專利名稱：疏水制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及物質(zhì)在不正常溶解的疏水溶劑中的制劑，和得到這些制劑的方法。具體地，本發(fā)明涉及親水物在疏水溶劑如油類中的制劑。
本發(fā)明具體地用于不正常地溶于油類或其它疏水溶劑的親水大分子。
對于許多應(yīng)用，例如在藥學(xué)，在食品技術(shù)或美容劑工業(yè)上，加工蛋白質(zhì)和類似大分子存在問題，因為其親水性和高度極性限制它們與類脂相相互作用或摻人類脂相的程度。許多天然體系用類脂障礙物(例如皮膚，細(xì)胞膜)以防止親水分子進(jìn)入內(nèi)部空間；蛋白質(zhì)在類脂載體中分散的能力將打開一條將這些大分子導(dǎo)入生物體系的新途徑，其中含有蛋白質(zhì)的類脂介質(zhì)可與疏水的障礙物成分結(jié)合，而不是被它們排斥。
蛋白質(zhì)被溶解到油中產(chǎn)生優(yōu)點(diǎn)的另一領(lǐng)域是酶在有機(jī)相的應(yīng)用。酶合成與化學(xué)方法相比變得越來越重要，因為其低得多的能量需要，更大的底物和產(chǎn)物專一性，高產(chǎn)率，和許多不能用化學(xué)手段進(jìn)行的反應(yīng)被催化的事實。最近關(guān)于酶可以在有機(jī)環(huán)境中保持活性的發(fā)現(xiàn)打開了許多額外的可能性。這樣，包括親脂的底物和產(chǎn)物的反應(yīng)可被有效地催化，使它們被有用于如高溫的極端條件下，酶的穩(wěn)定性經(jīng)常大大大于在水性環(huán)境中。一個很重要的方面是包括水解酶如脂酶和肽酶的反應(yīng)可優(yōu)先在低水環(huán)境中在逆反應(yīng)中進(jìn)行，使廣泛的工業(yè)上重要的化合物的合成成為可能。另一應(yīng)用是其中反應(yīng)復(fù)合鏈被包括在多催化單元需要互相保持最近的情況中，這類可以是光引發(fā)的氧化-還原反應(yīng)。一個額外的可能性是用酶通過在有機(jī)金屬底物上作用誘導(dǎo)礦化而在油相被控制的纖微粒的生產(chǎn)。在油相預(yù)先形成的纖微粒的穩(wěn)定分散體的制備也有利于某些表面-催化反應(yīng)的實施。
親水物質(zhì)在油相而不是水相中的分散體提供與增加其溫度介導(dǎo)的變性，水解，光敏等等方面的穩(wěn)定性有關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。油類可選擇那些在比水溶液在更寬的溫度范圍保持流體的，或那些具有更高粘度的，導(dǎo)致對物理損害的更大保護(hù)。在混合相體系中，蛋白質(zhì)被限制在油中可限制與水溶性化合物的共同的有害相互作用-例如氧化。
已有既含有大分子又含油的制劑的例子，而且一個這類例子被披露于EP-A-0366277。披露于此文獻(xiàn)中的制劑是同時具有疏水的和親水相的乳劑。其中疏水相含有形成乳糜微粒的類脂。然而，大分子被溶于親水相而不是疏水相。
EP-A-0521994也涉及適于口服輸送大分子的組合物，該組合物包含與卵磷脂或在體內(nèi)可作為卵磷脂前體的化合物有關(guān)的生物活性物質(zhì)。所有舉例的組合物都是包含親水和親脂相的制劑。而且，在此先有技術(shù)文獻(xiàn)中，大分子被溶于親水相而不是親脂相。
盡管上述制劑確實含有大分子和油類，但明顯地，在所有情況下，大分子被溶于親水而不是親油相。形成大分子和油類真正溶液的企圖只得到有限的成功。
本發(fā)明涉及出人意料的發(fā)現(xiàn)，即如果親水物與兩親物在一定條件下混合，產(chǎn)生的組合物將很容易溶于油類親脂溶劑中。本發(fā)明的第一個方面提供制備在疏水溶劑中含有親水物的單相疏水制劑的方法，該方法包括(i)親水物在一液體介質(zhì)中與兩親物混合，以使在液體介質(zhì)中，在兩親物和親水物之間沒有化學(xué)作用(ii)除去液體介質(zhì)以留下一個兩親物分子膠束，其親水首基朝向親水物；且(iii)在親水物/兩親物膠束周圍提供疏水溶劑。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“化學(xué)作用”指諸如共價或離子鍵或氫鍵的相互作用。不包括Van der Waals力和該層次的其它相互作用。
已被發(fā)現(xiàn)，制劑的成分被混合的順序特別重要。在一個制備分子分散體的企圖中，我們將大分子化合物(親水物的一個例子)與疏水溶劑混合，然后加入兩親物，而在另一工藝中，大分子化合物被加入疏水溶劑和兩親物的混合物中。然而，這兩種方法導(dǎo)致產(chǎn)生大分子化合物在溶劑中的粒狀分散體而不是真正的分子分散體。現(xiàn)已被發(fā)現(xiàn)，只有以這樣的方式形成膠束，其中兩親物的親水首基朝向大分子，然后將此膠束溶于疏水溶劑，才能產(chǎn)生單相制劑。
如上所述，親水物和兩親物在液體介質(zhì)中混合，在許多情況下，膠束在溶劑被除去之前在液體介質(zhì)中形成。這發(fā)生在兩親物和液體介質(zhì)是膠束在液體介質(zhì)中形成的，甚至沒有親水物存在的情況。
在本發(fā)明中，術(shù)語“親水物”指任何一般溶于水溶劑但不溶于疏水溶劑的類型。用于本發(fā)明的親水物的范圍是多種多樣的，但大分子代表被應(yīng)用的類型的一個例子。
廣泛的大分子適合用于本發(fā)明。一般地，大分子化合物因是親水的或至少具有親水區(qū)，因為通常將疏水大分子溶于油溶液中困難較小。合適的大分子類包括蛋白質(zhì)和糖蛋白，寡和多核酸，例如DNA和RNA，多糖和任何這些的超分子集合，在某些情況下包括整個細(xì)胞或細(xì)胞類脂質(zhì)。將一個小分子如維生素與一個大分子，尤其是多糖如環(huán)糊精共溶也是適合的，諸如維生素B12的小分子也可與大分子化學(xué)結(jié)合并因而被包括在組合物中。
可用本發(fā)明的方法成功地溶解的具體蛋白質(zhì)的例子包括胰島素，降血鈣素，血紅蛋白，細(xì)胞色素C，辣根過氧化酶，抑肽酶，蘑菇酪氨酸酶，促紅細(xì)胞生成素，生長激素，生長激素，生長激素釋放因子，galanin，尿激酶，因子IX，組織纖維蛋白溶酶原活化因子，超氧化物歧化酶，過氧化氫酶，過氧化酶，鐵蛋白，干擾素，因子VIII和其片段(上面的所有蛋白質(zhì)都可從任何合適的來源得到)。其它可用的大分子是FITC-標(biāo)記的葡聚糖和從Torulla酵母的RNA提取物。
