專利名稱：豐富的細胞外產(chǎn)物和其生產(chǎn)與使用方法
與相關申請的相互參照本申請是1993年11月23日提交的序號為156，358的共同未決美國專利申請的部分繼續(xù)申請，在此引用前者作為參考。與政府的關系發(fā)本明是在政府支持下完成的，衛(wèi)生部(the Department ofHealth and Human Services)給與的授權(quán)號為A1-31338。政府對本發(fā)明享有某些權(quán)利。
發(fā)明的領域本發(fā)明總地涉及免疫治療劑和抗病原性生物體如細菌、原生動物、病毒和真菌的疫苗。更具體的說，與基于表現(xiàn)有最大或最特異分子免疫原性之病原體亞單位或產(chǎn)物的現(xiàn)有的技術疫苗及免疫治療劑不同，本發(fā)明使用由選擇的病原體如結(jié)核分枝桿菌(Mycobat-terium tuberculosis)釋放的最普遍或主要豐富的免疫原決定簇刺激哺乳動物宿主體內(nèi)的有效免疫反應。因此，通過本發(fā)明產(chǎn)生的獲得免疫性和免疫治療活性是針對那些在病原體感染期間最常展現(xiàn)于被感染宿主細胞上的抗原標志的，而沒有特別考慮所投用之化合物的相關或絕對免疫原性。
發(fā)明的背景很早即已了解到，寄生微生物具有感染動物因而引起疾病并常常致使宿主死亡的能力。致病因子在整個歷史上一直是死亡的主要原因并且繼續(xù)使人遭受巨大痛苦。雖然近百年來在預防和治療許多傳染病中已取得了顯著進展，但復雜的宿主-寄生物相互作用仍限制治療手段的普遍有效性。各種疾病如結(jié)核復發(fā)，以及許多細菌和病毒抗藥株的出現(xiàn)證明了在對抗由許多病原性載體展示之精細侵染機制中的困難。
在流行病學所涉及的主要病原因子中，已證明細胞內(nèi)細菌在治療或預防手段面前是特別難以處理的。包括分枝桿菌屬和軍團菌屬在內(nèi)的細胞內(nèi)細菌在被感染宿主生物體的細胞內(nèi)而不是細胞外完成其全部或部分生活周期。在世界范圍內(nèi)，每年有數(shù)百萬人死于細胞內(nèi)細菌感染并遭受巨大痛苦。由結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病是全世界傳染病死亡的主要原因，每年有一千萬新的病例并有兩千九百萬人死亡。另外，有數(shù)百萬麻風病例是由細胞內(nèi)細菌感染引起的。由細胞內(nèi)致病因子傳播的其他致衰弱性疾病包括皮膚和內(nèi)臟利什曼病、南美洲錐蟲病(恰加斯氏病)、李司忒氏病、弓形體病、組織胞漿菌病、沙眼、鸚鵡熱、Q熱以及包括Legionnaires氏病在內(nèi)的軍團菌病。目前，對于接觸這些生物體的敏感個體來說，為預防致衰弱性感染所能采取的措施相對很少。
由于不能夠有效地保護人群免于受結(jié)核侵染和由結(jié)核病引起的人類固有發(fā)病率和死亡率，所以結(jié)核病是人類面臨的最重要的疾病之一。更具體地說，主要由結(jié)核分枝桿菌引起的人肺結(jié)核是發(fā)展中國家病人死亡的一種主要原因。由于能夠在巨噬細胞和單核細胞內(nèi)存活，所以結(jié)核分枝桿菌可以產(chǎn)生慢性細胞內(nèi)感染。通過將其本身隱蔽在主要負責檢出外來成分的細胞內(nèi)并且繼而激活免疫系統(tǒng)，結(jié)核分枝桿菌即可相對成功地侵犯宿主生物體的正常防御機制。因此這些同樣的病原特征阻礙了抗結(jié)核感染之有效免疫治療劑或疫苗的發(fā)展。同時結(jié)核桿菌相對比較容易培養(yǎng)及在實驗室條件下觀察。因此，結(jié)核分枝桿菌特別適合于證明本發(fā)明的原理和優(yōu)點。
本領域技術人員將會理解，下文舉例討論的結(jié)核分枝桿菌絕不是用來限制本發(fā)明處理結(jié)核分枝桿菌的范圍。同樣，本文所述技術并不是限于治療結(jié)核感染。相反，可使用本發(fā)明有利地提供用于對抗任何表達細胞外產(chǎn)物之病原因子的免疫決定簇并因而抑制那些生物體傳染性傳播的安全而有產(chǎn)的疫苗和免疫治療劑。
據(jù)了解，目前大約有全世界人口的半數(shù)感染結(jié)核分枝桿菌，致使每年出現(xiàn)數(shù)百萬肺結(jié)核病例。雖然這種疾病主要是在拉丁美洲、非洲和亞洲的發(fā)展中國家傳播，但在第一世界國家也有較大的流行趨勢。在美國的特定人群特別是貧困、免疫受損個體和來自高流行區(qū)域的移民也處于高危險發(fā)病的危險狀態(tài)。在發(fā)達國家主要由于艾滋病流行，目前結(jié)核病的發(fā)生率也在不斷增加，而且常常是以多藥物抗性結(jié)核分枝桿菌的形式傳播。
最近，在美國50個州中36個州報導了抗一種或多種藥物的結(jié)核病。在紐約市，1991年檢驗的所有病例中有三分之一是抗一種或多種主要藥物的。雖然非抗性結(jié)核病可以經(jīng)長期使用抗生素得以治愈，但涉及藥物抗性菌株的治療前景仍是暗淡的。受抗兩種或多種主要抗生素之菌株感染的病人死亡率約為50％。因此，特別需要抗結(jié)核分枝桿菌的這些變種的安全而有效的疫苗。
因為病原體在濕的或干燥的痰中仍可繼續(xù)存活數(shù)周或數(shù)月，所以通過吸入氣霧化的顆粒幾乎總會發(fā)生結(jié)核分枝桿菌的最初感染。雖然原感染部位是在肺部，但這種生物體也可以感染骨、脾臟、腦膜及皮膚。根據(jù)特定菌株之毒力及宿主抵抗力的不同，感染及對組織的相應損傷可以很小或范圍很大。在人類病例中，大多數(shù)接觸到毒性菌株的個體的初始感染均受到控制。在初始攻擊后獲得性免疫的發(fā)展減少了細菌的增殖，從而使損傷愈合，大多數(shù)人沒有癥狀但可能有傳染性。
當結(jié)核分枝桿菌沒有被經(jīng)受感染的病人控制時，常常導致肺組織的廣泛退化。在敏感個體中，通常在肺中的損傷是因為結(jié)核菌在肺泡或肺巨噬細胞內(nèi)繁殖而形成的。隨著該生物體繁殖，它們可通過淋巴系統(tǒng)擴散到遠處淋巴結(jié)并通過血液系統(tǒng)擴散到肺頂，骨髓、腎臟和包繞腦的腦膜。主要由于細胞介導的超敏感性反應，與感染的嚴重程度成比例地產(chǎn)生特征性肉芽腫損傷或結(jié)核。這些損傷由周邊有單核細胞、淋巴細胞和成纖維細胞的上皮樣細胞組成。在大多數(shù)例子中，損傷或結(jié)核最終發(fā)生壞死并經(jīng)受干絡性壞死。
雖然結(jié)核分枝桿菌是一種重要的病原體，但分枝桿菌屬的其他菌種也可引起動物包括人的疾病，并顯然也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，牛分枝桿菌(M.bovis)與結(jié)核分枝桿菌密切相關并負責牛、豬、羊、馬、狗和貓等家畜的結(jié)核感染。另外，牛分枝桿菌可通過腸道，特別是由消化牛奶而感染人。定位的腸道感染最終播散到呼吸道，之后出現(xiàn)短時結(jié)核病的典型癥狀。分枝桿菌屬的另一個重要致病載體是造成數(shù)百萬古老疾病麻風病病例的麻風分枝桿菌。引起包括人在內(nèi)的動物疾病的其他分枝桿菌屬細菌包括堪薩斯分枝桿菌(M.Kansasii)、鳥細胞內(nèi)分枝桿菌(M.avium intracellulare)、偶發(fā)分枝桿菌(M.fortuitum)、海分枝桿菌(M.marinum)、龜分枝桿菌(M.chelonei)、非洲分枝桿菌(M.africanum)、潰瘍分枝桿菌(M ulcer-ans)，田鼠分枝桿菌(M.microti)和瘰疬分枝桿菌(M.scrofulaceum)。病原分枝桿菌菌種在其各自DNA和相應蛋白質(zhì)序列上表現(xiàn)有高度同源性，并且某些菌種如結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌又是密切相關的。
基于明顯的實踐的道德原因，在人體內(nèi)確定實驗組合物對這些病痛的效力的最初工作是不能實行的。因此，由于安全和費用的原因，在早期開發(fā)任何藥物或疫苗中的常規(guī)方法是使用適當?shù)膭游锬Ｐ??；诹私獾矫庖邇?yōu)勢表位常常在不同種宿主中都是有活性的，而推測到實用實驗動物模型的成功。因此，一個種例如嚙齒動物或者豚鼠中的免疫原性決定簇一般在不同種如人體內(nèi)也是有免疫反應性的。只有在充分地建立了適當?shù)膭游锬Ｐ椭蟛拍苓M行人體臨床試用，以進一步證明疫苗在人體內(nèi)的安全性和效力。
就結(jié)核分枝桿菌的肺泡和肺感染來說，豚鼠模型在許多方面十分接近于人體疾病的病理學。因此，本領域技術人員將會理解到，將這種疾病的豚鼠模型延推到人和其他哺乳動物是適當?shù)?。同人一樣，豚鼠對低劑量氣霧化人病原體結(jié)核分枝桿菌的結(jié)核性感染是敏感的。與初始感染通常受到控制的人不同，豚鼠在接觸氣霧化病原體后持續(xù)發(fā)展傳播性疾病，而有利于繼后的分析。另外，豚鼠和人均呈現(xiàn)以發(fā)展致密單核細胞硬化或在皮膚試驗部位的硬化區(qū)域為特征的遲發(fā)性皮膚超敏性反應。最后，人和豚鼠的特征性結(jié)核損傷表現(xiàn)出包括存在朗漢氏巨細胞在內(nèi)的相似形態(tài)學。因為豚鼠比人對初始感染更敏感，并且疾病進展更快，所以在使用這一動物模型的實驗中，賦予的任何保護作用都將為在人或其他不太敏感的動物中可能產(chǎn)生的同樣保護性免疫提供更強的指征。因此，僅僅為了解釋而不是限制目的，本發(fā)明主要將以豚鼠作為哺乳動物宿主來加以證明。本領域技術人員將會理解到，可用包括人和家養(yǎng)動物在內(nèi)的其他哺乳動物來實現(xiàn)本發(fā)明。
受到病原載體特別是細胞內(nèi)微生物感染的任何動物或人都難以激發(fā)宿主免疫系統(tǒng)。雖然體液反應和相應的保護性抗體的產(chǎn)生可以有效地控制許多感染因子，但這些機制主要是對那些定位于身體中細胞外液內(nèi)的病原體有效。特別是，調(diào)理抗體與細胞外的外來因子結(jié)合，從而使它們對吞噬作用敏感并繼而在細胞內(nèi)殺傷之。但對其他一些病原體則不是這種情況。例如，以前的研究表明，體液免疫反應對抗細胞內(nèi)細菌如結(jié)核分枝桿菌的感染似乎沒有起到明顯的保護作用。然而，本發(fā)明可產(chǎn)生對靶病原體的有利的體液反應，照此，其效果即不只限于受刺激之免疫反應的任何特定成分。
更具體地說，抗體介導的防御作用似乎并不阻止細胞內(nèi)病原體的初始感染，并且一旦細菌被掩蔽在宿主細胞內(nèi)則將起不到防御功能。作為水溶性蛋白質(zhì)，抗體可以穿過細胞外液和血液，但難以通過細胞的脂質(zhì)膜遷移。另外，抗細菌表面結(jié)構(gòu)之調(diào)理抗體的產(chǎn)生可能實際上幫助細胞內(nèi)病原體進入宿主細胞。因此，任何抗細胞內(nèi)因子如結(jié)核分枝桿菌的有效預防手段都應加入一種攻擊性細胞介導的免疫反應成分，以導致抗原特異性淋巴細胞的迅速增殖，借以激活遭損的巨噬細胞或借助細胞毒性清除之。但正如下文中將要詳細討論的，誘導細胞介導的免疫反應并不等于誘導保護性免疫。雖然細胞介導的免疫可能是保護性免疫的先決條件，但按照本發(fā)明的技術生產(chǎn)疫苗，還需要進行動物攻擊研究。
這種細胞介導的免疫反應一般包括兩個步驟。第一步是用可將病原體的碎片輸送到細胞表面上的特異性分子(主要組織相容性分子或稱MHC分子)完成對被感染細胞的信號標記。這些MHC分子與已在被感染細胞內(nèi)降解的細菌蛋白質(zhì)的小片段結(jié)合，并將其呈現(xiàn)于細胞表面。它們在T細胞上的呈現(xiàn)刺激宿主的免疫系統(tǒng)，借以清除被感染的宿主細胞或誘導宿主細胞消滅定居在細胞內(nèi)的所有細菌。
與大多數(shù)傳染性細菌不同，包括結(jié)核分枝桿菌在內(nèi)的分枝桿菌屬細菌傾向于在液泡內(nèi)增殖，而這些液泡實質(zhì)上是通過膜與細胞的其余部分封離的。吞噬細胞天然形成這些保護性液泡而使它們對這類病原體的感染特別敏感。在這樣的空泡中，細菌可有效地免于被降解，使免疫系統(tǒng)難于在被感染細胞的表面上呈現(xiàn)整合的細菌成分。然而，被感染細胞的MHC分子將移向液泡并收集所有游離的(釋放的)細菌產(chǎn)物，或者移向宿主細胞中已輸送了外來細胞外細菌產(chǎn)物的其他部位，以便在細胞表面上正常呈遞這些產(chǎn)物。如以前證明的，外來細菌產(chǎn)物的呈遞將誘發(fā)宿主免疫系統(tǒng)的適當反應。
細胞內(nèi)病原體提出的涉及免疫系統(tǒng)的問題也構(gòu)成了對疫苗開發(fā)的特殊挑戰(zhàn)。迄今為正，抗分枝桿菌感染特別是抗結(jié)核分枝桿菌感染之有效疫苗的生產(chǎn)已使大多數(shù)研究者感到困惑。目前，廣泛利用的抗細胞內(nèi)病原體的疫苗只是活的減毒疫苗BCG(即強毒力牛分枝桿菌菌株疫苗)，以其作為對抗結(jié)核菌的預防工具。在1988年，世界衛(wèi)生組織在印度進行的深入研究確定，最好的BCG疫苗的效率也如此的低以致于檢測不到。盡管有這樣成問題的效力，BCG疫苗仍一直在全世界結(jié)核病高發(fā)地區(qū)廣泛使用。更嚴重的問題是，甚至已接種了BCG的人也常常產(chǎn)生對結(jié)核菌素的敏感性，從而否定用來進行結(jié)核病篩選和控制的最常用皮膚試驗的有用性。
涉及使用活的減毒疫苗如BCG的另一個嚴重問題是可能在免疫低下病人體內(nèi)引發(fā)致命性疾病。這些疫苗可對有受壓抑的細胞介導性免疫的人造成一種特殊的危險，這是因為它們降低了對抗迅速增殖誘導之感染的能力。這樣的個體包括因營養(yǎng)不良和惡劣生活條件而身體虛弱的人、器官移植接受者，以及受HIV感染者。就使用BCG疫苗來說，高危險個體還包括患有肺部疾患如肺氣腫、慢性支氣管炎、塵肺、矽肺或以前有結(jié)核病者。因此，應只限于在具有最大潛在收益的特殊人群中使用減毒的疫苗。
使用活減毒疫苗還可能產(chǎn)生其他不期望的副作用。因為活疫苗可在接受者體內(nèi)再生，所以它們可以比非傳染性疫苗產(chǎn)生更寬范圍的抗體和更小的細胞介導的針對性免疫反應。這種鳥槍法常常會阻斷針對那些最常參予細胞預防作用之分子結(jié)構(gòu)的免疫反應。另外，使用有完整膜結(jié)構(gòu)的活疫苗可誘導產(chǎn)生調(diào)理抗體，借以制成一種有效預防所需的外來體。因此，在宿主接觸到靶微生物的毒性株之后，這些抗體的存在實際上可增加非減毒病原體在宿主細胞內(nèi)的攝入，并在其中存活和增殖。再者，減毒的疫苗含有數(shù)千種不同的分子并因而更可能含有有毒的或能夠在病人體內(nèi)引發(fā)不利免疫反應的分子。與使用活疫苗有關的其他問題包括毒性逆轉(zhuǎn)、天然傳播接觸、污染病毒和病毒干擾，以及難于實現(xiàn)標準化。
同樣，非傳染性疫苗如針對強抗原性膜結(jié)合結(jié)構(gòu)的死微生物或常規(guī)第二代亞單位疫苗，在抑制細胞內(nèi)細菌方面受到限制。與減毒疫苗一樣，殺死的細菌也引發(fā)可抑制大多數(shù)有效的預防性決定簇的普遍反應。另外，死疫苗仍存在大量針對免疫系統(tǒng)的潛在抗原結(jié)構(gòu)，從而增加毒性反應或免疫系統(tǒng)調(diào)理作用的可能性。包含膜結(jié)合結(jié)構(gòu)的傳統(tǒng)的亞單位疫苗(無論是合成的還是純化的)也可能誘導強的調(diào)理作用，而有利于細胞內(nèi)病原體進入巨噬細胞并在其中繁殖?？辜毎麅?nèi)表面抗原的死疫苗可通過增加細菌包涵的速率來增加病原因子的相對毒力。因此，在細胞內(nèi)病原體的情況下可能不適于使用抗強抗原性細菌表面成分的常規(guī)減毒或死疫苗。
