專利名稱：延長(zhǎng)體液免疫抑制的方法
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)對(duì)外來(lái)抗原可產(chǎn)生兩種抗原-特異性應(yīng)答。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫這一術(shù)語(yǔ)通常是指通過(guò)T(淋巴)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)的效應(yīng)功能。而體液免疫這一術(shù)語(yǔ)通常指通過(guò)B(淋巴)細(xì)胞介導(dǎo)的抗原-特異性抗體的產(chǎn)生。長(zhǎng)久以來(lái)，人們已經(jīng)評(píng)價(jià)了抗大多數(shù)抗原的體液免疫的形成與發(fā)展不僅需要產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞，而且還涉及輔助性T細(xì)胞(本文簡(jiǎn)稱Th)。見Mitchison，Eur.J.Immunol.，118-25(1971)；Clamah and Chaperon，Transplant Rev.，192-119(1969)；Katz et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，702624-2629(1973)；Raff et al.，Nature，2261257-1260(1970)。在對(duì)胸腺依賴的(本文簡(jiǎn)稱TD)抗原刺激的應(yīng)答中，Th細(xì)胞可提供某些信號(hào)或“輔助”。當(dāng)某些B細(xì)胞的輔助是由Th細(xì)胞(如淋巴因子，白介素-4和白介素-5)釋放的可溶性分子介導(dǎo)時(shí)，B細(xì)胞的活化還需要B細(xì)胞與Th細(xì)胞間的一種接觸依賴的相互作用。見Herohata et al.，J.Immunol.，1403736-3744(1988)；Bartlett et al.，J.Immunol.，1431745-1754(1989)。這表明B細(xì)胞的活化涉及B細(xì)胞和Th細(xì)胞表面分子間的一種專一性的相互作用。分離的活化T細(xì)胞膜能提供對(duì)B細(xì)胞活化所必需的輔助功能的觀察結(jié)果進(jìn)一步支持上述這樣的一種相互作用。見Brian，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85564-568(1988)Hodgkin et al.，J.Immunol.，1452025-2034(1990)；Noelle et al.，J.Immunol.，1461118-1124(1991)。
當(dāng)與抗體交聯(lián)時(shí)，在誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖的未成熟和成熟B細(xì)胞上已經(jīng)鑒定了一種細(xì)胞表面分子——CD40。見Valle et al.，Eur.J.Immunol.191463-1467(1989)；Gordon et al.，J.Immunol.，1401425-1430(1988)；Gruber et al.，J.Immunol.，1424144-4152(1989)。CD40已被分子克隆并確定特征。見Stamenkovic et al.，EMBO J.，81403-1410(1989)。CD40的一個(gè)配基-gp39(包膜蛋白39，又叫CD40配體或CD40L)也已被分子克隆并鑒定特征。見Armitage et al.，Nature，35780-82(1992)；Lederman et al.，J.Exp.Med.，1751091-1101(1992)；Hollenbaugh et al.，EMBO J.114313-4319(1992)。gp39蛋白是在活化的、但非靜止的CD4+Th細(xì)胞上表達(dá)的。見Spriggs et al.，J.Exp.Med.，1761543-1550(1990)；Laneet al.，Eur.J.Immunol.，222573-2578(1992)；Roy et al.，J.Immunol.，1511-14(1993)。用gp39基因轉(zhuǎn)染并在細(xì)胞表面表達(dá)的gp39蛋白的細(xì)胞能觸發(fā)B細(xì)胞的增殖，并與其它的刺激信號(hào)一起誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生。Amitage et al.，Nature 35780-82(1992)；Hollenbaugh et al.，EMBO J.，114313-4319(1992)。
一方面誘導(dǎo)體液應(yīng)答是一種重要的宿主防御機(jī)制，但在某種情況下抑制一種針對(duì)特定抗原的抗體產(chǎn)生是有益的。例如，抑制一種致敏原的體液應(yīng)答能預(yù)防或降低個(gè)體的變態(tài)反應(yīng)。此外，當(dāng)給予一種治療性抗體時(shí)，抑制針對(duì)該抗體的體液應(yīng)答能延長(zhǎng)抗體的療效。
發(fā)明概述抑制體液免疫的一種途徑(方法)是抑制B細(xì)胞活化。本發(fā)明是涉及在體內(nèi)抑制對(duì)胸腺依賴性(TD)抗原的體液免疫應(yīng)答的方法。此方法是通過(guò)抑制Th細(xì)胞刺激B細(xì)胞的能力，從而干擾B細(xì)胞的活化和抗體的產(chǎn)生。本發(fā)明至少部分是基于這樣的必要性即隨后的B細(xì)胞的活化需要Th細(xì)胞上的gp39和B細(xì)胞上的CD40在體內(nèi)的相互作用。體內(nèi)抑制gp39與CD40相互作用有效的gp39拮抗劑與一種TD抗原一起施用受試對(duì)象，以抑制對(duì)TD抗原的體液免疫。施用的這種gp39拮抗劑可能是一種直接針對(duì)gp39抗原的抗體。在一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該gp39拮抗劑是一種單克隆抗體，如一種抗人gp39抗體或抗小鼠gp39抗體(即MR1)。嵌合抗體，人化抗體和抗體片段也在本發(fā)明之列。選擇的gp39拮抗劑可能是一種可溶類型的gp39配基CD40。CD40的可溶性融合蛋白也是本發(fā)明包括的內(nèi)容之一。
用本發(fā)明的方法抑制的這種體液免疫應(yīng)答，可以是在初次暴露于一種抗原時(shí)的初始體液免疫應(yīng)答，或者是在再次暴露于一種過(guò)去已暴露過(guò)的抗原時(shí)的再次體液免疫應(yīng)答。例如，這里描述的方法可用來(lái)抑制抗原特異性IgM抗體、IgG抗體、IgD抗體及/或IgE抗體的產(chǎn)生。此外，該方法用于在體內(nèi)延長(zhǎng)體液免疫應(yīng)答的抑制。
本發(fā)明的一個(gè)方面是提供了對(duì)TD抗原體液免疫抑制的方法。本發(fā)明所利用的抗原包括那些其特異性抗體的產(chǎn)生需要gp39和B細(xì)胞表面的一種配基(例如CD40)相互作用的抗原。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗原是一種治療抗體、藥物、致敏原或外來(lái)細(xì)胞，并且本發(fā)明的方法對(duì)于抑制對(duì)TD抗原的體液免疫應(yīng)答以及保護(hù)對(duì)2型胸腺非依賴抗原(下稱TI-2)的體液免疫應(yīng)答是有效的。
本發(fā)明另一方面是提供這樣一種方法，通過(guò)給予gp39拮抗劑來(lái)阻礙gp39和B細(xì)胞表面配基(例如CD40)之間的相互作用，從而在體內(nèi)特異性抑制活化Th細(xì)胞的輔助功能。根據(jù)這種方法，活化Th細(xì)胞的輔助功能在體內(nèi)被抑制而不消除Th細(xì)胞或使之失去免疫能力。
本發(fā)明還涉及這樣的方法，通過(guò)聯(lián)合給予gp39拮抗劑和另一種免疫抑制劑，在體內(nèi)抑制體液免疫應(yīng)答。與gp39拮抗劑聯(lián)合給藥的另一種免疫抑制劑包括細(xì)胞因子抑制劑、CD28/CTLA4 T細(xì)胞共同激活路徑的抑制劑，或者免疫抑制藥物。
本發(fā)明的再一個(gè)方面是確定一種抗原是TD還是TI-2抗原的方法。這可通過(guò)給予gp39拮抗劑，看其體內(nèi)對(duì)該抗原的體液免疫應(yīng)答是否被抑制來(lái)決定。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1A是描述抗gp39體內(nèi)治療時(shí)初始抗SRBC IgM抗體產(chǎn)生的抑制情況條形圖。
圖1B是描述短期體內(nèi)抗gp39治療后，初始抗SRBC IgM抗體產(chǎn)生的延長(zhǎng)抑制情況圖。
圖2A是描述體內(nèi)抗gp39治療的再次抗KLH抗體產(chǎn)生(各種異型)抑制的條形圖，抗體滴度是在抗原刺激7天后測(cè)定的。
圖2B是描述體內(nèi)抗gp39治療的再次抗KLH抗體產(chǎn)生(各種異型)抑制的條形圖，抗體滴度是在抗原刺激后14天測(cè)定的。
圖3是兩個(gè)條形圖，描述體內(nèi)抗gp39治療的初始抗ChiL6 IgM抗體產(chǎn)生的抑制(左)及再次抗ChiL6 IgG1抗體產(chǎn)生的抑制(右)。
圖4A是條形圖描述由于對(duì)TNP-SRBC免疫及體內(nèi)抗gp39治療的初始抗TNP IgM抗體產(chǎn)生抑制。
圖4B條形圖描述由于對(duì)TNP-聚蔗糖免疫及體內(nèi)抗gp39治療的初始抗TNP IgM抗體產(chǎn)生的抑制缺乏。
圖5條形圖描述曾經(jīng)暴露于體內(nèi)抗gp39治療的T細(xì)胞的完整的輔助活性可轉(zhuǎn)移到未治療的小鼠，說(shuō)明抗gp39給藥不能有效地清除Th細(xì)胞。
圖6A是蛋白質(zhì)斑跡法描述體內(nèi)給藥7、14及21天后血清中抗gp39抗體。
圖6B描述體內(nèi)給藥7、14和21天后，血清中存留的抗gp39活性的百分比。
圖7A，B和C描述用CD40Ig(照片A)、單克隆抗體4D9-8(照片B)或單克隆抗體4D9-9(照片C)作用6小時(shí)的人外周血淋巴細(xì)胞的流動(dòng)式細(xì)胞輪廓染色照片。
圖8A，B和C流動(dòng)式細(xì)胞輪廓照片描述在有Cycloporin A條件下培養(yǎng)的人外周血淋巴細(xì)胞，用單克隆抗體4D9-8(照片A)、單克隆抗體4D9-9(照片B)或CD40Ig(照片C)染色6小時(shí)情況。
圖9A和B流動(dòng)式細(xì)胞輪廓照片描述在有未標(biāo)記的單克隆抗體4D9-8(照片A)或未標(biāo)記的單克隆抗體4D9-9(照片B)情況下用CD40Ig染色人外周血淋巴細(xì)胞6小時(shí)的情況。
圖10是當(dāng)細(xì)胞在有抗人gp39單克隆抗體4D9-8、4D9-9，24-31，24-43，89-76，或89-79存在的情況下培養(yǎng)時(shí)，由可溶性gp39和IL4誘導(dǎo)的人B細(xì)胞增殖抑制的示意圖。
圖11是當(dāng)細(xì)胞在有抗人gp39單克隆抗體24-31或89-79存在情況下培養(yǎng)時(shí)，異常特異性混合淋巴細(xì)胞應(yīng)答抑制的示意圖。
