專利名稱：單純性皰疹病毒-2ul26基因，衣殼蛋白，免疫測定和蛋白酶抑制劑的制作方法
有關(guān)申請的相互參考這個申請是1993年8月20日提交的共同未決的美國專利申請系列號08/110,522的一個部分繼續(xù)申請，該申請整個內(nèi)容在此引入作為參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及HSV-2(單純性皰疹病毒-2)UL26和HSV-2 UL26.5的基因；涉及基本上純的HSV-2 UL26和HSV-2 UL26.5的基因各產(chǎn)物；涉及生產(chǎn)和利用HSV-2 UL26和HSV-2 UL26.5 DNA序列和基因產(chǎn)物的組成和方法。發(fā)明背景皰疹病毒由大約二十面體包封的內(nèi)含一條雙鏈基因組的病毒粒子組成。當(dāng)前，六種人的皰疹病毒已被分離到，并已知它們從亞臨床感染到致死病害狀態(tài)的多種免疫受損狀態(tài)有關(guān)。有一種人的皰疹病毒，單純性皰疹病毒類型2，叫作HSV-2，常是通過性接觸被傳染的并引起生殖器皰疹。第二次生殖器皰疹復(fù)發(fā)率范圍為每年1到6次之間。據(jù)估計(jì)，在美國有1千萬到6千萬人發(fā)生生殖器HSV-2感染。當(dāng)今，還沒有可以用來預(yù)防HSV-2感染的疫苗。
關(guān)于HSV-2的基因組組成所知甚少。然而，HSV-2引出了一個重要的公共健康問題。多數(shù)個人繼續(xù)被病毒感染而且還沒有完全滿意的抗病毒藥劑或疫苗。需要有一種鑒定抗HSV-2劑的方法以及在這樣方法中使用的試劑。需要有一種鑒定化合物的方法，該種化合物能調(diào)節(jié)HSV-2蛋白的活性和影響病毒在一個感染的細(xì)胞中復(fù)制和產(chǎn)生多重感染的病毒粒子的能力。還需要有區(qū)別HSV-2感染與其他皰疹病毒感染的方法和檢別試劑盒。發(fā)明概要本發(fā)明涉及基本上純的HSV-2 UL-26基因產(chǎn)物和其片段，他們包括HSV-2蛋白酶前體蛋白，成熟的HSV-2蛋白酶及其活性片段，HSV衣殼前體蛋白和成熟的HSV-2衣殼蛋白。
本發(fā)明涉及基本上純的包括HSV-2衣殼前體蛋白和成熟的HSV-2衣殼蛋白的HSV-2 UL26.5基因產(chǎn)物及其片段。
本發(fā)明涉及分離的包含HSV-2 UL-26基因或它的部份的核酸分子，該基團(tuán)或它的部份的核酸分子包括編碼成熟的HSV-2蛋白酶和其活性片段的核酸分子以及編碼前體或成熟的HSV-2衣殼蛋白，調(diào)節(jié)區(qū)域，例如啟動子區(qū)域或其功能片段的核酸分子。
本發(fā)明涉及包含HSV-2 UL-26基因或其一部分的表達(dá)載體，其中包括編碼成熟HSV-2蛋白酶和它的活性片段的核苷酸序列，以及編碼前體或成熟的HSV-2衣殼蛋白或它的功能片段的核苷酸序列。
本發(fā)明涉及含有包括HSV-2 UL-26基因或他的一部分的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，其中包括編碼成熟的HSV-2蛋白酶和他的活性片段的核苷酸序列和編碼前體或成熟的HSV-2衣殼蛋白或他的功能片段的核苷酸序列。
本發(fā)明涉及包括HSV-2 UL 26.5基因或他的一部分的分離到的核酸分子，該UL 26.5基因或他的一部分包含編碼成熟的HSV-2衣殼蛋白、調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動子區(qū)或他的片段)的分離到的核酸，和編碼前體或成熟的HSV-2衣殼蛋白或他的功能片段的核苷酸序列。
本發(fā)明涉及包括HSV-2 UL 26.5基因或他的一部分的表達(dá)載體，該UL 26.5基因或他的一部分包含編碼成熟的HSV-2衣殼蛋白或他的片段的核苷酸序列和編碼前體或成熟的HSV-2衣殼蛋白或他的功能片段的核苷酸序列。
本發(fā)明涉及含有包括HSV-2 UL 26.5基因或他的一部分的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，該UL 26.5基因或它的一部分包括編碼成熟的HSV-2衣殼蛋白或他的片段的核苷酸序列和編碼前體或成熟的HSV-2衣殼蛋白或他的功能片段的核苷酸序列。
本發(fā)明涉及鑒定抑制HSV-2蛋白酶活性的化合物的方法，包括在一種被試化合物存在下，用一個HSV-2蛋白酶的底物與HSV-2蛋白酶或他的活性片段接觸以檢測底物被蛋白酶裂解的水平，并與不存在被試化合物下酶解的水平相比較。
本發(fā)明涉及鑒定抑制HSV-2病毒粒子裝配的化合物的方法，通過在一種被試化合物存在下與HSV-2衣殼蛋白的接觸，檢測衣殼-衣殼聯(lián)合的水平，并以此水平與在沒有被試化合物下發(fā)生的水平相比較。
本發(fā)明涉及用化學(xué)合成手段產(chǎn)生HSV-2蛋白酶底物，或重組生產(chǎn)斷定是全部UL 26基因產(chǎn)物或部分片段的HSV-2蛋白酶底物。
本發(fā)明涉及抗體，他選擇性地結(jié)合HSV-2蛋白酶處理過的底物但不是沒有處理過的底物，或選擇性地與不經(jīng)處理過的底物結(jié)合但不是經(jīng)過處理的底物。
本發(fā)明涉及區(qū)別HSV-1 DNA和HSV-2 DNA間的方法，包括擴(kuò)增HSV-1 DNA但不是HSV-2 DNA的引物用PCR擴(kuò)增DNA和/或用擴(kuò)增HSV-2 DNA但不是HSV-1 DNA的引物用PCR擴(kuò)增DNA。
本發(fā)明涉及擴(kuò)增HSV-1 DNA但不是HSV-2 DNA的PCR引物和擴(kuò)增HSV-2 DNA但不是HSV-1 DNA的PCR引物。
本發(fā)明涉及用以區(qū)別HSV-1 DNA與HSV-2 DNA的試劑盒，包括一個內(nèi)裝有擴(kuò)增HSV-1 DNA但不是HSV-2 DNA的PCR引物和-個陽性對照以及確定HSV-1 DNA是否通過引物擴(kuò)增的分子大小標(biāo)志的容器，和/或一個內(nèi)裝有擴(kuò)增HSV-2 DNA但不是HSV-1 DNA的PCR引物和一個陽性對照以及用以確定HSV-2 DNA是否已通過引物擴(kuò)增的分子大小標(biāo)志的容器。
本發(fā)明涉及區(qū)別HSV-1蛋白和HSV-2蛋白的方法包括采用選擇性地與HSV-1蛋白但不是HSV-2蛋白相結(jié)合的抗體的免疫測定法和/或利用選擇性地與HSV-2蛋白但不是HSV-1蛋白相結(jié)合的抗體的一個免疫測定法。
本發(fā)明涉及選擇性地與HSV-1蛋白但不是HSV-2蛋白相結(jié)合的抗體或選擇性地與HSV-2蛋白但不是HSV-1蛋白相結(jié)合的抗體。
本發(fā)明涉及用以區(qū)別HSV-1蛋白和HSV-2蛋白的試劑盒。所說的試劑盒包括一個有分隔空間以接受一系列嚴(yán)格規(guī)定的容器的運(yùn)載箱，它裝有一個包含選擇性地與HSV-1蛋白但不是HSV-2蛋白相結(jié)合的抗體和一套檢測抗體是否被結(jié)合到HSV-1蛋白上工具的第一容器，和/或一個包含選擇性地與HSV-2蛋白但不是HSV-1蛋白相結(jié)合的抗體和一套檢測抗體是否被結(jié)合到HSV-2蛋白上的工具的第二容器。
本發(fā)明涉及HSV-2蛋白酶啟動子和/或增強(qiáng)子元件和他們的應(yīng)用。
本發(fā)明涉及HSV-2衣殼蛋白啟動子和/或增強(qiáng)子元件和他們的應(yīng)用。附圖簡述

圖1說明HSV-2 UL 26基團(tuán)。符號<>表示HSV-2 UL 26基團(tuán)產(chǎn)物的限界線。公認(rèn)的末端密碼子為在字下劃線。
符號[[]]表示HSV-2 UL 26基團(tuán)產(chǎn)物的限界線。
符號[]表示二個主要蛋白水解位點(diǎn)的限界線。
裂開鍵用*表示。
符號‖表示HSV-2 UL 26.5基因的啟動子區(qū)域，一個公認(rèn)的“TATA盒”用在字下劃線表示。
圖2說明在HSV-2 UL 26.5啟動子調(diào)節(jié)下，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。發(fā)明詳述這里所用的術(shù)語UL 26基團(tuán)指的是包含一個編碼HSV-2蛋白酶和一種HSV-2衣殼蛋白的核苷酸序列的一個DNA分子。UL 26基因被公開在SEQ ID NO1(序列鑒定1號)中。UL 26基因的編碼區(qū)域由SEQ ID NO1的534-2447間核苷酸組成。UL 26基因表達(dá)時編碼一個638個氨基酸的活性蛋白酶前體(在SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中公開)。
如在這里所用，術(shù)語“有活性的蛋白酶前體”指的是不經(jīng)加工的UL 26翻譯的產(chǎn)物。有活性的蛋白酶前體是一個有活性的HSV-2蛋白酶。當(dāng)產(chǎn)生時，有活性的蛋白酶前體位在247和248氨基酸之間的一個內(nèi)部的蛋白酶裂開位點(diǎn)上自剪切。氨基酸247個氨基酸部分仍保留蛋白酶活性。
在這里所用的，術(shù)語“成熟的蛋白酶”指的是有活性的蛋白酶前體的通過自剪切而產(chǎn)生的氨基酸247個氨基酸的蛋白。成熟蛋白酶的氨基酸序列以SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的1-247氨基酸公開。
如在這里所用的，術(shù)語“HSV-2蛋白酶”意思就是，交替地表示為有活性的蛋白酶前體，成熟的蛋白酶或其活性的片段。
如在這里所用的，術(shù)語“UL 26.5”基因指的是一個包含編碼HSV-2衣殼蛋白核苷酸序列的DNA分子。UL 26.5基因是UL 26基因內(nèi)被分開轉(zhuǎn)錄的一個內(nèi)部序列。UL 26.5基因在SEQ ID NO1中公開，包括從1461-2447個核苷酸的編碼區(qū)域。當(dāng)表達(dá)時，UL 26.5基因編碼一個329個氨基酸的衣殼前體(在SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中以310-638間氨基酸公開)。
如在這里所用的，術(shù)語“衣殼前體”指的是沒有加工過的UL 26.5翻譯產(chǎn)物。在希望有關(guān)本發(fā)明基因產(chǎn)物的功能不被任何特殊機(jī)制理論約束的同時，但根據(jù)有關(guān)HSV-1的部分文獻(xiàn)，可相信的是衣殼前體產(chǎn)生之后由HSV-2蛋白酶于SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的613與614氨基酸殘基之間的一個內(nèi)部蛋白酶裂解位點(diǎn)上被切開。304氨基酸部分是用于病毒裝配和病毒DNA包被的衣殼蛋白。UL 26.5的C末端加工促使病毒DNA包被成為成熟衣殼。這個加工事件的抑制會導(dǎo)致不能將DNA包裝成成熟衣殼。
如在這里所用，術(shù)語“成熟的衣殼蛋白”指的是由HSV-2蛋白酶通過對衣殼前體的裂解所產(chǎn)生的304氨基酸蛋白。成熟衣殼蛋白的氨基酸序列作為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的310-613氨基酸被公開。
如在這里所用，術(shù)語“HSV-2衣殼蛋白”意思就是衣殼前體和成熟衣殼蛋白(可相互變換)。
如在這里所用，術(shù)語“功能片段”，當(dāng)用于修飾特殊的基因或基因產(chǎn)物時，意指一個比基因或基因產(chǎn)物全長部分短的而其實(shí)質(zhì)上保留有與全長基因相關(guān)連的有關(guān)全長基因產(chǎn)物的所有生物功能。要決定一個特殊基因或基因產(chǎn)物的一個片段是否是一個功能片段，只不過用熟知的核酸分解和蛋白分解的技術(shù)產(chǎn)生一個片段和測定如此產(chǎn)生的片段的生物學(xué)功能。
