專利名稱：控釋制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及活性化合物，特別是藥物活性化合物的控釋。具體地講，它涉及應(yīng)用復(fù)合試劑與藥物活性化合物或其它活性化合物作用，并與陰離子聚合物載藥骨架結(jié)合的釋放控制機(jī)理，改善藥物活性化合物對(duì)所需化合物作用位點(diǎn)的靶向性。
廣義來講，本發(fā)明的范圍可延伸至在工業(yè)或農(nóng)業(yè)以及醫(yī)藥和獸藥領(lǐng)域具有特別活性的任何化合物的控釋制劑。
在此以細(xì)胞毒或細(xì)胞生長抑制藥物，特別是抗腫瘤藥物阿霉素(DOX)及順鉑(CDDP)對(duì)人或動(dòng)物患者腫瘤位點(diǎn)的靶向性來詳盡描述本發(fā)明，但應(yīng)理解本發(fā)明并不僅限于這些特別的抗腫瘤藥物的給藥，某種意義上講，它的范圍延伸至任何藥物活性化合物的給藥。如上所述，廣義來講，本發(fā)明的范圍總體上可延伸至活性化合物的控釋。
現(xiàn)已表明將活性細(xì)胞毒藥物加入到控釋骨架中對(duì)腫瘤的治療極有應(yīng)用價(jià)值。這些藥物-聚合物復(fù)合物可通過直接注射到腫瘤內(nèi)或通過以微球體的形式栓塞到腫瘤靶器官的動(dòng)脈循環(huán)中給藥。栓塞動(dòng)脈循環(huán)及直接給固體腫瘤病灶注射都是局部腫瘤治療的已知方式1，2。當(dāng)藥物-聚合物復(fù)合物栓塞患腫瘤的器官的動(dòng)脈循環(huán)時(shí)，藥物-聚合物復(fù)合物被制成小顆?；蛭⑶蝮w的形式，通常其粒度以直徑表示為10-200微米。當(dāng)藥物-聚合物復(fù)合物直接對(duì)腫瘤給藥時(shí)，可使用相同的制劑形式但不用形成微球體。
為保證這種形式治療的療效需兩個(gè)基本的要求。首先，需要在靶位點(diǎn)集中足夠量的藥物以取得預(yù)期的細(xì)胞毒作用。其次，需要控制藥物進(jìn)入腫瘤周圍環(huán)境的速度，這樣可引起最大限度的細(xì)胞破壞。為此，需要設(shè)計(jì)或完善一種聚合物骨架系統(tǒng)，它能提供較高的細(xì)胞毒藥物載藥量以及控釋或緩釋特性。
但對(duì)緩釋骨架的形成卻經(jīng)常出現(xiàn)問題。經(jīng)常觀察到高藥載骨架會(huì)快速釋放藥物，即所謂的“突發(fā)性釋放”作用。這極可能是在高藥載骨架制備過程中導(dǎo)致鍵合弱或藥物位于表層的結(jié)果。常規(guī)使用的包衣技術(shù)會(huì)減緩藥物的釋放，但常常降低了系統(tǒng)的藥載3。
在癌癥患者的局部化療中，要求藥物-聚合物復(fù)合物可降解以便可重復(fù)給藥。因此，也需要制備在體內(nèi)組織中可降解的藥物-聚合物復(fù)合物。
對(duì)于緩釋/控釋系統(tǒng)，藥物的釋放速度在很大程度上決定于藥物和聚合物骨架之間的作用，這受藥物加入的方法的影響。通常藥物可通過以下簡化的方法摻入控釋系統(tǒng)物理包藏、離子作用及共價(jià)結(jié)合。物理包藏可獲得中等至高藥載但通常藥物的釋放太快。離子作用也能得到較好的藥載但突發(fā)性釋放仍是個(gè)問題。共價(jià)結(jié)合得到低藥載及低的釋放速度。對(duì)于聚合物骨架，降解的速度也會(huì)影響體內(nèi)的藥物釋放速度。
阿霉素(DOX)，一種蒽環(huán)類抗生素，是治療癌癥使用得最廣泛的藥物之一。但是，這種制劑的系統(tǒng)給藥會(huì)導(dǎo)致心臟毒性或其它組織損傷，這迫使人們致力于研制更加直接地針對(duì)腫瘤位點(diǎn)的靶向性DOX給藥系統(tǒng)。其中最有前途的是將含DOX的微球體注射入為腫瘤供給的脈管系統(tǒng)以期這些微球體形成栓塞并隨后在長時(shí)間內(nèi)向腫瘤的環(huán)境中釋放藥物。
最初的研究是使用在DOX4-8存在下聚合白蛋白制備的微球體，但這些顆粒的缺點(diǎn)是藥載能力低(1-13％)以及固有的突發(fā)性釋放的特性。在白蛋白微球體制備時(shí)加入聚陰離子化合物如聚α-L-谷氨酸9、聚β-L-精氨酸10或肝素11在一定程度上改善了其藥載及釋放特性。另一個(gè)研究中使用市場銷售的含磺酸基團(tuán)的陰離子交換樹脂結(jié)合DOX12，13。這些顆粒具有高藥載量和優(yōu)異的釋放特性并被認(rèn)為在小鼠肝癌和后肢腫瘤的治療方面很有前景14，15。但是，即使無毒，在體外或體內(nèi)這些微球體也不能降解，這限制了它們?cè)谛枰M(jìn)行進(jìn)一步藥物治療的病人中的應(yīng)用。
本發(fā)明目的之一是提供具有高藥載、緩釋、最小的突發(fā)性釋放作用和可生物降解性的給藥系統(tǒng)。在該工作的一方面，本發(fā)明者開發(fā)了一種可生物降解的陰離子聚合物骨架并使用離子作用作為藥物-聚合物結(jié)合機(jī)理，這能得到高藥載。本發(fā)明者也應(yīng)用藥物金屬離子復(fù)合物的形成來抑制突發(fā)性釋放。其結(jié)果是載體骨架具有臨床應(yīng)用所需的所有性質(zhì)。
本發(fā)明提供了含有陰離子聚合物骨架并載有活性化合物，例如藥物活性化合物的一種控釋制劑，所述活性化合物與螯合劑螯合從而改善了活性化合物從聚合物骨架中的釋放。