為了避免與使用傳統(tǒng)疫苗相關的問題，已使用細胞外蛋白質(zhì)或其免疫原性類似物發(fā)展了新的疫苗，借以刺激針對特異性細胞內(nèi)病原體的保護性免疫。例如，本發(fā)明人的美國專利No.5,108,745(1992年4月28日公布)公開了產(chǎn)生抗親肺軍團菌(Legionella pneu-mophila)和結(jié)核分枝桿菌及其他細胞內(nèi)病原體之保護性免疫的疫苗和方法。這些現(xiàn)有疫苗總地是基于最初衍生于蛋白質(zhì)化合物的細胞外嚴物，所說的蛋白質(zhì)化合物是由病原菌向細胞外釋放到體外培養(yǎng)中的，以及由體內(nèi)被感染宿主細胞內(nèi)的細菌向細胞外釋放的。如文中所公開的，這些疫苗是基于選擇性鑒定那些能刺激抗哺乳動物宿主體內(nèi)靶病原體之強免疫反應的細胞外產(chǎn)物或其類似物而制得的。
更具體地說，通過檢測其在對感興趣病原體有免疫性之哺乳動物體內(nèi)引發(fā)強淋巴細胞增殖反應或皮膚遲發(fā)型超敏反應的能力，來篩選這些現(xiàn)有的候選細胞外蛋白質(zhì)。雖然這種已公開的方法及相關疫苗避免了許多使用傳統(tǒng)疫苗固有的缺點，但由于交叉反應性和宿主改變可能使對有效免疫制劑的選擇復雜化而抵削免疫反應效果。因此，雖然分子免疫原性是有效疫苗的指標之一，但其他一些因素則可能使其在體內(nèi)引發(fā)有效免疫反應中產(chǎn)生難以解決的問題。
更重要的是，已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，特別是就結(jié)核分枝桿菌來說，鑒定有效保護性免疫誘導疫苗的常規(guī)現(xiàn)有技術方法是很不方便而且可能是無效的。例如，對大批量結(jié)核分枝桿菌細胞外蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE分析，然后進行常規(guī)Western印跡分析的目的是鑒定這些細胞外成分中最具免疫原性的部分，結(jié)果產(chǎn)生了不一致的結(jié)果。已報導的試驗沒有鑒定出來應產(chǎn)生最強免疫原性反應的細胞外產(chǎn)物，并因而與原來的想法相一致，也就沒有發(fā)揮其作為最有效疫苗的功能。結(jié)核分枝桿菌的許多細胞外產(chǎn)物都是本領域已知的，已經(jīng)作了鑒定并且有些還測定了序列。另外，與任何外來蛋白質(zhì)一樣，可以顯示這些已知化合物誘導了免疫反應。然而，本領域沒有證據(jù)直接表明這些已知化合物可誘導如傳統(tǒng)鑒定的保護性免疫。
因此，本發(fā)明的一個主要目的是提供疫苗或免疫治療劑及其生產(chǎn)方法和在引發(fā)抗傳染性細菌病原體之有效免疫反應中的應用，其并不依賴于傳統(tǒng)疫苗考慮及基于高特異性、強免疫原可操作性的選擇技術。
本發(fā)明的另一個目的是提供疫苗或免疫治療劑及其用于在哺乳動物宿主體內(nèi)賦予對抗包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、鳥細胞內(nèi)分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌、海分枝桿菌、非洲分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、田鼠分枝桿菌和瘰疬分枝桿菌在內(nèi)之細胞內(nèi)病原體獲得性免疫的方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供容易產(chǎn)生的疫苗和免疫治療劑。其相對于死疫苗或減毒疫苗表現(xiàn)有降低的毒性。發(fā)明的概要本發(fā)明通過提供用作疫苗和/或免疫治療劑的化合物及其生產(chǎn)方法以在哺乳動物宿主體內(nèi)產(chǎn)生抗病原體感染的保護性或治療性免疫反應而實現(xiàn)了上述及其他目的?？偟卣f來，本發(fā)明提供了誘導對抗細胞外化合物生成性傳染載體之保護性或治療性免疫反應的手段。雖然本發(fā)明的化合物對抗病原菌是特別有效的，但它們可用于產(chǎn)生保護性或治療性免疫反應，以對抗生成主要豐富細胞外產(chǎn)物的任何病原體。
對本發(fā)明來說，術語“主要豐富的”應理解為一個認定那些由感興趣的病原體以最大量釋放之細胞外產(chǎn)物的相對術語。例如，就在各種不同培養(yǎng)條件下生長至光密度約為0.5的結(jié)核分枝桿菌而言，本領域技術人員可望獲得10μg/mL數(shù)量級或更多的主要豐富細胞外產(chǎn)物。因此，于正常或熱休克條件下生長的結(jié)核分枝桿菌的總共4mg/L細胞外產(chǎn)物的總產(chǎn)量中，大約100份已知細胞外產(chǎn)物中的約15至20份(單獨或合并的)將構(gòu)成總量的約90％。這些是期望包括于本發(fā)明范圍內(nèi)的主要豐富細胞外產(chǎn)物，并很容易作為SDS-PAGE凝膠中出現(xiàn)的寬帶得以識別。另外，可進一步鑒定感興趣的細胞外產(chǎn)物并根據(jù)氨基酸序列分析結(jié)果區(qū)別之。其余的細胞外產(chǎn)物比較少。本領域技術人員也將理解到，依據(jù)培養(yǎng)條件的不同，特異性主要細胞外產(chǎn)物的相對定量豐度可以有所變化。然而，在大多數(shù)情況下，個別主要豐富細胞外產(chǎn)物的認定將不會改變。
因此，本發(fā)明可用于保護哺乳動物宿主不受病毒、細菌、真菌或原生物物病原體感染。應提到的是，在某些情況下如在病毒感染中，可由受感染的宿主細胞產(chǎn)生主要豐富細胞外產(chǎn)物。雖然有對抗所有釋放主要豐富細胞外產(chǎn)物的微生物，但本發(fā)明的疫苗和方法在產(chǎn)生抗細胞內(nèi)病原體包括不同種和血清型結(jié)核分枝桿菌的保護性免疫中是特別有效的。本發(fā)明的疫苗作為治療已有疾病的免疫治療劑也是有效的。
本發(fā)明人已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，用由細菌病原體細胞外釋放的最豐富或主要豐富產(chǎn)物或其免疫原性類似物進行免疫可引發(fā)有效的免疫反應，而不考慮給藥化合物的絕對免疫原性。由于它們是從微生物體內(nèi)釋放的并因而可被宿主分子利用來參予抗原加工和呈遞，以及由于它們在感染期間在組織中的天然高濃度，所以病原因子的主要豐富細胞外產(chǎn)物比其他細菌成分更常受到加工并呈遞于宿主免疫系統(tǒng)。就細胞內(nèi)病原體來說，主要豐富細胞外產(chǎn)物呈現(xiàn)于被感染之宿主細胞表面上的主要免疫原性決定簇并因此而在周圍環(huán)境中表現(xiàn)有更大的存在量。因此，抗病原微生物之主要豐富細胞外產(chǎn)物的獲得性免疫允許宿主防御系統(tǒng)迅速檢出隔離在宿主細胞內(nèi)的病原體并有效地抑制它們。
更具體地說，由病原菌釋放的主要豐富產(chǎn)物似乎是由吞噬細胞和其他宿主免疫系統(tǒng)機制以比不太普遍的或膜結(jié)合的病原成分更大的速率加工的，而不管它們各自的免疫原活性或特異性如何。當病原因子是一種與正常免疫活性隔絕的細胞內(nèi)細菌時，這種免疫加工不一致性是特別重要的。借助于它們大量和連續(xù)地呈遞于被感染之宿主免疫系統(tǒng)，最廣泛的細菌細胞外產(chǎn)物或其免疫原性類似物可引發(fā)強烈的免疫反應，而大可不必顧及它們各自的分子免疫原性特征。
主要豐富細胞外產(chǎn)物是由靶病原體釋放到周圍環(huán)境中之蛋白質(zhì)和其他分子實體的主要構(gòu)成成分。最近的研究表明，在某些情況下單一主要豐富細胞外產(chǎn)物可占微生物釋放之產(chǎn)物的達40％(重量)。更常見的是，個別主要豐富細胞外產(chǎn)物總計占傳染性病原體釋放之總產(chǎn)物的大約0.5％至25％。另外，可發(fā)現(xiàn)最多的5種或6種主要豐富細胞外產(chǎn)物占微生物釋放之總質(zhì)量的60％至70％。當然，本領域技術人員將會理解到，就所能釋放的絕對或相對產(chǎn)物量來說，在不同時間里細胞外產(chǎn)物的相對水平可能有所波動。例如，pH、氧化劑、滲透性、熱及對生物體的其他應力條件、生物周期的不同階段、再生狀態(tài)及周圍環(huán)境的組成成分均可改變所釋放之產(chǎn)物的組成和量。再者，在不同菌種間甚至在某個種的不同菌株間，細胞外產(chǎn)物的絕對和相對水平可能有很大不同。
就細胞內(nèi)病原體來說，細胞外產(chǎn)物似乎可擴充能夠檢測和發(fā)揮抗含活細菌之巨噬細胞的抗微生物作用的特異性免疫淋巴細胞群體。此外，借助它們反復呈現(xiàn)于被感染細胞之表面上的能力，主要豐富的或主要的細胞外產(chǎn)物可具有有效抗原標志物的功能。因此，依據(jù)本發(fā)明的技術，進行疫苗接種并誘導針對病原菌之主要豐富細胞外產(chǎn)物或其免疫原等同決定簇的保護性免疫，當繼后受到靶病原體感染時促進宿主免疫系統(tǒng)用強的細胞介導的成分建立迅速而有效的免疫反應。
與主要集中于生產(chǎn)疫苗并基于個別篩選之病原體成分的高度特異性的分子免疫原性來刺激免疫反應的現(xiàn)有技術免疫活動相反，本發(fā)明優(yōu)先開發(fā)利用相對豐富的細菌細胞外產(chǎn)物或其免疫原性類似物(而不是它們的免疫原特異性)，用實際上可能比不太普遍的細胞外產(chǎn)物表現(xiàn)有更低免疫原特異性的化合物建立或誘導保護性免疫。就本公開來說，免疫原類似物是足以相似于至少一種由靶病原體表達的主要豐富細胞外產(chǎn)物或其部分，具有在繼后受到靶病原體感染時刺激哺乳動物宿主體內(nèi)之保護性免疫反應的任何分子或化合物。簡單地說，本發(fā)明的疫苗是通過選擇由特定病原體向細胞外釋放的主要豐富產(chǎn)物(或能夠刺激實質(zhì)性等同免疫反應的分子類似物)并以相對純的形式分離之而鑒定或產(chǎn)生的。然后可使用本領域已知的技術配制一種或多種分離的免疫反應性產(chǎn)物，并在受到靶離病原體感染之前免疫哺乳動物宿主，以引發(fā)所需的抗靶病原體的預防性免疫反應。
可以預見到的是，本發(fā)明的疫苗將由至少一個、兩個或者可能甚至幾個已充分限定的免疫原決定簇組成。從而，本發(fā)明可產(chǎn)生恒定的，標準化的疫苗，其可被開發(fā)、試驗并相對容易和迅速地使用。另外，使用相當于主要豐富分泌產(chǎn)物或細胞外產(chǎn)物的幾個充分限定的分子可大大降低與常規(guī)疫苗相關的有害副作用，并可消除對有效免疫原標志的可能的吸留。同樣，因為本發(fā)明的疫苗不是一種減毒的或殺死的疫苗，所以在生產(chǎn)、純化期間或在給藥后可有效地消除感染的危險。因此，本發(fā)明的疫苗可以安全地用于免疫受損的個體，包括無癥狀結(jié)核病人和受到HIV感染的病人。再者，因為體液免疫反應是無例外地針對由靶病原體釋放之產(chǎn)物的，所以幾乎沒有產(chǎn)生有害調(diào)理免疫成分的機會。因此，本發(fā)明可使受刺激的體液反應幫助從抗體敏感區(qū)域清除靶病原體。
本發(fā)明的另一個有利的方面是可以借以比較容易地收獲、產(chǎn)生和繼后純化疫苗。例如，可用較小的工作量從包括結(jié)核分枝桿菌或牛分枝桿菌在內(nèi)的靶病原體培養(yǎng)物中得到優(yōu)勢豐富的細胞外產(chǎn)物。因為所需的化合物在微生物生長期間被釋放到培養(yǎng)基中，所以可利用常規(guī)技術從細菌體內(nèi)和靶病原體的膜結(jié)合成分成中很容易地分離之。更好的是可從基因工程改造的生物體中產(chǎn)生并純化本發(fā)明疫苗的所需免疫反應性成分，其中所說的生物體中已克隆了表達結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、麻風分枝桿菌或其他感興趣之病原體的特定細胞外產(chǎn)物的基因。如本領域已知的，可以對這些工程化生物體進行修飾使之產(chǎn)生更高水平的選擇的細胞外產(chǎn)物或經(jīng)修飾的免疫原性類似物。或者，可以使用本領域已知的技術以化學方法合成免疫保護產(chǎn)物、其部分或其類似物。不管所利用的生產(chǎn)來源如何，均可使用分級分離、層析或其他純化方法學及常規(guī)配制技術等常用生化手段分離優(yōu)勢或主要豐富細胞外產(chǎn)物的免疫原性成分并在其后配制成可釋放的疫苗。
例如，在本發(fā)明的一個舉例說明性實施方案中，靶病原體是結(jié)核分枝桿菌，從其他細菌成分中分離出由結(jié)核分枝桿菌釋放到培養(yǎng)液中的主要豐富細胞外，產(chǎn)物并用于引發(fā)哺乳動物宿主的免疫反應。然后在基于動物的攻擊實驗中利用個別蛋白質(zhì)或一類蛋白質(zhì)鑒定那些可誘導保護性免疫，而使之適于按照本發(fā)明的技術用作疫苗的蛋白質(zhì)。更具體地說，在培養(yǎng)并收獲細菌之后，借助其物理豐度，通過離心和過濾從細菌內(nèi)和其他成分中分離出主要的細胞外產(chǎn)物。必要時，再使用硫酸銨沉淀法對所得到的大量濾液進行分級分離，繼之進行透析以得到通稱為EP的細胞外產(chǎn)物的混合物。然后使用本領域已知和下文更充分描述的適當層析技術將經(jīng)過透析之部分中的溶解的細胞外產(chǎn)物純化到實質(zhì)上的均一狀態(tài)。
這些舉例的方法生產(chǎn)出十四種單個的分子量在110至12千道爾頓(KD)的結(jié)核分枝桿菌主要細胞外蛋白質(zhì)產(chǎn)物。純化后各單個主要豐富細胞外產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠電泳上展示出一條相當于其各自分子量的帶，從而得以鑒定和制備相當于主要豐富細胞外產(chǎn)物的個別產(chǎn)物或各組產(chǎn)物，以用作本發(fā)明的疫苗。可使用本領域通用的技術檢測它們各自的全部或部分氨基酸序列以進一步定性和區(qū)分純化的主要豐富細胞外產(chǎn)物。序列分析也可為了解主要豐富細胞外產(chǎn)物間的可能的結(jié)構(gòu)關系提供信息。
然后，可在一段時間內(nèi)經(jīng)多次皮下或皮內(nèi)注射這些純化的細胞外產(chǎn)物，通過本發(fā)明的技術免疫哺乳動物并在哺乳動物宿主系統(tǒng)中刺激獲得性免疫。例如，注射一種或多種加于不完全弗氏佐劑中的純化的主要豐富細菌細胞外產(chǎn)物，然后加在同樣佐劑中進行第二次注射，約三周后可用以引發(fā)在繼后用毒性病原體攻擊后的保護性免疫反應。本發(fā)明范圍和技術內(nèi)的其他示例性免疫方法可包括在一定時間內(nèi)注射加在Syntex Adjuvant Formulation(SAF)中的純化的細胞外產(chǎn)物或其類似物，共注射3或4次。雖然系列注射一般更為有效，但一次投用選擇的主要豐富細胞外產(chǎn)物或其免疫原性亞基或類似物也可產(chǎn)生預期的免疫反應，并期望該方法也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
