專利名稱：能誘導對hiv免疫應答的肽及含有該肽的預防、治療aids的藥物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是關于一種含有人類免疫缺陷病毒(Human Immunode-ficiency Virus，以下略為HIV)蛋白的部分區(qū)域的氨基酸序列且能誘導對HIV免疫應答的肽及含有該肽的預防、治療AIDS的藥物。
眾所周知，獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquired ImmunodeficiencyDisease Syndrome，以下略為AIDS)是因感染HIV而引起的疾病。人們正積極地研究開發(fā)治療這種疾病的藥物，疊氮脫氧胸苷(以下略為AZT)、雙脫氧肌苷(以下略為DDI)等藥物已在實際中應用，但存在療效及副作用等問題，還沒有發(fā)現(xiàn)能徹底治療由感染HIV引起的疾病的藥物，前景也難以預測。另一方面，通過增加對HIV的免疫抵抗力預防HIV感染和抑制AIDS發(fā)病的疫苗，作為可望防止這種疾病在世界范圍內的迅速蔓延的最后手段，正在被廣泛地研究。至今已設計出多種類型的疫苗，部分疫苗進入了臨床試驗，但還沒有發(fā)現(xiàn)實際應用中被證實對人有效的預防感染或抑制發(fā)病的疫苗。
迄今為止，已知的疫苗種類有i)采用滅活或減毒病毒顆粒的疫苗已知有引起與HIV病原性相關的基因突變而致缺失的方法(Droc.Natl.Acad.Sci.USA，841434(1987))、應用與HIV有共同的抗原性的猴子等的類似病毒的方法(Science，232，238，(1987))，但因有潛在的危險而不容易實用。
ii)采用病毒部分抗原蛋白的亞單位疫苗用基因重組的方法等生產(chǎn)只含有病毒顆粒的部分抗原蛋白作為免疫原的方法(Droc.Natl.Acad.Sci USA，84，6924，(1987)、Ann.Int.Med.，114 119，1991)、(Nature，355，728(1992))。這是最廣泛嘗試的方法，臨床試驗的例子也多。但是存在諸如中和抗體滴度不升高、抗體滴度的持續(xù)時間等應該解決的問題。還有這種方法增強產(chǎn)生抗體等的體液免疫的效果，很難與殺傷感染細胞的細胞免疫的激活相關聯(lián)，從HIV的感染方式看單純應用這種方法未必對預防感染有效。
iii)牛痘病毒及BCG菌等的重組活疫苗將取自HIV的部分基因序列整合到可在人體細胞內增殖的牛痘病毒及BCG菌等的基因中使其表達理論上可望有增強細胞免疫的效果。問題在于對于免疫力低下的患者即使是通常無害的牛痘病毒也有引起嚴重感染的可能以及至少迄今為止研制出來的牛痘重組活疫苗都沒能引起充分的免疫應答等。
iv)抗個體遺傳型抗體有報告關于不采用病毒抗原而以抗個體遣傳型抗體為免疫原的方法(Proc.Natl.Acad Sci.USA，89 2546，(1992))。
v)合成肽疫苗對化學合成中和抗體的決定區(qū)域的肽序列等進行了研究，特別是包被糖蛋白gp120的V3區(qū)域是主要的中和決定區(qū)域，正在進行以合成的V3區(qū)肽作為疫苗的嘗試(Proc Natl.Acad.Sci，USA，86，6768，(1989))。關于這些疫苗的研究開發(fā)情況記載于高橋秀實，《實驗醫(yī)學》11卷655—8661頁(1993)；奧田研爾山川正，《臨床上微生物》20卷55—62頁；A.T.Profy，BIOmedica8卷133—139頁等處。
上述至今為止的對疫苗的研究開發(fā)以通過誘導產(chǎn)生中和抗體來增強體液免疫的類型為主。但是與HIV作為自由的病毒顆粒相比，它更容易靠感染的細胞與未感染的細胞的融合傳播。因此，依靠殺傷感染細胞的細胞毒性T細胞(cytotoxic T Cell，以下略為CTL)的細胞免疫比依靠中和抗體的體液免疫在防御感染上更重要。實際上，通過調查那些有感染HIV的機會但感染未成立的個體，常常在血液中檢測不到抗體而存在CTL，因此有人報告早期誘導CTL對于預防感染很重要(J.Infec.Dis.，164，178，(1992))。
所以本發(fā)明的發(fā)明者們研究了能誘導特異地殺傷HIV感染的細胞的CTL的肽，旨在于以此治療或預防AIDS。
為了有效地誘導針對HIV感染細胞的CTL，鑒定CTL能識別的抗原決定部位并把它應用到疫苗中是極重要的。至今為止采用的方法是首先建立特異的針對HIV的CTL克隆，然后鑒定這種CTL克隆識別的抗原決定部位(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，3105，(1988))。采用這種方法通過眾多的人白血球抗原(以下略為HLA)I類抗原來鑒定提呈給CTL的HIV抗原決定部位，這需要合成大量的肽，要花費大量的時間和費用，因此抗原決定部位的鑒定也沒有進行。
CTL通過靶細胞表面表達的主要組織相容性抗原復合體(以下略為MHC)I類抗原識別抗原提呈的抗原決定肽，攻擊靶細胞，但最近已證實，在特異的MHCI類抗原上結合的被抗原提示的抗原決定肽是一種大致9鏈長的肽，其氨基酸序列有一定的規(guī)律性(mo-tif)(Nature，351，290，(1991)、Eur.J.Immunol.，22，2453，(1992)、Nature，353，326，(1991)、Nature，360 434，(1992)、Immunogenet-ics，38，161，(1993))。
本發(fā)明的目的在于提供能誘導對HIV免疫應答的肽。
本發(fā)明的目的也在于提供編碼上述肽的DNA。
本發(fā)明的目的還在于提供含有上述肽的預防治療AIDS的藥物。
本發(fā)明的目的還在于提供能誘導對HIV免疫應答的肽的選取方法。
下述記載會使本發(fā)明的上述及其他目的更清楚。
本發(fā)明從可能與各種HLAI類抗原結合的自身抗原肽的基序(motif)推定可能與HLAI類抗原結合的HIV肽并合成推定的HIV肽。轉化細胞表層存在大量未被肽結合的表達的HLAI類抗原。選擇與大量表達在其表層的HLAI類抗原實際結合的肽。
然后從選出的肽中得到與HLAI類抗原結合并能刺激患者末梢血淋巴細胞從而誘導CTL的該合成肽，將其用于預防、治療AIDS。本發(fā)明是基于上述發(fā)現(xiàn)完成的。
即本發(fā)明提供的肽是HIV全部蛋白的片斷、該片斷含有8—11個氨基酸的連續(xù)序列、相當于與HLA結合的基序、實際與HLA結合并能誘導以HIV感染細胞為靶細胞的殺傷細胞。
本發(fā)明也提供編碼上述肽的DNA。
本發(fā)明還提供含有上述肽及醫(yī)藥上允許的載體和/或稀釋劑的預防、治療AIDS的藥物。
本發(fā)明還提供選取能誘導以感染HIV細胞為靶細胞的殺傷細胞的肽的方法。其特征是合成屬于HIV全部蛋白的片斷、含有8—11個連續(xù)序列的氨基酸、相當于與HLA結合的基序的肽。從合成的肽中選出與HLA實際結合的肽，然后從中選出與HLAI類抗原結合并能刺激HIV疾病患者的末梢淋巴細胞從而誘導殺傷細胞的肽。