在整個(gè)說明書和后面的權(quán)利要求書中，術(shù)語“藥物活性化合物”應(yīng)視為具有治療作用并用于人類藥物和獸藥領(lǐng)域的化合物。
有利的是，陰離子聚合物骨架以微球體的形式提供，如粒度以直徑表示為10-200微米的微球體，并優(yōu)選直徑為20-70微米。這樣的微球體特別適于控釋制劑含有藥物活性化合物并非腸道給藥，如靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或直接注射。但是，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的控釋制劑可用于或摻入其它類型的制劑或給藥系統(tǒng)如混懸劑、乳劑、脂質(zhì)體、微顆粒、微膠囊/微顆粒、結(jié)合物/凝集物、埋置劑、片劑、薄膜及膜給藥系統(tǒng)中。
簡言之，本發(fā)明應(yīng)用了活性化合物與載藥陰離子結(jié)合物骨架復(fù)合的機(jī)理來控制活性化合物的釋放。使用活性化合物的試驗(yàn)結(jié)果表明相對(duì)于其它藥物-骨架制劑這種復(fù)合帶來很多優(yōu)點(diǎn)，包括高藥載、降低了活性化合物的起初的突發(fā)性釋放、活性化合物的控釋及可生物降解性。
按照本發(fā)明的一個(gè)特別的內(nèi)容，藥物-金屬離子復(fù)合作用使突發(fā)性釋放降至最小并不影響系統(tǒng)高藥載的優(yōu)點(diǎn)。已知某種金屬對(duì)藥物及結(jié)合物具有親和性16。在一些例子中，藥物-金屬復(fù)合物可以有生物活性。DOX-離子就是一例17。但是，藥物-金屬復(fù)合作用以前并未用作藥物的控釋機(jī)理。就此而言，應(yīng)當(dāng)注意到本發(fā)明并不僅僅是直接針對(duì)DOX-離子的控釋，而是使用DOX-金屬離子形成及DOX-金屬離子-聚合物復(fù)合物作為控釋機(jī)理以提供原有DOX按適當(dāng)/所需速度釋放的系統(tǒng)?；诒疚牡脑囼?yàn)數(shù)據(jù)，顯然金屬離子與DOX的復(fù)合作用，特別是與DOX弱結(jié)合，在聚合物骨架內(nèi)形成一種大分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這導(dǎo)致DOX的緩釋。因?yàn)樾纬蓮?fù)合物所需的金屬離子的量非常小，這種技術(shù)并不影響原來的藥載。使用不同比率及不同類型的金屬離子使形成的骨架系統(tǒng)具有多方面的及藥物緩釋的特性，而同時(shí)保持高水平的藥載量。
在本發(fā)明的優(yōu)選的內(nèi)容中，膠聯(lián)的白蛋白和硫酸葡聚糖的微球體用作離子藥物如DOX和CDDP的聚合物骨架，提供載藥結(jié)構(gòu)并為陽離子藥物DOX和CDDP提供陰離子位點(diǎn)以得到高藥載。在此實(shí)施例中，白蛋白和硫酸葡聚糖代表聚合物的兩個(gè)基團(tuán)，一個(gè)提供藥載網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，另一個(gè)為強(qiáng)離子交換劑。白蛋白和硫酸葡聚糖都可用具有相似性質(zhì)的其它聚合物代替，如分別以轉(zhuǎn)鐵蛋白和硫酸軟骨素。在一些例子中，這兩個(gè)聚合物也可被一個(gè)同時(shí)提供藥載和離子結(jié)合功能的聚合物系統(tǒng)代替，如某種離子交換樹脂，例如以聚苯乙烯二乙烯苯為基礎(chǔ)的離子交換樹脂或SP-Sephadex。對(duì)于陰離子藥物，可應(yīng)用相同的原理通過使用含陽離子基團(tuán)的聚合物形成聚合物骨架。
本發(fā)明控釋制劑的離子聚合物骨架可以是可生物降解或不可生物降解的。不可生物降解的聚合物骨架的例子為離子交換樹脂如上述以聚苯乙烯-二乙烯苯為基礎(chǔ)的離子交換樹脂。
上述含膠聯(lián)白蛋白和硫酸葡聚糖的聚合物骨架是可生物降解的聚合物骨架的例子之一。在這樣的骨架中，硫酸葡聚糖用作離子試劑形成離子聚合物骨架與含有陽離子基團(tuán)的活性化合物作用并控制其釋放。可用來代替硫酸葡聚糖的其它離子試劑的例子包括硫酸支鏈淀粉、角叉菜膠、硫酸軟骨素、硫酸肝素、肝素、巖藻多糖、聚精氨酸、聚谷氨酸、聚肌苷酸、聚乳酸、多價(jià)聚合酸、SP-Sephadex、CM-Sephadex、硫酸葡聚糖纖維素、硫酸葡聚糖瓊脂糖、陽離子交換樹脂及任何其它含有酸性/陰離子基團(tuán)的試劑。
白蛋白如小牛或人血清白蛋白可用于可生物降解離子聚合物骨架作為載藥物質(zhì)。在這些骨架中多種其它載藥物質(zhì)可用來代替白蛋白，包括如酪蛋白、明膠、血紅蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、膠原蛋白、纖維蛋白原、纖維蛋白、玉米蛋白、鐵蛋白、肌動(dòng)蛋白及任何其它性質(zhì)相似并能與硫酸葡聚糖或上述任何離子試劑形成離子聚合物骨架的試劑。
優(yōu)選金屬離子用于復(fù)合載于離子聚合物骨架上的活性化合物并因此控制活性化合物的釋放特性?？捎米鲝?fù)合試劑的金屬離子的例子包括鐵、銅、鋅、鈷、鉻、鎳、鈀、鋯、鈦及釩離子。也可使用能與活性化合物形成復(fù)合物的其它試劑，如CDDP及其它金屬-活性化合物例子中的聚氨基葡糖。