本發(fā)明涉及基本上純的HSV-2蛋白酶，涉及其組成生產(chǎn)方法及應(yīng)用，涉及編碼HSV-2蛋白酶的核酸分子以及生產(chǎn)和應(yīng)用此編碼HSV-2蛋白酶核酸分子的方法。本發(fā)明涉及基本上純的HSV-2衣殼蛋白，涉及其成分和生產(chǎn)和應(yīng)用HSV-2衣殼蛋白的方法，涉及編碼HSV-2衣殼蛋白的核酸分子，涉及產(chǎn)生和應(yīng)用編碼HSV-2衣殼蛋白的核酸分子的方法。本發(fā)明涉及用作HSV-2蛋白酶裂解的底物，涉及抑制HSV-2蛋白酶活性的化合物的鑒定方法。涉及抑制HSV-2衣殼裝配的化合物的鑒定方法，涉及區(qū)別含有HSV-1 DNA的樣本和含有HSV-2 DNA樣本的方法，涉及區(qū)別含有HSV-1蛋白樣本和含有HSV-2蛋白樣本的方法，以及涉及用以完成這樣方法的試劑，包括寡核苷酸和抗體。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案提供了鑒定抑制或在其他方面調(diào)節(jié)HSV-2蛋白酶活性化合物的方法。因此，本發(fā)明提供了鑒定用作抗HSV-2劑的化合物的方法，因?yàn)镠SV-2蛋白酶的活性是病毒生活史中必不可少的。根據(jù)本發(fā)明，在存在有一個要測定的化合物時，HSV-2蛋白酶與一個HSV-2蛋白酶底物(底物)相接觸以確定受測定化合物對蛋白分解活性有或沒有影響。受試化合物對HSV-2蛋白酶的影響也可用存在有受試化合物時的蛋白分解活性與不存在有受試化合物時將被觀察到的蛋白分解活性相比較而決定。
蛋白分解活性指的是HSV-2蛋白酶酶解加工底物成產(chǎn)物的能力，即分解一個單一的底物肽分子成兩個或多個肽分子(蛋白分解產(chǎn)物)。在病毒生活史中，通過這樣的蛋白裂解，蛋白酶前體被加工成成熟的蛋白酶，衣殼前體被加工成成熟的衣殼。這種變換對病毒粒子裝配和病毒DNA包裝是必須的。蛋白分解活性的水平可被在本領(lǐng)域中那些具有常規(guī)技術(shù)人員所熟知的多種方法進(jìn)行確定?；旧咸峁┝艘环N把沒有加工的底物與蛋白分解產(chǎn)物區(qū)別開的方法。因此，底物加入以后，HSV-2蛋白酶與受試化合物相接觸，通過檢測保留的沒有加工過的底物量，沒有加工過底物的消耗量，或蛋白分解產(chǎn)物的生成量就能觀察到蛋白分解活性的水平。
本發(fā)明提供了基本上純的HSV-2蛋白酶，它在鑒定調(diào)節(jié)HSV-2蛋白酶活性的化合物的分析中是有用的。本發(fā)明也提供了產(chǎn)生基本上純的HSV-2蛋白酶的方法。HSV-2蛋白酶的氨基酸序列在SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中公開。如上所述，638氨基酸的活性蛋白酶前體也在SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中公開。有活性的蛋白酶前體是一個有活性的HSV-2蛋白酶，它是通過在氨基酸殘基247和248之間的一個蛋白酶內(nèi)部裂解位點(diǎn)的自動裂解而進(jìn)行加工以產(chǎn)生一個247個氨基酸的蛋白稱為成熟的蛋白酶。通過常規(guī)的肽的合成方法或者通過用在SEQ ID NO1中提供的信息，應(yīng)用重組DNA技術(shù)可以生產(chǎn)純的有活性的蛋白酶前體，成熟蛋白酶和它的活性片段。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的操作和容易得到的起始材料，本領(lǐng)域中具有一般技術(shù)者就能生產(chǎn)HSV-2蛋白酶。另一方面，用標(biāo)準(zhǔn)的操作和容易得到的起始材料，本領(lǐng)域中具有一般技術(shù)者就能確定一個片段和/或有蛋白酶活性的前體的衍生物或成熟的蛋白酶是否為一個有活性的片段。
確定一個蛋白或肽能不能裂解一個特殊底物的測定法在此公開。要確定一個HSV-2蛋白酶片段是否有蛋白分解活性，則本領(lǐng)域中具有一般技術(shù)者就能如在此所敘述的沒有試驗(yàn)化合物條件下，用蛋白酶的片段或衍生物代替與SEQ ID NO2相同的蛋白酶完成蛋白酶活性測定。如果片段或衍生物裂解底物，則他是有活性的，即這片段或衍生物擁有蛋白分解活性。因此，本領(lǐng)域中具有一般技術(shù)者就能常規(guī)地確定蛋白酶的一個片段或衍生物是一個有活性的片段或一個有活性的衍生物。
本發(fā)明涉及編碼HSV-2蛋白酶的核苷酸序列和涉及編碼HSV-2衣殼蛋白的核苷酸序列。UL 26基因包括編碼HSV-2蛋白酶和HSV-2衣殼蛋白的一個前體形式的核苷酸序列在SEQ ID NO1中被公開。UL 26基因包括一個編碼HSV-2衣殼蛋白的核苷酸序列也在SEQ ID NO1中被公開。在本領(lǐng)域中具有一般技術(shù)者，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和容易得到的起始材料，利用在這里公開包括SEQ ID NO1的信息可以得到或合成一個編碼HSV-2蛋白酶的核酸分子，或一個編碼HSV-2衣殼蛋白的核酸分子。而且，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)、容易得到的起始材料和在這里公開的包括SEQ ID NO1的信息，在本領(lǐng)域中一個具有一般技術(shù)者就能生產(chǎn)基本上純的HSV-2蛋白酶，包括有活性的前體蛋白酶，成熟蛋白酶或有活性的HSV-2蛋白酶片段。同樣地，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，容易得到的起始材料和在這里公開的包括SEQ ID NO1的信息，在本領(lǐng)域中一個具有一般技術(shù)者就能生產(chǎn)基本上純的HSV-2衣殼蛋白包括衣殼前體，成熟的衣殼或能裝配成功能片段的HSV-2衣殼片段。本領(lǐng)域中一個具有一般技術(shù)乾，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)和容易得到的起始材料，能利用在這里公開的包括在SEQ ID NO1的信息利用表達(dá)系統(tǒng)中給定宿主細(xì)胞以產(chǎn)生理想且白質(zhì)產(chǎn)品的密碼子獲得或合成編碼HSV-2蛋白酶或HSV-2衣殼蛋白的核酸分子。
在本領(lǐng)域中那些具有一般技術(shù)者利用不同的技術(shù)和適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)也能產(chǎn)生編碼HSV-2蛋白酶或HSV-2衣殼蛋白的核酸分子。例如，應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)方法學(xué)。可設(shè)計(jì)引物用以產(chǎn)生編碼HSV-2蛋白酶或HSV-2衣殼蛋白的多拷貝核苷酸序列。通過病毒DNA的擴(kuò)增也可能常規(guī)地得到編碼有活性的蛋白酶前體的完整的核苷酸序列。同樣，通過病毒DNA的擴(kuò)增也可以常規(guī)地獲得編碼成熟蛋白酶的核苷酸序列。同樣地，通過病毒DNA的擴(kuò)增，也可以常規(guī)地得到編碼一個有活性的HSV-2蛋白酶片段的核苷酸序列。在一個相同的情況中，通過病毒DNA的擴(kuò)增也可以常規(guī)地得到編碼衣殼前體，成熟衣殼或它的功能片段的完整核苷酸序列。換一種方法，利用限制性酶，編碼HSV-2蛋白酶的DNA，包括有活性的蛋白酶前體，成熟蛋白酶，或其有活性片段或HSV-2衣殼蛋白包括衣殼前體，成熟衣殼或其功能片段也可從把病毒DNA克隆到載體中得到，用從公開的核苷酸序列設(shè)計(jì)的探針通過雜交后鑒定。此外，編碼HSV-2蛋白酶或HSV-2衣殼蛋白的核酸分子也可以用在本領(lǐng)域中那些具有一般技術(shù)者所熟知的技術(shù)進(jìn)行合成。為HSV-2蛋白酶或HSV-2衣殼蛋白編碼的密碼子可用于優(yōu)化選作HSV-2蛋白酶或HSV-2衣殼蛋白主組生產(chǎn)的宿主細(xì)胞的蛋白產(chǎn)品。HSV-2基因組有高富含量的G＋C核苷酸。這一點(diǎn)對編碼HSV-2蛋白酶的UL26基因來說是特別正確的。這樣高含量G＋C的特征在E.coli(大腸桿菌)中過度表達(dá)基因中由于密碼子使用和移碼突變機(jī)會的增加提出了一個問題。在努力改進(jìn)UL 26在E.coli中表達(dá)中，變更UL 26基因和其片段以提供在E.coli中表達(dá)仍保留蛋白酶的可靠的氨基酸序列的優(yōu)選密碼子。有關(guān)優(yōu)選密碼子使用的參考文獻(xiàn)是Wada等，(1992)“從基因銀行遺傳序列資料中制作成的密碼子使用表”，Nncleic Acid Research，Vol.20 Supplement，2111-2118頁，在這里以參考文獻(xiàn)編入。密碼子的最適使用已為大家所熟知，并根據(jù)本發(fā)明能應(yīng)用于設(shè)計(jì)核酸分子，使其在一個選擇過的宿主中能被表達(dá)到一個效率增高的水平。
在本領(lǐng)域中一個具有一般技術(shù)者，應(yīng)用大家熟知的技術(shù)能把這樣的DNA分子插入到像商業(yè)上可以得到的熟知作表達(dá)系統(tǒng)用的載體那樣的載體中。例如，商業(yè)上可以得到的象psE 420(Invitrogen，SanDiego，CA)或pET-16(b)(Novagen，Modison N.I.)可以用為在E.coli中生產(chǎn)HSV-2蛋白酶。商業(yè)上可以得到的質(zhì)粒pYES2(Invitrogen，San Diego，CA)例如，在酵母菌的S.cerevisiae(啤酒酵母菌)也可用作生產(chǎn)。商業(yè)上可以得到的NAXBACTM完全的桿菌狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen，San Diego，CA)例如在昆蟲細(xì)胞中也可用以生產(chǎn)。商業(yè)上可以得到的質(zhì)粒pcDNAI(Invitrogen，San Diego，CA)，例如，在哺乳類細(xì)胞中如中國倉鼠卵巢細(xì)胞中也可用作生產(chǎn)。在本領(lǐng)域中一個有一般技術(shù)的人員，應(yīng)用常規(guī)的技術(shù)和容易得到的起始材料，能夠利用這些商業(yè)上的表達(dá)載體和系統(tǒng)或其他的以生產(chǎn)HSV-2蛋白酶或HSV-2衣殼蛋白。(請見，例如，Sambrook等，分子克隆，一個實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版，冷泉港出版社(1989)，此書以參考文獻(xiàn)在這里編入)因此。在原核的和真核的二個系統(tǒng)中能夠制備所期望的蛋白，產(chǎn)生一個蛋白加工形式的系列。
適合期望宿主的表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建細(xì)節(jié)，本領(lǐng)域中的那些人是知道的。簡短的說，為重組體蛋白的生產(chǎn)，編碼多肽的DNA要合適地連接到所選擇好的表達(dá)載體上。DNA可操作連接到在選擇宿主中DNA表達(dá)所必需的所有調(diào)節(jié)元件。本領(lǐng)域中一個有一般技術(shù)人員，用熟知的技術(shù)能夠制備出重組產(chǎn)生多肽的表達(dá)載體。
包含編碼HSV-2蛋白酶或HSV-2衣殼蛋白的DNA的表達(dá)載體被用于去轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染合適宿主，然后把該宿主培養(yǎng)和保持在外源DNA表達(dá)發(fā)生的條件下。從培養(yǎng)物，或通過裂解細(xì)胞，或從適當(dāng)?shù)募盀楸绢I(lǐng)域中那些人所知道的培養(yǎng)基中回收本發(fā)明產(chǎn)生的蛋白。本領(lǐng)域中一個有一般技術(shù)的人員，應(yīng)用熟知的技術(shù)，能分離應(yīng)用這樣表達(dá)系統(tǒng)所產(chǎn)生的蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例，蛋白也可以被生產(chǎn)和純化如下。包括編碼HSV-2蛋白酶或HSV-2衣殼蛋白的核苷酸序列的一個DNA分子可制成包括在蛋白的一個末端部分編碼多個組氨酸殘基的核苷酸序列。這個DNA分子被組合到一個表達(dá)載體，并把該載體引入適合的宿主細(xì)胞中。DNA被表達(dá)，所產(chǎn)生的蛋白包含末端的組氨酸殘基，他在這里被稱作組氨酸尾標(biāo)或His-tag。收集這種細(xì)胞放入pH8.5的磷酸緩沖液生理鹽水中并保持在冰上。然后用超聲波把細(xì)胞裂開。經(jīng)過超聲波振裂的細(xì)胞物質(zhì)在30,000xg離心。然后把上清液通過一個2微米濾膜過濾。把過濾過的上清液用一種金屬螯合樹脂(例如，氨基三乙酸鎳樹脂是一個對這樣目的有用的多種樹脂之一)在室溫共孵2小時，經(jīng)過這2小時后，通過離心把樹脂從沒有結(jié)合的物質(zhì)中分離開來。然后把樹脂裝柱并用50mM咪唑液清洗以除去沒有特異結(jié)合的蛋白。然后用150mM咪唑緩沖液把末端標(biāo)記組氨酸蛋白酶從Ni柱上洗脫下來。把來自柱的洗脫液，用Pharmacia Superdex 75大小的柱在磷酸鹽緩沖生理鹽水中通過柱層析進(jìn)一步純化。
