專利名稱：具有作為血小板聚集抑制劑活性的新的肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有血小板聚集抑制作用的新型肽，和含有新型肽為活性成分的血小板聚集抑制劑，體外循環(huán)血液凝固抑制劑，細(xì)胞粘連抑制劑，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑，和輸血用血小板制劑的保護(hù)劑，以及加有新型肽的輸血用血小板制劑，輸血用血小板制劑包，該包中的輸血用血小板制劑含有新型肽。
背景技術(shù)：
血小板通過粘附于損傷血管表面在止血中起重要作用。
但是，已知血小板聚集主要引起血栓的形成，而形成的血栓阻塞血管。這種阻塞阻止了氧和養(yǎng)分對組織和器官的充分供應(yīng)，從而在循環(huán)器官中引起局部缺血疾病，以心肌梗塞形成和大腦梗塞形成為代表。目前，這些局部缺血疾病的死亡率僅次于癌癥，已成為一個嚴(yán)重的社會問題。
當(dāng)在醫(yī)學(xué)治療中涉及血液體外循環(huán)時，例如在外科手術(shù)中使用人工心臟和肺，對腎衰竭患者使用腎透析時，血小板激活作用和聚集作用可引起血液凝固，其對醫(yī)學(xué)治療的進(jìn)行產(chǎn)生不利影響。
因此防止血栓生成和血液凝固在避免局部缺血性疾病的發(fā)生或在安全進(jìn)行體外循環(huán)中是重要的事情。
血小板通過血漿中凝血酶，連接組織蛋白如由于血管損傷而暴露的內(nèi)皮下組織中的膠原蛋白及其它物質(zhì)與血小板膜上的受體結(jié)合而被激活。血小板也可通過類似自泌的方式使釋放的二磷酸腺苷(ADP)，腎上腺素，5-羥色胺，促凝血酶(TX)A2等這類物質(zhì)與膜受體結(jié)合而被激活。含有血纖維蛋白原受體的兩種糖蛋白單元存在于細(xì)胞表面上，并與形成受體復(fù)合物(gpIIbIIIa)有關(guān)，以此引發(fā)由血纖維蛋白原為橋的聚集作用。
先天性缺乏gpIIb和gpIIIa的血小板機(jī)能不全患者沒有血小板聚集能力。因此，很明顯，gpIIbIIIa復(fù)合物與血纖維蛋白原的結(jié)合對于血小板聚集是必不可少的(Rouslahti et al.，Science，238，491(1987))。
人們已作出努力，利用gpIIbIIIa復(fù)合物的性質(zhì)通過抑制血小板聚集作用來防止血栓形成。
例如，Coller等報(bào)導(dǎo)抗gpIIbIIIa復(fù)合物的單克隆抗體的F(ab′)2片段對血小板聚集有強(qiáng)烈的抑制作用，并證實(shí)了利用這種作用可開發(fā)血小板聚集抑制劑(Blood，68，783(1986))。
盡管認(rèn)識到這種單克隆抗體具有作為抑制血小板聚集的治療劑的潛在效能，但由于它本身是一個大的蛋白質(zhì)，重復(fù)給藥可能會產(chǎn)生抗這種單克隆抗體的抗體，這是令人擔(dān)憂的。
因此，希望開發(fā)含有非致免疫小化合物作為活性成分的血小板聚集抑制劑，這些小化合物具有拮抗gpIIbIIIa復(fù)合物的性質(zhì)。
已經(jīng)積極地進(jìn)行了血纖維蛋白原與gpIIbIIIa復(fù)合物結(jié)合的研究。這些研究起始于Ruoslahti等人進(jìn)行的一系列研究所發(fā)現(xiàn)的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)為細(xì)胞粘連分子共有氨基酸序列(Ruoslahtiet al.，Nature 309，30-33(1984))。識別RGD序列受體的研究證實(shí)gpIIbIIIa復(fù)合物是一個分類于識別RGD序列整聯(lián)蛋白類的受體(Phillips et al.，Blood，71，831-843(1988))，并且這種復(fù)合物特定識別存在于血纖維蛋白原分子中的兩個精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸(RGDF)序列，由此復(fù)合物與血纖維蛋白原結(jié)合(Andrieux et al.，J.Biol.Chem.，264，9258-9265(1989))。
進(jìn)一步地，已知gpIIbIIIa復(fù)合物與具有RGD序列的遺傳性假血友病因子，纖維連結(jié)素，玻璃體結(jié)合蛋白和凝血酶敏感蛋白以及血纖維蛋白原結(jié)合(Pytela et al.，Science.，231，1559(1986)和Cell，42，439(1985))。
由這些發(fā)現(xiàn)人們期望含有RGD序列的合成肽抑制gpIIbIIIa復(fù)合物與血纖維蛋白原結(jié)合，從而抑制血小板聚集。事實(shí)上，已有報(bào)導(dǎo)400μM合成肽甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸-脯氨酸(GRGDSP)完全抑制了被ADP激活的血小板聚集作用(Plow etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，82，8057-8061(1985))。另外，也已證明濃度為46-50μM的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸(RGDS)以濃度依賴方式抑制80-90％的血小板聚集作用(Plow et al.，Blood，70，110-115(1987))。并且已經(jīng)報(bào)導(dǎo)肽RGDF具有的血小板聚集抑制活性是RGDS的4-5倍(Harfinestet al.，71，132-136(1988))。
日本未審專利公開(下文稱作“KOKAI”)Nos.平1-190699和平2-62892，EPO422937A1和美國專利(下文稱作“USP”)No.4952562公開了含有RGD序列的四肽衍生物。KOKAI No.昭63-215696公開了其它含RGD序列的肽衍生物。KOKAI Nos.平3-118331和平2-62892和WO91/01331公開了含有RGD肽環(huán)狀結(jié)構(gòu)的衍生物。
最近幾年，為了開發(fā)具有高血小板聚集抑制活性并在體內(nèi)有極好穩(wěn)定性的試劑，已經(jīng)積極進(jìn)行了研究，其中具有天然不存在結(jié)構(gòu)的化合物由作為關(guān)鍵化合物的RGD肽衍生(Hartman et al.，J.Med.Chem.35，4640-4642(1992)and Callahan et al.，ibid，35，3970-3972(1992))。這些化合物作為口服血小板聚集抑制劑是有用的，其對蛋白酶作用敏感。
但是預(yù)期這些化合物會呈現(xiàn)毒性(這個問題經(jīng)常發(fā)生在衍生為非天然結(jié)構(gòu)的情況中)和副作用，這是由于這些藥物在人體內(nèi)不產(chǎn)生代謝變化而累積造成的。因此要非常關(guān)注安全性。
化合物在體內(nèi)的穩(wěn)定性的提高會導(dǎo)致血小板聚集抑制作用和血凝固抑制作用的持久性，由此便潛在性地長期抑制血小板所固有的重要生理作用，如誘發(fā)出血傾向等。
已經(jīng)報(bào)導(dǎo)，在體外循環(huán)期，即使實(shí)際上給藥用以抑制血液凝固的來自生物體的肝素也具有明顯副作用，即肝素作用長于合適的時期從而引起易出血傾向(Tadao Akizawa，et al.，NIHON RINSHO，Vol.43，377-391(1985))。
如“技術(shù)背景”中描述的，RGD肽本身不具有這樣高的血小板聚集作用以保證床實(shí)踐中的應(yīng)用。但RGD肽具有極好特性，因?yàn)樗鼈兡鼙簧矬w內(nèi)固有的蛋白酶酶解為氨基酸，這些氨基酸對生物體是安全有用的。
本發(fā)明人就是想應(yīng)用這種特性制備具有極好血小板聚集抑制能力和血液凝固抑制能力，血小板保護(hù)作用和細(xì)胞粘連抑制活性的肽衍生物，并將這些化合物用作藥物制劑。
本發(fā)明的一個目的是提供具有極好血小板聚集抑制能力和血液凝固抑制能力，血小板保護(hù)作用和細(xì)胞粘連抑制活性并高度安全的肽及其鹽。
本發(fā)明的另一目的是提供含有所述肽或其鹽為活性成分的血小板聚集抑制劑，體外循環(huán)血液凝固抑制劑，細(xì)胞粘連抑制劑，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑和輸血用血小板制劑的保護(hù)劑，以及加有所述肽或其鹽的輸血用血小板制劑和輸血用血小板制劑包，其中該包中輸血用血小板制劑含有該肽或其鹽。
本發(fā)明進(jìn)一步目的是提供含有肽或其鹽為活性成分的藥物組合物，特別用于抑制血小板聚集，體外循環(huán)時血液凝固，細(xì)胞粘連和腫瘤轉(zhuǎn)移及用于保護(hù)輸血用血小板制劑中的血小板。
本發(fā)明還有進(jìn)一步目的是提供應(yīng)用該肽或其鹽抑制血小板聚集的方法，抑制體外循環(huán)時血液凝固的方法，抑制細(xì)胞粘連的方法，抑制腫瘸轉(zhuǎn)移的方法，保護(hù)輸血用血小板制劑中血小板的方法。本發(fā)明的公開內(nèi)容作為所進(jìn)行的解決上述問題各種研究的結(jié)果，本發(fā)明人制得了具有高度活性和安全的肽化合物，它具有極好的血小板聚集抑制活性和血液凝固抑制活性而且可實(shí)際應(yīng)用。出人意料地，盡管它們不含有被認(rèn)為是血小板聚集抑制作用所必須的RGD序列，但本發(fā)明肽仍具有非常高水平的這些活性。
本發(fā)明的主題如下(1)用下面通式(I)表示的化合物或其鹽Pro-Ser-A-B-Asp-C-D (I)其中A是一種在側(cè)鏈上沒有胍基的氨基酸，B是一種氨基酸，C是側(cè)鏈上有疏水基團(tuán)的氨基酸，和D是羥基或氨基；(2)含有(1)的化合物或其鹽為活性成分的血小板聚集抑制劑；(3)含有(1)的化合物或其鹽為活性成分的體外循環(huán)血液凝固抑制劑；
(4)含有(1)的化合物或其鹽為活性成分的細(xì)胞粘連抑制劑(5)含有(1)的化合物或其鹽為活性成分的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑；(6)含有(1)的化合物或其鹽為活性成分的輸血用血小板制劑的保護(hù)劑(7)其中加有(1)的化合物或其鹽的輸血用血小板制劑；(8)輸血用血小板制劑包，包中輸血用血小板制劑中含有(1)的化合物或其鹽；(9)含有(1)的化合物或其鹽和可藥用載體的藥物組合物；(10)抑制血小板聚集的方法，包括給患者施用可藥用載體中的有效量的(1)的化合物或其鹽這一步驟；(11)抑制體外循環(huán)中血液凝固的方法，包括給患者施用可藥用載體中的有效量的(1)的化合物或其鹽這一步驟；(12)抑制細(xì)胞粘連的方法，包括給患者施用可藥用載體中的有效量的(1)的化合物或其鹽這一步驟(13)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，包括給患者施用可藥用載體中的有效量的(1)的化合物或其鹽這一步驟；和(14)保護(hù)輸血用血小板制劑中的血小板的方法，包括向血小板制劑中加入有效量的(1)的化合物或其鹽這一步驟。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的最好方式在本發(fā)明中，術(shù)語“氨基酸”指分子中含有氨基和羧基的分子。
