斑經(jīng)第三次篩選后，涂布在ER1647細(xì)胞上以制備其擴(kuò)增的種子。克隆分析為了確定克隆對(duì)駢聯(lián)體抗原的特異性，進(jìn)行了噬菌斑免疫分析。噬菌斑純化的克隆在BL21(DE3)pLys E大腸桿菌細(xì)胞上涂布并如上所述用IPTG濾紙誘導(dǎo)。然后濾紙與如下物質(zhì)反應(yīng)抗駢聯(lián)體mAb、無(wú)關(guān)IgM小鼠mAb、在羊中產(chǎn)生的用于抗純化的駢聯(lián)體抗原的羊抗血清或者陰性對(duì)照羊血清(兩種羊血清都在BLOTTO中以1∶50稀釋?zhuān)诙贵w是結(jié)合了以1∶5000稀釋的來(lái)自Jackson Immunore-search的免抗羊IgG的堿性磷酸酶。如上所述檢測(cè)陽(yáng)性反應(yīng)。所有克隆都對(duì)抗-駢聯(lián)體mAb呈陽(yáng)性，而對(duì)無(wú)關(guān)mAb和陰性羊血清呈陰性。兩個(gè)克隆(命名為3-2和5-2b)對(duì)羊產(chǎn)生的抗駢聯(lián)體血清呈強(qiáng)烈陽(yáng)性(圖1b～1e)。
以每80mM平板2000噬菌斑將克隆，或入MOSELOX對(duì)照噬菌斑涂布開(kāi)來(lái)以達(dá)到匯合融菌。一旦針刺噬菌斑出現(xiàn)，就加入IPTG濾紙并繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜。用TNT充分沖洗濾紙，在BLOTTO中封閉1小時(shí)，并用抗駢聯(lián)體羊抗血清(BLOTTO中1∶50稀釋)室溫培養(yǎng)4小時(shí)。(在使用前，將該血清與來(lái)自含野生型入MOSELOX噬菌斑的平板的濾紙一起培養(yǎng)以除盡其中的抗一大腸桿菌抗體)。然后在TNT中將濾紙洗五次，在硼酸洗滌緩沖液(0.1M硼酸、0.5M NaCl、0.05％Tween 20，pH8)中洗一次并在PBS(140mM NaCl、2.7mM KCl、8mM Na2HPO4、0.0015mM KH2PO4)中洗一次。將每張濾紙?jiān)?ml0.1M甘油、0.15M NaCl，pH2.6的溶液中洗脫一分鐘以洗脫下對(duì)各克隆特異性的已結(jié)合的親和純化抗體，立即加到含300μl 1Mfris-HCl，pH8溶液的試管中進(jìn)行中和。在4℃下將該抗體在TNT中透析1至2小時(shí)，加入低脂防奶粉以達(dá)到5％W/V并儲(chǔ)存于-20℃。L3幼蟲(chóng)液體提取物在12.5％變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，用電印跡法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到Immobilon膜(Millipore)上。將膜在TNT中沖洗，在BLOTTO中封閉并切成條塊。將條塊與如下物質(zhì)一起于4℃過(guò)夜培養(yǎng)來(lái)自克隆的親和純化抗體、抗駢聯(lián)體的mAb或陰性對(duì)照mAb、或者羊抗駢聯(lián)體抗血清或陰性對(duì)照羊血清。用結(jié)合抗一種類(lèi)抗體的堿性磷酸酶進(jìn)行檢測(cè)，隨后用BCIP和NBT顯色。在對(duì)羊抗-駢聯(lián)體抗血清呈陽(yáng)性的2個(gè)克隆(即3-2和5-2b)中親和純化的抗體在Western印跡特異性地識(shí)別來(lái)自普通奧斯脫幼蟲(chóng)的駢聯(lián)體帶。
按照載體制造商的建議(Amersham Australia)在存在羧芐青霉素的條件下將克隆涂布于大腸桿菌BM25.8細(xì)胞上使其轉(zhuǎn)為質(zhì)粒形式(在pMOSELOX中)。按照《Molecular cloning，A Laboratory Manual，第二版》(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F. & Maniatis，T.，1989，ColdSpring Harbor Laboratory Press)中所述的堿性溶菌和CsCl密度梯度離心制備質(zhì)粒DNA。用EcoRl消化質(zhì)粒DNA，并在含有50μg/ml溴化乙錠的TAE緩沖液(40mM fris-乙酸，pH8，1mM EDTA)中于1％瓊脂糖凝膠上分析質(zhì)粒DNA?？寺?-2含有大約為1000，400和200個(gè)堿基對(duì)的三個(gè)EcoR1片段，而克隆5-2b含有1000和400堿基對(duì)的兩個(gè)片段。