專利名稱：抗gp39抗體及其應用的制作方法
發(fā)明的背景為了誘導抗原特異性T細胞激活和克隆擴充，必須使由抗原呈遞細胞(APC)提供的兩個信號傳遞到靜息T淋巴細胞的表面上(Jenkins，M.and Schwartz，R.(1987)J.Exp.Med.165，302-319；Mueller，D.L.，et al.，(1990)J.Immunol.144，3701-3709；Williams I.R.and Unanue，E.R.(1990)J.Immunol.145，85-93)。賦予免疫反應之特異性的第一個信號是在識別呈現于主要組織相容性復合體(MHC)相關部分中的外來抗原肽之后，通過T細胞受體(TCR)介導的。稱為共刺激信號的第二個信號誘導T細胞增殖并變成功能細胞(Schwartz，R.H.(1990)Science 248，1349-1356)。共刺激信號既不是抗原特異性的，也不是MHC限制性的，并且被認為是由APC表達的一種或多種不同的細胞表面分子提供的(Jenkins，M.K.，et al.(1988)J.Immunol.140，3324-3330；Linsley，P.S.，et al.(1991)J.Exp.Med.173，721-730；Gimmi，C.D.，et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，6575-6579；Young，J.W.，et al.(1992)J.Clin，Invest.90，229-237；Koulova，L.，et al.(1991)J.Exp.Med.173，759-762；Reiser，H.，et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，271-275；Van-Seventer，G.A.，et al.(1990)J.Immunol.144，4579-4586；LaSalle，J.M.，et al.，(1991)J.Immunol.147，774-80；Dustin，M.I.，et al.，(1989)J.Exp.Med.169，503；Armitage，R.J.，et al.，(1992)Nature 357，80-82；Liu，Y.，et al.(1992)J.Exp.Med.175，437-445)。一個參與T細胞激活的共刺激途徑涉及T細胞表面上的分子CD28。該分子可接受由B細胞或其他APC上的配體傳遞的共刺激信號。CD28的配體包括B淋巴細胞激活抗原B7家族的成員，如B7-1和/或B7-2(Freedman，A.S.et al.(1987)J.Immunol.137，3260-3267；Freeman，G.J.et al.(1989)J.Immunol.143，2714-2722；Freeman，G.J.et al.(1991)J.Exp.Med.174，625-631；Freeman，G.J.et al.(1993)Science 262，909-911；Azuma，M.et al.(1993)Nature 366，76-79；Freeman，G.J.et al.(1993)J.Exp.Med.178，2185-2192)。B7-1和B7-2也是存在于激活的T細胞表面的另一種分子CTLA4的配體，但CTLA4在其刺激中的作用尚不明確。
由共刺激信號向T細胞傳遞抗原特異性信號導致T細胞活化，其可包括T細胞增殖和細胞因子分泌。相反，認為在沒有共刺激信號的情況下向T細胞傳遞抗原特異性信號可誘導T細胞中的非反應或無反應性狀態(tài)，從而誘導T細胞中的抗原特異性耐受。
T細胞和B細胞間的相互作用在免疫反應中起著關鍵性作用。誘導對胸腺依賴性抗原的體液免疫需要有由T輔助(以下縮寫為“Th”)細胞提供的“幫助”。雖然提供給B淋巴細胞的某些幫助是由Th細胞釋放的可溶性分子(例如淋巴因子IL-4和IL-5)介導的，但B細胞的激活也需要B細胞和Th細胞間的接觸依賴性相互作用(Hirohata et al.，J.Immunol.，1403736-3744(1988)；Bartlett et al.，J.Immunol.，1431745-1754(1989))。這表明B細胞激活需要有B細胞和Th細胞上細胞表面分子間的專性相互作用。因此T細胞上的分子介導T細胞的接觸依賴性輔助效應子功能。分離的被激活T細胞的質膜可提供B細胞激活所需的輔助功能這一觀察結果，進一步證實B細胞和T細胞上的分子間的接觸依賴性相互作用(Brian，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85564-568(1988)；Hodgkin et al.，J.Immunol.，1452025-2034(1990)；Noelle et al.，J.Immunol.，1461118-1124(1991))。
已鑒定了不成熟和成熟B淋巴細胞表面上的一種稱為CD40的分子，當其與抗體交聯(lián)時可誘導B細胞增殖(Valle et al.，Eur.J.Immunol.，191463-1467(1989)；Gordon et al.，J.Immunol.，1401425-1430(1988)；Gruber et al.，J.Immunol.，1424144-4152(1989))。已分子克隆CD40并鑒定了其性質。(Stamenkovic et al.，EMBO J.，81403-1410(1989))。也已分子克隆了CD40的配體gp39(也稱為CD40配體或CD40L)并鑒定了gp39的性質(Armitage et al.，Nature，35780-82(1992)；Lederman et al.，J.Exp.Med.，1751091-1101(1992)；Hollenbaugh et al.，EMBO J.，114313-4319(1992))。gp39蛋白質在活化的而不是靜息的CD4+Th細胞上表達(Spriggs etal.，J.Exp.Med.，1761543-1550(1992)；Lane et al.，Eur.J.Immunol.，222573-2578(1992)；Roy et al.，J.Immunol.，1511-14(1993))。用gp39基因轉染細胞并在其表面表達gp39蛋白質可激發(fā)B細胞增殖，并且可與其他刺激信號一起誘導抗體產生(Armitage et al.，Nature，35780-82(1992)；Hollenbaughet al.，EMBO J.，114313-4319(1992))。
發(fā)明的概要介導T細胞之接觸依賴性輔助效應子功能的細胞表面分子對于誘導需要T細胞幫助的免疫反應是很重要的。例如，T細胞上的gp39與B細胞上的CD40間的相互作用在激活B細胞對抗原的反應中起著關鍵性作用。本發(fā)明至少是部分地基于介導接觸依賴性輔助效應子功能的細胞表面分子也在T細胞對抗原的反應中起關鍵性作用這一發(fā)現。具體地說，已發(fā)現在適當條件下干擾T細胞上gp39和向T細胞呈遞抗原的細胞上的配體間的相互作用，可誘導抗原特異性T細胞耐受。因此，向T細胞呈遞抗原的細胞需要該細胞上的gp39配體(如CD40)和T細胞上的gp39之間的相互作用，以便能夠提供激活T細胞所需的信號。抑制gp39配體和gp39間的相互作用可阻止T細胞活化并進而誘導抗原特異性T細胞耐受。
本發(fā)明的方法涉及誘導抗原特異性T細胞耐受。該方法包括使T細胞與下述細胞或物質接觸1)向T細胞呈遞抗原并在其表面上有配體的細胞，所說的配體與T細胞表面上介導接觸依賴性輔助效應子功能的受體相互作用；和2)T細胞表面上介導接觸依賴性輔助效應子功能之受體的拮抗物。該拮抗物抑制受體與其配體間的相互作用。T細胞可以在體外與呈遞抗原的細胞和拮抗物接觸，或者說將細胞與拮抗物給予受試對象以在體內誘導T細胞耐受。
在一優(yōu)選實施方案中，介導接觸依賴性輔助效應子功能的T細胞表面上受體是gp39。在該實施方案中，拮抗物是抑制gp39與將抗原呈遞給T細胞之細胞上的它的配體之相互作用的分子。特別優(yōu)選的gp39拮抗物是抗gp39抗體?；蛘?，gp39拮抗物是可溶形式的gp39配體，例如可溶性CD40。將抗原呈遞給T細胞的細胞較好是B細胞。該B細胞可以是小的靜息B細胞。為了誘導T細胞對可溶性抗原的耐受性，可以使B細胞在與T細胞接觸之前(例如在給受試對象使用T細胞之前)與抗原接觸。在另一個實施方案中，為了誘導T細胞對同種抗原的耐受性，用于向T細胞呈遞抗原的細胞是同種異體細胞。同種異體細胞例如可以是同種異體B細胞、同種異體骨髓、同種異體脾細胞或外周血中的同種異體細胞。
本發(fā)明的方法例如可用于誘導T細胞對可溶性抗原的耐受性，誘導T細胞對骨髓移植或其他器官移植的耐受性，或者抑制骨髓移植中的移植物抗宿主疾病。就骨髓移植來說，被移植的骨髓細胞本身被用作本發(fā)明方法中向T細胞呈遞抗原的細胞。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，通過給受試對象使用同種異體骨髓連同gp39拮抗物(例如抗gp39抗體)來促進對骨髓移植物的接受程度。
本發(fā)明進一步涉及能夠抑制B細胞增殖、B細胞分化及T細胞反應的抗人gp39單克隆抗體，和含有這些抗體的藥物組合物。本發(fā)明的抗人gp39單克隆抗體較好用于從總體上調節(jié)免疫反應，特別是用于誘導抗原特異性T細胞耐受性。優(yōu)選的抗體包括實施例6中所述的單克隆抗體3E4、2H5、2H8、4D9-8、4D9-9、24-31、24-43、89-76和89-79。特別優(yōu)選的抗體是單克隆抗體89-76和24-31。分別產生89-76和24-31抗體的89-76和24-31雜交瘤已按照布達佩斯條約的規(guī)定于1994年9月2日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，Parklawn Drive，Rockville，Md.)。89-76雜交瘤的ATCC保藏登記號為＿＿，24-31雜交瘤的ATCC保藏登記號為＿＿。24-31和89-76抗體均為IgG1同種型的。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供IgG1同種型的抗人gp39單克隆抗體(mAb)。本發(fā)明的抗人gp39mAb可抑制標準體外試驗中的B細胞增殖，例如經用。白細胞介素4或可溶性gp39處理B細胞而誘導的B細胞增殖?？谷薵p39抗體較好以大約0.01至5.0μg/ml，更好以大約0.1至2.5μg/ml，最好以大約0.1至1.25μg/ml的IC50(即抑制50％增殖所必需的濃度)抑制B細胞增殖。本發(fā)明的抗人gp39 mAb還可在標準體外試驗中抑制B細胞產生IgG、IgM和/或IgA，例如將B細胞與激活的T細胞(例如經用抗CD3抗體處理而激活的T細胞)一起培養(yǎng)所誘導的Ig產生?？谷薵p39抗體較好以大約0.01至1.0μg/ml，或更好以大約0.01至0.1μg/ml的IC50抑制B細胞產生IgG、IgM和/或IgA。