可使用認可的實驗模型如豚鼠證明這些舉例的免疫方法。例如將在下文中詳細討論的，經(jīng)三次注射加在SAF佐劑中的細菌產(chǎn)物并建立對照動物的相應假免疫，以完成合用五種主要豐富細胞外產(chǎn)物(按前述方法從結(jié)核分枝桿菌中純化的)對幾只豚鼠的免疫。各蛋白質(zhì)的劑量范圍為100μg至2μg。末次免疫接種后，使所有動物同時接觸傳染性和潛在致死劑量的氣霧化結(jié)核分枝桿菌并長時間監(jiān)測之。與合用結(jié)核分枝相菌之主要豐富細胞外產(chǎn)物免疫的動物相比，對照組動物顯示有明顯的體重丟失。另外，在觀察期間有半數(shù)對照組動物死亡，而所有經(jīng)免疫的動物均未死于結(jié)核病。實驗后進行的尸體解剖表明未免疫的對照組動物比受到保護的動物有更顯著的集落形成單位(CFU)和其肺及脾臟中的相應損傷。試驗測知合用另外十七種純化的主要豐富細胞外產(chǎn)物具有免疫預防作用，從而證明本發(fā)明的范圍，并可按照本發(fā)明的技術配制寬抗菌范圍的疫苗。
但應強調(diào)的是，本發(fā)明并不限于合用分泌產(chǎn)物或細胞外產(chǎn)物。例如，幾種可代用的實驗方法證明，按照本發(fā)明的技術，單一豐富細胞外產(chǎn)物即具有誘導哺乳動物產(chǎn)生保護性免疫的能力。在各實驗中，使用本文詳述的層析方法從結(jié)核分枝桿菌中純化單一主要豐富細胞外產(chǎn)物并用以免疫豚鼠。一個例子是使用含有純化之豐富分泌產(chǎn)物(分子量相當于30KD)的佐劑組合物在多重實驗中接種動物。在本發(fā)明的另一個實施例中，使用含有從結(jié)核分枝桿菌中分離的豐富細胞外產(chǎn)物(分子量相當于71KD)的佐劑組合物免疫接種不同的豚鼠。免疫后，使兩組實驗動物和適當?shù)膶φ战M動物接觸致死劑量的氣霧化結(jié)核分枝桿菌以確定疫苗效力。
更具體地說，在一次實驗中，于6周時間里三次用100μg 30KD蛋白質(zhì)(加在SAF中)免疫6只豚鼠。同時用相應量的細胞外蛋白質(zhì)(EP)的批量制劑或緩沖液接種對照組動物。末次接種后3周，用致死劑量的氣霧化結(jié)核分枝桿菌攻擊動物并監(jiān)測14周。30KD蛋白質(zhì)免疫的豚鼠和整體細胞外產(chǎn)物制制免疫的豚鼠存活率分別為67％和50％(說明相對于EP，主要豐富細胞外產(chǎn)物的不可預料的優(yōu)良效能)，而假免疫的動物則只有17％的存活率。實驗終止后，殺死動物并檢驗活的結(jié)核菌。結(jié)果可見未經(jīng)免疫的動物顯示在肺和脾臟中有顯著高濃度的結(jié)核分枝桿菌。
對那些用71KD蛋白質(zhì)免疫的動物進行相似的實驗。一項實驗中，在三周時間里用含有100μg純化的71KD蛋白質(zhì)的SAF佐劑組合物兩次免疫接種6只豚鼠。其他動物則用未純化之細胞外蛋白質(zhì)的整體制劑、或用作陽性對照的EP及用作陰性對照的緩中液作相似的免疫。接觸致死量氣霧化結(jié)核菌后，監(jiān)測豚鼠體重6個月。再次用純化形式的豐富細胞外產(chǎn)物免疫的動物產(chǎn)生了抗強毒力結(jié)核分枝桿菌的保護性免疫。這個階段終了時，與實驗組動物相比較，用緩沖液免疫的動物顯示有明顯的體重降低。另外，陽性對照組和71KD蛋白質(zhì)免疫的動物存活率分別為63％和50％，而未經(jīng)免疫的動物均在觀察期結(jié)束前死亡。
值得注意的是，疫苗的配制對于本發(fā)明來說并不是關鍵性的，并且可作最佳化改動以利于給藥?？梢詥为毷褂没蛘咭匀魏卧O計好的方式聯(lián)合使用從病原體主要豐富細胞外產(chǎn)物制得的純化之免疫原性決定簇的溶液，以產(chǎn)生保護性免疫反應?？梢詥为毻队眉兓牡鞍踪|(zhì)溶液，或者將其與佐劑混合配制后給藥。用于本發(fā)明以提高選擇的免疫原性決定簇之活性的特定示例性佐劑是SAF、含有單磷?；|(zhì)A的佐劑、弗氏不完全佐劑及含有死細菌的弗氏完全佐劑?？捎糜诒景l(fā)明的其他佐劑是油包水型乳劑、礦物鹽(例如明礬)、核酸、嵌段聚合物表面活性劑及微生物細胞壁(肽糖脂)。雖然不限制本發(fā)明的范圍，但相信由于佐劑可減慢抗原從注射部位釋放，故可能提高免疫反應。
本領域技術人員在結(jié)合將在下文中首先給出的簡要說明的附圖，閱讀了下面對本發(fā)明優(yōu)選實施方案的詳細描述后，將會全面了解本發(fā)明的其他目的、特征及優(yōu)點。
附圖的簡要說明

圖1顯示4個標示為1A至1D的考馬斯藍染色的凝膠，說明如經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定的幾種結(jié)核分枝桿菌主要豐富細胞外產(chǎn)物的純化。
圖2顯示鑒定十二種結(jié)核分枝桿菌主要豐富細胞外產(chǎn)物的5個N末端氨基酸，及十四種這類產(chǎn)物的表觀分子量。
圖3列表顯示三種結(jié)核分枝桿菌主要豐富分泌產(chǎn)物的延伸的N末湍氨基酸序列，這些產(chǎn)物是不能根據(jù)圖2中所示的5個N末湍氨基酸來區(qū)別的。
圖4是圖解比較用純化的結(jié)核分枝桿菌30KD主要豐富分泌產(chǎn)物免疫的豚鼠、用現(xiàn)有技術整體細胞外蛋白質(zhì)制劑免疫的陽性對照組動物，以及未免疫的陰性對照組動物在接觸致死量氣霧化結(jié)核分枝桿菌后的存活率。
圖5是圖解比較用純化的71KD主要豐富細胞外產(chǎn)物免疫的豚鼠，用現(xiàn)有技術中結(jié)核分枝桿菌整體細胞外蛋白質(zhì)制劑免疫的陽性對照組動物，及未經(jīng)免疫的陰性對照組動物在接觸致死量氣霧化結(jié)核分枝桿菌后的平均豚鼠體重。
圖6是圖解比較圖5中用結(jié)核分枝桿菌的純化的71KD主要豐富細胞外產(chǎn)物免疫的豚鼠、用現(xiàn)有技術中細胞外蛋白質(zhì)的整體制劑免疫的陽性對照組動物，以及未免疫的陰性對照組動物在接觸致死量氣霧化結(jié)核分枝桿菌后的存活率。
圖7是圖解比較在第二次不同實驗中用純化的主要豐富71KD細胞外產(chǎn)物免疫的豚鼠和未免疫的陰性對照組動物在接觸致死劑量氣霧化結(jié)核分枝桿菌后的平均體重。
圖8A和8B是圖解比較在PPD+(結(jié)核分枝桿菌感染的指征)和PPD-人體中對舉例的純化之主要豐富71KD細胞外產(chǎn)物的淋巴細胞增殖反應。圖8A是圖示在淋巴細胞與該抗原保溫后2天測得的數(shù)值，而圖8B是圖示在保溫后4天測得的數(shù)值。
圖9是圖解比較用含有按本發(fā)明技術生產(chǎn)之聯(lián)合的細胞外產(chǎn)物的疫苗免疫的豚鼠和未免疫的對照組動物在接觸致死量氣霧化結(jié)核分枝桿菌后的平均體重。
圖10是圖解比較用三個不同劑量的含有按本發(fā)明技術生產(chǎn)之聯(lián)合的細胞外產(chǎn)物的疫苗免疫的豚鼠，和未免疫的對照組豚鼠在接觸致死量氣霧化結(jié)核分枝桿菌后的平均體重。
圖11是圖解比較用含有以六種不同方式組合之按本發(fā)明技術生產(chǎn)的細胞外產(chǎn)物的疫苗免疫的豚鼠，和非免疫的對照組豚鼠在接觸致死量氣霧化結(jié)核分枝桿菌后的平均體重。
發(fā)明的詳細描述本發(fā)明涉及化合物和其生產(chǎn)方法及其作為疫苗和免疫治療劑對抗病原生物體的應用。更具體地說，本發(fā)明涉及由病原生物體釋放的主要豐富細胞外產(chǎn)物或其免疫原性類似物的生產(chǎn)和作為疫苗或免疫治療劑的應用，以及在哺乳動物宿主中產(chǎn)生抗感染之保護性免疫的相關方法。為便于描述，本申請中將這些化合物稱為疫苗。
在舉例說明性的本發(fā)明實施方案中，區(qū)分并隨后純化了結(jié)核分枝桿菌的主要豐富細胞外產(chǎn)物。用純化形式的這些主要優(yōu)勢細胞外產(chǎn)物免疫豚鼠，而不必確定個別產(chǎn)物的特異分子免疫原性。另外，可以個別或聯(lián)合使用純化的細胞外產(chǎn)物，并以不同的劑量和給藥途徑進行免疫。本領域熟練技術人員將會理解到，可以利用上述戰(zhàn)略以任何病原生物體或細菌去實踐本發(fā)明的方法，因此本發(fā)明不特別限于抗結(jié)核分枝桿菌的疫苗和方法。
在這些舉例的實施方案中，使用柱層析法分離和純化結(jié)核分枝桿菌的主要豐富細胞外產(chǎn)物。使用聚丙烯酰胺凝膠電泳法確定細胞外產(chǎn)物的相對豐度并純化之。在純化疫苗成分后，單獨或聯(lián)合使用主要豐富細胞外產(chǎn)物免疫接種豚鼠，并在其后用結(jié)核分枝桿菌攻擊動物。如將在下文中詳細討論的，除了在免疫后建立抗這些細胞外產(chǎn)物的預期的可檢測反應外，本發(fā)明的疫苗還不可預見地在這些實驗室動物體內(nèi)引發(fā)對抗繼后致死量氣霧化結(jié)核分枝桿菌感染的有效免疫性。
雖然這些舉例的實施方案使用了純化形式的細胞外產(chǎn)物，但本領域技術人員會理解到可以使用通過重組技術生產(chǎn)的免疫原類似物或以本領域已知技術化學合成的其他形式的細胞外產(chǎn)物很容易地實現(xiàn)本發(fā)明。另外，可以使用主要豐富細胞外產(chǎn)物的免疫原性類似物、同系物或其選擇的片段代替屬于本發(fā)明范圍和原則內(nèi)的天然產(chǎn)物。
為使本領域技術人員進一步理解本發(fā)明，提供下列非限制性實施例，以舉例說明鑒定、分離、生產(chǎn)和使用作為疫苗之主要豐富細胞外產(chǎn)物(單獨和聯(lián)合使用的)的方法。
實施例1分離和生產(chǎn)結(jié)核分枝桿菌中的整體細胞外蛋白質(zhì)(EP)從美國組織培養(yǎng)物保藏中心(American Tissue Culture Collec-tion，Rockville，Md)得到結(jié)核分枝桿菌Erdman菌株(ATCC 35801)。將凍干的細菌重新懸浮在Middlebrook 7H9培養(yǎng)基(DifcoLaborato-ries，Detroit，Mich.)中并保持在Middlebrook7H10瓊脂培養(yǎng)基上。按前已描述的方法使用Bacto Middlebrook 7h10瓊脂(Difco)、OADCEnrichment Medium(Difco)、0.1％酪蛋白酶促水解物(Sigma)、和甘油制備7H11瓊脂(Cohn，M.L.，Am.Rev.Respir.Dis.，98295-296)。高壓滅菌后，將瓊脂散布于細菌培養(yǎng)皿(100×15mm)中并冷卻之。
然后使用無菌技術鋪敷結(jié)核分枝桿菌并在5％CO2-95％空氣，100％濕度環(huán)境中37℃培養(yǎng)之。在7H11上培養(yǎng)7天后，從平皿上刮取菌落，以108CFU/ml懸浮在7H9培養(yǎng)液中并分裝于1.8ml Nunc冷凍管(Roskilde，Denmark)中。用998ml蒸餾水和2ml甘油(SigmaChemical，Co.，St.Louis，MO.)再水合7.7g Bacto Middlebrook 7H9粉末以制備每升培養(yǎng)液，然后將混合物調(diào)到pH6.75并將培養(yǎng)液于121℃高壓滅菌15分鐘。然后緩慢冷凍等份的細胞并貯存于-70℃。在這些條件下貯存的細胞仍可無限期存活并可在需要時使用之。
從生長于上述Middlebrook 7H9培養(yǎng)液中的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物制得整體細胞外蛋白質(zhì)(EP)制劑。重新配制后，于121℃下將150ml等份的培養(yǎng)液高壓滅菌15分鐘，并分散于排空的Co-star225cm2組織培養(yǎng)瓶中。融化按上文所述貯存于-70℃下的結(jié)核分枝桿菌細胞并用于接種7H11瓊脂平皿。培養(yǎng)7天后，從平皿上刮取菌落，懸浮于幾ml 7H9培養(yǎng)液中，并在水溶中進行超聲處理以形成單細胞懸液。根據(jù)用Perkin-Elmer Junior35型分光光度計(Norwalk，Conn)檢測結(jié)果，在初始光密度為0.05時以150ml等份無菌懸浮結(jié)核分枝桿菌細胞。然后在5％CO2-95％空氣中將細胞于37℃保溫3周，直至懸液顯示有0.4至0.5的光密度。用這些培養(yǎng)物作為進一步在7H9培養(yǎng)液中培養(yǎng)的原菌液。在水溶中超聲處理原菌液使之形成單細胞懸液。然后在7H9培養(yǎng)液中將結(jié)核分枝桿菌細胞稀釋至初始光密度為0.05，并在5％CO2-95％空氣中于37℃保溫21/2-3周，直到光密度為0.4-0.5。分離培養(yǎng)物上清并相繼通過0.8μm和0.2μm低蛋白質(zhì)結(jié)合濾膜(Gelman SciencesInc，Am.Arbor，Mich.)過濾除菌。然后在帶有10KD截留分子量Omega膜的Filtron Minisette超濾器中將上述濾液濃縮大約35倍，并在4℃下貯存之。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析整體細胞外蛋白質(zhì)制劑揭示出有多條帶的蛋白質(zhì)組合物。得到40——95％硫酸銨沉淀的培養(yǎng)物濾液，制得整體細胞外蛋白質(zhì)混合物(EP)。
實施例2純化結(jié)核分枝桿菌的基本主要豐富細胞外產(chǎn)物0℃下以10％至95％的濃度向?qū)嵤├?的無菌培養(yǎng)物濾液中加硫酸銨(I級，Sigma)，并輕輕攪拌以分級分離蛋白質(zhì)。將懸浮移入塑料瓶中，用RC3B Sorvall離心機在大直徑料桶轉(zhuǎn)子中3,000rpm離心以分離所得到的沉淀物。倒出上清液并根據(jù)所需產(chǎn)物不同進一步純化上清液或沉淀產(chǎn)物。在感興趣的產(chǎn)物含在上清液中時，經(jīng)增加上述第一次沉淀的鹽濃度，完成對上清液的第二次硫酸銨沉淀。在輕輕攪動溶液后按上述方法離心以沉淀所需產(chǎn)物，并對第二上清液進行進一步的純化。
離心后，將沉淀的蛋白質(zhì)重新溶解在適當?shù)睦渚徶幸褐胁⒃诰哂?,000至8,000截留分子量的Spectrapor透析膜(Spectrum Medi-calIndustries，Los Angeles，California)中徹底透析以除鹽。用雙辛可酸蛋白質(zhì)檢測法(Pierec Chemical Co.，Rockford，Illinois)檢測細胞外蛋白質(zhì)濃度，并使用SDS-PAGE檢測各部分成分。將各部分加于層析柱上進一步純化之。
使用上文簡要的一般流程，從按實施例1所述方法制得的總體細胞外蛋白質(zhì)濾液中純化出十四種細胞外產(chǎn)物。以下就所分離的每種細胞外產(chǎn)物詳細描述確切的硫酸銨沉淀方法和層析方法。A.110KD細胞外產(chǎn)物1.按上述方法得到50——100％硫酸銨沉淀物。
2.透析重新溶解的沉淀物并上樣于DEAE Sepharose CL-6B或QAE Sepharose離子交換柱上，其中柱緩沖液由10％山梨醇、10mM磷酸鉀(pH7)、5mM 2-巰基乙醇和0.2mM EDTA組成，并用氯化鈉梯度洗脫。在約550mM鹽濃度時洗脫含110KD蛋白質(zhì)的部分并收集之。將收集的部分上樣于在PB5(磷酸鹽緩沖鹽水)中的S200 Sepharose大小分收分離柱中。作為均質(zhì)110KD蛋白質(zhì)洗脫該蛋白質(zhì)。B.80KD細胞外產(chǎn)物1.棄去0-25％硫酸銨沉淀部分(0°，1小時)并按上文討論的方法保留25-60％硫酸銨沉淀部分(0℃過夜)。