發(fā)明詳述對(duì)胸腺依賴(TD)抗原的體液免疫的發(fā)生不僅需要B淋巴細(xì)胞，它能產(chǎn)生針對(duì)抗原的特異性抗體；而且有賴于Th細(xì)胞，它對(duì)于B淋巴細(xì)胞的激活是必要的。雖然T輔助細(xì)胞功能確實(shí)包括產(chǎn)生為B淋巴細(xì)胞所用的細(xì)胞因子，但是Th細(xì)胞對(duì)B淋巴細(xì)胞激活的需要并不能通過(guò)給B細(xì)胞提供外源性細(xì)胞因子而消除。而且，接觸依賴的，細(xì)胞膜介導(dǎo)的B細(xì)胞與T細(xì)胞間的相互作用，是誘導(dǎo)體液免疫的整體的組成部分。這種相互作用中的一個(gè)受體配基對(duì)CD40和gp39已被確定。CD40在B細(xì)胞上，并有與gp39結(jié)合的能力，而gp39在Th細(xì)胞表面被介導(dǎo)，導(dǎo)致刺激B淋巴細(xì)胞并大量產(chǎn)生特異性抗體。阻斷CD40和gp39的相互作用，提供了阻礙特異性體液免疫應(yīng)答發(fā)生的一種方法。
因而，本發(fā)明是關(guān)于在體內(nèi)抑制TD抗原的體液免疫應(yīng)答的方法。通過(guò)阻礙介導(dǎo)接觸依賴輔助作用因子功能的Th細(xì)胞上的分子與其在B淋巴細(xì)胞表面的配基之間的相互作用，抑制體液免疫應(yīng)答。優(yōu)選的實(shí)施方案是，通過(guò)阻礙T細(xì)胞上的gp39與體內(nèi)給藥gp39拮抗劑使之暴露于TD抗原的B細(xì)胞上的CD40之間的相互作用，從而抑制體液免疫應(yīng)答。一個(gè)實(shí)施方案是通過(guò)體內(nèi)同時(shí)給予gp39拮抗劑和抗原的方法，使得B細(xì)胞暴露于TD抗原。優(yōu)選地，這種TD抗原是一種治療劑，例如一種治療性抗體或藥物，用于病人的治療，并通過(guò)抑制對(duì)該抗原的體液免疫應(yīng)答來(lái)延長(zhǎng)其療效的維持時(shí)間。另一實(shí)施方案是，這種TD抗原是一種受試者可在環(huán)境中暴露的抗原，例如某種致敏原，對(duì)這種致敏原的體液免疫應(yīng)答對(duì)受試者(或患者)是有害的，例如導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)，在這種情況下抑制體液免疫應(yīng)答對(duì)于受試者(患者)在治療上是有益處的。I.GP39拮抗劑根據(jù)本發(fā)明的方法，給gp39拮抗劑是為了阻礙T細(xì)胞上gp39和B細(xì)胞上gp39配基之間的相互作用。gp39拮抗劑被確定是一種阻礙這種相互作用的分子。gp39拮抗劑可以是直接針對(duì)gp39的抗體(例如，一種抗gp39單克隆抗體)，直接針對(duì)gp39的抗體的片段或衍生物(例如，F(xiàn)ab或F(ab)′2片段，嵌合體抗體或人化的抗體)，gp39配基的可溶形式(例如，可溶的CD40)，gp39配基的融合蛋白的可溶形式(例如，可溶的CD40Ig)，或者阻斷gp39-CD40相互作用的藥物制劑。A.抗體一種哺乳動(dòng)物(例如，小鼠、倉(cāng)鼠或兔)可以由其有免疫原性的gp39蛋白或蛋白質(zhì)片段(例如肽段)引發(fā)抗體反應(yīng)而獲得免疫。在其表面表達(dá)gp39的細(xì)胞也可用作免疫原?？晒┻x擇的免疫原包括純化的gp39蛋白或蛋白片段?？赏ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)的純化技術(shù)從gp39表達(dá)細(xì)胞得到純化gp39；gp39 cDNA(Armitage et al.，Nature，35780-82(1992)；Lederman et al.，J.Exp.Med.，1751091-1101(1992)；Hollenbaugh et al.，EMBO J.，114313-4319(1992))可在宿主細(xì)胞中表達(dá)，例如細(xì)菌或某種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，并將gp39蛋白純化。gp39肽可以在gp39氨基酸序列基礎(chǔ)上合成(Armitageet al.，Nature，35780-82(1992)；Lederman et al.，J.Exp.Med.，1751091-1101(1992)；Hollenbaugh et al.，EMBO J.，114313-4319(1992))。給予蛋白質(zhì)致敏性(包括與載體結(jié)合)的技術(shù)，以及其它技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員都非常熟悉。例如，該蛋白質(zhì)可在有佐劑時(shí)給藥。免疫的過(guò)程可通過(guò)檢測(cè)血漿或血清中抗體滴度來(lái)監(jiān)測(cè)。可用免疫原作為抗原，用標(biāo)準(zhǔn)ELISA或其它免疫測(cè)定方法來(lái)測(cè)定抗體水平。
免疫發(fā)生后，可獲得抗血清，如果需要，還可從血清中分離到多克隆抗體。為生產(chǎn)單克隆抗體，可從免疫動(dòng)物獲得產(chǎn)生抗體的細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的體細(xì)胞融合程序使之與骨髓瘤細(xì)胞融合，使這些細(xì)胞永生并產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。這種技術(shù)為該領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。例如，最初由Kohler和Milstein發(fā)展起來(lái)的雜交瘤技術(shù)(Nature(1975)256495-497)，及其它技術(shù)如人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbar et al.，Immunol.Today(1983)472)，EBV雜交瘤技術(shù)，以生產(chǎn)人單克隆抗體(Cole et al.，MonoclonalAntibodies in Cancer Jherapy(1985))(Allen R.Bliss，Inc.，Pages 77-96)，以及抗體庫(kù)的篩檢(Huse et al.，Science(1989)2461275)。可用免疫化學(xué)篩選雜交瘤細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)與蛋白質(zhì)或多肽特異性反應(yīng)的抗體并分離單克隆抗體。
本文所指的抗體試圖包括與gp39蛋白或其肽或gp39融合蛋白特異性反應(yīng)的片段?？贵w可用常規(guī)技術(shù)分解為片段，并且如上所述這些片段篩選后應(yīng)用可具有全部抗體的作用。例如F(ab′)2片段可由胃蛋白酶處理抗體而產(chǎn)生，所產(chǎn)生的F(ab′)2片段可經(jīng)處理以減少雙硫橋鏈而產(chǎn)生Fab′片段。本發(fā)明的抗體還試圖包括含抗gp39部分的雙重特異性和嵌合的分子。
當(dāng)用不是在人體宿主生產(chǎn)的抗體來(lái)治療人時(shí)，可能不同程度地將這些抗體識(shí)別的外來(lái)物質(zhì)，發(fā)生免疫反應(yīng)。減少或消除這一問題的優(yōu)于全身免疫抑制的一個(gè)途徑是，產(chǎn)生嵌合體抗體衍生劑，即將非人的動(dòng)物的可變區(qū)和人的恒定區(qū)結(jié)合起來(lái)的抗體分子。例如嵌合抗體分子可包括來(lái)源于小鼠、鼠或其它種類動(dòng)物的抗體的抗原結(jié)合區(qū)，以及人的恒定區(qū)。多種制作嵌合抗體的方法已描述并可被用于制造含有識(shí)別gp39的免疫球蛋白可變區(qū)的嵌合抗體，例如Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.816851(1985)；Takeda etal.，Nature 314452(1985)，Cabilly et al.，U.S.PatentNo.4,816,567；Boss et al.，U.S.Patent No.4,816,397；Tanaguchi et al.，European Patent Publication EP 171496；European Patent Publication 0173494，United Kingdom PatentGB 2177096B。期望這種嵌合抗體比相應(yīng)的非嵌合抗體在人類受試者中將產(chǎn)生更小的免疫原性。
為用于人的治療，與gp39蛋白或肽特異反應(yīng)的單克隆或嵌合抗體，可以通過(guò)產(chǎn)生人恒定區(qū)嵌合體進(jìn)一步人化，在變異區(qū)，尤其是抗原結(jié)合部位的保守框架區(qū)，是人原的，只有超變區(qū)是非人原的。這種改變的免疫球蛋白分子可通過(guò)大家熟知的某些技術(shù)來(lái)制造，(例如，Teng et al.，Proc.Natl.A cad.Sci.U.S.A.，807308-7312(1983)；Kozbor et al.，Immunology Today，47279(1983)；Olsson et al.，Meth.Enzymol.，923-16(1982))，并優(yōu)選根據(jù)PCT Publication WO 92/06193或EP 0239400的方法制造。人化的抗體可以商業(yè)化生產(chǎn)，例如，由Scotgen Limited，2 HollyRoad，Twickenham，Middlesex，Great Britain。