優(yōu)選可延遲活性化合物釋放的復(fù)合試劑。優(yōu)選其中活性化合物是DOX，復(fù)合試劑為鐵離子。
如前所述，按照本發(fā)明離子聚合物骨架中可裝入任何適當(dāng)?shù)幕钚曰衔?，包括藥物活性化合物，如?xì)胞毒或細(xì)胞生長抑制藥物如阿霉素、正定霉素和順鉑。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，含有白蛋白-硫酸葡聚糖微球體(A-DMS)的聚合物骨架對(duì)DOX具有高的載藥量?？赏ㄟ^微球體的不同程度的載藥量及用不同濃度的鐵離子處理載藥的微球體以與DOX形成復(fù)合物從而改變DOX對(duì)微球體的結(jié)合控制由這些微球體中釋放DOX的速度17，18。
另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，包括上面充分描述的控釋制劑與藥用載體和/或稀釋劑，其中活性化合物為藥物活性化合物。
這種藥物組合物的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。適當(dāng)?shù)乃幱幂d體和/稀釋劑包括任何及所有常規(guī)溶劑、分散介質(zhì)、水溶液、抗細(xì)菌及抗真菌試劑、等滲及吸收延遲試劑等。對(duì)藥物活性化合物使用這樣的介質(zhì)及試劑是本領(lǐng)域已知的，并描述于，例如，Remington′s Pharmaceutical Science，18th，Mack PublishingCompany，Pennsylvania，USA。除了任何常規(guī)介質(zhì)或試劑要與活性成分相容這一點(diǎn)外，將其用于本發(fā)明的藥物組合物是經(jīng)仔細(xì)考慮的。附加的活性成分也可摻入該組合物中。
在進(jìn)一步的內(nèi)容中，本發(fā)明提供了人類或動(dòng)物患者的治療方法，它包括給患者使用上面詳細(xì)描述的控釋制劑的治療有效劑量，其中活性化合物為藥物活性化合物。就此而言，本發(fā)明范圍也延伸至上述控釋制劑在制備用于治療人類或動(dòng)物患者的藥物組合物中的用途，其中活性化合物為藥物活性化合物。
在用于治療人類或動(dòng)物患者時(shí)，可使用多種給藥途徑。當(dāng)然，所選特定的方式依賴于治療的特定癥狀及有效治療所需的劑量。總之，本發(fā)明的方法可用于醫(yī)用的任何給藥方式，即達(dá)到藥物活性化合物的治療水平而不引起臨床不能接受的副作用的任何方式。這樣的給藥方式包括非腸道給藥(如皮下、肌肉、動(dòng)脈及靜脈)途徑。
適于非腸道給藥的組合物常包含活性化合物的無菌水溶液制劑，優(yōu)選與受者的血液等滲。無菌注射制劑可以是存在于無毒非腸道可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌注射溶液或混懸劑。在可接受的載體和溶劑中，可以選用水、格林溶液及等滲氯化鈉溶液。
藥物活性化合物以治療有效的劑量給藥。治療有效劑量是指至少部分達(dá)到所需效果或延緩被治療的疾病的發(fā)作、抑制其進(jìn)展、或同時(shí)抑制其發(fā)作或進(jìn)展所需的劑量。當(dāng)然，這樣的劑量依賴于所治療的特定疾病、疾病的嚴(yán)重程度及病人的個(gè)體參數(shù)如年齡、身體狀況、身高、體重及同時(shí)進(jìn)行的其它治療。這些因素對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的并且它們的確定并不難于常規(guī)試驗(yàn)。一般優(yōu)選使用最大劑量，即按照正確的醫(yī)療診斷確定的最大安全劑量。但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解出于醫(yī)療原因、心理原因或其它任何原因可使用較低的劑量或耐受劑量。
本文的詳盡描述表明通過將白蛋白乳液和高分子量硫酸葡聚糖交聯(lián)制備的可生物降解的微球體顆粒具有強(qiáng)的離子交換性質(zhì)。這些微球體對(duì)陽離子藥物DOX和CDDP具有高載藥量。可通過改變載藥百分率或用Fe(III)處理載藥微球體改變DOX從這些微球體中的釋放特性，而CDDP的釋放特性可通過用聚氨基葡糖處理載藥微球體改變。這種釋放特性的多樣性為在臨床腫瘤治療中使用這些微球體提供了保證。
在整個(gè)說明書及后面的權(quán)利要求書中，除非本文中另有需要，“包含”一詞或它的其它變化的說法應(yīng)理解為指包括所述的整體或整體的一部分但并不排除任何其它的整體或整體的一部分。
本發(fā)明的進(jìn)一步的特征在下列實(shí)施例中充分描述。但應(yīng)理解這種詳細(xì)的描述只是出于舉例說明本發(fā)明的目的，而不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的上述描述的任何限制。在附圖中

圖1表明使用連續(xù)方法且用PBS洗脫時(shí)，最大藥載A-DMS(DOX有效載藥量78％)與離子交聯(lián)樹脂(DOX有效載藥量63％)和游離藥物的釋放性質(zhì)比較。每個(gè)方法使用1mg DOX。