2.用含有1M NaCl的25mM Tris(pH8.7)裝填DEAE CL-6B柱(pHarmacia)，并用25mM Tris(Ph8.7)、10mM NaCl平衡之，將蛋白質(zhì)樣品對25mM Tris透析并加樣于柱上。用同樣緩沖液洗柱過夜，使加在25mM Tris(pH8.7)中的10mM至200mM NaCl的第一鹽梯度通過柱以洗脫其他蛋白質(zhì)。使第二鹽梯度(200至300mM NaCl)通過柱并在大約275mM NaCl處洗脫80KD蛋白質(zhì)。
3.用25mM Tris(pH8.7)，10mM NaCl裝Q-Sepharose HP柱并重新平衡到25mM Tris(pH8.7)、10mM NaCl。將蛋白質(zhì)樣品對25mM Tris(pH8.7)、10mM NaCl透析并上柱。在同樣緩沖液中洗柱，然后用加在25mM Tris(pH8.7)中的200-300mM NaCl洗脫。
4.收集含有80KD蛋白質(zhì)的部分并對25mM Tris(pH8.7)、10mM NaCl透析，然后在Speed-Vac濃縮器中濃縮到1-2ml。將蛋白質(zhì)樣品加樣于Superdex 75柱上并用25mM Tris(pH8.7)、150mM NaCl洗柱。作為均一蛋白質(zhì)洗脫80KD蛋白質(zhì)。C.71KD細胞外產(chǎn)物1.按上述方法制得40-95％硫酸銨沉淀物，但不同的是在7H9培養(yǎng)液(pH7.4)中，于0％CO2環(huán)境下培養(yǎng)71KD產(chǎn)物，并于42℃熱休克3小時，每周一次。將沉淀物對初始緩沖液(InitialBuffer；20mM Hepes、2mM MgAc、25mM KCl、10mM(NH4)2SO4、0.8mM DL-二硫蘇糖醇，pH7.0)透析。
2.將重新溶解的沉淀物加樣于初始緩沖液平衡過的ATP A-garose柱上。收集流出物并再次上ATP Agarose柱。71KD蛋白質(zhì)結(jié)合于柱上。
3.首先用初始緩沖液，再用1M KCl，然后用初始緩沖液洗ATPAgarose柱。
4.用10mM ATP從柱上洗脫均質(zhì)71KD蛋白質(zhì)并對磷酸鹽緩中液透析。D.58KD細胞外產(chǎn)物1.按上述方法得到25-50％硫酸銨沉淀物。
2.透析重新溶解的沉淀物并加于DEAE-SepharoseCL-6B或QAE-Sepharose柱上，然后用NaCl洗脫。收集在大約400mM NaCl處洗脫的含58KD蛋白質(zhì)的部分。
3.然后使收集的部分過Sepharose CL-6B柱。在大約670-700,000道爾頓處洗脫該蛋白質(zhì)。
4.將洗脫的蛋白質(zhì)上硫丙基-瓊脂糖柱。在大約250-350mM2-硫基乙醇處洗脫均質(zhì)58KD蛋白質(zhì)。使用SDS-PAGE監(jiān)測洗脫的蛋白質(zhì)并在凝膠上展示出如圖1A第2欄所示的單一帶。E.45KD細胞外產(chǎn)物1.a.棄去0-25％硫酸銨沉淀物(0℃下1小時)。
b.保留25-60％硫酸銨沉淀物(0℃下過夜)。
2.a.用含有1M NaCl的2.5mM Tris(pH8.7)裝DEAE CL-6B柱(Pharmacia)并用25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)平衡該柱。
b.將蛋白質(zhì)樣品對25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)透析并上柱。然后用同樣緩沖液洗柱過夜。
c.用加在25mM Tris，pH8.7緩沖液中的鹽梯度(10mM至200mM)洗脫柱。在大約40mM NaCl處洗脫45KD蛋白質(zhì)。
3.a.用含有1M NaCl的25mM Tris，pH8.7填充Q-SepharoseHP柱(Pharmacia)并再次用25mM Tris，10mM NaCl，pH8.7平衡之。
b.將蛋白質(zhì)樣品對25mM Tris，10mM NaCl，pH8.7透析，上柱后用同樣緩中液洗柱。
c.用加在25mM Tris(pH8.7)中的10-150mM NaCl洗脫柱。
4.a.收集含45KD產(chǎn)物的部分，合并后對25mM Tris，10mMNaCl，pH8.7透析，然后在Speed Vac濃縮器中濃縮至1ml。
b.將濃縮物加于用25mM Tris，150mM NaCl，pH8.7平衡過的Superdex75柱上。作為均質(zhì)蛋白質(zhì)洗脫該產(chǎn)物。使用SDS-PAGE監(jiān)測洗脫的蛋白質(zhì)并可見如圖1B第二欄中所示的單一帶。F.32KD細胞外產(chǎn)物(A)1.a.棄去0-25％硫酸銨沉淀物(0℃，1小時)。
b.保留25-60％硫酸銨沉淀物(0℃，過夜)。
2.a.用含有1M NaCl的25mM Tris，pH8.7裝填DEAE CL-6B柱，然后用25mM Tris，10mM NaCl，pH8.7平衡之。
b.將蛋白質(zhì)樣品對25mM Tris，10mM NaCl，pH8.7透析，上柱后用同樣緩中液洗柱過夜。
c.用加在25mM Tris，pH8.7緩沖液中的鹽梯度(10mM至200mM)洗脫柱。在大約70mM NaCl處洗脫32KD蛋白質(zhì)。
3.a.收集含32KD產(chǎn)物的部分，合并并對25mM Tris，10mMNaCl，pH8.7透析，然后在Speed-Vac濃縮器中將蛋白質(zhì)樣品濃縮到1ml。
b.然后使所得濃縮物通過已用25mM Tris，150mM NaCl，pH8.7平衡過的Superdex75柱，并用該緩中液洗脫。作為均質(zhì)蛋白質(zhì)洗脫32KD產(chǎn)物。
4.a.用含有1M NaCl的25mM Tris，pH8.7裝填Q-SepharoseHP柱(Pharmacia)，并再次用25mM Tris，10mM NaCl，pH8.7平衡之。
b.將蛋白質(zhì)樣品對25mM Tris，10mM NaCl，pH8.7透析并上柱，然后用同樣緩沖液洗柱。
c.用100-300mM NaCl梯度洗脫柱。在大約120mM NaCl處洗脫作為均質(zhì)蛋白質(zhì)的標記的32A，并給出如圖1B，欄4中所示的單一帶。G.32KD細胞外產(chǎn)物(B)
1.a.棄去0-25％硫酸銨沉淀部分(0℃1小時)。
b.保留25-60％硫酸銨沉淀部分(0℃過夜)。
2.a.用含有1M NaCl的25mM Tris，pH8.7裝填DEAE CL-6B柱(Pharmacia)，然后用25mM Tris，10mM NaCl，pH8.7平衡之。
b.將蛋白質(zhì)樣品對25mM Tris，10mM NaCl，pH8.7透析，上柱后用同樣緩沖液洗柱過夜。
c.過加在25mM Tris，pH8.7中的10mM至200mM NaCl的第一鹽梯度以洗脫各種蛋白質(zhì)。平衡柱后，過第二鹽梯度(200至300mM NaCl)。在大約225mM NaCl處洗脫32KD蛋白質(zhì)。
3.a.將含有1M NaCl的25mM Tris，pH8.7充入Q-SepharoseHp柱(Pharmacia)中，并再次用25mM Tris，10mM NaCl，pH8.7平衡之。
b.將蛋白質(zhì)樣品對25mM Tris，10mM NaCl，pH8.7透析，上柱，然后在同樣緩沖液中洗柱。
c.用加在同樣緩中液中的200-300mM NaCl梯度洗脫柱。
4.a.收集含有32KD產(chǎn)物的部分，合并后對25mM Tris，10mMNaCl，pH8.7透析，然后在Speed-Vac濃縮器中將蛋白質(zhì)樣品濃縮到1ml。
b.然后將濃縮物過已用25mM Tris，150mM NaCl(pH8.7)平衡的Superdex75柱，并用同樣緩中液洗脫。作為均一蛋白質(zhì)洗脫標記為32B的32KD產(chǎn)物，以將其與使用方法H分離的32KD蛋白質(zhì)區(qū)分開，該產(chǎn)物在凝膠電泳上顯示如圖1B欄3所示的單一帶。H.30KD細胞外產(chǎn)物1.a.棄去0-25％硫酸銨沉淀物(0℃1小時)。
b.保留25-60％硫酸銨沉淀物(0℃過夜)。
2.a.用含有1M NaCl的25mM Tris，pH8.7填入DEAE CL-6B柱(Pharmacia)，然后用25mM Tris，10mM NaCl，pH8.7平衡。
b.將蛋白質(zhì)樣品對25mM Tris，10mM NaCl，pH8.7透析，上柱后用同樣緩沖液洗柱過夜。
c.用加在25mM Tris(pH8.7)緩沖液中的鹽梯度(10mM至200mM)洗脫。在大約140mM NaCl處洗脫30KD蛋白質(zhì)。
3.a.收集含30KD產(chǎn)物的部分，合并后對25mM Tris，10mMNaCl，(pH8.7)透析，然后在Speed-Vac濃縮器中將蛋白質(zhì)樣品濃縮到1ml。
b.然后將濃縮物上樣于用25mM Tris，150mM NaCl(pH8.7)平衡過的Superdex75柱上并用該緩中液洗脫。作為均質(zhì)蛋白質(zhì)洗脫30KD產(chǎn)物，并顯示為如圖1B，欄5上所示的單一帶。I.24KD細胞外產(chǎn)物1.a.棄去0-25％硫酸銨沉淀物(0℃，1小時)。
b.保留25-60％硫酸銨沉淀物(0℃過夜)。
2.a.將含有1M NaCl的25mM Tris，(pH8.7)填入DEAE CL-6B柱(Pharmacia)，然后用25mM Tris，10mM NaCl，(pH8.7)平衡。
b.將蛋白質(zhì)樣品對25mM Tris，10mM NaCl，(pH8.7)透析，上柱并用同樣緩沖液洗柱過夜。
c.使加在25mM Tris(pH8.7)中的10mM至200mM NaCl的第一鹽梯度通過柱以洗脫各種蛋白質(zhì)。平衡柱后加入第二鹽梯度(200至300mM NaCl)。在大約250mM NaCl處洗脫24KD蛋白質(zhì)。
3.a.將含有1M NaCl的25mM Tris(pH8.7)加于Q-SepharoseHp柱(Pharmacia)中，并用25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)平衡之。
b.將蛋白質(zhì)樣品對25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)透析，上柱后用同樣緩沖液洗柱。
c.用加在同樣緩沖液中的200-300mM NaCl梯度洗脫柱。
4.a.收集含有24KD蛋白質(zhì)產(chǎn)物的部分，合并后對25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)透析，然后在Speed-Vac濃縮器中將蛋白質(zhì)樣品濃縮到1ml。
b.將濃縮物加樣于已用25mM Tris，150mM NaCl(pH8.7)平衡過的柱上并用同樣緩沖液洗脫。作為均質(zhì)蛋白質(zhì)洗脫24KD產(chǎn)物，并顯示為如圖1B，欄7上所示的單一帶。J.23.5KD細胞外產(chǎn)物1.a.棄去0-25％硫酸銨沉淀物(0℃1小時)。
b.保留25-60％硫酸銨沉淀物(0℃過夜)。
2.a.將含有1M NaCl的25mM Tris(pH8.7)充入DEAE CL-6B柱(Pharmacia)上，然后用25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)平衡柱。
b.將蛋白質(zhì)樣品對25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)透析，上柱后用同一緩沖液洗柱過夜。
c.用加在25mM Tris(pH8.7)緩中液中的鹽梯度(10mM至200mM)洗脫柱。在大約80mM NaCl處洗脫23.5KD蛋白質(zhì)。
3.a.將含有1M NaCl的25mM Tris(pH8.7)充入Q-SepharoseHP柱，并再次用25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)平衡之。
b.將蛋白質(zhì)樣品對25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)透析，上柱后用同一緩沖液洗柱。
c.用加在25mM Tris(pH8.7)中的100-300mM NaCl洗脫柱。
d.重復步驟3a至3c。
4.a.收集含有23.5KD產(chǎn)物的部分，合并并對25mM Tris，10mMNaCl(pH8.7)透析，然后在Speed-Vac濃縮器中將蛋白質(zhì)樣品濃縮到1ml。
b.然后將濃縮物上樣于已用25mM Tris，150mM NaCl(pH8.7)平衡過的Superdex75柱上，并用同樣緩沖液洗脫。作為均質(zhì)蛋白質(zhì)洗脫23.5KD產(chǎn)物。使用SDS-PAGE監(jiān)測洗脫的蛋白質(zhì)，并產(chǎn)生出如圖1B，欄6所示的單一帶。K.23KD細胞外產(chǎn)物1.a.棄去0-25％硫酸銨(0℃小時)和25-60％硫酸銨(0℃過夜)沉淀的部分。
b.保留60-95％硫酸銨沉淀物。
2.a.將含有1M NaCl的50mM Bis-Tris(pH7.0)加到DEAE CL-6B柱(Pharmacia)上，并用50mM Bis-Tris，100mM NaCl(pH7.0)平衡之。
b.將蛋白質(zhì)樣品對加有100mM NaCl的50mM Bis-Tris(pH7.0)緩中液透析并上柱，然后用同一緩沖液洗柱過夜。
c.用加在50mM Bis-Tris(pH7.0)中的100至300mM NaCl線性梯度洗脫柱。
d.收集含有大的100-150mM NaCl處洗脫之23KD的蛋白質(zhì)的部分。
3.a.將蛋白質(zhì)部分對25mM Tris(pH8.7)、10mM NaCl透并在Savant Speed Vac濃縮器上濃縮到1-2ml。
b.將濃縮物上樣于已用25mM Tris，150mM NaCl(pH8.7)、平衡過的Superdex75柱上。作為均質(zhì)蛋白質(zhì)洗脫如圖1B，欄8中所示的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。L.16KD細胞外產(chǎn)物1.a.棄去0-25％硫酸銨沉淀物(0℃，1小時)。
b.保留25-60％硫酸鈉沉淀物(0℃過夜)。
2.a.將含有1M NaCl的2.5mM Tris(pH8.7)充入EDAE CL-6B柱(Pharmacia)中，然后用25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)平衡之。
b.將蛋白質(zhì)樣品對含有10mM NaCl的25mM Tris，(pH8.7)透析并上柱，然后用同一緩沖液洗柱過液。
c.用加在25mM Tris，(pH8.7)緩沖液中的鹽梯度(10mM至200mM)洗脫柱。在大約50mM NaCl處洗脫16KD蛋白質(zhì)。
3.a.收集含有16KD產(chǎn)物的部分，合并后對25mM Tris，10mMNaCl(pH8.7)透析，然后在Speed-vac濃縮器中將蛋白質(zhì)的樣品濃縮到1ml.