在上述式(I)中，N末端Pro-Ser結(jié)構(gòu)由在N末端有一堿性部分的脯氨酸和在側(cè)鏈上有一羥基的絲氨酸結(jié)合構(gòu)成。C末端Asp-C結(jié)構(gòu)由側(cè)鏈上有一羧基的酸性氨基酸天冬氨酸與側(cè)鏈上含有疏水基團(tuán)的氨基酸(下文稱作“疏水氨基酸”)結(jié)合組成。
在本發(fā)明肽中，有堿性部分的脯氨酸和有酸性部分的天冬氨酸的存在是血小板聚集抑制活性和血液凝固抑制活性所需要的。而且為了增強(qiáng)這兩種活性，一種連接堿性和酸性部分從而固定其空間位置的結(jié)構(gòu)和一種通過一疏水鍵，一氫鍵等與IIbIIIa復(fù)合物相互作用的結(jié)構(gòu)，這兩者的存在是重要的。
脯氨酸N-末端存在的亞氨基相當(dāng)于堿性部分，天冬氨酸側(cè)鏈上的羧基相當(dāng)于酸性部分。通式(I)所示的肽中絲氨酸或A和B氨基酸，和C疏水氨基酸有利于氫鍵和疏水鍵的生成，該氫鍵和疏水鍵參與生成上述重要結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)血小板聚集抑制活性和血液凝固抑制活性。
式(I)中，A是一種側(cè)鏈上不含胍基的氨基酸，包括中性氨基酸，側(cè)鏈上含有氨基的氨基酸和其衍生物，該氨基可被1-10碳原子烷基取代如對-氨基環(huán)己基甘氨酸，對-氨基環(huán)己基丙氨酸，對-氨基苯基甘氨酸，對-氨基苯基丙氨酸等等。
在本發(fā)明中，術(shù)語“側(cè)鏈”指下面氨基酸通式中R部分。 本發(fā)明中，術(shù)語“中性氨基酸”指側(cè)鏈上有不帶電荷基團(tuán)的氨基酸，以及甘氨酸、脯氨酸或其衍生物。甘氨酸衍生物的例子包括具有1-10碳原子烷基的N-烷基甘氨酸、脯氨酸衍生物的例子包括環(huán)中有一個取代基，一個不飽和鍵和一個雜原子的脯氨酸，和具有不同大小的環(huán)的脯氨酸。側(cè)鏈上不帶電荷基團(tuán)的例子包括具有1-30個碳原子的取代或未取代烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的雜芳基，具有3-10個碳原子的取代或未取代的環(huán)烷基，和其結(jié)合基團(tuán)。這些基團(tuán)可進(jìn)一步含有不帶電荷的基團(tuán)，該基團(tuán)含一個雜原子如氧、硫等等。這種基團(tuán)的例子包括羥基、巰基，和具有1-10個碳原子的烷硫基。
具體地講當(dāng)側(cè)鏈?zhǔn)羌谆鶗r，該中性氨基酸是丙氨酸。
當(dāng)側(cè)鏈?zhǔn)且煌榛鶗r，優(yōu)選為直鏈或支鏈形式，這樣使含有該烷基的中性氨基酸在水中具有相對高的溶解性，并且從其空間位阻方面來說更優(yōu)選的例子是具有1-20個碳原子的烷基如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基、庚基和辛基。
側(cè)鏈上有烷基的中性氨基酸的優(yōu)選實(shí)例包括丙氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、亮氨酸、正亮氨酸、叔亮氨酸、異亮氨酸、別異亮氨酸等這類物質(zhì)。其中側(cè)鏈上有正丙基或正丁基線型烷基的中性氨基酸是特別優(yōu)選的。例如將包含帶有龐大的異丙基或異丁基的纈氨酸或亮氨酸的肽(實(shí)施例3和6制備的化合物)與包含有相同碳原子數(shù)的線性基團(tuán)正丙基或正丁基的正纈氨酸或正亮氨酸的肽(實(shí)施例5和9制備的化合物)相比，含有帶線性烷基的正纈氨酸或正亮氨酸這樣的中性氨基酸的肽趨于具有較高血小板聚集抑制和血液凝固抑制活性。
側(cè)鏈上具有線性烷基的中性氨基酸的優(yōu)選例子包括Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Nva-Sar-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Nva-Ala-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Nle-Gly-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Nle-Sar-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Nle-Ala-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Ala-Gly-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Ala-Sar-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Ala-Ala-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Ala-Sar-Asp-Phe-OH，Pro-Ser-Gly-Gly-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Gly-Sar-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Gly-Ala-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Met-Gly-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Met-Ala-Sar-Trp-OH，Pro-Ser-Met-Ala-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Cys-Gly-Asp-Trp-OH，和Pro-ser-Pen-Gly-Asp-Trp-OH.
更優(yōu)選的例子包括Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH和Pro-Ser-Nle-Gly-Asp-Trp-OH。最優(yōu)選的例子包括Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH。
側(cè)鏈上具有支鏈型烷基的中性氨基酸的優(yōu)選實(shí)例包括Pro-Ser-Tle-Gly-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Tle-Sar-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Tle-Ala-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Tle-Gly-Asp-Phe-OH，Pro-Ser-Tle-Sar-Asp-Phe-OH，Pro-Ser-Val-Gly-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Val-Sar-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Val-Ala-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Leu-Gly-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Leu-Sar-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Leu-Ala-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Leu-Gly-Asp-Phe-OH，Pro-Ser-Ile-Gly-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Ile-Sar-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Ile-Ala-Asp-Trp-OH和Pro-Ser-(allo)Ile-Gly-Asp-Trp-OH.更優(yōu)選的例子包括Pro-Ser-Tle-Gly-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Leu-Gly-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Ile-Gly-Asp-Trp-OH和Pro-Ser-(allo)Ile-Gly-Asp-Trp-OH.最優(yōu)選的例子包括Pro-Ser-Tle-Gly-Asp-Trp-OH。
氨基酸A中側(cè)鏈為芳基的情況下，包括苯基和萘基等等。該芳基可以被上述不帶電荷的基團(tuán)取代如含有1-10個碳原子的烷基，含有3-10個碳原子的環(huán)烷基或芳基，鹵原子如溴、碘、氯原子等等，氰基、硝基，含有1-10個碳原子的烷氧基，含有2-10個碳原子的?；蛲?br> 側(cè)鏈上含有芳基的中性氨基酸的例子包括苯基甘氨酸、萘基甘氨酸等，優(yōu)選例子包括Pro-Ser-Phg-Gly-Asp-Trp-OH及類似物。
氨基酸A的側(cè)鏈為雜芳基的情況下，雜芳基包括呋喃基、四氫呋喃基、吡喃基、噻吩基等這類基團(tuán)。該雜芳基可被不帶電荷的上述基團(tuán)取代如含有1-10個碳原子的烷基，含有3-10個碳原子的環(huán)烷基或芳基，鹵原子如溴、碘或氯原子等，氰基、硝基，含有1-10個碳原子的烷氧基，含有2-10個碳原子的酰基或酮基。
氨基酸A的側(cè)鏈?zhǔn)且缓?-10個碳原子的環(huán)烷基的情況下，其優(yōu)選為含有3-7個碳原子烷基的環(huán)烷基如環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基等。該環(huán)烷基可以被上述不帶電荷的基團(tuán)取代如含有1-10個碳原子的烷基，含有3-10個碳原子的環(huán)烷基或芳基，鹵原子如溴、碘或氯原子等等，氰基、硝基，含有1-10個碳原子的烷氧基，含有2-10個碳原子的?；蛲蛄u基。
側(cè)鏈上含有一個環(huán)烷基的中性氨基酸的例子包括環(huán)己基甘氨酸等等。優(yōu)選的例子包括Pro-Ser-Chg-Gly-Asp-Trp-OH。
含1-10個碳原子烷基，芳基和雜芳基，具有3-10個碳原子環(huán)烷基基團(tuán)結(jié)合的具體例子包括芳烷基如苯基烷基；環(huán)烷基-烷基如環(huán)己基烷基；烷基-環(huán)烷基等等。更具體的例子包括芐基、苯基乙基、環(huán)己基甲基等等。結(jié)合基團(tuán)中的環(huán)部分可以被上述不帶電荷的基團(tuán)取代如含有1-10個碳原子的烷基，含有3-10個碳原子的環(huán)烷基或芳基，鹵原子如溴、碘或氯原子等等，氰基、硝基，含有1-10個碳原子的烷氧基，含有2-10個碳原子的?；蛄u基。
具有上述結(jié)合基團(tuán)的中性氨基酸的例子包括苯基丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸、4-甲基苯基丙氨酸、4-溴苯基丙氨酸、萘基丙氨酸、高苯基丙氨酸，和O-甲基酪氨酸。肽的優(yōu)選例子包括Pro-Ser-Cha-Gly-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Phe-Gly-Asp-Trp-OH，和Pro-Ser-Hph-Gly-Asp-Trp-OH.
