專利名稱：：血小板特異性的嵌合性免疫球蛋白及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明所屬
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在凝血塊的形成過程中，血小板的凝聚起著主導(dǎo)作用，在正常的情況下，凝血塊是為了防止血細胞從血管中漏出。但是，在某些病狀下，凝血塊會限制或者完全地阻止血液的流通，導(dǎo)致細胞壞死。例如，在動脈粥樣化的位點發(fā)生的血小板凝聚及其隨后形成的血栓是形成眾多疾病，例如，心膠痛、急性心肌梗塞以及在成功地進行了凝血溶解和血管成形后的再次阻塞的重要原因。急性心臟病患者一般都接受溶血制劑，例如組織血纖維蛋白溶酶原激活因子和鏈激酶的治療，這些制劑將溶解凝血中的血纖維蛋白。與血纖維蛋白作用相伴隨的主要的并發(fā)癥是血小板凝聚所引發(fā)的再次閉塞，它還能夠造成心臟的進一步受損。由于糖蛋白(GP)IIb/IIIa受體是已知的引起血小板凝聚的主要因素，那么，封閉這些受體的制劑就被認(rèn)為是能夠減少甚至完全防止在凝血溶解治療后的再次閉塞并從而提高溶血的速率。這些制劑還被認(rèn)為是可以用在其它的血管閉塞性和血栓栓塞的疾病中。封閉血小板凝聚的一種方法是使用對GPIIb/IIIa受體為特異性的單克隆抗體。在歐洲專利申請第205,207和206,532號中，揭示了鼠單克隆抗體，命名為7E3，該抗體抑制血小板的凝聚并表現(xiàn)為可用于治療人的血栓疾病。已知的是鼠單克隆抗體具有的某些特性能夠嚴(yán)重地限制它們在人體治療中的應(yīng)用。作為外源性蛋白，鼠抗體能夠刺激那些降低或者損害其治療效率和/或在患者身上引起變應(yīng)性和過敏性反應(yīng)的免疫反應(yīng)。在血栓栓塞疾病中，需要重復(fù)使用這些治療制劑，因而就會提高這類免疫反應(yīng)的發(fā)生率。包括非人體來源的結(jié)合區(qū)與人體來源的恒定區(qū)的嵌合性抗體已被提出并被認(rèn)為是消除鼠抗體的這些免疫反應(yīng)的一種措施，見Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(81)6851(1984)和PCT申請NO.PCT/GB8500392。由于恒定區(qū)主要負責(zé)抗體分子的免疫反應(yīng)性，那么帶有人體來源的恒定區(qū)的嵌合性抗體引起人體的抗鼠反應(yīng)的可能性就比較小。然而，無法預(yù)測的是把人體來源的恒定區(qū)與具有所需要的特異性的鼠結(jié)合區(qū)相結(jié)合是否一定能夠使所得到的嵌合性抗體的免疫反應(yīng)被降低和/或改善其結(jié)合能力。與本發(fā)明相關(guān)的
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及包括有非人體來源可變區(qū)或抗原結(jié)合區(qū)與人體來源恒定區(qū)的血小板特異性嵌合免疫球蛋白。這種嵌合免疫球蛋白可以是對GPIIb/IIIa受體或其它血小板成分為特異性的。這些抗體可與血小板結(jié)合并且防止血小板凝聚，從而用作抗血栓劑使用在防止或降低在各種臨床情況下(例如，溶解血栓治療之后以及伴隨著血管成形術(shù))發(fā)生的血管閉塞及復(fù)發(fā)性閉塞和在防止血管狹窄及重復(fù)性狹窄之中。本發(fā)明的抗血小板抗體還可以用于造影。附圖的簡要說明圖1是使用克隆化的可變區(qū)作為探針對7E3單克隆抗體的mRNAs的重鏈和輕鏈的Northern分析。圖2A和2B是質(zhì)粒p7E3VKhCK(圖2A)和p7E3VHhCG4(圖2B)，它們各自帶有對嵌合性7E3免疫球蛋白的輕鏈和重鏈進行編碼的嵌合性基因結(jié)構(gòu)。圖3是由載體p7E3VKhCK和p7E3VHhG4編碼的嵌合性7E3免疫球蛋白與血小板的結(jié)合。圖4是嵌合性7E3(c7E3)免疫球蛋白對血小板凝聚的抑制。圖5是說明血漿抗體濃度(ng/mL)對時間(天數(shù))的點陣圖解，表明在三位長期冠心病患者接受5分鐘靜脈滲透0.25-mg/kg劑量的c7E3Fab后，c7E3Fab(γ1，k)的迅速從血漿中消失的速度。圖6(A-C)是在使用了抗體(γ1，k)兩小時后一次施給嵌合性7E3Fab(0.15mg/kg，0.20mg/kg及0.25mg/kg)濃縮藥丸對血小板活性的效果的總結(jié)。當(dāng)對受體封閉(圖6A，上)，血小板凝聚(圖6B，中)，和失血時間(圖6C，下)進行分析后，這些劑量對血小板活性的作用得到證實，其中的線條是平均值。圖7(A-C)表明在進行血管成形術(shù)之前以0.25mg/kg濃縮藥丸劑量給藥c7E3Fab(γ1，κ)的抗血小板效果的作用時間。其中的線條表明的是在基線上時間為0至第24小時的受體封閉(圖7A，上)，血小板凝聚(圖7B，中)，和失血時間(圖7C，下)的平均值。圖8(A-C)總結(jié)的是在11位患者中按0.25mg/kg濃縮藥丸劑量給藥，然后再進行12小時c7E3Fab(γ1，κ)的連續(xù)滲透(10μg/分)的抗血小板活性。其中的線條表明的是受體封閉百分度(圖8A，上)，給藥前的血小板凝聚百分度(基線上的零點)(圖8B，中)，和失血時間(圖8C，下)的平均值。圖9是在實施例4中對47位患者進行滲透后的從基點到24小時的血細胞比容的絕對變化值。圖10是表明對三組接受治療的人員進行隨機處理后，不需要進行緊急重復(fù)經(jīng)皮血管治療的概率的Kaplan-Meier點陣圖。圖11是對接受治療的人員中的關(guān)鍵組(圖中右側(cè))的優(yōu)勢比例和95％的置信區(qū)間的圖示。其中的數(shù)據(jù)表示主要效率終點[死亡，非致命性梗塞，緊急血管成形或手術(shù)，對不應(yīng)性局部缺血放置冠狀動脈內(nèi)斯坦特(stent)或主動脈內(nèi)的氣囊泵]。此外，對每一亞組的主要終點的絕對事件比率在左側(cè)例表給出[事件比率(％)]。圖12給出的是所有患者中在6個月追蹤期不發(fā)生事件的分?jǐn)?shù)。圖13表示的是在那些接受了成功的治療之后30天沒有發(fā)生事件的患者之中的在隨后6個月追蹤期內(nèi)不發(fā)生事件的患者的分?jǐn)?shù)。圖14表示的是在接受了成功的初期治療后48小時沒有發(fā)生事件的患者在隨后6個月追蹤期內(nèi)不發(fā)生事件的患者的分?jǐn)?shù)。圖15表明的是在所有的患者中在隨后6個月追蹤期內(nèi)不需對與治療有關(guān)的動脈(PRA，治療有關(guān)的動脈)進行血管再造的患者的分?jǐn)?shù)。本發(fā)明的技術(shù)方案本發(fā)明的嵌合免疫球蛋白包括單個的免疫球蛋白嵌合重鏈和嵌合輕鏈。嵌合重鏈包括從非人體來源的對血小板(例如，對GPIIb/IIIa受體)為特異性的重鏈維生素的抗原結(jié)合區(qū)與人體來源的重鏈恒定區(qū)結(jié)合在一起。嵌合性輕鏈包括從非人體來源的抗體的輕鏈衍生的抗原結(jié)合區(qū)與人體來源的輕鏈恒定區(qū)結(jié)合在一起。本發(fā)明的免疫球蛋白可以是單價的，雙價的或多價的。單價的免疫球蛋白是二聚體(HL)，由嵌合重鏈通過二硫鍵與嵌合輕鏈相結(jié)合在一起而形成的。二價的免疫球蛋白是四聚體(H2L2)，由兩個二聚體通過至少一個二硫鍵結(jié)合在一起而形成。多價的免疫球蛋白也可以被制造出來，例如，使用可聚合的重鏈恒定區(qū)(例如，μ重鏈恒定區(qū))。嵌合免疫球蛋白片段，例如Fab，F(xiàn)ab’和F(ab’)2也可被制造出來。嵌合免疫球蛋白的非人體來源的抗原結(jié)合區(qū)是從對血小板為特異性的免疫球蛋白中產(chǎn)生。優(yōu)選的免疫球蛋白是對血小板GPIIb/IIIa受體為特異性，并且能夠阻止配體結(jié)合到糖蛋白的IIb/IIIa受體的復(fù)合體上。當(dāng)血小板粘結(jié)在血管壁受到損傷的位置時就開始產(chǎn)生血栓。血小板的粘結(jié)是受血小板表面受體調(diào)控的，這些受體與暴露出來的內(nèi)皮下組織的細胞外的基質(zhì)蛋白相結(jié)合，例如vonWillebrand因子，膠原，纖維連結(jié)素，玻連蛋白和昆布胺酸。血小板的粘結(jié)導(dǎo)致單層的血小板排列。隨后血小板的激活是在對激活劑，例如腎上腺素，ADP，膠原或凝血酶等發(fā)生反應(yīng)時產(chǎn)生。激活導(dǎo)致血小板表面的糖蛋白IIb/IIIa受體(GPIIb/IIIa)被暴露出來。在被激活的血小板上的GPIIb/IIIa就可與纖維蛋白原相結(jié)合，并且調(diào)控血小板的凝聚。GPIIb/IIIa與其它粘結(jié)性蛋白的結(jié)合，例如vonWillebrand因子的結(jié)合還可以導(dǎo)致血小板的交聯(lián)和凝聚。因此，粘結(jié)性分子例如纖維蛋白原和yonWillebrand因子與GPIIb/IIIa的結(jié)合就造成血小板的凝聚，并且是血栓形成中的一個共同步驟，這樣就使得GPIIb/IIIa受體成為治療劑的具有吸引力的靶標(biāo)，這些治療劑可以干擾GPIIb/IIIa與這些分子的相互作用。此外，使用抗GPIIb/IIIa嵌合抗體可以在不干擾血小板的初始粘接的條件下抑制被激活的血小板的凝聚。這種對血小板凝聚的選擇性的抑制可能正是人們所期望的，因為在不發(fā)生凝聚的條件下血小板的粘結(jié)可以對止血有利。適宜的對血小板為特異的抗體包括7E3和10E5。參見歐洲專利申請205,207號和206,532號，其中的教導(dǎo)通過引述在此結(jié)合于本文。最優(yōu)選的是的7E3抗體(或者是與相同的或功能上等同的對象產(chǎn)生反應(yīng)的抗體)，因為它是對復(fù)合形式的GPIIb/IIIa受體為特異性的。其它的對GPIIb/IIIa受體(被7E3識別的抗原)為特異的抗體，例如那些對IIb/IIIa成分為特異性的抗體也可被使用。還可以使用對其它血小板抗原為特異性的抗體。例如與血小板α粒膜蛋白GMP-140起反應(yīng)的抗體，例如S12抗體(J.Biol.Chem.，2599799-9804(1984)；美國專利No.4,783,330)也可被使用。嵌合抗體的抗原結(jié)合區(qū)可以從非人體來源的免疫球蛋白中衍生。優(yōu)選的抗原結(jié)合區(qū)來源于鼠，因為鼠抗血小板，特別是GPIIb/IIIa受體的抗體可以從鼠中產(chǎn)生并且是可獲得的。其它的動物和嚙齒類提供了抗原結(jié)合區(qū)的另外來源(參見Newmanetal.，Bio/technology，101455-1460(1992))。在一個實施方案中，嵌合免疫球蛋白的抗原結(jié)合區(qū)包括非人體來源的對血小板為特異性的免疫球蛋白的、足夠?qū)乖Y(jié)合區(qū)為特異性或選擇性的至少一部分，例如從非人體來源的免疫球蛋白產(chǎn)生的一種或多種輔助性確認(rèn)區(qū)(參見Winter，美國專利No.5,225,539，歐洲專利No.0,239,400，英國專利No.2,188,638；Adairetal.，WO91/09967Jolliffeetal..WO91/09966)。在另一個實施方案中，嵌合免疫球蛋白包括至少一條由非人體來源的免疫球蛋白的重鏈的可變區(qū)與人體來源的重鏈的恒定區(qū)的至少一部分相連接的嵌合重鏈和一條從非人體免疫球蛋白的輕鏈產(chǎn)生的可變區(qū)與人體來源的輕鏈的恒定區(qū)的至少一部分共價連接的嵌合輕鏈。其它的可變區(qū)與恒定區(qū)的組合方式也是可能的(參見美國專利第5,169,939號)。嵌合抗體的恒定區(qū)是從人免疫球蛋白中產(chǎn)生的。重鏈恒定區(qū)可以從五種同型物α，δ，ε，γ，μ中選擇。進而言之，不同亞組的重鏈(例如IgG亞組重鏈)對不同的功能因子負責(zé)，因此，選擇所需的重鏈恒定區(qū)就可以產(chǎn)生具有所需功能因子的嵌合抗體。優(yōu)選的恒定區(qū)是γ1(IgG1)，γ3(IgG3)和γ4(IgG4)。輕鏈恒定區(qū)可以是κ和λ型?？偠灾谥苽淝逗峡贵w時對嵌合免疫球蛋白的每一輕鏈和重鏈成分都制造一個融合基因，該基因包括對非人體來源的血小板特異性可變區(qū)的功能部分的至少一部分(例如將可變區(qū)與相鄰段進行功能性重新安排)進行編碼的第一DNA片段與對人體來源的恒定區(qū)的至少一部分進行編碼的第二DNA片段連接。每一個融合基因都是在表達載體中組建或插入到其中，產(chǎn)生含有處于可表達形式的融合基因的表達載體。在一個實施方案中，含有抗原結(jié)合區(qū)的DNA是通過間隔序列與恒定區(qū)共價結(jié)合在一起。在另一實施方案中，可以制造出缺少一個或多個間隔序列的結(jié)構(gòu)。能夠表達這些基因產(chǎn)物的受體細胞就被用這些基因進行轉(zhuǎn)染。被轉(zhuǎn)染的受體細胞在允許對所插入的基因進行表達的條件下進行培養(yǎng)，然后回收表達出來的免疫球蛋白和免疫球蛋白鏈。對Ig輕鏈和重鏈的可變區(qū)進行編碼的基因可以從產(chǎn)生血小板特異性抗體的淋巴細胞中獲取。例如，那些產(chǎn)生抗GPIIb/IIIa抗體的雜交瘤細胞系是本發(fā)明嵌合抗體的免疫球蛋白可變區(qū)的一種來源。其它的嚙齒類細胞系也是可選用的。用人血小板或包含GPIIb/IIIa受體成分或血小板片段對嚙齒類進行攻擊，在產(chǎn)生抗體的細胞和骨髓瘤細胞系之間形成融合雜交細胞，將所得雜交細胞克隆化，選擇那些產(chǎn)生抗血小板或GPIIb/IIIa受體的抗體的克隆，從而產(chǎn)生所需的細胞系。用常規(guī)的克隆技術(shù)可以從人的產(chǎn)生抗體的細胞中得到恒定區(qū)。另外，由于代表兩類輕鏈和五類重鏈的基因已經(jīng)被克隆化了，所以人體來源的恒定區(qū)可以從這些克隆中得到。嵌合抗體結(jié)合片段例如F(ab’)2和Fab片段可以通過將嵌合重鏈基因制成被剪切的形式而制取。例如，對F(ab’)2重鏈部分進行編碼的嵌合基因包括對重鏈的關(guān)節(jié)區(qū)和CH1部分進行編碼的DNA序列。另外，這些片段可以通過對嵌合免疫球蛋白進行酶切來得到。例如，使用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶的酶切可以分別得到Fab和F(ab’)2片段。優(yōu)選地，對嵌合輕鏈和重鏈(或它們的一部分)進行編碼的融合基因可以裝配于兩種不同的并可對受體細胞進行共轉(zhuǎn)染的表達載體之中。每一個載體都包含兩個可選擇的基因，一個基因用于在細菌系統(tǒng)中進行選擇，另一個用于在真核細胞體系中進行選擇，每一個載體含有不同的一對基因。這些載體可以使融合基因在細菌系統(tǒng)中生產(chǎn)和放大，然后在真核細胞中進行共轉(zhuǎn)染并選擇被共轉(zhuǎn)染的細胞。用于細菌體系的可選擇的基因包括例如那些具有氨芐青霉素抗性的和那些具氯零素抗性的基因。在對真核轉(zhuǎn)染物進行選擇的兩種選擇性基因優(yōu)選(i)黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(gpt)，和(ii)從Tn5來的磷酸轉(zhuǎn)移酶(定名為neo)。選擇gpt依據(jù)的是這個基因所編碼的酶將黃嘌呤作為底物合成出嘌呤核苷酸的能力；其它的內(nèi)生性酶的類似物是無法完成這一任務(wù)的。在含有黃嘌呤霉酚酸的培養(yǎng)基中，因為該培養(yǎng)基可以阻止次黃苷單磷酸鹽轉(zhuǎn)變成黃嘌呤單磷酸鹽，所以，只有表達gpt的基因可以在其中存活下來。neo基因的產(chǎn)物封閉由抗生素G418和其同類的抗生素所造成的對在真核細胞中的蛋白合成的抑制。這兩種選擇程序可以同時使用或者順序使用，以對插入到真核細胞中的兩個不同的DNA載體上的免疫球蛋白鏈基因的表達進行選擇。優(yōu)選的受體細胞系是骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞可以對轉(zhuǎn)染的Ig基因所編碼的免疫球蛋白進行合成，組建和分泌。此外，它們還具有對免疫球蛋白進行糖化的機制。特別優(yōu)選的受體細胞是一種不產(chǎn)生Ig的骨髓瘤細胞系，例如，Sp2/0。這些細胞系僅僅產(chǎn)生由轉(zhuǎn)染的免疫球蛋白基因所編碼的免疫球蛋白。骨髓瘤細胞可以在培養(yǎng)基中或者在小鼠的腹膜中生長，并分泌免疫球蛋白，然后從腹水中獲取這些免疫球蛋白。其它的淋巴細胞例如B淋巴細胞或雜交瘤細胞也可作為適當(dāng)?shù)氖荏w細胞?，F(xiàn)在已有幾種用含有免疫球蛋白編碼基因的載體對淋巴細胞進行轉(zhuǎn)染的方法。一種優(yōu)選的將DNA引入到淋巴中的方法是電穿孔法(electroporation)。在這一方法中，在有要被引入的DNA存在的條件下對受體細胞進行電脈沖刺激。參見Potteretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，817161(1984)。另一種引入DNA的方法是原生質(zhì)體融合。在這一方法中對含有包含嵌合Ig基因的重組質(zhì)粒的細菌的細胞壁用溶菌酶進行處理。所得到的原生質(zhì)球與骨髓瘤細胞用乙二醇進行融合。原生質(zhì)融合完成后，對被轉(zhuǎn)染的細胞進行選擇和分離。另外的一種可以將DNA引入到眾多細胞的方法是磷酸鈣沉淀法。嵌合免疫球蛋白基因還可以在非淋巴細胞中進行表達，例如在細菌或酵母菌中。當(dāng)在細菌中進行表達時，免疫球蛋白重鏈和輕鏈就變?yōu)閮?nèi)含體的一部分。因此，這些鏈就必須被分離和提純，然后組建到功能性免疫球蛋白分子中。其它的在大腸桿菌E.coli中進行表達的方法是已知的(參見Pluckthun，A.，Bio/Technology，9545-551(1991)；Skerra，A.etal.，Bio/Technology，9273-278(1991))，包括從E.coli分泌含有信號序列的融合蛋白。血小板特異性嵌合免疫球蛋白的用途本發(fā)明的嵌合血小板特異性抗體可用作抗血栓治療制劑。例如，嵌合抗體(或其片段)可用于患有血栓或具有發(fā)生血栓危險的患者以抑制血小板的凝集和血栓的發(fā)生。這些抗體還可以用于抑制由血小板凝集引起的血液循環(huán)異常及其進而造成的血栓或血栓的復(fù)發(fā)情況。這些抗體可以用于防止血栓形成或復(fù)發(fā)性血栓(復(fù)發(fā)性閉塞)的各種情況。此外，這些抗體還可用于抑制狹窄或復(fù)發(fā)性狹窄(減低，延遲或預(yù)防)的各種情況。例如，患有或可能患有冠狀動脈疾病的患者可以通過使用有效劑量的本發(fā)明的嵌合抗血小板抗體片段(例如，嵌合抗GPIIb/IIIa抗體或優(yōu)選其片段，例如，嵌合7E3Fab或F(ab’)2)來抑制血管的閉塞，復(fù)發(fā)性閉塞，狹窄和/或復(fù)發(fā)性狹窄。例如，本發(fā)明的抗體可以使用于個體(例如，哺乳動物，例如人)以防止肺部血栓，瞬時性失血(TIAs)，深度靜脈血栓，冠狀動脈分流手術(shù)，插入人造瓣膜和血管(例如，在自體性，非自體性或合成性血管植入中)。本發(fā)明的抗體還可以用于患者在進行氣囊，冠狀動脈癍塊切除(atherectomy)，和激光血管成形術(shù)(angioplasty)及其它適當(dāng)?shù)难艹尚涡g(shù)之前，之中或之后來防止血小板凝集或血栓?？贵w可在進行血管成形術(shù)之前，之中或之后使用。這類處理方式可以防止血栓的形成，進而降低在血管成形術(shù)之后的并發(fā)癥的出現(xiàn)，例如，死亡，心肌梗塞，進行導(dǎo)致PTCA時的局部缺血事件或冠狀動脈分流手術(shù)(急性局部缺血事件)。此外，這種治療可以獲得長期的效果，減少冠狀動脈介入手術(shù)(例如，血管成形術(shù))的局部缺血事件和并發(fā)癥的發(fā)生，例如，死亡，心肌梗塞，導(dǎo)致進行PTCA時的局部缺血事件或冠狀動脈分流手術(shù)(血管再造)，指示性降低，延遲或防止狹窄或復(fù)發(fā)狹窄。例如在實施例4中所示，當(dāng)在進行血管成形手術(shù)[經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動脈血管成形術(shù)(percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty，PTCA)]之前將嵌合抗血小板抗體(嵌合7E3Fab片段)作為輔助治療劑使用時，就可以有效地提高失血時間，并且降低拮抗劑引導(dǎo)的血小板凝聚，正如用體外血小板凝聚檢測方法所測的結(jié)果所示。在實施例4和5中的實驗的結(jié)果還表明對血小板GPIIb/IIIa的封閉和用c7E3抗體(Fab片段)對血小板凝聚的抑制可以在人的體內(nèi)產(chǎn)生有效的抗血栓效果。在實施6和7中給出的結(jié)果是使用嵌合7E3抗體片段的隨機的雙盲性對照研究結(jié)果。在實施例6中給出的數(shù)據(jù)揭示了對進行血管成形手術(shù)和有發(fā)生血管堵塞(復(fù)發(fā)性閉塞)高度危險的患者給以嵌合7E3抗體片段，可以有效地防止急性堵塞，同時降低了急性局部缺血的發(fā)生。正如在實施例7中進一步所表明的，對這類患者采用相同的處理可以降低、延遲和/或防止以后的復(fù)發(fā)性血管狹窄。這種使用嵌合抗GPIIb/IIIa抗體片段(見實施例7)所產(chǎn)生的對非急性局部缺血并發(fā)癥的長期有利效果是沒有先例的。此外，那些能夠選擇性地與GPIIb/IIIa受體相結(jié)合的化合物可以用來防止或者降低狹窄或重復(fù)性狹窄的發(fā)生，同時能夠帶來有效的在臨床上降低非急性局部缺血并發(fā)癥的發(fā)生率。當(dāng)使用這些化合物時，還可以另外地防止閉塞或者重復(fù)性閉塞。這些化合物包括，例如GPIIb/IIIa拮抗藥，免疫球蛋白或非免疫球蛋白的肽或蛋白質(zhì)(例如合成性的或者重組的)及它們的類似物，核苷酸或核苷酸類似物。