b.然后將濃縮物上樣于已用25mM Tris，150mM NaCl(pH8.7)平衡過的Superdex75柱上，并用同一緩沖液洗脫之。作為均一蛋白質(zhì)洗脫16KD產(chǎn)物。使用SDS-PAGE監(jiān)測洗脫的蛋白質(zhì)并形成如圖1B，欄9中所示的單一帶。M.14KD細胞外產(chǎn)物1.a.棄去0-25％硫酸銨沉淀物(0℃，1小時)。
b.保留25-60％硫酸鈉沉淀物(0℃過夜)。
2.a.將含有1M NaCl的25mM Tris(pH8.7)充填到EDAE CL-6B柱(Pharmacia)上，然后用25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)平衡。
b.將蛋白質(zhì)樣品對25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)透析并上柱，然后在同一緩沖液中洗柱過液。
c.用加在25mM Tris，(pH8.7)緩沖液中的鹽梯度(10mM至200mM)洗脫柱。在大約60mM NaCl處洗脫14KD蛋白質(zhì)。
3.a.用含有1M NaCl的25mM Tris，(pH8.7)填充Q-SpeharoseHP柱，并重新用25mM NaCl(pH8.7)平衡。
b.將蛋白質(zhì)樣品對25mM Tris，10mM NaCl(pH8.7)透析并上柱，然后用同樣緩中液洗柱。
c.用加在25mM Tris(pH8.7)中的10-150mM NaCl洗脫柱。
d.重復步驟3a至3c.
3.a.收集并合并含有14KD產(chǎn)物的部分，對25mM Tris，10mMNaCl(pH8.7)透析，然后在Speed-Vac濃縮器中將蛋白質(zhì)的樣品濃縮到1ml.
b.然后將濃縮物加樣于已用25mM Tris，150mM NaCl(pH8.7)平衡過的Superdex75柱上，并用該緩沖液洗脫。作為均一蛋白質(zhì)洗脫14KD產(chǎn)物。使用SDS-PAGE監(jiān)測洗脫的蛋白質(zhì)并呈現(xiàn)為如圖1C，欄2中所示的單一帶。N.12KD細胞外產(chǎn)物
1.得到0-10％硫酸銨沉淀物(4℃過夜)。
2.將重新溶解的沉淀物上樣于S200 Sephacryl大小分級分離柱上，并洗脫12KD蛋白質(zhì)分子。
3.將蛋白質(zhì)部分加樣于DEAE-Sepharose CL-6B或QAE-Sepharose離子交換柱上，并按前述方法用NaCl梯度洗脫。在大約300-350mM NaCl處洗脫含有分子量約為12KD之兩種均質(zhì)蛋白質(zhì)的部分，并收集之。該蛋白質(zhì)標記為12A和12B，并作為如圖1D，欄2所示的雙帶純化之。
如圖1的SDS-PAGE圖形中舉例顯示的，使用實施例2A-2N中詳述的步驟將結(jié)核分枝桿菌的基本或主要豐富細胞外蛋白質(zhì)純化到均質(zhì)性。更具體地說，圖1圖解顯示使用SOS-PAGE展現(xiàn)的并標記為1A、1B、1C和1D的四個舉例的12.5％丙烯酰胺凝膠。凝膠1A-1C泳道1中的標準品包括分子量為66、45、36、29、24、20和14KD的蛋白質(zhì)。凝膠1D中，泳道1上的標準品含有分子量為68、45、31、29、20和14KD的蛋白質(zhì)。含有各自純化之細胞外產(chǎn)物的泳道基本上顯示具有個別蛋白質(zhì)已報導分子量的一條帶。應注意的是，在凝膠1D中，泳道2上可見12KD蛋白質(zhì)為雙重帶。序列分析顯示，下方12KD帶(或12B KD帶)等同于上方12KD帶(或12AKD帶)，不同的是其缺少前3個N末端氨基酸。
圖2中提供了對這些個別主要豐富細胞外產(chǎn)物的進一步分析結(jié)果。更具體地說圖2是列表比較從這些純化之細胞外產(chǎn)物得到的N末端序列數(shù)據(jù)，顯示大部分分離的產(chǎn)物確實是不同的。蛋白質(zhì)32A、32B和30都具有相同的5個N末端氨基酸，因此，為了充分鑒定和區(qū)分這些產(chǎn)物須作進一步的序列分析。圖3顯示這三種純化的分泌產(chǎn)物的延伸的N末端氨基酸序列。位置16、31和36上不同的氨基酸證明，盡管這些分離的蛋白質(zhì)的分子量相似，但它們是彼此不同的。
除了蛋白質(zhì)30、32A和32B外，還檢測了其他主要豐富細胞外產(chǎn)物的延伸的N末端氨基酸序列，以提供一級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)并找出這些蛋白質(zhì)間的可能的關系。使用本領域已知的技術對按照實施例2所述方法純化的細胞產(chǎn)物進行序列測定。下表中給出由完整蛋白質(zhì)的表觀分子量認定的，并使用標準的單字母縮寫字代表天然氨基酸的，用于確定每種細胞外產(chǎn)物的不同長度的N末端氨基酸序列。為了與已建立的記錄規(guī)則一致，以氨基末端到羧基末端的方向從左到右書寫N末端序列。在已確定之氨基酸的認定不太肯定的位置下方旬有橫線。有特殊位置的氨基酸是未測出或不明確的，在序列中的這一位置用短線代表。最后，兩個氨基酸由一斜線分開是表示正確組成尚未被明確鑒定并且可能由任一個氨基酸占據(jù)該序列中的這一位置。蛋白質(zhì) N末端氨基酸序列5 10 15 20 25 30 3512KDFDTRL MRLED EMKEG RYEVR AELPG VDPDK DVDTM40 45VRDGQLTIKAERT5 10 15 20 25 3014KDADPRL QFTAT TLSGA PFDGA S/NLQGK PAVLW5 10 15 20 25 3016KDAYPIT GKLGS ELTMT DTVGQ VVLGWKVSDL35 40 45F/YKSTAVIPGYTV - EQ QI5 10 15 2023KDAETYL PDLDWDYGALEPHIS GQ5 1023.5KD APKTY - EELK GTD
5101520 25303524KD APYEN LMVPS PSMGR DIPVAFLAGG PHAVY LLDAF4045505560NAGPD VSNWV TAGNA MMTLA- KGIC/S510152025 303530KD FSRPG LPVEY LQVPS PSMGRDIKVQFQSGG NNSPA40VYLLD510152025 303532A KD FSRPG LPVEY LQVPS PSMGRDIKVQFQSGG ANSP-40LYLLD510152032B KD FSRPGLPVEY LQVPS A-MGRDI510152025 3045KD DPEPAPPVPD DAASP PDDAAAPPAPADPP-510152058KD TEKTPDDVFK LAKDE KVLYL571KD ARAVG I580KD TDRVSVGN
5 10 15 20110KD NSKSV NSFGA HDTLK V-ERK RO這一序列數(shù)據(jù)，再結(jié)合使用SDS-PAGE確定的物理性質(zhì)，即可得以鑒定并區(qū)分本發(fā)明的這些有代表性的主要豐富細胞外產(chǎn)物。所描述的分析結(jié)果表明，這些蛋白質(zhì)構(gòu)成了包括71KD、30KD、32AKD、23KD和16KD產(chǎn)物的，約占可利用之總細胞外產(chǎn)物60％(重量)的大部分的結(jié)核分枝桿菌細胞外產(chǎn)物。進一步估測到，30KD蛋白質(zhì)可能構(gòu)成由結(jié)核分枝桿菌釋放之總產(chǎn)物重量的至多25％。因此，在本發(fā)明的實踐中使用的結(jié)核分枝桿菌個別主要豐富細胞外產(chǎn)物可以從細胞外產(chǎn)物總重量的大約0.5％至大約25％。
如上文所討論的，由于了解到傳統(tǒng)的Western印跡分析法不能恒定地鑒定最具免疫原特異性的細胞外產(chǎn)物，所以本發(fā)明人決定基于它們的豐度來分析主要豐富細胞外產(chǎn)物的免疫原性，并進而易于鑒定和分離之。結(jié)果令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，這些主要豐富細胞外產(chǎn)物誘導了不可預見的有效免疫反應，致使發(fā)明人得出它們可能有疫苗功能的結(jié)論。這一令人驚奇的發(fā)現(xiàn)導致了如上文討論的本發(fā)明的非限制性功能理論的發(fā)展。
為了證明本發(fā)明的效率，使用各種不同劑量的單一主要豐富細胞外產(chǎn)物和其組合進行附加實驗，以在常規(guī)采用的實驗室動物模型體內(nèi)誘導保護性免疫。更具體地說，使用純化的單一主要豐富細胞外產(chǎn)物在繼后受到結(jié)核分枝桿菌的豚鼠體內(nèi)誘導保護性免疫。使用不同的給藥途徑對五種純化之主要豐富細胞外產(chǎn)物的不同組合進行相似地試驗，結(jié)果顯示這些蛋白質(zhì)能夠誘導保護性免疫。特別是使用30KD豐富細胞外產(chǎn)物與純化形式的71KD細胞外產(chǎn)物一樣在認可的動物模型體內(nèi)誘導保護性免疫。與個別舉例的主要豐富的細胞外產(chǎn)物一樣，五種主要豐富細胞外產(chǎn)物的組合疫苗也賦予了對抗致死量結(jié)核分枝桿菌攻擊的保護作用。對本發(fā)明的這些疫苗所作的各項研究的結(jié)果如下所述。
在包括用結(jié)核分枝桿菌進行免疫原或氣霧攻擊在內(nèi)的所有實驗中均使用無特異病原體的雄性Hartley品系豚鼠(Charles RiverBreeding Laboratories，North Wilmington，Massachusetts)作為動物模型。將動物分2或3只圈養(yǎng)在不銹鋼籠內(nèi)并之自由接近標準的豚鼠食物和水。在進入動物設施后，至少觀察豚鼠一周，然后再開始每項實驗，以確保動物健康。
使用估計占通常存在的總細胞外產(chǎn)物之3％-25％的個別主要豐富細胞外產(chǎn)物進行最初的實驗。這些實驗證明主要豐富細胞外產(chǎn)物可引發(fā)有效的免疫反應。更具體地說，所分離的30KD和71KD細胞外產(chǎn)物均顯示能夠產(chǎn)生在豚鼠接觸致死量結(jié)核分枝桿菌后保護動物的細胞介導的免疫反應。
實施例3用純化的30KD蛋白質(zhì)進行皮膚試驗以檢測30KD免疫之豚鼠的細胞介導的免疫反應進行皮膚超敏感性試驗以舉例說明可由純化形式的豐富細胞外產(chǎn)物誘導可檢測的免疫反應。用按照實施例2所述方法純化并椐信含有大約25％結(jié)核分枝桿菌總細胞外產(chǎn)物的主要豐富結(jié)核分枝桿菌30KD分泌產(chǎn)物免疫豚鼠。在三個獨立的實驗中，每隔三周用加在SAF佐劑中的100mg實質(zhì)上純化的30KD蛋白質(zhì)豚鼠免疫三次。依同樣方法將加在SAF中的緩沖液注射給對照組動物。末次免疫后三周用30KD蛋白質(zhì)攻擊豚鼠以進行皮膚超敏感性試驗。
剃掉豚鼠背部毛并經(jīng)皮內(nèi)注射投用0.1、1和10μg 30KD蛋白質(zhì)，24小時后檢查所產(chǎn)生的紅斑(皮膚紅色)和硬結(jié)，結(jié)果如下列表A中所示。數(shù)據(jù)使用傳統(tǒng)方法以各組的平均測定值±標準誤差(SE)表示。ND表示未作本發(fā)明的這一特殊方面的實驗。
表A對30KD蛋白質(zhì)的紅斑反應(mm)(平均值±SE)豚鼠狀態(tài)n0.1μg1.0μg10.0μg實驗1免疫組 61.2±0.5 3.9±0.8 6.9±1.0對照組5 NDND 3.0±0.9實驗2免疫組60.5±0.5 5.4±0.7 8.1±0.6對照組30±0 2.5±0 1.7±0.8實驗3免疫組6 ND 1.7±1.1 6.2±0.3對照組3 NDND 2.0±0.0對30KD蛋白質(zhì)的硬結(jié)反應(mm)(平均值±SE)豚鼠狀態(tài)n0.1.μg1.0μg10.0μg實驗1免疫組 60±0 3.3±0.3 5.6±0.9對照組 5ND ND 1.6±1.0實驗2免疫組 60±0 3.8±0.7 4.9±1.2對照組 30±0 0.8±0.8 1.7±0.8實驗3免疫組 6ND1.1±1.1 4.7±0.4對照組 3ND 0±0 0±0如表A所示的顯著紅斑和硬結(jié)所證實的，用30KD分泌產(chǎn)物免疫的豚鼠表現(xiàn)出強的細胞介導的免疫反應。相反，對照組動物則表現(xiàn)很小的反應。
為了進一步證實30KD分泌產(chǎn)物的免疫反應性并顯示其對傳染性結(jié)核病的可應用性，用結(jié)核分枝桿菌感染非經(jīng)免疫的豚鼠并用該蛋白質(zhì)攻擊動物。
實施例4檢測結(jié)核分枝桿菌感染之豚鼠的細胞介導的免疫反應的純化之30KD蛋白質(zhì)試驗為了獲得用于實驗中感染豚鼠所需的細菌，首先將結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)于7H11瓊脂上并通過豚鼠肺傳代一次以保證它們是有毒力的。為此，用含有大約5×104個細菌/ml的加在7H9培養(yǎng)液中之10ml細菌懸液的氣霧劑攻擊豚鼠。豚鼠發(fā)病后，殺死動物并切除包含明顯的結(jié)核分枝桿菌損傷的肺。將每葉肺研碎并在7H11瓊脂上培養(yǎng)7天至10天。從平皿上刮取細菌，在含有10％甘油的7H9培養(yǎng)液中稀釋，在水浴中超聲處理以得到單細胞懸液，并以大約2×107個活菌/細胞的濃度于-70℃緩慢冷凍。經(jīng)融化細菌懸液并在7H11瓊脂上培養(yǎng)懸液的系列稀釋液來檢測冷凍之細胞的存活率。剛好在攻擊之前，融化一小瓶細菌細胞并在7H9培養(yǎng)液中稀釋到所需的濃度。