DNA測(cè)序使用測(cè)序酶試劑盒根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)(United Sfafes Biochemi-cal Corporafion)以雙脫氧法進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序反應(yīng)在α-35S-dATP存在的條件下進(jìn)行并對(duì)凝膠進(jìn)行放射自顯影。起初使用以插入片段兩邊的載體為基礎(chǔ)的引物(T7基團(tuán)10和SP6引物)。隨后用來(lái)測(cè)序整段插入序列的引物根據(jù)所獲的序列來(lái)設(shè)計(jì)。除了克隆3-2含有一個(gè)相當(dāng)長(zhǎng)的3非翻譯區(qū)(包括mRNA的poly(A)尾巴)外，克隆3-2和5-2b含有相同的DNA序列。該DNA序列及其預(yù)測(cè)的氨基酸序列在圖1g中顯示。預(yù)測(cè)的氨基酸序列用來(lái)通過(guò)BLAST程序(Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，1W.Myers，E.W.80 Lipman，D.J.，1990，J.Mol.Biol.215，403-410)對(duì)綜合蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜尋，該搜尋以ANGIS作為界面在國(guó)家生物技術(shù)信息中心的計(jì)算機(jī)上進(jìn)行。發(fā)現(xiàn)該序列與來(lái)自Caenorhabditis elegans和旋盤(pán)屬絲蟲(chóng)的32kD類(lèi)植物凝血素β-半乳糖苷-結(jié)合蛋白質(zhì)(GBP)具有高度同源性。普通奧斯脫序列與C.elegans序列有69％相同并與旋盤(pán)屬絲蟲(chóng)序列有78％相同。氨基酸序列的對(duì)比如圖1h所示。通過(guò)與這些同源序列的類(lèi)比，兩個(gè)克隆都含有起始序列ATG。該駢聯(lián)體是一種類(lèi)植物凝血素β-半乳糖苷結(jié)合蛋白質(zhì)的證據(jù)駢聯(lián)體抗原與C.elegans 32k GBP所共有的特征包括在SDS-PAGE上的大小、缺乏糖基化和封閉的N-末端(見(jiàn)Hirabayashi，J.，Satoh，M.和Kasai，K.，1992，J.Biol.Chem.267，15485-15490)。C.elegans GBP的一個(gè)特征是它能夠通過(guò)結(jié)合到asialofetuin柱上而被親和純化(Hirabayashi，J.，Satoh，m.，Ohyama，Y.& Kasai，K.，1992，J.Biochem.Tokyo 111，553-555)在含水緩沖液(150mM NaCl、2mM EDTA、50mM tris-HCl，pH8)中提取普通奧斯脫的L3幼蟲(chóng)，將提取物用于過(guò)asialofefuin-af-figel 15柱用含有100mM乳糖的上述緩沖液洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。SDS-PAGE分析表明該駢聯(lián)體結(jié)合到asialofefuin柱上(圖表1i)。這證實(shí)該駢聯(lián)體確實(shí)是一種類(lèi)植物凝血素β-半乳糖苷結(jié)合蛋白質(zhì)。由于駢聯(lián)體的兩條帶都結(jié)合到糖柱上，因此，它們都是類(lèi)植物凝血素GBP。還不知道為什么該GBP在普通奧斯脫中顯示兩條帶而在C.el-egans中只顯示一條帶。也許普通奧斯脫的蛋白質(zhì)經(jīng)歷了某種程度的翻譯后裂解。
線(xiàn)蟲(chóng)中的這些GBP的功能還不清楚，但是對(duì)C.elegans而言，據(jù)推測(cè)，它們涉及形態(tài)發(fā)生的調(diào)節(jié)，如表皮的形成。重組抗原的表達(dá)使用D.Hanahan的簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)化方法〔在《DNA克隆實(shí)用方法》第一卷，1985(D.M.Glover編輯)，IRL出版社，牛津，第115頁(yè)〕將來(lái)自克隆或pMOSELIX對(duì)照的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)pLysE細(xì)胞中。有必要將該質(zhì)粒從BM25.8轉(zhuǎn)移到該菌株上，因?yàn)橹亟M抗原在T7啟動(dòng)子控制下表達(dá)而且BL21(DE3)pLysE細(xì)胞是在Lac啟動(dòng)子控制下攜帶編碼T7聚合酶的基因。