圖1所示為RMA—S—B*3501細胞上HLA—B*3501抗原表達水平的變化。圖中△指與HLA—B*3501抗原有結合性的自身抗原肽28H(LPGPKFLQY)、○指37F(LPFDFTPGY)、□指加入無結合活性的肽MP～1(KGILGKVFTLTV)的HLA—B*3501表達水平的變化。
圖2所示為使用HIV(B35)—16作為肽時的特異細胞殺傷活性。圖中●指標記靶細胞為T2—B*—3501細胞、○指標記靶細胞為T2細胞，作為對照。用肽刺激培養(yǎng)的患者末梢淋巴細胞采用3種不同數(shù)量的細胞計數(shù)1×105，2.5×104，或者6.25×103。圖中所示特異的細胞殺傷活性值是細胞數(shù)1×105個時的結果。
圖3所示為使用HIV(35)—18作為肽時的特異細胞殺傷活性。圖中●指標記靶細胞為T2—B*—3501細胞、○指標記靶細胞為T2細胞，作為對照。用肽刺激培養(yǎng)的患者末梢淋巴細胞采用3種不同數(shù)量的細胞計數(shù)1×105，2.5×104，或者6.25×103。圖中所示特異的細胞殺傷活性值是細胞數(shù)1×105個時的結果。
圖4所示為使用HIV(B35)—POL—2α作為肽時的特異細胞殺傷活性。圖中●指標記靶細胞為T2—B*—3501細胞、○指標記細胞為T2細胞，作為對照。用肽刺激培養(yǎng)的患者末梢淋巴細胞采用3種不同數(shù)量的細胞計數(shù)1×105，2.5×104，或者6.25×103。圖中所示特異的細胞殺傷活性值是細胞數(shù)1×105個時的結果。
HIV的全部蛋白記載于如Nature Vol.313，P277—283(1985)、Proc.Natl.，Acad.Sci USA Vol.83，P2209—2213(1986)等中。本發(fā)明的肽是上述HIV全部蛋白的片斷。該片斷是含有8—11個最好是9—11個氨基酸的連續(xù)序列的肽。本發(fā)明的肽還必須相當于HLA結合基序，與HLA實際結合。這里，HLA結合基序是8—11個氨基酸的序列，包括第2位氨基酸是Pro、C末端是Tyr、Leu、Ile、Met、Phe及Ala中的任一種氨基酸的序列；第2位氨基酸是Pro、Ala、Gly中的任一種氨基酸，C末端是Ile、Leu、Val、Phe及Met中的任一種氨基酸的序列；第2位氨基酸是Leu、Val、Tyr及Phe中的任一種氨基酸，C末端是Arg的序列。本發(fā)明中相當于與HLA結合的基序的肽實際上與HLA結合與否，可用含有HLAI類抗原的細胞確定。這樣的細胞有RMA—S—B*3501細胞、RMA—S—B*5101細胞及RMA—S—A*3101細胞等。這些細胞可以將HLA—B*3501基團、HLA—B*—5101基因及HLA—A*3101基因導入RMA—S細胞、很容易得到。有關RMA—S細胞記載于Liunggren et al.，J.Immu—nol.，142，2911，(1989)。
本發(fā)明中與HLAI類抗原結合的合成HIV肽還必須在實際應用中刺激患者的末梢血淋巴細胞從而誘導CTL，即能誘導以感染HIV的細胞為靶細胞的殺傷細胞。
例舉出序列號從1至63的具備這些條件的肽。
序列號1—24中的任一種氨基酸序列的肽都能與HLA—B3501抗原結合，是利用RMA—S—B*3501細胞得到的。序列號25～46中的任一種氨基酸序列的肽都能與HLA—B51抗原結合，是利用RMA—S—B*5101細胞得到的。還有，序列號47—63中的任一種氨基酸序列的肽都能與HLA—A3101抗原結合，是利用RMA—S—A*3101細胞得到的。本發(fā)明得到肽的方法將在以后的實施例中詳細說明。
序列號1—63中的任一種氨基酸序列的肽都可用本行業(yè)人員周知的方法合成或生產(chǎn)。近年來肽合成器的發(fā)展使由數(shù)十個氨基酸殘基構成的肽能容易地生產(chǎn)出來。或者，將編碼序列號1—63中任何一種氨基酸序列肽的DNA連接于適當?shù)谋磉_載體，也可以通過培養(yǎng)由此被轉化了的大腸桿菌屬細菌等的細胞來生產(chǎn)。這種用基因重組技術生產(chǎn)蛋白質、肽等的方法是本行業(yè)人員所熟知的。
編碼序列號1—63中任何一種氨基酸序列的肽的DNA能從序列號1—63中任何一種氨基酸序列演譯出來。各氨基酸所對應的密碼是本行業(yè)人員周知的。將該DNA導入細胞使之表達時，各種細胞傾向選擇的密碼不同，因此應考慮這個因素。例如使用大腸桿菌屬細菌細胞內傾向選擇的密碼時，以編碼序列號為3的氨基酸序列的肽的DNA為例，有編碼序列號為64的DNA的堿基序列；以編碼序列號為4的氨基酸序列的肽的DNA為例，有編碼序列號為65的DNA的堿基序列；以編碼序列號為5的氨基酸序列的肽的DNA為例，有編碼序列號為66的DNA的堿基序列。
序列號1—63中任一種氨基酸序列的肽都是T細胞抗原決定部位，能誘導HIV特異的CTL，因此作為疫苗很有用。實際作為疫苗使用時，單純肽的溶液、或者加上適當?shù)妮o助劑注射給藥或用噴霧等方法經(jīng)粘膜透皮吸收等給藥方式都有好的效果。給藥量每次0.1—100mg，單次或重復給藥。如果同時應用多個用上述方法選出的抗原決定肽，大都會產(chǎn)生更好的效果。制劑上冷凍干燥，加入糖等賦形劑制成顆粒也可，并不需要任何特殊的東西。注射給藥時，用注射用蒸餾水溶解后使用。本藥是肽類化合物，不存在用上述給藥方法成為問題的嚴重的急性毒性。
為提高疫苗的免疫原性而添加的佐劑可使用BCG菌等的菌體成分、Morein等人開發(fā)的從Quilla樹皮提取的ISCOM(Immunostim-ulating Complex)(Nature，308，457，(1984)Nature，344，873，(199))、皂角苷系列的QS—21—(J.Immunol.，148 1438，(1992))、脂質體(J.Immunol.，148，1585，(1992))、氫氧化鋁(alum，明礬)、KLH(Keyhole Lympet Hemocymin)(J.Virol.，65，489，(1991))等。上述早先的文獻及Sciencl，255，333，(1992)等也論述了用這樣的方法在生物體內能誘導CTL等的免疫應答。