更優(yōu)選的例子包括Pro-Ser-Cha-Gly-Asp-Trp-OH。
氨基酸A側(cè)鏈?zhǔn)峭榛?、芳基，含有一個雜原子如氧、硫等的不帶電荷基團(tuán)的雜芳基或環(huán)烷基，或這些基團(tuán)結(jié)合成的基團(tuán)時，該基團(tuán)特別的例子包括具有羥基或巰基的烷基和環(huán)烷基，或含有1-10個碳原子的烷硫基。含有這種基團(tuán)的中性氨基酸的優(yōu)選例子包括絲氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸等這類物質(zhì)。
氨基酸A是含有1-10個碳原子烷基的N-烷基甘氨酸的情況下，具有3或更少碳原子烷基的所述氨基酸如肌氨酸是優(yōu)選的。
氨基酸A是其環(huán)中有取代基的脯氨酸的情況下，取代基的例子包括上面提到的不帶電荷的基團(tuán)如具有1-10碳原子烷基，具有3-10碳原子環(huán)烷基或芳基，鹵原子如溴、碘或氯原子等，氰基、硝基，具有1-10碳原子的烷氧基，具有2-10碳原子的?；?、酮基或羥基。具有不飽和鍵衍生物的例子包括脫氫脯氨酸。其中構(gòu)成環(huán)的碳原子被雜原子取代的衍生物的例子包括硫代脯氨酸等這類物質(zhì)。具有不同大小環(huán)的衍生物的優(yōu)選例子包括具有3元至8元環(huán)的衍生物如氮雜環(huán)丁烷羧酸，高脯氨酸等等。脯氨酸衍生物可以是它們的化合產(chǎn)物如β，β-二甲基硫代脯氨酸等這類物質(zhì)。
使肽具有高溶解性和活性的中性氨基酸的例子包括絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、羥基脯氨酸、脫氫脯氨酸、4-甲基脯氨酸和4-甲氧基脯氨酸。
這種肽優(yōu)選的例子包括；Pro-Ser-Pro-Gly-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Pro-Sar-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Pro-Ala-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Ser-Gly-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Ser-Sar-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Thr-Gly-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Thr-Sar-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Hyp-Gly-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Hyp-Sar-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-ΔPro-Gly-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-ΔPro-Sar-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-(4-CH3Pro)-Gly-Asp-Trp-OH，
Pro-Ser-(4-CH3Pro)-Sar-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-(4-OCH3Pro)-Gly-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-(4-OCH3Pro)-Sar-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Thz-Gly-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Dmt-Gly-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Dmp-Gly-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Azt-Gly-Asp-Trp-OH和Pro-Ser-Hyp(Bzl)-Gly-Asp-Trp-OH.
更優(yōu)選的例子包括Pro-Ser-Pro-Gly-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-Hyp-Gly-Asp-Trp-OH，Pro-Ser-ΔPro-Gly-Asp-Trp-OH和Pro-Ser-Hyp(Bzl)-Gly-Asp-Trp-OH.
最優(yōu)選的例子包括Pro-Ser-ΔPro-Gly-Asp-Trp-OH。
為防止酶裂解并保持肽的高活性，可使用D-氨基酸。D-氨基酸優(yōu)選的例子包括上述中性氨基酸的D-異構(gòu)體，并且肽的優(yōu)選例子包括Pro-Ser-DPro-Gly-Asp-Trp-OH。
側(cè)鏈上含有氨基且該氨基可被1-10碳原子烷基取代的氨基酸的例子包括用下面通式(X)表示的氨基酸殘基 其中R1和R2可以相同或不同，各自為氫原子或1-10碳原子的烷基，n是4-10的整數(shù)。優(yōu)選例子包括用下面通式(X′)代表的氨基酸殘基
其中R1是氫原子、甲基或叔丁基。這些氨基酸殘基是賴氨酸，ε-N-甲基賴氨酸和ε-N-叔丁基賴氨酸殘基。就其空間位阻來說，賴氨酸優(yōu)于ε-N-甲基賴氨酸，而ε-N-甲基賴氨酸優(yōu)于ε-N-叔丁基賴氨酸殘基。具有未取代氨基的賴氨酸是優(yōu)選的。如下文實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1所示，含有氨基酸A為賴氨酸的肽(實(shí)施例13制備的化合物，其中上式(X)中的n為4)比含有氨基酸A為鳥氨酸的肽(對比實(shí)施例1中制備的n＝3的化合物)顯示更高的血小板聚集抑制和血液凝固抑制活性。式(X)中的整數(shù)n代表α-碳到側(cè)鏈中氨基的距離。因此n優(yōu)選至少為4，更優(yōu)選4～6 。
并且除上文所述事實(shí)外，如下文所描述的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1所示，與含有氨基酸A為鳥氨酸的肽(對比實(shí)施例1制備的化合物)相比，氨基酸A為側(cè)鏈上有相同長度烷基鏈但沒有堿性功能氨基的正纈氨酸的肽(實(shí)施例4制備的化合物)顯示明顯增強(qiáng)的血小板聚集抑制活性和血液凝固抑制活性。
通式(I)中，B是-氨基酸。具有大空間位阻的氨基酸和酸性氨基酸趨于降低含有它們的肽的血小板聚集抑制活性和血液凝固抑制活性。因此優(yōu)選氨基酸B的例子包括含10個或更少碳原子的較小側(cè)鏈的中性氨基酸和其N-烷基取代產(chǎn)物。N-烷基取代產(chǎn)物中烷基的碳原子數(shù)優(yōu)選為1～5。具體可提及甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、肌氨酸、N-乙基甘氨酸、N-異丙基甘氨酸、N-丙基甘氨酸等為優(yōu)選實(shí)例。如下文描述的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1所示，B為肌氨酸的本發(fā)明肽(實(shí)施例1制備的化合物)具有大約2倍于B為甘氨酸的肽(實(shí)施例2制備的化合物)的血小板聚集抑制和血液凝固抑制活性。據(jù)信這是因?yàn)殡牡闹麈溚ǔ＞哂蟹词綐?gòu)型，但當(dāng)引入肌氨酸時它們轉(zhuǎn)換成順式，而這些結(jié)構(gòu)有助于形成較高血小板聚集抑制和血液凝固抑制活性所需的構(gòu)型。
任何側(cè)鏈上含有疏水基團(tuán)的氨基酸通過疏水鍵與受體相互作用，其可用作通式(I)中的C。C氨基酸優(yōu)選的例子包括側(cè)鏈上有疏水基團(tuán)如烷基、苯基、苯基烷基、烷氧苯基、環(huán)烷基、吡啶基、吲哚基等基團(tuán)的氨基酸。特別的例子包括苯基丙氨酸、色氨酸、O-烷基酪氨酸、萘基丙氨酸、吡啶基丙氨酸等等。其中色氨酸是優(yōu)選的。作為烷基，不多于10個碳原子的低級烷基是優(yōu)選的。
通式(I)中，D是羥基或氨基，D是羥基的情況下肽的活性趨于比D為氨基時高。但是，D是氨基情況下作用時間較長。選擇羥基還是氨基決定于所要達(dá)到的目的。
當(dāng)本文用縮寫定義氨基酸、肽、保護(hù)基團(tuán)、活性基團(tuán)等時，其應(yīng)與IUPAC和IBU定義或本領(lǐng)域所用任何常規(guī)符號相符。在直接與基因控制相關(guān)的α-氨基酸有旋光異構(gòu)現(xiàn)象情況下，應(yīng)明白意指L-異構(gòu)體，除非另有說明。
縮寫的例子如下所示Asp或D天冬氨酸Ala 丙氨酸Arg或R精氨酸Gly或G甘氨酸Phg 苯基甘氨酸Sar 肌氨酸Ser或S絲氨酸Thr 蘇氨酸Val 纈氨酸Nva 正纈氨酸
Ile異亮氨酸(allo)Ile 別異亮氨酸Leu亮氨酸Nle正亮氨酸Tle叔亮氨酸Lys賴氨酸Chg環(huán)己基甘氨酸Cha環(huán)己基丙氨酸Met蛋氨酸Trp色氨酸Tyr酪氨酸Tyr(CH3) O-甲基酪氨酸Phe或F 苯丙氨酸Hph高苯丙氨酸Pro或P 脯氨酸DPro D-脯氨酸Hyp羥基脯氨酸ΔPro 脫氫脯氨酸4-CH3Pro 4-甲基脯氨酸4-OCH3Pro 4-甲氧基脯氨酸Boc叔丁氧羰基But叔丁基OBut叔丁基酯Mtr4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基Pmc2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰基
Fmoc 9-芴基甲氧羰基Orn鳥氨酸Cys半胱氨酸Pen青霉胺Azt氮雜環(huán)丁烷羧酸Thz硫代脯氨酸Dmt二甲基硫代脯氨酸Dmp二甲基脯氨酸通過簡單方法用可商購的氨基酸可容易地合成本發(fā)明肽。例如可以用肽化學(xué)領(lǐng)域中常規(guī)方法或者液相或者固相合成肽，如Schroder和Luhke“The Peptides”Vol.1，Academic Press，New York，U.S.A(1966)，Nobuo Izumiya et al.，“The Fundamentals andExperiments of Peptide Synthesis”，Maruzen(1985)等所描述的方法。這些制備方法可以是柱法或分批方法(batch method)。
生成肽鍵的縮合方法包括疊氮化物法、酰氯法、酸酐法、碳化二亞胺法、碳化二亞胺加成法、活化酯法、羰基咪唑法、氧化還原法、酶法，使用Woodward′s試劑K的方法等等。用固相法進(jìn)行縮合反應(yīng)情況下，可以優(yōu)先使用酸酐法、碳化二亞胺法和活化酯法。
當(dāng)用固相法增長肽鏈時，C末端氨基酸與載體偶聯(lián)，載體為例如不溶于所用有機(jī)溶劑的樹脂。在這種情況下，為將氨基酸與樹脂鍵連，可通過引入官能團(tuán)，在樹脂和官能團(tuán)間插入間隔基或者根據(jù)條件引入能在各種位置解離的稱為“手臂”的鏈根據(jù)目的將樹脂改性。樹脂的例子包括鹵甲基樹脂(如氯甲基樹脂)、氧甲基樹脂、4-(氧甲基)苯基乙酰胺甲基樹脂、4-(氧甲基)苯氧甲基樹脂、用于C-末端酰胺化的樹脂等等。