另一種產(chǎn)生抗gp39蛋白或肽的特異性抗體或抗體片段的方法是，篩檢編碼免疫球蛋白基因的與gp39蛋白或肽一起在細(xì)菌中表達(dá)的表達(dá)庫(kù)或其中部分。例如完整的Fab片段，VH區(qū)和FV區(qū)可以用噬菌體表達(dá)文庫(kù)在細(xì)菌表達(dá)。示例見Ward et al.，Nature，341544-546(1989)；Huse et al.，Science，2461275-1281(1989)；以及McCafferty et al.，Nature，348552-554(1990)。例如，用gp39肽去篩檢這種文庫(kù)，可以確定與gp39反應(yīng)的免疫球蛋白片段。可選擇Genpharm建立的SCID-hu小鼠來(lái)生產(chǎn)抗體或者其片段。B.gp39的可溶性配基其它能夠在給藥后抑制體液免疫的gp39拮抗劑是gp39配基的可溶形式。一種單價(jià)的gp39可溶性配基能與gp39結(jié)合，從而抑制gp39和B細(xì)胞上CD40間的相互作用。這里可溶性指配基并非持續(xù)地保持在細(xì)胞膜上。可溶性gp39配基可通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備，或者，優(yōu)選通過(guò)重組DNA技術(shù)制備。一種優(yōu)選的可溶性gp39配基是可溶性CD40。除此，可溶性gp39配基還可以是融合蛋白的形式。這種融合蛋白至少部分由連接著第二個(gè)分子的gp39配基組成。例如CD40可以表現(xiàn)為帶有免疫球蛋白(CD40Ig)的融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生的融合蛋白含有CD40細(xì)胞外區(qū)部分的氨基酸殘基，連接在Cγ1的鉸鏈、CH2及CH3區(qū)域相應(yīng)的序列的氨基酸殘基上，形成CD40Ig融合蛋白(見例如，Linsley et al.，(1991)J.Exp.Med.1783721-730；Capon et al.，(1989)Nature 337，525-531；及Copon U.S.5,116,964)。該融合蛋白可由化學(xué)合成產(chǎn)生，或者優(yōu)選地通過(guò)重組DNA技術(shù)在CD40的cDNA基礎(chǔ)上產(chǎn)生(Stamenkovic et al.，EMBOJ.81403-1410(1989))。II.體液免疫被抑制的抗原本發(fā)明針對(duì)抑制對(duì)抗原的體液免疫，它需要Th細(xì)胞釋放的接觸依賴性輔助作用。被經(jīng)典地描述為胸腺依賴性(TD)抗原的抗原，包含在本發(fā)明之中。對(duì)來(lái)自Th細(xì)胞的接觸依賴“輔助”的需要是由于對(duì)T細(xì)胞上gp39和B細(xì)胞上CD40之間相互作用的需要。如本發(fā)明所確定的，術(shù)語(yǔ)“TD抗原”是試圖包括那些需要在T細(xì)胞和B細(xì)胞之間gp39-CD40相互作用來(lái)誘導(dǎo)對(duì)抗原的體液免疫應(yīng)答的抗原。通常，蛋白抗原是TD抗原。本發(fā)明所包含的其它形式的TD抗原是一種分子，稱為半抗原，與一種蛋白質(zhì)連接。這種情況下，蛋白質(zhì)作為一種載體引起T細(xì)胞輔助，從而誘導(dǎo)對(duì)該半抗原的體液免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的TD抗原可以溶解形式給受試者給藥，例如注射一種可溶解的蛋白?；蛘逿D抗原可以在某細(xì)胞的表面，例如某種細(xì)胞表面蛋白。該TD抗原可以與gp39拮抗劑一起向受試者投藥，或者受試者暴露于某種TD抗原環(huán)境，例如變應(yīng)素。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，TD抗原是作為一種為治療性目的施用于受試者的藥劑。例如，這種藥劑(一種TD抗原)可以是一種治療性抗體，或治療藥物的其它形式。例如，抑制對(duì)某種治療性抗體的體液免疫應(yīng)答，能夠通過(guò)防止受試者中該治療性抗體的清除，來(lái)延長(zhǎng)其在體內(nèi)的治療時(shí)間。如果小分子(作為半抗原)與蛋白質(zhì)或其它載體結(jié)合給藥，能誘導(dǎo)T細(xì)胞輔助功能去激活B細(xì)胞則作為治療劑的小分子也可以是使針對(duì)其所免疫應(yīng)答受抑制的目標(biāo)抗原；抑制對(duì)這些治療性藥劑的體液免疫同樣能延長(zhǎng)其療效。
本發(fā)明的方法提供抑制對(duì)TD抗原體液免疫應(yīng)答，而并不影響對(duì)胸腺非依賴性II型(TI-2)抗原的免疫應(yīng)答。TI-2抗原包括多糖和脂，它們能以多克隆的方式非特異性激活B細(xì)胞。正如本發(fā)明所確定的，術(shù)語(yǔ)“TI-2”抗原試圖包括所有那些不需要在T細(xì)胞和B細(xì)胞之間gp39-CD40相互作用來(lái)誘導(dǎo)對(duì)抗原的體液免疫應(yīng)答的抗原。本發(fā)明提供了一種鑒別一種抗原是TD抗原還是TI-2抗原的方法，正如發(fā)明中所確定的，通過(guò)對(duì)該抗原的體液免疫應(yīng)答是否被gp39拮抗劑所抑制來(lái)決定。III.體液免疫的抑制本發(fā)明是關(guān)于抑制對(duì)TD抗原的體液免疫應(yīng)答的方法。體液免疫應(yīng)答可以是在初次暴露于TD抗原時(shí)的初次體液免疫應(yīng)答，或者是再次暴露于該抗原的再次體液免疫應(yīng)答。一種或多種異型抗體的產(chǎn)生可被抑制。對(duì)于初次體液免疫應(yīng)答，IgM是產(chǎn)生的最主要的抗體，IgM被抑制最顯著。對(duì)于再次體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生一些不同抗體，包括IgM，IgG以及IgE均可能被抑制。
本發(fā)明提供了延長(zhǎng)對(duì)TD抗原體液免疫抑制的方法。這里所用的“延長(zhǎng)抑制”意思是指在體內(nèi)施用gp39結(jié)束后能維持對(duì)TD抗原的抗體產(chǎn)生的抑制。IV.gp39拮抗劑的施用根據(jù)這里所描述的方法，對(duì)于暴露于TD抗原的受試者，給予gp39拮抗劑，能夠抑制其對(duì)TD抗原的體液免疫應(yīng)答。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，gp39拮抗劑與TD抗原聯(lián)合給藥。優(yōu)選該gp39拮抗劑與TD抗原同時(shí)給藥，但可以在TD抗原之前、或TD抗原之后給藥，只要在TD抗原誘導(dǎo)B細(xì)胞活化前給gp39拮抗劑就行。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，受試者暴露于抗原環(huán)境。這種情況下，應(yīng)在暴露于抗原后體內(nèi)給gp39拮抗劑，盡可能抓緊時(shí)間以防B細(xì)胞活化。
本發(fā)明中拮抗劑以適合體內(nèi)藥物學(xué)用藥的生物學(xué)的適當(dāng)形式施用，以抑制體液免疫應(yīng)答。通過(guò)“適合體內(nèi)藥物學(xué)用藥的生物學(xué)適當(dāng)形式”意思是指使蛋白質(zhì)的治療作用超過(guò)了毒性作用的這種拮抗劑的給藥形式。術(shù)語(yǔ)受試者試圖包括可被誘發(fā)免疫反應(yīng)的活的生物體，例如哺乳動(dòng)物。這些受試者包括例如人，狗，描，小鼠，大鼠，以及這些受試者的轉(zhuǎn)基因種。本文描述的阻礙gp39和CD40相互作用的拮抗劑，其給藥可以是以任何藥理學(xué)形式和一種藥學(xué)可接受載體。該發(fā)明的治療性合成物的治療作用量的給藥定義為有效量，達(dá)到期望結(jié)果所必須的劑量和時(shí)間。例如，阻礙gp39和CD40相互作用的拮抗劑的治療作用量可能根據(jù)諸如疾病狀況，個(gè)體的年齡、性別、體重，以及拮抗劑在個(gè)體中誘導(dǎo)所期望的免疫反應(yīng)的能力因素不同而不同。劑量可調(diào)整到提供最適宜的治療反應(yīng)。例如，可以分成每日數(shù)次給藥，或者根據(jù)治療情況下病情危重情況適當(dāng)減少給藥。
活性化合物(例如拮抗劑)可以常規(guī)方式給藥，比如注射(皮下，靜脈內(nèi)，等)，口服給藥，吸入，經(jīng)皮膚應(yīng)用，或直腸給藥。根據(jù)給藥途徑不同，活性化合物可包裹某種材料以防該化合物被酶、酸和其它可能使該化合物滅活的自然條件所作用。
給予阻礙gp39和CD40相互作用的拮抗劑，尤其是胃腸道給藥，可能有必要將拮抗劑包裹或同時(shí)給予某種物質(zhì)以防滅活。例如，可用適當(dāng)?shù)妮d體或稀釋劑，聯(lián)合給予酶抑制劑，或者在適當(dāng)?shù)妮d體如脂質(zhì)體中，將拮抗劑有效地給藥到個(gè)體體內(nèi)。藥學(xué)可接受的稀釋劑包括鹽水和水性緩沖溶液。酶抑制劑包括胰蛋白酶抑制劑，異丙氟磷和抑肽酶。脂質(zhì)體包括水包油包水乳劑以及常規(guī)脂質(zhì)體(Strejan et al.，(1984)J.Neuroimmunol 727)。
該活性化合物還可以胃腸道外給藥或腹腔內(nèi)給藥?？捎酶视汀⒁簯B(tài)聚乙二醇，以及其混和物或油作為分散劑。在通常儲(chǔ)存和使用條件下，這些制劑能維持較好的保存，防止微生物生長(zhǎng)。
適合可注射使用的藥物組合物包括無(wú)菌水溶液(可水溶)或分散劑和無(wú)菌粉末，以供臨時(shí)制備無(wú)菌可注射溶液或分散體。但在任何情況下，都必須無(wú)菌，而且注射使用簡(jiǎn)單并在體內(nèi)分布廣泛。在生產(chǎn)和儲(chǔ)存條件下必須穩(wěn)定，必須防止微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或分散劑，例如包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油，聚乙二醇，液態(tài)聚乙二醇，和其它類似物)，及其適當(dāng)?shù)幕旌衔铩＠?，通過(guò)裹上卵磷脂外殼，通過(guò)保持在分散過(guò)程中必要的粒子大小，以及通過(guò)使用表面活性劑，可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。通過(guò)各種抗細(xì)菌和抗真菌劑，例如，對(duì)羥苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚、asorbic acid、硫柳汞等，可達(dá)到防止微生物作用的目的。大多數(shù)情況下，優(yōu)選溶液組成中還包括等滲劑，例如糖，多元醇如甘露醇、山梨糖醇、氯化鈉。在溶液中加入延遲吸收劑，如硬脂酸鋁和明膠，能夠延長(zhǎng)對(duì)可注射組分的吸收。
可以通過(guò)將需要量的活性化合物(例如干擾gp39和CD40相互作用的拮抗劑)根據(jù)需要與上述的一種或幾種組分的組合在適當(dāng)?shù)娜軇├锘旌?，制備無(wú)菌注射溶液，然后通過(guò)過(guò)濾滅菌。通常，通過(guò)在包含基礎(chǔ)分散劑與所需的如上所述的其它成分的無(wú)菌載體內(nèi)將活性化合物混入而配制成分散系。當(dāng)用無(wú)菌粉末制備無(wú)菌注射溶液時(shí)，優(yōu)選的制備方法是真空干燥或凍干，產(chǎn)生活性成分再加上從已無(wú)菌過(guò)濾溶液中選擇的所需要的組分的粉末。
當(dāng)該活性化合物采用上述方法適當(dāng)保護(hù)后，可以口服給藥，例如用惰性稀釋劑或可吸收的可食用的載體。這里所用的“藥學(xué)可接受載體”包括任何和所有溶劑、分散劑、包裹物、抗細(xì)菌及抗真菌劑、同型及吸收延遲劑等等。用這些介質(zhì)或藥劑制備藥學(xué)活性物質(zhì)已為同行所共知。除此之外只要任何其它通常的介質(zhì)或藥劑與本活性化合物不相適合，則在該治療學(xué)組成中應(yīng)用它們應(yīng)予斟酌。增加的活性化合物也可以加入到組合物中。