看起來大分子的分子量似乎沒有上限，因為具有分子量約1000000的葡聚糖很容易用本發(fā)明的方法溶解。
除大分子外，本發(fā)明的方法可用于溶解較小的分子。小有機(jī)分子的例子包括葡萄糖，羧基熒光生和藥劑，例如抗癌藥，當(dāng)然，本方法可以同樣用于其它小有機(jī)分子，例如維生素和藥學(xué)或生物學(xué)活性劑。另外，諸如氯化鈣和磷酸鈉的化合物也可用本方法溶解。確實，本發(fā)明對于藥學(xué)或生物學(xué)活性劑特別有利，因為非水溶液的應(yīng)用使分子進(jìn)入體內(nèi)而變化，例如增加生物效力的途徑成為可能。
可被包括在本發(fā)明的疏水組合物中的其它類型是無機(jī)物如小無機(jī)分子或膠態(tài)物質(zhì)，例如膠態(tài)金屬。本發(fā)明的方法使膠態(tài)金屬如膠態(tài)金，鈀，鉑或銠的某些性質(zhì)被保留，即使在正常環(huán)境下顆粒將聚集的疏水溶劑中。這將對于催化在有機(jī)溶劑中進(jìn)行的反應(yīng)特別有用。
一個與本發(fā)明有某些相似的方法在Okahata et al(J.Chem.Soc.Chem.Commun.，1988，1392-1394)中披露。然而，似乎由該文獻(xiàn)的作者生產(chǎn)的蛋白質(zhì)被兩親物分子包圍的膠束與本發(fā)明的方法生產(chǎn)的相當(dāng)不同。尤其是，作者陳述了兩親物分子與蛋白質(zhì)在液體介質(zhì)中反應(yīng)通過氫健或靜電相互作用形成固體沉淀。相反地，似乎本發(fā)明中親水物不與兩親物分子在液體介質(zhì)中發(fā)生化學(xué)作用。
有許多可被用于本發(fā)明的兩親物和兩性離子兩親物如磷脂類被發(fā)現(xiàn)特別合適。具有磷脂酰膽堿首基的磷脂類已被特別成功地應(yīng)用，其例子包括磷脂酰膽堿(PC)本身，溶脂酰膽堿(lyso-PC)，鞘磷脂，任何這些的衍生物，例如十六烷基磷酰膽堿或含磷酰膽堿的兩親聚合物。在本發(fā)明中，術(shù)語磷脂酰膽堿(PC)和卵磷脂被互用。合適的天然卵磷脂可從任何適當(dāng)?shù)膩碓矗绲?，特別是大豆衍生。在更多的情況下，優(yōu)選地選擇與被選定的疏水溶劑化學(xué)上相似的兩親物，這將在下面更詳細(xì)討論。
事實上，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)諸如磷脂類的兩性離子兩親物特別適合用于本方法，這進(jìn)一步顯示了本發(fā)明和Okahata等人的方法之間的明顯區(qū)別。明顯地，現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的作者斷言陰離子和兩性離子類脂完全不適合用于他們的方法中，并陳述他們用這些類脂得到了零產(chǎn)率的它們的復(fù)合物。
選擇的疏水溶劑將取決于組合物的目的，將要溶解的物質(zhì)類型和兩親物。合適的溶劑包括長鏈脂肪酸(不飽和脂肪酸如油酸亞油酸是優(yōu)選的)，醇類，特別是中長鏈醇類如辛醇，和分支的長鏈醇類如植醇，單酸甘油酯如甘油單油酸酯(GMO)，雙酸甘油酯和三酸甘油酯，特別是中長鏈三酸甘油酯和其混合物。
當(dāng)疏水溶劑和兩親物適當(dāng)競爭時，一般得到最佳結(jié)果。例如，對于諸如油酸的溶劑，Lyso-PC是比PC更合適的兩親物的選擇，當(dāng)疏水溶劑是三酸甘油酯時，逆轉(zhuǎn)也成立。
另外，在某些情況下已被發(fā)現(xiàn)，在與親水物/兩親物膠束接觸之前將大量兩親物加到疏水溶劑中是有利的。這確證了兩親物分子沒有被從圍繞親水物的位置剝離，因為兩親物對疏水溶劑具有高度親和力。
非常優(yōu)選地是，本發(fā)明的制劑是光學(xué)上清亮的，這可以通過在可見波長測量濁度，在某些情況下，通過檢查一定時間的沉淀而監(jiān)測。
其中兩親物的親水首基朝向親水物的親水物/兩親物膠束以前曾被生產(chǎn)過，但從來沒有被建議過此類組合物可溶于親脂溶劑中。
Kirby et al，在Bio/Technology，1984，11月，979-984和在Liposome technology，卷I，P19-27，Gregoriadis，Ed.，CRC Press，Inc.，Boca Raton，F(xiàn)lorida，USA中描述了制備脂質(zhì)體制劑的方法，其中磷脂被懸浮在蒸餾水中形成小的單層囊或多層囊，與被捕集的物質(zhì)混合并凍干?；旌衔锶缓笤偎o出脂質(zhì)體。
在此現(xiàn)有技術(shù)的公開時間，對于脂質(zhì)體的制備具有世界性的廣泛興趣，但是生產(chǎn)大分子的單相疏水制劑的想法似乎既從來沒有被想過，或認(rèn)為不可能或沒有價值而不考慮?？隙ǖ兀谌魏维F(xiàn)有技術(shù)中都沒有建議中間體膠束除制備脂質(zhì)體外而作其它用途。即使單相疏水制劑曾經(jīng)是一需要的目標(biāo)，加入疏水的而不是親水溶劑的想法也未被嚴(yán)肅的提出過，因為在本領(lǐng)域?qū)τH水分子的疏水制劑有一種嚴(yán)重的偏見。
兩新物分子以其親水首基面向親水物部分而向膠束的朝向可以幾種方式實現(xiàn)，特別適合的方法的例子在下面更詳細(xì)的描述。
在第一種方法中，具有與Kirby等如前文獻(xiàn)所述的方法相同的起點(diǎn)，親水物與兩親物在親水溶劑中的分散體混合，以使兩親物分子形成一組合體，其中親水首基面朝上地朝向含有親水物的親水相。親水溶劑然后被除去留下一干燥的組合物，其中兩親物分子的親水首基朝向親水物。
在Okahata等人描述的方法中，蛋白質(zhì)的溶液也與兩親物在水中的分散體混合。然而，明顯地，該論文的作者相信，必需得到沉淀，然后將其溶于親水溶劑中。因為許多本發(fā)明優(yōu)選的兩親物不形成這類沉淀，Okahata等人斷言他們將是沒用的。在本發(fā)明的方法中，不需要有沉淀，實際上，一般認(rèn)為不希望形成沉淀，因為這將導(dǎo)致所需產(chǎn)品產(chǎn)率的降低。
在此第一方法中，優(yōu)選的是親水溶劑是水，盡管其它極性溶劑也可被使用。