圖2表明用PBS洗脫使用不連續(xù)方法時(shí)，最大藥載A-DMS(DOX有效藥載量80％)與離子交換樹脂(DOX有效載藥量61％)釋放性質(zhì)的比較。每個(gè)方法中使用1mg DOX。
圖3表明使用連續(xù)方法用PBS洗脫由微球體中DOX的累積釋放。通過UV吸收測定濃度。
圖4表明次最大藥載A-DMS(DOX有效藥載量20-60％)用PBS洗脫的釋放性質(zhì)，圖中顯示了通過不連續(xù)方法測定的降低載藥量對(duì)“突發(fā)性釋放”的影響。每個(gè)方法中使用1mg DOX。
圖5表明在鐵離子處理前后最大藥載A-DMS(DOC有效載藥量80％)的釋放性質(zhì)。微球體用PBS使用連續(xù)方法洗脫。每個(gè)方法使用1mg DOX。
圖6表明A-DMS(DOX有效載藥量50％)用PBS洗脫用不連續(xù)方法測定的釋放性質(zhì)，圖中顯示了以Fe(III)與DOX的不同比率處理的效果。每個(gè)方法使用1mg DOX。
圖7表明接受游離DOX及載DOX的鐵離子處理A-DMS(1mg/kg病人體重)治療的病人體內(nèi)阿霉素的血漿濃度。
圖8表明Fe-及Cu-處理載DOX的離子交換樹脂用含EDTA的PBS作釋放介質(zhì)時(shí)的釋放性質(zhì)。
實(shí)施例1本實(shí)施例說明制備摻入阿霉素的可降解的藥物-復(fù)合物系統(tǒng)的技術(shù)。A.材料和方法小牛血清由Commonwealth Serum Laboratories，Melbourne，Australia制備。葡聚糖硫酸鈉鹽(分子量500000)得自Sigma(Ohio，USA)。阿霉素由Farmitalia，Sydney，Australia無償提供。離子交換樹脂Aminex AG50WX4(直徑32.5±2.5μm)自Bio-Rad，將它通過用HCl和NaOH及蒸餾水洗滌純化。使用的所有其它化學(xué)品為分析純。白蛋白-硫酸葡聚糖微球體(A-MDS)的合成將小牛血清白蛋白(0.4g)溶于含有1％十二烷基磺酸鈉的1.6ml 1mM磷酸緩沖液(pH7.5)中，然后與2ml 20％(w/v)葡聚糖硫酸鈉混合形成分散相。用Silverson Mixer(SilversonMachines，Chesham，bucks，UK)在100ml橄欖油中以720rpm的轉(zhuǎn)速在室溫將該分散相乳化。向乳液中加入戊二醛水溶液(10％w/v，400μl)，乳液攪拌1小時(shí)交聯(lián)白蛋白并固化微球體。將微球體分離并用石油醚(×3)、異丙醇(×2)及含有0.1％土溫80的蒸餾水(×2)洗滌。離心后通過尼龍篩(63μm)及不銹鋼篩(20μm)將微球體過濾。將20-63μm粒度范圍的微球體用異丙醇(×2)洗滌后在37℃孵育箱干燥48小時(shí)。使用前將它保持在4℃的干燥器中。載藥為了得到最大藥載，用100μl乙醇處理A-MDS(一般20mg)并用3ml水洗滌使微球體膨脹。然后將膨脹的微球體與2ml DOX(10mg/ml)在4℃黑暗中混合18小時(shí)。用2ml水將微球體洗滌3次并通過DOX溶液中的吸收量及清洗液中的DOX量確定載藥量。為了少于最大藥載(20-60％)，計(jì)量的DOX與膨脹的微球體混合的時(shí)間為10分鐘至1小時(shí)，其間吸收量大于99％，紅色載藥溶液變得幾乎無色。通過在495nm的UV吸收值測定DOX水平。用鐵離子處理載DOX的A-DMS與鐵離子得到最大復(fù)合作用的典型方法如下。含10mg DOX的載DOX的A-DMS懸浮與1ml水中并加入200μl 0.1mol/l Hepes緩沖液(pH7.0)再加入200μl 0.1mol/l FeSO4·7H2O。將混懸液混合5分鐘，微球體的顏色由深紅色變成棕黑色，然后用水(3×3ml)洗滌處理后的顆粒除去緩沖液及過量的FeSO4。也用Fe與DOX的不同比率范圍(1∶1，1∶3，1∶6，1∶9，1∶12)制備鐵離子處理的DOX微球體以便測定復(fù)合程度對(duì)釋放速度的作用。釋放研究用連續(xù)流動(dòng)系統(tǒng)及不連續(xù)系統(tǒng)評(píng)價(jià)A-DMS中DOX在體外的釋放。對(duì)于流動(dòng)系統(tǒng)，將含DOX或鐵離子處理的DOX(通常1mg藥物)的微球體固定在玻璃柱上并以5ml/h的速度用磷酸鹽水緩沖液(PBS，成分為0.15mol/l氯化鈉，0.05mol/l磷酸二氫鈉，pH7.0)在37℃洗滌。洗脫液中DOX的濃度由495nm UV吸收連續(xù)監(jiān)控。對(duì)于不連續(xù)系統(tǒng)，載DOX的A-DMS與3.5ml PBS在搖動(dòng)混合器上混合20分鐘。通過離心沉積微球體并將上清液抽出，通過495nm的UV吸收值測定其中DOX的含量。加入新鮮的PBS，此循環(huán)重復(fù)6小時(shí)。保留由兩種方法得到的洗脫液的餾分并進(jìn)行HPLC、UV光譜法及原子吸收測定。HPLC按照以前描述的條件進(jìn)行13。B.結(jié)果和討論A-DMS的合成由重量相等的白蛋白和硫酸葡聚糖制得的微球體為流動(dòng)自由的棕色粉末，產(chǎn)率32-40％，直徑20-63μm(由光學(xué)顯微術(shù)測定)。載藥A-MDS具有強(qiáng)離子交換性質(zhì)及與市售含磺酸官能團(tuán)所陰離子交換樹脂相近的DOX載藥量。