在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗人gp39 mAb與可被選自下列一組中的單克隆抗體識別的表位結合，這些單克隆抗體是3E4、2H5、2H8、4D9-8、4D9-9、24-31、24-43、89-76和89-79?？谷薵p39 mAb較好與可被單克隆抗體24-31或單克隆抗體89-76識別的表位結合?？捎脴藴式徊娓偁幏ù_定mAb與可被上述任何抗體識別的表位結合的能力。例如，與可被mAb 24-31識別的同樣表位結合的抗體將同標記的24-31競爭與活化之T細胞的結合，而結合了與被mAb 24-31識別的表位不同之表位的抗體則不同標記的24-31競爭與活化之T細胞的結合。
本發(fā)明還提供含本發(fā)明抗人gp39抗體的藥物組合物。這些組合物一般包含抗人gp39 mAb(例如更好是24-31或89-76)和藥學上可接受的載體。
本發(fā)明的再一個方面涉及編碼抗人gp39 mAb的核酸(如編碼抗人gp39 mAb之免疫球蛋白重鏈或輕鏈，或其部分的DNA)?？捎脴藴始夹g從產生抗人gp39 mAb的細胞(如雜交瘤)中分離這樣的核酸。例如，可以用cDNA文庫篩選、PCR擴增或其他常規(guī)技術分別從24-31或89-76雜交瘤中分離編碼24-31或89-76mAb的核酸?？梢杂贸Ｒ?guī)DNA重組技術操作編碼抗人gp39 mAb的核酸，以產生重組抗人gp39 mAb，例如嵌合或人源化抗人gp39 mAb。
此外，可以將編碼抗人gp39 mAb的核酸摻入表達載體中并導入宿主細胞內，以便于表達并產生重組體形式的抗人gp39抗體。
附圖的簡單描述

圖1是圖解說明經體內抗gp39處理而誘導的T細胞對蛋白質抗原的耐受性。在加或不加抗gp39抗體的情況下，用以前體內給予的抗原攻擊脈沖輸送抗原的B細胞后，于體外檢測T細胞反應。
圖2是圖解說明經體內抗gp39處理而誘導的T細胞對同種異體B細胞的耐受性。在加或不加抗gp39抗體的情況下，用以前體內給予的同種異體B細胞攻擊后體外檢測T細胞反應。
圖3A是圖解說明當用抗gp39抗體處理接受體動物時對同種異體B細胞誘導的初次同種異體CTL反應的抑制作用。圖中給出的各組分別是未經處理的小鼠(■)、經抗gp39處理的小鼠(△)和未致敏的Balb/c小鼠的脾細胞(●；用作陰性對照效應細胞)。
圖3B和3C是圖解說明當用抗gp39抗體處理接受體動物時對LPS處理的B細胞母細胞誘導的初次同種異體CTL反應的抑制作用。B和C代表兩個獨立的實驗。所給出的各組分別是沒有處理的體內LPS母細胞(▲)、用抗gp39處理的體內LPS母細胞(●)、沒有處理的體內靜息B細胞(○)和用抗gp39處理的體內靜息B細胞(□)。
圖4A是圖解說明當用抗gp39抗體處理接受體動物時，對同種異體B細胞誘導的再次同種異體CTL反應的抑制作用。所示的各組效應子是用Hlg處理的接受體(●)、首次試驗的Balb/c(▲)和抗gp39處理的接受體(■)。相應的同源反應(用Balb/c細胞刺激的Balb/c細胞)用空心符號表示。
圖4B是圖解說明抗gp39處理對同種異體CTL反應之抑制作用的特異性。所顯示的各組分別是由首次試驗Balb/c細胞(○)或經給予H-2b單元型B細胞及抗gp39而對H-2b產生耐受的細胞(■)抗H-2k靶的CTL反應。
圖5所示直方圖說明在用或不用抗gp39抗體處理的情況下，在給宿主移植骨髓后的不同時間，已接受了骨髓移植物的宿主體內的脾細胞數目。
圖6A是圖解說明在體內用或不用抗gp39處理的情況下，從接受了骨髓移植物的小鼠體內除去脾臟后，脾臟B細胞于體外產生的IgA的濃度。除去脾臟B細胞并在骨髓移植后第7或14天檢測抗體產生量。
圖6B是圖解說明在體內用或不用抗gp39處理的情況下，從接受了骨髓移植物的小鼠體內除去脾臟后，脾臟B細胞于體外產生的IgG1的濃度。除去脾臟B細胞并在骨髓移植后第7或14天檢測抗體產生量。
圖7A是圖解說明在骨髓移植后的不同時間，在體內用或不用抗gp39處理的情況下，接受骨髓移植物的小鼠體內的血清IgE濃度。
圖7B是圖解說明在骨髓移植后的不同時間，在體內用或不用抗gp39處理的情況下，接受骨髓移植物的小鼠體內的血清抗DNA抗體濃度。
圖8A和8B是圖解說明在體內用或不用抗gp39處理的情況下，以不同的效應細胞對靶細胞比例(E∶T比例)，得自己接受了骨髓移植物的小鼠的細胞毒性T細胞的體外溶細胞活性。A和B代表兩個獨立的實驗。
圖9A、9B和9C是顯示用CD40Ig(A)、mAb 4D9-8(B)和mAb 4D9-9(C)著染被激活的人外周血淋巴細胞6小時后的流式細胞分布圖。
圖10A、10B和10C是顯示在被mAb 4D9-8(A)、mAb 4D9-9(B)或CD40Ig(C)著染的環(huán)孢菌素A(cycloporin A)存在下將培養(yǎng)的被激活之人外周血淋巴細胞著染6小時后的流式細胞分布圖。
圖11A和11B是顯示在未標記的mAb 4D9-8(A)或未標記的mAb4D9-9(B)存在下用CD40Ig著染被激活的人外周血淋巴細胞6小時后的流式細胞分布圖。
圖12是圖解說明當在抗人gp39 mAb 4D9-8、4D9-9、24-31、24-43、89-76或89-79存在下培養(yǎng)細胞時，對由可溶性gp39和IL-4誘導的人B細胞增殖的抑制作用。
圖13是圖解說明當在抗人gp39 mAb 24-31或89-79存在下培養(yǎng)細胞時，對同種異體特異性混合的淋巴細胞反應的抑制作用。
發(fā)明的詳細描述本發(fā)明著意描述誘導抗原特異性T細胞耐受性的方法。該方法包括使T細胞與1)向T細胞呈遞抗原并在其細胞表面上有配體的細胞-所說的配體與T細胞表面上介導接觸依賴性輔助效應子功能的受體相互作用，和2)T細胞上的抑制受體與配體相互作用之受體的拮抗物接觸。如本文所限定的，介導接觸依賴性輔助效應子功能的分子或受體是在Th細胞上表達的，并與效應細胞(如B細胞)上的配體相互作用的分子或受體，其中受體與其配體的相互作用是產生效應細胞反應(如B細胞激活)所必需的?，F已發(fā)現，這些分子除參與效應細胞反應外，還參與T細胞對抗原的反應。
介導接觸依賴性輔助效應子功能的T細胞上的優(yōu)選分子是gp39。因此，在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法包括使T細胞與呈遞抗原的細胞和gp39拮抗物接觸。因此，用于呈遞抗原的細胞是與T細胞表面上的gp39相互作用以激活T細胞(即向T細胞呈遞T細胞活化所必需的信號)的細胞。例如，該細胞可以是表達CD40并向T細胞呈遞抗原的B細胞。通過抑制呈遞抗原的細胞上的gp39配體與T細胞上的gp39間的相互作用，T細胞便不被所呈遞的抗原激活，而是變得更加耐受抗原。
本發(fā)明的方法可用于在體內誘導T細胞對抗原的耐受性。例如，可以給受試對象使用向T細胞呈遞抗原的細胞連同在介導接觸依賴性輔助效應子功能的T細胞上表達之受體的拮抗物(如gp39拮抗物)。本發(fā)明的方法還可通過使T細胞在體外與向T細胞呈遞抗原的細胞連同在介導接觸依賴性輔助效應子功能的T細胞上表達之受體的拮抗物(如gp39拮抗物)接觸，進一步用于在體外使T細胞易于耐受抗原。然后可將體外耐受的T細胞用于受試對象。本發(fā)明的方法可用于使受試者體內T細胞耐受特異性抗原，或被移植的細胞，如同種異體骨髓(如在骨髓移植中)。本發(fā)明的方法還可用于在骨髓移植中抑制移植物抗宿主疾病。
本發(fā)明的各個方面將在下面小節(jié)中作更詳細地描述。I.gp39拮抗物按照本發(fā)明的方法，將gp39拮抗物與T細胞接觸(例如給受試對象施用的)以干擾T細胞上的gp39與抗原呈遞細胞，如B細胞上的gp39配體相互作用。gp39拮抗物被限定為干擾這種相互作用的分子。gp39拮抗物可以是抗gp39的抗體(例如抗gp39的單克隆抗體)、抗gp39之抗體的片段或衍生物(例如Fab或F(ab)′2片段、嵌合抗體或人源化抗體)、可溶形式的gp39配體(例如可溶性CD40)、可溶形式的gp39配體的融合蛋白質(例如可溶性CD40Ig)，或破壞或干擾gp39-CD40相互作用的藥劑。
A.抗體可以用在哺乳動物體內引發(fā)抗體反應的免疫原形式的gp39蛋白質或蛋白質片段(如肽片段)免疫哺乳動物(例如小鼠、倉鼠或兔)。也可以使用在其表面表達gp39的細胞作為免疫原?？纱玫拿庖咴兓膅p39蛋白質或蛋白質片段?？梢杂贸Ｒ?guī)純化技術從表達gp39的細胞中純化gp39；可以在宿主細胞如細菌或哺乳動物細胞系中表達gp39 cDNA(Armitage et al.，Nature，35780-82(1992)；Lederman et al.，J.Exp.Med.，1751091-1101(1992)；Ho1lenbaugh et al.，EMBO J.，114313-4319(1992))，并可用標準技術從細胞培養(yǎng)物中純化gp39蛋白質?？梢允褂靡阎椒?例如F-moc或T-boc化學合成技術)，基于gp39的氨基酸序列(如在Armitage et al.，Nature，35780-82(1992)；Ledermanet al.，J.Exp.Med.，1751091-1101(1992)；Hollenbaughet al.，EMBO J.，114313-4319(1992)中公開的)合成gp39肽。賦予蛋白質以免疫原性的技術包括與載體連接或本領域已知的其他技術。例如，可以在佐劑存在下施用蛋白質?？梢詸z測血漿或血清中的抗體滴度以監(jiān)視免疫進程?？墒褂脴藴蔈LISA或其他免疫檢測法及作為抗原的免疫原來估計抗體水平。