DNA分子可設(shè)計(jì)為在尾標(biāo)組氨酸與可靠的HSV-2蛋白酶間包含一個特異裂解位點(diǎn)，使能從表達(dá)的蛋白上除去尾標(biāo)記組氨酸。尾標(biāo)記的組氨酸的去除也可被完成如下當(dāng)尾標(biāo)記組氨酸位在HSV-2蛋白酶氨基末端時，可將(天冬氨酸)4賴氨酸序列置于尾標(biāo)記組氨酸后面及HSV-2序列之前。腸激酶在(天冬氨酸)4賴氨酸序列之后特異地切裂因而產(chǎn)生可信HSV-2蛋白酶。
除了用重組體技術(shù)生產(chǎn)這些蛋白以外，也可以應(yīng)用自動的肽合成儀生產(chǎn)HSV-2蛋白酶或HSV-2衣殼蛋白。本領(lǐng)域中具有一般技術(shù)的那些人，對這樣的技術(shù)是熟知的。
本發(fā)明提供了基本上純的用于HSV-2蛋白酶裂解活性的底物，包括合成的底物。一個HSV-2蛋白酶底物是一個肽，被HSV-2蛋白酶引起的蛋白水解作用裂解成至少二個分開的肽。在一些實(shí)施例中，裂解的和不裂解的底物間大小的差別能被用于檢測蛋白酶是活性的或沒有活性的。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的底物是被標(biāo)記的因此他們也能被測知。在一些實(shí)施例中，底物是被固定在固相上。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，或是底物或是一個蛋白分解產(chǎn)物有生物學(xué)上的或化學(xué)的活性但在其他部分活性則不存在，這一點(diǎn)能用于把這一個與其他區(qū)別開來。生物活性的范例包括酶活性和與特異抗體的結(jié)合能力。
在已被鑒定有天然裂解位點(diǎn)的UL 26中含有兩個氨基酸序列。第一個是LQAS(SEQ ID NO3)在那里HSV-2蛋白酶在A和S之間把肽裂解。第二個是VNAS(SEQ ID NO4)，在那里HSV-2蛋白酶在A和S之間把肽裂開。天然的或合成的底物能被產(chǎn)生含有這二個裂解位點(diǎn)的任一個。因此，按照本發(fā)明的底物有通式R1-SEQ ID NO3-R2或通式R1-SEQ ID NO4-R2在式中R1和R2分別地表示為氫或一個或多個氨基酸。在有些實(shí)施例中，底物是UL 26基因的產(chǎn)物，它含有兩個蛋白酶裂解位點(diǎn)；一個包含SEQ ID NO3和另一個包含SEQ ID NO4。在有些實(shí)施例中，底物是UL 26.5基因產(chǎn)物，它含有一個包含SEQ ID NO4的蛋白酶裂解位點(diǎn)。在有些實(shí)施例中，R1優(yōu)選1-20個氨基酸，更好是1-10個最好為3、4、5、6、7、8或9個氨基酸。在有些實(shí)施例中，R2可以是1-20個氨基酸，更好是1-10個，最好是3、4、5、6、7、8或9個氨基酸。本領(lǐng)域中一個具有一般技術(shù)人員按照上述的通式能容易設(shè)計(jì)底物。下列各肽已被設(shè)計(jì)作為底物。
1.包含內(nèi)部裂解位點(diǎn)SEQ ID NO3(LQA*S)的各肽AHTYLQA*SEKFK SEQ ID NO5AGIAGHTYLQA*SEKFK SEQ ID NO6GIAGHTYLQA*SEKFK SEQ ID NO7IAGHTYLQA*SEKFK SEQ ID NO8GHTYLQA*SEKFK SEQ ID NO9HTYLQA*SEKFKM SEQ ID NO10HTYLQA*SEKFKMWSEQ ID NO11HTYLQA*SEKFKMWG SEQ ID NO12HTYLQA*SEKFKMWGA SEQ ID NO13HTYLQA*SEKFKMWGAE SEQ ID NO142.包含末端裂解位點(diǎn)SEQ ID NO4(VNA*S)的各肽ALVNA*SSAAHVDVD SEQ ID NO15星號(*)表示裂開鍵，HSV-2蛋白酶就在這里使鏈裂開。
底物也可從UL 26的蛋白水解的裂解中或UL 26.5蛋白產(chǎn)物中得到。他們可通過UL 26基因或UL 26.5基因的表達(dá)重組產(chǎn)生或含有裂解位點(diǎn)的它的片段；或用本領(lǐng)域中熟知的標(biāo)準(zhǔn)肽合成步驟，例如Merrifield合成法，依靠有機(jī)化學(xué)合成手段合成底物。
本領(lǐng)域中一個具有一般技術(shù)人員，應(yīng)用HSV-2蛋白酶和底物就能容易地設(shè)計(jì)測定方法去鑒定調(diào)節(jié)HSV-2蛋白酶活性的化合物。如在這里所用的術(shù)語“測定試驗(yàn)”指的是對包括HSV-2蛋白酶，底物和受試化合物的一個混合物的測定；術(shù)語“對照試驗(yàn)”指的是對包括HSV-2蛋白酶和底物但沒有受試化合物的一個混合液的測定。要決定一個受試化合物是否能調(diào)節(jié)HSV-2蛋白酶活性，在一個測定試驗(yàn)中HSV-2蛋白酶活性的水平可以與在一個對照試驗(yàn)中HSV-2蛋白酶活性的水平相比較。
在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，當(dāng)存在有一個受試化合物與HSV-2蛋白酶相接觸時，裂解的與不裂解的底物之間大小的差別是用于確定底物是否被裂解。在有些實(shí)施例中，采用HPLC(高壓液相層析)完成。含有蛋白酶的樣本與底物，例如HTYLQASEKFKNWGAE(SEQ ID NO14)，在磷酸鹽緩沖鹽水中在37C保溫4小時，保溫之后用三氟乙酸終止反應(yīng)。然后把反應(yīng)液經(jīng)過一個HPLC柱，用肽的裂解產(chǎn)物表明活性。
本發(fā)明的有些實(shí)施例中，當(dāng)一個受試化合物存在，并與HSV-2蛋白酶接觸時用免疫測定法檢測底物是否被裂解。在一些實(shí)施例中，提供的抗體特異地與未經(jīng)裂解的底物結(jié)合但不與蛋白酶裂解的產(chǎn)物結(jié)合。這樣的抗體在這里被稱為“底物-特異抗體”。在一些實(shí)施例中，提供的抗體特異地與HSV-2蛋白酶裂解產(chǎn)物相結(jié)合，但不與未經(jīng)裂解底物結(jié)合。這樣的抗體在這里被稱作為“產(chǎn)物-特異抗體”?；蚺c一個產(chǎn)物，或與一個底物反應(yīng)但不與二者(即底物-特異抗體和產(chǎn)物-特異抗體的群體)都反應(yīng)的抗體在這里被稱為“非交叉反應(yīng)抗體”。在有些實(shí)施例中，抗體被固定在一個固相上。在一些實(shí)施例中，抗體被標(biāo)記。
例如，一個含有HSV-2蛋白酶，底物和受試驗(yàn)化合物的混合液被保持在合適的條件下并經(jīng)一個充分的時間任其發(fā)生蛋白水解作用，除非受試化合物影響其作用。能把混合液加到一個內(nèi)部表面貼附有無交叉反應(yīng)抗體的容器中。如果無交叉反應(yīng)抗體是底物特異的抗體，則保留在混合液中的任何未經(jīng)裂解的底物將與抗體結(jié)合。如果底物標(biāo)記的，容器可以被淋洗，而存在的標(biāo)記總量可以被測知。因此HSV-2蛋白酶活性的水平就被確定。如果非交叉反應(yīng)抗體是產(chǎn)物-特異抗體，在混合液中任何HSV-2蛋白酶產(chǎn)物將與抗體結(jié)合。如果底物是被標(biāo)記在作為產(chǎn)物釋放出來的一部分上，容器可以被淋洗，存在的標(biāo)記量就可被測定。因此HSV-2蛋白酶活性水平就被確定。
ICP35抗體(目錄號B-118-100；Rivers Park，9108 GulfordRd.Columbia Maryland)也可以用于測定裂解的底物。這樣的抗體是產(chǎn)物特異的，它只與被HSV-2蛋白酶水解加工過的衣殼蛋白相結(jié)合。
換一種方法，代替應(yīng)用標(biāo)記的底物，把范例化的免疫測定可以被修改作夾心面包式測定，在方法中對被束縛住抗原復(fù)合物特異的抗體就能被測定。這樣的抗體在這里被稱作“復(fù)合-特異抗體”。容器再次被淋洗，并以充分的時間讓復(fù)合-特異抗體與存在的任何復(fù)合物的結(jié)合。測定復(fù)合-特異抗體的水平就表示出HSV-2蛋白酶活性水平。
在一些免疫測定法實(shí)施例中，不標(biāo)記的底物在反應(yīng)混合液中應(yīng)用。在把反應(yīng)混合液加到包含一個非交叉反應(yīng)抗體的容器之后并保持充分的時間利于非交叉反應(yīng)抗體與底物或與產(chǎn)物相結(jié)合，又把標(biāo)記的底物或標(biāo)記的產(chǎn)物，分別地加入并將使他與還沒有被混合液中的底物或產(chǎn)物結(jié)合的非交叉反應(yīng)抗體相結(jié)合。測定標(biāo)記底物或標(biāo)記產(chǎn)物的總量就能表明蛋白水解裂解的水平。
在一些實(shí)施例中，底物是被標(biāo)記的，當(dāng)?shù)孜锔膿Q成蛋白水解產(chǎn)物時標(biāo)記被釋放出來。測知標(biāo)記的釋放，就能表示HSV-2蛋白酶活性，這可用一類熟知的手段完成。在一些實(shí)施例中，被標(biāo)記的底物在固相上固定。由于HSV-2蛋白酶對其裂解，連接在部分底物上的標(biāo)記被釋放出來，這部分底物為未連接標(biāo)記的產(chǎn)物。比較存在于反應(yīng)液中前和后的標(biāo)記水平就知道多少標(biāo)記被釋放，因而也知道HSV-2蛋白酶活性的水平。換一種方式，測定脫離固相的標(biāo)記的總量，也表示HSV-2蛋白酶活性的水平。
在另外一個實(shí)施例中，檢測HSV-2蛋白酶活性的方法包括熒光析出測定法，其中，底物在裂開鍵鄰近含有熒光標(biāo)記。在這樣的位置上，在不裂解底物中標(biāo)記不能被測定到。然而，當(dāng)?shù)孜锉籋SV-2蛋白酶在裂解位點(diǎn)上被裂解時，熒光基團(tuán)成為暴露的，熒光便變成可被測定的。因此，在一個受試化合物存在時把底物與HSV-2蛋白酶接觸之后，用度量可檢測的熒光法可以量度蛋白水解活性的水平。
在另一個實(shí)施例中，測定HSV-2蛋白酶活性的方法包括閃爍近鄰測定法，在此法中，放射標(biāo)記的底物被結(jié)合到固體小珠上，當(dāng)小珠緊密鄰近放射標(biāo)記時被激發(fā)，通過閃爍法就可檢測的。當(dāng)?shù)孜锉涣呀鈺r，放射標(biāo)記不再緊密鄰近小珠，而小珠不被激發(fā)所以用閃爍法也不能檢測了。因此當(dāng)存在一個受試化合物時把結(jié)合的底物與HSV-2蛋白酶接觸之后，能用閃爍法量度小珠的激發(fā)以測定蛋白水解活性的水平。
除了這些實(shí)施例之外，本領(lǐng)域中一個具有一般技術(shù)的人員能應(yīng)用熟知的技術(shù)采用測定HSV-2蛋白酶裂解或其缺失的各種方法，去設(shè)計(jì)鑒定調(diào)節(jié)HSV-2蛋白酶活性的化合物的其他方法。
本發(fā)明涉及鑒定調(diào)節(jié)HSV-2蛋白酶活性的化合物的試劑盒。這樣的試劑盒包含有分開的容器，容器中包括HSV-2蛋白酶，底物和任意選擇的抗體，或其他用以檢測HSV-2蛋白酶活性的試劑或用于區(qū)別不裂解的底物和產(chǎn)物的試劑。底物或抗體也可能是被固定在容器的內(nèi)部表面。底物或抗體也可能是被標(biāo)記。