縮合反應(yīng)之前，不參加縮合反應(yīng)的精氨酸殘基中的羧基，氨基和胍基可以用常規(guī)已知技術(shù)保護(hù)。與此相反，直接參加縮合反應(yīng)的羧基和氨基可以被活化。
作為保護(hù)作用的保護(hù)基，可以使用有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域中經(jīng)常使用的那些基團(tuán)，如Greene，“Protective Groups in Organic Synthesis”John Willey & Sons，Inc(1981)中所描述的。
羧基保護(hù)基例子包括通常使用和已知的保護(hù)基如各種甲酯、乙酯、芐酯、對-硝基芐酯、叔丁基酯、環(huán)己基酯等等。
氨基保護(hù)基的例子包括芐氧羰基、叔丁氧羰基、異冰片基氧基羰基和9-芴基甲氧羰基等等。
氨基酸殘基如絲氨酸中羥基保護(hù)基的例子包括叔丁基、芐基、三甲基甲硅烷基和四氫吡喃基等等。
賴氨酸中ε-氨基保護(hù)基的例子包括叔丁氧羰基、9-芴基甲氧基羰基等等。
帶有活化羧基的氨基酸的例子包括相應(yīng)于羧基的酸酐；疊氮化物；與五氟苯酚，2，4-二硝基苯酚，氰甲基醇，對-硝基苯酚形成的活化酯，N-羥基琥珀酰亞胺，N-羥基-5-降冰片烯-2，3-二羧酰亞胺，N-羥基鄰苯二甲酰亞胺，和1-羥基苯并三唑等等。
帶有活化氨基的氨基酸的例子包括相應(yīng)于氨基的酰胺磷酸酯(amide phosphate)。
肽合成縮合反應(yīng)通常在溶劑中進(jìn)行。溶劑的例子包括氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、吡啶、二噁烷、四氫呋喃、N-甲基吡咯烷酮、水、甲醇等等及其混合物。通?？s合反應(yīng)一般在-30至50℃溫度下進(jìn)行。
可根據(jù)保護(hù)基的類型選擇肽制備方法中保護(hù)基的脫保護(hù)反應(yīng)類型，條件是保護(hù)基團(tuán)的去除不影響肽鍵。脫保護(hù)反應(yīng)例子包括用酸處理，所述酸為例如鹽酸、氫溴酸、無水氟化氫、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸或其混合物；用堿處理，所述堿為如氫氧化鈉、氫氧化鉀、肼、二乙胺、哌啶等，用液氨中的鈉處理，用鉑/炭還原，用三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯，三甲基甲硅烷基溴化物等進(jìn)行的甲硅烷基化反應(yīng)處理。在上述用酸或甲硅烷基化試劑的脫保護(hù)反應(yīng)中，優(yōu)選加入陽離子捕獲劑，如苯甲醚、苯酚、甲苯酚、硫代苯甲醚和乙二硫醇以有效進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)。
用固相方法進(jìn)行的肽合成可用常規(guī)方法從固相中解離。解離肽的方法的例子包括用上述酸或甲硅烷基化試劑處理。
上述一系列反應(yīng)后，如此制得的肽可用常規(guī)的和已知方法分離和純化。例如萃取、分配、再沉淀、重結(jié)晶、柱層析等可以用來得到更純形式的肽。
根據(jù)制備方法中的反應(yīng)條件的不同，本發(fā)明肽可以鹽的形式制得。鹽的例子包括無機(jī)酸鹽如鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等；有機(jī)酸鹽如甲酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、甘醇酸鹽、琥珀酸鹽、蘋果酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、三氟乙酸鹽等等；堿金屬鹽如鈉和鉀鹽等等，堿土金屬鹽如鈣鹽等，有機(jī)胺鹽如銨、乙醇胺、三乙胺和二環(huán)己基胺鹽等等。
當(dāng)如此制得的本發(fā)明肽被用作血小板聚集抑制劑，細(xì)胞粘連抑制劑，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑，和輸血用血小板制劑的保護(hù)劑(下文稱作“血小板聚集抑制劑等”)的活性成分時，優(yōu)選這些肽或其可藥用的鹽與固體或液體可藥用載體或稀釋劑即賦形劑，穩(wěn)定劑等一起配制成藥物組合物。在該藥物組合物中，活性成分與載體的比例可在1至90％(重量)間變化。藥物組合物可以以粒劑、細(xì)粒劑、粉劑、片劑、膠囊、丸劑、液體和溶液等形式口服給藥。另一種可選擇的方式，該藥物組合物可以以球粒(bulk powders)的形式口服給藥，或者可以靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或者皮下注射給藥。注射劑可以在使用前由本發(fā)明肽或其可藥用鹽粉末制備。
適用于口服，經(jīng)腸或腸胃外給藥的有機(jī)的或無機(jī)的，固體的或液體形式的可藥用載體或稀釋劑可被用來制備本發(fā)明血小板聚集抑制劑等。水、明膠、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、滑石、動物脂肪和油、植物脂肪和油、芐基醇、樹膠、聚亞烷基二醇、石油樹脂、椰子油、羊毛脂和所有其它醫(yī)用載體可用作本發(fā)明血小板聚集抑制劑等的載體或稀釋劑。穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑和改變滲透性或保持制劑合適pH值的鹽可以合適地用作輔助劑。
如果需要，本發(fā)明血小板聚集抑制劑等可以含有其它藥學(xué)活性成分如其用在治療各種疾病的情況中時的其它類型血小板聚集抑制成分。
粒劑、細(xì)粒劑、粉劑、片劑或膠囊劑情況下，活性成分含量優(yōu)選在5-80％(重量)范圍內(nèi)。液體和溶液情況下，活性成分含量優(yōu)選在1-30％(重量)范圍內(nèi)。進(jìn)一步地，在注射劑情況下，活性成分含量優(yōu)選在1-10％(重量)范圍內(nèi)。
當(dāng)血小板聚集抑制劑等用來口服給藥時，成人患者活性成分臨床劑量優(yōu)選在每天500至1000mg范圍內(nèi)，其可根據(jù)患者年齡，所要治療疾病的嚴(yán)重程度等變化。本發(fā)明血小板聚集抑制劑等可以以上述日劑量一天一次，兩次或三次以合適間隔時間給藥。注射情況下，活性成分的劑量對成人患者來說優(yōu)選在每次注射一至幾百mg。可選擇地，本發(fā)明血小板聚集抑制劑等可以通過輸注法等以一次或幾次注射給藥。
當(dāng)本發(fā)明肽或其鹽用于體外循環(huán)時，其可用注射或點(diǎn)滴輸入形式使用。給藥的位置和劑量可根據(jù)體外循環(huán)系統(tǒng)的種類，持續(xù)時間等而不同。例如本發(fā)明肽可以每小時1至100mg/kg的劑量由入口注射或連續(xù)輸入到體外循環(huán)系統(tǒng)中。不管它們是單獨(dú)使用還是與其它藥劑一起使用，與降解酶大量存在的體內(nèi)相比，本發(fā)明肽在體外循環(huán)系統(tǒng)中在較小劑量時便有效。
據(jù)信如果本發(fā)明肽與現(xiàn)有技術(shù)中用作血液凝固抑制劑的肝素結(jié)合使用，則血液凝固的兩個重要途徑即血小板聚集和血液凝固體系統(tǒng)會被抑制，從而完全抑制血液凝固。另外，由于預(yù)想兩種藥物有協(xié)同作用，可減少肝素的使用，已描述過其具有不希望的副作用。并且本發(fā)明肽與檸檬酸，蛋白酶抑制劑如futhan，溶解纖維蛋白酶原劑如組織纖維蛋白溶酶原激活劑及類似物質(zhì)結(jié)合使用被認(rèn)為是有效的。
本發(fā)明中，用于輸血的血小板制劑包的形式其特征在于，輸血用血小板的保護(hù)試劑包含在輸血用血小板制劑中，并且沒有特別限定。通常用于臨床實(shí)踐的所有輸血用血小板制劑包形式都可使用。合適的例子包括成包的袋或瓶等等。其材料也無特別限定。例如，能盡可能抑制活性成分吸收的聚乙烯材料，如聚氯乙烯、聚烯烴等可用作袋的材料；塑料和玻璃材料可用作瓶的材料。以血小板成分的量為基準(zhǔn)計(jì)，本發(fā)明輸血用血小板制劑的保護(hù)試劑可以以終濃度相當(dāng)于0.1μM至1mM，優(yōu)選1μM至50μM的本發(fā)明的肽或其鹽的量加入。當(dāng)然，通常加至輸血用血小板制劑包中的其它成分能與本發(fā)明保護(hù)輸血用血小板的試劑一同加入。
另外，應(yīng)用本發(fā)明肽的特性如潛在的血小板聚集抑制作用和低毒性，可將其用于預(yù)防血栓溶解治療后的血栓再形成和外科治療后的血栓生成。特別是，本發(fā)明肽可用于通過外科治療心肌梗塞和各種其它動脈血栓進(jìn)行的經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀血管成形術(shù)(PTCA)后防止血管再狹窄，保持血管成形術(shù)如動脈或靜脈偏側(cè)移植后的移植物開放，防止動脈血管移植后的血栓生成等等。
附圖的簡明描述

圖1是狗血液透析模型的透析循環(huán)示意圖。
圖2是顯示狗血液透析模型中血液凝固抑制效果的曲線。
圖3是防止儲存過程中血小板數(shù)減少的本發(fā)明肽的保護(hù)效果曲線。
圖4是說明本發(fā)明肽對于防止血小板聚集作用降低的保護(hù)效果。
實(shí)施例此后參照下面工作實(shí)施例將更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。[化合物的合成][實(shí)施例1]合成Pro-Ser-Ala-Sar-Asp-Trp-OH在反應(yīng)容器中放入用下式表示的對-烷氧基芐基醇型樹脂(引入的Trp量0.87meq/g；BACHEM Co.)(0.275g；0.25mmol)HOCH2-C6H4(1，4)-OCH2-C6H4(1，4)-聚合物。在二甲氨基嘧啶存在下以活化酯的形式加入Fmoc-Trp，然后重復(fù)表1所示的振蕩和過濾步驟得到下面通式代表的被保護(hù)肽樹脂。
Pro-Ser(But)-Ala-Sar-Asp(OBut)-Trp-樹脂所得到的被保護(hù)肽樹脂在三氟乙酸(TFA)中在m-甲酚和乙二硫醇的存在下用硫代苯甲醚在0℃下處理1小時。用蒸發(fā)器蒸發(fā)TFA，然后過濾去除樹脂，冰浴下向?yàn)V液中加入乙醚，得粉末狀由樹脂上解離下來的肽。用乙醚洗滌該粉末。洗滌過的肽用Sephadex G-10(Pharmacia Co.)為載體通過凝膠滲透色譜去鹽并凍干得粗產(chǎn)品肽。該粗產(chǎn)品肽用高壓液相色譜(HPLC)純化(柱ODS 5C18(μ粘合體球徑φ20×150mm)，流動相(A)0.1％TFA，(B)100％CH3CN/0.1％TFA，梯度(A)∶(B)＝90∶10至(A)∶(B)＝70∶30，20分鐘，流速17ml/min)。通過使用Sephadex G-25(Pharmacia Co.)為載體的凝膠過濾作用而得到肽的乙酸鹽并凍干得34mg標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N鹽酸＋苯酚，24小時，110℃)在該分析中不能測得色氨酸，因?yàn)樗谒峤庵薪到?，不存在?biāo)準(zhǔn)氨基酸的氨基酸不能測到，因?yàn)橛米鳛橛糜跍y定的外部標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸是標(biāo)準(zhǔn)氨基酸。