當(dāng)患有或有可能患冠狀動脈疾病的患者接受有效劑量的這些選擇性地與GPIIb/IIIa受體相結(jié)合的化合物時，就可以抑制血管的閉塞，復(fù)發(fā)性閉塞，狹窄和/或復(fù)發(fā)性狹窄。給藥血小板的凝聚誘發(fā)鏈鎖凝固并且產(chǎn)生更加穩(wěn)定的(血)纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和凝血塊，它們可以被血栓溶解劑來溶化掉。本發(fā)明的選擇性地與GPIIb/IIIa受體相結(jié)合的抗體或化合物可以單獨地或與血栓溶血制劑，例如，纖維蛋白溶酶原激活子(例如，組織血纖維蛋白溶酶原激活子、尿激酶、鏈激酶、重組的組織纖維溶酶原激活子)，或抗凝固劑(例如，抗凝血酶)，或抗血小板劑例如阿斯匹林、肝素、水蛭素或香豆素抗凝固劑(例如芐丙酮香豆素)等結(jié)合使用于人體(如，人)，從而防止及降低血栓溶解治療后的復(fù)發(fā)性閉塞并加速凝血塊的溶解。這些化合物、抗體或其片段可以在使用血栓溶血劑、抗溶血酶制劑、抗凝固制劑或抗血小板之前、之后或同時按有效劑量使用，從而防止那些能夠?qū)е麻]塞或重復(fù)性閉塞的血小板凝集和/或延遲或防止狹窄或復(fù)發(fā)性狹窄。有效劑量的(即足以獲得所需治療效果的劑量，例如抑制血小板凝聚并從而抑制血栓的形成或復(fù)發(fā)性血栓的劑量，能夠降低或延遲或防止狹窄或重復(fù)性狹窄或局部缺血的有效劑量)化合物或抗體或抗體片段可以按腸胃外的形式，優(yōu)選靜脈輸入的方式，在藥物上可接受的載體，例如無菌生理鹽水中對患者給藥。還可包括緩沖劑。這些抗體的制劑還可以包括另外的添加劑，例如穩(wěn)定劑(多乙氧基醚80，USP/NF)。這些抗體可以單一劑量、連續(xù)性使用或以多重滲透(例如，濃縮藥團注射然后進行連續(xù)滲透)使用。此外，這些化合物和抗體還可以被可調(diào)控的釋放方式[例如，用聚合物或外貼緩釋裝置(patch)]或另外的適當(dāng)?shù)姆绞絹斫o藥。給藥的劑量將要根據(jù)不同的因素，例如臨床癥狀，患者的體重以及是否伴有其它藥物(例如，血栓溶解劑)等一起使用而決定。在用抗血小板抗體的重復(fù)治療中，會發(fā)生藥物引起的血小板減少癥，其原因可能是身體將抗體所包被的血小板認(rèn)作是外來蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生更多的抗體來抵抗它們，并將它們以比正常情況更快的速度通過網(wǎng)狀內(nèi)皮的系統(tǒng)清除出去。由于GPIIb/IIIa受體在血小板的表面上的濃度很高(每個血小板上有約80,000受體)以及在循環(huán)系統(tǒng)中的血小板的數(shù)量很大(約0.25-0.5×106/μl)，因而使用抗血小板抗體的治療的一個顯著的并發(fā)癥是血小板減少癥。然而，使用嵌合抗血小板(抗GPIIb/IIIa)抗體可以避免這種問題。本發(fā)明的嵌合抗血小板抗體可以消除(減少或防止)在使用其它抗血小板抗體時產(chǎn)生的血小板減少癥。例如，在使用嵌合7E3Fab(參見實施例6和7)時只觀察到很少的血小板減少癥的癥狀的出現(xiàn)。另外，當(dāng)對人給予嵌合7E3Fab抗體片段時，顯示出了與其來源于鼠的等同物相比為另人吃驚的低的誘發(fā)性免疫反應(yīng)(參見實施例4和7)。當(dāng)與血小板結(jié)合時，抗血小板嵌合性抗體的來源于鼠的主要成分就與血小板表面相結(jié)合，例如通過GPIIb/IIIa受體，因此，就將使得它們無法與免疫系統(tǒng)相接觸，并使嵌合抗體在功能上與其相對應(yīng)的來源于人的抗相同表位的抗體無法區(qū)分。因此，本發(fā)明的其它嵌合抗血小板抗體盡管具有來源于鼠的抗原結(jié)合區(qū)，但是它們在非免疫性上是非常類似的。本發(fā)明的血小板特異性嵌合免疫球蛋白還可以用于血栓造影。要達到這一目的一般優(yōu)選使用抗體片段。如上所述，嵌合性重鏈基因可以被以剪切的形式設(shè)計出來，從而生產(chǎn)出嵌合性免疫球蛋白片段(例如Fab，F(xiàn)ab’和F(ab’)2)用于免疫閃爍圖造影(immunoscintigraphicimaging)。這些分子可以直接用或者通過螯合劑例如DTPA被放射性同位素例如131碘，125碘，99m锝或111銦等標(biāo)記，產(chǎn)生放射性免疫閃圖劑。另外可以在嵌合抗體位點中設(shè)置一個放射性金屬結(jié)合(螯合)區(qū)，從而對標(biāo)記物提供位點。這樣，嵌合免疫球蛋白可以被設(shè)計為一種具有非人體來源的血小板特異性可變區(qū)、人體來源的恒定區(qū)(優(yōu)選被剪切的)、以及一個由金屬結(jié)合蛋白質(zhì)例如金屬硫因產(chǎn)生的金屬結(jié)合區(qū)的蛋白質(zhì)。血小板特異性嵌合免疫球蛋白或其片段可以對那些被懷疑患有血栓的病人給藥。當(dāng)以足夠的時間允許被標(biāo)記的免疫球蛋白到達血栓位點區(qū)時，則由標(biāo)記產(chǎn)生的信號被光掃描設(shè)備例如γ照相機檢測到。然后將檢測到的信號轉(zhuǎn)換成血栓的圖像。這種圖像就可以幫助在體內(nèi)確定血栓的位置并設(shè)計出適合的治療方案。本發(fā)明將由以下的實施例得以進一步的說明，但并不受其限制。本發(fā)明的量佳實施例實施例1嵌合血小板特異性IgG4的制備A.總體方案由7E3雜交瘤對用于重鏈和輕鏈基因的可變區(qū)進行克隆化的總體方案是基于對功能性重新排列(和表達)Ig基因的可變區(qū)和相應(yīng)的結(jié)合區(qū)(J區(qū))的基因組之間的連接。J區(qū)DNA探針可以用于篩選基因庫以分離連接到J區(qū)的DNA，在種系表形(未被重新排列的)中的DNA還可以雜交到J探針中，但是并不連接到可變區(qū)序列上，可以通過對分離出來的克隆用限制酶分析對其進行確認(rèn)。因此，克隆化的方案是使用JH和JK從被重新排列的重鏈和輕鏈基因中分離出可變區(qū)。對這些克隆進行Northern分析(Northernanalysis)以確認(rèn)它們的序列是否在7E3雜交瘤中被表達。那些含有被表達了的序列的克隆被放置到含有人體來源的恒定區(qū)的表達載體中，并被轉(zhuǎn)染到小鼠骨髓瘤細胞中以確定是否有抗體的產(chǎn)生。然后對從細胞中產(chǎn)生的抗體與7E3鼠抗體比較以確定其結(jié)合特異性和功能性。有關(guān)的細胞系和鼠雜交瘤7E3被存放于ATCC(AmericanTypeCultureCollection，12301ParklawnDrive，Rockville，MD20852，USA)，存放日期是1985年5月30日，保存號是HB8832，并被確認(rèn)為是存活的。B.材料和方法除非另有說明，本文中所給出的份數(shù)和百分?jǐn)?shù)都是以重量為基準(zhǔn)的，溫度以℃度為準(zhǔn)。重鏈基因組庫的構(gòu)建為了從7E3雜交瘤中分離出重鏈的可變區(qū)基因，用噬菌體λ載體gt10建立了依照大小選擇的基因組庫。使用JH探針對被EcoRI消化的7E3DNA進行了Southern分析(Southernanalysis)，揭示了對應(yīng)于被重新排列的重鏈的位置的一個單一的3.5kb帶。這個片段非?？赡芎?E3重鏈可變區(qū)基因。從7E3雜交瘤細胞中分離出來的大分子DNA被用限制性內(nèi)切酶EcoRI完全消化。然后對該DNA在0.7％瓊脂凝膠上進行分級分離，并從凝膠中直接獲取尺寸范圍為3-4kb的DNA。在用苯酚/氯仿萃取后和交聯(lián)葡聚糖G-50凝膠過濾后，對3-4kb的片段用λgt10臂(PromegaBiotech，Inc.)配位，再用從PromegaBiotech獲取的Packagene在體外將其包裝在噬菌體顆粒內(nèi)。用32磷標(biāo)記的JH探針在濃度為大約每150mm培養(yǎng)皿中有30,000噬菌體的條件下對這個庫進行直接篩選。在5XSSC，50％甲酰胺，2XDenhardt試劑，200μg/ml變性的鮭魚精子DNA中以42℃的溫度對這些噬菌斑進行雜化18-20小時。最后，用0.5XSSC，0.1％SDS在65℃進行清洗。用放射自顯影照相鑒定了陽性的克隆。輕鏈基因組庫的構(gòu)建為了分離用于7E3輕鏈的可變區(qū)基因，在λ載體EMBL-3上構(gòu)建基因組庫。大分子量的DNA用限制內(nèi)切酶Sau3A進行部分消化，并在10-40％蔗糖濃度梯度上進行按大小尺寸的分組。具有18-23kb的DNA片段與EMBL-3臂相配位，然后再用Packagene將其在體外裝入到噬菌體顆粒中。用JK探針在濃度為大約每150mm培養(yǎng)皿中有30,000噬菌體的條件下對這個庫進行篩選。雜化和清洗的條件都與前述重鏈基因組庫的相同。DNA探針小鼠重鏈JH探針是含有J3和J4碎片的2kbBamHI/EcoRI的片段。小鼠輕鏈JK探針是含有所有5種JK碎片的2.7kbHindIII片段。32磷標(biāo)記的探針用從Amersham，Inc.獲取的制劑盒進行缺口轉(zhuǎn)譯來制備。用交連葡聚糖G-50柱進行離心把游離的核苷酸去除。該探針的特異活性大約是109cpm/μg。Northern分析總量為15μg的細胞RNA用1％瓊脂/甲醛凝膠(Maniatis，etal，MolecularCloning)進行電泳并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素上。在5XSSC，50％甲酰胺，2XDenhardt溶液和200μg/ml變性的鮭魚精子DNA中用42℃對漬點用缺口轉(zhuǎn)譯的DNA探針進行雜化。最后清洗的條件是0.5XSSC，0.1％SDS，65℃。采用電穿孔法的DNA轉(zhuǎn)染被轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA被在溴化乙錠/氯化銫梯度離心至平衡兩次來進行純化。將10-50μg的質(zhì)粒DNA加到放置在冰上的處于PBS中的8×106SP2/0細胞中，將該混合物放在Biorad電穿孔設(shè)備上。進行電穿孔的電壓是200伏特，然后將細胞放置到96孔微滴盤中。48小時后用藥品進行篩選，然后經(jīng)過1-2個星期將對藥物有抗性的克隆鑒定出來?？贵w生產(chǎn)的定量化按照顆粒濃度熒光免疫分析法(Jolley，M.E.etal.，(1984)J.Immunol.Meth.6721)用純化的IgG得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線分析組織培養(yǎng)上清液中的IgG蛋白含量。使用山羊抗人IgGFc抗體包被的聚苯乙烯珠粒和用結(jié)合有山羊抗人IgGFc抗體的熒光素對帶有人恒定區(qū)的嵌合7E3抗體的濃度進行確定。本分析用自動化的儀器(PandexLaboratories，Inc.)完成。血小板特異性嵌合IgG4抗體的純化用DiafloYM100超濾膜(Amicon)對組織培養(yǎng)上清液進行濃縮，然后裝載到蛋白質(zhì)A瓊脂糖柱上。用pH6.5-pH3.5的檸檬酸鈉的pH梯度將嵌合抗體從該蛋白質(zhì)A柱上洗脫下來。被純化的抗體用DiafloYM100超濾膜進行濃縮?？贵w的濃度根據(jù)其在280nm的吸收來確定。抑制結(jié)合的分析被純化的抗體(鼠7E3或嵌合7E3)與放射性碘化的7E3競爭與人血小板相結(jié)合。用檸檬酸化的人全血以1875rpm離心3.5分鐘來制備富含血小板的血漿(PRP)。將125碘標(biāo)記的7E3抗體(150,000cpm)加入到適當(dāng)稀釋濃度的純化的受試抗體中，然后加入150μlPRP中來啟動該反應(yīng)。在室溫下保育1-2小時，然后將其放入0.4mlmicrofuge管中的30％蔗糖內(nèi)以12,000g離心4分鐘將結(jié)合有抗體的血小板與游離的抗體分離開來。在管的尖部的含有血小板/抗體的小丸被取出并放在γ計數(shù)器上計數(shù)。碘化的7E3與嵌合7E3之間對血小板的競爭同碘化的7E3與未標(biāo)記的7E3IgG之間的競爭進行比較。對血小板凝聚的抑制將純化的7E3或嵌合的7E3抗體加入到檸檬酸化的人全血中，并在37℃保育10分鐘。血小板凝聚的速率是在用膠原或ADP活化后使用全血集合度計(ChronologCorp.)測量的。C.結(jié)果血小板特異性可變基因區(qū)的克隆化在用JH和JK探針分別對大約100萬個噬菌斑進行篩選之后，從其重鏈和輕鏈基因組庫中分離出來了幾個陽性克隆。在進行了至少3次純化之后，從每一個陽性的克隆中分離出來了細菌噬菌體DNA，用EcoRI(重鏈克隆)或HindIII(輕鏈克隆)進行消化，并用1％瓊脂糖凝膠進行分組。將該DNA轉(zhuǎn)移到硝基纖維素上，用JH(重鏈)或JK32磷標(biāo)記的DNA探針對漬點進行雜化。在重鏈中分離出兩個克隆，含有與JH探針雜化了的3.5kbEcoRIDNA片段。用JK探針鑒定出了兩類分別為3.0和6.0kb的HindIII片段。與來自于7E3雜交瘤的原始重鏈和輕鏈可變區(qū)相對應(yīng)的克隆化的DNA要與從雜交瘤中分離出來的mRNA雜化。在重鏈或輕鏈位置上的非功能性DNA重新排列將不被表達。圖1給出的是Northern分析，表明的是推斷的3.5kbEcoRI重鏈片段和推斷的6.0kbHindIII輕鏈片段各自與來自7E3雜交瘤的適當(dāng)大小的mRNA的雜化。這些亞克隆的片段被缺口轉(zhuǎn)譯進行32磷標(biāo)記，并且被雜化到含有來自于SP2/0(7E3雜交瘤的融合伴侶)或來自于7E3的全RNA的northern漬點，如圖1所示。3.5kbEcoRI重鏈片段與7E3RNA的2kbmRNA發(fā)生雜化，而不與SP2/0RNA的2kbmRNA發(fā)生雜化。相似地，6.0kb輕鏈HindIII片段與7E3RNA的但不與SP2/0RNA的1250bpmRNA相雜化，這些尺寸分別是重鏈和輕鏈mRNAs的正確尺寸。因為克隆化的DNA片段含有在7E3雜交瘤中表達的序列，這些數(shù)據(jù)就表明這些克隆含有來自于7E3雜交瘤的正確的可變區(qū)序列。然而，其功能性的最后測試是由這些序列與適當(dāng)?shù)暮愣▍^(qū)序列結(jié)合在一起時能夠指導(dǎo)合成具有與鼠7E3抗體相似的特異性和親和性的抗體而證實。載體和表達系統(tǒng)從7E3雜交瘤克隆化的推斷的輕鏈和重鏈V基因被結(jié)合到如前所述的(Sun，L.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84214-218(1987))在表達載體中的人κ和G4恒定區(qū)基因中。pSV184ΔHneo17-1AVκhCκ的17-1AVκHindIII片段被用與來自于7E3的推斷的輕鏈可變區(qū)基因相應(yīng)的6.0kbHindIII片段所取代。相似的pSV2ΔHgpt17-1AVH-hCG4的17-1AVHEcoRI片段被用與來自于7E3的推斷的重鏈V區(qū)基因相應(yīng)的3.5kbEcoRI片段所取代。所得到的質(zhì)粒，被命名為p7E3VκhCHκ和p7E3VHhCG4，如圖2所示。為了表達嵌合重鏈和輕鏈基因，將這兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到非生產(chǎn)型小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0中。輕鏈質(zhì)粒具有對G418的抗性，重鏈質(zhì)粒具有對霉酚酸的抗性，因此使得它們可以對含有從每一個質(zhì)粒來的表達基因的克隆進行篩選。具有對G418和霉酚酸抗性的克隆被擴展到穩(wěn)定的細胞系中并保持在有這兩種藥物的條件下。對從這些細胞系來的組織培養(yǎng)上清液測試抗體，使用的是顆粒濃度熒光免疫分析法，山羊抗人IgGFc抗體包被的聚苯乙烯珠粒和被熒光素標(biāo)記的同種抗體。在被檢測的最初10個細胞系中有一個產(chǎn)生大約2μg/ml抗體的細胞系(命名為c-7E3F6)被選來用于進一步研究。血小板結(jié)合活性的檢測在用蛋白質(zhì)A瓊脂糖柱對c-7E3F6進行提純后，對抗體進行濃縮并用血小板結(jié)合活性檢測法與鼠7E3IgG進行比較。圖3表示的是鼠7E3和c-7E3F6(推斷的嵌合抗體)同放射性標(biāo)記的7E3競爭與血小板同等程度的結(jié)合。結(jié)合曲線表明鼠7E3和嵌合7E3在這一標(biāo)準(zhǔn)下的結(jié)合特性是相等的。c-7E3F6對血小板凝聚的抑制純化的c-7E3F6與鼠7E3用測量受試抗體對人血小板凝聚的抑制力的功能性檢測來進行比較。其檢測的結(jié)果列于表4中，表明這兩種抗體在同樣濃度下對膠原引起的血小板凝聚的抑制程度是相等的。c-7E3F6還對ADP引起的血小板凝聚具有相似的抑制能力。血小板結(jié)合檢測以及抑制血小板凝聚的檢測表明(1)正確的可變區(qū)基因確實被從7E3雜交瘤克隆出來；(2)用人恒定區(qū)取代鼠恒定區(qū)并沒有對7E3可變區(qū)的結(jié)合和功能特性造成任何影響，正如這些檢測所示。纖維蛋白原包被的珠粒檢測嵌合c-7E3F6抗體在定量性、功能性的檢測中，即測定抗體抑制血小板同纖維蛋白原包被的珠粒的凝集的檢測中被發(fā)現(xiàn)是陽性的。Coller，B.etal.(1983)J.Clin.Invest.73325-338。實施例2嵌合IgG1和IgG3的生產(chǎn)對于從鼠7E3抗體來的重鏈的可變區(qū)進行編碼的DNA碎片通過以相應(yīng)的7E3可變區(qū)片段取代17-1A重鏈或輕鏈可變區(qū)片段而連接到在表達載體pSV2ΔHgpt17-1AVH-hCG1和pSV2ΔHgpt17-1AVH-hCH3(Sunetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84214-218(1987))上存在的人γ1和γ3恒定區(qū)。所得到的嵌合重鏈基因與嵌合輕鏈基因被共轉(zhuǎn)染到SP2/0細胞中，以獲得分泌γ1，K和γ3，K抗體的穩(wěn)定細胞系。實施例3對嵌合7E3Fab在人體應(yīng)用上的初步研究制備嵌合7E3Fab片段嵌合7E3(c7E3)Fab片段的生產(chǎn)是用蛋白水解酶如木瓜蛋白酶對純化的嵌合7E3IgG(γ1重鏈，κ輕鏈)進行酶消化來完成的。用一系列設(shè)計的純化步驟，即生產(chǎn)不含其它的消化的片段和污染成分(例如，蛋白質(zhì)，核酸，病毒)的純化步驟來分離Fab片段。最后的產(chǎn)品是一種無菌的非熱原溶液，含有2mg單克隆嵌合7E3Fab/ml0.15M氯化鈉，0.01M磷酸鈉，pH7.2。在某些制劑中，包含有最終濃度為0.001％(W/V)的多乙氧基醚80。使用前用0.22微米低蛋白結(jié)合過濾器進行過濾。產(chǎn)品儲存于2-8℃。藥物動力學(xué)c7E3Fab在人體血漿中的消失人體血漿中的消失是在三個患有穩(wěn)定的冠心病的患者中進行的。用5分鐘靜脈滲透給藥0.25-mg/kg的c7E3Fab，在給藥后的2分鐘起至72小時收取血樣?？深A(yù)見的是有一部分的抗體以非結(jié)合態(tài)存在于血漿中。為了對這些非結(jié)合的抗體成分進行定量，要盡快地將血漿與血小板分離開來以防止在體外的進一步結(jié)合。用固相酶免疫分析法(EIA)檢測血漿中游離的c7E3Fab濃度。在該檢測中，從兔抗血清中提純的抗鼠7E3IgG親和性分離物被用于固相捕捉，同時還使用了在同樣的兔抗體7E3抗體制劑的生物素化的衍生物的基礎(chǔ)上建立的檢測體系。其結(jié)果列于表1。表1在用0.25mg/kg劑量處理過的患者的血漿中的c7E3Fab濃度c7E3Fab(μg/mL)時間*患者A患者B患者C給藥前NDNDND2分鐘NA2.5542.3125分鐘1.1491.8731.41110分鐘0.7141.3311.11115分鐘0.6100.9160.85220分鐘0.4990.9850.75630分鐘0.4640.8150.51545分鐘0.3400.7040.4051小時0.3090.4370.1952小時0.2880.2620.1496小時0.2040.0950.10512小時0.1120.0720.06424小時0.0650.0580.04648小時0.0551.470.17572小時0.196ND0.076*給藥與抽血的時間間隔。注意，在血被抽出來以后血小板還與血漿有額外的2分鐘接觸時間(即用離心方法對血漿的分離時間)。ND＝未檢測出/低于檢測的最低檢測水平(0.025μg/mL)。NA＝未獲得。如果將整個注射的7E3作為血漿中的游離抗體進行檢測，則抗體濃度的理論最大值就為大約6.25μg/mL(0.25mg/kg除以40mL漿/kg)。然而，這一理論最大濃度是永遠無法獲得的，因為在注射的抗體中有很大一部分與血小板相結(jié)合了。事實上，在最早的那一次測定(2分鐘)時，血漿中平均c7E3Fab濃度(n＝2)是2.43μg/mL，這一數(shù)值是實測的最大血漿濃度(Cmax)。在注射后的按時間順序抽取的血樣中的測定值顯示了血漿中c7E3Fab濃度的迅速下降。在1小時和24小時的測定值顯示了在血漿(n＝3)中殘存的被注射的抗體的濃度分別小于0.5μg/mL和0.1μg/mL。在圖5中是血漿抗體濃度(ng/mL)對時間的點陣圖，以圖表的形式顯示了在得自所有3個患者的血漿中c7E3Fab的迅速消失。對c7E3Fab片段的藥物動力學(xué)特性進行了初步的分析。對獲得的血漿濃度的數(shù)據(jù)使用了幾種不同的模型，包括幾種混合的(隨機和固定效果)線性模型以及標(biāo)準(zhǔn)的兩室模型和不分室模型。血漿游離抗體的數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)的藥物動力學(xué)模型并不符合。由于對c7E3Fab的作用點是在血小板的受體上，游離抗體的血漿濃度與其作用點處的濃度不發(fā)生任何直接的聯(lián)系這一結(jié)果并不是無法預(yù)見的。