這些載藥量(以藥載的克數(shù)/100克空微球體計(jì)算)比以前報(bào)道的以白蛋白為基礎(chǔ)的微球體大(見表1)。用較低比率的DOX與微球體制得的次最大藥載量通過大大降低混合時(shí)間實(shí)現(xiàn)。本研究中所用最低藥載量(20-25％)的完成時(shí)間少于5分鐘，可見其載藥溶液起初的深紅色完全消失。表1以白蛋白(alb)為基礎(chǔ)的微球體有效藥載量的比較來源 ％藥載 比較本發(fā)明 78-99a alb-硫酸葡聚糖Goldberg等921-46a，balb-聚谷氨酸Cremers等1125-30a，balb-肝素Cremers等117a，balbChen等104b alb-聚精氨酸Chen等1367-86a 離子交換樹脂a制備后DOX載于微球體中b載藥量以百分含量計(jì)算％[藥物/(藥物＋微球體)]最大藥載A-DMS中DOX的釋放最大藥載A-DMS中DOX的釋放特性及其與離子交換微球體的比較見圖1及圖2，分別為連續(xù)及不連續(xù)方法。對(duì)此及進(jìn)行的其它所有釋放研究，兩種方法的結(jié)果在量上很相近。A-DMS釋放形式的特征為開始由微球體中快速釋放DOX，而后釋放速度較穩(wěn)定。在開始階段43％所含藥物被釋放(由不連續(xù)研究計(jì)算)。而相較而言離子交換顆粒具有更均一的釋放速度(在相同的時(shí)間內(nèi)釋放12％)。在那些試驗(yàn)中，載藥顆粒被反復(fù)提取直到不再有DOX釋放，這樣由A-DMS中回收DOX85-95％(按495nm UV吸收值計(jì)算)。見表3的載DOX的A-DMS中藥物的累積釋放圖。改變有效載藥量對(duì)釋放速度的影響由于突發(fā)性釋放特性增加了毒性故一般是臨床不希望的，因此進(jìn)行試驗(yàn)的目的在于降低由A-DMS中開始的高釋放速度。降低藥載的作用見圖4。當(dāng)藥載由60％降至20％時(shí)，突發(fā)性釋放現(xiàn)象有某種程度的降低。這導(dǎo)致試驗(yàn)后期觀察到最低藥載的微球體實(shí)際上比較高藥載的以更高的速度釋放，因?yàn)檩^高藥載的微球體中的藥物已完全釋放。雖然20及30％藥載的A-DMS以穩(wěn)定的速度釋放DOX，但是其可能的缺點(diǎn)是臨床上使用這些載藥量藥物時(shí)給同樣藥量需要更多的微球體。但這些低藥載的藥物仍比以前公開的以白蛋白為基礎(chǔ)的微球體優(yōu)越，因其具有更好的釋放特性。臨床上使用的最合適的載藥量需要用試驗(yàn)來確定。
對(duì)這些所觀察到的藥載量對(duì)釋放速度的影響的合理的解釋為A-DMS含有不同強(qiáng)度的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)藥載量低時(shí)，強(qiáng)的位點(diǎn)優(yōu)先被占據(jù)，這樣就會(huì)以低的速度釋放其結(jié)合的藥物。當(dāng)載藥量大到即使最弱的位點(diǎn)也被占據(jù)時(shí)，這些位點(diǎn)上的藥物會(huì)快速釋放，導(dǎo)致“突發(fā)性釋放”。鐵離子處理對(duì)A-DMS的釋放速度的影響已知在溶液中DOX能與一些金屬包括鐵(一分子Fe(III)結(jié)合三分子DOX)形成復(fù)合物，并且已表明用鐵或銅溶液處理載藥微球體后DOX由離子交換微球體中的釋放速度降低(見后面的實(shí)施例4)。特別是由于已知鐵離子也可與葡聚糖形成復(fù)合物，因此，決定研究鐵離子處理的載DOX的A-DMS是否具有相似的結(jié)果。雖然本研究中以Fe(II)的形式加入微球體，但是在試驗(yàn)條件下很快將其氧化成Fe(III)，在這種價(jià)態(tài)的鐵一定會(huì)與DOX復(fù)合。使用連續(xù)流動(dòng)方法研究用1份鐵與1份DOX(按照化學(xué)計(jì)算鐵過量6倍)的比率處理最大DOX藥載的A-DMS對(duì)釋放速度的影響(見圖5)。用鐵與DOX比率范圍(1∶1至1∶12)處理50％藥載的A-DMS的作用以不連續(xù)系統(tǒng)測定，結(jié)果見圖6。兩個(gè)試驗(yàn)都表明與未處理的微球體相比用鐵與DOX 1∶3或更大比率處理對(duì)克服突發(fā)性釋放現(xiàn)象有顯著作用并降低了釋放速度。鐵處理DOX A-DMS與未處理DOX離子交換微球體的釋放特性非常接近(比較圖1和5或2和6)。
為了測定由鐵處理微球體中釋放的DOX的量，將它們用PBS提取2小時(shí)。提取過程中有78％的所載藥物被回收(見圖3)，用木瓜蛋白酶部分消化的提取后微球體中還可提供4-9％的藥物。釋放產(chǎn)品的特征(a)由載DOX的A-DMS中釋放餾分的DOX濃度通過UV吸收檢測在495nm的所有發(fā)色團(tuán)以及一般的HPLC方法測定，后者解決了UV吸收的代謝物的問題。雖然沒有任何已知的DOX代謝物引起這種不一致的證據(jù)，但HPLC的DOX值為用UV吸收測定值的85-95％。既然微球體上的5-15％的DOX不易提取，原有效藥載量的72-90％應(yīng)是治療中可利用的活性DOX。(b)由鐵處理的載DOX的A-DMS中為確定DOX是以1∶3鐵-DOX復(fù)合物還是以游離的DOX釋放，除上述試驗(yàn)外，還檢測釋放的餾分中鐵的含量。雖然鐵已被檢測，但化學(xué)計(jì)算量不足實(shí)際復(fù)合物預(yù)測值的三分之一。復(fù)合物在612nm也報(bào)道有強(qiáng)吸收但在此波長未觀察到任何釋放餾分。即使DOX是以鐵-DOX螯合物的形式釋放，在本研究中達(dá)到的濃度，預(yù)計(jì)它會(huì)解離，正如以前表明此復(fù)合物會(huì)因稀釋解離成其組成成分17。因此推斷鐵處理的載DOX的A-DMS以游離形式釋放大部分的“DOX”。