免疫后，可得到抗血清并在必要時從血清中分離多克隆抗體。為了產生單克隆抗體，可以從被免疫動物體內收獲抗體生成細胞(淋巴細胞)并用常規(guī)體細胞融合方法與骨髓瘤細胞融合，從而使這些細胞永生化并產生雜交瘤細胞。這些技術是本領域已知的。例如，最初由Kohler和Milstein建立的雜交瘤技術(Nature(1975)256495-497)及其他一些技術，例如人B細胞雜交瘤技術(Kozbar et al.，Immunol.Today(1983)472)、用于產生人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(Cole et al.，Monoclonal Antibodies in CancerTherapy(1985)Allen R.Bliss，Inc.，pp.77-96)，及篩選組合抗體文庫的技術(Huse et al.，Science(1989)2461275)?？捎妹庖呋瘜W方法篩選雜交瘤細胞以產生與蛋白質或肽特異反應的抗體以及所分離的單克隆抗體。
本文所用的術語“抗體”意欲包括其可與gp39蛋白質或其肽或gp39融合蛋白質特異反應的片段?？墒褂贸Ｒ?guī)技術分段切割抗體并篩選出那些可以與上述完整抗體一樣的方式被利用的片段。例如，可以用胃蛋白酶處理抗體以產生F(ab′)2片段?？梢蕴幚硭玫降腇(ab′)2片段，還原二硫橋鍵以產生Fab′片段。本發(fā)明的抗體還欲包括具有抗gp39部分的雙特異性分子和嵌合分子。
當將在非人受試對象體內產生的抗體用于人體治療時，它們可在不同程度上被識別為外來物質并可在病人體內產生免疫反應。一種減小或消除這一問題的辦法(其較好是達到普遍性免疫抑制)是產生嵌合抗體衍生物，即產生與非人動物可變區(qū)和人恒定區(qū)結合的抗體分子。嵌合抗體分子例如可包括來自小鼠、大鼠或其他種動物抗體的抗原結合區(qū)與人恒定區(qū)。已描述過多種制備嵌合抗體的方法并可將其用于制備含有識別gp39之免疫球蛋白可變區(qū)的嵌合抗體(例如參見Morrisonet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8l5851(1985)；Takedaet al.，Nature 314452(1985)Cabilly et al.，美國專利No.4,816,567；Boss et al.，美國專利No.4,816,397Tanaguchiet al.，歐洲專利公開EP171496；歐洲專利公開0173494；英國專利GB2177096B)?？赏@樣的嵌合抗體在人受試對象體內比相應的非嵌合抗體有較小的免疫原性。
為了人類治療目的，可以通過產生人可變區(qū)嵌合體進一步使與gp39蛋白質或肽特異性反應的單克隆或嵌合抗體人源化，該人源化抗體中一部分可變區(qū)，特別是抗原結合區(qū)域的保守的構架區(qū)是來源于人的，而只有高可變區(qū)是非人來源的?？梢杂帽绢I域中已知的任何一種技術制備這種改變的免疫球蛋白分子(例如，Teng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，807308-7312(1983)；Kozbor et tl.，Immunology Today，47279(1983)；Olsson et al.，Meth.Enzymol.，923-16(1982))，并且較好按照PCT公開WO92/06193或EP0239400中公開的技術制備。例如可以由例如ScotgenLimited，2 Holly Road，Twickenham，Middlesex，Great Britain產業(yè)化生產人源化抗體。
產生對gp39蛋白質或肽有反應性的特異性抗體或抗體片段的另一種方法是，用gp39蛋白質或肽篩選在細菌中表達的編碼免疫球蛋白基因或其部分的表達文庫。例如，可以隨用噬菌體表達文庫在細菌中表達完整Fab片段、VH區(qū)和FV區(qū)(例如參見Ward et a1.，Nature，341544-546(1989)；Huse et al.，Science，2461275-1281(1989)；McCafferty et al.，Nature，348552-554(1990))。用例如gp39肽篩選這樣的文庫可以鑒定與gp39反應的免疫球蛋白片段。另外，可以用SCID-hu小鼠(可購自Genpharm)產生抗體或其片段。
實施例6中將進一步詳細描述產生抗gp39，包括人gp39和小鼠gp39單克隆抗體的方法學，以及用于本發(fā)明方法的適當單克隆抗體。本發(fā)明的特別優(yōu)選的抗人gp39抗體是分別由雜交瘤24-31和89-76產生的mAb 24-31和mAb 89-76。分別產生89-76和24-31抗體的89-76和24-31雜交瘤已按布達佩斯條約的規(guī)定于1994年9月2日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection，Parklawn Drive，Rockville，Md.)。89-76雜交瘤的保藏登記號為No.＿＿，24-31雜交瘤的保藏登記號為No.＿＿。
可按照標準重組DNA技術操作編碼抗gp39抗體的核酸(如DNA)以產生重組抗gp39抗體，如嵌合和人源化抗體。因此，本發(fā)明的另一個方面涉及分離的編碼與gp39特別是人gp39反應之免疫球蛋白重或輕鏈或其部分的核酸分子。編碼免疫球蛋白的核酸可編碼免疫球蛋白輕或重鏈可變區(qū)，其中有或沒有與之連接的重或輕鏈恒定區(qū)(或其部分)?？梢杂脴藴始夹g從產生抗人gp39 mAb的細胞(如雜交瘤)中分離這樣的核酸。例如，可以用cDNA文庫篩選、PCR擴增及其他標準技術分別從24-31或89-76雜交瘤中分離編碼24-31或89-76mAb的核酸。在分離及可能的進一步操作之后，可以將編碼抗人gp39 mAb的核酸摻入表達載體中并導入宿主細胞內，以便于表達和生產重組形式的抗人gp39抗體。
B.gp39的可溶性配體可用于誘導T細胞耐受性的其他gp39拮抗物是可溶形式的gp39配體。gp39的單價可溶性配體如可溶性CD40可以結合gp39，從而抑制gp39與B細胞上的CD40間的相互作用。術語“可溶性”是指配體與細胞膜不能持久結合?？梢杂没瘜W合成或優(yōu)選地用重組DNA技術，例如只表達配體的細胞外區(qū)域(沒有跨膜和胞槳區(qū)域)來制備可溶性gp39配體。優(yōu)選的可溶性gp39配體是可溶性CD40。另外，可溶性gp39配體也可以是融合蛋白質形式的。這樣的融合蛋白質包含與第二分子連接的至少一部分的gp39配體。例如，CD40可以作為與免疫球蛋白融合的融合蛋白質(即CD40Ig融合蛋白質)被表達。在一個實施方案中，所產生的融合蛋白質包含CD40分子之細胞外區(qū)域部分的氨基酸殘基，所說部分與相當于絞鏈區(qū)，免疫球蛋白重鏈的CH2和CH3區(qū)如Cγ1之序列的氨基酸殘基結合以形成CD40Ig融合蛋白質(例如參見Linsley et al.(1991)J.Exp.Med.1783721-730；Capon et al.(1989)Nature 337525-531；Capon，美國專利5,116,964)。可以用化學合成方法，或較好地用基于CD40的cDNA(Stamenkovic et al.，EMBO J.，81403-1410(1989))的重組DNA技術生產融合蛋白質。II.誘導抗原特異性耐受的細胞本發(fā)明至少部分地基于這一發(fā)現在gp39拮抗物存在下當抗原呈遞于T細胞時，由呈遞抗原并與gp39相互作用的細胞向T細胞呈遞抗原將導致抗原特異性T細胞耐受。能夠以這種機制誘導T細胞耐受的細胞包括那些向T細胞呈遞抗原，并需要該細胞上的gp39配體與T細胞上的gp39相互作用，以向T細胞傳遞T細胞活化所需的信號的細胞。抑制這種相互作用將阻止T細胞被呈遞的抗原激活，因而會誘導T細胞中的抗原特異性耐受。通過gp39干擾T細胞活化可阻止對抗原呈遞細胞上的共刺激分子(例如抗原呈遞細胞(如B細胞)上的B7家族分子)的誘導作用，以便使抗原呈遞細胞只在沒有共刺激信號的情況下傳遞抗原信號，從而誘導耐受性。
因此，在本發(fā)明的方法中，給接受體對象施用呈遞抗原的細胞。本文中使用的短語“呈遞抗原的細胞”和“抗原呈遞細胞”可以互換使用，并意欲包括向接受體的T細胞呈遞抗原的細胞，例如B淋巴細胞、“專業(yè)”抗原呈遞細胞(如單核細胞、樹枝狀細胞、郎漢氏細胞)及其他向免疫細胞呈遞抗原的細胞(如角質細胞、上皮細胞、星形細胞、成纖維細胞、少突膠質細胞)。此外，抗原呈遞細胞較好地有較低的刺激接受體T細胞中共刺激信號的能力。例如，呈遞抗原的細胞可能不表達或只以低水平表達共刺激分子如B7家庭的蛋白質(如B7-1和B7-2)?？梢允褂贸Ｒ?guī)技術，例如其中利用抗共刺激分子之抗體的流式細胞計數法估測將用于本發(fā)明方法中之潛在抗原呈遞細胞上的共刺激分子的表達。
用于誘導T細胞耐受的優(yōu)選的抗原呈遞細胞是淋巴樣細胞，例如外周血淋巴細胞或脾細胞。用于誘導T細胞耐受的優(yōu)選淋巴樣細胞是B細胞?？捎贸Ｒ?guī)細胞分離技術從混合的細胞群體(如外周血或脾臟中的其他細胞類型)中純化B細胞。例如，可以在塑料平皿上培養(yǎng)脾細胞除去貼壁細胞并回收非貼壁細胞群體?？梢酝ㄟ^用抗T細胞抗體(如抗Thy 1.1和/或抗Thy 1.2)和補體處理從混合的細胞群體中除去T細胞。在一個實施方案中，使用靜息淋巴樣細胞，優(yōu)選用靜息B細胞作為抗原呈遞細胞。可用本領域已知的技術，例如基于它們的小體積和密度的技術分離靜息淋巴樣細胞如靜息B細胞。例如可用Tony，H-P和Parker，D.C(J.Exp.Med.161222-241(1985))描述的反流離心淘析(counterflow centrifugal elutriation)技術分離靜息淋巴樣細胞。使用反流離心淘析技術，以14-19ml/分鐘，較好以19ml/分鐘(3,200rpm)的流速收集各部分而得到耗盡可激活T細胞反應之細胞的小的靜息淋巴樣細胞群體。另外，也可以用不連續(xù)密度梯度離心法，例如使用Ficoll或Percoll梯度分離小的靜息淋巴細胞(如B細胞)，并在離心后得到含有小的靜息淋巴細胞的細胞層。還可以用常規(guī)技術(如免疫熒光法)檢測活化的B細胞之表面上共刺激分子如B7-1和/或B7-2的表達，以從活化B細胞中區(qū)分出小的靜息B細胞。