c7E3Fab在血漿中的迅速消失，部分上反應(yīng)了抗體與血小板的GPIIb/IIIa受體的迅速結(jié)合。在所檢測的模型中隨機效果線性模型與血漿濃度的數(shù)據(jù)最相吻合。使用這一模型獲得了藥物動力學(xué)參數(shù)Clp，Vd和t1/2的初步值，并列于表2。表2c7E3Fab*的藥物動力學(xué)數(shù)值參數(shù)數(shù)值Clp(份數(shù)/小時)15.6Vd(L)6.8t1/2(小時)0.1(6分鐘)*使用了隨機效果線性模型對數(shù)據(jù)進行處理。Clp＝在血漿中的消失被定義為血漿濃度的下降除以該濃度的比率并被計算為每小時的速率，即如果在某一時刻的速率延續(xù)一小時，則計算的速率就將是在那一小時內(nèi)去除的藥物的份數(shù)。Vd＝體積分布被定義為所給藥的劑量除以測定的血漿濃度與血漿體積的乘積。計算中對體重為70公斤的人選用3升血漿體積。t1/2＝半消除期。人體尿樣的檢測3名穩(wěn)定的冠心病患者以靜脈注射0.25-mg/kgc7E3Fab后，收集他們的尿樣(這三名患者的血漿消失數(shù)據(jù)如上所述)。按以下的注射后的時間收取他們的尿樣0-2小時，2-6小時，6-12小時，12-24小時。此外，還收集了給藥前的尿樣。用對如上所述EIA進行了稍微修飾的方法在所收取的尿樣的選樣中測定游離的7E3Fab。在所有的案例中，都沒有在尿樣中檢測到c7E3Fab。基礎(chǔ)毒理學(xué)基礎(chǔ)毒理學(xué)的研究是用嵌合7E3Fab在18只猴子(Cyonomolgus屬和獼猴屬)中進行的。濃縮藥丸劑量上至0.6mg/kg，然后滲透上至0.8μg/kg/分，共96小時(包括對肝素，阿斯匹林和重組的組織血纖維蛋白溶酶原激活子的研究)。在所有的猴子中、所有的劑量內(nèi)以及所有的組合情況下，7E3都是安全的，并且完全都是可以忍受的，沒有任何顯著的失血并發(fā)癥或其它的有害反應(yīng)。在穩(wěn)定的心絞痛患者中的嵌合7E3Fab的劑量階梯劑量梯度的研究是在52名停止接受抗血小板治療10天以上的穩(wěn)定的心絞痛患者(男，43～75歲)中進行的。使用了不同的劑量。這些患者要么接受了一次性靜脈注射0.15～0.30mg/kg嵌合7E3Fab(20名患者)，要么是接受一次性濃縮藥丸，然后以12～96小時進行靜脈滲透(10μg/分)(32名患者)。在使用了濃縮丸劑c7E3Fab(0.15-0.30mg/kg)兩小時后，確定血小板GPIIb/IIIa受體的封閉，對20μMADP(拮抗劑)反應(yīng)的血小板凝聚，以及失血時間。受體封閉和作為對拮抗劑反應(yīng)的血小板凝聚是按照以上所述確定的(GoldH.K.etal.，J.Clin.Invest.86651-659(1990))。失血時間是用Simplate方法進行確定的。正如受體封閉的百分?jǐn)?shù)(由可利用的受體結(jié)合位點來確定)所指出的，隨著所用劑量的提高，對受體的封閉也逐步提高。在受體封閉增高的同時，相伴隨的還有對血小板凝聚抑制(以給藥前的數(shù)值或基線為準(zhǔn)的百分?jǐn)?shù))的升高，以及失血時間的增長。在所有三個參數(shù)中的峰值都是在0.25mg/kg觀察到的。這一劑量相應(yīng)的血漿濃度為5μg/ml，即在集合度計的小杯中有升高了濃度的嵌合7E3Fab存在時對正常人體的富含血小板的血漿保育15分鐘后觀察到抑制峰值的濃度。(從正常人體來的血漿的凝聚程度是用穿過小杯的光量的百分?jǐn)?shù)來決定的。在加入拮抗劑之前，血漿相對來說是不透明的，將此時的透光量的百分?jǐn)?shù)定為0點。當(dāng)把拮抗劑ADP加入到不含抗體的對照樣品中時，隨著凝聚的發(fā)生，透光量就逐漸提高。然而，當(dāng)有c7E3Fab存在時就觀察到了由劑量引起的對凝聚的封閉，并且完全抑制由5μg/mlc7E3Fab產(chǎn)生。)對受體的封閉，失血時間以及血小板凝聚的抑制的期間進行了確定。在兩小時處觀察到了受體封閉，血小板凝聚以及失血時間的峰值，并且是隨著時間而逐漸回復(fù)的。在6～12小時內(nèi)失血時間回到接近正常值處。由于受體封閉和功能性抑制的峰值是以0.25mg/kg獲得的，所以對該劑量的藥物進行連續(xù)滲透所造成的血小板抑制的期間進行了檢測以確定血小板抑制的期間是否可以被延長。在5名接受了0.25mg/kg給藥并以10μg/分連續(xù)72小時滲透嵌合7E3Fab的患者中，受體封閉、血小板凝聚的抑制以及失血時間的延長的程度都在整個連續(xù)滲透的期間內(nèi)保持不變，一旦連續(xù)滲透被中斷，就開始發(fā)生回復(fù)現(xiàn)象。在12，24，48和96小時的滲透中也發(fā)生了同樣的結(jié)果。沒有任何一個患者發(fā)生了過敏反應(yīng)。沒有與這種處理相關(guān)的在血液學(xué)和化學(xué)實驗數(shù)值上的顯著變化。也沒有任何嚴(yán)重失血現(xiàn)象發(fā)生。非顯著的失血現(xiàn)象是很少見的，僅在那些患有牙周病的患者中出現(xiàn)了輕微的牙齦滲血以及輕微的鼻出血。這一實驗的結(jié)果表明，嵌合7E3Fab可以按劑量對患者給藥，產(chǎn)生對血小板的抑制長達幾天的效果。免疫原性結(jié)果在鼠7E3F(ab’)2和Fab的實驗中(150名患者)，用敏感性酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)對免疫反應(yīng)進行了檢測，發(fā)現(xiàn)16％的患者(24/150)發(fā)生免疫反應(yīng)。所有的反應(yīng)都是低效價的，典型的范圍是1∶50到1∶200。在受試組內(nèi)包括用0.01-0.25mg/kg鼠7E3F(ab’)2處理過的正常的自愿者，用0.05-0.20mg/kg鼠7E3F(ab’)2處理過的非頑固性心絞痛患者，用0.1mg/kg鼠7E3F(ab’)2或0.15-0.35mg/kg鼠Fab處理過的PTCA患者，以及分別用一次性靜脈注射0.01-0.30mg/kg鼠7E3Fab處理過的、一次性給藥0.25或0.30mg/kg然后連續(xù)滲透12～36小時(0.15μg/kg/分或10μg/分)鼠Fab或按6小時間隔兩次注射鼠Fab(一次給藥0.2mg/kg-0.30mg/kg，隨后以0.05mg/kg第二次給藥)的頑固型心絞痛患者。用人-鼠嵌合7E3Fab可以明顯地降低免疫原性。在52名患有頑固型心絞痛并用嵌合7E3Fab處理過(如上所述)的劑量梯度研究中的患者身上沒有顯示出免疫反應(yīng)，其確定方法是與對嵌合Fab相似的檢測法。抗血小板活性的逆轉(zhuǎn)性嵌合7E3Fab(γ1，κ)從血小板上脫落的速率比較慢，血漿中游離的嵌合7E3Fab從循環(huán)系統(tǒng)中可以迅速地消失(如上所述)。因此，嵌合7E3的抗血小板效果可以由使用隨機供者的血小板來逆轉(zhuǎn)。這種由轉(zhuǎn)輸血小板而引起的逆轉(zhuǎn)或解毒效應(yīng)在2名接受了鼠Fab或嵌合Fab并在接近對血小板凝聚達到完全抑制的時候又接受了隨機供體血小板的患者中得到證實。對血小板功能的恢復(fù)是由測量失血時間來測定的。這一性質(zhì)對于因為失血而需要進行對血小板功能恢復(fù)的患者是非常有用的。實施例4用嵌合7E3抗體在選擇性冠心血管成形術(shù)中防止血栓并發(fā)癥經(jīng)皮經(jīng)腔冠心血管成形術(shù)(PTCA)，例如使用氣囊泵或冠狀動脈癍塊切除(atherectomy)的PTCA是一種有效的使狹窄的冠心動脈腔擴張的方法。在這一過程中，在進行血管成形術(shù)之中和之后都伴隨著固有的急性冠心血管閉塞的危險。報導(dǎo)的冠心閉塞的發(fā)生率在選擇性血管成形術(shù)的案例中為大約3％～6％(Detre，K.M.etal.，Circulation82739-750(1991))，并且是在醫(yī)院中發(fā)病和死亡的主要因素。在危險性高的患者中由血栓引起的重大心肌病癥發(fā)生率是10-20％。在冠心血管成形術(shù)之中或緊隨其后而發(fā)生的急性冠心閉塞的原因看起來是由于對動脈血管壁的深度損傷以及由此而產(chǎn)生的伴有或不伴有血栓的部分閉塞性“內(nèi)膜瓣(intimalflaps)”、或在血管壁損傷的部位的血栓而共同造成的。在動物中，在進行了成功的血栓溶解之后而發(fā)生的再次閉塞都有在以前發(fā)生過周期性的冠心血管流量的降低和恢復(fù)，即稱作“周期流量變化”(CFVs)的病史。這些CFVs幾乎完全是一種血小板調(diào)控的現(xiàn)象，其原因是血小板凝聚物在冠心狹窄處和內(nèi)皮損傷處的重復(fù)性聚集和脫落。在人體中也發(fā)現(xiàn)了在冠心血管成形術(shù)后出現(xiàn)的周期流量變化。在血管成形術(shù)中可以用嵌合7E3抗體抑制血小板的功能并進而防止血小板的凝聚和血栓。嵌合7E3抗體在那些有高度發(fā)生血栓危險的病人中是特別有用的。這些患者可以根據(jù)解剖學(xué)(例如血管造影術(shù)對狹窄位點的損傷的特性的確定)或臨床的那些預(yù)示著急性冠心血栓和那些產(chǎn)生急性心肌梗塞、非頑固性心絞痛或突發(fā)性堵塞綜合癥的危險征兆(例如心肌梗塞，非頑固性心絞痛，糖尿病，65歲以上的婦女)來確診。在選擇性PTCA中的嵌合抗血小板抗體本試驗是分兩階段進行的。第一階段的主要目的是確定在進行了選擇性經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動脈成形術(shù)(PTCA)的患者中嵌合7E3Fab的最佳一次劑量和其安全性。進行第二階段試驗是為了評價將嵌合7E3(c7E3)作為濃縮丸劑進行滲透并緊接著進行不同連續(xù)期間的滲透的安全性及前期效率。第二階段研究中的患者是接受了選擇性冠狀動脈成形術(shù)并且有高度局部心肌缺血并發(fā)癥危險的患者。高度危險的患者包括那些帶有B型或C型損傷特性的非頑固性心絞痛和頑固型冠心病的患者。表3給出了確定高度危險患者的標(biāo)準(zhǔn)，表4給出了血管造影學(xué)的損傷特征的定義。前期效率是由對血小板的抑制以及防止血栓并發(fā)癥的功能而測定的。在本實驗的兩個階段之中，可選用的對象是18-76歲的男性以及18-76歲的不具懷孕潛力的女性。表3具有高度局部缺血并發(fā)癥危險的患者的選擇標(biāo)準(zhǔn)中等程度的高度危險1)不具有所定義的損傷特異特征的非頑固性心絞痛。2)具有單一B損傷特異特征的狹窄。最高危險1)帶有≥2個B型損傷特異性特征的狹窄。2)帶有至少一個B型損傷特異特征的狹窄的非頑固性心絞痛。3)帶有至少一個B型損傷特異特征的狹窄的糖尿病。4)帶有至少一個B型損傷特異特征的狹窄的≥65歲的女性。5)帶有至少一個C型損傷特異特征的狹窄。表4損傷特異特征A型損傷(高成功率，＞85％；低危險)-稀疏的(＜10mm長度)-沒有或幾乎沒有被鈣化-同心的-并非完全閉塞的-可接觸的-不在口部的-非尖角的碎片，＜45°-不涉及主要支管-平滑輪廓的-沒有血栓B型損傷(中等成功率，60-85％；中等危險)-管狀(10-20mm長度)-中度-重度鈣化-偏心的-完全閉塞＜3個月-近端中等彎曲的碎片-位于口部-中等角度的碎片，＞45°，＜90°-分叉的損傷，需要兩條導(dǎo)線-非規(guī)則輪廓-有一些血栓存在C型損傷(低成功率，＜60％；高危險)-彌散-完全閉塞，＞3個月-近端極度彎曲的碎片-不能保護主要側(cè)枝-極度尖角的碎片，＞90°-帶有脆性損傷的變性的靜脈移植物第一階段在第一階段，將患者分組接受一次劑量靜脈注射嵌合7E3(γ1，κ)Fab片段(按實施例3的描述制備的和配方的)。對一共15名患者(3女12男)進行了治療，病人的平均年齡是62歲(46-76歲)。在表5A和表5B中對所有一次劑量的患者和在單個劑量組內(nèi)的患者給出了人口學(xué)的輪廓。在劑量梯度方案中，有5名患者(n＝5)在進行選擇性PTCA之前約30分鐘時接受了單一劑量的0.15mg/kg，0.20mg/kg，0.25mg/kg的c7E3Fab。在此程序中，所有的患者都接受了阿斯匹林(標(biāo)準(zhǔn)劑量)并用肝素(標(biāo)準(zhǔn)劑量)進行了充分的抗凝集治療。雖然，PTCA程序?qū)Φ谝浑A段的病人被劃分為選擇性的，15個患者中的6個患有非頑固性靜止心絞痛(unstablerestangina)。進行冠心擴張的部位總結(jié)于表6(底部)。15名第一階段患者中的7名接受了在單一血管中一個損傷的PTCA，6名接受了在單一血管中多個損傷的PTCA，2名接受了在多條血管中的PTCA(表6)。為了獲得最佳單一劑量c7E3的效率標(biāo)準(zhǔn)被預(yù)測定義為在進行滲透2小時后達到下列平均值的最低劑量(1)將失血時間延長了至少20分鐘；(2)對GPIIb/IIIa受體進行了封閉使得基線位點受體的80％以上被封閉；和(3)作為對20μMADP的反應(yīng)，對血小板凝聚的抑制≤基線的20％。5A嵌合7E3抗血小板抗體按年齡、體重、身高、性別和種族對病人的分類連續(xù)對照單一劑量全部患者32915年齡平均值57.454.260.1中間值57.056.062.0最小值383746最大值767476標(biāo)準(zhǔn)偏差9.710.59.7體重(kg)平均值82.888.285.5中間值84.884.284.0最小值42.367.370.5最大值113.0122.7107.0標(biāo)準(zhǔn)偏差16.619.011.1身高(cm)平均值171.2176.7173.6中間值172.8177.8175.2最小值152.4157.5160.0最大值185.0185.4188.0標(biāo)準(zhǔn)偏差7.98.87.8性別女性813男性24812種族001白人26811黑人512亞洲人001西班牙裔100表5B嵌合7E3抗血小板抗體基于年齡、體重、身高、性別和種族的患者分級0.25mg/kg0.25mg/kg0.25mg/kg7E3*7E3*7E3*0.15mg/kg0.20mg/kg0.25mg/kg10mcg/分鐘10mcg/mg10mcg/分鐘7E37E37E36小時12小時24小時安慰劑全體患者5551111109年齡平均值60.657.262.659.155.058.154.2中間值63.056.065.060.053.058.558.0最小值47465140423837最大值73687676737574標(biāo)準(zhǔn)偏差10.58.311.310.58.910.310.5體重(kg)平均值83.880.592.285.883.878.388.2中間值76.378.096.089.085.079.984.2最小值74.570.582.060.442.362.367.3最大值107.095.099.1113.0111.895.0122.7標(biāo)準(zhǔn)偏差13.89.57.717.819.610.719.0身高(cm)平均值170.8171.9178.1169.3170.9173.7176.7中間值173.0175.2177.8167.6172.7175.2177.8最小值160.0160.8169.0157.5152.4165.1157.5最大值177.8182.9188.0177.8185.0180.3185.4標(biāo)準(zhǔn)偏差7.08.87.06.410.85.48.8性別女性3003411男性2558798種族0010000白人3448998黑人2003201亞洲人0100000西班牙裔0000010表6血管造影特性被治療的損傷的數(shù)目對照c7E3Fabc7E3Fab第一階段第二階段單一血管/單一損傷8721單一血管/多重損傷067多重血管/單一損傷121多重血管/多重損傷002未知001被治療的損傷的位置RCA3913LCX4314LAD3917*在患有多重血管疾病的患者中，計數(shù)每一條血管。RCA＝右冠狀動脈LCX＝左回旋冠狀動脈LAD＝左前下冠狀動脈第二階段在第二階段中，患者被給予0.25mg/kg濃縮丸劑，然后連續(xù)滲透10μg/分c7E3Fab6、12或24小時。受試組中的32名患者(8女，24男)參加了第二階段的研究。接受c7E3Fab處理的患者的平均年齡是57歲(范圍是38～76歲)有9名患者(1女，8男)作為對照參加了本試驗。對照組患者的平均年齡是56歲(范圍是37～74歲)。對照患者是如上所述的高危險患者，不接受c7E3的治療，但是按照接受c7E3的患者一樣被監(jiān)測。在表5A和表5B中列出了所有第二階段的患者以及各接受單一劑量處理組的患者的人口學(xué)輪廓。在進行PTCA的氣囊擴張之前30分鐘用c7E3Fab給藥。阿斯匹林和肝素是按照臨床標(biāo)準(zhǔn)給藥，并參考在進行了血管成形術(shù)后肝素的用量應(yīng)該是每小時800單位。各有11名患者分別進入到6小時和12小時的組內(nèi)，有10名患者進入24小時的組內(nèi)。在32名接受了c7E3Fab治療的患者中，有21名患者經(jīng)歷了在單一血管內(nèi)有一個損傷的PTCA，7名患者接受了在單一血管中多重損傷的PTCA，有3名患者接受了多重血管的PTCA(表6)。有一名患者的PTCA的種類并沒有具體確定。在第二階段受試患者中的冠心擴張位置總結(jié)于表6。在9名對照患者中，8名接受了單一血管內(nèi)一個損傷的PTCA，一名接受了多種血管的PTCA。這32名接受了c7E3Fab治療的患者和9名對照患者都具有那些能夠使他們被劃分為對PTCA有高度局部缺血心肌并發(fā)癥危險的臨床和血管造影特征。有2名接受c7E3Fab治療的患者和一名對照患者具有未確定的危險因素。剩下的30名接受c7E3Fab治療的患者和8名對照患者都具有至少一種使他們被劃分為有高度局部缺血并發(fā)癥危險的臨床或血管造影特征，而且其中的大多數(shù)都具有一種以上的危險特征。表7中總結(jié)的是用于對照和c7E3處理組的危險因素，而對各劑量組內(nèi)的每一患者的危險因素則列于表8A-表8D。表7高危險特性第二階段危險因素對照c7E3治療(n＝9)(n＝32)一種B型特性514兩種或兩種以上B型特性1273一種C型特性02無被鑒定的損傷特性的非頑固性絞痛114非頑固性絞痛＋B型特性085非頑固性絞痛＋≥2個B型特性176非頑固性絞痛＋C型特性01未指定的危險特性121編號為04-006的患有糖尿病的患者。2編號為04-007的患有糖尿病的患者。3編號為03-001與02-007的患有糖尿病的患者。4患者04-004除糖尿病外，還帶有以下額外的危險因素女性，年齡＞65。5編號為03-003與05-001的患有糖尿病的患者。6患者01-018除糖尿病外，還帶有以下額外的危險因素女性，年齡＞65；編號為03-002的患有糖尿病的患者。表8A素因性高危險特性對照患者患者編號危險類型(S)1部位201-0231.非頑固性絞痛LAD01-0241.一個B型特性3LAD04-0061.糖尿病LCX2.一個B型特性(偏心的)04-0071.糖尿病RCA2.兩個B型特性(偏心的，角度緩和的碎片；＞45°，＜90°)04-0081.一個B型特性(偏心的)LCX04-0091.一個B型特性(偏心的)LCX01-0211.一個B型特性3RCA01-0221.非頑固性絞痛OM2.兩個B型特性(管狀；不正規(guī)輪廓)03-0051.未確定的危險特性RCA1列于表3和表4的潛在特性2RCA＝右冠狀動脈LCX＝左回旋冠狀動脈LAD＝左前下冠狀動脈OM＝LCX的鈍的邊緣的分支3未確定的特性表8B素因性高危險特性6小時持續(xù)滲透患者編號危險類型(S)1部位204-0011.非頑固性絞痛RCA2.一個B型特性(偏心的)06-0011.非頑固性絞痛LCX2.一個B型特性(血栓)06-0021.一個B型特性LAD(管狀[10至20mm損傷])01-0141.非頑固性絞痛LAD2.一個C型特性(彌散＞2cm長度)01-0131.非頑固性絞痛RCA2.兩個B型特性(偏心的，一些血栓)01-0151.二個或更多個B型特性3LAD，LADD01-0171.一個B型特性(偏心的)LCX02-0051.非頑固性絞痛LAD2.三個B型特性(管狀，(10至20mm長度)；不正規(guī)輪廓；口部)1列于表3和表4的潛在特性2RCA＝右冠狀動脈LCX＝左回旋冠狀動脈LAD＝左前下冠狀動脈LADD＝LAD的對角線分支3未確定的特性表8B(續(xù))素因性高危險特性6小時持續(xù)滲透(續(xù))患者編號危險類型(S)1部位203-0011.糖尿病LAD2.四個B型特性(偏心的，角度緩，45°，＜90°；不正規(guī)輪廓；中度至重度鈣化)01-0121.一個C型特性(彌散2cm長度)LAD01-0161.一個B型特性(一些血栓)RCAOMn1列于表3和表4的潛在特性2RCA＝右冠狀動脈LCX＝左回旋冠狀動脈LAD＝左前下冠狀動脈OMn＝LCX的鈍的邊緣的分支表8C素因性高危險特性12小時持續(xù)滲透患者編號危險類型(S)1部位201-0181.非頑固性絞痛OMn2.65歲以上女性2.兩個或兩個以上B型特性01-0191.非頑固性絞痛回旋2.兩個或兩個以上B型特性02-0061.非頑固性絞痛RCA2.一個B型特性(完全閉塞＜3個月)02-0071.糖尿病LCX2.五個B型特性(偏心的，近端片段的中度彎OM1，LADD曲；角度緩和的片段，＞45°，＜90°；需要雙重導(dǎo)線的分叉損傷；完全閉塞＜3個月)03-0021.非頑固性絞痛LAD2.糖尿病2.兩個B型特性(中度彎曲片段，不正規(guī)輪廓)03-0031.非頑固性絞痛RCA2.糖尿病2.一個B型特性(不正規(guī)輪廓)1列于表3和表4的潛在特性2RCA＝右冠狀動脈LCX＝左回旋冠狀動脈LAD＝左前下冠狀動脈OMn＝LCX的鈍的邊緣的分支表8C(續(xù))素因性高危險特性12小時持續(xù)滲透(續(xù))患者編號危險類型(S)1部位205-0011.非頑固性絞痛LADD2.糖尿病RCA3.一個B型特性3(偏心性)05-0021.一個B型特性(管狀)RCA2.一個C型特性LADD(完全閉塞＞3個月)05-0031.