兩親物集合采取的形式可以是膠束，單層囊，優(yōu)選地是一般理解為具有約25nm直徑的單層囊，多層囊或管狀結(jié)構(gòu)，例如蝸狀圓柱體，六方相，立方體相或髓磷脂類結(jié)構(gòu)。適合的形式將取決于所用兩親物，例如，諸如磷脂酰膽堿(PC)的兩親物傾向形成小單層囊，而溶脂酰膽堿形成膠束。然而，在所有這些結(jié)構(gòu)中，兩親物分子的疏水尾部面向內(nèi)朝向結(jié)構(gòu)的中心，而親水首基面向外朝向分散親水物的溶劑。
兩親物/親水物的重量比一般在1∶1至100∶1的范圍，優(yōu)選地從2∶1至20∶1，對PC最優(yōu)選地為8∶1，對Lyso-PC最優(yōu)選地為4∶1。
這些比例只是優(yōu)選的比例，特別應(yīng)指出的是，上限由經(jīng)濟(jì)方面的考慮設(shè)定，意思是使用最小的可能量的兩親物是優(yōu)選的。下限在某種程度上更重要，很可能2∶1或更低的比例只被用于其中親水物具有明顯的疏水部分或異常大的情況。
當(dāng)溶劑被迅速除去時得到良好的結(jié)果，除去溶劑的合適方法是凍干，盡管其它方法可被應(yīng)用。
在某些情況下，在親水溶液中包括鹽將是有用的，尤其是當(dāng)親水物是諸如大蛋白質(zhì)的大分子化合物時。然而，因為大量無機(jī)鹽的存在傾向于增加晶體的形成，因而產(chǎn)生一渾濁的溶液，優(yōu)選地是有機(jī)鹽被使用而不是無機(jī)鹽如氯化鈉。乙酸銨特別適于此目的，因為它具有額外的優(yōu)點(diǎn)--容易被冷凍干燥除去。
制備含有其首基指向親水物部分的兩親物的膠束的組合物的第二種方法是將親水物和兩親物共溶于一普通溶劑內(nèi)接著除去溶劑。
第二種方法是新穎的，其本身形成本發(fā)明的一部分。
因此，在本發(fā)明的第二方面，提供了形成其中兩親物分子的親水首基朝向親水物的親水物/兩親物膠束的方法，該方法包含將親水物和兩親物共溶于一普通溶劑中，隨后除去普通溶劑。
當(dāng)此方法被應(yīng)用時，優(yōu)選地是兩親物∶親水物的重量比為1∶1至50∶1，優(yōu)選地為2∶1至10∶1，最優(yōu)選地約4∶1。
當(dāng)然，普通溶劑必須同時溶解兩親物和親水物，并且優(yōu)選為極性溶劑如二甲基甲酰胺，二甲亞砜，或最合適地是冰乙酸。
在此方法中，與第一方法相反，膠束未必在除去普通溶劑之前形成。
似乎很可能的是，由于除去溶劑，兩親物分子傾向于自己排列成薄片，其首基朝向親水物而其親脂尾基遠(yuǎn)離親水物。然而，本發(fā)明的效果不取決于此意見的精確度或其它方面。
已被觀察到，當(dāng)溶劑被緩慢除去，例如通過在氮?dú)饬髦懈稍?，得到良好的結(jié)果，可能因為這樣有更多的時間使兩親物分子自己重排。
形成親水物/兩親物膠束的第三種方法包括用親水物在親水溶劑中的溶液乳化兩親物在疏水溶劑中的溶液，給出乳化液，并除去溶劑。
乳化液既可是油包水也可以是水包油型，但如果小親水物被使用而不是大分子，則油包水乳化液更合適。
對于兩親物，任何疏水溶劑都可被使用，但對于用小親水物優(yōu)選的油包水乳化液，低沸點(diǎn)溶劑如乙醚是優(yōu)選的，因為已被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)疏水溶劑通過緩和的方法如蒸發(fā)緩慢除去時得到最好的結(jié)果，很清楚，用低沸點(diǎn)溶劑是最有效的。低沸點(diǎn)溶劑對于油包水乳化液也是優(yōu)選的，盡管對于它們來說，凍干是更合適的溶劑除去法。親水溶劑優(yōu)選地是含水的。
兩親物∶親水物的重量比可能是約1∶1至約50∶1，優(yōu)選地為2∶1至10∶1，最優(yōu)選地為約4∶1。
親水溶液與疏水溶液的比例不是關(guān)鍵的，但是如果水親水物被使用，諸如確證油包水而不是水包油乳化液的形成是優(yōu)選的。
當(dāng)油包水乳化液形成時，第三種方法適用于任何類型的親水物，但第一和第二種方法已被發(fā)現(xiàn)比第三種不太適合于用小分子。
特別適用于用小親水物的形成膠束的另一方法是在分散于親水溶劑中的閉合的類脂囊如小單層囊(SUVs)中捕集親水物，然后除去溶劑。
本發(fā)明方法的產(chǎn)物是新的，因為它使包含不正常溶于疏水溶劑的親水物的單相疏水制劑的生產(chǎn)成為可能。因此，本發(fā)明的第三方面提供由本發(fā)明的方法得到的包含在疏水溶劑中的親水物的單相疏水制劑。
另外，本發(fā)明也提供包含在疏水溶劑中的親水物和兩親物的單相疏水制劑，其特征在于親水物的部分被兩親物分子包圍，兩親物分子的親水首基朝向親水物。
優(yōu)選的親水物，兩親物和疏水溶劑是特定于剛剛描述的方法的。
除親水物外，在單相疏水制劑內(nèi)包括其它成分也是理想的，當(dāng)親水物是大分子時，這樣常常是特別適合的，并且，在那種情況下，制劑將包括，例如，膽汁酸鹽，維生素類或其它連接或以其它方式與大分子連接的小分子。
盡管某些大分子/兩親物膠束在Kirby等如前文獻(xiàn)中披露過，但被披露的膠束都是形成脂質(zhì)體的中間體，并且如上討論的，沒有對包含這類實體非脂質(zhì)體或疏水組合物的在先興趣。因此，其中兩親物是不形成小單層囊的，且因此不被希望形成脂質(zhì)體的本發(fā)明的膠束是新的。
本發(fā)明的另一方面提供兩親物和親水物的膠束，其特征在于兩親物分子的親水首基朝向親水物，其中在兩親物和親水物之間沒有化學(xué)作用，條件是兩親物是當(dāng)水被加入膠束中時不可能形成脂質(zhì)體。
不可能形成脂質(zhì)體的兩親物的一個例子是溶血卵磷脂。在大部分含水環(huán)境中，此兩親物形成膠束而不是小單層囊，因此不適合用于制備脂質(zhì)體。然而，它在本發(fā)明中極其有用，特別是當(dāng)與可共容的疏水溶劑如油酸共用時。
本發(fā)明制劑的一個優(yōu)點(diǎn)是它們基本上無水因此對于水解穩(wěn)定。它們也對于凍-熔穩(wěn)定，并且在高溫具有更大的穩(wěn)定性，可能因為在蛋白質(zhì)伸展和變性過程中必須存在水。這意味著它們可被期望具有比親水物的含水制劑長得多的貨架壽命。
本發(fā)明的溶液極其通用并具有許多應(yīng)用。它們既可單獨(dú)使用，也可與水相結(jié)合形成乳化液或類似的兩相組合物，它形成本發(fā)明的另一方面。
本發(fā)明的這一方面提供包含親水相和疏水相的兩相組合物，疏水相包含由本文所述的方法得到的親水物在親脂溶劑中的制劑。
一般地，在此類組合物中，疏水相將被分散在親水相中。