本發(fā)明通過采用下面兩種方法使用抗原決定肽可有效適用于試管內將該抗原決定肽給予取自患者的細胞或具有單倍型HLAI類抗原的細胞，使經(jīng)抗原提示后，將細胞注入患者血管使其在患者體內有效地誘導CTL的方法以及將同一肽加入患者末梢血淋巴細胞在試管內培養(yǎng)，使試管內的CTL被誘導增殖后再回注給患者的方法。在序列號1—24中任一種氨基酸序列的肽的存在下培養(yǎng)具有HLA—B*3501抗原的末梢血淋巴細胞得到的細胞毒性T細胞可作為抗AIDS疫苗應用。實際操作是患者末梢血淋巴細胞每107—109中加入該肽0.01—1mg，培養(yǎng)數(shù)小時到1天后注入患者靜脈中?；蛘呤沁€可以用加入重組白細胞介素2(recombinant IL—2)50u/ml和該肽1μg/ml的培養(yǎng)液不斷更換培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)數(shù)周，在試管內誘導CTL后經(jīng)靜脈給患者注入。培養(yǎng)的方法用本行業(yè)人員熟知的常規(guī)方法即可。培養(yǎng)后用離心分離等方法洗滌培養(yǎng)成分后，用生理鹽水等制成混懸液給藥。這種細胞注入治療已經(jīng)作為癌的治療法應用，是本行業(yè)人員熟知的方法(New Eng.J.Med.，313，4185，(1985)、Sci-ence，233，1318，(1986))。
另外，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的CTL抗原決定部位也可活用于基因重組的牛痘病毒、BCG菌等的活疫苗即將編碼序列號1—63中任一種氨基酸序列的肽的DNA整合入這些基團重組活疫苗表達的基因重組抗原蛋白基因中，該肽序列作為抗原蛋白的一部分表達后，在細胞內被加工并被HLAI類抗原提呈，能誘導識別它的CTL。BCG菌表達外來基因的方法詳細記載于國際專利公開號為WO88/06626的專利中。關于BCG菌重組活疫苗詳細記載于J.Exp.Med.，178，197，(1993)。給藥量、給藥方法可依照通常的種痘、BCG疫苗標準。急性毒性等也與通常的種痘，BCG疫苗沒什么不同。只是牛痘病毒在AIDS發(fā)病、免疫力低下的患者有引起嚴重感染的危險，使用治療疫苗必須慎重。BCG疫苗還沒有這樣的例子。用這樣的方法能在生物體內誘導CTL等的免疫應答記載在Nature，332，728，(1988)、Na-ture，351，479，(1991)等處。
HIV疫苗存在的嚴重問題是HIV很容易發(fā)生突變從而逃脫宿主免疫。所以作為免疫原只含有一種抗原決定肽的疫苗很可能不久就失效。因此以本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的眾多的抗原決定肽作為免疫原的疫苗有很高的實用性。
下面通過實施例詳細說明本發(fā)明。
實施例1(1)通過與HLA—B*3501結合的自身抗原肽基序推測與HLA—B*3501結合的HIV肽。
與HLA—B*3501結合的自身抗原肽的基序在此之前已清楚(Nature，360，434，(1992)、Immunogenetics，38，161(1993)，由此推定來自HIV蛋白的肽中與自身抗原肽同樣由8—12個氨基酸構成、第2位是Pro，C末端是Tyr、Leu、Ile、Met、Phe中的任一種氨基酸的肽容易與HLA—B*3501結合。構成HIV全部蛋白質的氨基酸序列已經(jīng)被報告過，從中選出與HLA—B*3501結合的自身抗原肽的基序相一致的肽。HIV的ARV—2株HIV的蛋白質序列中與此相合的肽如表1所示有58種。這些肽用島津制作所生產(chǎn)的肽合成機合成，供測定與HLA—B*3501抗原結合實驗用。
表1HIV(B35)-1RPGGKKKY HIV(B35)—11 PPFLWMGYHIV(B35)-2VPLRPMTY HIV(B35)-13 PPLVKLWYHIV(B35)-3TPGPGIRY HIV(B35)-14 NPDIVIYQYHIV(B35)-4PPIPVGEIY HIV(B35)-15 EPPFLWMGYHIV(B35)-5GPKEPFRDY HIV(B35)-16 TPPLVKLWYHIV(335)-6QPKTACTTCY HIV(B35)-18 EPIVGAETFYHIV(B35)-7NPPIPVGEIY HIV(B35)-19 EPFKNLKTGKYHIV(B35)-8EPFRDYVDRFYHIV(B35)-20 IPAETGQETAYHIV(B35)-10 TPGIRYQYHIV(B35)GAG-8 TPQDLNTML HIV(B35)GAG-21GPGHKARVLHIV(B35)GAG-13NPPIPVGEI HIV(B35)GAG-26APPEESFRFHIV(B35)GAG-20GPAATLEEMHIV(B35)POL-1 LPGRWKPKM HIV(835)POL-20SPAIFQSSMHIV(B35)POL-7 VPVKLKPGM HIV(B35)POL-27YPGIKVRQLHIV(B35)POL-9 GPKVKQWPLHIV(B35)ARV2-1 EPIDKELY HIV(B35)ARV2-25EPIVGAETFHIV(B35)ARV2-2 EPVHEVYY HIV(B35)ARV2-26QPDKSESELHIV(B35)ARV2-3 QPRTACNNCY HIV(B35)ARV2-27LPPVVAKEIHIV(B35)ARV2-4 VPLDKDFRKY HIV(B35)ARV2-28VPRRKAKIIHIV(B35)ARV2-5 RPWLHSLGQY HIV(B35)ARV2-29DPGLADQLIHIV(B35)ARV2-6 RPQVPLRPMTYHIV(B35)ARV2-30TPKKTKPPLHIV(B35)ARV2-7 RPNNNTRKSIYHIV(B35)ARV2-31PPLPSVKKLHIV(B35)ARV2-8 FPVRPQVPL HIV(B35)ARV2-32FPRPWLHSLHIV(B35)ARV2-9 RPQVPLRPM HIV(B35)ARV2-33DPNPQEVVLHIV(B35)ARV2-10RRPMTYKAAL HIV(B35)ARV2-34KPCVKLTPLHIV(B35)ARV2-11YPLTFGWCF HIV(B35)ARV2-35CPKVSFEPIHIV(B35)ARV2-12LPPLERLTL HIV(B35)ARV2-36RPIVSTQLLHIV(B35)ARV2-18TPSQKQEPI HIV(B35)ARV2-37DPEIVMHSFHIV(B35)ARV2-19YPLTSLRSL HIV(B35)ARV2-38LPCRIKQIIHIV(B35)ARV2-20LPGKWKPKM HIV(B35)ARV2-39SPLSFQTRLHIV(B35)ARV2-24IPLTEEAEL(2)合成HIV肽與HLA—B*3501抗原結合的測定用表達HLA—B*3501的小鼠細胞株RMA—S株測定合成的HIV肽是否結合。