兩個B型特性LAD(角度緩和的片段，＞45°，＜90°；一些血栓)06-0031.非頑固性絞痛RCA2.一個B型特性(一些血栓)04-0021.非頑固性絞痛LCX2.一個B型特性(10至20mm管狀的)1列于表3和表4的潛在特性2RCA＝右冠狀動脈LCX＝左回旋冠狀動脈LAD＝左前下冠狀動脈LADD＝LAD的對角線分支OMn＝LCX的鈍的邊緣的分支3未確定的特性表8D素因性高危險特性24小時持續(xù)滲透患者編號危險類型(S)1部位201-0201.兩個B型特性(不正規(guī)輪廓，一些血栓)RCA02-0081.非頑固性絞痛2.B型特性a)4個特性(管狀；偏心的；近端片段中LCX度彎曲；不正規(guī)輪廓)b)3個特性(偏心的；角度緩和的片段LCX＞45°，＜90°)05-0051.非頑固性絞痛RCA2.一個B型特性305-0061.非頑固性絞痛RCA2.一個C型特性(彌散(＞2cm長度))04-0031.兩個B型特性LAD(偏心性；帶有雙重導(dǎo)線的分叉)04-0041.非頑固性絞痛LAD2.糖尿病3.65歲以上女性1列于表3和表4的潛在特性2RCA＝右冠狀動脈LCX＝左回旋冠狀動脈LAD＝左前下冠狀動脈LADD＝LAD的對角線分支Omn＝LCX的鈍的邊緣的分支3未確定的特性表8D(續(xù))素因性高危險特性24小時持續(xù)滲透患者編號危險類型(S)1部位204-0051.兩個B型特性(偏心性，一些血栓)RCA02-0091.非頑固性絞痛2.B型特性a)3個特性(不正規(guī)輪廓，一些血栓；需要雙重LAD導(dǎo)線的分叉損傷)b)1個特性(需要雙重導(dǎo)線的分叉損傷)LADc)2個特性(偏心性；需要雙重導(dǎo)線的分叉損傷)DB05-0041.一個B型特性O(shè)M1(需要雙重導(dǎo)線的分叉)OM21列于表3和表4的潛在特性2RCA＝右冠狀動脈LCX＝左回旋冠狀動脈LAD＝前下冠狀動脈DB＝Omn＝LCX的鈍的邊緣的分支3未確定的特性對血小板功能的抑制(第一階段的結(jié)果)為了鑒定嵌合7E3Fab對血小板功能的抑制活性，對GPIIb/IIIa受體結(jié)合位點的存在程度(記錄為被封閉的GPIIb/IIIa的平均百分?jǐn)?shù))，對由拮抗劑20μMADP引起的血小板凝聚的抑制的平均值，以及平均失血時間進行了一系列的檢測。對由拮抗劑引起的受體的封閉和血小板的凝聚的測定基本上按照如上所述進行(Gold，H.K.etal.，J.Clin.Invest.，86651-659(1990))。對于受體封閉的測定，在0時測定了受體的存在程度并將在此時所存在的受體數(shù)定義為被封閉受體為0％(基線)。其它時間點的數(shù)值都是相對于該基線或給藥前的測量的受體存在數(shù)值。失血時間是用Simplate方法進行的。圖6總結(jié)的是在按單一濃縮藥丸嵌合7E3Fab給藥之后2小時的劑量反應(yīng)，以受體封閉(圖6A)，血小板凝聚(圖6B)和失血時間(圖6C)來表示。在圖6中的實線表示的是在每一劑量組中的5名患者的平均值。隨著c7E3Fab劑量的提高，受體封閉也有逐步的提高，正如被封閉的受體的百分?jǐn)?shù)所顯示的那樣(圖6A)。在兩小時處的受體封閉的平均數(shù)值對0.15mg/kg為53.8％，對0.20mg/kg為80.2％，對0.25mg/kg為86.6％。受體封閉的增加伴隨著有對血小板凝聚抑制的增加，以對給藥前的數(shù)值的百分?jǐn)?shù)表示(圖6B)。在2小時處的平均血小板凝聚數(shù)值對0.15mg/kg，0.20mg/kg和0.25mg/kg各組分別為基線值的46.1％，44.6％和17.9％。同樣，在進行了滲透后的2小時處也表現(xiàn)出與劑量有關(guān)的失血時間的延長(失血時間的測量僅取了30分鐘，圖6C)。失血時間對于0.15mg/kg，0.20mg/kg和0.25mg/kg各劑量分別為26.0分鐘，27.5分鐘和30分鐘。在所使用的條件下，以及根據(jù)這些檢測所得到的結(jié)果，對于抗血小板活性的最佳劑量被確定為0.25mg/kg。圖7表示的是單次濃縮藥丸劑量0.25mg/kg給藥后的作用時間，在該劑量觀測到最大的血小板效果。圖中的線表示的是從0時(基線)到24小時的平均數(shù)值，如圖在X軸上所示，上圖表示的是對受體的封閉(圖7A)，中圖表示的是對血小板凝聚(圖7B)的結(jié)果，下圖表示的是失血時間(圖7C)。在兩小時處見到了受體封閉，血小板凝聚和失血時間的效果峰值，并隨時間逐步回復(fù)。失血時間在12小時處回復(fù)到接近正常值。沒有任何一個患者發(fā)生血小板減少癥。對血小板功能的抑制(第二階段的結(jié)果)在第二階段中，GPIIb/IIIa受體和血小板凝聚的數(shù)據(jù)并沒有從所有患者中取得，在接受了24小時滲透的患者中，只從2名患者身上獲取了這些數(shù)據(jù)。因此，只總結(jié)了6小時和12小時的數(shù)據(jù)。在6小時和12小時滲透的組內(nèi)，受體封閉的平均值在整個滲透期間都保持在大于基線的80％的水平上。在2小時處，6小時和12小時滲透組內(nèi)的20μMADP引起的血小板凝聚的平均值分別為基線的13％和15％，并且，12小時組內(nèi)則在整個滲透期間內(nèi)都低于25％。對所有3個滲透期間的2小時平均失血時間都大于30分鐘。圖8給出的結(jié)果是在接受了0.25mg/kg劑量后又接受了12小時的10μg/分的嵌合7E3Fab連續(xù)滲透的患者的結(jié)果。12小時滲透所產(chǎn)生的結(jié)果在圖8中由淺色區(qū)表示，線條表示的是平均值。在整個的滲透期間內(nèi)，對受體的封閉程度，對血小板凝集的抑制程度以及對失血時間的延長都得到了保持，一旦中止了滲透則它們就開始恢復(fù)。表9從圖8中得出的平均數(shù)值0.25mg/kg＋10μg/分12小時從起始滲透起平均失血時間平均凝聚平均結(jié)合計算的小時數(shù)(分)(％基線)(％基線)05.51000.023014.793.563022.489.11223.524.485.61813.961.172.9248.660.969.23614.575.060.6第一階段和第二階段患者的臨床效果在47名接受了c7E3Fab治療的患者中，沒有任何一個人在PTCA的過程中或之后經(jīng)歷了血栓。在所有47名接受了c7E3治療的人同中，除了2名以外，都成功地進行了PTCA，正如血管造影所確定的那樣，將損傷減小到小于50％的血管直徑。在兩例不成功的擴張患者中，01-012接受了將左前下冠狀動脈的由90％狹窄減少到70％的擴張，但是進一步的擴張是技術(shù)上無法實現(xiàn)的。第二名患者(患者01-019)，開始時進行了成功的擴張，但是隨后又對主要的縱向解剖(沒有明顯的血栓)放置了冠心內(nèi)的斯坦特(stent)。在9名對照人員中，有1名(01-022)在進程15分鐘時發(fā)生了急性血栓封閉，需要進行緊急冠狀動脈分流手術(shù)(CABG)，并得到復(fù)原。其他8名的對照患者都得到了成功的擴張，使狹窄的部位被降低至50％或更少。患者01-019(12小時滲透組)接受了氣囊擴張，使左回旋冠狀動脈的95％的損傷被降低了50％。其后，該患者經(jīng)歷了明顯的血管迷走神經(jīng)的異常，導(dǎo)致了心動過緩，低血壓，短暫的心搏停止。它被送回到導(dǎo)管插入室并且進行了緊急的冠狀動脈內(nèi)斯坦特安裝術(shù)。該斯坦特在左主冠狀動脈發(fā)生了錯位，該患者被送去進行了緊急的冠心動脈分流手術(shù)。根據(jù)調(diào)查的結(jié)果，沒有患冠心內(nèi)血栓的明顯跡象，不論是在血管造影中或是手術(shù)期中都是如此。該名患者還發(fā)生了周期發(fā)作的(peri-operative)心肌梗塞。術(shù)后8天該患者脫離危險并恢復(fù)。有3名接受c7E3Fab治療的患者各自分別患有PTCA術(shù)后的胸部疼痛，程度并不一致?；颊?1-009(0.25mg/kg單一劑量組)在c7E3處理后9小時后發(fā)生胸痛，患者05-003(12小時滲透組)在接受了c7E321小時后發(fā)生了絞痛，患者06-003(12小時滲透組)在接受c7E3處理2天后發(fā)生心絞痛。調(diào)查結(jié)果表明，這些胸痛的表現(xiàn)與標(biāo)志著復(fù)發(fā)閉塞的局部缺血表征并不相關(guān)?；颊?2-004(0.25mg/kg單一劑量組)在接受c7E3Fab治療之前就患有長期的胸痛并在PTCA過程中繼續(xù)有胸痛。在術(shù)后的那一天ECG的變化以及伴隨著的心酶(前一天抽取)的升高表明這位患者經(jīng)歷了周期性(peri-procedural)非Q波心肌梗塞(肌酸酐激酶峰值＝462，MB分?jǐn)?shù)＝64)。在用c7E3Fab處理的52天時，受試組中發(fā)生一例死亡。患者06-002(6小時滲透組)患有間隙肺病，充血性心衰和非頑固性絞痛的病史，進行過成功的近左下冠狀動脈的PTCA術(shù)。在試驗過程中，該患者發(fā)生了持續(xù)性的心室纖維性顫動，兩次需要電除顫，此后，試驗進展順利。當(dāng)離開了導(dǎo)管室后，該患者又發(fā)生了藍視(癥)，并立即給予利尿劑和輸氧治療。然而，該患者隨后又發(fā)生了呼吸困難并需要呼吸輔助器。該患者隨后在醫(yī)院內(nèi)的情況變得更為復(fù)雜，包括膿毒癥、成年人呼吸系統(tǒng)壓迫綜合癥、貧血(進行了多次輸血)、心臟局部缺血。該名患者在c7E3Fab治療后的第52天死于多重系統(tǒng)功能衰竭。安全性第一階段和第二階段圖9表示的是所有劑量組的患者在滲透終止后的從基線到24小時的血細胞比容的絕對變化值。在圖上標(biāo)出了變化為0的一條參照線。對照組中的一名患者(01-022)以及一名c7E3Fab治療的患者(01-019)的血細胞比容的數(shù)據(jù)并沒有在圖中表示出來，因為這兩名患者都在第一個24小時內(nèi)需要進行緊急冠心分流手術(shù)并輸血(見以下)。在-12處的第二條低線表明根據(jù)心肌梗塞血栓溶解(TIMI)標(biāo)準(zhǔn)被定義為少量出血的所需血細胞比容的變化(Raoetal.，J.Am.Coll.Cardiol.111-11(1988))。在對照的病人和所有c7E3Fab劑量組的病人之間的血細胞比容的變化是相似的。表10總結(jié)的是滲透終止后24小時血小板計數(shù)變化的平均值。血小板計數(shù)的變化在未接受治療的對照組和c7E3Fab治療組中具有相似的分布，并沒有明顯的與劑量相關(guān)的效果。表10滲透結(jié)束后24小時血小板計數(shù)平均變化值％劑量％變化范圍對照(n＝9)-0.7(-20.2，+13.2)0.15mg/kg(n＝5)-17.4(-24.5，+19.5)0.20mg/kg(n＝5)-11.6(-20.8，+4.7)0.25mg/kg(n＝5)+2.9(-8.9，+4.4)6小時*(n＝11)-7.7(-28.3，+19.4)12小時*(n＝11)0.0(-24.3，+24.4)24小時*(n＝10)-3.9(-9.0，+50.0)*注射濃縮藥丸劑量0.25mg/kg后c7E3Fab(10μg/分)的滲透時間對第一階段和第二階段結(jié)果的討論本研究的第一階段結(jié)果表明，c7E3在用阿斯匹林和肝素處理過的PTCA患者群中的劑量反應(yīng)特征與在劑量階梯試驗(實施例3)中的頑固性心絞痛患者中的特征是相同的。嵌合7E3產(chǎn)生了血小板GPIIb/IIIa受體的劑量依賴性封閉，并且這種受體封閉與對血小板功能的抑制相關(guān)。此外，第二階段的結(jié)果表明，用連續(xù)滲透可以獲得對血小板Fab功能長達24小時的抑制效果。在所有的患者中，不論其滲透時間長短，停止?jié)B透后6-12小時就會發(fā)生血小板功能的恢復(fù)。c7E3處理的患者的臨床結(jié)果，從血管造影學(xué)或臨床終點的觀點來看，都比根據(jù)它們的危險性的概況所預(yù)測的結(jié)果好得多。在c7E3處理的患者中，沒有任何人在此過程之中或之后發(fā)生血栓。此外，除2名患者以外，其他的患者都進行了在血管造影學(xué)上為成功的治療。所有進入第二階段的患者以及進入第一階段的15名患者中的6名都是根據(jù)臨床或血管造影特征而被定義為高危險性的患者。單個的臨床特征(例如非頑固性絞痛，糖尿病，婦女年齡大于65歲)或血管造影的損傷特異性特征(例如B型或C型)都使患者發(fā)生并發(fā)癥的危險性被提高，多重這些因素的效果是相加性的。在第二階段中，被處理的患者中的17名患有非頑固性心絞痛并帶有或不帶有另外的臨床或血管造影損傷特異危險特征。此外，在第一階段中的6名患者被確認(rèn)具有非頑固性心絞痛。在公開的文獻中，患有非頑固性心絞痛的患者發(fā)生重大并發(fā)癥(死亡，心肌梗塞，急性冠心血管分流或重復(fù)性PTCA)的發(fā)生率為10％～15％(DeFeyter，P.J.Editorial.Am.HeartJ.118860-868(1989)和Rupprecht，H.J.etal.EurHeartJ.11964-973，(1990))。血管造影特征同樣是對PTCA綜合癥有高度預(yù)測性的(Ellis，S.G.，1990，“Electivecoronaryangioplastytechnigueandcomplications”，InTextbookofInterventionalCardiology，E.J.Topol，Ed.，(W.B.SaundersCo.，Philadelphia)；DeFeyter，P.J.etal.，Circulation83927-936(1991)；Ellis，S.G.andTopol，E.J，Am.J.Cardiol.66932-937(1990)；andACC/AHATaskForceReportGuidelinesforpercutaneoustransluminalcoronaryangioplasty，J.Am.Coll.Cardiol.12529-545(1988))。29名第二階段c7E3處理的患者由于其損傷特異性特征而達到了該標(biāo)準(zhǔn)，其中的12名具有一個B型損傷，14名具有2個或更多個B型損傷，3名具有C型損傷。此外，在試驗中的很多患者都接受了在一個或多個血管中的多重損傷的擴張，因此而增加了本程序的潛在危險性(Samson，M.etal.，Am.HeartJ.1201-12(1990))。根據(jù)這些患者的血管造影學(xué)定義的高度的危險因子的數(shù)目和程度，局部缺血并發(fā)癥的預(yù)測發(fā)生率在10％～20％的范圍內(nèi)(Ellis，S.G.Electivecoronaryangioplastytechniqueandcomplications，InTextbookofInterventionalCardiology，(Ed.E.J.Topol)，W.B.SaundersCo.，philadelphia(1990)；DeFeyter，P.J.，Circulation83927-936(1991)；Ellis，S.G.andTopol，E.J，Am.J.Cardiol.66932-937(1990))。對照組中同樣包括高度危險的患者。然而，一般而言，對照組患者中的危險因子的數(shù)量和程度是較低的。9名對照患者中的5名具有單一的危險因子，即一個B型損傷(4名患者)或非頑固性絞痛(1名患者)，而32名第二階段c7E3處理的患者中有26名具有C型損傷或兩種甚至更多的高度危險特征。在這兩組之間，危險程度上的不同是顯著差異的(Fisher’sexacttestp＝0.018)。非常有趣的是，對照組中具有急性堵塞(患者01-022，具有2個B型損傷特征的非頑固性絞痛)是被鑒定為具有多于一種危險因子的3名患者之一(有一名對照患者具有未確認(rèn)的危險特征)。因此，當(dāng)對照組3名高度危險患者中的一名發(fā)生了血栓時，而同屬于這種最高危險性的26名經(jīng)c7E3Fab處理的患者中卻沒有任何一人發(fā)生血栓。本研究還表明在那些已經(jīng)接受了靜脈注射肝素或口服阿斯匹林治療的患者中可以獲得用c7E3的安全有效的抗血小板效果。在對照組和c7E3處理的患者之間對比其失血現(xiàn)象，表明在各組的基線之間沒有血細胞比容變化的明顯差異。其它的副作用都不是經(jīng)常發(fā)生的，而且是中等程度和比較緩和的。在整個試驗中發(fā)生了一例死亡，而且是在c7E3Fab治療后幾乎2個月時發(fā)生的，該患者患有間隙性肺病和心衰，并在PTCA后發(fā)生了呼吸困難且并發(fā)有膿毒病，成年人呼吸抑制綜合癥以及最后的多器官衰竭。最終，在所有那些得到了結(jié)果的20名患者中沒有任何一人發(fā)生了人抗嵌合抗體的免疫反應(yīng)?？偠灾逗?E3Fab可以對那些接受了阿斯匹林及靜脈注射肝素治療的患者在進行PTCA時，產(chǎn)生安全有效的對血小板功能的抑制。這種抗血小板作用可以保持長達24小時，即不引起顯著的失血危險性的增加，也不引起免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。在那些具有高度血栓并發(fā)癥危險的患者中，在接受c7E3治療的組內(nèi)沒有發(fā)生血栓現(xiàn)象。這就表明c7E3可以在這些患者中降低血栓并發(fā)癥的危險。實施例5在冠心血管成形術(shù)中治療急性堵塞在冠狀動脈血管成形術(shù)中，急性冠狀動脈堵塞是在這一手術(shù)中的決定其發(fā)病率和死亡率的主要因素，在選擇性的血管成形術(shù)案例中大約為3％～6％(Detre，K.M.eta1.，Circulation82739-750(1991))，但是在那些因為非頑固性絞痛或發(fā)生了急性心肌梗塞而進行血管成形術(shù)的患者中的發(fā)生率高達20％～40％(Ellis，S.G.etal.，Circulation77372-379(1988)；DeFeyter，P.J.etal.，Circulation83927-936(1991))。發(fā)生急性堵塞的機制是在進行血管成形術(shù)時，在動脈上所創(chuàng)造的或所延展的內(nèi)皮損傷區(qū)處發(fā)生的急性血栓而造成的。通常在這些位置由于血管的幾何形狀的變化而造成對血流形式的改變，一般都是由對斑塊的改動而造成的，并且一般都有內(nèi)皮下邊的組織的暴露，例如內(nèi)膜和中間切開的部分的暴露。因為在形成凝血的初期需要血小板的粘結(jié)和凝聚，所以嵌合7E3Fab抗體片段被用來治療在冠狀動脈血管成形術(shù)時發(fā)生的急性冠狀動脈堵塞。案例患者是一位年齡為45歲的男性醫(yī)師，并且身體狀況一直非常良好。在他接受血管成形術(shù)一周前開始發(fā)生胸部和頸部的不適。當(dāng)這些病征持續(xù)數(shù)天并惡化后，他向其同事進行咨詢。心電圖(EKG)結(jié)果揭示出前心T波的倒轉(zhuǎn)。該患者被送入當(dāng)?shù)蒯t(yī)院的冠心病病房，靜脈注射硝酸甘油和肝素，并口服阿斯匹林。在此后的24小時內(nèi)對心異化酶進行了一系列的測定，并沒有顯示出超出正常范圍。在此后的兩天內(nèi)數(shù)次心電圖記錄揭示了前心T波的持續(xù)性平緩，但是并沒有發(fā)生導(dǎo)致心肌梗塞的變化。住院的第二天，患者被送到心臟導(dǎo)管室，由左心室造影術(shù)揭示了左心室功能在整體上是正常的，但在左心室壁上的前外側(cè)有一個很小的運動減少區(qū)，同時在后下基底區(qū)也有一個運動減少區(qū)。左心室的泵血量為72％。冠狀動脈造影顯示出以左側(cè)為主的冠狀動脈系統(tǒng)有一個很小的但是完全堵塞右冠狀動脈的閉塞。在左側(cè)前下冠狀動脈(LAD)的中間部位有一個明顯的狹窄。在該中間LAD狹窄處的遠端有一個由此產(chǎn)生的斜向的很小的逐漸擴展的病灶。該患者被送回到冠心病病房，并被連續(xù)靜脈注射硝酸甘油和肝素48小時。在此期間內(nèi)，他沒有感到病痛，心異化酶沒有升高，每日的心電圖僅揭示出其前心T波的持續(xù)性平緩。隨后該患者被轉(zhuǎn)移到Hermann醫(yī)院(Houston，TX)進行血管成形術(shù)。在進行血管成形術(shù)前，該患者還繼續(xù)接受靜脈注射硝酸甘油和肝素，口服阿斯匹林，并且開始口服鈣通道封閉劑。在以下的幾天內(nèi)，患者的部分促凝血酶原激酶的時間(PTT)是70-90秒。在開始對其進行血栓成形手術(shù)時，活化的血凝塊時間(ACT)是173秒。給患者靜脈注射肝素5000單位，患者的左冠狀動脈口與一個8號FrenchJL3.5導(dǎo)向?qū)Ч芟嘟?。用尾?cè)右前斜向投像和顱側(cè)左前斜向投像觀察該LAD冠狀動脈，對LAD首先放置0.018英寸多普勒導(dǎo)線(Cardiometrics，Inc.，MountainView，CA)。我們經(jīng)常使用這種導(dǎo)線對高度危險性急性堵塞患者的血流進行監(jiān)測。從LAD相對于損傷的遠端和近端記錄到血流速度的信號。將一個2.5mm冠狀動脈氣囊導(dǎo)管(Intrepid，Baxter，Inc.，Irvine，CA)通過多普勒導(dǎo)線送入，該多普勒導(dǎo)線是穩(wěn)定在冠狀動脈處的。將該氣囊放置在跨騎在LAD損傷處的正確位置，然后對該氣囊以6個大氣壓的壓力進行系列性短暫的充氣。這樣就使得該狹窄的程度被降低，正如從血管造影上以及從血管流量峰值(APV)由12cm/秒到33cm/秒的升高所觀察到的變化證實的那樣。在進行這種擴張以后幾分鐘的觀察中，發(fā)現(xiàn)該流速信號開始消失。注射對比劑后顯示了在該血管成形位點又發(fā)生了狹窄，即彈性回縮，斑點扭曲和形成了血栓。然后將氣囊再次深入到該損傷位點，再次進行氣囊擴張。使該動脈得到了再次擴展并使流速信號再次回到APV為34cm/秒的水平。在繼續(xù)監(jiān)視的幾分鐘內(nèi)，該信號再次降低。在5分鐘內(nèi)，該信號已達到相當(dāng)?shù)偷乃剑骄逯邓俣仁?cm/秒?；颊唛_始感到胸痛。心電圖對心前區(qū)電極的監(jiān)視揭示了ST部分的升高。