出乎意料的是這類穩(wěn)定的兩相組合物可以形成，因為曾經(jīng)期望親水物將保留在疏水相中，但將穿到親水相中。然而，已被證明，在許多情況下，這一過程并不發(fā)生，疏水相確實保留在分散的疏水相中，并且不以游離的溶液存在。這可能是一些殘留的水或其它連接到兩親物的親水首基的殘留親水物的結(jié)果。它的一個優(yōu)點(diǎn)是親水物的滲透泄漏不是本發(fā)明組合物一問題，這是其它已知體系，尤其是脂質(zhì)體體系的問題。
兩相組合物根據(jù)所需目的，可以是瞬變的或穩(wěn)定的乳化液。
乳化液顆粒的平均大小將取決于疏水相和水相兩者的具體性質(zhì)。然而，將在2μm的范圍。
疏水制劑在水相的分散體可通過混合，例如或者在短時間例如10至60秒，通常約15秒劇烈渦旋，或者是例如用一軌道搖動器緩和混合幾小時而實現(xiàn)。
本發(fā)明含疏水制劑的乳化液也可用于制備微膠囊。如果乳化液從含有明膠的水相形成，該明膠可用已知方法通過凝聚而從溶液中沉淀，并將形成包圍含親水物的疏水相的微滴的膜。通過除去親水相，微膠囊將保留。此技術(shù)在本專業(yè)是已知的，但是與本發(fā)明的制劑結(jié)合就被改進(jìn)得特別有用。
本發(fā)明組合物可被使用的一條途徑是給哺乳動物類，包括人，口服輸送那些在正常環(huán)境將不溶于親脂溶劑中的物質(zhì)。這可以用于輸送飲食的補(bǔ)充物如維生素類或輸送生物活性物質(zhì)，尤其是蛋白質(zhì)或糖蛋白，包括胰島素和生長激素。
對于另一應(yīng)用，可以例如通過上述方法膠囊或微膠囊化如維生素類的營養(yǎng)物，它們?nèi)缓蟛粌H可用于人類食物的補(bǔ)充，也可用于農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖，后者的一個例子是作為喂養(yǎng)蝦苗的飼料。
另外，此組合物在制備用于非腸道給藥的藥物或其它制劑，以及用于局部或眼用方面發(fā)現(xiàn)了用途。對于這一應(yīng)用，使用如上所述的油溶液和水相的乳化液經(jīng)常是優(yōu)選的。
許多治療和預(yù)防傾向于持久或延緩釋放或包括兩個組分體系，例如包括立即釋放的組分與延緩或持久釋放的組分在一起。由于其高穩(wěn)定性，本發(fā)明的制劑對于持久或延緩釋放的大分子的制劑特別有用。
本發(fā)明組合物的更長貨架壽命在藥學(xué)領(lǐng)域特別有利。
油包水制劑可以在藥學(xué)或遮味工業(yè)上找到應(yīng)用。這在藥物工業(yè)上是一個問題，因為許多藥物具有不愉快的味道，因此不被患者，尤其是小孩接受。
進(jìn)一步的應(yīng)用是在美容劑工業(yè)上，其中，親水化合物的疏水制劑可以容易地被摻入美容劑中?？梢赃@種方式應(yīng)用的大分子的例子包括一些具有濕潤或酶作用的大分子。本發(fā)明也可用于將蛋白質(zhì)如膠原摻入皮膚用乳劑或洗劑中。
最后，本發(fā)明在化學(xué)和生物合成，例如非水酶催化合成領(lǐng)域具有大量用途。
本發(fā)明現(xiàn)在將進(jìn)一步用下列實施例說明。
實施例1
鮭魚降血鈣素如下被溶于油相。所有用于這個或其它實施例的化學(xué)藥品都是分析級或化學(xué)級的。
溶于氯仿/甲醇，2∶1(V/V)的純卵磷脂酰膽堿被旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至形成一干膜，加入蒸餾水給出濃度為100mg/ml的類脂。用氮?dú)鈴氐讻_洗之后，類脂通過劇烈渦旋分散，接著用探針聲化總共5分鐘，直到得到小單層囊(SUVs)的乳色分散液。在整個聲化步驟中，容器一直浸沒在冰漿浴中，聲化在30秒突發(fā)進(jìn)行，夾雜30秒的冷卻間隔。SUVs的懸浮液在1000×g離心10分鐘使聚集的類脂形成小球，上層清液被傾析并在蒸餾水中稀釋兩倍給每ml/50mg的濃度。
鮭魚降血鈣素溶液通過將5mg蛋白質(zhì)溶于1ml蒸餾水而制備，給出一清亮溶液。等體積(0.5ml)的蛋白質(zhì)溶液和類脂懸浮液被一起加到10ml圓底試管中，并混合好。產(chǎn)生的混合物在液氮中殼式冷凍，并在低于0.1mbar的真空和冷凝器溫度-45℃凍干過夜。
第二天，300mg油酸BP被加到凍干物中，并輕輕混合使所有的干燥固體與油接觸?；旌衔镌谂既换旌蠒r室溫放置約1至2小時，在此期間所有的固體都溶于油中形成清亮的單相類脂，它是光學(xué)透明的。
實施例2濃度為100mg/ml的大豆磷脂酰膽堿SUVs通過在蒸餾水中渦旋干燥的類脂而制備，然后如實施例1中聲化。鮭魚降血鈣素水溶液以10mg/ml制備，0.8g的等分試樣被轉(zhuǎn)移到試管中。1gSUVs被加入，該內(nèi)容被殼式冷凍并凍干過夜。1.2g 95％油酸被加到凍干物中，分散如實施例1中進(jìn)行。含有6.7mg蛋白質(zhì)/g油酸的降血鈣素制劑是完全清亮的。
實施例3含抑肽酶的凍干物在與上面實施例2對于鮭魚降血鈣素所述的相同條件下制備，然后在4℃存放5天，在一干燥器中與五氧化磷一起，在該條件下基本上所有的水，不管是連接的還是游離的，都可以除去。隨后在油酸中的分散液不被損害，因為加入300mg油酸給出一光學(xué)清亮的油相。
實施例4濃度為100mg/ml的大豆磷脂酰膽堿SUVs在蒸餾水中如實施例2制備。20mg/ml鮭魚降血鈣素溶液以通過在1.59g蒸餾水中溶解3.1mg，0.67g清亮溶液(13.4mg蛋白質(zhì))與1.0g SUVs(100mg PC)在試管中混合而制備?；旌衔锉粴な嚼鋬?，凍干，然后如實施例1(但用200mg油酸)中分散。產(chǎn)生含有42.7mg降血鈣素/g。
實施例5濃度為100mg PC/ml的卵PC SUVs如實施例1制備。10mg/ml的胰島素溶液通過在稍高的濃度以20mg/g所用胰島素的比例加入冰乙酸，然后加入足量的水給出所需胰島素濃度制備水懸浮液而制造。在混合和放置15分鐘之后，形成了清亮的溶液。在試管中往1.25ml的SUVs中加入1.25ml胰島素溶液，混合物被殼式冷凍，并凍干過夜。第二天，0.252g油酸被加入，試管渦旋至完全“濕潤”凍干物。將制劑放置過夜以發(fā)生完全分散，此后出現(xiàn)顯示強(qiáng)乳光的黃色光學(xué)清亮的分散液。在室溫，密封的試管內(nèi)氮?dú)鈨Υ?周后，在DPLC制劑的外觀(例如沉積作用)上沒有明顯變化。
實施例6按實施例2，使用每g100mg大豆磷脂酰膽堿，和如實施例2制備的胰島素溶液制備SUVs。在小玻璃瓶中加入50mg SUVs(5mg PC)和47mg胰島素溶液(0.47mg蛋白質(zhì))冷凍，凍干并分散于100mg二油精中。2小時之后初始的粒狀分散液變清。