2—1，RMA—S—B*3501細胞的制備HLA—B*3501基因可用原來報告過的方法從含有這個抗原的人末梢血淋巴細胞染色體DNA克隆化取得(Ooba et al.，Immuno-genetics，30，76(1989))。即用常規(guī)方法從含有HLA—B*3501抗原的人末梢血淋巴細胞制備染色體DNA，用限制性酶EcoRI消化后經(jīng)蔗糖密度梯度離心得到6.0—8.5Kb的片斷。將這些DNA片斷插入噬菌體載體λZAP(購自東洋紡社)制成基因組文庫。以HLA—B7CDNA(Coppin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82 8614，(1985)為探針篩選這個文庫，得到含有HLA—B*3501基因的克隆。得到的基因用electro poration法移入RMA—S細胞(Liungguenet al.，J.Immunol.，142，2911(1989))，通過應用HLA—Bw6單克隆抗體、SFR8、B6(ATCC HB152)的fiowcytomltry來選擇表達基因的細胞。RMA—S—B*3501細胞已委托通產(chǎn)省工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所保藏，保藏編號為FERM BP—4727。
2—2用RMA—S—B*3501細胞測定合成的HIV肽與HLA—B*3501細胞抗原的結合。
RMA—S細胞是缺乏TAP(Transporter Associated Protein)抗原的小鼠細胞株。因此，在37℃培養(yǎng)時，細胞表面只表達低水平的MHCI類抗原。但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在低溫(26℃)培養(yǎng)時，未結合肽的I類抗原在細胞表面高水平表達(Liunggren et al.，Nature，346，476，(1990))。
RMA—S—B*3501細胞也同樣在26℃培養(yǎng)時HLA—B*3501抗原在細胞表面高水平表達，但在37℃培養(yǎng)時表達水平低下。而且26℃培養(yǎng)的RMA—S—B*3501細胞置于37℃3小時，其HLA—B*3501抗原的表達則與37℃培養(yǎng)的情形相同，表達量減低。但是未結合肽的HLA—B*3501抗原結合了從外面加入的肽時，肽結合的HLA—B*3501抗原即使置于37℃也不消失，保持高表達量。圖1表示加入與HLA—B*3501抗原有結合活性的自身抗原肽28H(LPGPKFLQY圖中用△表示)、37F(LPFDFTPGY圖中用○表示)和無結合活性的肽MP—1(KGILGKVFTLTV圖中用□表示)時，HLA—B*3501表達水平的變化。得出了HLA—B*3501抗原的表達量依賴于有結合活性的肽的加入量的結論。關于有與HLA—B*3501抗原結合活性的自身抗原肽28H、37F和無結合活性的肽MP—1，記載在Nature，360，434(1992)、Immunogenetics，38，161(1993)。因此，這個實驗體系以HLA—B*3501抗原的細胞表層表達量為指標首次能容易地測定外加肽與HLA—B*3501結合的活性。實際測定被測肽的結合操作是于26℃培養(yǎng)的RMA—S—B*3501細胞中加入該肽，在26℃下放置1小時，然后37℃放置3小時后使用抗HLA—Bw6單克隆抗體、SFR8·B6和flowcytometry測定HLA—B*3501抗原的表達水平?！刺砑与牡膶φ?、●未添加肽且只在26℃培養(yǎng)的對照，■未加肽且只在37℃培養(yǎng)的對照。
測定了58種HIV肽與HLA—B*3501抗原的結合，如表2所示26種肽發(fā)生了結合。
表2結合的親和性肽 序列位置高親和性HIV(B35)-3 TPGPGIRYnef 133-139HIV(B35)-14NPDIVIYQY pol 330-338HIV(B35)ARV2-8 FPVRPQVPL nef 72-80中親和性HIV(B35)-16TPPLVKLWY pol 574-582HIV(B35)-18EPIVGAETFY pol 587-596
HIV(B35)-20 IPAETGQETAYpol 804-814HIV(B35)POL-20SPAIFQSSM pol 311-319HIV(B35)ARV2-11 YPLTFGWCF nef 139-147HIV(B35)ARV2-19 YPLTSLRSL gag 486-494HIV(B35)ARV2-25 EPIVGAETF pol 587-595低親和性HIV(B35)-7NPPIPVGEIY gag 255-264HIV(B35)-8EPFRDYVDRFYgag 293-303HIV(B35)-15 EPPFLWMGY pol 379-387HIV(B35)-19 EPFKNLKTGKYpol 587-596HIV(B35)GAG-20GPAATLEEM gag 340-348HIV(B35)GAG-26APPEESFRF gag 459-467HIV(B35)ARV2-1EPIDKELY gag 479-486HIV(B35)ARV2-2EPVHEVYY pol 467-474HIV(B35)ARV2-4VPLDKDFRKY pol 273-282HIV(B35)ARV2-6RPQVPLRPMTYnef 75-85HIV(B35)ARV2-9RPQVPLRPM nef 75-83HIV(B35)ARV2-12 LPPLERLTL rev 75-83HIV(B35)ARV2-24 IPLTEEAEL pol 448-456HIV(B35)ARV2-33 DPNPQEVVL env 77-85HIV(B35)ARV2-36 RPIVSTQLL env 255-263HIV(B35)ARV2-38 LPCRIKQII env 413-421
(3)與HLA—B*3501結合的肽誘導感染HIV患者的CTL的作用。
具有HLA—B*3501的感染HIV患者3人患者A(HLA—A24/31，B35/61，Cw3/—)、患者B(HLA—A24/26，B35/61，Cw3/—)及患者C(HLA—A24/26，B35/51，Cw3/—)。分離他們的淋巴細胞。淋巴細胞的分離采用常用的Ficoll—Cnray比重離心法(矢田純一、藤原道夫編著，《新淋巴球機能檢索法》，中外醫(yī)學社(1987)、《新生化學實驗講座12·分子免疫學I》，東京化學同人(1989)。即用加肝素的注射器采血后用生理鹽水稀釋加到Ficoll—Paqul分離液(Pharmacia公司)上分層后室溫下以400×g離心30分鐘。用移液管回收、洗滌中間層的淋巴細胞組分。于24孔培養(yǎng)板的各孔內加入2×106個淋巴細胞，再用加入了終濃度分別為50μ/ml及1μM的人重組白細胞介素2(recombinant IL2)及合成肽的RP-MI1640(含10％FCS)培養(yǎng)液培養(yǎng)。隔2—3天，用加入了濃度為50μ/ml的IL2的RPMI1640培養(yǎng)液進行半量換液。1周后，用PHA刺激后分別加入經(jīng)放射線照射的自身淋巴細胞(1×106)和1μM的合成肽再次刺激特異CTL細胞使增殖后，再培養(yǎng)1周，測定CTL的活性。