血管造影顯示該動脈被徹底地閉塞了。在此之前幾分鐘所獲得的活化凝血時間是344秒。然后給予血小板GPIIb/IIIa受體(c7E3Fab，γ1，κ)的特異性嵌合7E3單克隆抗體Fab片段，劑量為0.25mg/kg，1分鐘靜脈注射。此后約1-2分鐘，血流速度開始回升。注入對比劑后顯示了該冠狀動脈開放的流速已經(jīng)被恢復(fù)并達到血栓溶解心肌梗塞試驗的一級水平(TIMI1)。在此后的15分鐘期間內(nèi)，冠狀動脈流量繼續(xù)回升并穩(wěn)定在APV為23cm/秒。以后又注射了幾次對比劑，證明冠狀動脈流量確實得到了改善。患者的胸痛逐漸消失，由監(jiān)測電極所產(chǎn)生的ST部分回到了其基線部分。在使用了c7E3Fab15分鐘后，按照要求進行了血管造影。其結(jié)果顯示了TIME3冠狀動脈流動。此時的流速信號為20cm/秒。在此后的5分鐘連續(xù)觀測中，沒有發(fā)現(xiàn)冠狀動脈流量的進一步改善。在此期間內(nèi)的血管造影的錄像確認(rèn)了在該血管成形術(shù)位點處還有少量的血栓。因此，決定冠狀動脈內(nèi)注射250,000單位的尿激酶。這一血栓溶血劑在此后的大約10分鐘內(nèi)被滲透進去。在此期間內(nèi)由多普勒導(dǎo)線測量確認(rèn)在流速上沒有進一步的改善。當(dāng)冠狀動脈內(nèi)注射的尿激酶被完全滲透以后，即在使用了c7E3Fab后的第33分鐘時進行了再一次的冠狀動脈血管造影。該動脈開放并達到TIMI3水平的流動。在損傷位點還有一些中等程度的、殘余的狹窄繼續(xù)存在。此外，還可以觀察到血栓的尺寸進一步縮小但并未被完全溶解。因此，決定再次進行氣囊擴張術(shù)，以減少殘存的狹窄。氣囊導(dǎo)管就再一次通過導(dǎo)線進入到損傷的位點，然后以6個大氣壓進行最后的氣囊擴張2分鐘。此后，抽出氣囊導(dǎo)管，導(dǎo)線仍保留在原位置。流速信號升高到APV為29cm/秒，并在此水平上保持?jǐn)?shù)分鐘。此后的血管造影證實了該殘余狹窄被適當(dāng)?shù)販p小了。然后將導(dǎo)線抽回到該狹窄的近端，并再一次的記錄流速。抽出導(dǎo)線、氣囊導(dǎo)管和導(dǎo)向?qū)Ч?。該程序徹底完成。然后將該患者送回到冠心病病房。為了在未來的幾天使他的PTT保持在70-90秒的范圍內(nèi)，繼續(xù)給他口服阿斯匹林，硝酸鹽以及鈣通道封閉劑。此后的幾次心電圖(EKG)表明前心T波倒轉(zhuǎn)得到了緩解，此后的所有EKG都是正常的。此后幾次肌酸激酶(CK)異化酶值均為＜100U/L。在進行PTCA之前血小板的計數(shù)是248,000，在接受了c7E3Fab之后的2小時，6小時，12小時，24小時和48小時的血小板計數(shù)分別為304,000、279,000、246,000、185,000和220,000。由10μMADP引起的血小板凝聚在術(shù)前由光密度計測定為73％，在術(shù)后的2小時，6小時，12小時，24小時和48小時分別為0％、13％、26％、45％和51％。血管成形術(shù)后一個星期對患者進行了跟蹤導(dǎo)管檢測。其LAD冠狀動脈是充分開放的并達到TIMI3級流量。在當(dāng)天的晚些時候允許他回家。病歷的討論該患者接受了0.25mg/kgc7E3Fab的靜脈注射，冠狀動脈內(nèi)250,000單位尿激酶注射以及多次的擴張治療，成功地治療了他的在冠狀動脈血管擴張術(shù)中發(fā)生的突發(fā)堵塞引起的急性的局部冠狀動脈缺血綜合癥。這些結(jié)果表明抑制血小板糖蛋白IIb/IIIa受體結(jié)合以及血小板交連的抗血小板治療方法可以有效地幫助被急性閉塞的冠狀動脈重新獲得穩(wěn)定的流通，并可以用于其它相似的臨床病例。實施例6防止高度危險血管成形術(shù)局部缺血并發(fā)癥的抗GPIIb/IIIa嵌合抗體片段的隨機、雙盲評價概述自從1977年出現(xiàn)了冠狀動脈血管成形術(shù)后，經(jīng)皮心肌血管再造術(shù)就得到了迅速的發(fā)展(Gruentzig，A.R.etal.，N.Engl.J.Med.，3161127-1132(1987))。雖然這些手術(shù)能夠使局部缺血和生命的質(zhì)量得到改善(Parisi，A.F.etal.，N.Engl.J.Med.，32610-16(1992))，急性并發(fā)癥仍舊是其主要的缺陷。在醫(yī)院的這些手術(shù)之中或其后發(fā)生的在被治療的血管上的突然閉塞的發(fā)生率為4％～9％，發(fā)生的重復(fù)閉塞及急性堵塞都相伴有相當(dāng)數(shù)量的發(fā)病率以及大約10倍的死亡率的增加(Lincoff，A.M.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，19926-938(1992)；Tenaglia，A.N.etal.，Am.J.Cardiol，Inpress(1993)；Detre，K.M.etal.，Circulation，82739-750(1990)；Ellis，S.G.etal.，Circulation，77372-379(1988))。盡管血管上發(fā)生突然堵塞的機制通常都是無法確定的，但是血栓的形成以及血管的創(chuàng)傷都是其形成因素。使患者被確認(rèn)為具有高度急性并發(fā)癥危險的特征，包括與冠狀動脈血栓(非頑固性絞痛，急性的或近期的心肌梗塞)、糖尿病、女性及冠狀動脈形態(tài)特征(彎曲點，血栓，分叉)相關(guān)的臨床癥狀，表明患者損傷的復(fù)雜性的增加(Lincoff，A.M.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，19926-938(1992)；Ellis，S.G.etal.，J.Am.Coll.Cardiol，17(SupplB)89B-95B(1991)；Moushmoush，B.etal.，Cath.Cardiovasc.Diagn.，2797-103(1992)；andMyler，R.K.etal.，circulation，82(SupplII)II-88-II-95(1990)。盡管阿斯匹林已經(jīng)顯示出可以降低患者在接受血管成形術(shù)時發(fā)生急性血管堵塞和急性心肌梗塞的危險程度(Schwartz，L.etal.，N.Engl.J.Med.，3181714-1719(1988)；Barnathon，E.S.etal.，Circulation，76125-134(1987))。但是，它對血小板功能的作用相對來說較弱，而且在接受了阿斯匹林的那些高度危險的患者中繼續(xù)發(fā)生局部失血的發(fā)生率為10％～20％(Tenaglia，A.M.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，(1993，inpress))。相反，對患者給予嵌合7E3抗體的Fab片段就獲得了對GPIIb/IIIa受體的實質(zhì)上的封閉，并且抑制了血小板的凝聚(見實施例4，血小板功能的抑制)。在對進行血管成形術(shù)的患者的初期研究中，c7E3Fab降低了在進行經(jīng)皮手術(shù)之中或之后發(fā)生急性血管堵塞的危險性(見實施例4和Ellis，S.G.etal.，Cor.Art.Dis.，4167-75(1993))。現(xiàn)在進行的隨機性的研究是為了進一步評價對GPIIb/IIIa受體為特異性的嵌合抗體片段在防止局部缺血并發(fā)癥時的效率(EPIC實驗，c7E3Fab防止局部缺血并發(fā)癥的評價)。特別是對c7E3Fab在接受血管成形術(shù)的具有高度并發(fā)癥危險的患者中的臨床效果，用預(yù)期的、雙盲的、安慰劑控制的、隨機臨床的實驗進行了評價。該實驗包括在56個地區(qū)的2099名患者，他們按計劃要進行冠心血管成形術(shù)或定向性冠狀動脈癍塊切除術(shù)，并具有以下的臨床高度危險情況重度非頑固性絞痛并伴有靜止痛感和心電圖的變化，急性心肌梗塞、臨床的和冠狀動脈損傷形態(tài)特征并伴有高度的并發(fā)癥危險?；颊邆兘邮芰?a)安慰劑的濃縮藥丸及滲透，(b)c7E3Fab的濃縮藥丸和安慰劑滲透，或(c)c7E3Fab的濃縮藥丸及其滲透。主要終點(Primaryendpoint)是一種復(fù)合情況，包括發(fā)生下列情況中的任何一種死亡、非致命性心肌梗塞、計劃外的血管再造手術(shù)或重復(fù)的經(jīng)皮手術(shù)、計劃外的冠狀動脈斯坦特植入術(shù)或?qū)︻B固性局部缺血進行主動脈內(nèi)氣囊泵插入術(shù)。在主要終點處的濃縮藥丸和滲透的降低效果是35％(12.8vs8.3％，P＝0.008)，而獨自使用濃縮藥丸的降低效果是11％(12.8vs11.4％，P＝0.43)。使用濃縮藥丸加上滲透的降低效果對每一個終點成分都是一致的，另外，在大部分患者的按年齡、性別、已經(jīng)患有冠狀動脈血管血栓，急性冠狀動脈綜合癥(心肌梗塞、非頑固性絞痛的)所分的亞組中也是一致的。在使用了濃縮藥丸和其滲透的組中，失血現(xiàn)象及輸血現(xiàn)象是增加的，而僅使用濃縮藥丸時是中等程度的。這一實驗揭示了用抗體片段直接抑制血小板IIb/IIIa受體能夠通過明顯降低局部缺血并發(fā)癥而獲得延續(xù)的臨床效果。方法根據(jù)前述對常規(guī)經(jīng)皮手術(shù)的危險性所做的研究，患者如果有發(fā)生急性血管堵塞的高度危險并且沒有由于高度失血危險而造成的禁忌，那么，他們就是合適的患者。被認(rèn)為是高度危險的患者是被分在下列三組之一的患者(1)在開始進行了直接的或“搶救性”經(jīng)皮手術(shù)時，發(fā)生在12小時內(nèi)的急性心肌梗塞；(2)不論采用了何種藥物治療，在此前24小時發(fā)生了早期梗塞后絞痛或非頑固性絞痛并伴有至少兩次靜止絞痛的發(fā)作以及靜止心電圖的改變；(3)根據(jù)美國心臟協(xié)會/美國心臟病學(xué)院標(biāo)準(zhǔn)制定的臨床和/或血管造影標(biāo)準(zhǔn)為高度危險患者(Ryan，T.J.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，12529-45(1988))，該標(biāo)準(zhǔn)被修飾(Ellis，S.G.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，17(SupplB)89B-95B(1991))。這些高度危險的臨床和血管造影的標(biāo)準(zhǔn)包括在目標(biāo)損傷處有兩個B型特征或一個C型特征，或在65歲以上婦女或患糖尿病的患者中有一個B型特征。該標(biāo)準(zhǔn)具體條件如下(I)建議采用美國食品藥物和管理局(FDA)批準(zhǔn)的裝置對下列一種情況進行選擇性或急性的冠狀動脈血管氣囊成形術(shù)或癍塊切除(A)非頑固性絞痛和/或非Q波心肌梗塞，其定義如下1)靜止絞痛在靜止時有兩次或更多次絞痛并伴有局部缺血性ST部分或T波的異常；或2)復(fù)發(fā)性絞痛在住院期間對常規(guī)藥物治療無效并伴有局部缺血性ST部分或T波的異常的復(fù)發(fā)性絞痛3)早期梗塞后的絞痛在記錄有心肌梗塞后的7天內(nèi)的絞痛，伴隨有靜止時的絞痛以及局部缺血性ST部分或T波的異常；或由最低量的勞累引起的絞痛(2梅脫)，其中，短暫的ST部分或T波的異常的定義如下a)≥1mmST部分的壓低(在J點后80毫秒)或升高(J點后20毫秒處)，和/或b)T波的改變(通常為倒轉(zhuǎn))，其中，在所有的患者的入選時，他們的肌酸轉(zhuǎn)移酶(CK)比正常水平低2倍。(B)急性Q波心肌梗塞1)在心肌梗塞發(fā)生并且在此之前沒有接受溶血治療時，進行直接的手術(shù)，或2)對心肌梗塞進行溶血治療失敗后進行搶救性血管成形術(shù)，其中，所接受的心肌梗塞被定義為具有如下所述的3種情況中的至少2個(1)延長性心絞痛(長于30分鐘)；(2)總肌酸轉(zhuǎn)移酶的升高超過正常水平上限的2倍以上(由CK-MB異化酶的升高來證實)；(3)心肌梗塞的心電圖(ECG)證據(jù)，定義如下a)ST部分升高至少0.1mV(在J點以后0.2秒處測定)發(fā)生在下述3個位置中的至少一處i)3個下電極之中的2個(II、III、aVF)；或ii)6個心前電極中的至少2個(V1-V6)；或iii)電極I和aVL；或iv)心前電極V1-V4ST部分的壓低與傷后或后期心電相一致(鏡子法則)；或v)在左側(cè)支動脈有堵塞，在下或前電極的主要ST發(fā)生變化；b)新的顯著的Q波≥0.04秒或其深度≥相應(yīng)的R放大波的1/4，或同時具有兩者。(C)高度臨床/形態(tài)學(xué)危險特征1)在要擴張的動脈處具有兩個或更多B型損傷特異特征的狹窄。損傷特異性特征依據(jù)的是ACC/AHA標(biāo)準(zhǔn)；2)在要擴張的動脈處的具有一個或更多個C型特征的狹窄；3)年齡≥65歲的婦女并帶有至少一個B型特征的狹窄；4)糖尿病患者并在要進行擴張的動脈處具有至少一個B型特征的狹窄；或5)發(fā)生了由CK-MB異化酶升高而證實的心肌梗塞并在7天內(nèi)對由梗塞所造成的損傷進行了血管成形術(shù)。(II)年齡在18～80歲之間的男性，不具懷孕潛力的年齡在18～80歲之間的女性(即進行了絕育手術(shù)或絕經(jīng)，定義為絕經(jīng)至少一年以上)。(III)在開始進行規(guī)范化的專項手術(shù)和給予所研究的試劑之前有書面文件表示同意。其它條件適合但由于以下任何一種原因而被排出本實驗的患者(1)具有出血素質(zhì)的病史；(2)在入選前6星期曾經(jīng)做過重大手術(shù)；(3)近期(入選前6星期內(nèi))曾有臨床上為顯著的胃腸道或生殖泌尿系統(tǒng)的出血；(4)入選前2年內(nèi)曾經(jīng)發(fā)生過中風(fēng)或有中風(fēng)所遺留下來的明顯的神經(jīng)缺陷；(5)左主冠狀動脈發(fā)生＞50％的閉塞；(6)被推斷為或被證實為有脈管炎病史；(7)在接受計劃的受試藥劑的滲透之前的七天內(nèi)，曾經(jīng)參加了其它的受試藥物評價的臨床研究的患者；(8)在隨機研究藥劑的服用前七天內(nèi)，曾經(jīng)口服過抗凝聚藥物的患者，除非在隨機服藥之前所服用的凝血酶原的份量≤對照劑量的1.2倍；(9)在進行血管成形術(shù)之前或者計劃在該手術(shù)中靜脈注射葡聚糖；(10)有曾經(jīng)服用過鼠單克隆抗體或已知對鼠蛋白過敏的歷史；或(11)不能提供書面同意文件。在所有的試驗機構(gòu)中，都從其試驗審核委員會獲得了他們的批準(zhǔn)，并且從所有的患者獲得了書面的同意。受試患者的篩選工作是在1991年12月～1992年11之間完成的；共在美國的56所試驗機構(gòu)中選取了2099名患者。研究規(guī)則所有的患者都接受阿斯匹林和肝素的治療。程序開始至少2小時前口服阿斯匹林劑量為325mg，并在其后還保持每天325mg的劑量。肝素(豬)是以初始劑量為10,000～12,000單位靜脈給藥并接著進行每15分鐘給予至多3,000單位，但是其總量不超過20,000單位，目的是為了使活化的凝塊時間保持在“治療”范圍內(nèi)，一般在程序中為300～350秒(Dougherty，K.G.etal.，Abstractsofthe63rdScientificSessions，III-189(1991)；Rath，B.etal.，Br.Heart.J.，6318-21(1990)；OgilbyJ.D.etal.，Cath.Cardiovasc.Diag.，18206-9(1989))。然后繼續(xù)將肝素以每小時1,000單位的速率連續(xù)輸入12小時。根據(jù)臨床的要求，還可以按靜脈注射或冠狀動脈內(nèi)給藥硝酸鹽。嵌合7E3Fab(γ1，κ)是以含有每毫升0.15M氯化鈉，0.01M磷酸鈉和0.001％聚氧乙烯山梨醇脂肪酸脂80，pH7.2的無菌非熱原性溶液含2毫克單克隆Fab的形式使用的。在出院時患者所需要的唯一的藥品是每天325mg阿斯匹林。將患者隨機等分到三個雙盲研究組內(nèi)。其中的一個組的患者以劑量為0.25mg/kg接受c7E3Fab的濃縮藥丸，然后以10μg/分的劑量連續(xù)12小時滲透c7E3Fab。第二組的患者接受劑量為0.25mg/kg的c7E3Fab濃縮藥丸，然后連續(xù)12小時滲透安慰劑溶液。第三組接受安慰劑藥丸和12小時的安慰劑溶液連續(xù)滲透。濃縮藥丸的使用是在程序開始前至少10分鐘進行的，并且是以5分鐘的時間完成的，所進行的滲透都是12小時的，除非發(fā)生了臨床上的不良反應(yīng)。在病人出院以前，分別在給藥后的30分鐘、2小時、12和24小時對血壓的血小板計數(shù)進行測定以檢查血小板減少癥的證據(jù)。對威脅生命的失血以及血小板減少癥用一種事先設(shè)計好的算法進行評價和處理(Sane，D.C.etal.，Ann.Intern.Med.，1111010-22(1989))。該方法的守則中沒有關(guān)于紅血細胞轉(zhuǎn)輸?shù)木唧w指示；因而實際上進行的輸血是按照各個地點的當(dāng)?shù)貙嵺`方式進行的。血管成形術(shù)是按照標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)則進行的。在程序前以及程序后進行的血管造影都是在冠狀動脈內(nèi)給以150-300μg硝酸甘油并進行了冠狀動脈舒張以后完成的。在此程序之后，血管鞘在結(jié)束了研究藥劑的滲透后保持至少6小時。此外，將血管鞘繼續(xù)保持在該位置直至肝素滲透結(jié)束后的至少4小時以及直至達到了可接受的被激發(fā)的部分促凝血酶原激酶時間從而保持止血。研究終點一個獨立的臨床終點委員會審核了那些可能代表著研究終點或主要負作用現(xiàn)象的所有情況。這個委員會在整個研究期間對具體處理方法是一無所知的，隨后審核了病例記錄、心電圖以及所需要的相關(guān)的醫(yī)療記錄。對每一事件的確定需要兩個審核委員的一致意見。該實驗的主要終點是一個復(fù)合的臨床終點結(jié)果，包括在隨機選擇后的第一個30天內(nèi)發(fā)生了任何一種下列情況(1)由任何原因?qū)е碌乃劳觯?2)非致命性心肌梗塞；或(3)緊急救護(a)第二次血管成形術(shù)。重復(fù)經(jīng)皮救護以治療復(fù)發(fā)的急性局部缺血(氣囊血管成形術(shù)和癍塊切除)。按預(yù)定計劃進行的(例如，階段性的程序)都不屬于終點事件；(b)冠狀動脈分流術(shù)。緊急(非選擇性)手術(shù)搶救以治療復(fù)發(fā)的急性局部缺血；(c)插入冠狀動脈血管內(nèi)斯坦特(stent)。將冠狀動脈內(nèi)斯坦特放置在能夠使被擴張了的血管保持立即開放的位置；或(d)插入主動脈內(nèi)的對抗搏動的氣囊泵。對于那些被認(rèn)為不屬于重復(fù)血管成形術(shù)或手術(shù)搶救的患者的復(fù)發(fā)性局部缺血放置氣囊泵。在本研究中，“開放”的定義是TIMI2-3級流量并且手術(shù)醫(yī)生可以用肉眼觀察到小于或等于50％的狹窄，但心電圖又沒有局部缺血證據(jù)。終點心肌梗塞的定義如下1.在隨機取樣的并在24小時內(nèi)發(fā)生心肌梗塞的患者中，為了確診隨后發(fā)生的非致命性梗塞需要對兩種酶進行測定(a)肌酸激酶(CK)或肌酸激酶MB比正常值的上限至少高三倍，代表著從前一個“谷”升高至少33％(其定義為從前一個峰值降低了25％但是又保持在比正常的上限至少高2倍的水平上)；或(b)在前一個峰值降低了50％并且其“谷”值小于正常上限的兩倍之后或CK-MB升高了至少100％并保持在正常上限3倍以上的水平上。用記錄的新的長時間絞痛(長于2分鐘)并伴隨著心肌酶的再次升高的現(xiàn)象來確定再次梗塞的起始時間。在沒有記錄到絞痛的情況下，再次梗塞的起始時間就被定義為緊接著前一個新的酶的升高之后所測定到的低谷的時間。定義，僅適用于這樣的患者，即在參加本研究時所發(fā)生的心肌梗塞后24小時之內(nèi)有復(fù)發(fā)性絞痛和/或酶的低谷值開始發(fā)生的患者。在所有的病例中都使用的是CK-MB水平，除非無法獲得這些數(shù)據(jù)，在這種情況下就使用肌酸激酶全值代替之。2.在那些發(fā)生了急性梗塞24后或者最近未發(fā)生梗塞的進入本實驗的患者中，要將其確診為需要住院的心肌梗塞就要達到下列兩個標(biāo)準(zhǔn)中的一個(a)在兩個或更多個臨近的電極上的新的Q波≥0.04秒，深度比相應(yīng)的R波＞1/4；或(b)CK-MB值至少大于正常上限的3倍，并且在該水平是一個≥前一個“谷”值50％的增長。在本定義中，那些在進入本研究時帶有急性心肌梗塞的患者發(fā)生再次梗塞的起始時間是產(chǎn)生新的長時間絞痛(長于20分鐘)的時間，或是在新的酶的升高之前測定到酶的低谷水平的時間。要想使本定義可用于實際，這兩個時間從初始梗塞時算起都必須大于24小時。3.出院后要想被確診為心肌梗塞，必須達到下述兩個條件中的一個(a)在兩個或更多個相鄰的電極上的新的Q波≥0.04秒，或深度比相應(yīng)的R波＞1/4，或兩者同時發(fā)生；或(b)CK或CK-MB水平比正常的上限高2倍。主要終點的另一個要點是需要進行緊急的重復(fù)手術(shù)，定義為計劃外的送回到血管成形病房進行手術(shù)；主要終點并不包括按計劃進行的階段性程序。相似的，僅把用于治療復(fù)發(fā)性局部缺血或失敗了的血管成形術(shù)的緊急冠狀動脈手術(shù)算作主要終點。當(dāng)為了治療在血管成形術(shù)時發(fā)生的急性血管堵塞以及為了消除發(fā)生這一情況的危險性而將斯坦特放置在冠心內(nèi)時，才將這種斯坦特的放置算作主要終點。為了對沒有進行重復(fù)的血管再造術(shù)的患者的復(fù)發(fā)性局部缺血而放置主動脈內(nèi)氣囊泵時，才將這種主動脈內(nèi)氣囊泵的放置認(rèn)作是主要終點。