使用HPLC可確定70-85％的在495nm有UV吸收的物質(zhì)為游離的DOX。因此，考慮到鐵處理后可由微球體中提取的DOX的量，52-66％的所載藥物可以是容易被利用的活性DOX，同時(shí)還可能有近9％的藥物在微球體生物降解時(shí)釋放。貯存時(shí)A-DMS的穩(wěn)定性在4℃干燥器中貯存4個(gè)月A-DMS與新制備的微球體有相近的載藥量和釋放特性。貯存于-20℃的水的冰凍懸液中的載DOX的A-DMS一個(gè)月后在用于釋放研究時(shí)無降解。
實(shí)施例2為了表明按照上述實(shí)施例1中描述制備的鐵處理的載DOX的A-DMS的體內(nèi)使用結(jié)果，給四個(gè)肝癌病人(病人R、F、C及M)使用微球體。微球體的給藥劑量為1mg/kg病人體重并將它注射入每個(gè)病人的肝動(dòng)脈。在注射60分鐘內(nèi)檢測系統(tǒng)血漿水平。結(jié)果見圖7。它表明將載DOX的A-DMS注射進(jìn)肝動(dòng)脈后在系統(tǒng)循環(huán)中根本檢測不到阿霉素。一個(gè)病人(病人C)也進(jìn)行了游離的阿霉素肝臟動(dòng)脈注射，此后在系統(tǒng)循環(huán)中發(fā)現(xiàn)高水平的藥物。這些結(jié)果表明A-DMS結(jié)合阿霉素保持在微球體給藥的靶向器官中。
實(shí)施例3此實(shí)施例說明了用DOX制備可降解及不可降解的藥物-復(fù)合物的技術(shù)，以及載DOX復(fù)合物療效的評(píng)價(jià)。
聚苯乙烯-二乙烯苯的離子交換樹脂(IE樹脂，32.5±2.5μm)及白蛋白-硫酸葡聚糖微球體(A-DMS，29.4±8.0μm)作為DOX的藥物載體。通過用HCl和NaOH及去離子水洗滌將IE樹脂純化。使用批量制備方法將DOX載入離子交換微球體樹脂中。簡言之，純化的離子交換樹脂與純DOX溶液(10mg/ml)以重量比1∶1在室溫混合過夜。然后通過離心將載DOX的IE樹脂微球體與藥物上清液分離并用去離子水洗滌兩次，再懸浮于已知體積的去離子水中。
實(shí)施例1描述的技術(shù)用于制備載DOX的A-DMS微球體。
IE樹脂與經(jīng)或不經(jīng)金屬離子復(fù)合的A-DMS的藥物釋放研究，可通過用固定洗脫液的連續(xù)系統(tǒng)或用批量洗脫液的不連續(xù)系統(tǒng)進(jìn)行，釋放介質(zhì)是磷酸鹽水緩沖液(PBS)。
為了評(píng)價(jià)作用微球體的療效，用肝臟植入結(jié)腸肉瘤的WAG雄性小鼠進(jìn)行試驗(yàn)。腫瘤植入8天后，將小鼠隨機(jī)分為幾組，每組最少5只小鼠。通過以2.5mg/kg劑量肝臟動(dòng)脈給藥，小鼠接受游離DOX溶液或不同微球體系統(tǒng)治療。治療一周后，將所有的小鼠處死，將其肝臟移出并測腫瘤的重量。在治療期間，有規(guī)律地控制動(dòng)物的體重。用方差分析比較多個(gè)同樣大小樣品進(jìn)行兩組之間的顯著性差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
IE樹脂及A-DMS都有利于DOX的高載藥量，其中最大載藥量分別為67-86％(mg DOX/100mg空微球體)及75-100％。這是由于兩種微球體具有相近的官能團(tuán)，即IE樹脂具有磺酸基團(tuán)而A-DMS有硫酸基團(tuán)。因此，它們與DOX分子中的陽離子胺基形成離子結(jié)合產(chǎn)生高的載藥量。
盡管IE樹脂和A-DMS具有相近的載藥容量，但它們的釋放特性有很大不同。IE樹脂提供了慢而穩(wěn)定的藥物釋放，而盡管其水平比溶液中游離的DOX低得多，A-DMS還有突發(fā)性釋放。這可能是由于DOX與A-DMS中的硫酸基團(tuán)的弱離子作用產(chǎn)生的。但是，同樣的微球體用鐵離子(鐵∶DOX的摩爾比＝3∶1)處理后，它釋放DOX更慢并且?guī)缀鯖]有突發(fā)性釋放。鐵處理的DOX A-DMS與未處理的IE樹脂的釋放特性很相近。
已發(fā)現(xiàn)鐵和銅可與載DOX的IE樹脂微球體形成復(fù)合物，從而在釋放介質(zhì)為含EDTA的PBS中產(chǎn)生較慢且多方面的藥物釋放，見表1。這樣，鐵處理提供了降低突發(fā)性釋放的手段并提供了多方面的控釋特性而不影響載藥量。
對(duì)這些微球體的FTIR研究表明DOX與金屬離子之間的產(chǎn)生的化學(xué)作用導(dǎo)致形成降低DOX釋放的復(fù)合物。比較鐵處理的DOX A-DMS的釋放餾分的UV和HPLC檢測結(jié)果表明70-85％的DOX以其游離形式釋放。AA分析只檢測到痕量的鐵，與3-6％的實(shí)際復(fù)合物相當(dāng)。假設(shè)解離的鐵可與硫酸基團(tuán)作用更強(qiáng)，因此保留在微球體中，而DOX釋放到介質(zhì)中。