(4)使用HLA—B*3501結合肽而誘導產(chǎn)生的CTL的細胞殺傷活性的測定。
4—1，T2—B*—3501細胞的制備將HLA—B*3501基因用electropration法移至TAP抗原基因缺失的人淋巴細胞株T2細胞內(salter et al.，EMBO J.，5,943,(1986))，用SFR·B6單克隆抗體經(jīng)flowcytometry選擇表達的細胞，命名這種細胞為T2—B*3501。T2—B*3501細胞已委托通產(chǎn)省工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所保藏，保藏編號為FERM BP—4726。
HLA—B35的患者感染HIV發(fā)病時，感染HIV的淋巴細胞表面表達HLA—B*3501抗原和提呈HIV肽。T2—B*3501細胞與(2)中RMA—S—B*3501細胞同樣在26℃表達時，大量表達未結合肽的HLA—B*3501抗原。所以在這樣的條件下使肽與之結合，所謂人為制造感染了HIV的淋巴細胞作為測定CTL的細胞性活性的靶細胞使用。
4—2，測定CTL的細胞毒性活性將1×106個T2—B*3501細胞或T 2細胞與100μCi的Na251CrO4于26℃的條件下混合90分鐘，然后用含10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌3次后作為標記靶細胞。于96孔培養(yǎng)板的各孔內加入懸浮于50μl培養(yǎng)液的5×103個標記靶細胞(T2或T2—B*3501細胞)，再加入稀釋至4μM～4×10-4μM的合成肽溶液5μl，放入CO2溫箱中30分鐘后，加入前項肽刺激下培養(yǎng)的患者末梢淋巴細胞1×105、2.5×104或6.25×103(懸浮于100μl的培養(yǎng)液中)，放入37℃的CO2溫箱中4小時。然后取各孔半量的培養(yǎng)液(100μl)，用7計數(shù)儀測定因培養(yǎng)的患者末梢淋巴細胞的細胞毒性活性而從靶細胞游離的51Cr。特異的細胞毒性活性可按下面公式計算。 但，最小釋放值是只放入靶細胞的孔的測定值，是51Cr從靶細胞的自然游離值。最大釋放值是靶細胞中加入表面活性劑Triton100破壞細胞時的標記游離值。
結果見圖2、3、4。圖2為HIV(B35)—16(序列號3)、圖3為HIV(B35)—18(序列號4)、圖4為HIV(B35)POL—20(序列號6)的結果。證實了這些合成肽能有效地誘導殺傷結合了肽的T2—B*3501細胞的CTL細胞。
用同樣的方法測定了表2中記載的肽能否誘導對HIV的免疫應答，其中能誘導對HIV免疫應答的肽總結在表3中。
表3結合的親和性肽 序列 位置高親和性HIV(B35)-14NPDIIYQY pol 330-338HIV(B35)ARV2-8 FPVRPQVPL nef 72-80中親和性HIV(B35)-16TPPLVKLWY pol 574-582HIV(B35)-18EPIVGAETFY pol 587-596HIV(B35)POL-20 SPAIFQSSM pol 311-319HIV(B35)ARV2-11YPLTFGWCF nef 139-147HIV(B35)ARV2-25EPIVGAETF pol 587-595低親和性HIV(B35)ARV2-4 VPLDKDFRKY pol 273-282HIV(B35)ARV2-6 RPQVPLRPMTYnef 75-85HIV(B35)ARV2-24IPLTEEAEL pol 448-456HIV(B35)ARV2-33DPNPQEVVL env 77-85HIV(B35)ARV2-36RPIVSTQLL env 255-263HIV(B35)ARV2-38LPCRIKQII env 413-421
同樣對MN株、NDK株、HXB2株HIV序列進行測試，選出了表4中所列的肽。
表4結合的親和性肽 序列 位置高親和性HIV(B35)GAG-24 FPQSRTEPT gag 450-458(MN)HIV(B35)POL-5 FPISPIETV pol 155-163中親和性HIV(B35)-17VPLDEDFRKY pol 182-191(HXB2)HIV(B35)-29EPIIGAETFY pol 586-595(NDK)HIV(B35)GAG-9 HPVHAGPIT gag 219-227(MN)HIV(B35)GAG-29 YPLASLKSL gag 490-498(MN)低親和性HIV(B35)-9 KPQVPLRPMTYnef 73-83(MN)HIV(B35)-12EPVHGVYY pol 466-473(NDK)HIV(B35)-25NPEIVIYQY pol 329-327(NDK)HIV(B35)GAG-4 VPIVQNIEG gag 135-143(MN)HIV(B35)POL-26 LPEKDSWTV pol 401-409
實施例2作為與HLA結合基序，采用HLA—B51結合抗原肽的基序，是由8～11個氨基酸組成、第2位是Pro、Ala、及Gly中的任一種氨基酸、C末端是Ile、Leu、Val、Phe及Met中任一種氨基酸的氨基酸序列，且采用SF—2株HIV的蛋白質序列及RMA—S—B*5101細胞，余皆同實施例1，得到能誘導對HIV免疫應答的肽。這些肽總結于表5。RMA—S—B*5101細胞已委托通產(chǎn)省工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所保藏，保藏編號為FERM BP—4834。
表5肽 序列 位置HIV-B35-GAG-13(A55)NPPIPVGEIGAG255-264HIV-B35-GAG-29(A69)YPLASLKSLGAG490-498HIV-B35-POL-5(A74) FPISPIETVPOL155-163HIV-B35-POL-7(A76) VPVKLKPGMPOL163-171HIV-B35-POL-26(A95)LPEKDSWTVPOL401-409HIV-B35-SF2-8(C-1) FPVRPQVPLNEF71-80HIV-B35-SF2-21(C-7)YPLTSLRSLGAG486-494HIV-B35-SF2-27(C-12) LPPVVAKEIPOL743-751HIV-B35-SF2-32(C-17) FPRPWLHSLVPR34-42HIV-B35-SF2-35(C-20) CPKVSFEPIENV208-216HIV-B35-SF2-38(C-23)LPCRIKQIIENV413-421HIV-B35-33(C-31)YPCTVNFTIENV618-626HIV-B35-34(C-32)LPALSTGLIENV682-690HIV-B35-36(C-34)CPSGHAVGIENV1171-1179HIV-B35-39(C-37)IPTSGDVVIENV1426-1434HIV-B35-50(C-48)LPPTIGPPIENV2316-2324HIV-B35-55(C-53)APTLWARMIENV2835-2843HIV-B35-56(C-54)EPLDLPQIIENV2874-2882HIV-B51-3(H-3) NANPDCKTIGAG327-335HIV-B51-7(H-7) TAVQMAVFIPOL989-997HIV-B51-9(H-9) RAFHTTGRIENV316-324HIV-B51-10(H-10)YAPPIGGQIENV432-440HIV-B51-11(H-11)QARQLLSGIENV539-547HIV-B51-12(H-12)VAQRAYRAIENV831-839HIV-B51-13(H-13)RAYRAILHIENV834-842HIV-B51-29(H-18)VGPTPVNIIPOL133-141HIV-B51-32(H-21)QGWKGSPAIPOL306-314HIV-B51-43(H-32)VGGLVGLRIENV688-696HIV-B51-53(H-42)DARAYDTEVENV56-64HIV-B51-54(H-43)NALFRNLDVENV171-179HIV-B51-70(H-50)IPLGDAKLVVIF57-65HIV-B51-71(H-51)GPCTNVSTVENV240-248HIV-B51-83(H-63)CGHKAIGTVPOL123-131實施例3作為與HLA結合基序，采用HLA—A*3101結合抗原肽的基序，是由8～11個氨基酸組成、第2位氨基酸是Leu、Val、Tyr及Phe中的任一種氨基酸、C末端是Arg的氨基酸序列，且采用MN株HIV的蛋白質序列或SF—2株HIV的蛋白質序列及RMA—S—A*3101細胞，余皆同實施例1，得到能誘導對HIV免疫應答的肽。這些肽總結于表6。RMA—S—A*3101細胞已委托通產(chǎn)省工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所保藏，保藏編號為FERM BP—4823。
表6肽 序列 位置 Kd值C-119IVMHSFNCRENV373-3813.0×10-5C-121VLAVERYLRENV579-5879.0×10-5C-117NYRLIHCNRENV193-2011.1×10-4C-104MVHQAISPRGAG144-1521.4×10-4C-114SVKKLTEDRVIF165-1731.4×10-4C-124SLCLFSYRRENV761-7692.2×10-4C-125CLFSYRRLRENV763-7712.2×10-4C-111AVFIHNFKRPOL893-9012.9×10-4C-100KLAFHHMARNEF192-2003.7×10-4C-118TVQCTHGIRENV247-2557.4×10-4C-113ILGYRVSPRVIF124-1328.9×10-4C-112IVWQVDRMRVIF9-17 ＞10-4C-98 PVRPQVPLRNEF73-81 ＞10-4C-126ILHIHRRIRENV838-846＞10-4C-106ELYPLTSLRGAG424-432＞10-4C-123VLSIVNRVRENV700-708＞10-4C-122IVGGLVGLRENV687-695＞10-4
本發(fā)明的肽，因能誘導對HIV的免疫應答，可以有效地應用在AIDS的預防、治療上。具體地，可制成含有上述肽的AIDS疫苗，也可將具有含有編碼上述肽的DNA的重組DNA的牛痘疫苗及BCG疫苗制成AIDS疫苗。而且在上述肽存在的條件下培養(yǎng)末梢血淋巴細胞得到的細胞毒性T細胞可作為治療AIDS的藥物應用。
序列表序列號1序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Asn Pro Asp Ile Val Ile Tyr Gin Tyr序列號2序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Phe Pro Val Arg Pro Gin Val Pro Leu序列號3序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Thr Pro Pro Leu Val Lys Leu Trp Tyr序列號4序列長10序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Glu Pro Ile Val Gly Ala Glu Thr Phe Tyr序列號5序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Ser Pro Ala Ile Phe Gln Ser Ser Met序列號6序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Phe序列號7序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Glu Pro Ile Val Gly Ala Glu Thr Phe序列號8序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Val Pro Leu Asp Lys Asp Phe Arg Lys Tyr序列號9序列長11序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Arg Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr序列號10序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Ile Pro Leu Thr Glu Glu Ala Glu Leu序列號11序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Asp Pro Asn Pro Gln Glu Val Val Leu序列號12序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Arg Pro Ile Val Ser Thr Gln Leu Leu序列號13序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Leu Pro Cys Arg Ile Lys Gln Ile Ile序列號14序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Phe Pro Gln Ser Arg Thr Glu Pro Thr序列號15序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Phe Pro Ile Ser Pro Ile