這一點(diǎn)尤其有利，將胃腸道外組合物形成劑量單位形式，方便給藥和統(tǒng)一劑量形式。本文所用的劑量單位形式指物理分割單位，將其分割為單元?jiǎng)┝恳杂糜诓溉轭悇?dòng)物受試者的注射治療；聯(lián)合使用所需的藥物載體，每個(gè)單位含有經(jīng)計(jì)算能產(chǎn)生所需要的治療效果的活性化合物的預(yù)先確定的量。本發(fā)明的劑量單位形式的設(shè)計(jì)規(guī)范取決于和直接依賴于(a)活性化合物的獨(dú)特特征和所要達(dá)到的特定治療效果，以及(b)合成用于治療個(gè)體敏感性的這種活性化合物的技術(shù)本身的內(nèi)在限制。V.gp39拮抗劑與其它免疫抑制劑聯(lián)合給藥已經(jīng)表明，觸發(fā)CD28的可溶性CTLA-4，Th細(xì)胞上的一種共同刺激分子的干擾，也抑制TD抗體反應(yīng)[30]，和阻斷異體移植排異[31]。與抗gp39給藥相似，可溶性CTLA-4誘導(dǎo)一種延長(zhǎng)免疫抑制的狀態(tài)。因?yàn)榭筭p39和CTLA-4介導(dǎo)的免疫抑制效果是在體液免疫應(yīng)答的不同步驟，因此這兩種免疫抑制藥物聯(lián)合給藥可產(chǎn)生累加的或協(xié)同的免疫抑制效果。
變態(tài)反應(yīng)由IgE抗體介導(dǎo)。IgE反應(yīng)的產(chǎn)生需要細(xì)胞因子IL-4。聯(lián)合施用gp39拮抗劑和一種IL-4抑制劑，例如一種抗IL-4抗體，對(duì)于抑制對(duì)TD抗原的IgE反應(yīng)可能更加有效。
下列實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為僅限于此。所包括的參考文獻(xiàn)和整個(gè)本申請(qǐng)中所引用的公開的專利申請(qǐng)的內(nèi)容合并入本文作為參考。帶有名為Randolph J.Noelle et al.以及冠以“導(dǎo)致抗原特異性T細(xì)胞耐受”的與本文同一日期提交的專利申請(qǐng)的內(nèi)容也合并入本文作為參考。
下面是實(shí)例中所用的方法學(xué)。材料和方法動(dòng)物，雌性，6～8周齡Balb/c小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)在本研究中用于體內(nèi)試驗(yàn)。動(dòng)物飼養(yǎng)在DartmouthMedical School的特殊的無(wú)病原動(dòng)物機(jī)構(gòu)。輔助T細(xì)胞克隆(Th1)，從Worcester的University of Mass.的Dr.David Parker那里得到D1.6，一種I-Ad限制的兔Ig特異性Th1克隆[21]。在本報(bào)告中，D1.6將被稱為Th1。試劑和抗體，由DEAE HPLC從腹水中純化的倉(cāng)鼠抗鼠gp39單克隆抗體MR1[16]。倉(cāng)鼠Ig(HIg)，用作對(duì)照抗體，從倉(cāng)鼠血清中采取類似純化得到(Accurate Chemical and Scientific Corp.，Westbuty，NY)。RG7/7.6.HL，一種小鼠抗大鼠κ鏈抗體(與倉(cāng)鼠κ鏈強(qiáng)烈反應(yīng))，(RG7)[22]，與HRPO或FITC結(jié)合用作檢測(cè)MR1和HIg的第2試劑。親和純化的山羊抗小鼠IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b及IgG3(Southern Biotechnology，Birmingham Al)用作在全部IgM和IgG1ELISA以及抗原特異性ELISA時(shí)的檢測(cè)抗體。B1E3(由Dr.T.Waldschmidt，Univ.of Iowa友好提供)，一種單克隆抗鼠IgE，用作抗KLH ELISA IgE的檢測(cè)抗體。嵌合L6(Chi-L6)，一種腫瘤抗原L6特異性人化IgG1[23]，由Bristol-Myers SquibbPharmaceutical Research Institute，Seattle WA友好提供。抗CD4，GK1.5[24]用HPLC從腹水中純化制備。綿羊紅細(xì)胞(SRBC)從Colorado Serum Co.(Denver，CO)購(gòu)買。用于抗SRBC空斑測(cè)定的Sea Plaque瓊脂從FMC公司獲得(Rockland MA)。全部幼兔從Cedarlane購(gòu)買(Hornby，Ontario Canada)。KLH鑰孔血藍(lán)蛋白從Calbiochem購(gòu)買(LaJolla，CA)。用于免疫的完全弗氏佐劑(CFA)從Sigma Chemical Co得到(St.Louis，MO)。TNP-SRBC，TNP-KLH及TNP-BSA如前述方式制備[25]。體內(nèi)產(chǎn)生初次和再次抗體反應(yīng)的免疫接種初次免疫應(yīng)答，為引起對(duì)SRBC或TNP-SRBC的初次抗體反應(yīng)，給小鼠靜注200μl 1％的SRBC懸液使之產(chǎn)生免疫。在給抗原5天后用一種改良的Jenne空斑分析方法分析抗SRBC應(yīng)答的IgM[26]，在6天后用ELISA檢測(cè)抗TNP應(yīng)答的IgM。對(duì)異種免疫球蛋白Chi-L6的初次應(yīng)答通過(guò)給每只小鼠腹腔內(nèi)注射100μg明礬Chi-L6使之產(chǎn)生免疫。血清IgM抗Chi-L6抗體反應(yīng)在7天后檢測(cè)。對(duì)TNP-Ficoll的初次應(yīng)答通過(guò)腹腔內(nèi)注射25μg TNP-Ficoll產(chǎn)生免疫。IgM抗TNP反應(yīng)在第6天用ELISA檢測(cè)。再次免疫應(yīng)答，為產(chǎn)生對(duì)KLH的再次體液應(yīng)答，給動(dòng)物腹腔內(nèi)注射50μg完全弗氏佐劑中的KLH使之免疫。斷而在3個(gè)月后再給10μg可溶性KLH腹腔注射)。在第7天用同型特異性ELISA從免疫鼠血清中檢測(cè)抗KLH抗體反應(yīng)。通過(guò)腹腔內(nèi)注射10μg可溶性Chi-L6引起的Chi-L6免疫，產(chǎn)生對(duì)Chi-L6的再次抗體反應(yīng)。7天后檢測(cè)血清IgG1抗Chi-L6抗體反應(yīng)。抗gp39處理，按照每一實(shí)驗(yàn)的安排，在第0，2，4天給予已免疫或免疫性性試驗(yàn)者(腹腔注射)無(wú)菌的HPLC純化抗gp39(MR1)或HIg(作為一種抗體對(duì)照)?？乖禺愋訣LISA，抗原特異性IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3及IgE抗體滴度通過(guò)同型特異性ELISA來(lái)確定。簡(jiǎn)單地說(shuō)，抗原(在磷酸鹽緩沖液中1mg/ml的KLH，Chi-L6，TNP16-BSA，或TNP2-BSA)被吸收到撓性聚乙烯微滴盤中，4℃過(guò)夜。盤用PBS-1％ FCS-鈉-迭氮化物沖洗并阻斷。稀釋的血清樣品在37℃孵化2小時(shí)。樣本洗脫并用如下堿性磷酸酶連接的檢測(cè)抗體中的一種來(lái)確定抗原特異性抗體滴度山羊抗小鼠IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，或IgG3(Southern Biotechnology，Birmingham，Al)。IgE特異性ELISA檢測(cè)用生物素連接的B1E3，繼之以堿性磷酸酶抗生物素蛋白(SouthSan Francisco，CA)。所有ELISA均建立在堿性磷酸酶與磷酸酶基質(zhì)反應(yīng)之上(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。滴盤用Dynatech MR700 ELISA閱讀器在410nm下辨讀分析。每個(gè)單位代表標(biāo)準(zhǔn)免疫血清滴定曲線的基礎(chǔ)上任意定的值。所有實(shí)驗(yàn)組都滴定從1∶100到1∶100000，并且滴度的確定是在多點(diǎn)分析的基礎(chǔ)上。而未進(jìn)行免疫刺激的對(duì)照組的抗KLH、抗Chi-L6及抗TNP抗體的水平在可測(cè)值以下。
血清抗gp39的檢測(cè)抗gp39處理的小鼠血清中完整的抗gp39的定量從在第0、2、4天各250μg，共750μg抗gp39處理的鼠，分別在從抗gp39處理開始的第7、14和21天提取血清。血清在非還原條件下在7.5％SDS凝膠上電泳，轉(zhuǎn)移到硝化纖維素，并用HRPO連接的RG7染色。化學(xué)熒光檢測(cè)后，對(duì)應(yīng)于150～165KDa的斑區(qū)用Apple Scanner及圖象4.1軟件程序掃描計(jì)數(shù)。處理組小鼠血清中生物活性抗gp39的測(cè)定表達(dá)gp39的抗CD3激活的Th1，被接收750μg抗gp39(250μg分別在第0、2、4天)處理的小鼠血清的稀釋液的染色，用來(lái)確定血清中殘留的生物活性gp39的量。血清中所含抗gp39滴定法是，與活性Th1細(xì)胞克隆一起4℃孵化30分鐘，洗脫，再與FITC-RG7一起4℃孵化30分鐘，用純化的抗gp39產(chǎn)生出MF1與抗gp39濃度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在BectonDickinson FACScan中進(jìn)行樣本分析，血清中殘留的抗gp39的百分比根據(jù)gp39標(biāo)準(zhǔn)曲線推定。血清中第7天的抗gp39水平被定為100％。采用的輔助T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，鼠被用SRBC(200μl 1％ SRBC，靜脈注射)免疫并被施予抗gp39或HIg(250μg分別在第0、2、4天給藥)。第7天從非免疫的或SRBC免疫的鼠移出脾細(xì)胞，去除紅細(xì)胞、洗脫并移至(經(jīng)靜脈，50×106/鼠)經(jīng)輻照的受體(600拉德)，同時(shí)可有或無(wú)取自TNP-KLH刺激的(TNP-KLH-CFA，50μg，i.p.)鼠的50×106脾細(xì)胞作為免疫B細(xì)胞源。轉(zhuǎn)導(dǎo)的同時(shí)，用TNP-SRBC(200μl，1％ TNP-SRBC，i.v.)免疫小鼠。轉(zhuǎn)導(dǎo)后第7天可確定血清IgG1抗TNP滴度。
實(shí)施例1抗gp39抑制對(duì)紅細(xì)胞抗原的初次抗體應(yīng)答的發(fā)生在HIM病人觀察到TD免疫力缺陷，以及抗gp39和CD40Ig在體內(nèi)對(duì)Th依賴性B細(xì)胞活性的有效抑制效果，為抗gp39在體內(nèi)對(duì)體液介導(dǎo)免疫的潛在免疫抑制作用研究提供了基礎(chǔ)。為研究在體內(nèi)初次TD體液免疫應(yīng)答時(shí)gp39-CD40相互作用的意義，確定了在體內(nèi)施用抗gp39對(duì)針對(duì)綿羊紅細(xì)胞(SRBC)的初次抗體反應(yīng)的影響。動(dòng)物被SRBC免疫，并在4天內(nèi)施用抗gp39mAb(或?qū)φ誋Ig)。第5天，抗gp39處理、HIg處理及對(duì)照小鼠的初次抗SRBC抗體應(yīng)答被確定。與對(duì)照或HIg處理的小鼠的抗SRBC PFC應(yīng)答相比，接受總量1.5mg抗gp39(500μg/鼠，在第0、2、4天分別給藥)的小鼠的IgM抗SRBC斑形成細(xì)胞(PFC)應(yīng)答降低99％(圖1A)。此外，抗gp39接受量小至300μg/鼠(100μg/鼠，在0、2、4天給藥)，其抗SRBC初次免疫應(yīng)答降低66％。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明抗gp39治療削弱了體內(nèi)的初次抗體應(yīng)答。