失血現(xiàn)象可以劃分為嚴(yán)重、輕度及非顯著性，依據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)是血栓溶解在心肌梗塞中的研究(ThrombolysisinMyocardialInfarctionStudyGroupcriteria)(Rao，A.K.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，111-11(1988))。嚴(yán)重失血的定義是顱內(nèi)失血或血紅蛋白的降低大于5g/dl的失血(或當(dāng)無法測定血紅蛋白時，依據(jù)血細胞比容降低至少15％)。輕度失血要么是自發(fā)的并有大量尿血或嘔血，并伴有血紅蛋白的降低大于3g/dl(或當(dāng)無法測定血紅蛋白時，依據(jù)血細胞比容降低至少10％)，或當(dāng)無法確定失血位點時，血紅蛋白的降低大于4g/dl(或當(dāng)無法測定血紅蛋白時，依據(jù)血細胞比容降低至少12％)。在那些接受了輸血的患者中，將其所輸血的單位數(shù)累加到所觀察到的血細胞比容的降低并除以3的數(shù)值上，以確定血細胞的總降低數(shù)量并進而確定是否有嚴(yán)重或輕度的失血發(fā)生(Landefield，C.S.etal.，Am.J.Med.，82703-13(1987))。數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)通過公爵大學(xué)(DukeUniversity)的數(shù)據(jù)采集中心用電話隨機對患者進行采訪。隨機性是按照研究地點以及患者是否患有正在發(fā)展的急性心肌梗塞而進行的區(qū)分，基于以前的數(shù)據(jù)，選取了一組為2100名患者的樣品組群，為的是確定主要終點的33％的降低(在安慰劑組群中預(yù)計為15％)并且其乘方為0.8，α＝0.05。這些數(shù)據(jù)被研究調(diào)查員記錄到病歷表格上，并且在數(shù)據(jù)輸入前由本研究的盲點監(jiān)察人員進行監(jiān)察。本研究的主持人對于隨機抽樣的密碼以及研究結(jié)果一直為盲目的，直至所有的患者都被選擇完畢，并且所有終點都被臨床終點委員會進行了判斷時為止。在下表中，基線特征對于連續(xù)的可變值是以平均值和第25和第75百分分布來表示的，而對于間斷的可變值是用百分?jǐn)?shù)來表示的。對試驗中的主要終點進行了分析，即考慮在開始實驗后30天內(nèi)第一次發(fā)生任何一種構(gòu)成終點的現(xiàn)象的時間。如果在此30天的期間內(nèi)未發(fā)生這些現(xiàn)象，在30天以后就對患者進行追蹤調(diào)查。對每一試驗的Kaplan-Meier存活曲線被用來圖示出結(jié)果(Kaplan，E.L.etal.，J.Am.Stat.Assn.，53457-81(1958))。所有試驗相互間的比較是用以治療為目的的原則(intention-to-treat)而進行的。對于主要終點而言，進行了測定趨勢(劑量反應(yīng))的對數(shù)級別的試驗(log-ranktest)，將僅接受了濃縮藥丸的患者認(rèn)作是接受了濃縮藥丸和滲透組的患者的中間值(Kalbfleisch，J.D.andR.L.Prentice，TheStatisticalAnalysisofFailureTimeData，JohnWilleyandSons，NewYork(1980))。如果對趨勢的檢測是顯著性的，那么就在對照組和每一個c7E3Fab組之間進行成對的對數(shù)級別的比較。當(dāng)從1/3或2/3的患者中可獲得有關(guān)數(shù)據(jù)時，就進行安全性的臨時分析。在每一個臨時分析中，對劑量反應(yīng)的檢測的顯著性是用極小的α水平來判定的，即預(yù)先設(shè)定使總體的I型的誤差率≤0.05。在最終的分析中，這種比較的顯著性水平是0.036。在最終的分析中，也使用了相似的策略(測定趨勢，然后進行成對的比較)，以探查對組成終點的各個不同成分的治療方法之間的關(guān)系，雖然這些比較主要是用來對這些現(xiàn)象進行解釋的。在失血綜合癥的治療的最終分析中也使用了這種策略，采用的是X平方檢測。在主要分組(年齡、性別、體重、臨床亞組)中的治療效果的置信區(qū)間和差異率進行了計算并表示出來。結(jié)果患者組中的基線臨床特征表明對這些患者進行血管成形術(shù)時發(fā)生急性并發(fā)癥的危險很高，因為他們中間糖尿病患者、近期心肌梗塞患者、高齡以及帶有入選標(biāo)準(zhǔn)中的損傷特征的婦女的數(shù)量很高(見表11)。大多數(shù)的患者都曾經(jīng)有過一種或兩種血管疾病，但是左心室功能還是正常的。在表12中給出的是手術(shù)程序的詳情。對于每一種治療方案來說沒有見到明顯的差異。表13給出的是總體主要終點的結(jié)果以及其組成情況。與安慰劑組相比，c7E3Fab顯示出了分級的效果(P＝0.009)，在僅使用了濃縮藥丸的組中的綜合事件的發(fā)生率被降低了11％(P＝0.43)，在使用了濃縮藥丸以及滲透的組中的事件的發(fā)生率被降低了35％(P＝0.008)。在表13中的其它的最重要的局部缺血終點也觀察到相同的分級效果。因此，存留的GPIIb/IIIa封閉就降低了非致命性梗塞和進行緊急冠狀動脈分流手術(shù)及緊急經(jīng)皮血管再造手術(shù)的頻率。而在僅使用濃縮藥丸時所產(chǎn)生的短時間的封閉存在著發(fā)生上述事件的非顯著性的一種傾向。在使用了濃縮藥丸和滲透的組中發(fā)生了3例死亡，這3位病人都是在進行隨機抽樣后但又在接受藥物治療之前死亡的。盡管如此，這些死亡事件都根據(jù)以治療為目的的原則而包括在本分析中。由于c7E3Fab可以防止非致命性局部缺血現(xiàn)象，因此對非致命性心肌梗塞的嚴(yán)重程度的預(yù)防是非常有意義的。正如在表14中所示，c7E3Fab防止了Q波梗塞以及帶有酶的大量升高的梗塞，并且顯示出了劑量反應(yīng)的效果。表11基線特性安慰劑組濃縮藥丸濃縮藥丸＋滲透(N＝696)(N＝695)(N＝708)年齡(年)+62(53，69)61(52，68)63(53，69)男性(％)737271體重(kg)848282危險因素(％)糖尿病262323高血壓555554高膽固醇575955吸煙657168血管疾病(％)外周的999大腦的344曾患過MI(％)無343030＞30天2528278-30天131314＜8天282929進程前血管成形術(shù)252022分流術(shù)151416冠狀解剖(％)1血管疾病5451552血管疾病2934313血管疾病161513MI＝心肌梗塞+中間值(第25，75百分分布)表12手術(shù)程序細節(jié)安慰劑濃縮藥丸濃縮藥丸+滲透(N＝696)(N＝695)(n＝708)程序(％)氣囊血管成形術(shù)909090癍塊切除545上述兩者565在手術(shù)室的時間(分鐘)+134，(71，394)129(75，401)141(69，513)使用的對照(ml)+200(150，286)200(150，277)200(150，285)血栓溶解劑(％)3.23.72.3最低的ACT(秒)271(190，345)284(190，371)285(185，388)ACT＝活化的血凝塊時間+中間值(第25，75百分分布)表13主要發(fā)生事件安慰劑濃縮藥丸濃縮藥丸+滲透劑量反應(yīng)(N＝696)(N＝695)(n＝708)P值主要終點*89(12.8％)79(11.4％)59(8.3％)0.009主要終點的組成死12(1.7％)9(1.3％)12(1.7％)0.96非致命性MI60(8.6％)43(6.2％)37(5.2％)0.013緊急PTCA31(4.5％)25(3.6％)6(0.8％)＜0.0001緊急CABG25(3.6％)16(2.3％)17(2.4％)0.177斯坦特4(0.6％)12(1.7％)4(0.6％)0.97氣囊泵1(0.1％)l(0.1％)1(0.1％)0.99*P＝0.009對于趨勢的總體試驗P＝0.43安慰劑組與濃縮藥丸組的比較P＝0.008安慰劑組與濃縮藥丸及滲透組的比較3名死亡的患者被納入這一組，但實際上沒有接受治療MI＝心肌梗塞；PTCA＝經(jīng)皮血管造橋術(shù)或癍塊切除；CABG＝冠狀動脈分流術(shù)表14c7E3Fab對心肌梗塞的效果安慰劑濃縮藥丸濃縮藥丸＋滲透劑量反應(yīng)(N＝696)(N＝695)(n＝708)P值Q波MI(％)2.30.90.80.018大的非Q波MI(％)4.02.42.80.197小的非Q波MI(％)2.32.91.60.342總值(％)8.66.25.20.013MI＝心肌梗塞大的非Q波MI的定義是CK-MB的峰值或總的CK值＞5倍的正常上限；小的非Q波MI的定義是CK-MB的峰值或總的CK值在正常上限3～5倍之間。在3個組中需要進行緊急重復(fù)性血管再造手術(shù)的非致命性局部缺血事件的發(fā)生時間是不同的，并且可以被準(zhǔn)確地確定下來(見圖10)。在安慰劑組中大部分的事件發(fā)生在進行了引導(dǎo)程序后的數(shù)小時內(nèi)，而在使用了濃縮藥丸的組中其發(fā)生的時間是在數(shù)小時以后(約6～12小時)，相應(yīng)于對受體達到最大封閉的時間。在同時使用了濃縮藥丸和滲透的組中，局部失血現(xiàn)象的發(fā)生時間被明顯地推遲了，而且它們的絕對發(fā)生頻率也被明顯地降低了。表15給出的是在住院期間失血并發(fā)癥的輪廓情況。如同對主要終點的效果一樣，也明顯地存在著對失血治療的分級效果。接受了濃縮藥丸以及滲透的患者顯示出在失血率及輸血率上的明顯的升高，而在僅接受了濃縮藥丸的患者中只顯示了中等程度的升高。大部分的失血現(xiàn)象是發(fā)生在冠狀動脈分流手術(shù)時，或在腹股溝血管穿刺的位點，雖然它們的血管修復(fù)手術(shù)的分布情況是基本相等的(在安慰劑組和接受了濃縮藥丸以及滲透的組中為1％，在僅接受了濃縮藥丸的組中為2％)。相似地，在6名患者身上發(fā)生了顱內(nèi)失血現(xiàn)象，2例發(fā)生在安慰劑組中，1例發(fā)生在僅接受了濃縮藥丸的組中，3例發(fā)生在接受了濃縮藥丸以及滲透的組中，其中的一人并沒有接受藥物治療，因為他的顱內(nèi)失血現(xiàn)象是在進行了隨機抽樣以后但是在進行血管成形術(shù)之前發(fā)生的。表15失血并發(fā)癥和血液學(xué)測量安慰劑濃縮藥丸濃縮藥丸＋滲透(N＝696)(N＝695)(n＝708)嚴(yán)重失血(％)*46(7％)76(11％)97(14％)輸血**紅細胞49(7％)92(13％)109(15％)血小板18(3％)29(4％)39(6％)血計數(shù)Nadir血細胞比容35(32，38)34(29，38)33(29，37)Δ血細胞比容5.3(3.2，7.9)6.5(4.2，9.8)6.8(4.1，10.5)指數(shù)1.8(1.1，2.7)2.2(1.4，3.5)2.3(1.4，3.8)Nadir血小板196(159，240)194(153，236)193(154，231)血小板計數(shù)24(3.5％)29(4.2％)42(5.9％)＜100,000*P＝0.001**P＜0.001中間值(第25，75百分分布)在這些治療結(jié)果中，次級臨床癥狀發(fā)生的頻率很低并沒有很大的差別。在安慰劑組、濃縮藥丸組和濃縮藥丸及滲透組中的情況分別是30天心衰發(fā)生率(2.3％，2.4％，2.3％)，持續(xù)的低血壓(3.0％，3.6％，4.1％)，心室纖維性顫動(3.0％，2.6％，3.4％)以及臨床局部缺血的發(fā)生率(21％，17％，18％)。當(dāng)把患者按照急性梗塞、非持續(xù)性絞痛或高度解剖性危險分組治療以評價c7E3Fab的效果時(參見圖11)，在所有3個選定的組內(nèi)都見到了c7E3Fab的有益效果。相似地，其效果在按年齡或性別所分的亞組中都是相同的。雖然其效果對體重較大的患者更為明顯，但是作為體重的一個函數(shù)，c7E3Fab濃縮藥丸及滲透的有益效果在整個患者群中都是存在的。在僅接受了濃縮藥丸的患者中以及接受了濃縮藥丸和滲透的患者中，發(fā)生嚴(yán)重失血的危險性在較輕體重的患者中高于體重較重的患者。在接受了濃縮藥丸及滲透的組、僅接受了濃縮藥丸的組和安慰劑組的患者中，對于體重最輕的患者來說，發(fā)生嚴(yán)重失血的數(shù)字分別是21％、15％和7％，而在體重最重的患者中相應(yīng)地分別為8％、7％和7％。在接受了濃縮藥丸及滲透的組、僅接受了濃縮藥丸的組和安慰劑組的患者中，對于體重最輕的患者來說，接受了輸血的患者的數(shù)字分別是24％、20％和11％，而在體重最重的患者中相應(yīng)地分別為11％、7％和4％。討論這些結(jié)果確認(rèn)了血小板、推測的血小衍生的調(diào)節(jié)子和血小板功能對于那些進行經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動脈成形術(shù)的患者在發(fā)生急性局部缺血的情況下的重要性。在設(shè)計EPIC試驗時，特別考慮了要選擇一組具有高度發(fā)生急性血管堵塞(復(fù)發(fā)性堵塞)和其相伴隨的并發(fā)癥的危險的患者。對于以前的數(shù)據(jù)進行分析可以表明有些患者可以被認(rèn)定為是具有高度危險的患者，依據(jù)的是他們的臨床血栓病癥，例如急性梗塞(Stack，R.S.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，111141-49(1988)，嚴(yán)重的非延續(xù)性絞痛(Myler，R.K.etal.，Circulation，82(SupplII)II-88-II-95(1990))，或血管造影顯示了血栓(Sugrue，D.D.etal.，Br.HeartJ.，5662-66(1986)；Hettleman，B.D.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，15154A(1990))。其他的患者也是高度危險的，依據(jù)的是生理上的因素，例如血管口徑窄小，滲血或血管形態(tài)畸形(Sinclair，I.N.etal.，Am.J.Cardiol.，6161G-66G(1988)；Ruocco，N.A.etal.，Am.J.Cardiol.，6969-76(1992)；Ellis，S.G.etal.，Am.J.Cardiol.，6330-4(1989))。在本試驗中，這兩類患者都有相當(dāng)數(shù)量參加了本試驗，使得我們能夠進一步了解對每一類患者抑制血小板凝聚的內(nèi)在關(guān)系。收取這些高度危險的患者被認(rèn)為會使發(fā)生局部缺血現(xiàn)象在安慰劑組中的發(fā)生率為15％，盡管對每一位患者都給予了阿斯匹林和大劑量的肝素，這一預(yù)測的缺血發(fā)生率幾乎與現(xiàn)實相一致。c7E3Fab使得組成事件的發(fā)生率降低了35％，其主要效果見于進行緊急血管成形術(shù)或緊急冠狀動脈分流術(shù)的需要以及非致命性心肌梗塞都被有效地降低了。c7E3Fab的濃縮藥丸延遲了這些事件的起始時間，相應(yīng)于對血小板凝聚的有效作用時間。然而，過了4～6小時以后，開始發(fā)生局部缺血現(xiàn)象。這一時間間隔相應(yīng)于在給予鼠c7E3Fab濃縮藥丸之后，血小板凝聚恢復(fù)到其初始值的約50％時的時間間隔。除了延遲效果外，聯(lián)合使用對血小板產(chǎn)生長效抑制的(見實施例4)濃縮藥丸和滲透還能夠防止急性局部缺血事件的發(fā)生。組成終點提供了對在進行血管成形術(shù)期間的局部缺血現(xiàn)象的這種治療方法的總體評價。本試驗中最重要的發(fā)現(xiàn)之一是在不同的終點時的緩解效果的一致性。對心肌梗塞的緩解是實質(zhì)性的，并且與同時的對此后需要進行緊急臨床搶救的降低是一致的。就經(jīng)皮冠狀動脈術(shù)的評價而言，對非致命性梗塞的分類是一項重要的任務(wù)。經(jīng)常發(fā)現(xiàn)肌酸激酶MB異化酶高于正常上限，在所報導(dǎo)的情況中有4％～21％的患者發(fā)生了這種情況(Klein，L.W.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，17621-6(1991)；Hunt，A.C.etal.，Eur.HeartJ.，12690-3(1991)；Pauletto，P.etal.，Am.J.Cardiol.，69999-1000(1987)；Spadaro，J.J.etal.，Cath.Cardiovasc.Diagn.，12230-4(1986))。當(dāng)這些酶的升高并不與相應(yīng)的臨床癥狀完全一致時，就沒有記載到出現(xiàn)長期的有害結(jié)果。因此，防止那些沒有伴隨著臨床局部缺血事件的孤立的酶的升高就可能不具有非常深遠的意義。為了保證在這一模糊區(qū)的客觀性，就要有系統(tǒng)地采集酶和心電圖數(shù)據(jù)，采用盲點終點委員會，并且要確認(rèn)心肌梗塞就要求心肌特異性酶的提高至少要達到3倍以上。c7E3Fab降低所有情況的心肌梗塞，包括那些伴隨著中等程度的酶的升高、大量的酶的升高和產(chǎn)生Q波的心肌梗塞這一現(xiàn)象，再次確認(rèn)了那些被防止的病狀的臨床重要性，特別是進行緊急冠狀動脈再造手術(shù)的需要也被降低了。雖然沒有預(yù)期到也沒有觀察到對死亡率的作用，但因注意的是在濃縮藥丸和滲透組內(nèi)有3名沒有接受藥物的患者死亡。根據(jù)以治療為目的的原則，將這些死亡事件在主要分析中進行處理。所有的其他的死亡的患者都實際上接受了為他們選定的治療。由于與血管成形術(shù)所伴隨的死亡率很低，因此要確認(rèn)對死亡率產(chǎn)生25％有益或有害治療效果，就需要進行對20,000名以上的患者的試驗。GPIIb/IIIa受體封閉對在高度危險的血管成形手術(shù)中的臨床終點的有益效果是令人信服的，并且與近期開始進行的用同樣的抗體在復(fù)發(fā)性非持續(xù)性絞痛患者的血管成形術(shù)的實驗的良性結(jié)果相一致(Simoons，M.L.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，21269A(1993))。由于本試驗是第一次的大規(guī)模的IIb/IIIa受體封閉試驗，因此就存在著對其引起血小板減少癥的危險的關(guān)注。然而c7E3Fab僅產(chǎn)生了很小的、臨床上非顯著的血小板減少癥的增加。特別是，對這一試驗結(jié)果的分析揭示出在接受了濃縮藥丸及滲透的治療組內(nèi)有更多的患者(5.2％)發(fā)生了血小板減少現(xiàn)象(血小板計數(shù)＜100,000/μL)，高于濃縮藥丸治療組(3.6％)和安慰劑組(3.4％)。因此，與安慰劑組相比，在濃縮藥丸及滲透處理組中的血小板減少現(xiàn)象的發(fā)生(血小板計數(shù)＜100,000/μL)被提高了(P＝0.062)。嚴(yán)重的血小板減少癥(血小板計數(shù)＜50,000/μL)發(fā)生在濃縮藥丸及滲透處理組中的11名患者中(1.6％)，在安慰劑組中有5名(0.7％)患者發(fā)生了這一現(xiàn)象。在濃縮藥丸及滲透組和安慰劑組中各僅有4名患者(＜1％)同時發(fā)生血小板減少癥和嚴(yán)重的、危及生命的或致死性負作用。所有的血小板減少癥的情況都是短暫的，并且一般都發(fā)生在最初的幾天內(nèi)。在治療的患者中，失血并發(fā)癥和輸血都有明顯的增加。這一增加主要是在股穿刺位點的失血的結(jié)果，并且在這3組中都沒有導(dǎo)致Nadir血細胞比容或危及生命的并發(fā)癥的明顯的變化。無論是否將進行手術(shù)的患者包括或不包括在本分析中，這些趨勢都保持不變。在本盲點研究中，由于對所采用的治療方案的不確定性，就可能導(dǎo)致在某些試驗地區(qū)出于對止血的關(guān)心而降低了進行輸血的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)我們以往的經(jīng)驗，已經(jīng)得到證實的是經(jīng)過重新修訂的用于處理失血和對接受了溶血劑的患者進行輸血的守則，可以有效地減少使用血制品(Wall，T.C.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，21597-603(1993))。作為體重函數(shù)的治療效果與失血危險之間的相互作用實際上比預(yù)期的更為復(fù)雜。雖然在安慰劑組患者中主要癥狀的發(fā)生率和嚴(yán)重失血的危險性依據(jù)體重的變化是很小的，但是在c7E3Fab濃縮藥丸組和濃縮藥丸及滲透組的患者中非常清楚地存在著隨體重的降低而發(fā)生主要結(jié)果癥狀的增高和嚴(yán)重失血增高的趨勢。在進行經(jīng)皮血管擴張術(shù)之前、之中或之后對患者臨床采用本封閉GPIIb/IIIa受體的方法的判定要依據(jù)避免局部缺血現(xiàn)象對給予的血產(chǎn)品的相對平衡值來決定。在參加本試驗的高度危險的患者中，這一平衡表現(xiàn)出對患者是有益的。急性心肌梗塞和緊急重復(fù)血管擴張術(shù)的預(yù)后影響是嚴(yán)重的，幸運的是，進行輸血的要求繼續(xù)下降(Donahue，J.G.etal.，N.Engl.J.Med.，327369-73(1992)；Dodd，R.Y.N.Engl.J.Med.，327419-21(1992)；Nelson，K.E.etal.，Ann.Intern.Med.，117554-9(1992))。努力采用降低不必要的失血和輸血以及更有效地使用抗血栓劑的實際計算方法，包括抗血栓劑和抗血小板劑，應(yīng)該可以進一步提高在本試驗中所觀察到的臨床效果。在實踐中，對那些帶器械的患者給予有效的、非腸道抗血栓劑時，必須注重依其體重來調(diào)節(jié)抗血栓藥劑的劑量(例如，肝素的劑量在此并不依據(jù)體重而進行調(diào)節(jié))。