挑選菌落并在37℃生長(zhǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜培養(yǎng)物以1∶100稀釋?zhuān)?0ml培養(yǎng)物接種并生長(zhǎng)5小時(shí)。加入IPTG到0.1mM以誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的合成并繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜。將大腸桿菌細(xì)胞沉淀在含有0.1％Triton x-100的PBS中重新懸浮并用聲處理將其擊碎。沉淀不溶性物質(zhì)(包括內(nèi)含體)并在1％CTAB中用聲處理重新懸浮。樣品用SDS-PAGE和Western印跡進(jìn)行分析(圖1j和1k)。用抗駢聯(lián)體mAb或用抗駢聯(lián)體抗原的羊抗血清檢測(cè)在Western印跡中呈陽(yáng)性的克隆3-2和5-2b產(chǎn)生的融合蛋白質(zhì)。與此相反，克隆7-1、7-2和8-2產(chǎn)生的融合蛋白質(zhì)對(duì)駢聯(lián)體mAb呈陽(yáng)性但對(duì)羊抗血清不呈陽(yáng)性，這證實(shí)了前面所述的斑點(diǎn)免疫分析的結(jié)果(圖1b～1e)。pMOSELOX對(duì)照蛋白質(zhì)不與兩種抗體反應(yīng)。所有重組融合蛋白質(zhì)和pMOSELOX對(duì)照蛋白質(zhì)都全部定位于CTAB-溶融的細(xì)胞沉淀中，這表明它們?cè)趦?nèi)含體中表達(dá)。接種試驗(yàn)用含有26～36kD免疫反應(yīng)性區(qū)段的天然普通奧斯脫抗原的CTAB提取物進(jìn)行了三個(gè)接種試驗(yàn)。
接種過(guò)的羊免疫三次，每次間隔2至3周，每次免疫使用50～100μg蛋白質(zhì)(在quil A中)。對(duì)照羊只接受quil A。所有免疫都以皮內(nèi)給藥。在最后一次免疫2至3周后用20,000L3幼蟲(chóng)攻擊感染所有的羊并監(jiān)測(cè)其糞便蟲(chóng)卵數(shù)。三個(gè)不同的接種試驗(yàn)的結(jié)果如圖2a～2c所示，與對(duì)照相比，接種組的糞便蟲(chóng)卵數(shù)明顯減少。
第一個(gè)試驗(yàn)由5只接種羊和3只對(duì)照羊組成。第二個(gè)試驗(yàn)有10只接種羊和8只對(duì)照羊。第三個(gè)試驗(yàn)由7只接種羊和7只對(duì)照羊組成。物種的交叉反應(yīng)當(dāng)用以普通奧斯脫26～36kD抗原接種的羊的血清檢測(cè)時(shí)，在奧氏奧斯脫抗原制品中也鑒定到了一個(gè)26～36kD抗原區(qū)段(未顯示)。這表明相似的抗原也存在于該物種中，也可能存在于其它線(xiàn)蟲(chóng)種類(lèi)中。
用粗制可溶性捻轉(zhuǎn)血矛的L3提取物在第三次奧斯脫接種試驗(yàn)的最后進(jìn)行了周?chē)毫馨图?xì)胞增生試驗(yàn)。與對(duì)照羊(平均值為6122cpm)相比，在接種羊(平均值為24003cpm)中觀(guān)察到了由捻轉(zhuǎn)血矛抗原引起的極顯著(p＜0.02)的刺激，這表明在26～36kD抗原區(qū)段兩種寄生蟲(chóng)間存在交叉反應(yīng)。為了評(píng)估交叉保護(hù)，第三試驗(yàn)中的所有羊都喂用ivermecfin以去除殘留的奧斯脫蟲(chóng)，并用10,000捻轉(zhuǎn)血矛幼蟲(chóng)感染。如圖2d中所示，與對(duì)照組相比，接種的羊的糞便蟲(chóng)卵數(shù)始終較低，這表明發(fā)生了交叉保護(hù)。因?yàn)閷?duì)照組的糞便蟲(chóng)卵數(shù)存在很大差異，日蟲(chóng)卵數(shù)得不到統(tǒng)計(jì)顯著性，但是兩組間的方差(F-檢驗(yàn))存在顯著差異。這兩個(gè)結(jié)果表明在血矛屬和奧斯脫屬的物種間存在顯著的異源性刺激和保護(hù)，也可能存在類(lèi)似的保護(hù)性分子。95～105kD抗原的特征制備的抗澳大利亞專(zhuān)利640,364所述的捻轉(zhuǎn)血矛的60～90kD表面抗原的特異性抗血清也與同樣95～105kD區(qū)段的普通奧斯脫L3幼蟲(chóng)抽提物發(fā)生反應(yīng)。這表明它是一種與捻轉(zhuǎn)血矛中所述的類(lèi)似的抗原。