Asp1.06(1)Ser1.00(1)Sar -(1)Trp -(1)Ala1.09(1)Pro1.10(1)HPLC分析使用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱(Nacalai tesqueCo.)以1.0ml/min的流速，用0.1％TFA中10-40％(60分鐘)乙腈的梯度洗脫的分析HPLC譜表明在18.0分鐘的保留時間時出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值646.3，實(shí)測值646
表1 * 振蕩后不去除試劑或溶劑而繼續(xù)下一步**1-羥基苯并三唑*** 二異丙基碳化二亞胺[實(shí)施例2]合成Pro-Ser-Ala-Gly-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp0.82(1)Ser1.00(1)Gly1.08(1)Trp -(1)Ala1.08(1)Pro1.19(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60分鐘)乙腈梯度洗脫的HPLC分析譜表明在19.2分鐘保留時間時出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值632.3，實(shí)測值632[實(shí)施例3]合成Pro-Ser-Val-Sar-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp0.99(1)Ser1.00(1)Sar -(1)Trp -(1)Val1.13(1)Pro1.01(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明在20.0分鐘保留時間時出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值674.3，實(shí)測值674[實(shí)施例4]合成Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)
Asp1.03(1)Ser1.00(1)Gly1.12(1)Trp -(1)Nva1.08(1)Pro1.21(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)的乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明在26.0分鐘保留時間時出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值660.3，實(shí)測值660[實(shí)施例5]合成Pro-Ser-Nva-Sar-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題化合物。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp0.97(1)Ser1.00(1)Sar -(1)Trp -(1)Nva1.12(1)Pro1.24(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明在28.5分鐘保留時間時出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值674.3，實(shí)測值674[實(shí)施例6]合成Pro-Ser-Leu-Gly-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題化合物。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp0.97(1)Ser1.00(1)Gly1.12(1)Trp -(1)Leu1.16(1)Pro1.08(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60分鐘)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明在32.0分鐘保留時間出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值674.3，實(shí)測值674[實(shí)施例7]合成Pro-Ser-Leu-Sar-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp1.01(1)Ser1.00(1)
Sar -(1)Trp -(1)Leu1.07(1)Pro1.13(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明在36.0分鐘保留時間出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值688.3，實(shí)測值688[實(shí)施例8]合成Pro-Ser-Nle-Sar-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp0.97(1)Ser1.00(1)Sar -(1)Trp -(1)Nle1.22(1)Pro1.10(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明在34.5分鐘保留時間出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值688.3，實(shí)測值688[實(shí)施例9]合成Pro-Ser-Nle-Gly-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp0.94(1)Ser0.94(1)Gly1.04(1)Trp -(1)Nle1.06(1)Pro1.00(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明在34.6分鐘保留時間出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值674.3，實(shí)測值674[實(shí)施例10]合成Pro-Ser-Ala-Sar-Asp-Phe-OH用與實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp1.09(1)Ser0.93(1)Sar -(1)Phe1.08(1)
Ala1.00(1)Pro1.03(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明在17.0分鐘保留時間出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值607.3，實(shí)測值607[實(shí)施例11]合成Pro-Ser-Gly-Sar-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp1.07(1)Ser1.00(1)Gly1.14(1)Trp -(1)Sar -(1)Pro1.10(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明18.0分鐘保留時間時有一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值632.3，實(shí)測值632 合成Pro-Ser-Ile-Sar-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp0.99(1)Ser1.00(1)Sar -(1)Trp -(1)Ile1.20(1)Pro1.18(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明在34.0分鐘保留時間時出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值688.3，實(shí)測值688[實(shí)施例13]合成Pro-Ser-Lys-Gly-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp0.99(1)Ser1.00(1)Gly1.19(1)Trp -(1)Lys1.15(1)Pro1.24(1)
HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明在17.0分鐘保留時間時出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值689.3，實(shí)測值689[實(shí)施例14]合成Pro-Ser-Ile-Gly-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp0.98(1)Ser1.00(1)Gly1.08(1)Trp -(1)Ile1.05(1)Pro1.12(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明34.2分鐘保留時間時有一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值674.3，實(shí)測值674[實(shí)施例15]合成Pro-Ser-Ser-Gly-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)
Asp1.01(1)Ser2.00(2)Gly1.15(1)Trp -(1)Pro1.10(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×20)0mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明19.0分鐘保留時間時出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值648.3，實(shí)測值648[實(shí)施例16]合成Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Phe-OH用與實(shí)施例1相同方法制備標(biāo)題化合物。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp1.01(1)Ser1.00(1)Gly1.10(1)Nva1.12(1)Phe0.98(1)Pro1.05(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱(Nakalai tesqueCo.)以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明30.2分鐘保留時間時出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值621.3，實(shí)測值621[實(shí)施例17]合成Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Hph-OH用與實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題化合物。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp0.97(1)Ser1.00(1)Gly1.12(1)Nva1.09(1)Hph1.11(1)Pro1.06(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明在31.5分鐘保留時間時出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值635.3，實(shí)測值635[實(shí)施例18]合成Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Tyr(CH3)-OH用與實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp0.99(1)Ser1.00(1)Gly1.08(1)