可以在與T細胞接觸之前(在給受試對象施用之前)使抗原呈遞細胞如B細胞與抗原(如可溶性蛋白質)接觸，并在gp39拮抗物存在下利用讀細胞向T細胞呈遞抗原，以誘導T細胞對抗原的特異性耐受(參見實施例1)。另外，可以使用同種異體細胞作為抗原呈遞細胞誘導對同種抗原的耐受性(參見實施例2和3)。同種異體細胞向T細胞呈遞同種異體蛋白質的抗原片段。在一個實施方案中，同種異體細胞是同種異體淋巴樣細胞，如同種異體B細胞。另外，可用外周血中的細胞(如外周血淋巴細胞)、脾細胞或骨髓細胞使受試對象獲得耐受性。在骨髓移植的情況下，將供體骨髓細胞本身用作為與T細胞接觸(如施予受試對象)的抗原呈遞細胞。因此，可以將同種異體骨髓與gp39拮抗物一起聯(lián)合施用，以誘導接受體內對骨髓的耐受性并阻止移植物抗宿主疾病(參見實施例4和5)。III.細胞和gp39拮抗物的施用根據本發(fā)明，可以給受試對象聯(lián)合施用gp39拮抗物和向T細胞呈遞抗原并表達與T細胞上gp39相互作用之配體的細胞，以誘導抗原性異性T細胞耐受。在一個優(yōu)選實施方案中，可合并或同時施用抗原呈遞細胞和gp39拮抗物?；蛘?，可以在施用細胞之前施用gp39拮抗物，例如當拮抗物是有長半壽期的抗體時。在將施用的細胞是骨髓細胞(其中期望抑制移植物抗宿主疾病)的情況下，可將供體骨髓與宿主的B細胞及gp39拮抗物在體外一起保溫，以在將骨髓移入接受宿主體內之前使供體T細胞對骨髓產生耐受。必要時，可在骨髓移植期間或之后使gp39處理過程在體內繼續(xù)進行。在接受骨髓或其他器官移植物的受試對象體內，可以經用一種在器官或骨髓細胞轉移之前誘導同種異體耐受的方法，處理受試對象以誘導其對移植物的同種異體耐受。這種預處理方法可包括給受試對象施用供體的細胞以及gp39拮抗物。供體的細胞例如可以是B細胞、全外周血或其某些部分(如外周血淋巴細胞或小的靜息淋巴細胞或B細胞)。
已發(fā)現，施用一劑抗原呈現細胞(與拮抗物合用)便足以誘導T細胞耐受(參見有關實施例)。施用抗原呈遞細胞的數目可依據所用細胞的類型、組織或器官移植物的類型、接受體的體重和一般狀況及其他本領域技術人員已知的可變因素的不同而有所變化?？捎杀绢I域普通技術人員按常規(guī)方法(例如使用實施例中所述的檢測法)確定用于本發(fā)明方法中之細胞的數目。以一種適于誘導接受體耐受性的形式和途徑施用細胞?？蓪⒓毎釉谏砩峡山邮艿娜芤褐腥缇彌_鹽水或類似載體中施用。較好以靜脈內途徑施用細胞。
為誘導T細胞耐受性，以適于體內藥理學給藥的生理相容形式給受試對象施用本發(fā)明的拮抗物。所說的“適于體內給藥的生理相容形式”是指待施用之拮抗劑的形式，其中蛋白質的治療效應勝過任何毒性作用。術語“受試對象”意欲包括可在其體內引發(fā)免疫反應的活的生物體，例如哺乳動物。這些受試對象的例子包括人、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉基因物種?？梢匀魏嗡幚硇问剑芜x加在藥物可接受的載體內施用gp39拮抗物。施用治療活性量拮抗物限定為在一定劑量和用藥療程下，為達到預期效果所需的有效量。例如，gp39拮抗物的治療活性量可依據個體的病情、年齡、性別和體重，以及拮抗物在個體體內引發(fā)預期反應的能力等因素的不同而不同?？烧{整療程和劑量以提供最適治療反應。例如，可根據治療狀態(tài)的急迫情況每天分幾次施用或按比例降低劑量。
可以按常規(guī)方式如注射(皮下、靜脈內等)、口服、吸入、透皮或直腸用藥等方式施用活性化合物(拮抗物)。根據給藥途徑的不同，可以用某種材料包被活性化合物，以防止化合物遭受到那些可能使化合物失活的酶、酸及其他天然條件的破壞作用。優(yōu)選的給藥途徑是靜脈內注射。
為了以非胃腸道外途徑施用gp39拮抗物，用某種防止其失活的材料包被拮抗物或與之共同施用可能是必要的。例如，可將拮抗劑加在適當的載體或稀釋劑中施用，與酶抑制劑合用或加在適當的載體如脂質體中施用。藥學上可接受的稀釋劑包括鹽水和緩沖水溶液。酶抑制劑包括胰腺胰蛋白酶抑制劑、二異丙基氟磷酸酯(DEP)和trasylol。脂質體包括水包油包水型(水/油/水)型乳劑及常規(guī)脂質體(Strejan et al.，(1984)J.Neuroimmunol.727)。
該活性化合物也可以經胃腸道外或腹腔內途徑給藥。還可以在甘油、液態(tài)聚乙二醇、和其混合物及油中制成分散劑。在常規(guī)儲存和使用條件下，這些制劑可含有防止微生物生長的防腐劑。
適于注射使用的藥物組合物包括無菌水溶液(此時是水溶性的)或分散劑，和用于臨時制備無菌可注射溶液和分散劑的無菌粉末。在所有這些情況下，組合物都必須是無菌的并且必須是容易注射的液體。其在制造和儲存條件下必須是穩(wěn)定的，并且必須能阻止微生物如細菌和真菌的污染。載體可以是溶劑或含有例如水、乙醇、多元醇(如丙三醇、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)的分散介質，及其適當的混合物。例如借助使用卵磷酯等復蓋層、維持分散劑中固形物的必要顆粒大小及使用表面活性劑，以保持適當的流動性?？墒褂萌鏿arabens、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸、乙基汞硫代水楊酸鈉等各種抗細菌劑和抗真菌劑來達到抑制微生物的作用。在許多情況下，組合物中優(yōu)選包含等滲劑，例如糖、甘露醇和山梨醇等聚醇、氯化鈉?？稍诮M合物中加入例如單硬脂酸鋁和明膠等延遲吸收的制劑來延長可注射組合物的吸收。
可以按需要將活性化合物(如gp39的拮抗物)以所需量與一種或幾種上述成分一起摻入到適當的溶劑中，然后過濾除菌以制得無菌可注射溶液。一般說來，可將活性化合物摻入到包含基本分散介質及如上所述之其他必需組分的無菌載體中，以制得分散劑。就用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末來說，優(yōu)選的制備方法是經真空干燥和冷凍干燥以產生活性成分(如拮抗物)以及來自其以前無菌過濾之溶液的其他所需成分的粉末。
當按上述方法適當地保護活性化合物時，該蛋白質可以例如與惰性稀釋劑或某種可同化的可食載體一起口服給藥。本文所說的“藥學上可接受的載體”包括任何和所有溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌和抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑等。這些介質和制劑對藥理學活性物質的應用是本領域中已知的。除非某種常規(guī)介質或制劑是與活性化合物不相容的，否則均可考慮將其應用于本發(fā)明的治療組合物中。也可以將附加的活性化合物摻入該組合物中。
為了易于給藥和保持劑量的均一性，以劑量單位形式配制胃腸道外給藥組合物是特別有利的。本文所說的“劑量單位形式”是指對于被治療的哺乳動物受試對象來說適于作為單一劑量的物理上分立的單位；每個單位含有經過計算的預定量的活性化合物，從而可與必要的藥物載體結合以產生所需的治療效果。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格由下列因素指定并直接取決于這些因素(a)活性化合物的獨特性質和將要達到的特定治療效果和(b)為處理個體敏感性問題而提出的摻合這些活性化合物的本領域特有限制。
除了T細胞的體內耐受化外，本發(fā)明還欲包括例如在gp39拮抗物存在下使T細胞與抗原呈遞細胞接觸以誘導T細胞的體外耐受。例如，可從受試對象體內得到T細胞，經與抗原呈遞細胞和拮抗物一起培養(yǎng)而使之產生體外耐受，然后重新施用于受試對象。IV.本發(fā)明方法的應用本發(fā)明的方法可應用于誘導T細胞對多種抗原的耐受性。例如，如實施例1中所述，可誘導T細胞對可溶性抗原(如可溶性蛋白質)的耐受?？梢允筎細胞耐受與自身免疫病或與異常免疫反應有關之疾病的抗原。例如在一個實施方案中，抗原是自身抗原。在另一個實施方案中，抗原是變應原?；蛘?，可以使T細胞耐受外來細胞上表達的抗原(參見實施例2至5)。因此，在另一個實施方案中，抗原是同種抗原或異種抗原。誘導T細胞對同種抗原和異種抗原的耐受是移植中的特殊應用，例如用于抑制移植物接受體對供體移植物如組織或器官移植物或骨髓移植物的排斥。另外，骨髓移植物內供體T細胞的耐受化可用于抑制移植物抗宿主疾病(參見實施例5)。
下列實施例旨在進一步舉例說明本發(fā)明而不構成對本發(fā)明的限制。本申請通篇所列出的所有參考文獻、專利和已公布的專利申請的內容均摻入本文作為參考。
實施例1誘導抗原特異性耐受方法用KLH施加脈沖的脾B淋巴細胞免疫小鼠5天。初次免疫期間不處理或用抗gp39抗體MR1處理動物。初始免疫后5天，局部(爪墊)注射加在完全弗氏佐劑(CFA)中的KLH以攻擊小鼠。5天后殺死小鼠，切除引流淋巴結并在體外檢測T細胞對KLH的增殖反應。
結果用經抗原脈沖的活化的B淋巴細胞免疫動物并在其后用同樣抗原攻擊，產生明顯的抗免疫抗原的免疫反應。圖1中顯示根據抗原特異性T淋巴細胞增殖情況所測得的反應水平。在初次免疫期間用抗gp39抗體處理動物，導致在體外抗原攻擊后抗原特異性T淋巴細胞的無反應性。與得自未經處理之動物的淋巴結的T淋巴細胞相比，得自用抗gp39抗體處理之動物的淋巴結的T淋巴細胞顯示降低了增殖能力。
實施例2誘導T細胞對同種異體細胞的耐受方法用DBA/2(H-2b)小鼠的同種異體脾臟B細胞免疫Balb/c(H-2d)小鼠。免疫后用抗gp39抗體MR1處理，或不處理動物5天。第6天殺死動物并取脾臟。然后將得自抗gp39抗體處理的或未經處理之動物的脾細胞在體外與未刺激的或經過照射的DBA/2脾細胞一起培養(yǎng)。開始培養(yǎng)后第3天檢測對此再次同種異體刺激的增殖反應。
結果當在體外用同樣細胞攻擊5天后，經同種異體脾臟B細胞免疫之動物的T淋巴細胞產生了強的增殖反應(圖2)。但在繼后體外攻擊后，經同種異體脾臟B細胞免疫的并用抗gp39抗體處理之小鼠的T淋巴細胞則表現有降低的增殖能力。與對照組未處理的小鼠相比，抗gp39抗體處理的小鼠表現對攻擊的反應性降低約50％。
實施例3抗gp39處理干擾對同種異體B細胞之CTL反應的產生本實施例中研究gp39在產生細胞毒性T細胞(CTL)中的作用。為了估計gp39在CTL產生中的體內功能，檢測抗gp39處理對經用同種異體B細胞免疫引起之同種異體特異性CTL產生的影響。確定抗gp39處理對初次和再次CTL反應的影響。