實(shí)施例2游行毛圓線(xiàn)蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)經(jīng)過(guò)用游行毛圓線(xiàn)蟲(chóng)感染幾次來(lái)免疫羊然后保持至少4個(gè)月不受感染。用50,000游行毛圓線(xiàn)蟲(chóng)L3幼蟲(chóng)攻擊感染，10天后將羊殺死并取下第一腸系膜淋巴結(jié)(MLN)。按對(duì)普通奧斯脫所述的方法加工和培養(yǎng)淋巴結(jié)細(xì)胞，其上清用來(lái)探測(cè)寄生蟲(chóng)抗原的Western印跡。如前面對(duì)普通奧斯脫所述的方法制備普通奧斯脫、捻轉(zhuǎn)血矛和游行毛圓線(xiàn)蟲(chóng)的L3幼蟲(chóng)抗原提取物。
提取的抗原在還原條件下于12.5％(W/V)SDS-PAGE上電泳并Western印跡到PVDE膜(Immobilon，Millipore)上。用MLN-上清探測(cè)Western印跡并用結(jié)合抗一羊Ig(DAKO)的過(guò)氧化物酶顯色。結(jié)果和討論觀(guān)察到了與分子量為32～35kD間孤游行毛圓線(xiàn)蟲(chóng)抗原提取物的強(qiáng)烈反應(yīng)，顯然它由駢聯(lián)體構(gòu)成(圖3)。與普通奧斯脫和捻轉(zhuǎn)血矛抗原沒(méi)有或只有較弱反應(yīng)。然而，在SDS-PAGE上，游行毛圓線(xiàn)蟲(chóng)駢聯(lián)體抗原與上述普通奧斯脫抗原具有相同的位置，因此有可能兩者是基本相似的分子但具有能最強(qiáng)地被同源上清抗體探針識(shí)別的種特異性的抗原決定基。
實(shí)施例3肝片形吸蟲(chóng)我們已經(jīng)使用Western印跡技術(shù)用按澳大利亞專(zhuān)利No.640364所述方法獲取的抗體探針鑒定了推定的肝片形吸蟲(chóng)保護(hù)性抗原。類(lèi)似的抗原也可存在于其它片形吸蟲(chóng)屬種類(lèi)(如大片形吸蟲(chóng))和其它寄生線(xiàn)蟲(chóng)(如Schistosoma spp.)中。
寄生蟲(chóng)和抗原提取從Ciba-Geigy(N.S.W.，澳大利亞)獲取肝片形吸蟲(chóng)后囊蚴蟲(chóng)(Mc)。通過(guò)如前所述的體外脫囊法(澳大利亞專(zhuān)利No.640364)獲取剛脫囊的幼蟲(chóng)(NEJ)?？诜腥?7天后從小鼠肝中回收幼年肝吸蟲(chóng)。不同階段的吸蟲(chóng)在含有蛋白酶抑制劑的PBS中聲處理，在SDS非還原性樣品緩沖液中煮沸，然后在10％SDS-PAGE凝膠上電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜(immobilon-P Millipore，MA)上以供進(jìn)行如前所述的Western印跡(專(zhuān)利號(hào)640364)。培養(yǎng)上清的制備基本上如前所述(專(zhuān)利號(hào)640364)，以每毫升培養(yǎng)基(含有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100μ/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和2.5×10-52—巰基乙醇的DME培養(yǎng)基)3×106個(gè)細(xì)胞體外培養(yǎng)脾、肝淋巴結(jié)(HLN)和腸系膜淋巴結(jié)(MLN)細(xì)胞培養(yǎng)4至5天后收獲上清并貯存于—20℃直至使用。實(shí)施設(shè)計(jì)用100肝片形吸蟲(chóng)Mc感染8至9周齡的PVC大鼠，10天后用殺吸蟲(chóng)劑Fasinex 120(Ciba-Geigy)以75μg/克劑量處理。6周后用200Mc經(jīng)口服攻擊感染大鼠，攻擊7-10天后殺死大鼠以收集HLN、MLN和脾細(xì)胞。結(jié)果當(dāng)不存在“爆發(fā)性”感染(即用殺吸蟲(chóng)劑完全治愈和根除初始感染)時(shí)，第二次攻擊感染后不同淋巴器官之間的局部抗體反應(yīng)存在顯著差異。當(dāng)脾或HLN上清用來(lái)探測(cè)NEJ抗原的Western印跡時(shí)沒(méi)有觀(guān)察到反應(yīng)，然而一個(gè)明顯的抗原駢聯(lián)體被來(lái)自MLN細(xì)胞的上清所識(shí)別。該抗原位于110kD分子量標(biāo)記之上(圖4)，并在隨后的實(shí)驗(yàn)中(未顯示)見(jiàn)到它遷移到200kD分子量標(biāo)記之上，進(jìn)而稱(chēng)為大于200kD的抗原。
當(dāng)檢測(cè)到“爆發(fā)性”感染的信號(hào)時(shí)(即肝臟肉芽瘤或膽導(dǎo)管中的成蟲(chóng)吸蟲(chóng))，用HLN上清觀(guān)察到了一種NEJ抗原識(shí)別的多變而復(fù)雜的類(lèi)型，但是第二次攻擊感染之后大于200kD抗原又僅僅而且唯一地只被MLN細(xì)胞上清識(shí)別(未顯示)。