Giu Thr Val序列號16序列長10序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Val Pro Leu Asp Glu Asp Phe Arg Lys Tyr序列號17序列長10序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Glu Pro Ile Ile Gly Ala Glu Thr Phe Tyr序列號18序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Thr序列號19序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Tyr Pro Leu Ala Ser Leu Lys Ser Leu序列號20序列長11序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Lys Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr序列號21序列長8序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Glu Pro Val His Gly Val Tyr Tyr序列號22序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Asn Pro Glu Ile Val Ile Tyr Gln Tyr序列號23序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Val Pro Ile Val Gln Asn Ile Glu Gly序列號24序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Leu Pro Glu Lys Asp Ser Trp Thr Val序列號25序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile序列號26序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Tyr Pro Leu Ala Ser Leu Lys Ser Leu序列號27序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Val Pro Val Lys Leu Lys Pro Gly Met序列號28序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Tyr Pro Leu Thr Ser Leu Arg Ser Leu序列號29序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Leu Pro Pro Val Val Ala Lys Glu Ile序列號30序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Phe Pro Arg Pro Trp Leu His Ser Leu序列號31序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Cys Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro Ile序列號32序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile序列號33序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Thr Ala Val Gln Met Ala Val Phe Ile序列號34序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Arg Ala Phe His Thr Thr Gly Arg Ile序列號35序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Tyr Ala Pro Pro Ile Gly Gly Gln Ile序列號36序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile序列號37序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Val Ala Gln Arg Ala Tyr Arg Ala Ile序列號38序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Arg Ala Tyr Arg Ala Ile Leu His Ile序列號39序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Val Gly Pro Thr Pro Val Asn Ile Ile序列號40序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Gln Gly Trp Lys Gly Ser Pro Ala Ile序列號41序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg Ile序列號42序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Asp Ala Arg Ala Tyr Asp Thr Glu Val序列號43序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Asn Ala Leu Phe Arg asn Leu Asp Val序列號44序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Ile Pro Leu Gly Asp Ala Lys Leu Val序列號45序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Gly Pro Cys Thr Asn Val Ser Thr Val序列號46序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Cys Gly His Lys Ala Ile Gly Thr Val序列號47序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Ile Val Met His Ser Phe Asn Cys