初次CTL反應為了試驗抗gp39是否能阻止同種異體B細胞引發(fā)體內同種異體特異性CTL反應，給接受體小鼠施用加有或不加抗gp39的同種異體B細胞(排除T細胞的脾細胞)。用借助抗Thy 1.2(從ATCC克隆HO13.4制備的腹水)和兔補體處理而排除了T細胞的C57BL/6(雌性，6-8周齡，Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)脾細胞(30－50×106個)免疫Balb/c小鼠(雌性，6-8周齡，Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)。然后不處理或用抗gp39處理這些接受體小鼠5天(第0、2和4天，250mg/接受體動物)。第5天，切除脾臟并使用4小時鉻釋放檢測法檢測CTL反應。使用未致敏Balb/c小鼠的脾細胞作為陰性對照效應細胞。所使用的靶細胞是E雌性K1(H-2b，衍生于C57BL/6品系的T細胞淋巴瘤)和P815(H-2d，衍生于DBA/2J品系的肥大細胞瘤)。洗51Cr標記的靶細胞并按每孔1×104個細胞鋪敷在以100∶1、20∶1和4∶1的效應子∶靶(E∶T)比例加入效應細胞的96孔平板中。簡單離心平板并在5％CO2保溫箱中37℃保溫4小時。再次離心平板并從各孔中收集100ml無細胞上清以進行γ計數(LKB Clinigamma，Wallace Inc.，Gaithersburg，MD)。百分特異性溶胞限定為(a－b)/c，其中a是由加效應細胞一起保溫之靶細胞釋放的cpm，b是由只加培養(yǎng)基保溫之靶細胞釋放(自發(fā)釋放)的cpm，c是可從靶細胞凍融釋放的cpm(約為所摻入之總cpm的80％)。P815靶細胞沒有被所試驗的任何細胞樣品裂解。圖3A中圖解顯示了E雌性K1靶的結果，其中所示出的各組是未經處理的小鼠(■)、經抗gp39處理的小鼠(△)和未致敏Balb/c小鼠的脾細胞(●；用作陰性對照效應細胞)。結果證明，接受了抗gp39和同種異體細胞的小鼠在對同種異體B細胞反應中沒有產生體內初次CTL反應。相反，在沒有抗gp39的情況下，同種異體B細胞使接受體小鼠產生對同種異體抗原的敏感性并誘導了實質性CTL反應。
為了確定抗gp39是否只能放大未活化的脾臟B細胞的致耐受效應，在加有或沒有加抗gp39的情況下用LPS激活的B細胞刺激CTL反應。按上述方法制備C57BL/6小鼠的B細胞并在加有或不加脂多糖(LPS；50mg/ml；Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)的條件下培養(yǎng)2天。然后收獲細胞，徹底洗滌并腹膜注射(30－50×106個)到Balb/c接受體小鼠體內。在第0、2和4天按上述方法用抗gp39處理接受體小鼠或不作此處理。第5天，切除脾臟并按上述方法檢測CTL反應。圖3B(頂部和底部框)中顯示了兩個獨立的實驗的結果。所給出的各組是沒有處理的體內LPS母細胞(▲)、用抗gp39處理的體內LPS母細胞(●)、沒有處理的體內靜息B細胞(○)和用抗gp39處理的體內靜息B細胞(□)。結果表明，雖然不是完全的，但抗gp39處理還是降低了對同種異體LPS母細胞的初次CTL反應。
再次CTL反應為了檢查施用抗gp39和同種異體B細胞對CTL形成的影響，體外刺激經處理和未經處理之小鼠的脾細胞并研究CTL反應的程度。按上述方法用C57BL/6衍生的B細胞體內致敏Balb/c小鼠。分離抗gp39和對照倉鼠Ig(HIg)處理之動物的脾細胞，并將5×106個細胞/ml(“反應者”)與密度為5×106個刺激細胞/ml的各種絲裂霉素C(Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)處理(2.5mg/ml，37℃)的不同品系小鼠的脾臟B細胞(經用抗Thy 1.2+補體處理而制備的)一起培養(yǎng)5天。刺激細胞組分別是指示再次同種異體反應和初次同源反應的C57BL/6(H-2b)和Balb/c(H-2d)。在新鮮制備的致敏RPMI-1640培養(yǎng)基(Bio Whittaker，Walkersville，MD)、1×105M 2-巰基乙醇(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)、2mM L-谷氯酰胺(Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)、500U/ml青霉素和5000U/ml鏈霉素(SigmaDiagnostics，St.Louis，MO)中培養(yǎng)刺激細胞和反應細胞。5天后，收獲反應細胞并在密度梯度上離心除去死細胞。在如上文所述的CTL檢測法中使用所得到的活細胞作為效應細胞。靶包括E雌性K1(H-2b，得自C57BL/6品系的T細胞淋巴瘤)和P815(H-2d，得自DBA/2J品系的肥大細胞瘤)。結果圖解顯示于圖4A中。所顯示的各組同種異體刺激的效應于是Hlg處理的接受體(●)；首次試驗的Balb/c(▲)和抗gp39處理的接受體(■)。空心符號表示相應的同源反應(經Balb/c細胞刺激的Balb/c細胞)。正如所期望的，在沒有抗gp39處理的情況下體內用同種異體除去T細胞的脾細胞(H-2b)免疫小鼠后在體外產生了強烈的再次CTL反應。如果給小鼠體內施用抗gp39則沒有再觀察到增高的再次抗H-2bCTL反應。
為了確定抗gp39處理對CTL反應之抑制作用的特異性，在CTL檢測法中使用B10BR(H-2k)脾臟B細胞作為刺激細胞并用SL8(H-2k，衍生于AKR品種的自發(fā)性T細胞淋巴瘤)作為靶，分析上述脾細胞培養(yǎng)物的抗H-2k同種異體反應(第三組同種異體反應)。結果示于圖4B中。圖中所示的各組是首次試驗的Balb/c(○)和抗gp39處理的接受體(■)。結果證明經用抗gp39處理抑制抗H2b特異性CTL反應是同種異體特異性的，因為施用H-2b脾細胞和抗gp39并未改變對“旁觀者”同種異體抗原(H-2k)的體外CTL反應。
以上這些數據顯示，抗gp39干擾同種異體特異性CTL反應(初次和再次反應)的產生。在抗gp39存在下，對相關同種異體抗原特異的CTL前體仍然存在，因為在體外次級培養(yǎng)物中可以證明某些抗H-2bCTL活性。可以認為，抗gp39處理通過阻斷CTL引發(fā)或降低已引發(fā)的同種異體特異性CTL的頻率而降低了再次體外反應。使用靜息B細胞對于證明這種無反應性不是絕對必要的，因為由LPS母細胞誘導的同種異體CTL反應也被抗gp39所減弱。
實施例4用抗gp39抗體處理接受體時轉移同種異體鼠骨髓誘導穩(wěn)定的嵌合體治療許多不能用常規(guī)化學療法治愈的血液學疾病涉及轉移同種異體骨髓。這種進攻療法包括施用高的、骨髓脫落劑量的化學治療連同輸注致使克隆發(fā)生腫瘤細胞消亡的同種異體骨髓。
已經證明，當使用包括抗CD 4mAb在內的抗T細胞單克隆抗體(mAb)時，胸腺照射，缺失胸腺T細胞可增加穩(wěn)定嵌合體的發(fā)生率。這種抗體補給法導致T細胞缺失并進而導致供體特異性耐受(此可根據對供體皮膚移植物的耐受來表示)。在300拉德WBI、體內抗T細胞mAb處理及施用同種異體骨髓后沒有達到永久同種異體移植可能是由于胸腺內未受影響的T細胞所致。使用抗CD4和抗CD8mAb可導致外周血和脾臟T細胞的有效消耗，但胸腺T細胞只是被mAb簡單地包裹而沒有被除掉。因此對小鼠進行胸腺照射。
方法使用將F1的同種異體骨髓轉移(BMT)到親代的鼠模型以避免移植物抗宿主疾病被誘導。我們使用了F1品系CB6，其為產生H-2d/b之總MHC單元型的(C57BL/6×Balb/c)F1。除去骨髓并加或不加抗gp39抗體MR1靜脈注射到經過照射的BALB/c親代小鼠體內。改變總體照射(WBI)水平以便確定最好的嵌合狀態(tài)水平，并比較處于各照射水平的抗gp39抗體處理的和未經處理的動物。用流式細胞計數法分析存在于H-2d(BALB/c)小鼠體內的H-2bMHC單元型的外周血淋巴細胞，以確定嵌合狀態(tài)。以前已表明小鼠的這種組合是適宜的并且可以在500和600拉德WBI的水平上得到嵌合體。
結果經用流式細胞計數法鑒定C57BL/6衍生的細胞(H-2b)以檢測嵌合狀態(tài)。發(fā)現在用400、500和600拉德全身照射的小鼠中，只有從研究開始就用抗gp39抗體處理時才在14天內產生嵌合狀態(tài)。除給予600拉德全身照射外，沒有接受抗體處理的小鼠均在所有照射水平上排斥細胞，從而它們接受骨髓達到與以400拉德照射的抗體處理組相同的程度(表1)。發(fā)現用抗gp39抗體治療并以400、500和600拉德照射，于治療6周后嵌合狀態(tài)的水平分別是70.7＋5.74、94.1和84.4＋8.56；而以600拉德照射并且沒處理則發(fā)現它們?yōu)?5.7＋5.9嵌合(表2)。在這一點上對細胞進行表型鑒定表明，T細胞、B細胞和巨噬細胞都是嵌合的，并且與600拉德照射的未處理組相比，以400拉德照射的處理組達到同樣的嵌合程度(表2)。還看出抗gp39抗體處理并沒有顯著地改變該范圍內任何淋巴樣細胞的總百分群體。當終止用抗gp39抗體處理動物時，發(fā)現直到移植物8周仍是穩(wěn)定嵌合的。
表1用抗gp39處理的嵌合 未經抗gp39外理的嵌合全身照射水平(拉德)動物的數目動物的數目0 0(5) 0(5)2000(5) 0(5)4009(9) 0(9)4503(5) 0(5)5004(5) 2(5)6007(9) 7(9)導致嵌合狀態(tài)之全身照射的水平。括號內數字代表在各水平上試驗之動物的總數。
表2拉德 處理 II-2Kb+B細胞II-2Kb+T細胞II-2Kb+Mac.II-2Kb+400 +70.7±5.7489±2.6 45.9±13.3 82.3±3.3500 +94.1 100 89 100600 +84.4±8.5699.3±0.9472.3±15.9 91.1±8.3600 -85.7±5.9 97.3±1.7767.1±10.3 91±9B細胞、T細胞和巨噬細胞(Mac.)H-2Kb±標準誤差陽性的百分數。
實施例5同種異體骨髓移植并用抗gp39處理移植物接受體以抑制急性和慢性移植物抗宿主疾病本實施例中使用下述方法學小鼠從NCI實驗室(Bethesda，Maryland)得到DBA/2(H-2d)、C57BL/6(H-2b)和B6D2F1(C57BL/6(H-2d)×DBA/2)F1雜種)小鼠并飼養(yǎng)在Dartmouth Medical School動物室的無病毒環(huán)境中。本研究中使用的所有小鼠均為雌性，6-8周齡。
誘發(fā)慢性GVHD將親本(DBA/2)脾細胞靜脈注射到未經照射的(C57BL/6×DBA/2)F1雜種接受體體內以誘發(fā)慢性GVHD(Fast，L.D.(1990)J.Immunol.1444177)。麻醉親代小鼠并斷頸處死以切除脾臟。洗離散的脾細胞并重新懸浮在RPMI 1640培養(yǎng)基(Whittaker，Waldersville，Maryland)中，用以靜脈注射到F1接受體動物體內。
誘發(fā)急性GVHD將親本C57BL/6脾細胞靜脈注射到未經照射的(C57BL/6×DBA/2)F1雜種接受體體內以誘發(fā)急性GVHD。制備細胞用以如誘發(fā)慢性GVHD的細胞傳輸。