本發(fā)明的一些實(shí)施例，也提供一個用多體化測定法以鑒定抑制或其他調(diào)節(jié)HSV-2衣殼蛋白裝配的化合物的方法。本發(fā)明提供鑒別作為抗HSV-2藥劑有用的化合物的方法，因?yàn)橐職ぱb配對病毒復(fù)制和感染是必需的。按照本發(fā)明，提供的嵌合基因包含一個編碼HSV-2衣殼蛋白的HSV-2 UL 26.5基因(或其一部分)連接到編碼酵母菌GAL4 DNA結(jié)合蛋白的序列上或編碼HSV-2衣殼蛋白的HSV-2 UL 26.5基因(或其一部分)連接到編碼酵母GAL4活化蛋白序列上。編碼HSV-2衣殼蛋白的嵌合基因部分最好編碼成熟衣殼，也可用編碼衣殼前體蛋白的基因。把嵌合基因插入到啤酒酵母菌(Saccharomyces Cerevisiae)質(zhì)粒上并將此質(zhì)粒引入含有一個整合的GAL4-應(yīng)答的IacZ指示基因的啤酒酵母菌中，當(dāng)在質(zhì)粒上嵌合基因被表達(dá)時，就產(chǎn)生融合蛋白。包含HSV-2衣殼蛋白的融合蛋白各部分在選定的條件下，將彼此結(jié)合和使GAL4的DNA-結(jié)合區(qū)和活化區(qū)匯合。當(dāng)這二個很鄰近的GAL4區(qū)與GAL4-反應(yīng)的lacZ指示基因相互作用時，指示基因被表達(dá)在合適的條件下一種可檢測的蘭色就被觀察到。如果融合蛋白被阻止結(jié)合，這二個GAL4區(qū)彼此不是鄰近存在，故而指示基因不被活化。因此，看不到蘭色。
因此，這個酵母系統(tǒng)提供了一個測定HSV-2衣殼蛋白在病毒粒子裝配中發(fā)生的相互作用的快速和特異的方法。在存在有阻斷或抑制HSV-2衣殼蛋白相互作用的化合物時，由嵌合基因表達(dá)產(chǎn)生的融合蛋白中GAL4區(qū)將不結(jié)合因此將不活化酵母菌系統(tǒng)中的lacZ基因。因此，通過轉(zhuǎn)化過的酵母菌lacZ基因不出現(xiàn)活化可以鑒定抑制HSV-2衣殼裝配的化合物，因此化合物具有抗病毒的特性。
本發(fā)明的有些實(shí)施例中，提供了區(qū)別含有HSV-1 DNA的樣品和含有HSV-2 DNA的樣品的方法，或區(qū)別含有HSV-1蛋白樣品和含有HSV-2蛋白樣品的方法。因此，本發(fā)明提供了診斷某個體是否感染HSV-1和/或HSV-2的一個診斷方法。公開的是鑒定一個人是否感染HSV-1和/或HSV-2的方法，其中HSV-1感染能與HSV-2感染區(qū)別開來。
按照本發(fā)明的一些實(shí)施例，用PCR技術(shù)區(qū)別含有HSV-1 DNA樣本和含有HSV-2 DNA樣本。這樣的方法提供了一個區(qū)別HSV-1和HSV-2感染的手段，并考慮作為對一個人感染HSV類型的診斷方法。設(shè)計(jì)特異的引物以利于HSV-1 DNA但不是HSV-2 DNA的擴(kuò)增和/或HSV-2DNA但不是HSV-1 DNA的擴(kuò)增。因此。用這樣的引物通過擴(kuò)增技術(shù)以及取自個體的生物樣品例如細(xì)胞，血清或組織樣本，特別是在發(fā)皰區(qū)或其他可被見到有病毒散發(fā)表現(xiàn)區(qū)所取的樣本，人們就能確定樣品中的DNA是否來自HSV-1或HSV-2，取樣個體是否感染HSV-1或HSV-2就被確定。
UL26基因的核苷酸序列包括編碼HSV-2蛋白酶和HSV-2衣殼蛋白的核苷酸序列在SEQ ID NO1被公開。編碼HSV-1蛋白酶和HSV-1衣殼蛋白的核苷酸序列在SEQ ID NO16中被公開。設(shè)計(jì)一套PCR引物放大HSV-2序列但不放大HSV-1序列。因此，放大DNA的檢測表明HSV-2是存在的。同樣，設(shè)計(jì)一套PCR引物只放大HSV-1序列不放大HSV-2序列。因此，放大DNA的檢測就表明HSV-1是存在的。最好的是提供的兩套引物用在公開的放大方案中并以來自同一樣本的材料以便供給一個額外的對照。另外選擇的對照包括含有的DNA序列能被放大的陽性對照和/或不能被引物放大的陰性對照。在放大方案完成之后，放大的DNA用在電泳凝膠上跑電泳的方法可以被檢測。一個放大產(chǎn)物的期望長度的DNA分子可被提供作為大小標(biāo)志。
本發(fā)明也涉及區(qū)別一個樣品含有的DNA是否來自HSV-1或HSV-2的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒在診斷一個個人是否感染HSV-1和/或HSV-2上是有用的。試劑盒含有包含有放大HSV-1 DNA但不是HSV-2DNA的引物的各容器或?qū)⒎糯驢SV-2 DNA但不是HSV-1 DNA的各容器。試劑盒可以任選地含有二套引物放在分開的容器中，用同一樣本的不同部分進(jìn)行分別的放大程序。試劑盒也可任選地含有陽性和/或陰性對照于分開的容器中。試劑盒可任選地含有能作為大小標(biāo)志的DNA分子于一個分開的容器中。DNA分子用引物可被放大成一個期望長度的DNA分子。
按照發(fā)明一些實(shí)施例，所用的免疫測定法去區(qū)別含有HSV-1蛋白樣品與含有HSV-2蛋白的樣品。免疫測定法被用于區(qū)別HSV-1和HSV-2的感染從而也可診斷一個個人持有感染HSV的類型。這樣的免疫測定法是根據(jù)HSV-1和HSV-2的UL 26基因產(chǎn)物的不同或者根據(jù)HSV-1和HSV-2的UL 26.5基因產(chǎn)物的差別。免疫測定法也可根據(jù)HSV-1和HSV-2在蛋白酶和/或衣殼蛋白間的不同。提供的特異抗體它有選擇地與HSV-1抗原上表位相結(jié)合但不與HSV-2抗原上存在的結(jié)合，或它選擇地與在HSV-2抗原上的表位結(jié)合但不與HSV-1抗原上存在的結(jié)合。例如，提供的特異抗體它選擇地與HSV-2蛋白酶但不是HSV-2蛋白酶相結(jié)合，或它選擇地與HSV-2蛋白酶但不與HSV-1蛋白酶相結(jié)合。同樣地，提供的特異抗體它特異地與HSV-1衣殼但不是HSV-2衣殼相結(jié)合，或它選擇地與HSV-2衣殼但不是HSV-1衣殼相結(jié)合。
因此，用特異的抗體，通過抗體結(jié)合分析法的實(shí)行以及取自個人的生物樣品例如細(xì)胞，血清或組織樣品，特別是在發(fā)皰區(qū)或其他可被觀察到的有病毒散發(fā)表現(xiàn)區(qū)所取的樣品，人們就能確定HSV-1特異抗體或HSV-2特異抗體是否與樣品中蛋白相結(jié)合，因而取樣個體是否感染HSV-1和/或HSV-2就被確定。HSV-2活性蛋白酶前體的氨基酸序列在SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中跨越1-638氨基酸。HSV-2成熟蛋白酶的氨基酸序列跨越SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的1-247個氨基酸。HSV-2衣殼前體的氨基酸序列在SEQ ID NO1和SEQ IDNO2中跨越310-638氨基酸。HSV-2成熟衣殼的氨基酸序列跨越SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的310-613氨基酸。HSV-1蛋白酶和衣殼的氨基酸序列公開在SEQ ID NO17中。HSV-1活性蛋白酶前體的氨基酸序列在SEQ ID NO17中跨越1-635個氨基酸。HSV-1成熟蛋白酶的氨基酸序列跨越SEQ ID NO17的1-247氨基酸。HSV-1衣殼前體的氨基酸序列在SEQ ID NO17中跨越307-635氨基酸。HSV-1成熟衣殼的氨基酸序列跨越SEQ ID NO17的307-610氨基酸。
本領(lǐng)域中有一般技術(shù)的那些人用常規(guī)的方法和能廣泛地可得到的起始材料可以生產(chǎn)特異地與HSV-2蛋白酶結(jié)合但不與HSV-1蛋白酶結(jié)合的抗體。同樣，本領(lǐng)域中有一般技術(shù)的那些人，用常規(guī)的方法和可廣泛地得到的起始材料可以生產(chǎn)對HSV-2衣殼但不是HSV-1衣殼特異地結(jié)合的抗體。這些HSV-2特異抗體的任一個都可在一個區(qū)別HSV-1與HSV-2的免疫測定法中檢測HSV-2。同樣，在本領(lǐng)域中那些具有一般技術(shù)者用常規(guī)的方法和可廣泛地得到的起始材料，可以生產(chǎn)對HSV-1蛋白酶但不是HSV-2蛋白酶特異地結(jié)合的抗體。同樣地，在本領(lǐng)域中那些有一般技術(shù)者用常規(guī)的方法和可廣泛地得到起始材料，可以生產(chǎn)不是對HSV-2衣殼而是對HSV-1衣殼特異地結(jié)合的抗體。這些HSV-1特異的抗體被用于在一個區(qū)別HSV-1和HSV-2的免疫測定法中檢測HSV-1。最好的是，用從同一樣品材料進(jìn)行這二個免疫測定法以便提供一個附加的對照。其他選擇的對照包括陽性對照，它包含有時與在免疫測定中所用的抗體相結(jié)合的肽，和/或陰性對照，它包含有不與在免疫測定中所用的抗體結(jié)合的肽?？贵w可被標(biāo)記，也可應(yīng)用一個特異地與HSV特異抗體結(jié)合的抗體。本領(lǐng)域中一個有一般技術(shù)的人應(yīng)用這里提供的信息能容易地生產(chǎn)包含所有需要的試劑的免疫測定試劑盒。
HSV-1蛋白酶抗體由Serotech作為抗體45KD生產(chǎn)并在商業(yè)上可從生物產(chǎn)品科學(xué)公司(Bioproducts for Science Inc.)得到，其目錄號為MCA 406(P.O.Box 29176，Indianapolis，IN)，它能在免疫測定中應(yīng)用以從HSV-1中區(qū)別HSV-2。這種Serotech抗體對HSV-1前體或成熟衣殼蛋白但不是HSV-2前體或成熟衣殼蛋白相結(jié)合。因此，用Serotech抗體的一個免疫測定法可以完成確定一個樣品中是否含有HSV-1或HSV-2，因而確定從其本身取得樣品那個人是否感染HSV-1或HSV-2。
本發(fā)明也涉及診斷某個體是否感染HSV-1或HSV-2的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒可以包括含有與HSV-1蛋白酶結(jié)合但不與HSV-2結(jié)合的抗體之一個容器和/或含有與HSV-2蛋白酶結(jié)合但不與HSV-1蛋白酶結(jié)合的抗體的一個容器。最好的是試劑盒包含抗體二種類型存放于分開的容器中。用于試劑盒中的抗體可被標(biāo)記。試劑盒含有完成一種用抗體的免疫測定的其他所有試劑和材料。試劑盒也可任選地在分開的容器中含有陽性對照和/或陰性對照。試劑盒也可任選地含有檢測抗體的手段包括，例如，一個第二抗體，他特異地與抗-HSV蛋白酶抗體相結(jié)合。本發(fā)明的試劑盒也可包括含有與HSV-1衣殼結(jié)合但不與HSV-2衣殼結(jié)合的抗體的一個容器和/或一個含有與HSV-2衣殼結(jié)合但不與HSV-1衣殼結(jié)合的抗體的一個容器。最好的是試劑盒在分開的容器中包含抗體的二種類型。用于試劑盒的抗體可被標(biāo)記。試劑盒含有完成一種用抗體的免疫測定用的其他所有試劑和材料。試劑盒也可任選地在分開的容器中含有陽性和/或陰性對照。試劑盒也可任選地包含檢測抗體的手段包括，例如，一個第二抗體，他特異地與抗-HSV-1衣殼抗體相結(jié)合。試劑盒也可包括Serotech抗體。
本發(fā)明的另一方面涉及HSV-2蛋白酶啟動子和/或增強(qiáng)子和他們的用途。HSV-2蛋白酶啟動子可以被合成或被分離連接到編碼除HSV-2蛋白酶以外蛋白的編碼序列上。因此，本發(fā)明涉及重組體DNA分子，它至少包括SEQ ID NO1 1-534核苷酸間核苷酸序列的一部分，并操作連接到一個編碼除HSV-2蛋白酶外一個蛋白的核苷酸序列上。本發(fā)明涉及包含DNA分子的細(xì)胞，該DNA分子至少包含有SEQ ID NO1的在1和534間核苷酸序列的一部分，可操作連接到編碼除HSV-2蛋白酶以外的一個蛋白的核苷酸序列上。
發(fā)明的另一方面適用于入噬體克隆，該克隆存有HSV-2 UL 26基因(SEQ ID NO1)和基因的上游和下游序列。因此，連接的序列能被用為UL 26啟動子調(diào)節(jié)區(qū)和/或啟動子增強(qiáng)區(qū)的篩選。