實施例7以干燥形式提供的95％純度的卵磷脂酰膽堿通過渦旋被直接分散在蒸餾水中，給出帶有100mg/g濃度的磷脂的多層囊的懸浮液。此材料在生產(chǎn)者的指令下，在20000psi壓力下擠過EmulsiFlexTM設(shè)備3次。產(chǎn)生的乳色分散體用蒸餾水稀釋至50mg/ml，用氮?dú)鉀_洗，在使用前一直在4℃儲存。30mg鮭魚降血鈣素，與30mg抑肽酶一起被溶于6ml蒸餾水中，然后與如前制備的39.6ml磷脂分散體混合。該混合物被分散為適當(dāng)大小的等分試樣，殼式冷凍，凍干，然后加入總共47.52g甘油單油酸酯BP(溫?zé)嶂?0℃熔化)，如實施例1所述混合產(chǎn)生光學(xué)清亮的DPLC乳色分散體。
實施例8將合成的二棕櫚基磷脂酰膽堿溶于氯仿/甲醇，2∶1(V/V)混合物中，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)形成薄膜干燥的類脂以30mg/ml的濃度分散在蒸餾水中，并聲化形成SUVs的乳色分散液。此工藝與實施例1一般性相似，只是溫度保持在約45℃，即高于類脂的相變溫度。10mg/ml濃度的胰島素溶液如實施例4被制備，將0.14ml等分試樣(1.4mg蛋白質(zhì))被轉(zhuǎn)移到小試管中，與0.5g SUVs等分試樣(15mg DPPC)一起?；旌衔锉粴な嚼鋬霾龈桑a(chǎn)生的凍干物分散于300mg油酸中給出清亮的蛋白質(zhì)“溶液”。對比實驗顯示當(dāng)分散凍干物時，不需要在高于相變溫度操作。
實施例9以36mg/ml的濃度在水中制備卵磷脂酰膽堿的膠束溶液，將0.137ml轉(zhuǎn)移到小試管中。如實施例4制備濃度為10mg/ml的胰島素溶液，將0.137ml轉(zhuǎn)移到如上試管中。試管內(nèi)容物被殼式冷凍，凍干，然后與0.3g油酸混合，產(chǎn)生含有4.6mg胰島素/g油酸，在0.023nm有吸收的清亮分散液。
實施例10如實施例2制備濃度為100mg/ml的大豆磷脂酰膽堿SUVs，并如實施例4制備含10mg/ml的胰島素溶液。往5個試管的每個中加入0.1ml胰島素溶液(1mg蛋白質(zhì))，0.3mg SUVs(30mgPC)，混合物被殼式冷凍并凍干過夜。產(chǎn)生的凍干物各種被分散于300mg系列的精餾椰子油，viz.Miglyols 810，812，818，829和840之一中。(Miglyol一詞是商標(biāo))。除往其中加入Miglyol 829之外，所有的制劑都迅速形成乳色“溶液”，而后者形成一稠的，不透明的凝膠。經(jīng)放置，分散液變清，第二天，Miglyols 812，818和840完全清亮，而810輕微乳色。Miglyol 829保持為渾濁的凝膠。
實施例11如實施例2制備大豆磷脂酰膽堿SUVs，并制備濃度為10mg/ml的鮭魚降血鈣素溶液。將100μL降血鈣素溶液(1mg蛋白質(zhì))和300mg SUVs(30mg PC)加到6個小試管的每個中，內(nèi)容物被殼式冷凍并凍干。往5個凍干物的每個中加入300mg Miglyols 810，812，818，829和840。而往第6個中長鏈三酸甘油酯油(MCT)油混合后，所有的制劑都是乳色的或渾濁的，但放置之后變得較清。第二天早晨，在Miglyols 810和840中的分散液是渾濁的，在MCT油和Miglyols 812中的是乳色的，而在Miglyols 818和829中的完全清亮，輕微溫?zé)岷?，乳色和渾濁的分散液變清，但在室溫放置過夜后又變?yōu)榍懊娴男问健?br> 實施例12制備濃度為10mg/ml的Candida cylindericae脂酶水溶液，與濃度為100mg/ml(見實施例2)的大豆磷脂酰膽堿SUVs一起。將50μL脂酶溶液的等分試樣(0.5mg蛋白質(zhì))加到幾個小試管中，將100μL SUVs(10mg PC)加到每個試管中?；旌衔锪⒓蠢鋬觯瑑龈?，用氮?dú)鉀_洗，然后用石蠟密封，再儲存于冷凍器內(nèi)。凍干物之一被熔化并與0.44g亞油酸混合，30分鐘后，形成完全清亮的DPLC分散液。將0.1g膽甾醇溶于油中，試管用氮?dú)鉀_洗，用石蠟密封，轉(zhuǎn)移到37℃孵育器中。2天后，混合物用逆向薄層包譜分析，并顯示出，除起始反應(yīng)物之外，還有一個Rf值與膽甾醇亞油酸酯完全相同的斑點(diǎn)。這表示溶在油相的酶是催化活性的。此合成的酯化反應(yīng)與通常與酯酶活性有關(guān)的普通水解過程相反。
實施例13如實施例2制備濃度為100mg/ml的大豆磷酯酰膽堿SUVs。兩個0.15ml等分試樣(15mg PC)被分到小試管中，往每個中加入濃度為3mg/ml的蘑菇酪氨酸酶水溶液。內(nèi)容物被殼式冷凍并凍干。往凍干物之一中加入0.3g油酸，而往另一個中加入0.3gMCT油，之后，試管被渦旋混合。45分鐘之后，MCT制劑形成清亮的棕色分散液，而油酸的需要2小時。
將分散液對2個分開的酶底物，兒茶酚和酪氨酸，進(jìn)行試驗，其結(jié)果與用游離酶水溶液得到的比較。各個反應(yīng)在脯氨酸存在下進(jìn)行。當(dāng)用游離酶時，各個底物逐漸轉(zhuǎn)化為強(qiáng)顏色的顏料。然而，在DPLC分散液存在下，對于兒茶酚有顏料形成，而酷氨酸沒有。顏色強(qiáng)度對油酸制劑比MCT油的低，可能是因為酶活性的低pH作用。當(dāng)油相被暫時通過渦旋在水相中乳化時，可以見到相同類型的底物轉(zhuǎn)化。然而，當(dāng)乳化在Triton X100TM存在下進(jìn)行時，對于兩個底物都有顏料形成。
對于觀察到的結(jié)果提出的解釋是，兒茶酚能進(jìn)入油中接近被包裹的酶，而酪氨酸被限制在水相。酶對兒茶酚作用的醌產(chǎn)物可以回到水相并與脯氨酸相互作用形成有顏色的產(chǎn)物。此實驗證明酶以活性形式被包裹在油內(nèi)，在分散時不釋放到油中。然而，當(dāng)表面活性劑如Triton X100TM被加入時，酶被釋放并游離而對各個底物作用。
實施例14平均顆粒直徑30nm的膠態(tài)金被制備并通過加入牛血清蛋白到0.001％穩(wěn)定化。0.2g酒紅色金溶膠與如實施例1中制備的濃度為100mg/ml的0.2g卵磷酯酰膽堿SUVs一起被加到小試管中?；旌衔锉粴な嚼鋬?，凍干，然后與0.3g油酸混合。2小時(偶爾搖動)后，分散液完全清亮，形成與原始金水溶膠很相似的紅色油相。