抗體按已描述過的方法(Foy，T.M.et al.(1993)J.Exp.Med.1781567-1575；Noelle，R.J.et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896550)在腹水中產生抗gp39MR1并用離子交換HPLC純化之。多克隆抗同種型抗體從Southern BiotechnologyAssociates，Inc.，(Birmingham AL)得到所有抗IgG1和IgA抗體及標準對照品?？笽gE抗體用于IgE特異性ELASA的所有抗IgE抗體(BIE3和Biotin AM95)和標準品(A3B1)均由Dr.T.Waldschmidt，IA惠贈?？筂HC單元型抗體H-2KbFITC結合的抗體和H-2DdBiotin結合的抗體得自PharMingen(San Diego，CA)。
細胞系所使用的細胞系包括得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的P815(H-2d)和LB27.4(H-2bxd)。細胞系cl.18.5(H-2b)由Dr.William R.Green惠贈。
多克隆Ig體外產生分離對照組和cGVHD小鼠的脾臟并制備單細胞懸液。用Tris緩沖的氯化銨處理細胞以除去紅細胞并用肉眼可見的血細胞計數法確定總白細胞數。在1ml完全(c)RPMI-1640培養(yǎng)基(添加有10％胎牛血清(Hyclone，Logan UT)、25mM HEPES、2mML-谷氯酰胺、5000U/ml青霉素和5000mg/ml鏈霉素)中，5％CO2環(huán)境下37℃培養(yǎng)細胞3天。離心沉淀細胞收集培養(yǎng)物上清并用同種型特異性ELISA檢測法定量Ig。
同種型特異性和抗原特異性ELISA檢測IgG1和IgA的ELISA使溶于PBS中的羊抗小鼠IgG1或IgA(10μg/ml；SouthernBiotechnology Associates，Inc.，Birmingham AL)在96孔聚乙烯微滴定板上37℃吸附1小時，然后4℃保溫過夜。洗平板并用含有1％FCS的PBS于37℃封閉1小時。再次洗平板并加入上清液和標準對照物(IgG1和IgA，Southern Biotechnology Associates，Inc.，Birmingham AL)的適當稀釋液并于37℃下保持2小時。這一時間過后，將平板洗3次并加入堿性磷酸酶結合的羊抗小鼠IgG1或IgA(1/500稀釋)(Southern Biotechnology Associates，Inc.，Birmingham Alabama)37℃保持2小時。徹底洗平板并加入磷酸酶底物(1mg/ml；Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)而產生適當的顏色改變。于410nm吸光率處用ELISA讀出器(DynatechLaboratories，Inc.)確定讀數。與適當的同種型標準曲線相比較，確定Ig濃度并表示為平均值＋標準誤差(n＝3)。
檢測IgE的ELISA用抗小鼠IgE俘獲抗體(B1E3(2mg/ml))包被96孔聚乙烯微滴定板的各小孔(4℃過夜)，然后于37℃用含有1％FCS的PBS封閉1小時。再次洗平板并加入上清液和標準對照樣品(A3B1(IgE))的適當稀釋液，37℃放置2小時。徹底洗平板，向各孔內加入EM95-Biotin(5mg/ml)并于37℃保溫2小時。這一時間過后，加入與鏈霉抗生物素蛋白結合的堿性磷酸酶(1/500稀釋)繼續(xù)放置2小時，然后徹底洗平板并加入磷酸酶底物(1mg/ml；Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)以產生適當的顏色改變。于410nm吸光率處用ELISA讀出器(Dynatech Laboritories，Inc.)確定吸光率讀數。經與標準曲線比較確定Ig的濃度并表示為平均值＋標準誤差(n＝3)。
檢測抗DNA Ab的ELISA將牛胸腺DNA(Sigma，St.Louis，MO)(5μg/ml)溶解于含有0.1M碳酸鈉/碳酸氫鈉(pH9.8)的偶聯(lián)緩沖液中。將所得溶液煮沸10分鐘后在冰上保溫3分鐘。測定DNA的OD 260并將其濃度調到所需的5μg/ml DNA。向96孔聚乙烯微滴定板的小孔內加入100μl樣品并于4℃保溫過夜。然后將平板洗3次并于37℃用含有1％ FCS和0.02％疊氮化鈉的PBS封閉1小時。再次洗平板并加入一系列血清樣品的稀釋液(100ml)并于37℃保溫2小時。檢測抗體，再向各孔加入羊抗小鼠IgG 1-堿性磷酸酶并再次于37℃保溫2小時。徹底洗平板并加入磷酸酶底物(1mg/ml，Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)以產生適當的顏色改變。在410nm米吸收處用ELISA讀出器(Dynatech Laboratories，Inc.)確定吸光率讀數。與陽性血清樣品比較抗體滴度并用任意單位表示結果。
檢測供體衍生之細胞的流式細胞計算分析法從用和未用抗gp39處理之正常BDF1，cGVHD小鼠體內切除脾臟并制備單細胞懸液。將細胞在Ficoll-Hypaque上鋪層(4∶1)，然后于室溫下以2000rpm離心20分鐘。除下所得的淋巴細胞層并用含有5％FCS的BSS洗細胞1次。將每管1×106個細胞以50μl終體積用于染色。向各管內加入50μl大鼠血清以阻止抗體的非特異性結合。用(a)對照抗體大鼠Ig FITC(1∶100終稀釋度)和PE-鏈霉抗生物素蛋白(1∶500終稀釋度)，和(b)FITC H-2Kb及Biotin H-2Dd(兩者均為1∶100終稀釋度)著染細胞。在冰上將細胞保溫20分鐘，然后洗兩次以除去未結合的抗體。最后向適當試管內加入PE-鏈霉抗生物素蛋白(1∶500終稀釋度)，再于冰上保溫20分鐘檢測生物素結合的抗體。再洗細胞兩次以備在Becton Dickinson FACScan上進行分析。通過前向和側向散射陽性控制后，每份樣品收集10,000個流通顆粒以確定相關MHC單元型陽性的百分細胞數。
估值CTL試驗的鉻釋放檢測法洗51Cr標記的靶細胞并以每孔1×104個細胞，按100∶1、20∶1和4∶1的E∶T比例與效應細胞一起鋪敷于96孔平板各孔中。所用的靶細胞包括P815(H-2d)、LB27.4(H-2bxd)和c118.5(H-2b)。將平板簡單離心后于5％CO2中37℃保溫4小時。再次離心平板并從每孔中收集無細胞上清液的等分樣品，用γ計數器計數。百分特異性溶胞限定為(a－b)/c，其中a＝與效應細胞一起保溫之靶細胞釋放的cpm，b是只加培養(yǎng)基保溫之靶細胞釋放的cpm(自發(fā)釋放)，且c是靶細胞的可凍融釋放的cpm(均為所摻入之cpm的80％)。
急性GVHD脾細胞的體外二次刺激從經抗-gp39處理、HIg處理或未經處理的動物中切除急性GVHD脾臟，清除脾細胞中的紅細胞并以每孔1×104個脾細胞等分鋪板。將經過照射的刺激細胞(P815)加到適當的孔中。7天后按以前提到的方法進行針對適當靶細胞的CTL試驗。
結果小鼠的GVHD導致脾大。在小鼠中，cGVHD的后果之一是脾臟增大。主要的是宿主自身的細胞浸潤和增大脾臟，但這是在對供體細胞存在的反應中出現的(Rolink，A.G.et al.(1983)J.Exp.Med.158546)。圖5表明cGVHD發(fā)生后7-14天，與沒有cGVHD的小鼠相比脾臟幾乎含有兩倍數目的白細胞。在cGVHD發(fā)作時用抗gp39處理小鼠(250μg/小鼠，第0、2、4和6天)，可使cGVHD小鼠脾臟中白細胞的數目降低到相同于沒有疾病之小鼠的值。
GVHD誘導的多克隆免疫球蛋白的過度產生。已報導由于供體T細胞和B細胞之間同性質相互作用而在有cGVHD小鼠體內出現Ig的過度產生(Morris，S.E.et al.(1990)J.Exp.Med.171503)。為了確定抗gp39是否抑制Ig過量產生，給患cGVHD的小鼠施用抗gp39。于第7或14天，從對照和cGVHD小鼠體上切除脾臟并于體外檢測脾B細胞的IgG1和IgA的自發(fā)產生。得自患cGVHD小鼠的脾細胞于體外產生了高水平的IgA和IgG1(圖6A和6B)。然而，得自患有cGVHD并用抗gp39(第0、2、4和6天)處理之小鼠的脾細胞則產生了與沒有病之小鼠完全相同水平的IgG1和IgA。向患有cGVHD小鼠的脾細胞培養(yǎng)物中加入抗gp39沒有降低體外Ig產生的水平，此提示抗gp39只在體內發(fā)揮其作用。
當用倉鼠Ig(HIg)作為這些實驗的對照時，發(fā)現其在誘發(fā)GVHD中沒有顯示抑制作用，而是不僅就多克隆Ig產生而言而且就所形成的脾腫大而言實質上都加重了疾病。與未經1周處理的誘發(fā)GVHD的小鼠相比，測得經過1周HIg處理的誘發(fā)了GVHD的小鼠所產生的Ig水平增加達8倍。此表明，HIg本身就是一種免疫原。因此決定將未經處理的F1接受體小鼠稱為相關對照組。
抗gp39對GVHD誘導的血清高IgE和抗DNA自身抗體的影響?？筛鶕錓gE和抗雙鏈DNA抗體的升高監(jiān)測cGVHD病程(Morris，S.E.et al.(1990)J.Exp.Med.171503)。使用IgE特異性ELISA檢測血清IgE的水平。在第0、2、4和6天用抗gp39處理誘發(fā)了慢性GVHD的小鼠，然后不再施用抗體。以周為間隔期間養(yǎng)小鼠并確定血清IgE水平(圖7A)。cGVHD誘使血清IgE水平增加10-15倍。施用抗gp39在發(fā)病后長達8周時間抑制cGVHD誘發(fā)的血清IgE增加。除了抑制血清IgE升高外，施用抗gp39還阻斷了血清抗DNA自身抗體的產生。經用抗gp39處理降低了因慢性GVHD導致的高達5-10倍的抗DNA抗體增加水平(圖7B)。
以前的研究已顯示，抗gp39(MR1克隆)的半壽期為12天(Foy，T.M.et al.(1993)J.Exp.Med.1781567-1575)。對檢測抗gp39特異的ELISA試驗表明，治療后8周，經處理的小鼠血清中查不到抗gp39。因此，抗gp39持續(xù)存在不能說明延長了對cGVHD的抑制作用。進行轉移研究以明確是否患有cGVHD的并且已施用抗gp39之小鼠的脾細胞可轉移cGVHD。在過繼轉移后得自cGVHD和抗gp39之小鼠的脾細胞不能誘導IgE和抗DNA自身抗體血清水平的升高；而患有cGVHD之小鼠的脾細胞則誘導了血清IgE和抗DNA抗體的升高。這些數據提示，由于抗gp39處理的結果，同種異體反應性T細胞已被誘導成為非反應性的。