在所有參加本試驗的地區(qū)內(nèi)采用更加詳細的確定降低失血的方法的守則和評價方法，可以獲取更多的關(guān)于失血并發(fā)癥發(fā)生的信息。在患者群中，廣泛的有效治療的一致性是血栓形成在很多患者中為更重要因素的強有力的證據(jù)，盡管在某些病例中突然阻塞可能是血栓性的或生理性的。由濃縮藥丸劑所產(chǎn)生的對發(fā)病的延遲以及由濃縮藥丸和滲透共同產(chǎn)生的對發(fā)病的防止，都意味著在大多數(shù)情況下受到損害的動脈的表面都在本程序之后的18～24小時喪失了其血栓形成功能。實際治療方案中應(yīng)該考慮到在有高度危險發(fā)生急性血管堵塞的患者中對持續(xù)的抗血栓效果的需求。總而言之，本試驗表明了在進行高度危險的經(jīng)皮血管擴張手術(shù)的患者中提供有效的、持續(xù)的對GPIIb/IIIa受體的封閉可以降低和/或防止復(fù)發(fā)性閉塞及突發(fā)性堵塞。雖然這一有益效果的獲取是以增加失血的危險性為代價的，但是基于臨床的和本程序前所做的血管造影的預(yù)測，對于那些患有急性局部缺血并發(fā)癥危險的病人采取這種治療方法所得到的總體臨床效果則是對患者有益的。本試驗首次為抑制細胞組分的功能提供了真實有效、意義深遠的治療方法，并為將來在生物技術(shù)上選擇其它的細胞組分(integrin)目標(biāo)以及對這一特異性GPIIb/IIIa采取非抗體的或多肽方法鋪設(shè)了寬廣的道路。實施例7冠狀動脈手術(shù)后早期使用抗GPIIIb/IIIa嵌合抗體片段降低臨床復(fù)發(fā)性狹窄在進行了氣囊血管成形術(shù)或經(jīng)皮冠狀動脈手術(shù)后發(fā)生的重復(fù)狹窄是極為常見的，在術(shù)后的6個月內(nèi)，有25％的病例導(dǎo)致了絞痛癥狀的重復(fù)發(fā)生以及需要重復(fù)進行血管擴張術(shù)，其總的花費在美國每年高于20億美元(Popma，J.J.etal.，Circulation，841426-1436(1991)；Topol，E.J.etal.，Circulation，871489-1497(1993)Herrman，J.-P.R.etal.，Drugs，46249-262(1993))。重復(fù)狹窄的主要生物學(xué)起因是血管壁的損傷，由擴張的氣囊或手術(shù)器械在手術(shù)位點造成，以及伴隨著的血小板凝聚的形成和內(nèi)側(cè)平滑肌細胞從它們的休止與收縮狀態(tài)到可移動、繁殖和分泌功能狀態(tài)的表形上的改變(Forrester，J.S.etal.，J.Am.Coll.Cardiol..17758-769(1991)；Ip，J.H.etal.，J.Am.Coll.Cardiol..1777B-88B(1991)；Casscells，W.，Circulation，86723-729(1993))。盡管已經(jīng)有不同的藥物制劑在調(diào)節(jié)血管壁損傷后的特征性肌內(nèi)膜生長的試驗中為成功性的，而且小型研究也建議它們可帶來在血管造影上的有益效果，但是迄今為止還沒有一個大規(guī)模的臨床試驗在患者中證實了藥劑的有效性，而且也沒有已知的能夠降低這些病狀的藥物治療(Popma，J.J.etal..Circulation，841426-1436(1991)；Herrman，J.-P.R.etal.，Drugs，461489-1497(1993)；Herrman，J.-P.R.etal.，Drugs，46249-262(1993)；MercatorStudyGroup，Circulation，86100-110(1992))。冠狀動脈血管成形術(shù)是一種常規(guī)手術(shù)并輔助于口服阿斯匹林和靜脈內(nèi)注射肝素。然而，這種抗血栓方法只能對血小板的凝聚產(chǎn)生很弱的抑制。很多不同的拮抗劑包括凝血酶、膠原蛋白和二磷酸腺苷都可以激發(fā)血小板，甚至在有阿斯匹林存在時也是如此。對血小板的分子生物學(xué)的研究已經(jīng)闡明了GPIIb/IIIa組分是負責(zé)血小板凝聚的受體(Plow，E.F.etal.，Prog.Hemostas.Thromb.，296320-331(1988)；Coller，B.S.J.Clin.Invest.，76101-108，(1985))。嵌合7E3抗體的Fab片段，選擇性地與血小板的IIb/IIIa組分結(jié)合。當(dāng)最初的研究確認(rèn)了嵌合單克隆抗體Fab片段的初步安全性和有效性后，就在2,099名患者中進行了多中心、雙盲、安慰劑控制的試驗(見實施例6)。除了在急性狀態(tài)下的嚴(yán)重局部缺血現(xiàn)象得到降低的主要有效終點，即代表著對急性堵塞的抑制(見實施例6)之外，還確定了c7E3能夠降低臨床重復(fù)狹窄的發(fā)生，正如在其后6個月的追蹤期內(nèi)的局部缺血或進行重復(fù)血管擴張的需要的結(jié)果而證實的那樣。方法本研究的人群和守則的詳情都如實施例6中所述。簡而言之，合適的病人是指曾經(jīng)進行過冠狀動脈成形或定向性癍塊切除并正在發(fā)生或近斯內(nèi)發(fā)生過心肌梗塞、非頑固性絞痛或高度危險的血管造影損傷形態(tài)的患者，正如美國心臟學(xué)會/和美國心內(nèi)科學(xué)院的標(biāo)準(zhǔn)所定義的那樣(ACC/AHATaskForceReport，J.Am.Coll.Cardiol.，12529-545(1988))。排除的原則是失血性素質(zhì)、年齡≥80歲、近兩年內(nèi)曾經(jīng)發(fā)生過中風(fēng)或在過去的6周內(nèi)曾進行過重大手術(shù)。該守則在所有56個參加的地點都得到了該處的學(xué)術(shù)審查委員會的批準(zhǔn)，并且或得了所有的患者的同意?；颊呖诜⑺蛊チ?325mg/天)，第一次服藥是在程序開始的至少2小時前進行。靜脈注射肝素是在程序中進行的，為的是獲得至少300秒的活化凝血塊的時間。除了阿斯匹林和肝素以外，患者隨機地被給予下述3種處理中的一種(1)安慰劑濃縮藥丸和12小時的安慰劑滲透；(2)0.25mg/kg的活性c7E3(Centocor，Malvern，PA)的濃縮藥丸和12小時的安慰劑滲透；或(3)同樣劑量的活性c7E3濃縮藥丸并隨后立即進行12小時的10μg/分的c7E3滲透。濃縮藥丸的服用是在冠狀動脈手術(shù)程序開始前的10分鐘進行的。主要終點是30天內(nèi)的任何一種原因造成的死亡，其原因有心肌梗塞、對急性局部缺血進行的冠狀動脈分流術(shù)、對急性局部缺血進行重復(fù)的經(jīng)皮冠狀動脈手術(shù)，為了治療局部缺血而進行主動脈內(nèi)的氣囊泵放置和腔內(nèi)斯坦特。所有這些現(xiàn)象都由一個獨立的臨床終點委員會來進行審核，該委員會在整個研究期間內(nèi)是盲目的，而且對每一癥狀進行分類時至少得有2個審查委員的一致意見。在隨后的6個月的追蹤期內(nèi)繼續(xù)保持雙盲。除了隨后的死亡或致命性心肌梗塞之外對患者們進行追蹤，以確定進行包括經(jīng)皮冠狀動脈手術(shù)或冠狀動脈分流術(shù)或進行這兩種手術(shù)的重復(fù)性血管擴張的需要。與急性階段終點不同，放入斯坦特或在主動脈內(nèi)置入氣囊泵都不被包括在這一結(jié)果內(nèi)，因為本方法所注重的是進行血管擴張的需要，而不是作為突然局部缺血的替代品。出院后的心肌梗塞的確診的條件是兩個或更多個相鄰的電極上有新的顯著的Q波≥0.04秒或比相應(yīng)的R放大波的深度≥1/4的深度；或者肌酸激酶或肌酸激酶心肌帶超過正常上限的2倍以上。收集血管擴張的數(shù)據(jù)以及最初的目標(biāo)血管是否經(jīng)過了重復(fù)的手術(shù)或經(jīng)皮血管擴張的數(shù)據(jù)。追蹤的完成率是97.2％。為了評價6個月的調(diào)查結(jié)果是否與緊急階段的結(jié)果不同，在所進行的分析中就包括了從開始到6個月期間的所有發(fā)病情況，接受了成功的早期手術(shù)的患者的30天終點以后的發(fā)病情況(其定義為根據(jù)臨床醫(yī)生的檢測證實獲得了最后的狹窄小于50％并且沒有局部失血并發(fā)癥)，以及接受了成功的早期手術(shù)的患者的48小時以后的發(fā)病情況。對于30天終點的選擇依據(jù)的是以前的很多心血管手術(shù)試驗的病例。以48小時為一階段點，是因為已知定義限定的幾乎所有的冠狀動脈手術(shù)后的急性堵塞病狀都是在這一個期間內(nèi)發(fā)生的(Detre，K.M.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，13230A(1989)；Lincoff，A.M.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，19926-938(1992)；deFeyter，P.J.etal.，Circulation，83927-936(1991))。通過公爵大學(xué)(DukeUniversity)的數(shù)據(jù)采集中心用電話隨機對患者進行采訪。隨機性是按照研究地點以及患者是否患有急性心肌梗塞而進行的區(qū)分。這些數(shù)據(jù)被研究調(diào)查員記錄到6個月的病歷表格上，并且在數(shù)據(jù)輸入前由本研究的盲點監(jiān)察人員對表格的質(zhì)量進行監(jiān)察。本研究的主持人對于隨機抽樣的密碼以及追蹤調(diào)查結(jié)果一直為盲目的，直至所有的追蹤調(diào)查完畢，并且所有的病例都被臨床終點委員會進行了判斷，從而完成了數(shù)據(jù)庫的建立。統(tǒng)計學(xué)分析所有的治療之間的比較都是按以治療為目的的原則進行的。對發(fā)病率的評價采用了Kaplan-Meier方法(Kaplan，E.L.andP.Meier，J.Am.Stat.Assn.，53457-481(1958))，并且以存活曲線用圖示的方法表示其結(jié)果。采用常規(guī)化的對數(shù)級別統(tǒng)計方法(log-rankstatistic)對安慰組、濃縮藥丸組、濃縮藥丸及滲透組的發(fā)病率進行了劑量反應(yīng)的檢測(結(jié)果分別為0，1和2)。對安慰劑組與采用了c7E3的各組之間的比較也采用了對數(shù)級別統(tǒng)計的方法。部分危害模型(Proporstionalhazardsmodels)(Cox)適用于判定起始病征與結(jié)果之間是否存在著因果關(guān)系的檢驗。這些都是結(jié)合了治療差異模式在所有的治療組中進行的，并且對各治療組分別進行了檢驗以確定他們之間的差異。此外，部分危害回歸模式(Proporstionalhazardsregressionmodels)(Cox)適用于所有的在48小時追蹤后的組成終點以判定那些與后來發(fā)生的病狀或治療效果有關(guān)的因子。本分析中的這些因子包括治療方案，進行過血管擴張的單一損傷或多重損傷，治療期間的長短，在開始時的心肌梗塞或非頑固性絞痛或其它的高度危險的入選病狀，性別，年齡≥65歲或＜65歲，體重以及糖尿病。結(jié)果病人的選取從1991年12月1日開始直到1992年11月18日截止，共選擇了2099名患者。在整個研究中的各種特征都在以上給出了(見實施例6，表10)。表16給出的是那些曾經(jīng)進行了成功的先期血管成形術(shù)或癍塊切除術(shù)并使他們能夠入選為以后發(fā)生臨床重復(fù)狹窄的患者的初始病癥。在那些曾經(jīng)進行了成功的先期手術(shù)的患者的起始病癥中并沒有由于治療方案而造成的顯著差異。表16進行過成功的先期手術(shù)的患者的人口學(xué)特征安慰劑濃縮藥丸濃縮藥丸及滲透(N＝609)(N＝605)(N＝620)年齡(年)60.0±10.359.7±10.460.2±10.6性別(％)430(71.7％)434(71.7％)445(71.8％)體重(公斤)84.9±16.083.5±16.583.3±15.7危險因素(％)糖尿病155(25.8％)146(24.1％)139(22.4％)高血壓321(53.7％)329(54.8％)314(50.8％)高膽固醇316(52.7％)337(55.7％)324(52.3％)吸煙377(64.7％)428(71.8％)423(69.5％)血管疾病外周的47(7.9％)52(8.7％)52(8.5％)大腦的21(3.5％)19(3.1％)27(4.4％)曾經(jīng)患過MI(％)無275(45.8％)239(39.5％)253(40.8％)＞30天109(18.2％)126(20.8％)128(20.6％)8-30天45(7.5％)55(9.1％)57(9.2％)＜8天171(28.5％)185(30.6％)182(29.4％)進程前血管成形術(shù)145(24.3％)121(20.0％)139(22.6％)分流術(shù)88(14.7％)85(14.0％)95(15.3％)冠狀解剖(％)1血管疾病337(56.2％)324(53.6％)354(57.1％)2血管疾病170(28.3％)198(32.7％)191(30.8％)3血管疾病93(15.0％)83(13.7％)75(12.1％)手術(shù)種類氣囊540(90.0％)549(90.7％)561(90.5％)癍塊切除(atheretomy)37(6.2％)27(4.5％)34(5.5％)上述兩者23(3.8％)29(4.8％)25(4.0％)目標(biāo)血管LAD241(40.2％)229(37.9％)262(42.3％)LCX144(24.0％)159(26.3％)165(26.6％)RCA234(39.0％)253(41.8％)219(35.3％)LeftMain4(0.7％)1(0.2％)3(0.5％)移植35(5.8％)35(5.8％)43(6.9％)接受了c7E3濃縮藥丸的患者以及接受了c7E3濃縮藥丸及滲透的患者們都顯示了明顯的失血并發(fā)癥的升高，主要發(fā)生在第一個48小時內(nèi)，并且其輸血率幾乎增加了一倍(安慰劑組7％，濃縮藥丸且13％，濃縮藥丸及滲透組15％，P＜0.001)。12小時的連續(xù)滲透在下述患者中沒有進行完全，安慰劑組中48名患者(7.0％)，濃縮藥丸組85名患者(12.5％)，濃縮藥丸及滲透組患者107名(15.8％)。在接受了c7E3的患者中沒有見到血小板減少癥或過敏反應(yīng)的升高。人抗嵌合抗體(HACA)的陽性反應(yīng)在濃縮藥丸組中為5.2％，在濃縮藥丸及滲透組中為6.5％。大多數(shù)產(chǎn)生陽性HACA反應(yīng)的患者都是低效價的反應(yīng)。濃縮藥丸組中產(chǎn)生陽性HACA反應(yīng)的全部32名患者的效價都≤1∶1600。濃縮藥丸及滲透組中產(chǎn)生陽性HACA反應(yīng)的全體40名患者中的34名的效價都≤1∶1600。在濃縮藥丸及滲透組中有6名患者的HACA效價在1∶6400與1∶51200的范圍內(nèi)，而在濃縮藥丸組中沒有發(fā)生這種現(xiàn)象。到30天時，與安慰劑組(12.8％，P＝0.009)相比，接受了c7E3濃縮藥丸及滲透的患者(8.3％)中的嚴(yán)重局部缺血現(xiàn)象(死亡，心肌梗塞，急性血管擴張術(shù))被降低了35％(見實施6，表13)。表17給出的是6個月的數(shù)據(jù)，其中有死亡、心肌梗塞、以及需要進行冠狀動脈分流術(shù)或重復(fù)性冠狀動脈手術(shù)的結(jié)果，并且伴隨針對下列各種情況的血管擴張手術(shù)(a)所有入選的患者，(b)入選后的48小時內(nèi)沒有局部缺血并發(fā)現(xiàn)象但又進行了成功的治療的患者，和(c)那些進行了成功的先期治療并在第一個30天內(nèi)沒有發(fā)生病癥的患者。到6個月時局部缺血現(xiàn)象和血管擴張手術(shù)被降低了23％(27％對35％，P＝0.001；見表17，所有入選的患者，死亡、MI、CABG、PTCA)。造成這種有益的長期效果的主要原因是在那些進行了先期成功的手術(shù)的患者中降低了對再次進行分流手術(shù)或血管成形術(shù)的需要，正如重復(fù)進行的目標(biāo)血管擴張在c7E3濃縮藥丸及滲透組中(16.4％)與安慰劑組中(22.3％)相比所顯示的被降低而證實(P＝0.007；見表17)。在僅采用了濃縮藥丸的組的結(jié)果，根據(jù)本實驗的標(biāo)準(zhǔn)而言并沒有產(chǎn)生比安慰劑組強很多的結(jié)果，并且是非顯著性的。在另外的一個分析中，對所有的在30天內(nèi)沒有經(jīng)歷主要病狀的患者的6個月的數(shù)據(jù)進行了研究。這一分析的結(jié)果列于表18。這些數(shù)據(jù)指出在那些接受了c7E3濃縮藥丸及滲透的患者中，需要進行重復(fù)性血管擴張術(shù)的患者降低了21％。表176個月的結(jié)果安慰劑濃縮藥丸濃縮藥丸及滲透P值(N＝696)(N＝695)(N＝708)所有受試患者死亡(％)3.42.63.00.827MI(％)10.58.06.90.016CABG(％)11.09.79.40.339PTCA(％)20.819.814.30.001復(fù)合死亡，MI，CABG，PTCA(％)35.032.426.90.001任何血管擴張術(shù)(CABG/PTCA)(％)29.427.223.10.008目標(biāo)血管重復(fù)擴張(％)22.320.816.40.007所有進行了成功的手術(shù)的患者在48小時(N＝606)(N＝618)(N＝639)死亡(％)2.72.33.00.664MI(％)2.62.42.50.860CABG(％)7.67.47.00.701PTCA(％)16.417.211.50.010復(fù)合死亡，MI，CABG，PTCA(％)25.324.119.10.007任何血管擴張術(shù)(CABG/PTCA)(％)23.022.518.00.025(所有患者)(N＝636)(N＝655)(N＝666)目標(biāo)血管重復(fù)擴張(％)18.9％18.4％15.6％0.134所有進行了成功的手術(shù)的患者在30天(N＝549)(N＝576)(N＝598)死亡(％)1.71.31.50.789MI(％)2.01.91.70.716CABG(％)5.65.74.70.438PTCA(％)12.514.410.00.180復(fù)合死亡，MI，CABG，PTCA(％)19.220.115.20.072任何血管擴張術(shù)(CABG/PTCA)(％)18.418.314.60.077目標(biāo)血管重復(fù)擴張(％)16.816.414.30.265表18在所有30天時沒有發(fā)生病狀的患者的6個月時的結(jié)果安慰劑濃縮藥丸濃縮藥丸及滲透P值(N＝601)(N＝611)(N＝643死亡(％)1.81.31.00.38MI(％)2.42.52.20.85CABG(％)5.95.54.40.24PTGA(％)13.814.810.70.12CABG/PTCA(％)18.418.314.60.077復(fù)合死亡19.519.615.40.059MI，CABG，PTCA(％)從基線時的復(fù)合情況34.832.226.90.001(包括0-30天)(％)所有受試患者的所有病狀的數(shù)據(jù)(死亡，非致命性梗塞或需要進行冠狀動脈擴張術(shù))還在圖12中給出。那些進行了成功的手術(shù)并且在30天內(nèi)沒有發(fā)生病癥的患者的數(shù)據(jù)還在圖13中給出。對急性階段終點而言，81的病狀是在前48小時發(fā)生的。這一情況在所有各受試組都是相似的(安慰劑組82.0％，濃縮藥丸組79.7％，濃縮藥丸及滲透組是81.4％)。參考在進行了成功的先期手術(shù)的患者的第一個48小時內(nèi)發(fā)生病狀的情況，就可以確定在第1個30天內(nèi)所要進行的目標(biāo)血管擴張術(shù)。正如在圖14中所示，對于c7E3濃縮藥丸組和c7E3濃縮藥丸及滲透組之間的亞急性局部缺血病狀直到30天以后才有明顯的差異。除了對包括沒有進行先期治療的血管的復(fù)合死亡，心肌梗塞和血管擴張術(shù)進行分析外，對目標(biāo)血管擴張術(shù)進行單項分析也是很有意義的。對所有患者在6個月時而言，目標(biāo)血管擴張在濃縮藥丸及滲透組中比其他受試各組明顯地降低了26％(見圖15)。值得注意的是，按照本試驗的條件進行追蹤調(diào)查的結(jié)果顯示出僅采用濃縮藥丸的治療并沒有對目標(biāo)血管擴張造成任何影響。在開始時對亞組間的分析以區(qū)別具有急性冠狀綜合癥(非頑固性絞痛，最近的或急性的心肌梗塞)的患者與那些患有頑固性絞痛但沒有高度危險的血管形態(tài)的患者(表19)。這一研究表明在這兩個亞組中對復(fù)合事件都有顯著的降低效果，但是，對需要重復(fù)進行冠狀動脈手術(shù)的降低只在患有頑固絞痛的患者中為顯著的(表19)。這一發(fā)現(xiàn)在進行了成功的手術(shù)的患者中的開始及48小時的結(jié)果之間是一致的。表19對急性冠狀動脈綜合癥與頑固性絞痛患者的亞組的分析從開始至6個月的事件安慰劑濃縮藥丸濃縮藥丸及滲透P值急性冠狀動脈綜合癥N288306299復(fù)合事件33.1％28.8％25.5％0.039重復(fù)PTCA20.2％16.9％15.4％0.129頑固性絞痛N408389409復(fù)合事件36.3％35.3％28.0％0.012重復(fù)PTCA21.3％22.1％13.5％0.004從48小時至6個月時的事件急性冠狀動脈綜合癥N252277271復(fù)合事件23.5％21.4％17.8％0.094重復(fù)PTCA14.8％15.2％11.9％0.325頑固性絞痛N354341368復(fù)合事件26.6％26.4％20.0％0.034重復(fù)PTCA17.5％18.7％11.1％0.013討論從本大規(guī)模、多中心、隨機試驗所獲得的結(jié)果證實了在接受了濃縮藥丸及滲透以封閉血小板IIb/IIIa部分的進行冠狀動脈治療的患者中使復(fù)發(fā)性狹窄的臨床發(fā)生得到了降低。