繼而研究了抗gp39對(duì)SRBC的初次體液免疫應(yīng)答的免疫抑制作用的持續(xù)時(shí)間。用抗gp39處理SRBC免疫的鼠4天，并分析在此后不同的時(shí)間點(diǎn)其提高初次抗SRBC應(yīng)答的能力。在該試驗(yàn)中，所有動(dòng)物均在第0天用SRBC免疫，并在第0、2、4天施用抗gp39或HIg。一個(gè)小組在第5天測(cè)定IgM抗SRBC PFC應(yīng)答。其它SRBC免疫組在第7或14天被用SRBC刺激。在每個(gè)抗原刺激后5天(分別為第12和19天)，測(cè)定IgM抗SRBC PFC應(yīng)答。這種試驗(yàn)其中之一的結(jié)果見圖1B所描述。正如在圖1A中，在抗gp39給藥開始后5天，初次抗SRBC應(yīng)答被抑制80～90％。另外，在抗gp39處理后12和19天，初次抗SRBC應(yīng)答也被抑制90％以上。這些結(jié)果說(shuō)明短暫的抗gp39處理導(dǎo)致延長(zhǎng)抑制初次抗體應(yīng)答。
實(shí)施例2抗gp39抑制再次抗KLH抗體應(yīng)答的發(fā)生檢驗(yàn)初次抗體應(yīng)答的實(shí)驗(yàn)提示，gp39-CD40的相互作用在引起初次體液免疫中起了非常重要的作用。然而這些實(shí)驗(yàn)沒有論及gp39依賴的CD40的信號(hào)對(duì)于再次抗體應(yīng)答的產(chǎn)生是否需要。因此，抗gp39的施用對(duì)于KLH的可溶性刺激的再次免疫應(yīng)答的作用，通過(guò)KLH免疫的小鼠來(lái)確定。
用降低初次抗SRBC PFC應(yīng)答的抗gp39給藥時(shí)間表，設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)抗gp39處理對(duì)再次性抗體應(yīng)答的作用。在這些實(shí)驗(yàn)中，KLH免疫小鼠(3個(gè)月前用CFA和KLH免疫)被用可溶性KLH刺激(10μg/鼠/i.v.)。在抗原刺激之日(第0天)，同時(shí)給予小鼠250μg抗gp39或HIg，繼而在第2、4天給予抗gp39或HIg。在KLH刺激后的第7天(圖2照片A)及第14天(圖2照片B)，給鼠取血測(cè)定IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3及IgE抗KLH抗體的滴度。結(jié)果說(shuō)明了幾點(diǎn)1)可溶性KLH刺激引起持續(xù)再次免疫應(yīng)答，持續(xù)14天以上；2)施用抗gp39與施用同量的HIg相比，明顯降低同型再次抗KLH應(yīng)答；及3)抗gp39的免疫抑制作用似乎可維持在初次給抗gp39處理后至少14天?？傊?，這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，與初次體液免疫應(yīng)答相似，再次體液免疫應(yīng)答的發(fā)生也可以被抗gp39抑制。實(shí)施例3抗gp39抑制對(duì)異種Ig的抗體應(yīng)答的發(fā)生圖1描述的實(shí)驗(yàn)表明抗gp39在對(duì)強(qiáng)免疫原性顆?？乖?SRBC)的初次應(yīng)答中的免疫抑制能力。紅細(xì)胞的細(xì)胞屬性使得其在引發(fā)強(qiáng)免疫應(yīng)答的能力方面是獨(dú)特的。異種Ig分子也具有這種高度的免疫原性特征，因而提供了一種額外的模型抗原系統(tǒng)，用來(lái)檢查抗gp39處理對(duì)于初次和再次抗體反應(yīng)發(fā)生的作用。動(dòng)物用異種Ig分子，Chi-L6，一種人化的小鼠抗腫瘤細(xì)胞mAb來(lái)免疫，并用抗gp39或?qū)φ誋Ig處理。7天后，收集血清并分析IgM抗Chi-L6抗體的產(chǎn)生。此外，在鼠初次免疫并用gp39處理后14天用Chi-L6刺激，第21天測(cè)定IgG1抗Chi-L6抗體產(chǎn)生。圖3描述該實(shí)驗(yàn)之一的結(jié)果。用抗gp39處理的小鼠與用HIg處理的小鼠相比，其對(duì)Chi-L6的初次抗體應(yīng)答被抑制90％以上。而且對(duì)Chi-L6的再次IgG1應(yīng)答也類似地被抑制。這些結(jié)果表明，抗gp39處理抑制了對(duì)第二型TD抗原、異體IgG的初次和再次抗體應(yīng)答，就象其有效地抑制對(duì)紅細(xì)胞和可溶性蛋白抗原的應(yīng)答一樣。實(shí)施例4抗gp39不抑制對(duì)T非依賴性II型抗原，TNP-Ficoll的初次抗體應(yīng)答的發(fā)生雖然前面的實(shí)驗(yàn)表明抗gp39有效地抑制了在體內(nèi)對(duì)TD抗原的初次和再次抗體應(yīng)答的發(fā)生，但gp39-CD40相互作用在對(duì)TI抗原體液免疫的發(fā)生方面是否起作用還不清楚。有關(guān)報(bào)告提供的數(shù)據(jù)表明，對(duì)TI II型抗原、TNP-Ficoll的免疫，導(dǎo)致體內(nèi)Th細(xì)胞的gp39表達(dá)。為了弄清gp39-CD40相互作用對(duì)于TI抗原的抗體應(yīng)答的發(fā)生是否必要，分析了抗gp39處理對(duì)TNP-Ficoll免疫鼠的作用。用抗gp39或HIg處理用TNP-Ficoll或TNP-SRBC免疫的小鼠，6天后測(cè)定IgM抗TNP抗體反應(yīng)。圖4A表明，用TD抗原TNP-SRBC免疫的動(dòng)物誘發(fā)了顯著的抗TNP血清抗體反應(yīng)。正如根據(jù)前述實(shí)驗(yàn)所預(yù)測(cè)的，抗gp39處理強(qiáng)烈抑制了這些鼠的初次抗TNP應(yīng)答的發(fā)生。相反，TNP-Ficoll免疫的小鼠具有較高的抗TNP抗體反應(yīng)滴度(圖4B)；然而，用抗gp39處理并不抑制對(duì)TNP-Ficoll的抗體反應(yīng)。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說(shuō)明，與對(duì)TD抗原的反應(yīng)不同，抗gp39不抑制對(duì)TNP-Ficoll的體液免疫應(yīng)答的發(fā)生，提示對(duì)TI抗原的應(yīng)答可能是gp39非依賴性。實(shí)施例5施用gp39不能有效地消除SRBC特異性Th從以上實(shí)驗(yàn)知道，抗gp39阻礙TD體液免疫的建立；然而，抗gp39處理抑制體液應(yīng)答的機(jī)理并不清楚?？筭p39引起的免疫抑制可以被如下介導(dǎo)1)gp39耐受T細(xì)胞的負(fù)信號(hào)引起Th細(xì)胞無(wú)免疫性；2)抗gp39耐受CD4+T細(xì)胞的單克隆抗體介導(dǎo)細(xì)胞毒性的消除；以及/或者3)阻斷gp39與CD40結(jié)合。進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，通過(guò)抗gp39處理的觀察，以期探明延長(zhǎng)免疫抑制中的這些可能的作用機(jī)理。為探明抗原特異性Th被抗gp39處理消除或喪失免疫性的可能性，通過(guò)適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)gp39處理的小鼠的抗原特異性Th功能進(jìn)行了檢測(cè)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將鼠用SRBC免疫(以產(chǎn)生原發(fā)性SRBC特異性Th)，并施用抗gp39或HIg(250μg/鼠，第0、2、4天給藥)，7天后，將非免疫鼠的脾細(xì)胞或者HIg處理或抗gp39處理的小鼠的SRBC免疫脾細(xì)胞，適當(dāng)?shù)剞D(zhuǎn)導(dǎo)至帶有TNP免疫脾細(xì)胞作為TNP原發(fā)的B細(xì)胞源的受體鼠。將鼠用TNP-SRBC進(jìn)行類似的刺激，第5天測(cè)定IgG1抗TNP滴度。正如接受非免疫供體脾細(xì)胞的小鼠與接受SRBC引發(fā)免疫的動(dòng)物脾細(xì)胞的小鼠相比，所產(chǎn)生的IgG1抗TNP明顯低下這一事實(shí)所表明的，在受體鼠，SRBC引發(fā)的T輔助細(xì)胞對(duì)于誘發(fā)再次抗TNP反應(yīng)是需要的(圖5)。更重要的是，這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果揭示了，來(lái)自HIg處理的和抗gp39處理的小鼠的SRBC輔助功能是相似的，表明抗gp39處理并不改變Th功能或阻斷Th的引發(fā)。而且作為抗gp39處理的結(jié)果，并沒消除抗原反應(yīng)性Th或使之失去免疫性，因?yàn)門h細(xì)胞在轉(zhuǎn)導(dǎo)中提供了輔助作用。實(shí)施例6倉(cāng)鼠抗gp39的體內(nèi)清除前面的研究已經(jīng)確立了抗gp39(MR1)阻斷了gp39與CD40結(jié)合[15]，這就支持這樣的假設(shè)抗gp39的體內(nèi)免疫抑制作用是由于阻斷了gp39-CD40相互作用。假定這一假設(shè)正確，觀察抗gp39給藥的長(zhǎng)時(shí)間免疫抑制需要宿主中抗gp39的維持。為確定在免疫抑制得到證實(shí)的時(shí)間范圍內(nèi)抗gp39是否能被檢測(cè)，從血清中檢測(cè)抗gp39體內(nèi)清除率。小鼠接受4天的抗體給藥方案(3×250μg抗gp39)，在初次抗體給藥后第7、14、21天測(cè)定血清抗gp39水平。對(duì)非還原MR1(160kd)的Western blot分析表明，未破壞的血清抗gp39至少在初次抗體處理后21天還能檢測(cè)到(圖6A)。與初次抗體治療后7天的血清中抗gp39的水平相比，第21天血清抗gp39濃度接近5％(基于掃描光密度計(jì))。
雖然已確定血清中有完整的抗gp39，查明抗gp39是具有生物活性的這一點(diǎn)也同樣重要。因此，用在4天中接受3×250μg抗gp39的鼠血清染色gp39耐受Th(圖6B)。將最后一次注射后3天(初次抗體處理后7天)的血清抗gp39水平作為100％，初次抗體治療后14天，檢測(cè)出血清中生物活性抗gp39單克隆抗體接近10～15％，初次抗體治療后21天，血清中仍有抗gp39 2～3％。因此，用Western blot和生物學(xué)活性抗gp39檢測(cè)未被破壞的gp39的兩種方法都表明，在開始抗gp39治療后21天仍有近5％的抗gp39。這些結(jié)果表明，抗gp39的半衰期接近12天，并提供了與抗gp39延長(zhǎng)抑制體液免疫應(yīng)答是由于持續(xù)阻斷Th功能這一假說(shuō)一致的證據(jù)。
該研究表明，體內(nèi)施用阻斷了體內(nèi)gp39-CD40相互作用的抗gp39抗體，引起很深的對(duì)TD抗原的初次和再次體液免疫應(yīng)答抑制，但對(duì)TI II型抗原無(wú)此作用。另外，該研究表明，抗gp39處理并不阻斷抗原引發(fā)的Th細(xì)胞的引發(fā)。因此，gp39-CD40配基-受體對(duì)可以用作體液免疫應(yīng)答治療控制的目標(biāo)。