本發(fā)明另一方面涉及HSV-2衣殼蛋白啟動子和它的用途。HSV-2衣殼蛋白啟動子位在SEQ ID NO1的1461核苷酸上游。它可以被合成或被分離并連接到除HSV-2衣殼蛋白外其它編碼蛋白的序列上。因此，本發(fā)明涉及重組體DNA分子，它至少包含SEQ ID NO1的1461核苷酸上游核苷酸序列的一部分，并可操作連接到除HSV-2衣殼蛋白外的編碼蛋白的一個核苷酸序列上。本發(fā)明涉及細(xì)胞，它包含的DNA分子至少含有SEQ ID NO1的第1461核苷酸的上游核苷酸序列的一部分，并可操作連接到除HSV-2衣殼蛋白外編碼一個蛋白的核苷酸序列上。核苷酸1191到1461(SEQ ID NO1)，例如，被連接到氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因上并當(dāng)轉(zhuǎn)染進(jìn)入VERO細(xì)胞時表現(xiàn)出具有重要的啟動子活性。
實(shí)施例實(shí)施例1蛋白水解活性對皰疹病毒的病毒粒子成熟必不可少已被表示為HSV-2的特性。HSV-2蛋白酶也被稱為HSV-2 UL26，有約67,028Da(道爾頓)的分子量(表觀)和pI(等電點(diǎn))＝6.94。HSV-2蛋白酶用分子的和生化的技術(shù)通過合理的設(shè)計(jì)和篩選在體外實(shí)驗(yàn)中鑒定該活性的抑制劑并在感染的細(xì)胞中測定這些抑制劑的抗病毒活性。
HSV-2 UL 26基因被克隆成一個NcoI-EcoRI片段(1938堿基對)，它含有起動密碼子，整個開放閱讀框架，停止密碼子和3′-不翻譯序列的22對堿基。用pOTS載體系統(tǒng)在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)HSV-2 UL 26全部長度，在載體中基因被插入在來自pOTS-207載體的入噬菌體的強(qiáng)烈而緊密調(diào)節(jié)的P2啟動子的下游。當(dāng)表達(dá)著的基因很可能是對細(xì)胞有毒時，例如蛋白酶，啟動子的緊密調(diào)節(jié)是重要的。27KD蛋白酶區(qū)域相當(dāng)于來自HSV-2 UL 26原始翻譯產(chǎn)物的自動蛋白水解產(chǎn)物的一個產(chǎn)物，而該原始翻譯產(chǎn)物是用含有T7啟動子的緊密調(diào)節(jié)的表達(dá)載體pET-16(b)(Novagen，Madison W.I.)在大腸桿菌中產(chǎn)生。
設(shè)計(jì)的每個構(gòu)建物包括位在HSV-2 UL 26啟動子密碼子前面的6個組氨酸密碼子和(天門冬酸)4賴氨酸密碼子，因此表達(dá)的蛋白在N-末端含有一個可裂解的組氨酸尾利于在鎳柱進(jìn)行蛋白純化。也可用其他的螯合柱，組氨酸-尾標(biāo)記蛋白通過咪唑的加入從柱上洗脫下來。另外，用其他的方法例如改變pH它也能被洗脫下來。對純化蛋白有用的柱和技術(shù)方案也可從在商業(yè)上可得到的來源例如Qiagen處獲得。
對P2啟動子載體，把重組體構(gòu)建物引入到用于表達(dá)和處理/純化研究的大腸桿菌AR120(萘啶酮酸誘導(dǎo)株)和大腸桿菌AR58(熱誘導(dǎo)株)中。對T7啟動子載體，把重組構(gòu)建物引入到大腸桿菌BL21，一株IPTG(異丙基-β-D硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)菌株。在鎳螯合柱上通過色譜法蛋白很容易被純化。
p27蛋白酶片段像其能力所表現(xiàn)那樣是有活力的，其活力能從包含UL 26.5編碼區(qū)大部分的一個構(gòu)建物上除去最后25個氨基酸。實(shí)施例2p27蛋白酶基因可被合成使含有高表達(dá)的大腸桿菌基因?yàn)樘卣鞯拿艽a子，但仍保留有p27蛋白酶的氨基酸序列。合成的基因在表達(dá)載體pET-16(b)上位在緊迫調(diào)節(jié)的T7啟動子的下游。隨著IPTG(1mM)誘導(dǎo)，27KDa蛋白區(qū)域就在大腸桿菌中高度表達(dá)。實(shí)施例3把上述HSV-2 UL 26基因(NcoI-EcoRI片段)和p27蛋白酶克隆到昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體pVL1392上。然后把重組體構(gòu)建物引入到來自草地夜蛾的昆蟲細(xì)胞中。然后為蛋白酶活性分析制備高滴度病毒母液，繼之按比例加大蛋白生產(chǎn)。實(shí)施例4對分享有最少量相同性的HSV-1 UL 26基因和HSV-2 UL 26基團(tuán)的DNA區(qū)設(shè)計(jì)寡核苷酸PCR引物，以保證測定的特異性。通過計(jì)算機(jī)分析比較分別公開在SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中的二個DNA序列，就能容易地觀察到這樣一個區(qū)域。在二個同源染色體間少量相同的區(qū)域位在UL 26.5區(qū)域內(nèi)，即編碼衣殼基因的一部分。根據(jù)在輸入的計(jì)算機(jī)分析中所提供的在核苷酸序列比較中給出的核苷酸數(shù)，提供了下列所用引物的序列和所給引物的位置。如下面所示，它對設(shè)計(jì)產(chǎn)生不同大小的HSV-1和HSV-2產(chǎn)物的一個系統(tǒng)以改進(jìn)分析是有幫助的。5′-PCR引物(正義-鏈序列)SEQ ID NO18 HSV-15′-CCGGTGCCCAATCGTCCGT-3′(#864-882)SEQ ID NO19 HSV-25′-GTCCGTGCGCGTCAAGTCG-3′(#1397-1416)3′-PCR引物(反義-鏈序列)SEQ ID NO20 HSV-15′-TTCCGGCTCCCCCACCTGA-3′(#1560-1542)SEQ ID NO21 HSV-25′-ATTCGGATCCTGGAGGCGA-3′(#2470-2452)用這些引物組期望PCR產(chǎn)物的大小HSV-1696堿基對HSV-21073堿基對。
在HSV-1分析中用SEQ ID NO18和SEQ ID NO20或在HSV-2分析中用SEQ ID NO19和SEQ ID NO21，對懷疑含有HSV-1或HSV-2 DNA的樣品使用不同的PCR擴(kuò)增方法。如果一個696堿基對的DNA片段在HSV-1分析中產(chǎn)生，就表明HSV-DNA在樣品中存在。要檢測696堿基對片段的存在，可把擴(kuò)增產(chǎn)物通過一個電泳基質(zhì)上被遷移。大約696堿基對的DNA的一個大小標(biāo)志也在同一基質(zhì)上同時跑電泳。如果在HSV-2分析中產(chǎn)生的是一個1083堿基對的DNA片段，則就表明樣品中有HSV-2 DNA的存在。為要檢測一個1073堿基對片段的存在，可把擴(kuò)增產(chǎn)物通過一個電泳基質(zhì)上的遷移。把約1073堿基對的DNA的一個大小標(biāo)志也同時在相同的基質(zhì)上電泳。
提供一種試劑盒，它包括一個含有HSV-1分析中用的SEQ ID NO18和SEQ ID NO20的容器。提供一種試劑盒，它包括一個含有在HSV-2分析中用的SEQ ID NO19和SEQ ID NO21的容器。提供一種試劑盒，它包括這兩者，一個容器含有在HSV-1分析中的SEQ ID NO18和SEQ ID NO20，而另一個容器中含有在HSV-2分析中的SEQID NO19和SEQ ID NO21。也可任選地提供大小標(biāo)志DNA。在有些試劑盒中提供一個696堿基對大小的標(biāo)志。在有些試劑盒中提供一個1073堿基對大小的標(biāo)志。在一些試劑盒中提供一個696堿基對大小的標(biāo)志和一個1073堿基對大小的標(biāo)志。實(shí)施例5把包含在HSV-2 UL 26基因中推定的HSV-2 UL 26.5啟動子的區(qū)域克隆以測試啟動子的活性。被分析的256堿基對區(qū)跨越SEQ ID NO1的#1191至#1147。用正義鏈跨越SEQ ID NO1的核苷酸#1191到#1209的引物(5′-AACATGAGCTGCGTGACC-3′)和跨越SEQ ID NO1的#1447至#1429核苷酸的反義鏈引物(5′-AAAGAAGAAGAAGAAGAC-3′)通過多聚酶鏈反應(yīng)把DNA片段進(jìn)行克隆。通過把256堿基對PCR片段克隆在商業(yè)上可得到的質(zhì)粒pCAT Basic(Promega)的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)報告基因的上游測試啟動子的活性。然后把產(chǎn)生的構(gòu)建物引入到一個合適哺乳類細(xì)胞系如Vero細(xì)胞中，用分析CAT活性水平試驗(yàn)啟動子活性。該細(xì)胞系缺乏內(nèi)源的CAT，因此，在引入啟動子構(gòu)建物進(jìn)入這樣的細(xì)胞品系之后，CAT活性的水平就是HSV-2 UL 26.5啟動子活性的一個直接量度。
把Vero細(xì)胞在含艮他霉素(10μg/m1)的DMEM+10％FCS中生長，把15微克HSV-2 UL 26.5/pCAT構(gòu)建物，用標(biāo)準(zhǔn)的方案進(jìn)行電穿孔引入到5百萬Vero細(xì)胞中。經(jīng)過電穿孔后48小時，收集細(xì)胞放在100微升0.25M pH8.0 Tris緩沖液中。用反復(fù)凍-熔把細(xì)胞裂解，以15000rpm離心并把上清液轉(zhuǎn)移到新的試管中。用Bio-Rad蛋白測定染料試劑盒(目錄號500-0006)確定總蛋白濃度。把5微升D-蘇[二氯乙酰-1-14C]氯霉素(Amersham，56mCi/mmol)和5微升n-丁醛輔酶A(5mg/ml)加到一個細(xì)胞提取上清液的試樣中使其最后體積為100微升，用乙酸乙酯提取液接著用薄層色譜法以測定CAT活性。
除上述構(gòu)建物外，也可把256堿基對HSV-2 UL 26.5片段克隆在含有一個SV-40增強(qiáng)子的pCAT Enhancen載體中的CAT報告基因上游。這個構(gòu)建物在Vero細(xì)胞中用上述相同的方法也可測試CAT活性。
對照載體pCAT(含有SV40啟動子和增強(qiáng)子)可以用為HSV-2 UL26.5啟動子能力的比較。
圖2總結(jié)了四個實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。柱形1是一個陰性對照并代表在沒有啟動子和增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄控制因子時的CAT的表達(dá)。柱形2，一個陽性的對照，應(yīng)用SV40的啟動子和SV40的增強(qiáng)因子驅(qū)使CAT基因表達(dá)。柱形3代表由UL 26.5啟動子單獨(dú)驅(qū)使CAT基團(tuán)表達(dá)，而柱形4代表當(dāng)UL 26.5啟動子與SV40增強(qiáng)子聯(lián)合應(yīng)用時CAT基團(tuán)表達(dá)。
已建立起一個基本的UL 26.5表達(dá)水平(柱形3)只要通過從核苷酸1191回到核苷酸1上游分離合適長度的片段，并把此片段引入到相對于啟動子區(qū)起作用位置的基本表達(dá)構(gòu)建物中并測定他們超過基本水平的增強(qiáng)CAT表達(dá)能力，這樣就能用在圖1中基因序列的附加片段以鑒定UL 26.5增強(qiáng)因子。
這里所述的啟動子當(dāng)操作連接到那里則對異源基因表達(dá)的調(diào)節(jié)是有用的。
序列目錄(1)一般信息(i)申請者Dilella，Anthony G.
Debouck，Christine(ii)發(fā)明的題目新的基因(iii)序列數(shù)21(iv)相應(yīng)的通訊地址(A)收信人Smithkline Beecham公司法人專利-USUW2220(B)街道P.O.Box 1539(C)城市King of Prussia(D)州 Pennsylvania(E)國家USA(F)ZIP 19406-0939(V)計(jì)算機(jī)可讀型(A)基質(zhì)類型軟磁盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容的(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn釋放#1.0文件，#1.25，mmd(vi)本申請資料(A)申請?zhí)?B)歸檔日期(C)分類(viii)代理人/業(yè)務(wù)代理人信息(A)姓名Jervis，Herbert H.