表2總結(jié)了檢測三種類型的微球體的DOX轉(zhuǎn)運(yùn)所得的結(jié)果?？梢娙N類型的最大載藥量相近，但它們?cè)谒幬镝尫欧矫嬗袠O大的不同，A-DMS比其它兩種類型的藥物釋放快3-4倍。IE樹脂和FE處理的A-DMS釋放都較慢并相對(duì)穩(wěn)定，但是IE樹脂是不可生物降解的。在降低腫瘤的生長方面，與游離的DOX治療相比Fe處理的A-DMS最有療效，顯著性差異p＜0.05。表2微球體系統(tǒng)的總結(jié)微球體 ％載藥量藥物釋放 生物降解性 腫瘤生長(mg/100mg (％)微球微球體) 體/游離DOXIE樹脂 67-86％ + -60％A-DMS75-100％++++102％Fe-A-75-100％+ +38％DMS此研究清楚地表明在改進(jìn)DOX的療效方面緩釋藥物的重要性。使用鐵與DOX復(fù)合顯著改善了對(duì)藥物釋放的控制程度并抑制了藥物由微球體中的突發(fā)性釋放同時(shí)保持了有利的載藥量。這導(dǎo)致了DOX療效的顯著提高，表明當(dāng)藥物復(fù)合物用于局部化療時(shí)，應(yīng)用藥物-金屬離子作用的原理使腫瘤的治療最有療效。
實(shí)施例4本實(shí)施例是藥物-金屬離子復(fù)合作用原理的應(yīng)用，制備以金屬為基礎(chǔ)的藥物的緩釋系統(tǒng)。在此以金屬為基礎(chǔ)的藥物順鉑與聚合物骨架白蛋白-硫酸葡聚糖及聚氨基葡糖復(fù)合。
除了以1mg/ml純順鉑溶液與樹脂混合外，使用與實(shí)施例3描述相同的批量制備的方法將順鉑載到以聚苯乙烯-二乙烯苯為基礎(chǔ)的離子交換樹脂(IE樹脂)上。
為了得到載順鉑的A-DMS，將實(shí)施例1描述的方法制備的白蛋白/葡聚糖-SO4微球體用2％乙醇潤濕后在與等量的順鉑溶液(1mg/ml)室溫混合過夜。通過離心將未結(jié)合的藥物由微球體中分離并隨后用去離子水洗滌微球體來完成順鉑向A-DMS中的摻入。
載CDDP的IE樹脂和A-DMS與1.5％聚氨基葡糖溶液(在5％乙酸中)以1∶5的重量比率(順鉑∶聚氨基葡糖)室溫混合過夜。然后用去離子水洗滌微球體、離心并立即用于釋放研究。
雖然兩種微球體制劑相近的CDDP載藥量(分別為45.7±8.7％和46.1±12.4％)，但它們的釋放特性有很大差別。IE樹脂釋放藥物的速度明顯較快，在頭5個(gè)小時(shí)釋放了約60％的順鉑。相較而言，A-DMS在相同的時(shí)間內(nèi)只有近20％的CDDP釋放。用聚氨基葡糖處理微球體在釋放的后期延遲了CDDP由IE樹脂中的釋放，但對(duì)開始的釋放幾乎沒有影響。然而，用連續(xù)流動(dòng)通過釋放系統(tǒng)檢測時(shí)，A-DMS的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)表明它抑制了起始階段順鉑從封閉釋放系統(tǒng)中的A-DMS中的突發(fā)性釋放。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的特別描述的前提下，對(duì)本文全面描述的本發(fā)明可進(jìn)行多種改變及修飾。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍延伸至包括所有這樣的變化及修飾的形式。
參考文獻(xiàn)1. Kerr，D.J.，Willmott，N.，McKillop，J.H.et al..Target organ disposition andplasma pharmacokinetics of doxorubicin incorporated into albuminmicrospheres after intrarenal arterial administration.Cancer，62(1988)，878.2. Orenberg，E.K.，Miller，B.H.，Greenway，H.T.et al..The effect ofintralesional 5-fluorouracil therapeutic implant(MPI5003) for treatment ofbasal cell carcinoma.J.Am.Acad.Dermatol.27(5pt1)(1992)，723.3. Irwin，W.J.，Belaid，K.A.and Alpar，H.O.Drug delivery by ion exchangeIV coated resinate complexes of ester pro-drugs of propranoiol.Drug.
Dev.Ind.Pharm.14(1988)，13074. Senyei，A.E.，Driscoll，C.F.and Widder，K.J.Biophysical drug targetingmagnetically responsive albumin microspheres.Methods Enzymol.112(1985)，56-67.5. Longo，W.E.and Goldberg，E.P Hydrophilic albumin microspheres.