以缺乏肉眼可見(jiàn)的肝小管和在搗碎的全部肝臟制品中完全缺乏幼年吸蟲(chóng)判定所有大鼠都對(duì)口服攻擊感染產(chǎn)生免疫。
當(dāng)用17日齡肝吸蟲(chóng)抗原與跟上述相同的MLN上清在Western印跡上進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，沒(méi)有觀(guān)察到這種大于200kD駢聯(lián)體反應(yīng)(未顯示)，這表明該抗原對(duì)NEJ階段具有特異性。結(jié)論已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在非還原SDS-PAGE凝膠上分子量大于200kD的駢聯(lián)體抗原，該抗原存在于NEJ階段并且能在給免疫大鼠口服攻擊感染后的早期次級(jí)應(yīng)答期間被MLN細(xì)胞培養(yǎng)上清專(zhuān)一性地識(shí)別。由于在大鼠中形成的抗口服攻擊感染的免疫已表明發(fā)生于消化道水平(查閱Vet.Parasitol.1986，20，63～93)，因此該抗原是一種很有希望的候選疫苗。大于200kD的抗原似乎對(duì)NEJ吸蟲(chóng)具有階段特異性，因?yàn)樵谙嗨茥l件下在從肝組織收集到的吸蟲(chóng)中沒(méi)有檢測(cè)到該抗原，因此它可能只對(duì)NEJ階段有效。
實(shí)施例4肝片形吸蟲(chóng)以實(shí)施例2中報(bào)道的方式進(jìn)行寄生蟲(chóng)和抗原提取以及培養(yǎng)上清的制備。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用50個(gè)肝片形吸蟲(chóng)Mc口服感染8至9周齡的PVC大鼠，14天后用150μg Triclabendazole/克將其治愈。3天后再次用150個(gè)Mc口服感染，4天后跟上次那樣將其治愈。第一次感染1-2個(gè)月后經(jīng)口服攻擊感染用400Me大鼠，7天后將其殺死以收集HLN、MLN和脾細(xì)胞。單克隆抗體(mcAb)的產(chǎn)生如上面那樣對(duì)大鼠進(jìn)行免疫和攻擊感染，并在攻擊感染5天后將其殺死。制備MLN細(xì)胞懸液，并與由英國(guó)牛津MRC Cellubr Im-munology Unit提供的Y3大鼠骨髓瘤細(xì)胞融合。針對(duì)NEJ和17日肝階段抗原在Western印跡上篩選融合上清。以鼠胸腺細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞將陽(yáng)性融合體重新克隆至少二次。利用mcAb的表面染色用含有0.05％迭氮化鈉的mcAb上清液在冰上培養(yǎng)體外脫皮的NEJ30分鐘。在冷的PBS-迭氮化合物中洗滌三次，然后象前面那樣用結(jié)合了兔抗-大鼠免疫球蛋白(DAKO-Denmark)并且以1∶20在PBS中稀釋的過(guò)氧化物酶進(jìn)行培養(yǎng)。在PBS中洗三次，之后用Di-amino聯(lián)苯胺底物顯色數(shù)分鐘，再稀釋以中止顯色。在PBS中再洗兩次后，NEJ在含有1％甲醛和2％葡萄糖的PBS中固定并在光學(xué)顯微鏡下評(píng)價(jià)其染色情況。結(jié)果實(shí)施例3的結(jié)論部分所述的大于200kD的抗原也出現(xiàn)在免疫過(guò)兩次的大鼠的MLN上清液中。另外，這種高度免疫的MLN上清液也識(shí)別約32kD的抗原和分子量的在42kD和100kD之間的彌散性抗原(圖5)。這兩種額外的抗原也僅能在NEJ抗原的印跡上檢測(cè)到而在17日齡肝階段抗原的印跡上檢測(cè)不到。單克隆抗體(mcAb)從二次免疫和攻擊感染后的MLN細(xì)胞的融合體中獲得了一些單克隆抗體。其中的三個(gè)mcAb(F.h.1-3)似乎識(shí)別用MLN上清液檢測(cè)到的三種抗原。從感染的大鼠肝淋巴結(jié)中產(chǎn)生了一個(gè)mcAb(FY 1-6)并且該mcAb識(shí)別也被NEJ和肝階段吸蟲(chóng)的感染血清所強(qiáng)烈識(shí)別的抗原。所有產(chǎn)生的mcAb和它們各自的分子量抗原都?xì)w納在表1中。
后繼實(shí)驗(yàn)(未顯示)表明mcAb FY4-7-12、FY3-3-1和FY3-3-2還與感染未處理過(guò)的小鼠2天后(而不是4天)收集的腹腔吸蟲(chóng)發(fā)生反應(yīng)。