(B)注冊號31，171(C)參考文獻(xiàn)/摘要號P50188(ix)電信交流信息(A)電話215-270-5019(B)傳真215-270-5090(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長度2472(B)類型核酸(C)鏈雙鏈(D)拓樸學(xué)線性(ii)分子類型基團(tuán)組DNA(ix)特征(A)名稱/按鍵CDS(B)位置534..2447(ix)特征(A)名稱/按鍵misc特征(B)位置1461，2442(xi)序列描述SEQ ID NO1GTCGACGAGG CGCGTGGTGG ATATGTCGTC GGGCGCCCGC CAGGCGGCGC TCGTGCGCCT60CACCGCGCTG GAGCTCATCA ACCGCACCCG CACAAACACC ACCCCTGTGG GGGAGATTAT 120TAACGCCCAC GATGCCTTGG GGATACAATA CGAACAGGGC CTGGGGCTGC TCGCCCAGCA 180GGCACGCATC GGCTTGGCGT CGAACGCCAA GCGATTCGCC ACGTTCAACG TGGGCAGCGA 240CTACGACCTG TTGTACTTTT TGTGTCTCGG GTTCATTCCC CAGTACCTGT CCGTGGCCTA 300GGGAAGGGTG GGGGTGGTGG TGGTGGGGTG TTTTTCTGTT GTTGTTGTTT CTGGTCCGCC 360TGGTCACAAA AGGCACGGCG CCCCGAAACG CGGGCTTTAG TCCCGGCCCG GACGTCGGCG 420GACACACAAC AACGGCGGGC CCCGTGGGTG GGTAAGTTGG TTCGGGGGCA TCGCTGTATT 480CCCTTGCCCG CTTCCACCCC CCCTTCCCGT TTGGTTTGTT TGTGCGGGTG CCC ATG536Met1GCG TCG GCG GAA ATG CGC GAG CGG TTG GAG GCG CCT CTG CCC GAC CGG 584Ala Ser Ala Glu Met Arg Glu Arg Leu Glu Ala Pro Leu Pro Asp Arg5 10 15GCG GTG CCC ATC TAC GTG GCC GGG TTT TTG GCC CTG TAC GAC AGC GGG 632Ala Val Pro Ile Tyr Val Ala Gly Phe Leu Ala Leu Tyr Asp Ser Gly20 25 30GAC CCG GGC GAG CTG GCC CTG GAC CCA GAC ACG GTG CGT GCG GCC CTG 680Asp Pro Gly Glu Leu Ala Leu Asp Pro Asp Thr Val Arg Ala Ala Leu35 40 45CCT CCG GAG AAC CCC CTG CCG ATC AAC GTA GAC CAC CGC GCT CGG TGC 728Pro Pro Glu Asn Pro Leu Pro Ile Asn Val Asp His Arg Ala Arg Cys50 55 60 65GAG GTG GGC CGG GTG CTC GCC GTG GTC AAC GAC CCT CGG GGG CCG TTT 776Glu Val Gly Arg Val Leu Ala Val Val Asn Asp Pro Arg Gly Pro Phe70 75 80TTT GTG GGG CTG ATC GCG TGC GTG CAG CTG GAG CGC GTC CTC GAG ACG 824Phe Val Gly Leu Ile Ala Cys Val Gln Leu Glu Arg Val Leu Glu Thr85 90 95GCC GCC AGC GCC GCT ATT TTT GAG CGC CGC GGA CCC GCG CTC TCC CGG 872Ala Ala Ser Ala Ala Ile Phe Glu Arg Arg Gly Pro Ala Leu Ser Arg100 105 110GAG GAG CGT CTG CTG TAC CTG ATC ACC AAC TAC CTG CCA TCG GTC TCG 920Glu Glu Arg Leu Leu Tyr Leu Ile Thr Asn Tyr Leu Pro Ser Val Ser115 120 125CTG TCC ACA AAA CGC CGG GGG GAC GAG GTT CCG CCC GAC CGC ACC CTG 968Leu Ser Thr Lys Arg Arg Gly Asp Glu Val Pro Pro Asp Arg Thr Leu130 135 140 145TTT GCG CAC GTG GCC CTG TGC GCC ATC GGG CGG CGC CTT GGA ACC ATC 1016Phe Ala His Val Ala Leu Cys Ala Ile Gly Arg Arg Leu Gly Thr Ile150 155 160GTC ACC TAC GAC ACC AGC CTA GAC GCG GCC ATC GCT CCG TTT CGC CAC 1064Val Thr Tyr Asp Thr Ser Leu Asp Ala Ala Ile Ala Pro Phe Arg His165 170 175CTG GAC CCG GCG ACG CGC GAG GGG GTG CGA CGC GAG GCC GCC GAG GCC 1112Leu Asp Pro Ala Thr Arg Glu Gly Val Arg Arg Glu Ala Ala Glu Ala180 185 190GAG CTC GCG CTG GCC GGG CGC ACC TGG GCC CCC GGC GTG GAG GCG CTC 1160Glu Leu Ala Leu Ala Gly Arg Thr Trp Ala Pro Gly Val Glu Ala Leu195 200 205ACA CAC ACG CTG CTC TCC ACC GCC GTC AAC AAC ATG ATG CTG CGT GAC 1208Thr His Thr Leu Leu Ser Thr Ala Val Asn Asn Met Met Leu Arg Asp210 215 220 225CGC TGG AGC CTC GTG GCC GAG CGG CGG CGG CAG GCC GGG ATC GCC GGA 1256Arg Trp Ser Leu Val Ala Glu Arg Arg Arg Gln Ala Gly Ile Ala Gly230 235 240CAC ACG TAC CTT CAG GCG AGC GAA AAA TTT AAA ATA TGG GGG GCG GAG 1304His Thr Tyr Leu Gln Ala Ser Glu Lys Phe Lys Ile Trp Gly Ala Glu245 250 255TCT GCC CCT GCG CCG GAG CGT GGG TAT AAA ACC GGC GCC CCG GGT GCC 1352Ser Ala Pro Ala Pro Glu Arg Gly Tyr Lys Thr Gly Ala Pro Gly Ala260 265 270ATG GAC ACA TCC CCC GCC GCG AGC GTT CCC GCG CCG CAG GTC GCC GTC 1400Met Asp Thr Ser Pro Ala Ala Ser Val Pro Ala Pro Gln Val Ala Val275 280 285CGT GCG CGT CAA GTC GCG TCG TCG TCG TCT TCT TCT TCT TCT TTT CCG 1448Arg Ala Arg Gln Val Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Phe Pro290 295 300 305GCA CCG GCC GAT ATG AAC CCC GTT TCG GCA TCG GGC GCC CCG GCC CCT 1496Ala Pro Ala Asp Met Asn Pro Val Ser Ala Ser Gly Ala Pro Ala Pro310 315 320CCG CCG CCC GGC GAC GGG AGT TAT TTG TGG ATC CCC GCC TCT CAT TAC 1544Pro Pro Pro Gly Asp Gly Ser Tyr Leu Trp Ile Pro Ala Ser His Tyr325 330 335AAT CAG CTC GTC ACC GGG CAA TCC GCG CCC CGC CAC CCG CCG CTG ACC 1592Asn Gln Leu Val Thr Gly Gln Ser Ala Pro Arg His Pro Pro Leu Thr340 345 350GCG TGC GGC CTG CCG GCC GCG GGG ACG GTG GCC TAC GGA CAC CCC GGC 1640Ala Cys Gly Leu Pro Ala Ala Gly Thr Val Ala Tyr Gly His Pro Gly355 360 365GCC GGC CCG TCC CCG CAC TAC CCG CCT CCT CCC GCC CAC CCG TAC CCG 1688Ala Gly Pro Ser Pro His Tyr Pro Pro Pro Pro Ala His Pro Tyr Pro370 375 380 385GGT ATG CTG TTC GCG GGC CCC AGT CCC CTG GAG GCC CAG ATC GCC GCG 1736Gly Met Leu Phe Ala Gly Pro Ser Pro Leu Glu Ala Gln Ile Ala Ala390 395 400CTG GTG GGG GCC ATC GCC GCC GAC CGC CAG GCG GGT GGG CTT CCG GCG 1784Leu Val Gly Ala Ile Ala Ala Asp Arg Gln Ala Gly Gly Leu Pro Ala405 410 415GCC GCC GGA GAC CAC GGG ATC CGG GGG TCG GCG AAG CGC CGC CGA CAC 1832Ala Ala Gly Asp His Gly Ile Arg Gly Ser Ala Lys Arg Arg Arg His420 425 430GAG GTG GAG CAG CCG GAG TAC GAC TGC GGC CGT GAC GAG CCG GAC CGG 1880Glu Val Glu Gln Pro Glu Tyr Asp Cys Gly Arg Asp Glu Pro Asp Arg435 440 445GAC TTC CCG TAT TAC CCG GGC GAG GCC CGC CCC GAG CCG CGC CCG GTC 1928Asp Phe Pro Tyr Tyr Pro Gly Glu Ala Arg Pro Glu Pro Arg Pro Val450 455 460 465GAC TCC CGG CGC GCC GCG CGC CAG GCT TCC GGG CCC CAC GAA ACC ATC 1976Asp Ser Arg Arg Ala Ala Arg Gln Ala Ser Gly Pro His Glu Thr Ile470 475 480ACG GCG CTG GTG GGG GCG GTG ACG TCC CTG CAG CAG GAA CTG GCG CAC 2024Thr Ala Leu Val Gly Ala Val Thr Ser Leu Gln Gln Glu Leu Ala His485 490 495ATG CGC GCG CGT ACC CAC GCC CCC TAC GGG CCG TAT CCG CCG GTG GGG 2072Met Arg Ala Arg Thr His Ala Pro Tyr Gly Pro Tyr Pro Pro Val Gly500 505 510CCC TAC CAC CAC CCC CAC GCA GAC ACG GAG ACC CCC GCC CAA CCA CCC 2120Pro Tyr His His Pro His Ala Asp Thr Glu Thr Pro Ala Gln Pro Pro515 520 525CGC TAC CCC GCC GAG GCC GTC TAT CTG CCG CCG CCG CAC ATC GCC CCC 2168Arg Tyr Pro Ala Glu Ala Val Tyr Leu Pro Pro Pro His Ile Ala Pro530 535 540545CCG GGG CCT CCT CTA TCC GGG GCG GTC CCC CCA CCC TCG TAT CCC CCA 2216Pro Gly Pro Pro Leu Ser Gly Ala Val Pro Pro Pro Ser Tyr Pro Pro550 555 560GTT GCG GTT ACC CCC GGT CCC GCT CCC CCG CTA CAT CAG CCC TCC CCC 2264Val Ala Val Thr Pro Gly Pro Ala Pro Pro Leu His Gln Pro Ser Pro565 570 575GCA CAC GCC CAC CCC CCT CCG CCG CCG CCG GGA CCC ACG CCT CCC CCC 2312Ala His Ala His Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Pro Thr Pro Pro Pro580 585 590GCC GCG AGC TTA CCC CAA CCC GAG GCG CCC GGC GCG GAG GCC GGC GCC 2360Ala Ala Ser Leu Pro Gln Pro Glu Ala Pro Gly Ala Glu Ala Gly Ala595 600 605TTA GTT AAC GCC AGC AGC GCG GCC CAC GTG AAC GTG GAC ACG GCC CGG 2408Leu Val Asn Ala Ser Ser Ala Ala His Val Asn Val Asp Thr Ala Arg610 615 620 625GCC GCC GAT CTG TTT GTG TCA CAG ATG ATG GGG TCC CGC TAACTCGCCT2457Ala Ala Asp Leu Phe Val Ser Gln Met Met Gly Ser Arg630 635CCAGGATCCG AATTC 2472(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長度638氨基酸
(B)類型氨基酸(C)拓樸學(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ala Ser Ala Glu Met Arg Glu Arg Leu Glu Ala Pro Leu Pro Asp1 5 10 15Arg Ala Val Pro Ile Tyr Val Ala Gly Phe Leu Ala Leu Tyr Asp Ser20 25 30Gly Asp Pro Gly Glu Leu Ala Leu Asp Pro Asp Thr Val Arg Ala Ala35 40 45Leu Pro Pro Glu Asn Pro Leu Pro Ile Asn Val Asp His Arg Ala Arg50 55 60Cys Glu Val Gly Arg Val Leu Ala Val Val Asn Asp Pro Arg Gly Pro65 70 75 80Phe Phe Val Gly Leu Ile Ala Cys Val Gln Leu Glu Arg Val Leu Glu85 90 95Thr Ala Ala Ser Ala Ala Ile Phe Glu Arg Arg Gly Pro Ala Leu Ser100 105 110Arg Glu Glu Arg Leu Leu Tyr Leu Ile Thr Asn Tyr Leu Pro Ser Val115 120 125Ser Leu Ser Thr Lys Arg Arg Gly Asp Glu Val Pro Pro Asp Arg Thr130 135 140Leu Phe Ala His Val Ala Leu Cys Ala Ile Gly Arg Arg Leu Gly Thr145 150 155 160Ile Val Thr Tyr Asp Thr Ser Leu Asp Ala Ala Ile Ala Pro Phe Arg165 170 175His Leu Asp Pro Ala Thr Arg Glu Gly Val Arg Arg Glu Ala Ala Glu180 185 190Ala Glu Leu Ala Leu Ala Gly Arg Thr Trp Ala Pro Gly Val Glu Ala195 200 205Leu Thr His Thr Leu Leu Ser Thr Ala Val Asn Asn Met Met Leu Arg210 215 220Asp Arg Trp Ser Leu Val Ala Glu Arg Arg Arg Gln Ala Gly Ile Ala225 230 235 240Gly Mis Thr Tyr Leu Gln Ala Ser Glu Lys Phe Lys Ile Trp Gly Ala245 250 255Glu Ser Ala Pro Ala Pro Glu Arg Gly Tyr Lys Thr Gly Ala Pro Gly260 265 270Ala Met Asp Thr Ser Pro Ala Ala Ser Val Pro Ala Pro Gln Val Ala275 280 285Val Arg Ala Arg Gln Val Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Phe290 295 300Pro Ala Pro Ala Asp Met Asn Pro Val Ser Ala Ser Gly Ala Pro Ala305 310 315 320Pro Pro Pro Pro Gly Asp Gly Ser Tyr Leu Trp Ile Pro Ala Ser His325 330 335Tyr Asn