檢測同種異體反應性供體細胞。當分析誘發(fā)了cGVHD的小鼠脾臟內是否存在供體衍生的細胞時，發(fā)現與H-2Kb和H-2Dd著染雙陽性的正常BDF1小鼠相比，cGVHD小鼠擁有約5-7％供體細胞。這些細胞是DBA/2衍生的，因此對H-2Dd呈著染單陽性。檢測這些細胞時不考慮抗gp39處理。這一結果說明抗gp39處理充許輸入供體細胞而沒有不當地引出接受體B細胞的輔助功能，該輔助功能可在未經處理的cGVHD組小鼠體內導致多克隆Ig產生。
抗gp39處理對誘發(fā)急性GVHD的影響。急性GVHD與誘導增加的抗同種異體CTL反應有關。雖然已知gp39-CD40相互作用對于Th-B細胞相互作用是很關鍵的，但還不清楚抗gp39治療是否也可改變對其他免疫效應物機制的誘導作用。經F1接受體施用C57BL/6脾臟細胞可誘發(fā)AGVHD。如圖8中所示，在轉移同種異體細胞后12天，檢測到強的H-2b抗H-2dCTL反應。用抗gp39但不用HIg處理小鼠，阻止了H-2b抗H-2dCTL的產生(圖8)。在兩個實驗中的一個實驗中，經用抗gp39處理使動物的CTL反應降低到未實驗過之小鼠脾細胞的CTL反應水平以下。這一結果表明GVHD小鼠的脾細胞此時受到了攻擊。如果其后在被照射過的P815細胞存在下將這些脾細胞培養(yǎng)7天并繼而進行CTL檢測，可見這些細胞沒有發(fā)動對P815細胞的二次刺激，但正常BDF1脾細胞則出現了初次反應。如所預期的，未經處理的aGVHD誘導的小鼠發(fā)起了二次免疫反應。這些結果表明，用抗gp39處理急性GVHD小鼠使得CD8+群體對二次攻擊無反應性。
討論經施用gp39后，在誘發(fā)了GVH的小鼠體內出現脾腫大逆轉(圖5)、抑制Ig過度產生(圖6A和6B)、抑制血清IgE和抗DNA自身抗體產生的水平(圖7A和7B)等作用，提示抗gp39阻斷了被移植之T細胞誘導宿主B細胞活化的能力。在停止施用抗體后7天，這種對脾腫大和多克隆IgG1與IgA產生的抑制作用仍處于低水平。當終止處理時，IgE和抗DNA抗體的降低甚至持續(xù)8周。這些結果表明，T細胞功能已受到反應性T細胞之克隆缺失，或者T細胞無反應性已出現的影響。前已證明(Van den Eertwegh et al.(1993)J.Exp.Med.1781555-1565)，在被免疫小鼠的原位雜交研究中，抗體處理之小鼠的細胞因子生成細胞的水平仍保持正常。這一結果表明，T細胞沒有因上述處理而被消除。當分析cGVHD小鼠體內供體衍生之細胞的存在時，發(fā)現它們存在于未經處理或經用抗gp39處理的小鼠中。因此抗gp39具有誘導這些供體T細胞之非反應性狀態(tài)，且不當地產生對抗體反應抑制的能力。的確，如果將這些動物的脾臟移入未實驗過的接受體動物體內，當供體脾臟是未經處理的cGVHD小鼠的脾臟時可見抗體水平升高，但經抗gp39處理之cGVHD小鼠則不能在轉移后造成再次cGVHD狀態(tài)。這一數據提示，抗gp39干擾T細胞引起強的GVHD臨床免疫病理學狀態(tài)和脾腫大的能力，即施用抗體可引起對CD4+亞群的無反應性。
已報導，正如在對B細胞缺陷小鼠進行的誘導抗Friend鼠白血病病毒所致白血病的保護性T細胞免疫研究中所看到的，為誘導CTL反應須由B細胞提供幫助(Schultz，K.R.et al.(1990)Science249)。因此似乎可以理解到，在誘發(fā)aGVHD的小鼠中抗gp39抑制B細胞活化，因此阻止抗原呈遞并進行致敏CD8+T細胞。也已顯示，CD8+CTL的產生需要II類限制性Th細胞的相互作用(Von Boehmer，H.et al.，(1979)J.Exp.Med.1501134；Keene，J.et al.(1982)J.Exp.Med.155768)，并且當TCR親和力低時，體內需要CD4+介導的T細胞幫助(Gao，X.et al.，(1991)J.Immunol.1473268)。
已進行了尋找CD28-B7/BB1相互作用在誘導CD8+CTL反應中所發(fā)揮之作用的研究。發(fā)現CD28-B7/BB1相互作用對于I類MHC特異性CTL的產生是必要的并且是足夠的(Harding，F.A.andAllison，J.P.(1993)J.Exp.Med.1771791)。正如通過用抗CD40抗體抑制B7在正常和白血病B細胞上表達的研究所顯示的，有人認為CD40的配體可能是B7的重要誘導物(Ranheim，E.A.and Kipps，T.J.(1993)J.Exp.Med.177925)。這些研究結果共同表明，抗gp39可能阻斷CD4+T細胞與B細胞的相互作用，因而未能誘導B7的表達，也就不能供以使B細胞有效地激活T細胞以發(fā)生增殖并產生細胞因子。這些數據提示，CD4+T細胞是首先通過gp39和其配體CD40間的T-B細胞關聯(lián)性相互作用誘導CTL形成所必需的。然后B細胞上CD40的發(fā)出信號致使B7/BB1上調。B7/BB1與其配體CD28在T細胞上的交互作用使T細胞增殖和細胞因子產生得以增強。但如果只向T細胞提供一個信號，即gp39與CD40相互作用的信號，而未得到第二個信號，則在T細胞中誘導了無反應性并使之變?yōu)槟褪芑暮蜔o反應化的。
這些研究表明，當在小鼠體內誘發(fā)了aGVHD時，即獲得抗H-2d反應。但如果用抗gp39處理動物則觀察不到CTL反應。顯然抗gp39正在以以前已描述的方法抑制CTL生成(Schultz，K.R.et al.(1990)Science 249)。B細胞沒有通過CD40連接被激活并因此而不能促進CTL的誘導。此外，我們的研究顯示當用P815細胞體外攻擊脾細胞時，發(fā)現體內暴露于抗gp39的細胞不能發(fā)動二次抗H-2dCTL。因此，這可能表明抗gp39已誘導了對T細胞區(qū)室的耐受狀態(tài)，因為gp39不能連接CD40，從而沒有造成B7/BB1上調作用并因此使T細胞沒有進一步被激活而仍是非反應性的。還了解到，除非被抗IgM抗體、PMA或LPS預激活，靜息B細胞在混合的淋巴細胞反應中一般是同種異體T細胞的無效刺激物(Inaba，K.and Steinman，R.M.(1989)J.Exp.Med.1601717；Metley，J.P.et al.(1989)J.Exp.Med.169239；Frohman，M.and Cowing，C.(1985)J.Immunol.1342269)。另外，直接由B細胞體內呈遞的可溶性單體抗原可導致特異性T細胞無反應性(Eynon，E.E.and Parker，D.(1992)J.Exp.Med.175131)。因此，似乎可以證明，依據所涉及的抗原和APC的施用方法的不同，可能誘導無反應性或耐受性。在P815細胞攻擊脾臟的CD8+T細胞區(qū)室之后，抗原呈遞即不需要B細胞，從而同種異體抗原可直接呈遞并誘導CTL。脾臟對再次刺激無反應表明在該系統(tǒng)中已誘導了同種異體特異性耐受。
這一結果與以前的結果(Foy，T.M.et al.(1993)J.Exp.Med.1781567-1575)相反，后者表明在抗原特異性系統(tǒng)中抗體沒有誘導耐受性。兩個系統(tǒng)不同是因為呈遞同種異體抗原的aGVHD模型已結合到抗原呈遞細胞上，而就抗原特異性系統(tǒng)來說則施用了抗原并且已在體內被攝取、加工并由專職APC呈遞。因此似乎抗gp39可依據所使用的抗原及呈遞方法而可能有不同的作用。
可以認為，抗gp39可在免疫系統(tǒng)的CD4+和CD8+區(qū)室中誘導同種異體特異性耐受，并且考慮移植物免疫學和免疫治療時這種耐受可能是明顯有益的治療干預。可以想象到為處理經受骨髓移植的病人，抗gp39治療將足以誘導對移植物的耐受，并防止誘發(fā)如GVHD這樣的移植物處理的后果。
實施例6抗gp39抗體的產生和性質鑒定實驗1-抗人gp39抗體為了在人類受試對象體內誘導抗原特異性T細胞耐受，較好地可施用抗人gp39的抗體。使用下述方法學產生小鼠抗人gp39單克隆抗體。用加在完全弗氏佐劑(CFA)中的可溶性gp39融合蛋白質gp39-CD8免疫Balb/c小鼠。6周后用加在不完全弗氏佐劑(IFA)中的可溶性gp39-CD8再次攻擊小鼠。第二次免疫后4周施用可溶形式的可溶性gp39-CD8。2周后用活化的人外周血淋巴細胞對小鼠進行加強免疫，然后再在2周后用可溶性gp39-CD8進行末次加強免疫。末次免疫后第4天按標準方法將脾細胞與NS-1融合對象融合。
基于多篩選方法選擇產生抗人gp39抗體的克隆。首先使用gp39-CD8以平板結合試驗篩選克隆。然后篩選抗對照CD8融合蛋白質，CD72-CD8的陽性克隆。除去在CD8-CD72平板結合試驗中記錄為陽性的克隆。然后用流式細胞計數分析法在靜息和6小時活化的人外周血淋巴細胞(PBL)上篩選其余的克隆。著染被激活后，但非靜息的PBL雜交瘤視為陽性。最后，試驗其余的克隆檢查它們阻斷CD40Ig與平板結合之gp39結合的能力。
在平板結合試驗中初次篩選約300個抗gp39-CD8和CD72-CD8的克隆。這些克隆中，發(fā)現30個可檢出與平板結合的gp39并且不能檢出CD8。然后篩選這些克隆用于在激活的人PBL上檢測gp39。約15個克隆檢測出了在活化的PBL，而不是靜息細胞上的分子。經確定這些克隆阻斷CD40Ig檢測與平板結合之gp39的能力進一步證實特異性。在該試驗中10個克隆中有3個阻斷CD40Ig結合。這些克隆是3E4、2H5和2H8。這樣的克隆較好用于本文所述方法中。還根據與活化的大鼠T細胞克隆POMC8的反應性篩選在活化的但非靜息的PBL上試驗陽性的克隆?？寺?H8表達了與該大鼠T細胞系的交叉反應性。
實驗2-抗人gp39抗體使用如實驗1中所述的相似的免疫程序產生另外的抗人gp39抗體。用加在CFA中的可溶性gp39-CD 8免疫一只Balb/c小鼠，4周后用6小時活化的人外周血淋巴細胞進行攻擊。再用可溶性gp39-CD8加強免疫小鼠，4天后按標準方法將脾細胞與NS-1融合對象融合。經流式細胞法染色6小時活化的人PBL以篩選雜交瘤克隆。選擇活化的但非靜息的人PBL的著染克隆。選擇4D9-8、4D9-9、24-31、24-43、89-76和89-79等6個克隆進行進一步分析。