Arg序列號48序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Val Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Arg序列號49序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Asn Tyr Arg Leu Ile His Cys Asn Arg序列號50序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Met Val His Gln ALa Ile Ser Pro Arg序列號51序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Ser Val Lys Lys Leu Thr Glu Asp Arg序列號52序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Ser Leu Cys Leu Phe Ser Tyr Arg Arg序列號53序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Cys Leu Phe Ser Tyr Arg Arg Leu Arg序列號54序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Ala Val Phe Ile His Asn Phe Lys Arg序列號55序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Lys Leu Ala Phe His His Met Ala Arg序列號56序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile Arg序列號57序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Ile Leu Gly Tyr Arg Val Ser Por Arg序列號58序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Ile Val Trp Gln Val Asp Arg Met Arg序列號59序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Pro Val Arg Pro Gln Val Pro Leu Arg序列號60序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Ile Leu His Ile His Arg Arg ILe Arg序列號61序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Glu Leu Tyr Pro Leu Thr Ser Leu Arg序列號62序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Val Leu Ser Ile Val Asn Arg Val Arg序列號63序列長9序列類型氨基酸拓撲結構直鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg序列號64序列長27序列類型核酸拓撲結構直鏈鏈數(shù)雙鏈來源生物名人類免疫缺陷病毒序列ACTCCGCCGC TGGTTAAACT GTGGTAC序列號65序列長30序列類型核酸拓撲結構直鏈 鏈數(shù)雙鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列GAACCGATCG TTGGTGCTGA AACTTTCTAC序列號66序列長27序列類型核酸拓撲結構直鏈鏈數(shù)雙鏈序列種類肽來源生物名人類免疫缺陷病毒序列TCTCCGGCTA TCTTCCAGTC TTCTATG
權利要求
1.一種作為HIV全蛋白片斷的肽，該片斷為含有8-11個氨基酸的連續(xù)序列的肽，相當于與HLA結合的基序，能與HLA實際結合且能誘導以HIV感染細胞為靶細胞的殺傷細胞。
2.權利要求1中記載的肽，該肽具有9—11個氨基酸的連續(xù)序列。
3.權利要求1中記載的肽，該肽具有序列號為1—63中任一種氨基酸序列。
4.權利要求1中記載的肽，其中與HLA結合的基序是8—11個氨基酸的序列，是從第2位是Pro、C末端是Tyr、Leu、Ile、Met、Phe及Ala的氨基酸組成的組中選擇的氨基酸。
5.權利要求4中記載的肽，該肽具有序列號1—24中任一種氨基酸序列。
6.權利要求4中記載的肽，該肽具有序列號1—13中任一種氨基酸序列。
7.權利要求1中記載的肽，其中與HLA結合的基序是8—11個氨基酸的序列，是從第2位是Pro、Ala及Gly、C末端是Ile、Leu、Val、Phe及Met的氨基酸組成的組中選擇的氨基酸。
8.權利要求7中記載的肽，該肽具有序列號25—46中的任一種氨基酸序列。
9.權利要求1中記載的肽，其中與HLA結合的基序是8—11個氨基酸的序列，是從第2位是Leu、Val、Tyr及Phe、C末端是Arg的氨基酸組成的組中選擇的氨基酸。
10.權利要求9中記載的肽，該肽具有序列號47—63中的任一種氨基酸序列。
11.編碼權利要求1中記載的肽的DNA。
12.含有權利要求1中記載的肽及醫(yī)藥上允許使用的載體和/或稀釋劑的預防、治療AIDS的藥物。
13.含有權利要求3中記載的肽及醫(yī)藥上允許使用的載體和/或稀釋劑的預防、治療AIDS的藥物。
14.含有權利要求4中記載的肽及醫(yī)藥上允許使用的載體和/或稀釋劑的預防、治療AIDS的藥物。
15.含有權利要求6中記載的肽及醫(yī)藥上允許使用的載體和/或稀釋劑的預防、治療AIDS的藥物。
16.通過向AIDS患者給以權利要求1中記載的肽來治療AIDS的方法。
17.選取能誘導以HIV感染細胞為靶細胞的殺傷細胞的肽的方法，其特征在于，合成作為HIV全蛋白片斷的含有8—11個氨基酸的連續(xù)序列的相當于HLA結合基序的肽，從合成的肽中選擇能與HLA實際結合的肽，然后從選擇的合成肽中選取與HLAI類抗原結合并能通過刺激HIV疾病患者末梢淋巴細胞從而誘導殺傷細胞的肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種作為HIV全蛋白的片斷，該片斷為含有8-11個氨基酸的連續(xù)序列的肽，相當于HLA結合基序，能與HLA實際結合且能誘導以HIV感染細胞為靶細胞的殺傷細胞，這種肽作為AIDS的預防、治療藥很有效。
文檔編號A61K38/00GK1133597SQ94193851
公開日1996年10月16日 申請日期1994年10月19日 優(yōu)先權日1993年10月19日
發(fā)明者滝口雅文, 三輪清志 申請人:味之素株式會社