Gln Leu Val Thr Gly Gln Ser Ala Pro Arg His Pro Pro Leu340 345 350Thr Ala Cys Gly Leu Pro Ala Ala Gly Thr Val Ala Tyr Gly His Pro355 360 365Gly Ala Gly Pro Ser Pro His Tyr Pro Pro Pro Pro Ala His Pro Tyr370 375 380Pro Gly Met Leu Phe Ala Gly Pro Ser Pro Leu Glu Ala Gln Ile Ala385 390 395 400Ala Leu Val Gly Ala Ile Ala Ala Asp Arg Gln Ala Gly Gly Leu Pro405 410 415Ala Ala Ala Gly Asp His Gly Ile Arg Gly Ser Ala Lys Arg Arg Arg420 425 430His Glu Val Glu Gln Pro Glu Tyr Asp Cys Gly Arg Asp Glu Pro Asp435 440 445Arg Asp Phe Pro Tyr Tyr Pro Gly Glu Ala Arg Pro Glu Pro Arg Pro450 455 460Val Asp Ser Arg Arg Ala Ala Arg Gln Ala Ser Gly Pro His Glu Thr465 470 475 480Ile Thr Ala Leu Val Gly Ala Val Thr Ser Leu Gln Gln Glu Leu Ala485 490 495His Met Arg Ala Arg Thr His Ala Pro Tyr Gly Pro Tyr Pro Pro Val500 505 510Gly Pro Tyr His His Pro His Ala Asp Thr Glu Thr Pro Ala Gln Pro515 520 525Pro Arg Tyr Pro Ala Glu Ala Val Tyr Leu Pro Pro Pro His Ile Ala530 535 540Pro Pro Gly Pro Pro Leu Ser Gly Ala Val Pro Pro Pro Ser Tyr Pro545 550 555560Pro Val Ala Val Thr Pro Gly Pro Ala Pro Pro Leu His Gln Pro Ser565 570 575Pro Ala His Ala His Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Pro Thr Pro Pro580 585 590Pro Ala Ala Ser Leu Pro Gln Pro Glu Ala Pro Gly Ala Glu Ala Gly595 600 605Ala Leu Val Asn Ala Ser Ser Ala Ala His Val Asn Val Asp Thr Ala610 615 620Arg Ala Ala Asp Leu Phe Val Ser Gln Met Met Gly Ser Arg625 630 635(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長度4氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓樸學(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Leu Gl n Ala Ser1(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)長度4氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓樸學(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO4Val Asn Ala Ser1(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)長度12氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓樸學(xué)線性
(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO5Ala His Thr Tyr Leu Gln Ala Ser Glu Lys Phe Lys1 5 10(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)長度16氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓樸學(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO6Ala Gly Ile Ala Gly His Thr Tyr Leu Gln Ala Ser Glu Lys Phe Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓樸學(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO7Gly Ile Ala Gly His Thr Tyr Leu Gln Ala Ser Glu Lys Phe Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特征(A)長度14氨基酸
(B)類型氨基酸(C)拓樸學(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO8Ile Ala Gly His Thr Tyr Leu Gln Ala Ser Glu Lys Phe Lys1 5 10(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)長度12氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓樸學(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO9Gly His Thr Tyr Leu Gln Ala Ser Glu Lys Phe Lys1 5 10(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特征(A)長度12氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓樸學(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO10His Thr Tyr Leu Gln Ala Ser Glu Lys Phe Lys Met1 5 10(2)SEQ ID NOl1信息
(i)序列特征(A)長度13氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓樸學(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO11His Thr Tyr Leu Gln Ala Ser Glu Lys Phe Lys Met Trp1 5 10(2)SEQ ID NO12信息(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓樸學(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO12His Thr Tyr Leu Gln Ala Ser Glu Lys Phe Lys Met Trp Gly1 5 10(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓樸學(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO13His Thr Tyr Leu Gln Ala Ser Glu Lys Phe Lys Met Trp Gly Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO14信息(i)序列特征(A)長度16氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓樸學(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO14His Thr Tyr Leu Gln Ala Ser Glu Lys Phe Lys Met Trp Gly Ala Glu1 5 10 15(2)SEQ ID NO15信息(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓樸學(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO15Ala Leu Val Asn Ala Ser Ser Ala Ala His Val Asp Val Asp1 5 10(2)SEQ ID NO16信息(i)序列特征(A)長度1908堿基對(B)類型核酸(C)鏈雙鏈(D)拓樸學(xué)線性(ii)分子類型cDNA
(ix)特性(A)名稱/按鍵CDS(B)位置1....1908(ix)特性(A)名稱/按鍵misc特性(B)位置919....1908(xi)序列特征SEQ ID NO16ATG GCA GCC GAT GCC CCG GGA GAC CGG ATG GAG GAG CCC CTG CCC GAC48Met Ala Ala Asp Ala Pro Gly Asp Arg Met Glu Glu Pro Leu Pro Asp1 5 10 l5AGG GCC GTG CCC ATT TAC GTG GCT GGG TTT TTG GCC CTG TAT GAC AGC96Arg Ala Val Pro Ile Tyr Val Ala Gly Phe Leu Ala Leu Tyr Asp Ser20 25 30GGG GAC TCG GGC GAG TTG GCA TTG GAT CCG GAT ACG GTG CGG GCG GCC 144Gly Asp Ser Gly Glu Leu Ala Leu Asp Pro Asp Thr Val Arg Ala Ala35 40 45CTG CCT CCG GAT AAC CCA CTC CCG ATT AAC GTG GAC CAC CGC GCT GGC 192Leu Pro Pro Asp Asn Pro Leu Pro Ile Asn Val Asp His Arg Ala Gly50 55 60TGC GAG GTG GGG CGG GTG CTG GCC GTG GTC GAC GAC CCC CGC GGG CCG 240Cys Glu Val Gly Arg Val Leu Ala Val Val Asp Asp Pro Arg Gly Pro65 70 75 80TTT TTT GTG GGG CTG ATC GCC TGC GTG CAG CTG GAG CGC GTC CTC GAG 288Phe Phe Val Gly Leu Ile Ala Cys Val Gln Leu Glu Arg Val Leu Glu85 90 95ACG GCC GCC AGC GCT GCG ATT TTC GAG CGC CGC GGG CCG CCG CTC TCC 336Thr Ala Ala Ser Ala Ala Ile Phe Glu Arg Arg Gly Pro Pro Leu Ser100 105 110CGG GAG GAG CGC CTG TTG TAC CTG ATC ACC AAC TAC CTG CCC TCG GTC 384Arg Glu Glu Arg Leu Leu Tyr Leu Ile Thr Asn Tyr Leu Pro Ser Val115 120 125TCC CTG GCC ACA AAA CGC CTG GGG GGC GAG GCG CAC CCC GAT CGC ACG 432Ser Leu Ala Thr Lys Arg Leu Gly Gly Glu Ala His Pro Asp Arg Thr130 135 140CTG TTC GCG CAC GTC GCG CTG TGC GCG ATC GGG CGG CGC CTC GGC ACT 480Leu Phe Ala His Val Ala Leu Cys Ala Ile Gly Arg Arg Leu Gly Thr145 150 155 160ATC GTC ACC TAC GAC ACC GGT CTC GAC GCC GCC ATC GCG CCC TTT CGC 528Ile Val Thr Tyr Asp Thr Gly Leu Asp Ala Ala Ile Ala Pro Phe Arg165 170 175CAC CTG TCG CCG GCG TCT CGC GAG GGG GCG CGG CGA CTG GCC GCC GAG576His Leu Ser Pro Ala Ser Arg Glu Gly Ala Arg Arg Leu Ala Ala Glu180 185 l90GCC GAG CTC GCG CTG TCC GGG CGC ACC TGG GCG CCC GGC GTG GAG GCG624Ala Glu Leu Ala Leu Ser Gly Arg Thr Trp Ala Pro Gly Val Glu Ala195 200 205CTG ACC CAC ACG CTG CTT TCC ACC GCC GTT AAC AAC ATG ATG CTG CGG672Leu Thr His Thr Leu Leu Ser Thr Ala Val Asn Asn Met Met Leu Arg210 215 220GAC CGC TGG AGC CTG GTG GCC GAG CGG CGG CGG CAG GCC GGG ATC GCC720Asp Arg Trp Ser Leu Val Ala Giu Arg Arg Arg Gln Ala Gly Ile Ala225 230 235 240GGA CAC ACC TAC CTC CAG GCG AGC GAA AAA TTC AAA ATG TGG GGG GCG768Gly His Thr Tyr Leu Gln Ala Ser Glu Lys Phe Lys Met Trp Gly Ala245 250 255GAG CCT GTT TCC GCG CCG GCG CGC GGG TAT AAG AAC GGG GCC CCG GAG816Glu Pro Val Ser Ala Pro Ala Arg Gly Tyr Lys Asn Gly Ala Pro Glu260 265 270TCC ACG GAC ATA CCG CCC GGC TCG ATC GCT GCC GCG CCG CAG GGT GAC864Ser Thr Asp Ile Pro Pro Gly Ser Ile Ala Ala Ala Pro Gln Gly Asp275 280 285CGG TGC CCA ATC GTC CGT CAG CGC GGG GTC GCC TTG TCC CCG GTA CTG912Arg Cys Pro Ile Val Arg Gln Arg Gly Val Ala Leu Ser Pro Val Leu290 295 300CCC CCC ATG AAC CCC GTT CCG ACA TCG GGC ACC CCG GCC CCC GCG CCG960Pro Pro Met Asn Pro Val Pro Thr Ser Gly Thr Pro Ala Pro Ala Pro305 310 315 320CCC GGC GAC GGG AGC TAC CTG TGG ATC CCG GCC TCC CAT TAC AAC CAG 1008Pro Gly Asp Gly Ser Tyr Leu Trp Ile Pro Ala Ser His Tyr Asn Gln325 330 335CTC GTC GCC GGC CAT GCC GCG CCC CAA CCC CAG CCG CAT TCC GCG TTT 1056Leu Val Ala Gly His Ala Ala Pro Gln Pro Gln Pro His Ser Ala Phe340 345 350GGT TTC CCG GCT GCG GCG GGG TCC GTG GCC TAT GGG CCT CAC GGT GCG 1104Gly Phe Pro Ala Ala Ala Gly Ser Val Ala Tyr Gly Pro His Gly Ala355 360 365GGT CTT TCC CAG CAT TAC CCT CCC CAC GTC GCC CAT CAG TAT CCC GGG 1152Gly Leu Ser Gln His Tyr Pro Pro His Val Ala His Gln Tyr Pro Gly370 375 380GTG CTG TTC TCG GGA CCC AGC CCA CTC GAG GCG CAG ATA GCC GCG TTG 1200Val Leu Phe Ser Gly Pro Ser Pro Leu Glu Ala Gln Ile Ala Ala Leu385 390 395 400GTG GGG GCC ATA GCC GCG GAC CGC CAG GCG GGC GGT CAG CCG GCC GCG 1248Val Gly Ala Ile Ala Ala Asp Arg Gln Ala Gly Gly Gln Pro Ala Ala405 410 415GGA GAC CCT GGG GTC CGG GGG TCG GGA AAG CGT CGC CGG TAC GAG GCG 1296Gly Asp Pro Gly Val Arg Gly Ser Gly Lys Arg Arg Arg Tyr Glu Ala420 425 430GGG CCG TCG GAG TCC TAC TGC GAC CAG GAC GAA CCG GAC GCG GAC TAC 1344Gly Pro Ser Glu Ser Tyr Cys Asp Gln Asp Glu Pro Asp Ala Asp Tyr435 440 445CCG TAC TAC CCC GGG GAG GCT CGA GGC GCG CCG CGC GGG GTC GAC TCC 1392Pro Tyr Tyr Pro Gly Glu Ala Arg Gly Ala Pro Arg Gly