ND＝未做過(guò)*＝在活NEJ上進(jìn)行表面染色的檢測(cè)當(dāng)與活NEJ反應(yīng)時(shí)，2個(gè)mcAb(FY3-3-1和FY3-3-2)與NEJ吸蟲(chóng)的表面發(fā)生反應(yīng)，且各自具有獨(dú)特的染色表現(xiàn)(圖6)。生化特征將2-巰基乙醇(終濃度為5％V/V)加到NEJ蛋白質(zhì)提取物中以檢測(cè)被mcAb識(shí)別的分子的還原敏感性。還原后抗原F.h.2有顯著的上移現(xiàn)象，這表明該抗原含有許多二硫鍵。還原后被mcAb FY3-3-2識(shí)別的頂部帶在凝膠上下移而抗原F.h.6未移動(dòng)。
為了確定該mcAb是否識(shí)別碳水化合物抗原決定基，將NEJ抗原提取物的SDS-PAGE凝膠印跡到PVDF膜上并且按Woodward，MP等(J.Immunol.Methods，78143，1985)所述方法用高磺酸進(jìn)行處理。高碘酸處理后mcAbFY3-3-2和FY1-6的反應(yīng)性分別喪失或者劇烈降低，這表明這些mcAb與碳水化合物抗原決定基發(fā)生反應(yīng)。印跡的高碘酸處理沒(méi)有改變mcAbFY3-3-1和FY4-7的反應(yīng)性。mcAbFY3-3-2對(duì)碳水化合物抗原決定基的識(shí)別解釋了它在Western印跡上的彌散識(shí)別方式，因?yàn)樘妓衔锟乖瓫Q定基存在于許多糖蛋白中。氨基酸序列資料NFJ抗原制品在SDS-PAGE上電泳，印跡到ProBlot膜(AppliedBiosystems)上并用考馬斯亮藍(lán)染色。相應(yīng)于抗原號(hào)F.h.2和F.h.6的位置的帶被切下來(lái)并直接在ABI型476A蛋白質(zhì)測(cè)序儀中測(cè)序。獲得的N-末端序列是F.h.6LEDNGRTHWAVLVAF.h.2KPNYKRQFEPFSDELIHYINLEF.h.2的序列與孟氏血吸蟲(chóng)的組織蛋白酶B(Sm31)mRNA〔Mol.Biochem.Parasitol.33113-122(1989)〕在14個(gè)氨基酸的重疊區(qū)有64.3％是相同的。
對(duì)于F.h.6沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有明顯的同源性。結(jié)論本發(fā)明包括了那些被免疫攻擊感染的大鼠的MLN上清所識(shí)別的抗原和所有在表1中所述的抗原及其各自的抗體。因?yàn)樵诖笫笾嗅槍?duì)口服攻擊感染而形成的免疫性表明出現(xiàn)在抗早期吸蟲(chóng)階段的消化道和腹腔水平上(查閱Vet.Parasitol.1986，2063～93)，所以這些抗原是候選疫苗。其中四種抗原對(duì)NEJ和2日齡吸蟲(chóng)表現(xiàn)出具有階段專(zhuān)一性，因?yàn)樵陬?lèi)似的條件(Western印跡)下在感染的晚期收集的吸蟲(chóng)中檢測(cè)不到它們，因此它們可能參與保護(hù)作用。階段專(zhuān)一性抗原以前在肝片吸蟲(chóng)中沒(méi)有鑒定出來(lái)，而且僅僅在本發(fā)明中通過(guò)使用分泌新抗體的細(xì)胞探針才被檢測(cè)出來(lái)。
最后，要明白的是，在沒(méi)有背離本文概括的本發(fā)明實(shí)質(zhì)的情況下可進(jìn)行各種其它的修飾和/或改變。
權(quán)利要求
1.一種抗普通奧斯脫線(xiàn)蟲(chóng)或有關(guān)感染的推定的保護(hù)性抗原或其片段，選自具有前文所述的近似分子量范圍為26～36和95～105千道爾頓的抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的推定的保護(hù)性抗原，其中26～36kD抗原包括在32～36kD位置上的駢聯(lián)體抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的推定的保護(hù)性抗原，其中駢聯(lián)體抗原是類(lèi)植物凝血素β-半乳糖苷結(jié)合蛋白質(zhì)，并且可包含下列多肽序列中的一個(gè)或多個(gè)SAHGPPGQFPHGPSYQHGYAIVTHPNR
4.根據(jù)權(quán)利要求1的推定的保護(hù)性抗原，其中在26～36kD范圍的抗原與普通奧斯脫含有N-末端序列MKAEEVRQALK和中間序列VEADLERAEERAEAAGEN-KVVVL的原肌球蛋白同源。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的推定的保護(hù)性抗原，其中26～36kD范圍的抗原是普通奧斯脫中的含有N-末端序列VQYKLYYFDGRX-AAEV的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的同源物。