為弄清抗gp39是如何對(duì)體液免疫進(jìn)行免疫抑制作用的，研究了抗gp39對(duì)Th功能的直接作用。數(shù)據(jù)表明，抗gp39處理的小鼠的SRBC免疫Th完全能夠給適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)導(dǎo)提供輔助作用，提示抗gp39處理并不引起在體內(nèi)Th消除或失去免疫性。這些結(jié)果導(dǎo)致這樣推測(cè)抗gp39通過(guò)阻斷gp39與CD40結(jié)合而不是通過(guò)使gp39耐受Th失活來(lái)介導(dǎo)其免疫抑制作用的。為支持這一假設(shè)，建立了抗gp39阻斷gp39與CD40結(jié)合的體外研究[16]。而且，在免疫抑制發(fā)生期間可從血清中檢測(cè)出生物活性抗gp39。雖然在免疫抑制得到證實(shí)時(shí)在血清中出現(xiàn)的抗gp39只有5％，但有可能次級(jí)淋巴器官的特殊部位的抗gp39的局部組織濃度，比血清抗gp39濃度要高，而且清除率要低。用抗gp39處理小鼠長(zhǎng)時(shí)間地抑制對(duì)SRBC和異體Ig的初次免疫應(yīng)答90％以上。假如抗gp39通過(guò)阻斷gp39功能來(lái)介導(dǎo)抑制，這些數(shù)據(jù)提示gp39-CD40相互作用在對(duì)TD抗原的初次免疫應(yīng)答的建立方面是重要的。免疫組織化學(xué)分析確定，gp39被作為對(duì)TD抗原免疫的結(jié)果而引發(fā)，并可能具有重要功能。gp39表達(dá)的原位研究表明，在初次體液免疫應(yīng)答過(guò)程中g(shù)p39-CD40相互作用的最初位點(diǎn)是在外周動(dòng)脈淋巴鞘(PALS)的外周部分及脾終末動(dòng)脈周圍。正是在這些位置，發(fā)現(xiàn)了相互連接的gp39表達(dá)Th和抗原特異性B細(xì)胞共同存在，提示PALS周圍是在初次體液免疫應(yīng)答時(shí)T細(xì)胞和B細(xì)胞相互作用的主要部位。因而，PALS可能也是抗gp39干擾gp39表達(dá)Th細(xì)胞，最終抑制T-B細(xì)胞相互作用、繼而抑制Ig產(chǎn)生的部位。
與初次應(yīng)答相似，被CFA中的KLH引發(fā)的鼠，在給藥抗gp39后，其再次體液免疫應(yīng)答也表現(xiàn)出抑制。與抗gp39引起抗SRBC PFC降低相一致，還觀察到血清中對(duì)抗原刺激的抗體滴度也降低。小鼠血清中所有抗KLH的Ig同型體的檢測(cè)均因用抗gp39處理小鼠而降低(IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，及IgE)?？筭p39給藥的作用至少在用抗原再次刺激后14天仍有所表現(xiàn)，確定了抗gp39的持續(xù)性免疫抑制。抗gp39介導(dǎo)的對(duì)KLH的再次應(yīng)答的免疫抑制并非KLH所獨(dú)有的，因?yàn)閷?duì)異種Ig及異種紅細(xì)胞的再次免疫應(yīng)答也被抗gp39處理所抑制。gp39表達(dá)Th的解剖學(xué)分布與在初次免疫中觀察到的一樣，然而，gp39表達(dá)Th在免疫脾的分布頻度超過(guò)了在初次免疫應(yīng)答中觀察到的結(jié)果。在免疫脾的生發(fā)中心或?yàn)V泡未發(fā)現(xiàn)gp39表達(dá)Th。因此，這表明B細(xì)胞是在外周動(dòng)脈淋巴鞘和脾終末動(dòng)脈被觸發(fā)，與激活的Th細(xì)胞反應(yīng)，繼而轉(zhuǎn)移至濾泡和生發(fā)中心。
該研究的焦點(diǎn)是弄明抗gp39在對(duì)TD體液免疫控制中的潛在作用。抗gp39的簡(jiǎn)單治療方案導(dǎo)致延長(zhǎng)抑制，是這種治療性抗體的一種富有吸引力的標(biāo)志。特別感興趣的可能是抗gp39防止對(duì)其它異種、治療性抗體，如Chi-L6的初次和再次體液反應(yīng)的能力。這將使得病人能夠反復(fù)暴露于異種治療性抗體。實(shí)施例7抗gp39抗體的生產(chǎn)和鑒定實(shí)驗(yàn)1-直接抗人gp39抗體為在人體誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞耐受，優(yōu)選給某種直接抗人gp39的抗體。下面是用來(lái)生產(chǎn)小鼠抗人gp39單克隆抗體的方法學(xué)。Balb/c鼠用完全弗氏佐劑(CFA)中的可溶性gp39融合蛋白，gp39-CD8免疫。6周后用非完全弗氏佐劑(IFA)中的可溶性gp39-CD8刺激。再次免疫后4周，再給可溶形式的可溶性gp39-CD8。2周后，用活化的人外周血淋巴細(xì)胞強(qiáng)化。2周后，最后再用可溶性gp39-CD8強(qiáng)化。在最后一次免疫后第4天，脾細(xì)胞與NS-1融合伴侶融合，作為標(biāo)準(zhǔn)程序。
產(chǎn)生抗人gp39抗體的克隆是在多步篩選過(guò)程的基礎(chǔ)上選擇出來(lái)的。首先通過(guò)利用gp39-CD8進(jìn)行盤結(jié)合分析篩選。然后陽(yáng)性克隆再用對(duì)照CD8融合蛋白CD72-CD8篩選。那些CD8-CD72盤結(jié)合分析表現(xiàn)出陽(yáng)性的克隆被剔除。剩余的克隆靜置，并與人外周血淋巴細(xì)胞(PBL)作用6小時(shí)，用流式細(xì)胞計(jì)分析篩選。雜交瘤染色激活的，但不染靜置的，PBL被視作陽(yáng)性。最后，檢測(cè)剩余克隆的阻斷CD40Ig與盤結(jié)合gp39結(jié)合的能力。
最初約有300克隆通過(guò)gp39-CD8和CD72-CD8盤結(jié)合分析的篩選。在這些克隆中，發(fā)現(xiàn)有30個(gè)能檢測(cè)出盤結(jié)合gp39，而不能檢出CD8。繼而，這些克隆被篩選來(lái)檢測(cè)活性人PBL的gp39。約15個(gè)克隆檢測(cè)出活性PBL上的分子，但不能檢出靜息細(xì)胞。進(jìn)一步通過(guò)確定該克隆阻斷CD40Ig檢測(cè)盤結(jié)合gp39的能力來(lái)證實(shí)其特異性。該分析中，被試驗(yàn)的10個(gè)克隆中的3個(gè)阻斷CD40Ig的結(jié)合，這些克隆是3E4、2H5和2H8。本文所述的方法優(yōu)選使用這些克隆。那些在激活非靜息PBL試驗(yàn)中呈陽(yáng)性的克隆，也用激活的大鼠T細(xì)胞克隆POMC8再篩選其活性?？寺?H8表現(xiàn)出與該大鼠T細(xì)胞系的交叉反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)2-直接抗人gp39的抗體用實(shí)驗(yàn)1所描述的類似的免疫過(guò)程生產(chǎn)另外的直接抗人gp39抗體。一只Balb/c小鼠用CFA中的可溶性gp39-CD8免疫，繼而4周后用6h活性人外周血淋巴細(xì)胞刺激。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)程序NS-1融合部分與脾細(xì)胞融合的前4天，用可溶性gp39-CD8強(qiáng)化。雜交瘤克隆的篩選通過(guò)6h活性人PBL染色、流式細(xì)胞計(jì)分析。將被活性而非靜息人PBL染色的克隆篩選出來(lái)。6個(gè)克隆被選出作進(jìn)一步分析4D9-8，4D9-9，24-31，24-43，89-76，及89-79。
所篩選出的抗體的特異性通過(guò)數(shù)項(xiàng)測(cè)定來(lái)確定。首先，流式細(xì)胞計(jì)分析表明，所有6個(gè)單克隆抗體染色活性而非靜息外周血T細(xì)胞(見圖7B和7C，作為代表性例子，描述活性T細(xì)胞被4D9-8和4D9-9分別染色)。被6種抗體中任一種辨識(shí)的分子的表達(dá)可在活化4小時(shí)內(nèi)被檢測(cè)，活化后6～8小時(shí)內(nèi)達(dá)高峰，活化后24小時(shí)則不能檢出。所有6種單克隆抗體辨識(shí)一種在活化CD3+PBL上表達(dá)的分子，這種分子主要是CD4+表現(xiàn)型，但部分CD8+T細(xì)胞也表達(dá)這種分子。被6種單克隆抗體辨識(shí)的這種分子的表達(dá)在培養(yǎng)基中有Cyclosporin A的存在時(shí)被抑制，就象gp39的表達(dá)一樣(見圖8A和8B，作為代表性例子，描述用Cyclosporin處理過(guò)的T細(xì)胞分別被4D9-8和4D9-9染色)。在用人CD40Ig融合蛋白檢測(cè)時(shí)，被這些單克隆抗體辨識(shí)的分子與gp39，其表達(dá)的動(dòng)力學(xué)和分布相同。另外，所有這6種單克隆抗體阻斷gp39被CD40Ig染色(見圖9A和9B，作為代表性例子，描述分別在4D9-8和4D9-9存在時(shí)，gp39被CD40Ig染色的抑制)。在ELISA測(cè)定中，所有6種單克隆抗體辨識(shí)gp39-CD8，一種gp39分子的可溶性融合形式。而且，所有6種單克隆抗體免疫沉淀一種來(lái)自35S蛋氨酸標(biāo)記的活性人PBL的約36kd的分子。該免疫沉淀的分子與由人CD40Ig融合蛋白沉淀的分子相同。
這6種篩選出的單克隆抗體(4D9-8，4D9-9，24-32，24-43，89-76，和89-79)的功能活性被作如下分析。首先，測(cè)定單克隆抗體對(duì)純化的人B細(xì)胞在有IL-4和可溶性gp39條件下培養(yǎng)的增殖的抑制能力。純化的人B細(xì)胞在有g(shù)p39和IL-4存在，或缺乏純化的單克隆抗體，或劑量在0～12.5μg/ml的CD40Ig的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后，用胸腺嘧啶結(jié)合測(cè)定B細(xì)胞增殖。結(jié)果(圖10示)表明，所有6種單克隆抗體能夠抑制gp39和IL-4誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖。mAbs 89-76和24-31在抑制誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖方面最為有效。