Val Asp Ser450 455 460CGG CGC GCG GCC CGC CAT TCT CCC GGG ACC AAC GAG ACC ATC ACG GCG 1440Arg Arg Ala Ala Arg His Ser Pro Gly Thr Asn Glu Thr Ile Thr Ala465 470 475 480CTG ATG GGG GCG GTG ACG TCT CTG CAG CAG GAA CTG GCG CAC ATG CGG 1488Leu Met Gly Ala Val Thr Ser Leu Gln Gln Glu Leu Ala His Met Arg485 490 495GCT CGG ACC AGC GCC CCC TAT GGA ATG TAC ACG CCG GTG GCG CAC TAT 1536Ala Arg Thr Ser Ala Pro Tyr Gly Met Tyr Thr Pro Val Ala His Tyr500 505 510CGC CCT CAG GTG GGG GAG CCG GAA CCA ACA ACG ACC CAC CCG GCC CTT 1584Arg Pro Gln Val Gly Glu Pro Glu Pro Thr Thr Thr His Pro Ala Leu515 520 525TGT CCC CCG GAG GCC GTG TAT CGC CCC CCA CCA CAC AGC GCC CCC TAC 1632Cys Pro Pro Glu Ala Val Tyr Arg Pro Pro Pro His Ser Ala Pro Tyr530 535 540GGT CCT CCC CAG GGT CCG GCG TCC CAT GCC CCC ACT CCC CCG TAT GCC 1680Gly Pro Pro Gln Gly Pro Ala Ser His Ala Pro Thr Pro Pro Tyr Ala545 550 555 560CCA GCT GCC TGC CCG CCA GGC CCG CCA CCG CCC CCA TGT CCT TCC ACC 1728Pro Ala Ala Cys Pro Pro Gly Pro Pro Pro Pro Pro Cys Pro Ser Thr565 570 575CAG ACG CGC GCC CCT CTA CCG ACG GAG CCC GCG TTC CCC CCC GCC GCC 1776Gln Thr Arg Ala Pro Leu Pro Thr Glu Pro Ala Phe Pro Pro Ala Ala580 585 590ACC GGA TCC CAA CCG GAG GCA TCC AAC GCG GAG GCC GGG GCC CTT GTC 1824Thr Gly Ser Gln Pro Glu Ala Ser Asn Ala Glu Ala Gly Ala Leu Val595 600 605AAC GCC AGC AGC GCA GCA CAC GTG GAC GTT GAC ACG GCC CGC GCC GCC 1872Asn Ala Ser Ser Ala Ala His Val Asp Val Asp Thr Ala Arg Ala Ala610 615 620GAT TTG TTC GTC TCT CAG ATG ATG GGG GCC CGC TGA 1908Asp Leu Phe Val Ser Gln Met Met Gly Ala Arg625 630 635(2)SEQ ID NO17信息(i)序列特征(A)長度635氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓樸學(xué)線性(ii)分子類型氨基酸(xi)序列描述SEQ ID NO17Met Ala Ala Asp Ala Pro Gly Asp Arg Met Glu Glu Pro Leu Pro Asp1 5 10 15Arg Ala Val Pro Ile Tyr Val Ala Gly Phe Leu Ala Leu Tyr Asp Ser20 25 30Gly Asp Ser Gly Glu Leu Ala Leu Asp Pro Asp Thr Val Arg Ala Ala35 40 45Leu Pro Pro Asp Asn Pro Leu Pro Ile Asn Val Asp His Arg Ala Gly50 55 60Cys Glu Val Gly Arg Val Leu Ala Val Val Asp Asp Pro Arg Gly Pro65 70 75 80Phe Phe Val Gly Leu Ile Ala Cys Val Gln Leu Glu Arg Val Leu Glu85 90 95Thr Ala Ala Ser Ala Ala Ile Phe Glu Arg Arg Gly Pro Pro Leu Ser100 105 110Arg Glu Glu Arg Leu Leu Tyr Leu Ile Thr Asn Tyr Leu Pro Ser Val115 120 125Ser Leu Ala Thr Lys Arg Leu Gly Gly Glu Ala His Pro Asp Arg Thr130 135 140Leu Phe Ala His Val Ala Leu Cys Ala Ile Gly Arg Arg Leu Gly Thr145 150 155 160Ile Val Thr Tyr Asp Thr Gly Leu Asp Ala Ala Ile Ala Pro Phe Arg165 170 175His Leu Ser Pro Ala Ser Arg Glu Gly Ala Arg Arg Leu Ala Ala Glu180 185 190Ala Glu Leu Ala Leu Ser Gly Arg Thr Trp Ala Pro Gly Val Glu Ala195 200 205Leu Thr His Thr Leu Leu Ser Thr Ala Val Asn Asn Met Met Leu Arg210 215 220Asp Arg Trp Ser Leu Val Ala Glu Arg Arg Arg Gln Ala Gly Ile Ala225 230 235 240Gly His Thr Tyr Leu Gln Ala Ser Glu Lys Phe Lys Met Tp Gly Ala245 250255Glu Pro Val Ser Ala Pro Ala Arg Gly Tyr Lys Asn Gly Ala Pro Glu260 265 270Ser Thr Asp Ile Pro Pro Gly Ser Ile Ala Ala Ala Pro Gln Gly Asp275 280 285Arg Cys Pro Ile Val Arg Gln Arg Gly Val Ala Leu Ser Pro Val Leu290 295 300Pro Pro Met Asn Pro Val Pro Thr Ser Gly Thr Pro Ala Pro Ala Pro305 310 315 320Pro Gly Asp Gly Ser Tyr Leu Trp Ile Pro Ala Ser His Tyr Asn Gln325 330 335Leu Val Ala Gly His Ala Ala Pro Gln Pro Gln Pro His Ser Ala Phe340 345 350Gly Phe Pro Ala Ala Ala Gly Ser Val Ala Tyr Gly Pro His Gly Ala355 360 365Gly Leu Ser Gln His Tyr Pro Pro His Val Ala His Gln Tyr Pro Gly370 375 380Val Leu Phe Ser Gly Pro Ser Pro Leu Glu Ala Gln Ile Ala Ala Leu385 390 395 400Val Gly Ala Ile Ala Ala Asp Arg Gln Ala Gly Gly Gln Pro Ala Ala405 410 415Gly Asp Pro Gly Val Arg Gly Ser Gly Lys Arg Arg Arg Tyr Glu Ala420 425 430Gly Pro Ser Glu Ser Tyr Cys Asp Gln Asp Glu Pro Asp Ala Asp Tyr435 440 445Pro Tyr Tyr Pro Gly Glu Ala Arg Gly Ala Pro Arg Gly Val Asp Ser450 455 460Arg Arg Ala Ala Arg His Ser Pro Gly Thr Asn Glu Thr Ile Thr Ala465 470 475 480Leu Met Gly Ala Val Thr Ser Leu Gln Gln Glu Leu Ala His Met Arg485 490 495Ala Arg Thr Ser Ala Pro Tyr Gly Met Tyr Thr Pro Val Ala His Tyr500 505 510Arg Pro Gln Val Gly Glu Pro Glu Pro Thr Thr Thr His Pro Ala Leu515 520 525Cys Pro Pro Glu Ala Val Tyr Arg Pro Pro Pro His Ser Ala Pro Tyr530 535 540Gly Pro Pro Gln Gly Pro Ala Ser Mis Ala Pro Thr Pro Pro Tyr Ala545 550 555 560Pro Ala Ala Cys Pro Pro Gly Pro Pro Pro Pro Pro Cys Pro Ser Thr565 570 575Gln Thr Arg Ala Pro Leu Pro Thr Glu Pro Ala Phe Pro Pro Ala Ala580 585 590Thr Gly Ser Gln Pro Glu Ala Ser Asn Ala Glu Ala Gly Ala Leu Val595 600 605Asn Ala Ser Ser Aia Ala His Val Asp Val Asp Thr Ala Arg Ala Ala610 615 620Asp Leu Phe Val Ser Gln Met Met Gly Ala Arg625 630 635(2)SEQ ID NO18信息(i)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓樸學(xué)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO18CCGGTGCCCA ATCGTCCGT(2)SEQ ID NO19言息(i)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓樸學(xué)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO19GTCCGTGCGC GTCAAGTGG(2)SEQ ID NO20信息(i)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈
(D)拓樸學(xué)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO20TTCCGGcTCC CCCACCTGA(2)SEQ ID NO21信息(i)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓樸學(xué)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO21ATTCGGATCC TGGAGGCGA
權(quán)利要求
1.一個基本上純的由HSV-2 UL26基因編碼的蛋白及其功能片段。
2.權(quán)利要求1中基本上純的蛋白，其中所說的蛋白選自由HSV-2蛋白酶前體蛋白，成熟的HSV-2蛋白酶以及所說成熟的HSV-2蛋白酶的功能片段所組成的組中。
3.權(quán)利要求1中基本上純的蛋白，其中所說的蛋白是成熟的HSV-2蛋白酶。
4.一個基本上純的由HSV-2 UL26.5基因所編碼的蛋白或其片段。
5.權(quán)利要求4中基本上純的蛋白，其中所說的蛋白選自由HSV-2衣殼前體蛋白，成熟的HSV-2衣殼蛋白和它的功能片段組成的組中。
6.權(quán)利要求1中基本上純的蛋白，其中所說的蛋白是成熟的HSV-2衣殼蛋白。
7.分離到的包含一個HSV-2 UL26基團(tuán)或它的功能片段的核酸分子。
8.權(quán)利要求7的分離到的核酸分子，包含一個SEQ ID NO1或它的一個功能片段的核苷酸序列。
9.權(quán)利要求7的分離到的核酸分子，包含一個編碼成熟HSV-2蛋白酶的核苷酸序列。
10.權(quán)利要求7的分離到的核酸分子，包含一個HSV-2 UL26.5基團(tuán)或它的一個功能片段。
11.權(quán)利要求10的分離到的核酸分子，包含一個編碼成熟HSV-2衣殼蛋白的核苷酸序列。
12.權(quán)利要求10的分離到的核酸分子，包含HSV-2 26.5啟動子。
13.一個包含HSV-2 UL26基因或它的功能片段的表達(dá)載體。
14.權(quán)利要求13的表達(dá)載體，其中所說UL26基因在SEQ IDNO1中公開。
15.權(quán)利要求13的表達(dá)載體，其中所說UL26基因的所說片段選自由編碼成熟HSV-2蛋白酶的一個核苷酸序列，一個編碼成熟HSV-2衣殼蛋白的核苷酸序列，一個編碼HSV-2 UL26.5基因的核苷酸序列，一個編碼成熟HSV-2衣殼蛋白的核苷酸序列和HSV-2UL26.5啟動子組成的組中。
16.已用權(quán)利要求13的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所說的宿主細(xì)胞能表達(dá)所說的UL26基因或它的功能片段。
17.一種鑒定抑制HSV-2蛋白酶活性的化合物的方法包括下列步驟a)在一種試驗(yàn)化合物存在下，用一個HSV-2蛋白酶底物與HSV-2蛋白酶或他的功能片段相接觸b)檢測所說底物的蛋白水解裂解的水平，以及c)在(b)水平與在沒有試驗(yàn)化合物存在下，用一個HSV-2蛋白酶底物與HSV-2蛋白酶或其功能片段接觸時發(fā)生的蛋白水解活性的水平相比較。
18.一個鑒定抑制HSV-2病毒粒子裝配的化合物的方法，包含a)在一種受試化合物存在下，把二個或二個以上存在于一個受試化合物中的至少包含HSV-2衣殼蛋白部分的蛋白相接觸，b)檢測衣殼-衣殼聯(lián)合的水平，以及c)以所說的衣殼-衣殼聯(lián)合的水平與在沒有受試化合物存在下，當(dāng)二個或二個以上至少包括HSV-2衣殼蛋白的部分蛋白相接觸時發(fā)生的衣殼-衣殼聯(lián)合的水平相比較。
19.一種合成的HSV-2蛋白酶底物，它具有通式R1-SEQ IDNO3-R2或R1-SEQ ID NO4-R2。
20.權(quán)利要求19中合成的HSV-2蛋白酶底物，選自SEQ IDNO3；SEQ ID NO4；SEQ ID NO5；SEQ ID NO6；SEQ ID NO7SEQ ID NO8；SEQ ID NO9；SEQ ID NO10；SEQ ID NO11；SEQ ID NO12；SEQ ID NO13；SEQ ID NO14和SEQID NO15。
21.一種選擇性地與一個未經(jīng)加工的HSV-2蛋白酶相結(jié)合的抗體，其中所說的抗體是不能與加工過的HSV-2底物相結(jié)合的。
22.一種區(qū)別HSV-1 DNA和HSV-2 DNA的方法，包括下列步驟a)應(yīng)用擴(kuò)增HSV-1 DNA而非HSV-2 DNA的引物擴(kuò)增樣品中的DNA，和/或應(yīng)用擴(kuò)增HSV-2 DNA而非HSV-1 DNA的引物擴(kuò)增樣品中的DNA，b)檢測擴(kuò)增DNA的存在。
23.一組PCR引物，包含只能用于擴(kuò)增HSV-1 DNA而非HSV-2DNA的核苷酸序列或只能用于擴(kuò)增HSV-2 DNA而非HSV-1 DNA的核苷酸序列。
24.一種區(qū)別HSV-1 DNA和HSV-2 DNA的試劑盒，包括一個含有權(quán)利要求23的一組PCR引物的容器和一個含有一個DNA大小標(biāo)志分子的容器。
25.一種區(qū)別HSV-1蛋白和HSV-2蛋白的方法，包括下列步驟a)應(yīng)用能選擇地與HSV-1蛋白結(jié)合但不能與HSV-2蛋白結(jié)合的抗體進(jìn)行免疫測定，和/或應(yīng)用能選擇地與HSV-2蛋白結(jié)合但不能與HSV-1蛋白結(jié)合的抗體進(jìn)行免疫測定；以及b)檢測結(jié)合抗體的存在。
26.一種能選擇地與HSV-2蛋白結(jié)合但不能與HSV-1蛋白結(jié)合的抗體，和一種能選擇地與HSV-1蛋白結(jié)合而不能與HSV-2蛋白結(jié)合的抗體。
27.一種區(qū)別HSV-1蛋白和HSV-2蛋白的試劑盒，包括一個含有權(quán)利要求26的一個抗體的容器和/或一個含有能選擇地結(jié)合HSV-1蛋白而不能結(jié)合HSV-2蛋白的抗體和/或一個含有能選擇地結(jié)合HSV-2蛋白而不能結(jié)合HSV-1蛋白的抗體的容器。
28.用權(quán)利要求17的方法鑒定的HSV-2蛋白酶抑制劑化合物。
29.用權(quán)利要求18的方法鑒定的抑制HSV-2病毒粒子裝配的化合物。
全文摘要
公開了基本上純的HSV-2UL26基因產(chǎn)物和其片段，包括成熟的HSV-2蛋白酶和其活性片段。公開了在實(shí)質(zhì)上純的HSV-2UL26.5基因產(chǎn)物和其片段，包括成熟的HSV-2衣殼蛋白和功能片段。公開了包括HSV-2UL26基因的全部或一部分和/或HSV-2UL26.5基因的分離到的核酸分子。公開了表達(dá)載體和包含這些核酸分子的宿主細(xì)胞。公開了鑒定抑制HSV-2蛋白酶活性的化合物的方法和鑒定抑制HSV-2病毒粒子裝配的化合物的方法。公開了合成的HSV-2底物。公開了選擇性地與HSV-2蛋白酶加工過的底物相結(jié)合但不與未加工的底物結(jié)合的抗體，或與未加過工的底物結(jié)合但不與加過工的底物結(jié)合的抗體。公開了區(qū)別HSV-1DNA或蛋白與HSV-2DNA或蛋白的方法和試劑盒以及在這些方法和試劑盒中有用的試劑。
文檔編號A61K39/395GK1133594SQ94193881
公開日1996年10月16日 申請日期1994年8月19日 優(yōu)先權(quán)日1993年8月20日
發(fā)明者A·G·迪萊拉, C·M·迪布克 申請人:史密絲克萊恩比徹姆公司