Nva 1.17(1)Tyr(CH3)1.05(1)Pro 1.12(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明27.6分鐘保留時間時出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值651.3，實(shí)測值651[實(shí)施例19]合成Pro-Ser-Pro-Gly-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp0.99(1)Ser1.00(1)Gly1.08(1)Trp -(1)Pro2.13(2)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用(0.1％TFA中10-40％(60min)中乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明在21.0分鐘保留時間時出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值658.3，實(shí)測值658 合成Pro-Ser-(allo)Ile-Gly-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp 0.97(1)Ser 1.00(1)Gly 1.07(1)(allo)Ile1.08(1)Trp -(1)Pro 1.12(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明32.1分鐘保留時間時出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值674.3，實(shí)測值674[實(shí)施例21]合成Pro-Ser-Tle-Gly-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp0.99(1)Ser1.00(1)Gly1.05(1)Tle1.02(1)Trp -(1)Pro1.10(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明34.0分鐘保留時間有一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值674.3，實(shí)測值674[實(shí)施例22]合成Pro-Ser-Chg-Gly-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp1.01(1)Ser1.00(1)Gly0.99(1)Chg1.08(1)Trp -(1)Pro1.05(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明39.5分鐘保留時間時出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值700.3，實(shí)測值700[實(shí)施例23]合成Pro-Ser-Met-Gly-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)
Asp1.00(1)Ser1.00(1)Gly1.06(1)Met1.09(1)Trp -(1)Pro1.02(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明29.0分鐘保留時間時有一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值692.4，實(shí)測值692[實(shí)施例24]合成Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Cha-OH用與實(shí)施例1相同的方法制備標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp1.03(1)Ser1.00(1)Gly1.05(1)Nva1.10(1)Cha1.09(1)Pro1.04(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明在38.1分鐘保留時間出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值627.3，實(shí)測值627[實(shí)施例25]合成Pro-Ser-Phe-Gly-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp0.99(1)Ser1.00(1)Gly1.02(1)Phe1.01(1)Trp -(1)Pro1.06(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min速率用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明在38.3分鐘保留時間出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值709.3，實(shí)測值709[實(shí)施例26]合成Pro-Ser-Phg-Gly-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp1.03(1)Ser1.00(1)
G1y1.09(1)Phg1.10(1)Trp -(1)Pro1.08(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明在36.1分鐘保留時間出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值695.3，實(shí)測值695[實(shí)施例27]合成Pro-Ser-Hyp-Gly-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp0.96(1)Ser1.00(1)Gly1.10(1)Hyp1.04(1)Trp -(1)Pro1.11(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明19.7分鐘保留時間時出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值674.3，實(shí)測值674[實(shí)施例28]合成Pro-Ser-DPro-Gly-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp0.99(1)Ser1.00(1)Gly1.13(1)Trp -(1)Pro2.05(2)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明21.0分鐘保留時間時出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值658.3，實(shí)測值658[實(shí)施例29]合成Pro-Ser-Azt-Gly-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp1.10(1)Ser1.03(1)Gly1.15(1)Trp -(1)Pro1.08(1)
HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明20.5分鐘保留時間時出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值644.3，實(shí)測值644[實(shí)施例30]合成Pro-Ser-Thz-Gly-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp0.98(1)Ser1.00(1)Gly1.06(1)Trp -(1)Pro1.08(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明23.5分鐘保留時間時出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值676.3，實(shí)測值676[實(shí)施例31]合成Pro-Ser-Dmt-Gly-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)
Asp1.05(1)Ser1.02(1)Gly1.10(1)Trp -(1)Pro1.07(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明30.1分鐘保留時間時有一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值704.3，實(shí)測值704[實(shí)施例32]合成Pro-Ser-ΔPro-Gly-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp0.99(1)Ser1.00(1)Gly1.00(1)Trp -(1)ΔPro 1.10(1)Pro1.08(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明22.1分鐘保留時間時出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值657.3，實(shí)測值657[實(shí)施例33]合成Pro-Ser-Hyp(Bzl)-Gly-Asp-Trp-OH用與實(shí)施例1相同方法合成標(biāo)題肽。氨基酸分析(6N HCl＋苯酚，24小時，110℃)Asp1.05(1)Ser1.02(1)Gly1.10(1)Trp -(1)Pro1.10(1)HPLC分析用Cosmosil 5C18-AR(φ4.6×200mm)柱以1.0ml/min流速用0.1％TFA中10-40％(60min)乙腈梯度洗脫的分析HPLC譜表明38.2分鐘保留時間時出現(xiàn)一單峰。FAB-MSM＋H 計(jì)算值764.3，實(shí)測值764[實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1]本發(fā)明化合物的血小板聚集抑制能力合成肽活性的測定[用PRP測定體外人血小板聚集作用]健康雄性志愿者作為受實(shí)驗(yàn)者對待，他們至少兩周沒有使用過任何藥物。用一個預(yù)先裝入1/10體積3.8％檸檬酸鈉溶液并帶有#19針頭的塑料注射器由每個空腹受實(shí)驗(yàn)者的前臂靜脈抽取血樣。采集血樣后立即將注射器輕輕搖蕩使血液與檸檬酸鈉溶液混合?；旌涎涸谑覝叵码x心(1100rpm，250g)15分鐘。不使用制動器使旋轉(zhuǎn)停下。然后，用Komagome型吸管收集上清液得富血小板血漿(PRP)。室溫下保存PRP。離心剩余的血液在室溫下再次離心(3500rpm，1500g)15分鐘，不用制動器使旋轉(zhuǎn)停下。收集上清液得缺乏血小板的血漿(PPP)。制備PRP后，計(jì)數(shù)血小板數(shù)，含有多于2×108/ml血小板的樣品被用于下面的實(shí)驗(yàn)。