使豚鼠在一特殊設計的有機玻璃氣霧室中接觸活結(jié)核分枝桿菌的氣霧。氣霧室大小為14×13×24英寸，并在相反側(cè)面上包括兩個6英寸直徑的門以用來引入或放出豚鼠。氣霧入口位于小室頂蓋的中心。真空泵(Gast Mfg.Co.，Benton Harbor，Michigan)于301b/英寸2的速度將空氣送到氣霧噴射管單元(Mes Inc.，Burbank，Cali-fornia)并從10ml細菌懸液產(chǎn)生氣霧。一個0.2μm呼吸循環(huán)過濾單元(Pall Biomedical Inc.，F(xiàn)ajardo，Puerto Rico)位于小室的一端，用以平衡裝置內(nèi)部和外部的壓力。為安全考慮，用全部置于層流罩內(nèi)的小室進行氣霧攻擊。
使動物接觸病體原氣霧30分鐘，在此期間完全排出氣霧器中的細菌懸液。每次從含有大約5.0×104細菌顆粒/ml的10ml懸液產(chǎn)生氣霧。先前的研究已顯示，接觸這一濃度細菌的未受保護豚鼠均發(fā)生了感染。氣霧感染后，將豚鼠圈養(yǎng)在置于層流安全罩(AiroClean Engineering Inc.，Edgernont，Pernnsylvania)內(nèi)的不銹鋼籠中并觀察疾病征象。在整個實驗期間，動物可自由接近標準的豚鼠食物和水。
在該實驗中，殺死被感染的豚鼠并檢測在對各種濃度之30KD蛋白質(zhì)反應中出現(xiàn)的脾淋巴細胞增殖情況。更具體地說，按Brie-man和Horwitz(J.Exp.Med.164799-811；列為本文參考文獻)所述方法制備并純化脾淋巴細胞。將加在含有青霉素(100v/ml)、鏈霉素(100μg/ml)和10％胱牛血清(GIBCO)之RPMI 1640(GIBCOLaboratories，Grancl Island，New York)中的淋巴細胞調(diào)到107/ml的終濃度，并在微量試驗孔(96孔圓底組織培養(yǎng)板；Falcon Labware，Oxnard，California)中以100ml的總體積，在5％CO2-95％空氣和100％濕度條件下于37℃與不同濃度的純化30KD分泌產(chǎn)物一起保溫2天。使用未被感染的動物作為陰性對照。保溫結(jié)束時，向各孔內(nèi)加入0.25μCi〔3H〕胸腺嘧啶(New England NaClear，Boston，Mas-sachusetts)并在5％CO2-95％空氣和100％濕度環(huán)境下將細胞繼續(xù)于37℃保溫2小時。使用多樣品自動細胞收獲器(Skatron Inc.，Sterling，Vinginia)洗各小孔，并使流出物通過過濾墊(Skatron)。將代表分立微量試驗孔的濾墊部分放在閃爍瓶中，并加入2ml EcoscintH液體閃爍混合液(National Diagnostics，Manyille，New Jersey)。在3閃爍計數(shù)器(Beckman Instruments Inc.，F(xiàn)ullerton，Califotnia)中檢測β粒子發(fā)射。
對1和10μg/ml分離的30KD分泌蛋白質(zhì)檢測得自被感染和未被感染豚鼠的組織樣品。然后監(jiān)測樣品摻入〔3H〕胸苷的能力。下列表B中給出了這些檢測的結(jié)果。
數(shù)據(jù)是本公開目的作為刺激指數(shù)給出的，其定義為與抗原一起保溫的淋巴細胞的平均〔3H〕胸苷摻入/沒有加抗原保溫的淋巴細胞的平均〔3H〕胸苷摻入。
表B對30KD蛋白質(zhì)的刺激指數(shù)豚鼠狀態(tài)n0.1.μg/ml10.0μg/ml
感染的62.2±0.29.7±4.6對照組61.5±0.32.0±0.8如表B中所示，被感染動物的細胞表現(xiàn)出對30KD蛋白質(zhì)的強反應，即在對該主要豐富分泌產(chǎn)物的反應中出現(xiàn)明顯的劑量依賴性脾淋巴細胞增值。相反，未被感染的動物則只顯示很少的淋巴細胞增值。因此，30KD分泌產(chǎn)物可在結(jié)核分枝桿菌感染的哺乳動物體內(nèi)明顯的誘導細胞介導的免疫反應。
為了舉例說明本發(fā)明疫苗的保護性方面，用純化的30KD蛋白質(zhì)免疫豚鼠并按下述方法使動物接觸結(jié)核分枝桿菌。
實施例5用氣霧化的結(jié)核分枝桿菌攻擊30KD蛋白質(zhì)免疫的豚鼠如前所述，以三周間隔用加在SAF中的100μg 30KD分泌蛋白質(zhì)將動物免疫三次。用加在SAF中的120μg整體EP免疫對照組豚鼠，或用加在圖一佐劑中的緩沖液進行假免疫。末次免疫后三周，按實施例4中所述方法用氣霧化結(jié)核分枝桿菌攻擊動物。監(jiān)測三組動物的存活率，并圖解顯示于表4中。下列表C中給出了攻擊后14周確定的絕對死亡率。
表C豚鼠狀態(tài)存活數(shù)/受攻擊數(shù)百分存活率30KD免疫的 4/6 67％EP免疫的3/6 50％假免疫的1/6 17％如圖4中所示用30KD蛋白質(zhì)免疫三次的豚鼠受到保護而免于死亡。用30KD蛋白質(zhì)免疫的豚鼠約有67％存活，而只有17％假免疫的對照組豚鼠存活。
還監(jiān)測了被免疫動物的體重保留情況(數(shù)據(jù)未示出)，并進一步說明摻入了按本發(fā)明教導由病原菌生產(chǎn)主要豐富細胞外產(chǎn)物的疫苗的預防能力。雖然被免疫動物似乎保留其體重，但假免疫動物的高死亡率使得在被免疫動物和對照組動物之間不可能作出圖解比較。
在得出體重監(jiān)測研究的結(jié)論之后，殺死存活的動物并檢測每只動物右肺和脾中的活結(jié)核分枝桿菌。將動物浸在2％酚衍生物溶液(National Laboratiories，Montvale，New Jersey)中，并無菌切除肺和脾臟。肉眼觀察計數(shù)肺中大體初級表面損傷的數(shù)目。用研缽和杵及90目Norton Alunduin(Fisher)在10ml 7H9中制備各器官勻漿，在7H9中系列稀釋組織勻漿液，并以每滴0.1ml的懸液滴大小在7H11瓊脂的復制平皿上培養(yǎng)各稀釋液，以檢測右肺和脾臟中結(jié)核分枝杵菌的集落形成單位(CFU)數(shù)目。所有平皿均保持在模式保溫箱小室中，并在5％CO2、95％空氣及100％濕度條件下于37℃保溫12至14天。使用該方法進行檢測試驗，結(jié)果以平均集落形成單位(CFU)±標準誤差(SE)表示并示于下列表D中。
表D平均CFU±SE豚鼠狀態(tài)n 右肺脾30KD免疫的 4 3.4±1.7×1077.7±3.9×106假免疫的1 1.8×1088.5×107對數(shù)差0.731.04如表D中所示，用30KD分泌蛋白質(zhì)免疫限制了肺和脾中結(jié)核分枝桿菌的生長。雖然用于比較目的數(shù)據(jù)只是從一只存活的假免疫動物得到的，但四只存活的30KD蛋白質(zhì)免疫的動物肺中的CFU比存活的假免疫動物低0.7對數(shù)值，而脾臟中CFU比存活的假免疫動物低1個對數(shù)值?；谝郧白C明的CFU計數(shù)與死亡率間的高度相關性，存活的動物在肺和脾臟中很可能比在進行CFU分析前即已死亡的動物有較少的CFU數(shù)目。被免疫動物的肺和脾臟中這種CFU數(shù)的降低再次明確地證明了本發(fā)明的范圍和可操作性。
還以其分離的形式試驗了另一種結(jié)核分枝桿菌主要豐富細胞外產(chǎn)物即71KD細胞外產(chǎn)物的免疫保護潛作用，以證明其免疫保護能力。
實施例6用純化的71KD蛋白質(zhì)對整體EP制劑免疫的豚鼠進行皮膚試驗為了證明71KD蛋白質(zhì)在動物體內(nèi)引發(fā)有效免疫反應的能力，使用這種分離的主要豐富細胞外產(chǎn)物以皮膚超敏感性試驗法對用整體結(jié)核分枝桿菌制劑免疫的豚鼠進行皮膚試驗。如上所述，整體EP將賦予動物以抗結(jié)核分枝桿菌感染的獲得性免疫，但反應程度比用本發(fā)明的疫苗小些。
用120μg按實施例1中所述方法制備的整體EP制劑以三周間隔免疫豚鼠兩次。在不完全弗氏佐劑中制備用于免疫接種的疫苗，且假免疫動物只接受緩沖液以代替EP。末次免疫接種后三周剃掉各組豚鼠背部的毛，并經(jīng)皮內(nèi)注射0.1、1.0和10μg的71KD蛋白質(zhì)以進行皮膚試驗。使用10.0μg緩沖液作為對照，且所有注射的總體積均為0.1ml。24小時后測量紅斑和硬結(jié)的直徑，結(jié)果示于下列表E中。各組試驗的結(jié)果均以平均測量值±使用傳統(tǒng)方法求得的標準誤差(SE)來表示。
表E對71KD的紅斑反應(mm)(平均值±SE)豚鼠狀態(tài) n0.1μg 1.0μg 10.0μg免疫的46.5±0.711.9±1.418.9±2.2對照組32.5±1.45.0±2.9 11.8±2.1
對71KD的硬結(jié)反應(mm)(平均值±SE)豚鼠狀態(tài) n0.1.μg 1.0μg 10.0μg免疫的43.6±1.16.8±1.118.9±0.8對照組30.7±0.73.7±0.97.8±1.0被免疫動物的反應幾乎是單獨用緩沖液攻擊之豚鼠反應的兩倍，并且與用整體EP攻擊之動物的反應差不多(所說的整體EP)相同于用來免疫動物的EP)(數(shù)據(jù)未示出)。
為了進一步證實純化的71KD主要豐富細胞外產(chǎn)物引發(fā)細胞介導的免疫反應，殺死整體EP免疫的豚鼠，并檢測在對各種濃度71KD蛋白質(zhì)反應中的脾淋巴細胞增殖情況。使用未免疫的動物作為對照。按照實施例4的方法將淋巴細胞與71KD蛋白質(zhì)一起或不加71KD蛋白質(zhì)保溫2天，然后檢測它們摻入〔3H〕胸苷的能力。
數(shù)據(jù)以按實施例4中所述法計算的刺激指數(shù)表示。該71KD蛋白質(zhì)攻擊的結(jié)果示于下列表F中。
表F對71KD的刺激指數(shù)(平均值±SE)豚鼠狀態(tài) n00.1.μg/ml 0.1μg/ml 1.0μg/ml免疫的41.5±0.12.3±0.58.1±2.2對照組21.7±0.61.6±0.42.5±0.6對ED的刺激指數(shù)(平均值±SE)豚鼠狀態(tài) n0.01.μg/ml 0.1μg/ml 1.0μg/ml免疫的41.5±0.1 2.2±0.3 5.3±1.4對照組21.4±0.21.5±0.21.2±0.1如表F中所示，淋巴細胞增殖試驗的刺激指數(shù)與皮膚超敏感性試驗中得到的結(jié)果差不多。71KD和整體EP試驗樣品均顯示出比對照組高2或3倍的反應，表明分離的71KD主要豐富細胞外產(chǎn)物能夠在用結(jié)核分枝桿菌提取物免疫之動物體內(nèi)引發(fā)細胞介導的免疫反應。但應再次強調(diào)的是，純化的主要豐富的或基本的細胞外產(chǎn)物沒有與現(xiàn)有技術中的疫苗或整體制劑相關的問題，并且更容易合成及商業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)于觀有技術的本發(fā)明的疫苗。
更具體地說，不可能很容易地通過現(xiàn)代分子生物學技術大批量制造整體制劑。商業(yè)化生產(chǎn)這些含有所有細胞外產(chǎn)物的非精制整體制劑的任何方法應包括大量培養(yǎng)靶病原體或密切相關種的病原生物體并收獲所得到的上清液。這種生產(chǎn)方法很容易被靶病原體、毒性副產(chǎn)物或其他寄生因素污染。另外，這些制劑中的許多免疫原性決定簇很可能會在被免疫群體的敏感者體內(nèi)引發(fā)毒性免疫反應。使用這些非精制的整體制劑還會導致不能有效地進行目前用于結(jié)核篩選和控制的最通用皮膚試驗。
相反，可以使用高產(chǎn)率轉(zhuǎn)化的宿主以相對高的安全性大量生產(chǎn)本發(fā)明的疫苗。同樣，可以相同的，容易實現(xiàn)批量標準化的方法生產(chǎn)本發(fā)明的疫苗，這正好與變化范圍較寬的整體細胞外產(chǎn)物的生產(chǎn)相反。再者，由于呈遞給宿主免疫系統(tǒng)的免疫原性決定簇的數(shù)目相當小，所以大大降低了毒性反應和導致通用篩選試驗無效的機會。
實施例7對71KD蛋白質(zhì)免疫之豚鼠的純化71KD蛋白質(zhì)皮膚試驗在證明分離的71KD主要豐富細胞外產(chǎn)物在整體EP免疫的動物體內(nèi)產(chǎn)生細胞介導的免疫反應之后，即顯示純化形式的這種主要豐富細胞外產(chǎn)物能夠在71KD免疫的動物體內(nèi)誘導細胞介導的免疫反應。
以三周間隔期，用加在SAF中的100μg純化的71KD蛋白質(zhì)接種豚鼠兩次。以同樣的程序用加在SAF中的緩沖液假免疫對照組動物。末次免疫后三周用1和10μg分離的71KD蛋白質(zhì)皮內(nèi)攻擊兩組動物。24小時后測量所產(chǎn)生的紅斑和硬結(jié)大小，結(jié)果示于下列表G中。
表G對71KD的紅斑反應(mm)(M均值±SE)豚鼠狀態(tài) n0μg1.0μg 10.0μg經(jīng)免疫的 30±06.5±1.515.0±1.5對照組 30±02.7±1.36.7±1.3對71KD的硬結(jié)反應(mm)(平均值±SE)豚鼠狀態(tài) n0μg1.0μg 10.0μg經(jīng)免疫的 30±03.0±1.09.3±0.3對照組30±00±01.3±1.3在經(jīng)免疫動物中，硬結(jié)和紅斑形成的程度遠大于未經(jīng)免疫的對照組動物，證明接種本發(fā)明的疫苗引發(fā)了強的抗71KD蛋白質(zhì)的細胞介導的免疫反應。