實施例151mg肽抗生素，Nisin，與用于實施例14的0.2g相同卵磷脂酰膽堿SUVs混合，并以相似方式處理。在2小時內(nèi)形成晶狀透明分散體。
實施例16如實施例13所述將酪氨酸酶摻入油酸中。將1份(重量)此分散液加到4份溫?zé)嶂?0℃的含水明膠中，通過渦漩快速混合，然后轉(zhuǎn)移到一小燒杯中，在其中用磁力攪拌器繼續(xù)混合。兩份20％硫酸鈉被均勻地滴加到里面，然后在15℃，磁力攪拌下將混合物倒入40份7％含水明膠中?；旌侠^續(xù)一會，然后將一部分產(chǎn)生的明膠囊用兒茶酚和酪氨酸作底物進(jìn)行酶活性試驗。如實施例13所見，對于兒茶酚有顏色形成，而酪氨酸則沒有，表明在油的微膠囊化期間酶/類脂復(fù)合物在油相內(nèi)保持完整。
實施例17將100mg細(xì)胞色素C，血紅蛋白和FITC-葡聚糖分別溶于1ml蒸餾水中。將4.4mg RNA(從Torula酵母提取)溶于1ml磷酸緩沖的生理鹽水中。這些溶液各2×50μL被分到干凈玻璃管內(nèi)，往一份溶液中加入250μL如實施例1以濃度為40mg/ml蛋黃卵磷脂(PC)制備的SUVs。
兩管都被殼式冷凍并如前凍干過夜。第二天300μL油酸被加入每管中。樣品在室溫放置，偶爾渦旋，共1小時直至完全分散，油類被放置過夜。不同PC制備的樣品的濁度比含PC的大。
第二天，沒用PC制備的樣品有沉淀出現(xiàn)。在不攪動任何樣品的情況下，每個樣品的頂部150μL被取出，測量兩個被取出物的吸光度，混合后遺留該物；比較兩個讀數(shù)，計算有或沒有PC的樣品的沉淀百分?jǐn)?shù)(測量誤差±5％)。得到的數(shù)值列在下面。
大分子24小時后的沉淀百分?jǐn)?shù)+PC -PC細(xì)胞色素C 3.1 76血紅蛋白 044FITC葡聚糖068RNA 073實施例18如實施例1的過程，所不同的是蛋白質(zhì)溶液由在乙酸銨(10mg/ml)中濃度為10mg/ml的鐵蛋白或辣根過氧化酶(HRPO)組成；而SUVs由在乙酸銨(也是10mg/ml)中濃度為50mg/ml的蛋黃磷脂酰膽堿組成。凍干并分散于油酸中后，得到光學(xué)清亮的溶液(盡管鐵蛋白溶液顯示一定的乳色，并有很強(qiáng)的顏色)。
將HRPO溶液分成相等的兩份，一份進(jìn)行五次凍-熔循環(huán)，在回到室溫前，重復(fù)冷卻至+4℃，每次都固化油酸。在凍-融樣品和放置不動的樣品之間沒有觀察到光學(xué)清亮度的不同。實施例19在下列過程中，不同的方法被用于在如前的油相溶解胰島素。制備用不同量的磷脂酰膽堿(PC)平行地進(jìn)行幾次。
100mg胰島素在渦旋下溶于2ml冰乙酸中。500mg PC在渦旋下溶于5ml冰乙酸中。往5個玻璃2ml旋蓋小瓶中分入100μL胰島素溶液。將不同體積(100，200，300，400，500μL)的PC溶液分入每個小瓶內(nèi)，每個內(nèi)容物被混勻。
溶液在氮?dú)饬髦袦u旋蒸干，然后最后剩余的溶劑在室溫下真空(8×10-2mbar)除去，在一凍干器中過夜。第二天，將300μL油酸加到每個小瓶內(nèi)，小瓶的內(nèi)容物在軌道搖動器上輕輕混合另外24小時。
150μL的每種溶液的吸光度在450nm用自動報讀數(shù)器測量。結(jié)果如下管數(shù)12 3 4 5胰島素(mg) 55 5 5 5油酸(mg)300 300 300 300 300PC(mg) 50 40 30 20 10PC∶胰島素 10∶18∶16∶14∶12∶1OD4500.1230.124 0.116 0.115 0.714所有得到的溶液者表現(xiàn)為光學(xué)清亮的，只有#5例外，它是渾濁的并強(qiáng)烈地散射光。
實施例20應(yīng)用與實施例19相同的過程，所不同的是用牛腦鞘磷脂代替磷脂酰膽堿，導(dǎo)致胰島素/鞘磷脂/油酸的重量比為5/50/200。干燥的固體與油混合1小時后得到完全清亮的溶液。室溫放置幾天后，形成不透光的凝膠，它在溫?zé)嶂?7℃時再給出清亮的溶液。
實施例21如實施例1的過程，所不同的是由辣根過氧化酶(HRPO)構(gòu)成的蛋白質(zhì)蒸餾水中濃度為10mg/ml，SUVs由蛋黃磷脂酰膽堿組成，并用實施例7中所述的方法，用EmulsiflexTM以50mg/ml的濃度制備。凍干后，固體物被分散于植醇或甘油單油酸酯中。在各種情況下都得到光學(xué)清亮的溶液。
實施例22將麥胚tRNA以5mg/ml的濃度溶于蒸餾水中，50μL等分試樣溶液與100μL或50μL由在蒸餾水中濃度為50mg/ml的大豆PC組成的SUVs混合。PC與tRNA的比例分別為20∶1和10∶1?；旌衔镌?20℃冷凍并凍干給出干燥的白餅。加入100μL油酸，接著在軌道搖動器上輕輕混合，對于PC∶RNA比為20∶1的情況給出光學(xué)清亮的溶液，相反地，10∶1PC∶RNA，或沒有PC的tRNA，給出不透明的渾濁懸浮液，已被650nm處的OD讀數(shù)證明。PC∶RNA比20∶110∶10OD4500.0440.2400.657實施例23將抑肽酶以10mg/ml的濃度溶于蒸餾水中。將十六烷基磷酰膽堿(HDPOC)以100mg/ml的濃度溶于蒸餾水中。往100μL抑肽酶溶液的等分試樣中加入體積范圍為0至10，20，30，40至50μL的HDPOC?；旌衔镌?20℃冷凍并凍干過夜。第二天，往每份樣品中加入100μL油酸，并在室溫下在軌道搖動器上搖動1小時。得到類脂∶蛋白質(zhì)比為4∶1和5∶1的光學(xué)清亮溶液，已被650nm處的讀數(shù)證明。類脂∶蛋白質(zhì)比 0 1∶1 2∶1 3∶14∶15∶1OD6501.117 0.8690.4380.207 0.094 0.099實施例24將4mg過氧化酶溶于4ml蒸餾水中，100μL等分試樣被分到玻璃旋蓋的2ml小瓶中。往每個小瓶中加入100μL聲比的DMPC(二肉豆蔻?；字Ｄ憠A，在蒸餾水中，100mg/ml)，混勻并凍干。
當(dāng)混合物被完全干燥時，通過往每個小瓶中加入100μL或者單獨(dú)或者在溶液中以3mg/10ml的濃度含OPD(鄰苯二胺)的叔丁醇而分散蛋白質(zhì)/類脂復(fù)合物。對照物通過在不存在酶時往空的的或含DMPC的管中加入叔丁醇±OPD而制備。制備每種組合的復(fù)制品，往一套管中在混合下加入10μL氫過氧化枯烯底物。室溫放置半小時后，各樣品的光學(xué)強(qiáng)度在450nm在微板讀數(shù)器中被讀數(shù)。背景消除后得到的結(jié)果列于表中。