用8通道血小板聚集測定儀(Hematracer，Nikoh Bioscience，Tokyo，Japan)通過PRP的光透射比的變化為基礎(chǔ)測定血小板聚集。首先，PPP和PRP(每樣200μl)放于玻璃比色杯中并在37℃下保溫然后測定透射比。PPP的透射比定為100％，PRP為0％。然后向PRP中加入10μl鹽水或含樣品鹽水，并在37℃保溫1分鐘。加入濃度為100μg/ml的膠原蛋白溶液(10μl)(終濃度5μg/ml)產(chǎn)生聚集作用，然后測定透射比超過7分鐘。用樣品進(jìn)行這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，其中在第一步驟確證與膠原蛋白和ADP的聚集作用并且其中與膠原蛋白聚集作用的最大比率至少為70％。
樣品溶解在鹽水中，濃度為2.2×10-2M，并制備2倍稀釋系列用于實(shí)驗(yàn)。不溶于鹽水的樣品溶解在含10％二甲亞砜的鹽水中。
如下計(jì)算所得結(jié)果 計(jì)算式(1)由聚集抑制的百分比對樣品濃度的點(diǎn)作圖，由該圖計(jì)算聚集作用被抑制50％時的濃度(IC50)。每個樣品的IC50見表2。表2表明，本發(fā)明在N-末端具有Pro-Ser結(jié)構(gòu)基本骨架并引入不含胍基氨基酸的肽與血纖維蛋白原分子中存在的氨基酸序列RGDS(表2，對比實(shí)施例2)相比，具有大大增強(qiáng)的血小板聚集抑制活性。
表2.本發(fā)明肽的血小板聚集抑制活性肽 IC50Pro-Ser-Ala-Sar-Asp-Trp-OH (實(shí)施例 1)2.2×10-6MPro-Ser-Ala-Gly-Asp-Trp-OH (實(shí)施例 2)4.6×10-6MPro-Ser-Val-sar-Asp-Trp-OH (實(shí)施例 3)7.3×10-6MPro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH (實(shí)施例 4)5.4×10-7MPro-Ser-Nva-Sar-Asp-Trp-OH (實(shí)施例 5)1.4×10-6MPro-Ser-Leu-Gly-Asp-Trp-OH (實(shí)施例 6)1.3×10-6MPro-Ser-Leu-Sar-Asp-Trp-OH (實(shí)施例 7)2.0×10-6MPro-Ser-Nle-Sar-Asp-Trp-OH (實(shí)施例 8)5.2×10-5MPro-Ser-Nle-Gly-Asp-Trp-OH (實(shí)施例 9)8.4×10-7MPro-Ser-Ala-Sar-Asp-Phe-OH (實(shí)施例10)4.1×10-6MPro-Ser-Gly-Sar-Asp-Trp-OH (實(shí)施例11)3.7×10-6MPro-Ser-Ile-Sar-Asp-Trp-OH (實(shí)施例12)5.0×10-6MPro-Ser-Lys-Gly-Asp-Trp-OH (實(shí)施例13)1.4×10-6MPro-Ser-Ile-Gly-Asp-Trp-OH (實(shí)施例14)1.0×10-6MPro-Ser-Ser-Gly-Asp-Trp-OH (實(shí)施例15)5.0×10-6MPro-Ser-Nva-Gly-Asp-Phe-OH (實(shí)施例16)1.0×10-5MPro-Ser-Nva-Gly-Asp-Hph-OH (實(shí)施例17)1.1×10-5MPro-Ser-Nva-Gly-Asp-Tyr(CH3)-OH (實(shí)施例18)3.4×10-8MPro-Ser-Pro-Gly-Asp-Trp-OH (實(shí)施例19)6.0×10-7MPro-Ser-(allo)Ile-Gly-Asp-Trp-OH (實(shí)施例20)1.0×10-6MPro-Ser-Tle-Gly-Asp-Trp-OH (實(shí)施例21)7.0×10-7MPro-Ser-Chg-Gly-Asp-Trp-OH (實(shí)施例22)6.0×10-7MPro-ser-Met-Gly-Asp-Trp-OH (實(shí)施例23)2.0×10-6MPro-Ser-Nva-Gly-Asp-Cha-OH (實(shí)施例24)4.0×10-6MPro-Ser-Phe-Gly-Asp-Trp-OH (實(shí)施例25)1.0×10-6MPro-Ser-Phg-Gly-Asp-Trp-OH (實(shí)施例26)1.0×10-6MPro-Ser-Hyp-Gly-Asp-Trp-OH (實(shí)施例27)6.0×10-7MPro-Ser-DPro-Gly-Asp-Trp-OH(實(shí)施例28)6.0×10-7MPro-Ser-Azt-Gly-Asp-Trp-OH (實(shí)施例29)5.1×10-6MPro-Ser-Thz-Gly-Asp-Trp-OH (實(shí)施例30)5.0×10-7MPro-Ser-Dmt-Gly-Asp-Trp-OH (實(shí)施例31)5.0×10-7MPro-Ser-ΔPro-Gly-Asp-Trp-OH (實(shí)施例32)3.0×10-7MPro-Ser-Hyp(Bzl)-Gly-Asp-Trp-OH(實(shí)施例33)5.0×10-7MPro-Ser-Orn-Gly-Asp-Trp-OH (對比實(shí)施例1)6.3×10-4MArg-Gly-Asp-Ser-OH (對比實(shí)施例2)4.6×10-4M
由此證明，與表2中對比實(shí)施例2所列的且含在血纖維蛋白原分子中的氨基酸序列RGDS-OH(由Peptide Laboratory，Minoo-shi，Japan購得)相比，本發(fā)明肽的血小板聚集抑制能力顯著增強(qiáng)。[實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2]急性毒性實(shí)驗(yàn)以100mg/kg的量給小鼠靜脈注射實(shí)施例1中得到的肽，沒有發(fā)現(xiàn)毒性。[實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3]用本發(fā)明肽作體外循環(huán)血液凝固抑制劑為了證明本發(fā)明肽具有在體外循環(huán)系統(tǒng)中抑制血液凝固的作用，如人工肺的血液透析，以小獵兔犬人工血液透析模型根據(jù)別處描述的方法(參見Hamano et al.，Thromb，Res，55(1989)pp.438-449)作一些改進(jìn)后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。狗血液透析模型中透析循環(huán)示意圖見圖1。
在這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中使用重10-12kg的小獵兔犬(雄性或雌性)。小獵兔犬用戊巴比妥麻醉(約30mg/kg)。切開右后腿露出股動脈和股靜脈。帶有硅試管的插管插入股動脈和股靜脈，并且這些硅試管與中空纖維透析器連接(RENAK-A，RA-04，0.4m2，KawasumiLab.Tokyo)。在該操作中沒有使用抗凝固劑如肝素。將一個輸血泵放在股動脈和透析器之間保持實(shí)驗(yàn)中體外循環(huán)體系血液流速為25ml/min。透析液不循環(huán)，當(dāng)透析器中空纖維外部空間流體靜力學(xué)壓力為大約100cm H2O時，密封透析液循環(huán)的入口和出口。
在這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中測定下面三個參數(shù)(1)透析器近端部分的壓力(灌入壓)，(2)血小板粘連程度(血小板功能和血小板激活程度的參數(shù))和(3)全血凝固時間(血凝固系統(tǒng)激活程度的參數(shù))。用如圖1所示透析器近端部分連接的壓力表測定灌注壓。由于在透析器這里血液經(jīng)常與外部材料接觸，并且血液在狹窄空間流動，因此透析循環(huán)中血凝固最可能發(fā)生在這里。如果血凝固在這里發(fā)生，透析器阻塞，近端部分的血壓將升高。這個位置灌注壓的變化表明透析循環(huán)中血凝固程度。以一定間隔時間在透析部分入口和出口采集等份血樣，用常規(guī)方法測定參數(shù)(2)和(3)。
循環(huán)一開始，血液立即通過周線循環(huán)，由動脈端開始注入本發(fā)明肽的鹽水溶液?？偟淖⑸淞繛?0mg/狗，在1小時之間逐漸給藥(注入速度1ml/min)。在對比實(shí)驗(yàn)中，只是以相同方式連續(xù)注射鹽水。60分鐘后停止注射藥物，然后血液循環(huán)至180分鐘，繼續(xù)測定上述參數(shù)。當(dāng)灌注壓超過500mmHg時，在該時間停止實(shí)驗(yàn)。
圖2表明了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中測定了實(shí)施例19化合物對灌注壓增強(qiáng)的抑制效果。橫坐標(biāo)上的數(shù)表示藥物輸注開始后的時間，縱坐標(biāo)上的數(shù)表示灌注液壓力。血液流動開始后灌注液壓力是0-30mmHg，且由于血凝固的發(fā)生而增大。在沒有注射抗凝劑的對照組，10分鐘后灌注液壓力很快增大，25分鐘內(nèi)超過500mmHg，不可能再進(jìn)一步測量。這種情況表明，在透析循環(huán)中沒有抗凝劑時血凝固很快發(fā)生，特別是在透析器位置。相反，當(dāng)注射實(shí)施例19制備的本發(fā)明肽時，血凝固作用顯著被抑制。
考慮到血小板粘連能力和全血凝固時間，發(fā)現(xiàn)與灌注液壓力的增長方式基本平行的變化。簡而言之，在對照組，隨時間進(jìn)程發(fā)現(xiàn)血小板粘連能力增加和全血凝固時間減少。這表明血小板被激活從而血液凝固系統(tǒng)被激活，結(jié)果是狗處于血液凝固高可能性發(fā)生的條件下。相反，在注射了本發(fā)明肽的組中，在藥物持續(xù)注入時間內(nèi)，發(fā)現(xiàn)血液凝固能力降至大約0％，因此，狗處在血小板激活作用完全被抑制這樣的條件下。另外，在這期間，全血凝固時間顯著增長。
如上所述，本發(fā)明肽完全抑制體外循環(huán)系統(tǒng)中血液凝固作用，這表明本發(fā)明肽能滿意地用作日常使用的抗凝劑肝素的替代物。如上所述，盡管肝素完全抑制體外循環(huán)系統(tǒng)中的血液凝固作用，但其缺點(diǎn)在于它只能從體內(nèi)少量排除從而抑制血液凝固作用而同時即使在血液透析后幾小時仍促進(jìn)出血傾向。相反，本發(fā)明肽在體內(nèi)可高度降解(在大約30分鐘內(nèi)從體內(nèi)消除)。因此認(rèn)為本發(fā)明肽比肝素或其相關(guān)藥物優(yōu)越，因?yàn)榻o藥停止后血凝固活性將立即恢復(fù)到正常水平。而且由于本發(fā)明肽具有極低的毒性，因此作為新的血凝固抑制劑來彌補(bǔ)肝素的缺點(diǎn)，其前景樂觀。
如上所示，如果本發(fā)明肽溶解在鹽水或檸檬酸鈉溶液中，并用點(diǎn)滴輸入等方式由體外循環(huán)系統(tǒng)入口以大約1-3mg/小時/kg的速度連續(xù)注射，則預(yù)期有令人滿意的血液凝固抑制作用。若實(shí)際應(yīng)用到人體時，則劑量會更少。