6.一種抗游行毛圓線(xiàn)蟲(chóng)或有關(guān)感染的推定的保護(hù)性抗原或其片段，具有前文所述的32-35千道爾頓的近似分子量。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的推定的保護(hù)性抗原，其中該抗原是駢聯(lián)體抗原。
8.一種選自前文所述的具有近似分子量為28千道爾頓、32千道爾頓、37千道爾頓、42至100千道爾頓、54至55千道爾頓和大于200千道爾頓的抗原的抗肝片形吸蟲(chóng)或其相關(guān)感染的推定的保護(hù)性抗原或其片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的推定的保護(hù)性抗原，其中大于200kD的抗原是駢聯(lián)體抗原。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的推定的保護(hù)性抗原，其中32kD抗原包括N-末端序列KPNYKRQFEPFSDELIHYINLE。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的推定的保護(hù)性抗原，其中54～55kD抗原含有N-末端肽序列LEDNGRTHWAVLVA。
12.根據(jù)權(quán)利要求8的推斷的保護(hù)性抗原，其中肝片吸蟲(chóng)抗原專(zhuān)一性地被免疫、攻擊感染的大鼠腸系膜淋巴結(jié)(MLN)細(xì)胞上清識(shí)別。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12任意一項(xiàng)的，與選自片形吸蟲(chóng)屬、奧斯脫屬和毛圓線(xiàn)蟲(chóng)屬的種類(lèi)及其相近物種病原體相聯(lián)系的抗原的制備方法，該方法包括(1)提供一種選自片形吸蟲(chóng)屬、奧斯脫屬和毛圓線(xiàn)蟲(chóng)屬種類(lèi)及其相近物種的病原體樣品；一種相應(yīng)的抗體探針，包括至少一種抗各自病原體的抗體，其生產(chǎn)方法包括提供一種用選自片形吸蟲(chóng)屬、奧斯脫屬和毛圓線(xiàn)蟲(chóng)屬的種類(lèi)及其相近物種的病原體或病原體提取物攻擊感染免疫動(dòng)物后短時(shí)間內(nèi)從免疫動(dòng)物中提取的生物樣品，從生物樣品中分離細(xì)胞，在合適的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)細(xì)胞并且收獲所說(shuō)的細(xì)胞產(chǎn)生的抗體；(2)用相應(yīng)的抗體探針探測(cè)病原體樣品以檢測(cè)出至少一種抗原；(3)分離被檢測(cè)的抗原。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中病原體樣品是在其最易受攻擊的發(fā)育階段提取的。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中樣品是在幼蟲(chóng)階段提取的。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中相應(yīng)的抗體探針以從培養(yǎng)基中收獲的上清形式存在。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中上清是來(lái)自免疫攻擊感染的大鼠的腸系膜淋巴結(jié)(MLN)細(xì)胞。
18.一種生產(chǎn)抗根據(jù)權(quán)利要求1至12中任何一個(gè)的，選自片形吸早屬、奧斯脫屬和毛圓線(xiàn)蟲(chóng)屬物種病原體的抗原的單克隆抗體的方法，該方法包括(1)提供一種從用針對(duì)上述病原體的保護(hù)性抗原免疫的動(dòng)物中獲得的并且能產(chǎn)生抗所說(shuō)的保護(hù)性抗原或其片段的抗體的B細(xì)胞；一種骨髓瘤細(xì)胞；(2)將骨髓瘤細(xì)胞與B細(xì)胞融合；(3)繁殖由此形成的雜交瘤；(4)收獲所說(shuō)的雜交瘤產(chǎn)生的抗體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中抗原是肝片形吸蟲(chóng)抗原。
20.一種抗根據(jù)權(quán)利要求18或19的方法產(chǎn)生的保護(hù)性抗原的單克隆抗體。
21.一種抗前文所述的選自由FY 4-7-12、FY3-3、FY3-3-2、FY3-5、FY4-7-6和FY1-6組成的組中的肝片吸蟲(chóng)抗原的單克隆抗體。