用幾種試驗證實所選擇之抗體的特異性。首先，流式細胞計數分析證明所有六種mAb品系均著染活化的但非靜息的外周血T細胞(參見有代表性實例的圖9B和9C，圖示分別用4D9-8和4D9-9著染活化的T細胞)。由六種抗體中的每一種識別的分子表達可在激活后4小時內檢測到，激活后6-8小時達到最大值，到激活后24小時即測不到。所有六種mAb均識別到在活化的CD3+PBL上表達的分子，且其中主要是CD4+表型，但一部分CD8+T細胞也表達該分子。同gp39的表達一樣，培養(yǎng)基中存在環(huán)孢菌素A可抑制由六種mAb識別之分子的表達(參見圖10A和10B所示的有代表性的實例，附圖分別顯示用4D9-8和4D9-9著染的經環(huán)孢菌素處理的T細胞)。如用人CD40Ig的融合蛋白質測得的，發(fā)現由這些mAb識別之分子表達的動力學和分布與gp39的完全相同。另外，所有六種mAb均阻斷CD40Ig對gp39的著染(參見圖11A和11B所示的有代表性的實例，附圖分別顯示在4D9-8和4D9-9存在下CD40Ig對gp39著染的抑制作用)。在ELISA試驗中，所有六種mAb均識別一種可溶性融合蛋白質形式的gp39分子，即gp39-CD8。此外，所有六種mAb均從經35S-蛋氨酸標記的活化的人PBL中免疫沉淀一種約36Kd的分子。該免疫沉淀的分子與被人CD40Ig融合蛋白質沉淀的分子相同。
按下述方法檢測六種選擇的mAb(4D9-8、4D9-9、24-32、24-43、89-76和89-79)的功能活性。首先，檢測mAb抑制加IL-4和可溶性gp39培養(yǎng)的純化之人B細胞增殖的能力。在有或沒有劑量為0至12.5μg/ml的純化之單克隆抗體或CD40Ig存在下，加gp39和IL-4培養(yǎng)純化的人B細胞。培養(yǎng)3天后以胸苷摻入法檢測B細胞增殖情況。結果(如圖12中所示)證明六種mAb均可抑制由gp39和IL-4誘導的B細胞增殖。在抑制被誘導的B細胞增殖方面，mAb 89-76和24-31是最有效的。89-76的IC50(抑制B細胞增殖達50％所需的抗體濃度)約為1μg/ml，24-31約為1.25μg/ml。
然后，檢測由抗CD 3激活之T細胞和IL-2誘導的Ig產生量，以測出mAb抑制B細胞分化的能力。用FACS進行陽性選擇以制備純化的IgD+人B細胞，然后在有或沒有劑量為0至10μg/ml的純化之抗gp39單克隆抗體存在下，將細胞與抗CD3激活的人T細胞(絲裂霉素C處理的)和IL-2一起培養(yǎng)6天。于第6天以ELISA估測IgM、IgG和IgA產生量。結果(下列表3所示)證明，如根據IgM、IgG和IgA產生量所測知的，所有六種抗體均可抑制T細胞依賴性B細胞分化。所有六種mAb(包括24-31和89-76抗體)的IC50(抑制Ig產生達50％所需的抗體濃度)為1.0μg/ml至0.1μg/ml以下。
表3免疫球蛋白的產生量mAb μg/ml IgM IgG IgA無 17,500671044714D9-80.1 4813 213028191.0 4394 2558151910.01081 389 3964D9-90.1 3594 919 17311.0 2659 1233160610.0374 448 26624-310.1 3863 981 3441.0 1287 314 16510.01120 596 2324-430.1 6227 41324321.0 3193 2130192100 7021 1232108189-760.1 3783 10693441.0 2180 352 17110.0818 551 1989-790.1 9763 192430211.0 2314 460 15610.0183 135 434為了檢驗抗gp39 mAb對T細胞反應的影響，在標準混合淋巴細胞反應(MLR)中包括mAb。在有或沒有抗gp39 mAb(10μg/ml)存在下，將300,000個人外周血淋巴細胞(反應細胞＝R)與100,000個經過照射的同種異體外周血淋巴細胞(刺激細胞＝S)一起培養(yǎng)。于第4、5或6天用3H-胸苷對培養(yǎng)物施加脈沖并在18小時后收獲細胞。如用MLR方法測知的，所有六種抗人gp39 mAb均抑制同種異體特異性反應(參見圖13所示的代表性實例，圖中顯示當在24-31或89-76存在下保溫R和S時對同種異體特異性反應的抑制；使用CTLA 4-免疫球蛋白融合蛋白質和抗CD28mAb作為陽性對照)。
為了確定是否六種mAb識別人gp39分子上的不同表位，進行交叉阻斷實驗。首先用六種mAb中的每一種阻斷激活的人PBL(25μg/ml未結合的抗體)。洗滌細胞并用10μg/ml生物素結合的抗體著染細胞，然后與植物刺酮堿(phytoerythrin)結合的抗生物素蛋白(PE-Av)反應。用FACS分析PE-Av著染的細胞。結果示于下列表4中。
表4阻斷 著染抗體Ab 4D9-84D9-924-3124-4389-7689-79無 +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++4D9-8ND -++++ ++++ +++ +++4D9-9+++ ND +++ ++++ +++ +++24-31++ND +++ ++ ++24-43+++++ ND ++ +89-76+++++ +++ ND +++89-79+++ +++ +++ +++ ND用+號代表染色強度和陽性細胞的百分比(++++＝MI＞200；+++＝MI＞125；++＝MI＞50；+＝MI＞25；-＝沒有在本底以上著染。)ND＝未測。
所有抗體均阻斷CD40Ig與活化的人PBL的結合。但表4中所示數據清楚地證明某些抗體阻斷其他抗體與活化的人PBL結合的失敗，提示它們識別人gp39分子上的不同表位。
分別產生89-76和24-31抗體的89-76和24-31雜交瘤已按布達佩斯條約的有關規(guī)定于1994年9月2日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，Parklawn Drive，Rockville，Md.)。89-76雜交瘤保藏登記號為ATCC No.＿＿，24-31雜交瘤保藏登記號為ATCC No.＿＿。24-31和89-76抗體是IgG1同種型的。
實驗3-抗小鼠gp39抗體在本發(fā)明的一個實施方案中，gp39拮抗物是抗小鼠gp39單克隆抗體MR1。使用下述方法產生MR1單克隆抗體，并且該方法也可用于產生其他抗gp39抗體。
經腹腔內注射，以周為間隔用5-106個活化的Th1細胞(d1.6)免疫倉鼠共6周。當抗小鼠Th1的血清滴度大于約1∶10,000時，用免疫倉鼠脾細胞和NS-1在聚乙二醇作用下進行細胞融合。用流式細胞計算法在靜息和活化的Th1上篩選得自含生長的雜交瘤之小孔中的上清液。進一步試驗一個產生選擇性識別被活化Th之Mab的特定雜交瘤，并亞克隆之以產生MR1。在腹水中產生MR1并經離子交換HPLC純化之。雜交瘤MR1已保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏登記號為HB11048。
等同物本領域技術人員將會理解到，或者能夠使用常規(guī)實驗方法確定許多本文所述的本發(fā)明特定實施方案的等同物。這些等同物也將包括在本發(fā)明權利要求范圍內。本申請通篇所列的參考文獻、已公布專利申請的內容均列入本文以供參考。
權利要求
1.IgG1同種型的抗人gp39單克隆抗體。
2.如權利要求1的抗人gp39單克隆抗體，其在標準的體外試驗中以大約0.01至5.0μg/ml的IC50值抑制B細胞增殖。
3.如權利要求2的抗人gp39單克隆抗體，其在標準的體外試驗中以大約0.1至2.5μg/ml的IC50值抑制B細胞增殖。
4.如權利要求3的抗人gp39單克隆抗體，其在標準的體外試驗中以大約0.1至1.25μg/ml的IC50值抑制B細胞增殖。
5.如權利要求2的抗人gp39單克隆抗體，其中B細胞增殖是體外用白細胞介素4和可溶性gp39處理B細胞而誘導的。
6.如權利要求1的抗人gp39單克隆抗體，其在標準的體外試驗中以大約0.01至1.0μg/ml的IC50值抑制B細胞產生IgM、IgG或IgA。
7.如權利要求6的抗人gp39單克隆抗體，其在標準的體外試驗中以大約0.01至0.1μg/ml的IC50值抑制B細胞產生IgM、IgG或IgA。
8.如權利要求6的抗人gp39單克隆抗體，其中B細胞產生IgM、IgG或IgA是經培養(yǎng)B細胞與抗CD3活化的T細胞而被誘導的。
9.與被選自下列一組中的單克隆抗體識別的表位結合的抗人gp39單克隆抗體單克隆抗體3E4、單克隆抗體2H5、單克隆抗體2H8、單克隆抗體4D9-8、單克隆抗體4D9-9、單克隆抗體24-31、單克隆抗體24-43、單克隆抗體89-76、和單克隆抗體89-79。
10.如權利要求9的抗人gp39單克隆抗體，其與由單克隆抗體24-31識別的表位結合。
11.如權利要求10的抗人gp39單克隆抗體，其為單克隆抗體24-31。
12.ATCC保藏登記號為No＿＿的雜交瘤24-31。
13.由權利要求12的雜交瘤產生的單克隆抗體24-31。
14.如權利要求9的抗人gp39單克隆抗體，其與由單克隆抗體89-76識別的表位結合。
15.如權利要求14的抗人gp39單克隆抗體，其為單克隆抗體89-76。
16.ATCC保藏登記號為No.＿＿的雜交瘤89-76。
17.由權利要求16的雜交瘤產生的單克隆抗體89-76。
18.包含權利要求1之抗人gp39單克隆抗體和藥學上可接受之載體的藥物組合物。
19.包含權利要求9之抗人gp39單克隆抗體和藥學上可接受之載體的藥物組合物。
20.包含權利要求13之單克隆抗體24-31和藥學上可接受之載體的藥物組合物。
21.包含權利要求17之單克隆抗體89-76和藥學上可接受之載體的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了與蛋白質gp39(也稱為CD40配體)結合的抗體。這些抗體較好是IgG1同種型并與人gp39結合的單克隆抗體。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體與由雜交瘤24-31(ATCC保藏登記號No.——)產生的單克隆抗體24-31識別的表位結合，或者與由雜交瘤89-76(ATCC保藏登記號No.——)產生的單克隆抗體89-76識別的表位結合。本發(fā)明還公開了包含本發(fā)明抗體的藥物組合物。本發(fā)明的抗體可用于抑制B細胞增殖和分化，抑制T細胞反應以誘導T細胞耐受。本發(fā)明還包括編碼抗gp39抗體的核酸分子或其部分，以及摻入所說核酸分子的表達載體和宿主細胞。
文檔編號A61K38/17GK1149299SQ94193918
公開日1997年5月7日 申請日期1994年9月2日 優(yōu)先權日1993年9月2日
發(fā)明者R·J·內勒, T·M·富瓦, A·阿魯夫福, J·A·萊德欠特 申請人:達特茅斯學院理事, 布里斯托爾-邁爾斯斯奎布公司