其有益效果的程度在6個月時為大約23％，包括所有的局部缺血事件，例如死亡、非致命性心肌梗塞和重復(fù)血管擴張術(shù)，而在目標(biāo)血管擴張術(shù)上的降低為26％。這些使用c7E3濃縮藥丸及12小時滲透所獲得的有益效果使急性堵塞和急性階段負反應(yīng)結(jié)果被降低到不需要進行后來的冠狀動脈血管擴張術(shù)的程度。在本試驗中所用的單克隆Fab片段對血小板IIb/IIIa表面部位有非常有效的結(jié)合性并且很少被解脫下來。前述的對接受了c7E3并進行血管成形術(shù)的患者的研究表明在終止抗體的滲透以后還持續(xù)存在著對IIb/IIIa結(jié)合位點的至少36～48小時的占據(jù)，以及對血小板凝聚的至少72小時的抑制(見實施例4；又見，Ellis，S.G.etal.，Cor.Art.Dis.，41675-175(1993)；Tcheng，J.E.etal.，Circulation，88(1993))。雖然這些效果都隨時間逐步消失并回到基線值，但是c7E3對血小板凝聚的抑制效果的期間是非常有意義的，因為在本試驗的條件和標(biāo)準(zhǔn)下，濃縮藥丸及安慰劑滲透的治療中沒有觀察到在急性階段或6個月的結(jié)果中產(chǎn)生明顯的臨床效應(yīng)。這一觀察結(jié)果指明通過使用抗GPIIb/IIIa抗體來降低急性局部缺血或臨床復(fù)發(fā)性狹窄可能需要更長時間的接受這些制劑(正如采用濃縮藥丸及滲透藥物所示)，而且更長期地對GPIIb/IIIa的抑制可以產(chǎn)生進一步改進的治療效果。還值得注意的是，c7E3還被報導(dǎo)可與玻連蛋白受體相結(jié)合(Hynes，R.O.，Cell，6911-25(1992))，其原因可能是該受體含有GPIIb/IIIa的β3成分。這一玻連蛋白受體(vitronectin)可能參與對狹窄或復(fù)發(fā)性狹窄的調(diào)節(jié)，將抗GPIIb/IIIa的物質(zhì)與該受體結(jié)合可能有助于所觀察到的效果。其他GPIIb/IIIa受體的抑制物具有對目標(biāo)及同源成分的不同程度的特異性(Sutton，J.etal.，ClinicalResearchAFCR，41118A(1993))。進行比較試驗可以將這些分子相互作用分解到與之相應(yīng)的臨床效果。在本試驗中，沒有進行系統(tǒng)性的6個月的重復(fù)血管造影檢驗以定量地確定各受試組中的效果。雖然重復(fù)的血管造影在很多的重復(fù)狹窄試驗中都被進行了(Forrester，J.S.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，17758-769(1991)；Ip，J.H.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，1777B-88B(1991)；Casscells，W.，Circulation.86723-729，(1993)；Topol，E.J.etal.，N.Engl.J.Med.，329228-233(1993)；Adelman，A.G.etal.，N.Engl.J.Med.，329228-233(1993)；Serruys，P.W.etal.，Circulation，841568-1580(1991))，但是它有一個主要的缺陷，即在無癥狀的患者中對目標(biāo)血管狹窄的診治經(jīng)常會導(dǎo)致在實際上不需要進行的重復(fù)的治療。與之相反，本試驗提供了對大量患者的臨床實際治療的一種模擬。復(fù)發(fā)狹窄試驗的真正目的是顯示對需要重復(fù)血管擴張術(shù)的顯著降低，因為最近進行的一些復(fù)發(fā)狹窄試驗記錄中的血管造影效果的本身并不是與臨床完全相關(guān)的或單項適合的。進而言之，由于死亡及心肌梗塞在接受了經(jīng)皮冠狀動脈治療的患者中并不是很常見的，因此由有效的藥物治療調(diào)節(jié)所得到的最重要的效果應(yīng)該是重復(fù)的目標(biāo)血管擴張術(shù)，正如在本試驗所見到那樣。因為在本試驗中的患者們接受的治療除了在使用的藥物、濃縮丸和滲透不一樣以外，在其他的方面包括在追蹤調(diào)查完成之前始終保持雙盲性方面都是一樣的，因此可以合理地得出的結(jié)論是對復(fù)發(fā)性狹窄的降低產(chǎn)生了所觀察到的臨床的有益的效果。這就顯示了本第一次的大型隨機試驗表現(xiàn)出在是否需要進行隨后的血管擴張術(shù)方面的有益的臨床降低效果，并且可被解釋為在臨床上更少地發(fā)生了復(fù)發(fā)性狹窄。這些結(jié)果是通過IIb/IIIa封閉劑的濃縮藥丸及滲透而達到的，并且導(dǎo)致受傷血管壁的真正的愈合。盡管c7E3的滲透只進行了12小時，但這種制劑的抗血小板效果可以延續(xù)數(shù)天，而且在急性階段沒有發(fā)現(xiàn)重復(fù)發(fā)生局部缺血事件的證據(jù)。更重要的是在6個月時降低目標(biāo)血管擴張術(shù)的獨立的有益效果表明緊急c7E3藥物治療的持續(xù)效應(yīng)，并且可以被認(rèn)作是血管壁愈合的臨床證據(jù)。用血小板IIb/IIIa封閉而使臨床復(fù)發(fā)狹窄被降低這一現(xiàn)象進一步地說明了血小板凝血在復(fù)發(fā)性狹窄中的作用，而這種血小板凝聚已經(jīng)被認(rèn)為是在血管成形術(shù)后或內(nèi)皮受傷的新內(nèi)膜損傷發(fā)生的關(guān)鍵(Schwartz，R.S.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，201284-1293(1992)；Toppl，E.J.MayoClin.Proc.，6888-90(1993)；Willerson，J.T.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8810624-10628(1991))。雖然內(nèi)側(cè)平滑肌細胞的增殖也可能在復(fù)發(fā)性狹窄中扮演非常重要的角色(Forrester，J.S.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，17758-769(1991)；Ip，J.H.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，1777B-88B(1991)；Casscells，W.，Circulation，86723-729，(1993))，但本試驗的結(jié)果表明，有效的抗血小板及抗凝血途徑可能是對這一重要的臨床現(xiàn)象為非常有益的。本試驗支持了這樣一種觀點，即現(xiàn)行的使用阿斯匹林作為唯一的抗血小板劑在冠狀動脈治療中(Schwartz，L.etal.，N.Engl.J.Med.，3181714-1719(1988))是非常不夠的，無法完成血管損傷的血小板反應(yīng)的拮抗。實施例8隨機性雙盲安慰劑對照試驗的其它發(fā)現(xiàn)管鞘尺立和失血并發(fā)癥用EPIC試驗(見實施例6和7)對失血并發(fā)癥進行分析，確定在進行PTCA/DCA時管鞘尺寸是否與失血并發(fā)癥相關(guān)。管鞘尺寸及導(dǎo)向?qū)Ч艿某叽缡怯舍t(yī)生臨床決定的。對主要的失血現(xiàn)象，如腹股溝失血、輸血、血管修補、nadirHct作了預(yù)測的分析。盡管對已知失血預(yù)測因素進行了調(diào)整，包括插入導(dǎo)管期間使用的肝素以及治療方案(P＝0.0004)，管鞘尺寸仍舊可以預(yù)測腹股溝的失血。較多的血管的修復(fù)伴隨著較大的管鞘尺寸這一傾向并非顯著性的(P＝0.0004)。嚴(yán)重失血(10.5％)、輸血(11.8％)和nadirHct(34％)并不依據(jù)管鞘的尺寸而變化。接受了c7E3Fab的患者發(fā)生比不接受c7E3Fab的患者有更多的腹股溝失血(55％vs.30％，P＜0.0001)。6F-7.5F8F-8.5F9F-llFn＝375n＝1416n＝291腹股溝失140(38％)674(48％)147(51％)血管修復(fù)5(1.3％)17(1.2％)7(2.4％)這些結(jié)果表明大尺寸的管鞘伴隨著更多的腹股溝失血但并不影響PTCA/DCA的嚴(yán)重失血并發(fā)癥。c7E3與腹股溝的失血增加有關(guān)，但是可以通過采用較小尺寸的管鞘和導(dǎo)向?qū)Ч芏怪钚』?。冠狀動脈治療中抑制血小板GPIIb/IIIa受體后的局部缺血現(xiàn)象與失血現(xiàn)象的關(guān)系EPIC(評價c7E3在防止局部缺血并發(fā)癥中的作用)試驗(見實施例6和7)表明用c7E3Fab這種血小板受體GPIIb/IIIa的有效拮抗劑的治療，可以防止在進行高度危險的冠狀動脈成形術(shù)(PTCA)時的局部缺血并發(fā)癥，但是對于其失血現(xiàn)象則需要將輸血從安慰劑組的7％升高到c7E3Fab組的14％。為了對其進行更深一步的調(diào)查，對失血指征(nadir血細胞比容，失血指數(shù)，血細胞比容的變化，所輸入的血紅細胞的單位數(shù))與本試驗的主要終點(死亡，心肌梗塞，冠狀動脈分流術(shù)(CABG)，或?qū)毙跃植咳毖M行的PTCA或針對治療失敗而進行的冠狀動脈斯坦特插入)之間的關(guān)系進行了調(diào)查。在失血與主要終點之間發(fā)現(xiàn)了很強的相關(guān)關(guān)系(對于所有失血指征P＝0.0001)。這一相關(guān)關(guān)系存在于下述各項治療中安慰劑，c7E3Fab濃縮藥丸，c7E3Fab濃縮藥丸及其滲透。因此，具有顯著失血的患者就更容易發(fā)生局部缺血并發(fā)癥。這一很強的相互關(guān)系可能是由于伴隨主要終點事件(如CABG)的失血的增高而造成的。另外，失血以及所伴隨的低血壓也可能是造成術(shù)后的局部缺血并發(fā)癥的主要因素之一。支持這一點的是，在進行了成功的PTCA后的患有低血壓(除了在主要結(jié)果事件以后的低血壓)的患者是非常明顯的更容易發(fā)生主要結(jié)果事件，并且更容易發(fā)生嚴(yán)重失血及主要結(jié)果事件。低血壓沒有低血壓P值數(shù)2391597-主要終點(％)46(16.1)103(6.5)＜.001終點+嚴(yán)重失血(％)18(39.9)10(9.7)＜.001其結(jié)論是，失血似乎是可以引起在某些患者身上的局部缺血并發(fā)癥，而降低失血的方法(例如改變肝素的劑量)可以進一步地在冠狀動脈治療中提高GPIIb/IIIa抑制的抗局部缺血的效率。在高度危險血管成形術(shù)中積極性血小板抑制的經(jīng)濟益處及害處在2,100名患者的EPIC隨機試驗中(見實施例6和7)采用高劑量的c7E3Fab的積極性血小板抑制使得高度危險的冠狀動脈血管成形術(shù)(PTCA)中發(fā)生的死亡、復(fù)發(fā)性梗塞和復(fù)發(fā)性局部缺血被降低了35％，但是，PTCA后的嚴(yán)重失血增加了一倍。為了評價這種臨床綜合效應(yīng)的經(jīng)濟學(xué)結(jié)果，進行了更詳細的經(jīng)濟學(xué)方面的展望及研究。對每一位參加試驗的患者收集了他們的參加試驗后6個月的住院花費(不包括服務(wù)費)和所用資源的數(shù)據(jù)。對于沒有復(fù)雜的住院過程的患者的平均基本住院花費為9300美元。嚴(yán)重并發(fā)癥對基本住院花費的影響是按照多變量線性回歸模型(multivariablelinearregressionmodel)進行分析的平均住院花費等于＝9065美元＋5923美元(緊急PTCA)＋28,219美元(緊急CABG)＋3645美元[(復(fù)發(fā))梗塞]＋3462美元(嚴(yán)重失血)這一模型顯示將緊急PTCA從4.5％減少到0.8％，緊急CABG從3.6％減少到2.4％以及將(復(fù)發(fā))梗塞從8.6％減少到5.2％就使得c7E3片段的治療方法比安慰劑治療方法對每個患者平均降低了費用682美元。然而，由于嚴(yán)重失血被增加了一倍，即從7％至14％，那么這種方法就喪失了242美元的潛在的可能節(jié)約的優(yōu)勢，其結(jié)果是對每位患者來說實際上的花費的凈節(jié)省值為440美元。實際上對于高劑量c7E3Fab(X＝$10,970±7,284)與安慰劑(X＝$11,376±12,555)之間的平均費用的差距為406美元，與模型的預(yù)測值非常接近。因此，通過對高度危險的PTCA的局部缺血并發(fā)癥的明顯降低，使用嵌合抗GPIIb/IIIa片段的對血小板的積極性抑制就提供了改善的醫(yī)療效果和凈花銷的節(jié)省。在保證治療的有益效果的同時，采用能夠使服用c7E3時的嚴(yán)重失血率被降低的方法還可以使預(yù)測的凈花費的節(jié)省數(shù)升高到每位患者為700美元。在冠狀動脈治療中用血小板GPIIb/IIIa拮抗劑可使活化的凝血時間得到提高活化的凝血時間(ACT)被用于經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動脈血管成形術(shù)(PTCA)以監(jiān)測對凝血酶抑制的程度和在使凝血現(xiàn)象被最小化的嘗試中的抗凝聚作用。在引入有效的血小板抑制劑例如嵌合單克隆c7E3Fab抗體后，對在PCTA中的調(diào)節(jié)ACT的方法的實用性還沒有進行檢驗。直至目前為止，c7E3對ACT的影響還是未知的，并且還沒有被推測出來。血小板GPIIb/IIIa的拮抗機制的對ACT方法的可能的影響已經(jīng)被調(diào)查了。在該試驗中接受了PTCA的2099名患者被隨機地給予安慰劑(n＝696)或GPIIb/IIIa拮抗劑c7E3Fab(n＝1403)。與安慰劑組相比，接受了很高劑量的肝素(＞14,000單位)的患者的數(shù)目比較少，盡管這些接受了c7E3Fab的患者也接受了相似劑量的肝素，但在根據(jù)體重進行了校正之后他們都具有明顯的高的(P＜0.001)ACT。肝素劑量安慰劑對象c7E3Fab對象％＜10,000單位或僅滲透112(16)265(19)10,000單位220(32)497(36)10,000-14,000單位141(21)298(22)＞14,000單位209(31)316(23)結(jié)論是，血小板GPIIb/IIIa拮抗劑c7E3Fab將活化凝血時間延長了35～40秒。這一點在肝素劑量輔助治療法以及在GPIIb/IIIa為指導(dǎo)的治療法中進行冠狀動脈治療時都具有非常重要的意義。使用單克隆抗血小板GPIIb/IIIa受體的抗體防止血管成形術(shù)的局部缺血并發(fā)癥的評價試驗的性別差異進行了使用單克隆抗血小板GPIIb/IIIa受體的抗體，即單克隆c7E3Fab抗體防止血管成形術(shù)中的局部缺血并發(fā)癥的評價試驗的性別差異研究(見實施例6和7)。進行經(jīng)皮治療(PTCA)的患者在治療前的不長時間內(nèi)接受了下述三者之一的盲點處理c7E3濃縮藥丸并隨后進行12小時c7E3滲透、c7E3濃縮藥丸或安慰劑。盡管事實上女性都比男性的年齡稍大，體重稍輕，并且具有更多的心血管危險因素，但是，女性及男性在下列各項目中都沒有顯出性別差異死亡頻率(2.2％vs.1.3％)，MI(7.5％vs.6.3％)，緊急PTCA(2.6％vs.3.1％)，緊急分流手術(shù)(1.7％vs.3.2％)，在30天內(nèi)的斯坦特置入、主動脈內(nèi)氣囊泵的放置或復(fù)合的對那些局部缺血負作用事件的處理(10.5％vs.11.0％，P＝0.74)。對于這些復(fù)合處理的已知因素的調(diào)整(治療方案、體重、高血壓、外周血管疾病)，以及對任何涉及性別的潛在的統(tǒng)計學(xué)作用的調(diào)整都不會改變這些結(jié)果。用c7E3Fab濃縮藥丸及其滲透的治療在兩種性別中都對局部失血事件的頻率產(chǎn)生了相似的降低。女性顯示出比男性更多的嚴(yán)重失血(12.6％vs.9.8％)，需要更多的輸血(PRBC)(19.5％vs，9.0％)并且具有更高的失血指數(shù)(Δ血細胞比容/3+PRBC單位，2.4vs.1.9)。在預(yù)測失血指數(shù)的回歸模型中，盡管對已知的失血預(yù)測因子進行調(diào)整(治療方案、年齡、體重、開始時的血細胞比容、高血壓)，性別在統(tǒng)計學(xué)上仍舊是獨立的預(yù)測因子(P＝.0041)。結(jié)論是，在接受了高度危險的血管成形術(shù)和c7E3Fab治療以后，女性顯示出了比男性更多的失血，但是，在其它的負作用上，并沒有顯示出增加。等同物本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員可以充分理解并且能夠使用不超出常規(guī)的試驗方法而得出本發(fā)明所述具體實施方案的等同方案。這些等同物都是本發(fā)明的權(quán)利要求書所要包括的。權(quán)利要求1.一種抑制狹窄和/或復(fù)發(fā)性狹窄的方法，包括給患有冠狀動脈疾病的患者以有效劑量的包括對血小板為特異性的非人類來源的抗原結(jié)合區(qū)以及人類來源的恒定區(qū)的嵌合免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的非人類來源的抗原結(jié)合區(qū)是對糖蛋白IIb/IIIa為特異性的。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中的抗原結(jié)合區(qū)是從單克隆抗體7E3衍化來的。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的免疫球蛋白片段是Fab，F(xiàn)ab’或F(ab’)2片段。5.一種抑制狹窄和/或復(fù)發(fā)性狹窄的方法，包括給患有冠狀動脈疾病的患者以有效劑量的對糖蛋白IIb/IIIa發(fā)生選擇性結(jié)合的化合物。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的化合物是包括對糖蛋白IIb/IIIa為特異性的來自于非人體抗原結(jié)合區(qū)以及來自于人體的恒定區(qū)的嵌合免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的抗原結(jié)合區(qū)是從單克隆抗體7E3衍化來的。8.一種抑制接受了冠狀動脈治療后人體發(fā)生復(fù)發(fā)性狹窄的方法，包括給所述人體以有效劑量的包括對血小板為特異性的非人類來源的抗原結(jié)合區(qū)以及人類來源的恒定區(qū)的嵌合免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的治療是血管成形術(shù)。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的抗原結(jié)合區(qū)是對糖蛋白IIb/IIIa受體復(fù)合物為特異性的。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的抗原結(jié)合區(qū)是從單克隆抗體7E3衍化來的。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中的免疫球蛋白片段選自于Fab，F(xiàn)ab’或F(ab’)2片段。13.一種抑制接受了冠狀動脈治療后人體發(fā)生復(fù)發(fā)性狹窄的方法，包括給所述人體以有效劑量的與GPIIb/IIIa選擇性結(jié)合的化合物。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的化合物是包括對糖蛋白IIb/IIIa為特異性的來自于非人體抗原結(jié)合區(qū)以及來自于人體的恒定區(qū)的嵌合免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的抗原結(jié)合區(qū)是從單克隆抗體7E3衍化來的。16.一種在人體的血管成形術(shù)中防止急性或非急性局部缺血并發(fā)癥的方法，包括給所述人體以有效劑量的包括對血小板為特異性的非人類來源的抗原結(jié)合區(qū)以及人類來源的恒定區(qū)的嵌合免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。17.一種在人體的血管成形術(shù)中降低或防止急性或非急性局部缺血并發(fā)癥的方法，包括給所述人體以有效劑量的與糖蛋白IIb/IIIa選擇性結(jié)合的化合物。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的化合物是包括對糖蛋白IIb/IIIa為特異性的非人體來源的抗原結(jié)合區(qū)和人體來源的恒定區(qū)的嵌合免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的抗原結(jié)合區(qū)是從單克隆抗體7E3衍化來的。全文摘要本發(fā)明描述了對血小板為特異性的嵌合免疫球蛋白及其片段。這種嵌合分子包括非人體來源的抗原結(jié)合區(qū)和人體來源的恒定區(qū)。優(yōu)選的免疫球蛋白是對糖蛋白IIb/IIIa受體復(fù)合形式為特異性的；它們封閉配體與受體的結(jié)合從而防止血小板凝聚。這種免疫球蛋白可以用于降低或防止閉塞、復(fù)發(fā)性閉塞(例如急性堵塞)、狹窄和/或復(fù)發(fā)性狹窄。此外，將這種球蛋白單獨或與溶血制劑同時使用時，可以用在抗血栓治療及血栓造影中。文檔編號A61P9/00GK1142189SQ94194772公開日1997年2月5日申請日期1994年11月7日優(yōu)先權(quán)日1993年11月5日發(fā)明者巴瑞·S·科勒,大衛(wèi)·M·奈特申請人:森特克公司,紐約州立大學(xué)研究基金會