22.一種針對(duì)根據(jù)權(quán)利要求1至12中任何一個(gè)的，選自片形吸蟲(chóng)屬、奧斯脫屬和毛圓線(xiàn)蟲(chóng)屬物種及其相近物種的病原體的人工合成的抗原性多肽的制備方法，該方法包括(1)提供一種從選自片形吸蟲(chóng)屬、奧斯脫屬和毛圓線(xiàn)蟲(chóng)屬物種及其相近物種病原體的樣品產(chǎn)生的cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)；一種相應(yīng)的抗體探針，它含有至少一種由如下方法產(chǎn)生的抗各自病原體的抗體，該方法包括提供一種用選自片形吸蟲(chóng)屬、奧斯脫屬和毛圓線(xiàn)蟲(chóng)屬物種及相近物種的病原體或病原體提取物攻擊感染免疫動(dòng)物后短時(shí)間內(nèi)從免疫動(dòng)物中制備的生物樣品，或者一種由此而得的相應(yīng)單克隆抗體，或者一種注射純化抗原后產(chǎn)生的多克隆或單克隆抗體；(2)由cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)產(chǎn)生人工合成的多肽；(3)用抗體探針探測(cè)合成的多肽；，(4)分離由此檢測(cè)到的合成多肽。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中cDNA文庫(kù)是源于普通奧斯脫樣品，相應(yīng)的抗體探針是產(chǎn)生的抗32～36kD駢聯(lián)體抗原的單克隆抗體。
24.一種用根據(jù)權(quán)利要求22或23的方法生產(chǎn)的人工合成的抗原多肽。
25.具有如下文所述的如下氨基酸序列的合成抗原多肽、克隆3-2和5-2bM.A.FETNYP IPYRSKLTEP FEPGQTLTVK GKTGEDSVRF TINLHNSSADFSGNDVPLHV SVRFDEGKIV CNSFAKGEWGKEERKSNPYK KGDDIDIRIRAHDSKFQIFV DQKELKEYEH RLPLSSITHF SIDGDVLITH IHWGGKYYPVPYESGLAGEG LSPGKSLYLY GMPEKKGKRF HINILKKNGD IALHFNPRFDEKAWRNSLI SNEWGNEERE GKMPFEKAVG FDLEIKNEDY PFQIMVNGERFASYSHRLEP HELNGLQIGG DVEITGIQLH
26.一種含有權(quán)利要求1至12中任意一個(gè)的診斷性抗原或其片段的診斷試劑盒。
27.一種預(yù)防動(dòng)物疾病的方法，該方法包括給動(dòng)物服用預(yù)防有效量的至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至12中任意一個(gè)的保護(hù)性抗原。
28.一種治療動(dòng)物疾病的方法，該方法包括給動(dòng)物服用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求20或21的抗保護(hù)性抗原的單克隆抗體。
29.一種疫苗或獸藥組合物，包括預(yù)防有效量的至少一種保護(hù)性抗原，該保護(hù)性抗原是根據(jù)權(quán)利要求1至12中任意一個(gè)的針對(duì)至少一種選自片形吸蟲(chóng)屬、奧斯脫屬和毛圓線(xiàn)蟲(chóng)屬的病原體的抗原。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的疫苗或獸藥組合物，包括針對(duì)多種病原體的復(fù)合保護(hù)性抗原。
31.一種疫苗或獸藥組合物包括治療有效量的至少一種根據(jù)權(quán)利要求20或21的單克隆抗體。
32.一種根據(jù)權(quán)利要求31的疫苗或獸藥組合物，包括多種單克隆抗體。
33.參考任一實(shí)施例的基本上如上文所述的一種推斷的保護(hù)性抗原，或單克隆抗體。
全文摘要
針對(duì)選自由普通奧斯脫線(xiàn)蟲(chóng)、游行毛圓線(xiàn)蟲(chóng)和肝片形吸蟲(chóng)組成的組中的感染或相關(guān)感染的推定的保護(hù)性抗原或其片段，作為抗原，它們選自具有近似分子量范圍為26～36和91～105千道爾頓的抗原、具有近似分子量為32～35千道爾頓的抗原和具有近似分子量范圍分別為28千道爾頓、32千道爾頓、37千道爾頓、42至100千道爾頓、54至55千道爾頓和大于200千道爾頓的抗原。
文檔編號(hào)A61P33/00GK1132514SQ94193571
公開(kāi)日1996年10月2日 申請(qǐng)日期1994年9月27日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月28日
發(fā)明者E·N·T·米森, J·瓦爾克, K·阿思曼, S·E·紐頓 申請(qǐng)人:墨爾本大學(xué), 肉類(lèi)研究公司