Methods Enzymol.112(1985)，18-27.6. Gupta，P.K.，Gallo，J.M.，Hung，C T.and Perrier，D.G.Influence ofstabilisation temperature on the entrapment of adriamycin in albuminmicrospheres.Drug Dev.Ind Pharm.13(1987)，1471-1482.7. MacArdle，C.S.，Lewi，H.，Hansell，D.，Kerr，D.J.，McKillop，J.andWillmott，N.Cytotoxic-loaded albumin microspheresa novel approachto regional chemotherapy.Br.J.Surg.75(1988)，132-134.8. Jones，C.，Burton，M.A.and Gray.B.N.Albumin microspheres asvehicles for the sustained and controlled release of doxorubicin.J.
Pharm.Pharmacol.4191989)，813-816. 11. Cremers，H.F.M.，F(xiàn)eigen，J.，Kwon，G.，Bae，Y.H.，Kim，S.W.，Noteborn，H.P.J.M.and McVie，J.G.Albumin-heparin microspheres as carriers forcytostatic agents.J.Controlled Release，11(1990)，167-179.12. Jones，C.，Burton，M.A.and Gray，B.N.In vitro release of cytotoxicagents from ion exchange resins.J.Controlled Release，8(1989)，251-257.13. Chen，Y.，Burton，M.A.，Codde，J.P.，Napoli，S.，Martins，I.J.and Gray，B.
Evaluation of ion-exchange microspheres as carriers for the anticancerdrug doxorubicinin vitro studies.J.Pharm.Pharmacol.4(1992)，211-215.14. Codde，J.P.，Lumsden，A.J.，Napoli，S.，Burton，M.A.and Gray，B.N.Acomparative study of the anticancer efficacy of doxorubicin carryingmicrospheres and liposomes using a rat liver tumour model.AnticancerRes.13(1993)，539-544.15. Burton，M.A.，Jones，C.，Trotter，J.M.，Gray，B.N.and Codde，J.P.
Efficacy of ion-exchange resins for anti-tumour drug delivery.Reg.
Cancer Treat.3(1990)，36-39.16. Lee，V.A.，Musin，R.I.，Tashmukhamedov，R.I. et al..Metal complexes ofpolymers with amino acid residues，formation，stability and controlledbiological activity.J.Controlled Release，14(1990)，61.17. Gelvan，D.and Samuni，A.Reappraisal of the association betweenadriamycin and iron.Cancer Res.48(1988)，5545-5649.18. Beraldo，H.，Garnier-Suillerot，A.，Tosi，L.and Lavelle，F(xiàn).Iron(III)-adriamycin and iron (III)-daunorubicin complexesphysiochemicalcharacteristics，interaction with DNA and antitumour activity.
Biochemistry，24(1985)，284-289.
權(quán)利要求
1.一種包含載有某種活性化合物的離子聚合物骨架的控釋制劑，其中所述活性化合物與某種復(fù)合試劑復(fù)合，以改善活性化合物由聚合物骨架中的釋放。
2.權(quán)利要求1所述的制劑，其中離子聚合物骨架是以微球體的形式。
3.權(quán)利要求2的制劑，其中微球體的直徑范圍為10-200微米，優(yōu)選20-70微米。
4.權(quán)利要求1的制劑，其中活性化合物是藥物活性化合物。
5.權(quán)利要求4的制劑，其中藥物活性化合物是細(xì)胞毒或細(xì)胞生長抑制藥物。
6.權(quán)利要求5的制劑，其中細(xì)胞毒或細(xì)胞生長抑制藥物是阿霉素、正定霉素或順鉑。
7.權(quán)利要求1的制劑，其中離子聚合物骨架包括可生物降解的交聯(lián)白蛋白/硫酸葡聚糖骨架。
8.權(quán)利要求1的制劑，其中復(fù)合試劑是金屬離子。
9.權(quán)利要求8的制劑，其中金屬離子是鐵離子。
10.權(quán)利要求1的制劑，其中離子聚合物骨架選自交聯(lián)白蛋白/硫酸葡聚糖骨架和以聚苯乙烯-二乙烯苯為基礎(chǔ)的離子交換樹脂，且離子聚合物骨架載有與鐵復(fù)合的阿霉素。
11.權(quán)利要求1的制劑，其中離子聚合物骨架選自交聯(lián)白蛋白/硫酸葡聚糖骨架和以聚苯乙烯-二乙烯苯為基礎(chǔ)的離子交換樹脂，且離子聚合物骨架載有與聚氨基葡糖復(fù)合的順鉑。
12.一種含有權(quán)利要求1至11中任意一項(xiàng)的控釋制劑的藥物組合物及某種藥用載體和/或稀釋劑，其中活性化合物是藥物活性化合物。
13.一種治療人類或動(dòng)物患者的方法，其中包括給病人使用權(quán)利要求1至11中任意一項(xiàng)的控釋制劑的治療有效劑量，其中活性化合物為藥物活性化合物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述控釋制劑以非腸道途徑使用，優(yōu)選動(dòng)脈或靜脈內(nèi)給藥。
15.權(quán)利要求1至11任意一項(xiàng)的控釋制劑在制備用于治療人類或動(dòng)物患者的藥物組合物中的用途，其中活性化合物是藥物活性化合物。
全文摘要
一種包括離子聚合物骨架的控釋制劑，骨架上載有活性化合物，特別是藥物活性化合物如阿霉素或其它細(xì)胞毒或細(xì)胞生長抑制藥物，該活性化合物與復(fù)合試劑如金屬離子復(fù)合以改善活性化合物由聚合物骨架中的釋放。該離子聚合物骨架可以提供以微球體的形式，如交聯(lián)白蛋白/硫酸葡聚糖的微球體。
文檔編號(hào)A61K9/16GK1139380SQ94194617
公開日1997年1月1日 申請(qǐng)日期1994年11月17日 優(yōu)先權(quán)日1993年11月18日
發(fā)明者Y.陳, B.N.格雷 申請(qǐng)人:癌癥研究所