在有機(jī)溶劑中在氫過氧化枯烯存在下過氧化酶對OPD的作用酶/DMPC 單獨(dú)的DMPC 單獨(dú)溶劑單獨(dú)的OPD0.249 0.032 0.015OPD+氫過氧化枯烯2.517 0.075 0.051實施例25將辛基葡糖苷溶于蒸餾水中并分到微板的井中給出每井如下量的兩親物0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，5，7.5和10mg。將抑肽酶以5mg/ml的濃度溶于蒸餾水中，100μL被分到上面的每個井內(nèi)，含0.5mg蛋白質(zhì)。將板混勻，在-20℃冷凍并凍干過夜。第二天，100μL油酸被加到各個井中。在室溫?fù)u動板，在550nm用板讀數(shù)器間隔地測定光學(xué)強(qiáng)度。低的吸光度值表明低散射，對應(yīng)于蛋白質(zhì)在油中的有效分散。
用上述方法，證明了加入辛基葡糖苷作為兩辛物幫助抑肽酶在油酸中分散的效果。在不同的時間，加入油酸后，以光學(xué)強(qiáng)度作為辛基葡糖苷濃度(以恒定的蛋白質(zhì)濃度)的函數(shù)的結(jié)果給于表和附圖
中。辛基葡糖苷1hr 4hr 8hr0.00 0.548 0.458 0.4890.50 0.082 0.043 0.1031.00 -0.003 -0.008 -0.0081.50 -0.004 -0.015 -0.0152.00 -0.007 -0.012 -0.0132.50 0.006 -0.004 -0.0025.00 0.307 -0.013 -0.0147.50 0.65-0.015 -0.01410.00 1.628 0.817 -0.014實施例26將1mg黑色素加1ml蒸餾水中，用氫氧化銨溶液升高pH后溶解。50μl此溶液通過加入950μL蒸餾水稀釋20倍。往微板的兩批7個井中加入0，12.5，25，37.5，和50μl稀溶液，和12.5和25μl濃溶液。往一批的每個井中加入通過在100mg/ml的濃度冷卻下聲化10分鐘制備的大豆磷脂酰膽堿。另一批不動。將板混勻，在-2℃冷凍并凍干過夜。第二天，100μl M818被加到含有黑色素/類脂復(fù)合物的那排井中，而100μl蒸餾水被加到只含黑色素的那排井中。在所有的紅棕色溶液完全變清后，在600nm測定所有濃度黑色素的光學(xué)強(qiáng)度。從表和附圖可以看出，Beer-Lambert’s定律服從于此濃度范圍(即對應(yīng)曲線是直線)，而黑色素的行為在油和水溶液中是相同的。黑色素在沒有磷脂酰膽堿存在下通過聲化分散于M818中給出一黑色分散液，它沉淀，在離心后給出清亮的上層清液。黑色素/類脂復(fù)合物分散于M818之后沒有這類變化被觀察到。在600nm測量濃度(mg/ml)Miglyol 水00 00.0625 0.078 0.0720.1250.157 0.1590.1870.23 0.230.25 0.306 0.3331.25 1.565 1.2592.5 2.857 2.653實施例27在冷卻下，通過在蒸餾水中以100mg/ml的濃度探針聲化制備大豆磷脂酰膽堿的分散液。1ml此懸浮液并分到玻璃容器內(nèi)，并加入660μl硫酸新霉素溶液(在蒸餾水中5mg/ml)。混合后，管內(nèi)容物在液態(tài)中殼式冷凍，并凍干過夜。第二天，加入1gMigloyol 818，容器用氮?dú)鉀_洗，封好并在室溫放置過夜。得到一光學(xué)清亮的溶液。
實施例28用與實施例27相同的過程，只是用后葉加壓素代替硫酸新霉素。
實施例29用與實施例27相同的過程，只是用5-氟尿嘧啶代替硫酸新霉素。
實施例30用與實施例27相同的過程，只是用5-氟脫氧尿苷代替硫酸新霉素。
實施例31將0.55ml核糖核酸酶溶液(含10mg RNA se/ml)與如實施例2中制備的1.6ml大豆PC SUV，在液氮中殼式冷凍并凍干過夜。凍干物與1.6g Miglyol 818混合，渦旋并放置。幾小時后形成清亮的分散液。
實施例32往在40μL水溶液中的32μg質(zhì)粒DNA中加入40μL 0.2nm精胺溶液；制劑被混合并放置15分鐘產(chǎn)生DNA縮合。如實施例2制備大豆PC SUVs，但含50mg PC/g，并將40μL加到DNA/精胺混合物中。將制劑冷凍，凍干過夜，將100μL Miglyol 818加到產(chǎn)生的凍干物中。制劑在1小時的周期分散給出清亮的分散液。
實施例33兩排3個小試管被裝好，往第一排的每個試管中加入57μL如實施例5制備的含10mg胰島素/ml的溶液。往第二排的每個試管中加入0.2ml 0.267mM羧基熒光生(CF)。如實施例2制備含100mg PC/ml的大豆PC SUV，0.2ml被加到每個試管中。將試管內(nèi)容物混合，殼式冷凍并凍干過夜。通過將適當(dāng)?shù)慕M份加到一起，加熱到78℃直到產(chǎn)生液化然后簡短渦旋制備各自含有2％(Wt/Wt)油酸的高熔點(diǎn)三酸甘油酯三棕櫚精(TP)，三(十七烷酸)甘油酯(TH)和三硬脂精(TS)的熔融物。將凍干物在爐內(nèi)加熱至相同溫度。往含胰島素凍干物的試管1，2和3中分別加入150mg TP，TH和TS的熔融物。往含CF凍干物的試管1，2和3中以相同順序加入100mg熔融物。加完后，試管加蓋，簡短渦旋，然后返回爐內(nèi)。幾分鐘后，所有的CF分散液完全清亮。胰島素制劑在1至2小時清化以形成幾乎清亮的分散液。
實施例34制備一系列凍干物，各自含有0.3mg葡萄糖(從含1.5mg/ml的溶液衍生)和6mg大豆PC(從如實施例2制備的SUV衍生)。往3份凍干物中分別加入辛醇，油酸和Miglyol 818。辛醇制劑在幾分鐘內(nèi)分散，而油酸和Miglyol制劑需2至3小時，形成清亮分散液。
實施例35從0.8ml 25mM氯化鈣與0.8ml大豆PC SUV(如實施例2制備)一起衍生制備凍干物。往一個中加入500mg Miglyol 818，而往另一個中加入500mg油酸。幾小時后，油酸制劑形成完全清亮的分散液，Miglyol制劑則在放置過夜之后。
實施例36往分開的小玻璃瓶中加入1mg抑肽酶和1mg胰島素，分別都為100μl含10mg/ml的溶液形式。胰島素溶液如實施例5制備。往每個小瓶中加入0.2ml AOT(以10％(W/V)提供)水溶液。將混合物殼式冷凍，凍干過夜，往每個中加入200mg辛醇。抑肽酶制劑迅速變清但24小時后形成乳色分散液。胰島素制劑分散較慢，但在放置過夜后清亮。