為了進一步證實這種豐富細胞外產(chǎn)物本身按照本發(fā)明的技術誘導有效免疫反應的能力，進行了淋巴細胞增殖試驗。殺死如表G中所示經(jīng)過免疫的動物，并使用實例4中確定的方法進行脾淋巴細胞增殖試驗。用0.1、1和10μg/ml分離的71KD蛋白質(zhì)攻擊得自71KD蛋白質(zhì)免疫之豚鼠和對照組豚鼠的組織樣品，并監(jiān)測它們摻入〔3H〕胸苷的能力。按前述方法計算刺激指數(shù)。這些試驗的結(jié)果示于下列表H中。
表H對71KD的刺激指數(shù)(平均值±SE)豚鼠狀態(tài)n0.1μg/ml 1.0μg/ml 10.0μg/ml經(jīng)免疫的34.0±1.35.6±2.5 12.2±5.1對照組 31.3±0.31.3±0.3 3.2±1.5與皮膚超敏感性試驗一樣，71KD蛋白質(zhì)免疫動物顯示了對純化的71KD蛋白具有比假免疫對照組動物更高的反應。雖然可以預期外源蛋白質(zhì)帶來的后果，但這些結(jié)果清楚地表明主要豐富細胞外產(chǎn)物具有誘導細胞介導之免疫反應的能力。
在確認分離的主要豐富細胞外蛋白質(zhì)將誘導有效的細胞介導之免疫反應后，進行如下所述的進一步的實驗，以證實這種抗結(jié)核菌的反應是交叉反應性的。
實施例8用純化的71KD蛋白質(zhì)攻擊感染結(jié)核分枝桿菌的豚鼠按實施例4中所述方法用氣霧化結(jié)核分枝桿菌感染未經(jīng)免疫的豚鼠。利用純化的蛋白質(zhì)衍生物(PPD-CT68；Connaught Laborato-ries Ltd.)作為陽性對照的保證被感染動物出現(xiàn)作為結(jié)核分枝桿菌感染指征的細胞介導的免疫反應。廣泛用于檢測結(jié)核病接觸的Mantoux試驗中的PPD一般是以硫酸銨分級分離法制備的，并包含有平均分子量的為10KD的小蛋白質(zhì)的混合物。對PPD的免疫反應實質(zhì)上是與使用按實施例1中所述方法分離的整體EP部分引發(fā)的免疫反應相似的。
感染后三周，用0.1、1和10μg舉例的純化之主要豐富71KD細胞外蛋白質(zhì)皮內(nèi)注射攻擊豚鼠。用未感染的動物作為對照并用分離的蛋白質(zhì)進行相似地攻擊。24小時后測量紅斑和硬結(jié)大小，結(jié)果示于下列表I中。
表I對71KD的紅斑反應(mm)(平均值±SE)豚鼠狀態(tài)n0.1μg 1.0μg 10.0μg感染的 79.5±1.7 13.4±1.3 19.7±1.3對照組 62.3±2.3 3.5±2.27.8±1.9對71KD的硬結(jié)反應(mm)(平均值±SE)豚鼠狀態(tài) n0.1μg 1.0μg 10.0μg感染的 75.3±1.8 8.7±1.6 13.4±1.1對照組 60±0 0.8±0.80±0
如表I中所示，在用本發(fā)明純化的主要豐富細胞外蛋白質(zhì)攻擊的被感染動物體內(nèi)出現(xiàn)了強免疫反應。這種反應中就紅斑形成來看比未感染動物大3至4倍，就硬結(jié)形成來看比未感染動物強10倍，從而進一步證實該優(yōu)勢71KD細胞外蛋白質(zhì)可在結(jié)核分枝桿菌感染的動物體內(nèi)誘導強的細胞介導的免疫反應。
為了進一步證實這些結(jié)果，殺死被感染和未被感染的動物，并按照實施例4的方法進行淋巴細胞增殖試驗。檢測這兩組豚鼠的組織樣品對0.1、1和10μg/ml分離之71KD蛋白質(zhì)和PPD的細胞增殖反應。按前述方法監(jiān)測這些樣品摻入〔3H〕胸苷的能力，結(jié)果示于下列表J中。
表J對71KD的刺激指數(shù)(平均值±SE)豚鼠狀態(tài)n0.1μg/ml 1.0μg/ml 10.0μg/ml感染的 32.4±0.56.2±1.8 29.1±16.2對照組 31.1±0.12.6±0.8 18.2±6.1對PPD刺激指數(shù)(平均值±SE)豚鼠狀態(tài)n0.1μg/ml1.0μg/m110.0μg/ml感染的 31.0±0.1 4.0±1.5 11.4±3.4對照組 30.9±0.2 0.9±0.031.5±0.3同皮膚敏感性試驗的結(jié)果一致，表J顯示被感染的組織比未經(jīng)免疫樣品的刺激指數(shù)高得多。更具體地說，被感染動物對71KD蛋白質(zhì)的平均峰值刺激指數(shù)比未經(jīng)感染的對照組動物高2倍，對PPD則比未經(jīng)感染的對照組動物高3倍，表明本發(fā)明的主要豐富細胞外蛋白質(zhì)疫苗在結(jié)核分枝桿菌感染的動物體內(nèi)誘導了強的細胞介導的免疫反應。
在證明純化的71KD主要豐富蛋白質(zhì)和結(jié)核分枝桿菌間的這種交叉反應性后，進行下一步實驗以證明這些按本發(fā)明所述方法純化的主要豐富細胞外產(chǎn)物的樣品可刺激有效的免疫反應。
實施例9用氣霧化的結(jié)核分枝桿菌攻擊71KD蛋白質(zhì)免疫的豚鼠為了證明主要豐富或基本細胞外蛋白質(zhì)疫苗的免疫保護能力，間隔三周用100μg按實施例2所述方法純化的主要豐富71KD蛋白質(zhì)將豚鼠免疫兩次。用120μg實施例1的整體EP或緩中液免疫對照組動物。免疫所有動物時均使用SAF佐劑。末次免疫后3周，用10μg 71KD蛋白質(zhì)對已用71KD蛋白質(zhì)免疫的豚鼠進行皮膚試驗，以估計是否發(fā)展了細胞介導的免疫反應。然后按實施例4中所述方法用氣霧化結(jié)核分枝桿菌感染對照組動物及71KD蛋白質(zhì)免疫的豚鼠。感染后6個月內(nèi)監(jiān)測并稱量動物體重。
將圖5所示曲線相比較可見假免疫的動物體重降低，而71KD和整體EP免疫的動物顯示相對正常的體重增加。各組的數(shù)據(jù)均以平均體重±SE表示。同樣動物的死亡率曲線示于圖6中。下列表K中報告了該項研究的絕對死亡率。
表K豚鼠的狀態(tài)存活數(shù)/受攻擊數(shù)百分存活率71KD免疫的 3/6 50％EP免疫的 5/8 62.5％假免疫的 0/6 0％體重丟失曲線和死亡率清楚地表明，本發(fā)明的主要豐富細胞外蛋白質(zhì)賦予了預防性免疫反應。未經(jīng)免疫的動物在監(jiān)測期間結(jié)束前100％死亡的事實進一步證實了這一點。
實施例10用氣霧化結(jié)核分枝桿菌攻擊71KD蛋白質(zhì)免疫的豚鼠進行相似的實驗以證實以前實施例的結(jié)果，并顯示投用基本細胞外蛋白質(zhì)可在動物體內(nèi)引發(fā)保護性免疫反應。在該實驗中，再次以3周間隔期用100μg 71KD細胞外蛋白質(zhì)(加在SAF中)將豚鼠免疫三次。對照組豚鼠用加在SAF中的緩沖液進行假免疫。末次免疫后3周用氣霧化結(jié)核分枝桿菌攻擊動物，并每周測體重，共監(jiān)測13周。計算每組6只豚鼠的平均體重±SE，并圖解顯示于圖F中。該曲線表明在監(jiān)測期間假免疫動物喪失了大量體重，而經(jīng)過免疫的動物則保持相當恒定的體重。因為體重喪失或“消耗”是結(jié)核病的典型癥狀之一。所以這些結(jié)果表明結(jié)核菌在被免疫動物體內(nèi)的生長和增殖受到了本發(fā)明疫苗的抑制。
通過接種分離形式的豐富細胞外產(chǎn)物已在豚鼠中引發(fā)了保護性免疫，進行下一步的實驗以證明本發(fā)明疫苗的種間免疫反應性，并進一步證實豚鼠模型的有效性和可應用性。
實施例11用純化的71KD蛋白質(zhì)試驗PPD陽性病人的細胞介導的免疫為了估計人對71KD主要豐富蛋白質(zhì)之免疫反應的細胞介導的成分，按照上文實施例4中所述的標準淋巴細胞增殖檢測法，研究得自PPD陽性和PPD陰性個體的外周血淋巴細胞對該蛋白質(zhì)的增殖反應。陽性PPD或結(jié)核菌素反應作為以前接觸過結(jié)核分枝桿菌的指征，是本領域熟知的。在兩天和四天時檢測增殖反應和相應的〔3H〕胸苷摻入。這些研究的數(shù)據(jù)示于圖8A和8B中。圖8A顯示兩天后對不同劑量水平71KD蛋白質(zhì)的反應；圖8B顯示四天時的同樣反應。
如圖8A和8B中圖解顯示的，PPD陽性個體的平均峰值刺激指數(shù)比PPD陰性個體對71KD蛋白質(zhì)的反應高兩倍，對PPD的反應高三倍。在PPD陽性個體中，對71KD蛋白質(zhì)和對PPD的峰值刺激指數(shù)間存在著線性相互關系，證明結(jié)核分枝桿菌的最優(yōu)勢或主要的豐富細胞外產(chǎn)物在以前接觸過結(jié)核分枝桿菌的人體內(nèi)刺激了強的細胞介導的反應。這一數(shù)據(jù)同見于豚鼠的反應性特征相符，并進一步證明豚鼠模型可應用于研究其他經(jīng)受感染的哺乳動物。
因此，同以前討論的30KD蛋白質(zhì)一樣，抗主要豐富71KD細胞外產(chǎn)物之強免疫反應的發(fā)展證明了本發(fā)明的寬范圍，事實表明71KD產(chǎn)物也可在人體內(nèi)有效地刺激細胞介導的免疫反應。
另外，應強調(diào)的是，本發(fā)明不只限于結(jié)核分枝桿菌的細胞外產(chǎn)物和使用71KD蛋白質(zhì)。本發(fā)明的技術還可適用于如實施例中證明的任何主要豐富細胞外產(chǎn)物。
完成進一步的研究，以確定是否會用結(jié)核分枝桿菌的主要豐富細胞外產(chǎn)物也會提供保護性免疫?？偟卣f來，這些研究是利用以各種不同劑量的疫苗，并以3或4周間隔期經(jīng)皮內(nèi)或皮下免疫三次的豚鼠進行的，其中所說的疫苗含有以不同方式組合的加在SAF中的5種純化的結(jié)核分枝桿菌細胞外蛋白質(zhì)。
用于免疫程序的標記為組合I的第一種蛋白質(zhì)組合包括按實施例2中所述方法純化的71KD、32A KD、30KD、23KD和16KD蛋白質(zhì)。相信這種組合含有高達60％的正常存在于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物上清中的總細胞外蛋白質(zhì)。圖2中用星號標示選擇用于組合I的這些蛋白質(zhì)。經(jīng)皮內(nèi)注射與佐劑SAF一起投用含有100μg、20μg或2μg各蛋白質(zhì)的組合I疫苗。另外在相似實驗中使用含有20μg各蛋白質(zhì)的組合I疫苗。以相同程序用等體積SAF和緩沖液免疫陰性對照豚鼠，并使用120μg按實施例1所述方法制備的整體細胞外蛋白質(zhì)制劑(加在SAF中)免疫陰性對照豚鼠。所有注射體積均使用緩中液調(diào)到標準體積。
實施例12組合I免疫的豚鼠對用組合I疫苗攻擊的反應進行皮膚超敏感性試驗，以確定動物在接種基本細胞外產(chǎn)物的組合I混合物后是否發(fā)展了可檢測的免疫反應。在豚鼠背部剃毛后皮內(nèi)注射1.0μg和10.0μg同樣組合的五種純化的細胞外蛋白質(zhì)。使用10.0μg緩沖液作為對照并且所有注射均以0.1ml的總體積進行。注射后24小時測量皮膚試驗部位紅斑和硬結(jié)的直徑。
測量結(jié)果示于下列表L中。數(shù)據(jù)均以各組的平均測定值±以傳統(tǒng)方法確定的標準誤差(SE)表示。ND表示未進行這一特定的檢測。
表I豚鼠狀態(tài) 紅斑(mm) (平均值±SE)nP D 1.0μg 10.0μg經(jīng)免疫的6 011.4±4.6 17.4±2.6對照組 6 0 ND 6.0±0.5硬結(jié)(mm)(平均值±SE)nP D1.0μg10.0μg經(jīng)免疫的6 07.3±0.8 11.6±1.2對照組 6 0 ND 4.2±0.3這些數(shù)據(jù)清楚地證明，接種疫苗的動物產(chǎn)生了抗組合I細胞外蛋白質(zhì)的強細胞介導的免疫反應。經(jīng)過免疫的豚鼠的紅斑和硬結(jié)測量值幾乎比對照組動物大三倍。
實施例13對抗氣霧化結(jié)核分枝桿菌的組合I疫苗免疫保護性分析末次免疫后三周，用氣霧化結(jié)核分枝桿菌(Erdman菌株)攻擊用于前述超敏感性試驗的豚鼠，并每周測動物體重連續(xù)10周。按實施例4中所述方法進行該氣霧攻擊。同時用氣霧化結(jié)核分枝桿菌攻擊6只用100μg組合I的基本細胞外產(chǎn)物免疫的動物，以及同樣大小組的陰性和陰性對照組動物。陽性對照組三次免疫接種加于SAF中的120μg EP。
解剖觀察期間結(jié)束前即已死亡的動物并檢查其大體結(jié)核病損傷的跡象。研究期間終了時發(fā)現(xiàn)所有動物均有這樣的損傷。
經(jīng)重復進行方差分析(ANOVA)，分析氣霧攻擊后免疫組和對照組動物平均體重間的差異。經(jīng)雙尾Fisher精確試驗分析攻擊后免疫組和對照組豚鼠的存活率差異。數(shù)據(jù)是每組6只豚鼠的平均體重±標準誤差(SE)。
攻擊后每周體重測量的結(jié)果示于圖9中。與用組合的細胞外產(chǎn)物免疫的豚鼠相比，假免疫的動物體重減少了其總體重的15.9％。陰性對照組的體重與合用五種純化之細胞外蛋白質(zhì)免疫的動物體重相似。攻擊前直接取標準化體重。經(jīng)重復檢測ANOVA，發(fā)現(xiàn)組合I疫苗免疫的動物和假免疫的動物之間有顯著性差異，p＜0.0000001。
攻擊后十周半確定死亡率。所有三只假免疫動物均在攻擊后的十和十周半之間的三天內(nèi)死亡。下列表M中給出了死亡率監(jiān)測結(jié)果。
表M豚鼠狀態(tài)存活數(shù)/受攻擊數(shù)百分存活率聯(lián)合免疫的 6/6 100％EP免疫的 5/6 83％假免疫的 3/6 50％在得出體重監(jiān)測研究的結(jié)論之后，經(jīng)引發(fā)高碳酸血癥處死存活的動物，并使用實施例5所述方法檢測每只動物右肺和脾中的活結(jié)核分枝桿菌數(shù)。下列表N中給出了包括三只在實施的最后一周死亡的動物的計數(shù)結(jié)果，并且數(shù)值以平均集落形成單位(CFU)±標準誤差(SE)表示。