其次，檢測(cè)mAb對(duì)抑制B細(xì)胞分化的能力，正如檢測(cè)抗CD3激活的T細(xì)胞及IL-2誘導(dǎo)的Ig產(chǎn)生。通過(guò)用FACS陽(yáng)性選擇，制備純化的IgD+人B細(xì)胞，然后在有或無(wú)劑量在0～10μg/ml的純化的抗gp39單克隆抗體的條件下，與抗CD3活化的人T細(xì)胞(絲裂霉素C處理)和IL-2一起培養(yǎng)6天。第6天用ELISA測(cè)定IgM、IgG和IgA的產(chǎn)生。結(jié)果(見表1)表明，正如IgM、IgG和IgA產(chǎn)生的檢測(cè)，所有6種抗體均能抑制T細(xì)胞依賴的B細(xì)胞的分化。表1免疫球蛋白的產(chǎn)生mAb μg/ml IgMIgGIgAnone - 17,500 6710 44714D9-80.14813 2130 28191.04394 2558 151910.0 1081 3893964D9-90.13594 91917311.02659 1233 160610.0 37444826624-310.13863 9813441.01287 31416510.0 1120 5962324-430.16227 4132 4321.03193 2130 19210.0 7021 1232 108189-760.13783 1069 3441.02180 35217110.0 8185511989-790.19763 1924 30211.02314 46015610.0 183135434為檢測(cè)抗gp39mAb對(duì)T細(xì)胞反應(yīng)的作用，將mAb包含在標(biāo)準(zhǔn)的混合淋巴細(xì)胞應(yīng)答(MLR)中。在有或無(wú)抗gp39mAb(10μg/ml)存在的條件下，將300,000人外周血淋巴細(xì)胞(應(yīng)答者＝R)與100,000照射過(guò)的同種異體的外周血淋巴細(xì)胞(刺激物＝S)一起培養(yǎng)。第4、5或6天給培養(yǎng)物加入3H胸腺嘧啶并在18小時(shí)后取樣。經(jīng)MLR檢測(cè)，所有6種抗人gp39mAb都抑制異種特異性反應(yīng)(見圖11，作為代表性例子，描述當(dāng)R和S在有24-31或89-76存在條件下培養(yǎng)，CTLA4免疫球蛋白融合蛋白及抗CD28mAb用作陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，異種特異性反應(yīng)的抑制)。
為確定是否6種mAb識(shí)別人gp39分子上的獨(dú)特的表位，進(jìn)行了交叉阻斷實(shí)驗(yàn)。首先用6種單克隆抗體的每種阻斷(25μg/ml非連接抗體)活化的人PBL。洗脫細(xì)胞，然后用10μg/ml生物素連接抗體染色，再與植物紅細(xì)胞素連接抗生素蛋白(PE-Av)反應(yīng)。通過(guò)FACS分析細(xì)胞被PE-Av染色情況。結(jié)果如表2。表2陽(yáng)斷 染色抗體抗體 4D9-8 4D9-9 24-31 24-43 89-7689-79none +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++4D9-8ND- ++++ ++++ +++ +++4D9-9+++ ND+++++++ +++ +++24-31+ + ND +++ ++ ++24-43+ + +++ND++ +89-76+ + ++++++ ND +++89-79+ ++++++++ +++ ND染色密度及陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)用+符號(hào)代表(++++＝MI＞200；+++＝MI＞125；++＝MI＞50；+＝MI＞25；-＝背景上沒有染色)。ND＝未測(cè)定。
所有抗體阻斷CD40Ig與活性人PBL的結(jié)合。然而，表2中數(shù)據(jù)表示一些抗體并沒有阻斷其它抗體與活性人PBL的結(jié)合，提示它們辨識(shí)人gp39分子上獨(dú)特的表位。
分別產(chǎn)生89-76及24-31抗體的89-76及24-31雜交瘤根據(jù)Budapest Treaty的規(guī)定，于1994年9月2目存放在American TypeCulture Collection，Parklawn Drive，Rockyille，Md.。該89-76雜交瘤被標(biāo)為ATCC索取號(hào)__，并且該24-31雜交瘤被標(biāo)為ATCC索取號(hào)__。實(shí)驗(yàn)3-直接抗鼠gp39抗體在本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案中，gp39拮抗劑是一種抗小鼠gp39單克隆抗體，MR1。下述方法被用于生產(chǎn)MR1單克隆抗體，可能用于產(chǎn)生其它直接針對(duì)gp39的抗體。
將倉(cāng)鼠用5×106活性Th1細(xì)胞腹腔內(nèi)免疫，間隔一周共6周。當(dāng)血清抗鼠Th1滴度高至1∶10,000以上時(shí)，使用免疫倉(cāng)鼠的脾細(xì)胞及NS-1用聚乙二醇進(jìn)行細(xì)胞融合。從含有生長(zhǎng)的雜交瘤的孔的上清液中，用流式細(xì)胞計(jì)篩檢靜息的和活性的Th1。對(duì)一種產(chǎn)生選擇性辨識(shí)活性Th的多克隆抗體的特殊雜交瘤進(jìn)行進(jìn)一步檢驗(yàn)并亞克隆獲得MR1。MR1在腹水中產(chǎn)生，通過(guò)離子交換HPLC純化。一種雜交瘤MR1已被存放在American Type Culture Collection，并被指定獲取號(hào)HB 11048。
下列參考文獻(xiàn)根據(jù)實(shí)施例中和本發(fā)明詳細(xì)描述中的參閱數(shù)字參看。
.1.Inaba K.，M.D.Witmer，R.M.Steinman.1984.Clustering of dendritic cells，helper Tlymphocytes，and B cells during primary antibody responses in vitro.J.Exp.Med.160858.
2.Inaba K.，R.M.Steinman.1985.Protein-specific helper T-lymphocyte formationinitiated by dendritic cells.Science.229475.
3.Noelle R.J.，E.C.Snow.1991.Cognare interactions of helper T cells and B cells.Immunol.Tod.11361.
4.Gordon J.，M.J.Millsum，G.R.Guy，J.A.Ledbetter.1987.Synergistic interactionbetween interleukin 4 and anti-Bp50(CDw40)revealed in a novel B cell restimulation assay.Eur.J.Immunol.171535.
5.Clark E.A.，J.A.Ledbetter.1986.Activation of human B cells mediated through twodistinct cell surface differentiation antigens，Bp35 and Bp 50.Proc.Natl.Acad. Sci. USA..834494.
6.Stamenkovic I.，E.A.Clark，B.Seed.1989.A B-lymphocyte activation moleculerelated to the nerve growth factor receptor and induced by cytokines in carcinomas.EMBO.81403.
7.Hollenbaugh D.，L.Grosmaire，C.D.Kullas，N.J.Chalupny，R.J.Noelle，I.Stamenkovic，J.A.Ledbetter，A.Aruffo.1992.The human T cell antigen p39，a member ofthe TNF gene family，is aligand for the CD40 receptorExpression of a soluble form of gp39with B cell co-stimulatory activity.EMBO.114313.
8.Armitage R.J.，W.C.Fanslow，L.Strockbine，T.A.Sato，K.N.Clifford，B.M.Macduff，D.M.Anderson，S.D.Gimpel，T.Davis-Smith，C.R.Maliszewski，E.A.Clark，C.A.Smith，K.H.Grabstein，D.Cosman，M.K.Spriggs.1992.Molecular and biological characterizationof a murine ligand for CD40.Nature.35780.
9.Valle A.，C.E.Zuber，T.Defrance，O.Djossou，R.M.De，J.Banchereau.1989.Activation of human B lymphocytes through CD40 and interleukin 4.Eur.J.Immunol.191463.
10.Gordon J.，M.J.Millsum，R.L.Flores，S.Gillis.1989.Regulation of resting andcycling human B lymphocytes via surface the accessory molecules interleukin-4，CD23 andCD40.Immunology.68526.
11.Jabara H.H.，S.M.Fu，R.S.Geha，D.Vercelli.1990.CD40 and IgEsynergismbetween anti-CD40 monoclonal antibody and interleukin 4 in the induction of IgE synthesisby highly purified human B cells.J.Exp.Med.1721861.
12.Banchereau J.，F(xiàn).Rousset.1991.Growing human B lymphocytes in the CD40 system.Nature. 353678.
13.Armitage R.J.，T.A.Sato，B.M.Macduff，K.N.Clifford，A.R.Alpert，C.A.Smith，W.C. Fanslow.1992.Identification of a source of biologically active CD40 ligand.Eur.J.Immunol.222071.
14.Lane P.，A.Traunecker，S. Hubele，S.Inui，A.Lanzavecchia，D.Gray.1992.Activated human T cells express a ligand for the human B cell-associated antigen CD40which participates in T cell-dependent activation of B lymphocytes.Eur.J.Immunol.222573.
15.Noelle R.J.，J.A.Ledbetter，A.Aruffo.1992.CD40 and its ligand，an essential ligand-receptor pair for thymus-dependent B cell activation.Immunol.Tod.13431.
16.Noelle R.J.，M.Roy，D.M.Shepherd，I.Starnenkovic，J.A.Ledbetter，A.Aruffo.1992.A novel ligand on activated T helper cells binds CD40 and transduces the signal for thecognate activation of B cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.896550.