如果本發(fā)明肽與其它完全不同作用模式的抗凝劑結(jié)合，如檸檬酸鈉溶液，肝素，futhan，溶解纖維蛋白原試劑等，預(yù)期含有協(xié)同作用。因此，兩種藥物劑量會降低并且保證更加安全。[實(shí)驗(yàn)實(shí)施例4]應(yīng)用本發(fā)明肽作輸血用血小板制劑的保護(hù)劑本實(shí)驗(yàn)使用Hartley豚鼠(雄性體重350-400g)。豚鼠用乙醚麻醉后，剖開腹膜腔并從腹膜動脈采集血樣。用裝有1/10體積預(yù)先消毒過的3.8％檸檬酸鈉溶液并帶有一#24針頭的注射器采血，采取后立即輕輕振蕩注射器使血液與檸檬酸鈉溶液混合。將混合的血在室溫下離心(900rpm)15分鐘并停止旋轉(zhuǎn)。然后無菌條件下用一Komagome型吸管收集上清液得到血小板部分保存。
將血小板部分轉(zhuǎn)移至血小板儲存包(TERUMO CORP.，SeparationBag S for Apheresis)后，該包置于振蕩器上，以振幅20cm，振頻20Hz室溫下振蕩保存。
儲存一定時間后，取等份血小板部分樣品并測定血小板數(shù)目。用檸檬酸溶液將儲存部分調(diào)至pH6.5并在室溫下離心(2000rpm，15分鐘)。移去上清液后，加入含有腺苷三磷酸雙磷酸酶的Ca-Tyrode溶液(pH6.5)(Sigma Co，終濃度0.2U/ml)重新懸浮血小板。室溫下保持20分鐘后，將懸浮液離心(2000rpm，15分鐘)并去除上清液。用相同方法再次洗滌懸浮液并將血小板再次懸浮在預(yù)先保留的豚鼠血漿(血小板數(shù)大約3×108/ml)中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1相同的方法用這種血小板懸浮液測定血小板聚集能力。
圖3表明儲存過程中血小板數(shù)的變化。在只加入生理鹽水的對照組中，儲存過程中血小板數(shù)大大減少。相反，加入實(shí)施例28制備的化合物的組中，發(fā)現(xiàn)其與對比組相比有明顯抑制血小板數(shù)降低的效果。這種保護(hù)效果隨所加入的肽的濃度而定，表明本發(fā)明肽本身對血小板具有保護(hù)作用。
圖4表示儲存過程中血小板聚集能力隨時間的變化。在沒有加入藥物的對比組，儲存后48小時血小板聚集活性降低到少于40％。在加入了實(shí)施例28制備的化合物的組中，儲存48小時后血小板聚集活性保持了至少60％。這表明通過加入本發(fā)明化合物明顯抑制了血小板聚集活性的下降。
如上所示，本發(fā)明肽的加入產(chǎn)生了儲存期間的血小板被保護(hù)的效果如抑制血小板數(shù)的減少，對血小板聚集能力降低的抑制作用等等。已經(jīng)證明即使至今應(yīng)用的肽化合物如RGDS、RGDF等加入到血小板部分中，它們也會被血漿中存在的酶的作用酶解，因此明顯不適合用于血小板的長期保存中。另一方面，非常穩(wěn)定且在體內(nèi)不易分解的化合物將在輸血后抑制體內(nèi)血小板的所有功能，從而降低了輸血效率。相反，本發(fā)明肽具有理想特性，如在血小板部分中的高穩(wěn)定性，在體內(nèi)可高度降解性和低毒性，因此其可用作極好的血小板保護(hù)劑。
另外，如果本發(fā)明肽以乙酸鹽或磷酸鹽形式給藥，預(yù)期他們將表現(xiàn)出緩沖作用，從而在血小板部分儲存期間產(chǎn)生抑制pH值變化的效果。而且，如果本發(fā)明肽不是單獨(dú)使用而與阿斯匹林或其它具有不同作用模式的血小板聚集抑制劑結(jié)合使用時，預(yù)期會有協(xié)同效果。[制劑實(shí)施例1]將實(shí)施例1-31得到的每一種肽(100mg)溶解在100ml鹽水中。在無菌條件下，所得溶液以2.5ml體積安瓿分裝，將安瓿密封得注射制劑。[制劑實(shí)施例2]向由一種實(shí)施例1-31得到的肽(500mg)、結(jié)晶纖維素(50mg)和乳糖(450mg)組成的混合物中加入乙醇和水的混合物(1ml)，并且細(xì)密研磨，所得混合物用常規(guī)方法造粒制備顆粒劑。
工業(yè)可應(yīng)用性如上文所解釋的，本發(fā)明肽用作血小板聚集制劑。換句話說，本發(fā)明肽用來防止血栓溶解治療后和治療期間的血栓，血栓栓塞和再梗塞，防止冠狀動脈和其它動脈血管成形術(shù)后和冠狀動脈分流術(shù)后的血栓，血栓栓塞和再梗塞，并防止心肌梗塞形成。
另外，本發(fā)明肽可用作體外循環(huán)時抑制血栓生成的體外循環(huán)血液凝固抑制劑。
而且，本發(fā)明肽對抑制血小板功能的降低是有效的，即它們有效保護(hù)血小板。而且本發(fā)明肽作為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的細(xì)胞粘連抑制劑是有效的。
權(quán)利要求
1.一種用下面通式(I)表示的肽或其鹽Pro-Ser-A-B-Asp-C-D(I)其中A是一種在側(cè)鏈上沒有胍基的氨基酸，B是一種氨基酸，C是側(cè)鏈上有疏水基的氨基酸，和D是羥基或氨基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽或其鹽，其中A是中性氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的肽或其鹽，其中所述中性氨基酸是甘氨酸，脯氨酸或其衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的肽或其鹽，其中所述中性氨基酸是在側(cè)鏈上含有至少一個選自下組基團(tuán)的氨基酸，該組基團(tuán)為含有1-30個碳原子的取代或未取代的烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代雜芳基，和有3-10個碳原子的取代或未取代的環(huán)烷基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的肽或其鹽，其中A是在測鏈上有氨基的氨基酸，該氨基可被含有1-10個碳原子的烷基取代。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的肽或其鹽，其中A是一種用下面通式(X)表示的氨基酸 其中，R1和R2可以相同或不同，各自是氫原子或1-10個碳原子的烷基，且n是4-10的整數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一權(quán)利要求的肽或其鹽，其中B是甘氨酸或N-烷基甘氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一權(quán)利要求的肽或其鹽，其中C是色氨酸或苯丙氨酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的肽或其鹽，其中A是一種中性氨基酸或側(cè)鏈上有氨基的氨基酸，該氨基可以被1-10碳原子烷基取代，B是甘氨酸或N-烷基甘氨酸，且C是色氨酸或苯丙氨酸。
10.一種血小板聚集抑制劑，其含有權(quán)利要求1-9任一權(quán)利要求的肽或其鹽作為活性成分。
11.一種體外循環(huán)血液凝固抑制劑，其含有權(quán)利要求1-9任一權(quán)利要求的肽或其鹽作為活性成分。
12.一種細(xì)胞粘連抑制劑，其含有權(quán)利要求1-9任一權(quán)利要求的肽或其鹽作為活性成分。
13.一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑，其含有權(quán)利要求1-9任一權(quán)利要求的肽或其鹽作為活性成分。
14.一種輸血用血小板制劑的保護(hù)劑，其含有權(quán)利要求1-9任一權(quán)利要求的肽或其鹽作為活性成分。
15.一種輸血用血小板制劑，其中加入了權(quán)利要求1-9任一權(quán)利要求的肽或其鹽。
16.一種輸血用血小板制劑包，在包中輸血用血小板制劑中含有權(quán)利要求1-9任一權(quán)利要求的肽或其鹽。
17.一種藥物組合物，其含有權(quán)利要求1-9任一權(quán)利要求的肽或其鹽和可藥用載體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組合物，其被用于抑制血小板聚集。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組合物，其被用于抑制體外循環(huán)血液凝固。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組合物，其被用于抑制細(xì)胞粘連。
21.根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組合物，其被用于抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。
22.根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組合物，其被用于保護(hù)輸血用血小板。
23.一種抑制血小板聚集的方法，包括給患者施用可藥用載體中有效量的權(quán)利要求1-9任一權(quán)利要求的肽或其鹽的步驟。
24.一種抑制體外循環(huán)血液凝固的方法，包括給患者施用可藥用載體中有效量的權(quán)利要求1-9任一權(quán)利要求的肽或其鹽的步驟。
25.一種抑制細(xì)胞粘連的方法，包括給患者施用可藥用載體中有效量的權(quán)利要求1-9任一權(quán)利要求的肽或其鹽的步驟。
26.一種抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，包括給患者施用可藥用載體中有效量的權(quán)利要求1-9任一權(quán)利要求的肽或其鹽的步驟。
27.一種保護(hù)輸血用血小板制劑中血小板的方法，包括向血小板制劑中加入有效量的權(quán)利要求1-9任一權(quán)利要求的肽或其鹽的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供了用下面通式(I)表示的化合物或其鹽Pro-Ser-A-B-Asp-C-D (I)其中A是一種側(cè)鏈上沒有胍基的氨基酸，B是一種氨基酸，C是一種側(cè)鏈上有疏水基的氨基酸，并且D是羥基或氨基。本發(fā)明化合物和其鹽是有用的，因?yàn)樗麄兙哂袠O好的血小板聚集抑制和血液凝固抑制活性并且是高度安全的。另外本發(fā)明提供了含有本發(fā)明化合物和其鹽為活性成分的下列試劑血小板聚集抑制劑；血液凝固抑制劑；腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑；和血小板制劑的保護(hù)劑。而且本發(fā)明提供了含有該化合物或其鹽和可藥用載體的藥物組合物；抑制血小板聚集的方法，包括給患者施用可藥用載體中有效量的該化合物或其鹽的步驟抑制體外循環(huán)血液凝固的方法，包括給患者施用可藥用載體中有效量的該化合物或其鹽；抑制細(xì)胞粘連的方法，包括給患者施用可藥用載體中有效量的該化合物或其鹽的步驟；抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，包括給患者施用可藥用載體中有效量的該化合物或其鹽的步驟；保護(hù)輸血用血小板制劑中血小板的方法，包括向血小板制劑中加入有效量該化合物或其鹽的步驟。
文檔編號A61K38/36GK1132515SQ94193587
公開日1996年10月2日 申請日期1994年9月29日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月30日
發(fā)明者佐藤吉美, 林良雄, 片田淳 申請人:新日本制鐵株式會社