實施例37將20μl含0.8mg Mucor mehii脂酶的脂酶溶液加到2個小玻璃瓶中。往一個小瓶中加入89μl含36mg lyso PC/ml的膠束溶液，往另一個中加入如實施例2制備的9μl大豆PC SUV。將每瓶的內(nèi)容物混合，在液氮中冷凍并凍干過夜。往每個凍干物中加入含88mg膽甾醇/g和1mg α-生育酸/g的500mg亞油酸。小瓶用氮?dú)獬湎?，密封并轉(zhuǎn)移到一輥筒式混合器中2小時。在此期間形成一清亮的分散液。然后將小瓶在一加熱部件中50℃培育。該混合物與適當(dāng)?shù)膶φ找黄鹩帽由V分析，發(fā)現(xiàn)膽甾醇亞油酸酯在每個制劑中已被生物合成。
由此可見，本發(fā)明提供了將親水物摻入親脂溶液的方法和具有許多不同應(yīng)用的多功能產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.制備在疏水溶劑中含有親水物的單相疏水制劑的方法，該方法包括(i)親水物在一液體介質(zhì)中與兩親物混合；(ii)除去液體介質(zhì)以留下一個兩親物分子膠束，其親水首基朝向親水物；且其中兩親物與親水物之間沒有化學(xué)作用；且(iii)在親水物/兩親物膠束周圍提供疏水溶劑。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中親水物包含大分子，小有機(jī)或無機(jī)分子或膠態(tài)物質(zhì)。
3.如權(quán)利要求2的方法，其中大分子包含蛋白質(zhì)，糖蛋白，寡或多核酸，多糖或其超分子組合。
4.如權(quán)利要求3的方法，其中蛋白質(zhì)是胰島素，降血鈣素，血紅蛋白，細(xì)胞色素C，辣根過氧化酶，抑肽酶，蘑菇酪氨酸酶，促紅細(xì)胞生成素，促生長素，生長激素，生長激素釋放因子，galanin，尿激酶，因子IX，組織纖維蛋白溶酶原活化因子，超氧化物歧化酶，過氧化氫酶，過氧化酶，鐵蛋白，干擾素，因子VIII和其片段。
5.如權(quán)利要求1至4任一項的方法，其中兩親物是磷脂。
6.如權(quán)利要求5的方法，其中磷脂具有磷脂酰膽堿首基。
7.如權(quán)利要求6的方法，其中磷脂是磷脂酰膽堿(PC)，溶脂酰膽堿(lyso-PC)，鞘磷脂，任何這些的衍生物，例如十六烷基磷酰膽堿或含磷酰膽堿的兩親聚合物。
8.如權(quán)利要求1至7任一項的方法，其中疏水溶劑包括長鏈脂肪酸，中長鏈醇，分支的長鏈醇，單酸甘油酯，雙酸甘油酯和中長鏈三酸甘油酯。
9.如權(quán)利要求1至8任一項的方法，其中兩親物包括PC，疏水溶劑是三酸甘油酯，或其中兩親物包含lyso-PC而疏水溶劑是油酸。
10.如權(quán)利要求1至9任一項的方法，其中親水物/兩親物膠束通過在親水溶劑中將大分子或化合物與兩親物分散液混合并除去親水溶劑而形成。
11.如權(quán)利要求10的方法，其中親水溶劑是水。
12.如權(quán)利要求10或11的方法，其中兩親物集合包括膠束，單層囊，例如單層囊，多層囊或管狀結(jié)構(gòu)如蝸狀圓柱體，六方相，立方體相或髓磷脂類結(jié)構(gòu)。
13.如權(quán)利要求10至12任一項的方法，其中兩親物與親水物的重量比為1∶1至100∶1。
14.如權(quán)利要求10至13任一項的方法，其中親水溶液通過凍干除去。
15.如權(quán)利要求1至10任一項的方法，其中親水物/兩親物膠束通過在普通溶劑中，使大分子化合物與兩親物共溶，然后除去普通溶劑而形成。
16.制備親水物/兩親物膠束的方法，該方法包括親水物和兩親物在普通溶劑中共溶并隨后除去普通溶劑。
17.如權(quán)利要求15或16的方法，其中普通溶劑是二甲基甲酰胺，二甲基亞砜或冰醋酸。
18.如權(quán)利要求15至17任一項的方法，其中溶劑通過在氮?dú)饬髦懈稍锍ァ?br> 19.如權(quán)利要求1至9任一項的方法，其中親水物/兩親物膠束通過兩親物在疏水溶劑中的溶液與親水物在親水溶劑中的溶液乳化，給出一乳化液并除去疏水溶劑而形成。
20.制備親水物/兩親物膠束的方法，該方法包括乳化兩親物在疏水溶劑中的溶液與親水物在親水溶劑中的溶液，給出一乳化液并除去疏水溶劑。
21.如權(quán)利要求15至20任一項的方法，其中兩親物與親水物的重量比為約1∶1至50∶1。
22.如權(quán)利要求20或21的方法，其中乳化液是油包水乳化液。
23.如權(quán)利要求21至22的方法，其中疏水溶劑是諸如乙醚的低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑。
24.可由權(quán)利要求1至23任一項的方法得到的親水物在疏水溶劑中的單相疏水制劑。
25.一種在疏水溶劑中包含親水物和兩親物的單相疏水制劑，其特征在于親水物的部分被兩親物分子包圍，兩親物分子的親水首基朝向親水物，其中在兩親物分子和親水物之間沒有化學(xué)作用。
26.如權(quán)利要求24或25的制劑，還包含小分子，例如膽汁酸鹽，藥劑或維生素類，與親水物混合。
27.一種兩親物分子和親水物的膠束，其特征在于兩親物分子的親水首基朝向親水物的部分，其中在兩親物分子和親水物之間沒有化學(xué)作用，條件是當(dāng)往膠束中加入水時 兩親物不能形成脂質(zhì)體。
28.含有親水相和疏水相的兩相組合物，其中疏水相包含如權(quán)利要求24至27任一項的制劑。
29.如權(quán)利要求28的組合物，其中疏水相被分散在連續(xù)的親水相中。
30.如權(quán)利要求28或29的組合物，它是乳化液。
全文摘要
親水物，尤其是大分子化合物如蛋白質(zhì)或糖蛋白在疏水溶劑如油中的單相制劑可通過制備親水物/兩親物膠束(其中兩親物的親水首基朝向親水物)并將膠束與疏水溶劑接觸而得到。本發(fā)明的制劑可單獨(dú)使用或與水相結(jié)合形成其中親水物存在于疏水相的乳化液。本發(fā)明的組合物是多用的，并在藥物，食品，美容，化學(xué)和農(nóng)業(yè)的工藝中有用途。
文檔編號A61K9/107GK1137751SQ9419450
公開日1996年12月11日 申請日期1994年11月14日 優(yōu)先權(quán)日1993年11月16日
發(fā)明者R·R·C·紐, C·J·基爾比 申請人:科特克斯有限公司