17.Allen R.C.，R.J.Armitage，M.E.Conley，H.Rosenblatt，N.A.Jenkins，N.G.Copeland，M.A.Bedell，S.Edelhoff，J.Disteche，D.K.Simoneaux，W.C.Fanslow，J.Belmont，M.K.Spriggs.1993.CD40 ligand gene defects responsible for X-linked hyper-IgM Syndrome.Science.259990.
18.Aruffo A.，M.Farrington，D.Hollenbaugh，Li X.，A.Milatovich，S.Nonoyama，J.Bajorath，L.S.Grosmaire，R.Stenkamp，M.Neubauer，R.L.Roberts，R.J.Noelle，Ledbetter，U.J.A.Francke，H.D.Ochs.1993.The CD40 ligand，gp39，is defective in activated T cellsfrom patients with X-linked hyper-IgM syndrome.Cell.72291.
19.DiSanto J.P.，J.Y.Bonnefoy，J.F.Gauchat，A.Fischer，G.de Saint Basile.1993.CD40 ligand mutations in X-linked immunodefiency with hyper-IgM.Nature.361541.
20.Korthaner U.，D. Graf，H.W.Mages，F(xiàn).Brieres，M.Padayachee，S.Malcolm，A.G.Ugazio，L.D. Notarangelo，R.L.Levinsky，A.Kroczek.1993.Defective Expression of T-cellCD40 ligand causes X-linked immunodeficiency with hyper-IgM. Nature.361539.
21.Kurt-Jones E.，S.Hamberg，J.Ohara，W.E.Paul，A.K.Abbas.1987.Heterogeneity ofhelper/inducer T lymphocytes.I.Lymphokine production.J.Exp.Med.1661774.
22.Springer T.A.，A.Bhattacharya，J.T.Cardoza，F(xiàn).Sanchez-Madrid.1982.Monoclonalantibodies specific for rat IgGl，IgG2a，and IgG2b subclasses，and kappa chain monotypicand allotypic determinantsreagents for use with rat monoclonal antibodies. Hybrid.125.
23.Hellstrom I.1986.Monoclonal mouse antibodies raised against human lungcarcinoma.Can.Res.463917.
24.Wilde D.B.，P.Marrack，J.Kappler，D.P.Dialynas，F(xiàn).W.Fitch.1983.Evidenceimplicating L3T4 in class II MHC antigen reactivity；monoclonal antibody GK1.5(anti-L3T4a) blocks class II MHC antigen-specific proliferation，release of lymphokines，andbinding by cloned murine helper T lymphocyte lines.J.Immunol.1312178.
25.Snow E.C.，R.J.Noelle.1987.Thymus-dependent antigenic stimulation of hapten-specific B lymphocytes. Immunol.Rev.99173.
26.Jeme N.K.C.Henry，A.A.Nordin，H.Fuji，A.M.Koros，and I.Lefkovits.1974.Plaque forming cellsMethodology and theory.Transplant Rev.18130.
27.Ochs H.D.，R.J.Wedgewood.1989.Disorders of the B cell system.In Immunologicdisorders in infants and children，Third ed.，E.R.Sreihm，ed. (PhiladelphiaW.B.Saunders)，pp.226.
28.Notarangelo L.D.，M.Duse，A.G.Ugazio.1992.Immunodeficiency with hyper-IgM(HIM).Immunodef.Rev.3101.
29.Shizuru J.A.，S.A. Alters，C.G.Fathman.1992.Anti-CD4 monoclonal antibodies intherapyCreation of nonclassical tolerance in the adult.Immunol.Rev.129103.
30.Linsley P.S.，P.M.Wallace，J.Johnson，M.G.Gibson，J.L.Greene，J.A.Ledbetter，C.Singh，M.A.Tepper.1992.Immunosuppression in vivo by a soluble form of the CTLA-4Tcell activation molecule.Science.257792.
31.Lenschow D.J.，Y.Zeng，J.R.Thistlethwaite，A.Montag，W.Brady，M.G.Gibson，P.S.Linsley，J.A.Bluestone.1992.Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet graftsinduced by CTLA4lg.Science.257789.等效方案本領(lǐng)域的技術(shù)人員不超過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)便可了解或確定許多與本發(fā)明所描述的特定實(shí)施方案等效的方案。這些等效方案也應(yīng)包含在下述權(quán)利要求書的保護(hù)范圍中。
權(quán)利要求
1.一種在體內(nèi)抑制對(duì)TD抗原的體液免疫應(yīng)答的方法，包括向受試者施用TD抗原和介導(dǎo)接觸依賴輔助作用功能的Th細(xì)胞上的一種分子的一種拮抗劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中介導(dǎo)接觸依賴輔助作用功能的Th細(xì)胞上的分子是gp39。
3.權(quán)利要求2的方法，其中拮抗劑是一種抗原gp39抗體。
4.一種在體內(nèi)抑制對(duì)TD抗原體液免疫應(yīng)答的方法，包括向受試者施用TD抗原和一種gp39拮抗劑。
5.權(quán)利要求4的方法，其中體液免疫應(yīng)答是一種初次體液免疫應(yīng)答。
6.權(quán)利要求4的方法，其中體液免疫應(yīng)答是一種再次體液免疫應(yīng)答。
7.權(quán)利要求4的方法，其中TD抗原是一種蛋白質(zhì)。
8.權(quán)利要求4的方法，其中TD抗原是一種抗體。
9.權(quán)利要求4的方法，其中TD抗原是一種細(xì)胞表面。
10.權(quán)利要求4的方法，其中g(shù)p39拮抗劑是一種抗gp39抗體。
11.權(quán)利要求10的方法，其中抗gp39抗體是一種單克隆抗體24-31(ATCC獲取號(hào)__)。
12.權(quán)利要求10的方法，其中抗gp39抗體是一種單克隆抗體89-76(ATCC獲取號(hào)__)。
13.權(quán)利要求10的方法，其中抗gp39抗體是一種嵌合的單克隆抗體。
14.權(quán)利要求10的方法，其中抗gp39抗體是一種人化的單克隆抗體。
15.權(quán)利要求4的方法，其中g(shù)p39拮抗劑是一種gp39配基的可溶性形式。
16.權(quán)利要求15的方法，其中g(shù)p39配基是CD40。
17.權(quán)利要求16的方法，其中CD40是一種融合蛋白。
18.權(quán)利要求4的方法，其中對(duì)TI-2抗原的體液免疫應(yīng)答未被抑制。
19.一種在體內(nèi)抑制對(duì)TD抗原的抗原特異性IgE應(yīng)答的方法，包括向暴露于TD抗原的受試者施用一種gp39拮抗劑。
20.權(quán)利要求19的方法，其中g(shù)p39拮抗劑是一種抗gp39抗體。
21.權(quán)利要求20的方法，其中抗gp39抗體是一種單克隆抗體24-31(ATCC獲取號(hào)__)。
22.權(quán)利要求20的方法，其中抗gp39抗體是一種單克隆抗體89-76(ATCC獲取號(hào)__)。
23.權(quán)利要求20的方法，其中抗gp39抗體是一種嵌合的單克隆抗體。
24.權(quán)利要求20的方法，其中抗gp39抗體是一種人化的單克隆抗體。
25.權(quán)利要求19的方法，其中g(shù)p39拮抗劑是一種gp39配基的可溶形式。
26.權(quán)利要求25的方法，其中g(shù)p39配基是CD40。
27.權(quán)利要求26的方法，其中CD40是一種融合蛋白。
28.一種在體內(nèi)抑制對(duì)一種治療劑的體液免疫應(yīng)答的方法，包括向受試者施用該治療劑與一種gp39拮抗劑。
29.權(quán)利要求28的方法，其中治療劑是一種抗體。
30.權(quán)利要求28的方法，其中g(shù)p39拮抗劑是一種抗gp39抗體。
31.權(quán)利要求30的方法，其中抗gp39抗體是一種單克隆抗體24-31(ATCC獲取號(hào)__)。
32.權(quán)利要求30的方法，其中抗gp39抗體是一種單克隆抗體89-76(ATCC獲取號(hào)__)。
33.權(quán)利要求30的方法，其中抗gp39抗體是一種嵌合的單克隆抗體。
34.權(quán)利要求30的方法，其中抗gp39抗體是一種人化的單克隆抗體。
35.權(quán)利要求28的方法，其中g(shù)p39拮抗劑是一種gp39配基的可溶形式。
36.權(quán)利要求35的方法，其中g(shù)p39配基是CD40。
37.權(quán)利要求36的方法，其中CD40是一種融合蛋白。
38.一種在體內(nèi)抑制對(duì)致敏原的體液免疫應(yīng)答的方法，包括向暴露于該致敏原的受試者施用gp39拮抗劑。
39.權(quán)利要求38的方法進(jìn)一步包括向受試者施用一種IL-4抑制劑。
40.權(quán)利要求39的方法，其中IL-4抑制劑是一種抗IL-4抗體。
41.一種在體內(nèi)延長(zhǎng)抑制對(duì)TD抗原的體液免疫應(yīng)答的方法，包括向受試者施用TD抗原與一種gp39拮抗劑。
42.一種在體內(nèi)抑制對(duì)TD抗原的體液免疫應(yīng)答，而保護(hù)對(duì)IL-2抗原的體液免疫應(yīng)答的方法，包括向受試者施用TD抗原與一種gp39拮抗劑。
43.一種在體內(nèi)被TD抗原誘導(dǎo)的活化Th細(xì)胞功能的免疫抑制方法，包括向受試者施用TD抗原與一種gp39拮抗劑。
44.權(quán)利要求43的方法，其中活化的Th細(xì)胞沒有消除。
45.權(quán)利要求43的方法，其中活化的Th細(xì)胞沒有失去免疫性。
46.一種確定某種抗原是一種TD抗原還是一種TI-2抗原的方法，包括a)向受試者施用該待測(cè)抗原與gp39拮抗劑；b)檢測(cè)對(duì)該抗原的體液免疫應(yīng)答；以及c)通過(guò)缺乏體液免疫應(yīng)答確定該抗原是TD抗原，或通過(guò)出現(xiàn)體液免疫應(yīng)答確定該抗原是TI-2抗原。
全文摘要
公開了抑制對(duì)胸腺依賴性(TD)抗原的體液免疫應(yīng)答的方法。該方法包括向受試者施用一種TD抗原以及一種介導(dǎo)接觸依賴輔助作用功能的分子的拮抗劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該拮抗劑是一種gp39拮抗劑。初次和再次體液免疫應(yīng)答能被抑制，并且能延長(zhǎng)抑制。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1137758SQ94194005
公開日1996年12月11日 申請(qǐng)日期1994年9月2日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月2日
發(fā)明者R·J·尼勒, T·M·福伊 申請(qǐng)人:達(dá)特茅斯學(xué)院理事