表N平均CFU±SE豚鼠狀態(tài)n 右肺 脾假免疫的68.9±5.4×1071.3±0.7×107免疫的 63.4±1.7×1061.8±0.6×106EP免疫的61.7±0.7×1075.0±2.8×106使用聯(lián)合的純化蛋白質(zhì)免疫的動物與假免疫的動物肺內(nèi)細菌濃度間的對數(shù)差為1.4，而脾內(nèi)細胞濃度的對數(shù)差為0.9。將經(jīng)過免疫動物的尸體解剖組織與假免疫的對照組動物的組織并列比較，大體觀察可見前者肺內(nèi)結(jié)核損傷明顯降低。用實施例1的整體細胞外制劑(EP)免疫的陽性對照組動物與用純化之細胞外蛋白質(zhì)的組合I混合物免疫的動物相比，前者肺中細胞計數(shù)比后者多0.7個對數(shù)值，脾中細菌計數(shù)值比后者多0.5個對數(shù)值。
實施例14皮內(nèi)和皮下投用低劑量組合I疫苗所產(chǎn)生的免疫保護作用分析雖然實施例13證實以每種蛋白質(zhì)(30＋32A＋16＋23＋71KD)100μg的劑量，用組合I蛋白質(zhì)每隔4周皮內(nèi)注射免疫動物三次可產(chǎn)生免疫保護作用，但還需作另外的研究以證明低劑量特別是各20μg或2μg的組合I蛋白質(zhì)的免疫保護能力。按實施例13中所述方法，以3周間隔期用組合I蛋白質(zhì)(30＋32A＋16＋23＋71KD)與SAF一起皮內(nèi)注射免疫豚鼠4次。每次免疫時動物均接受20μg或2μg每種蛋白質(zhì)。對照組動物是利用前述方法進行假免疫的。末次免疫后3周，用氣霧化結(jié)核分枝桿菌攻擊動物并在9周內(nèi)每周測動物體重。所有經(jīng)過免疫的動物均存活到實驗結(jié)束時，而一只假免疫動物在實驗結(jié)束前死亡。如下示結(jié)果所表明的，既使劑量比實施例13中使用的劑量低5倍甚至50倍，仍可保護被免疫動物免于遭受氣霧化結(jié)核分枝桿菌的攻擊，并且皮內(nèi)和皮下途經(jīng)給藥都是有效的。
與用每種蛋白質(zhì)各20μg的組合I疫苗免疫的豚鼠相比，假免疫的動物在9周實驗期間體重丟失總體重的12％(攻擊之前標定體重)。與用每種蛋白質(zhì)各3μg的組合I疫苗免疫的豚鼠相比，假免疫的動物丟失了其標定的總體重的11％。因此，用低劑量組合I蛋白質(zhì)皮內(nèi)注射免疫的豚鼠在遭受結(jié)核分枝菌氣霧攻擊后可能阻止體重的丟失。
同樣，用低劑量組合I蛋白質(zhì)皮內(nèi)注射免疫的豚鼠可對抗與結(jié)核分枝桿菌浸染脾臟有關的過度脾腫大。如表O中所示，用每種蛋白質(zhì)各20μg或2μg的組合I蛋白質(zhì)免疫的動物平均脾重分別為4.6±1.29和4.0±0.89(平均值±SE)，而假免疫的動物脾臟稱重量平均為1.96±1.8g，或高達前者的2倍以上。
表O脾臟重量(g)豚鼠的狀態(tài)n平均值±SE假免疫的 59.6±1.8免疫的(20μg) 64.6±1.2免疫的(2μg) 64.0±0.8用低劑量組合I蛋白質(zhì)皮內(nèi)免疫的豚鼠在其脾臟中也有較少的結(jié)核分枝桿菌CFU計數(shù)。如表P中所示，在用各20μg或2μg的組合I蛋白質(zhì)免疫之豚鼠的脾臟中，CFU計數(shù)分別比假免疫動物平均少0.6和0.4個對數(shù)值。
表P脾臟中的CFU豚鼠狀態(tài) n平均值±SE 對數(shù)差假免疫的 53.1±2.3×106免疫的(20μg) 68.1±2.4×105-0.6免疫的(2μg) 61.2±0.6×106-0.4此外，用組合I蛋白質(zhì)皮下免疫的豚鼠也可阻止體重丟失，脾腫大及結(jié)核分枝桿菌在脾臟中的生長。在與實施例14所述者相同的實驗中，還以3周間隔期用20μg組合I蛋白質(zhì)經(jīng)皮下而不是皮內(nèi)免疫豚鼠4次。這些動物幾乎同使用20μg組合I蛋白質(zhì)經(jīng)皮內(nèi)免疫的動物一樣免遭攻擊。
實施例15組合I和組合II免疫的豚鼠對組合I和組合II攻擊的反應進行附加研究以確定是否結(jié)核分枝桿菌主要豐富細胞外蛋白質(zhì)產(chǎn)物的其他組合也可提供保護性免疫。一項研究是利用含有兩種組合即組合I(71、32A、30、23和16KD)和組合II(32A、30、24、23和16KD)的疫苗免疫豚鼠。相信組合II中含有高達62％的正常存在于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物上清中的總細胞外蛋白質(zhì)。用含有100μg各種蛋白質(zhì)的組合工或II(加在SAF中)免疫動物(每組6只)4次(每次間隔3周)。按同樣程序用等體積SAF和緩沖液假免疫陰性對照組動物。
按實施例12中所述方法對動物進行皮膚遲發(fā)型超敏感性試驗，以確定動物在疫苗接種后是否產(chǎn)生了可檢測的免疫反應。用組合II免疫的動物在對組合II之皮膚試驗的反應中產(chǎn)生16.8±1.3mm(平均值±SE)大小的紅斑和12.8±1.2mm大小的硬結(jié)；而假免疫的動物在對組合II的反應中只出現(xiàn)1.3±0.8mm大小的紅斑和0.3±0.3mm大小的硬結(jié)?？梢?，組合II免疫之動物紅斑比對照組動物大12倍，硬結(jié)比對照組大40倍。相比之下，組合I免疫的動物在對組合I皮膚試驗的反應中出現(xiàn)21.3±2.0mm紅斑和15.8±0.1mm硬結(jié)。而假免疫的動物在對組合I的反應中只出現(xiàn)6.4±0.8mm紅斑和2.6±0.7mm硬結(jié)?？梢姡M合I免疫的動物紅斑比對照組大3倍，硬結(jié)比對照組大6倍。就組合II蛋白質(zhì)來說，與對照組的差異甚至比組合I蛋白質(zhì)與對照組的差異還大。
在同樣的實驗中，用低劑量組合II蛋白質(zhì)(每種蛋白質(zhì)各20μg)也產(chǎn)生了對組合II強皮膚超敏感性反應。在對組合II的反應中它們出現(xiàn)有21.0±2.0mm的紅斑和15.3±0.9mm的硬結(jié)，而假免疫的動物則只出現(xiàn)如上面提到的1.3±0.8mm的紅斑及0.3±0.3mm的硬結(jié)?？梢姡玫蛣┝拷M合II蛋白質(zhì)免疫的動物，其紅斑比對照組大16倍，硬結(jié)比對照組大50倍，與對照組差異甚至比用高劑量組合II蛋白質(zhì)免疫的動物還大。
實施例16組合I和II疫苗抗氣霧化結(jié)核分枝桿菌的免疫保護分析末次免疫后3周，按實施例13中所述用氣霧化結(jié)核分枝桿菌(Erdman菌株)攻擊用于前述超敏感性試驗的豚鼠，并每周測體重連續(xù)7周。同實施例13中一樣，每組6只動物。在攻擊后的前7周內(nèi)，假免疫的動物平均體重丟失19.5g。相反，用組合II疫苗(每種蛋白質(zhì)各100μg)免疫的動物則體重增加了52.4g，并且用低劑量(每種蛋白質(zhì)各20μg)組合II蛋白質(zhì)免疫的動物平均體重增加67.2g。相比之下，用組合I免疫的動物體重增加了68g?？梢?，與用組合II(100μg)免疫的豚鼠相比，假免疫的動物總體重降低了11％。與用低劑量(20μg)組合II免疫的豚鼠相比，假免疫的動物總體重降低了14％。與用組合I免疫的動物相比，假免疫的動物總體重也降低了14％。
實施例17用組合III至VII免疫的豚鼠對用同樣疫苗或其成分攻擊的反應進行附加實驗以證明各種結(jié)核分枝桿菌主要豐富細胞外產(chǎn)物之組合的有效性。在這些實驗中，用含有2種或多種按實施例2所述方法純化之主要豐富細胞外產(chǎn)物的組合疫苗經(jīng)皮內(nèi)注射免疫Hart-ley型豚鼠。經(jīng)SDS-PAGE檢測，根據(jù)其表觀分子量鑒定這些純化的細胞外產(chǎn)物。用如下組合的主要豐富細胞外產(chǎn)物免疫豚鼠。
組合蛋白質(zhì)組分III30＋32A＋32B＋16＋23IV 30＋32AV 30＋32BVI 30＋16VII30＋23VIII 30＋71IX 30＋23.5X 30＋12XI 30＋24XII30＋58
每種組合疫苗各含有100μg所列的每種蛋白質(zhì)。調(diào)整組合疫苗的體積，并加在佐劑SAF中進行皮內(nèi)注射。如前所述，以3周間隔期將豚鼠免疫4次。
進行皮膚超敏感性試驗以確定動物是否在用組合III至XII疫苗接種后發(fā)展了可檢測的免疫反應。對每組6只豚鼠背部剃毛并皮內(nèi)注射與用于免疫這些動物時所使用者有同樣組合的純化的細胞外產(chǎn)物。為進行這一攻擊，注射以各10μg的量組合的蛋白質(zhì)。所有的注射均使用0.1ml的總體積完成。還用組合III至XII蛋白質(zhì)，并以各個組合中每種蛋白質(zhì)均為10μg的量對已只用SAF免疫的假免疫對照組動物進行皮膚試驗。在按實施例3中所述方法注射后24小時測量皮膚試驗部位紅斑和硬結(jié)的直經(jīng)。
這些測量的結(jié)果示于下列表Q中。所有數(shù)據(jù)以該組的平均測量值±使用傳統(tǒng)方法確定的標準誤差(SE)表示。
表Q皮膚反應的直徑(mm)疫苗組合 皮膚試驗組合 紅斑 硬結(jié)III III12.2±2.06.8±0.8IVIV 9.9±0.5 6.3±0.2V V 13.0±1.18.1±0.7VIVI 19.2±1.212.4±0.5VII VII14.3±1.08.7±0.4VIII VIII 18.9±1.112.6±0.8IXIX 17.0±0.912.1±0.9X X 19.3±1.413.6±1.2XIXI 18.3±1.212.4±0.8XII XII17.7±0.914.0±1.2假III4.8±0.9 2.0±0.0假IV 4.3±1.1 2.0±0.0假V 5.0±0.5 2.0±0.0假VI 4.5±0.3 2.0±0.0假VII4.5±0.3 2.0±0.0假VIII 3.3±0.3 2.3±0.3假IX 3.7±0.3 2.0±0.0假X 3.7±0.4 2.0±0.0假XI 3.7±0.2 2.0±0.0假XII3.8±0.2 2.0±0.0這些結(jié)果清楚地證明產(chǎn)生了對抗各種組合的純化細胞外蛋白質(zhì)的強細胞介導的免疫反應。就所有組合來說，免疫的豚鼠顯示出紅斑大的至少是對照組的2倍，通常是3倍或更大。此外，對于所有的組合，免疫的豚鼠的硬結(jié)大小至少是對照組的3倍。
實施例18組合III-XII蛋白質(zhì)抗氣霧化結(jié)核分枝桿菌的免疫保護性分析為了證明這些舉例組合的純化細胞外產(chǎn)物的預防效果，在使用實施例4的程序進行最后一次免疫之后三周，用結(jié)核分枝桿菌攻擊已用組合III至XII蛋白質(zhì)免疫的豚鼠。
與較早得到的結(jié)果相一致，在受到攻擊后所有用組合III至XII免疫的豚鼠均得以保護而免于死亡。在攻擊后第4周，6只假免疫的動物中有2只(33％)死亡，相比之下用組合IV-XIII蛋白質(zhì)免疫的動物則均未死亡，而用組合III蛋白質(zhì)免疫6只動物中只有1只(17％)死亡。攻擊后10周，假免疫的動物有50％已死亡，相對地用組合IX和XII免疫的動物沒有死亡(0％)，用組合III、IV、V、VI、X和XI免疫的各組6只動物中有1只死亡(17％)，用組合VIII免疫的動物中5只有1只死亡(20％)，而在用組合VII免疫的動物中6只有2只死亡(33％)。
尸體剖檢在觀察期間結(jié)束前死亡的豚鼠，并檢查其大體結(jié)核病損傷的跡象。發(fā)現(xiàn)在研究結(jié)束時所有動物均有損傷。
在得出死亡率研究的結(jié)論之后，經(jīng)高碳酸血處理殺死存活的動物并使用實施例5的方法檢查每只動物脾臟中的活結(jié)核分枝桿菌數(shù)。結(jié)果以平均集落形成單位(CFU)數(shù)連同從假免疫動物開始的對數(shù)降低值形式示于下列表R中。CFU值后面的星號指示各組中一只動物的脾臟CFU計數(shù)值為O。為計算目的，將0計數(shù)看作為103CFU/脾或3log。
表R脾臟中的CFU疫苗組(平均log數(shù))從假免疫的對數(shù)降低值III 5.99 .5IV 5.41 1.1V6.27 .3VI ＜5.80* ＞.7VII ＜5.61* ＞.9VIII 6.47 .1IX ＜5.85* ＞.7X＜5.74* ＞.8XI 5.93 .6XII 6.03 .5假 6.53 --用組合III、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、IX、X、XI、和XII免疫的動物脾臟中平均結(jié)核分枝桿菌集落形成單位數(shù)至少比假免疫的對照組動物低0.5log值。特別是證明組合VI和VII尤為有效，大約使集落形成單位平均數(shù)降低10倍。用組合V和VIII免疫的動物脾臟中平均集落形成單位(CFU)數(shù)分別比假免疫的對照組低0.3和0.1log值。按照本發(fā)明的技術免疫的動物器官中集落形成單位的這種顯著降低，再一次說明本發(fā)明在免疫保護上的可操作性。
實施例19用三種不同劑量的組合XIII免疫的豚鼠對組合XIII攻擊的反應為了進一步限定本發(fā)明的可操作性和范圍，并證明其他組合方式的純化之細胞外產(chǎn)物的效力，按前述方法以不同的疫苗接種劑量免疫豚鼠。具體地說，用50μg、100μg和200μg定為組合XIII并包含30KD、32(A)KD和16KD蛋白質(zhì)的另外組合的3種主要豐富細胞外產(chǎn)物免疫動物。同前述實施例一樣，以3周間隔期用加在SAF中的不同劑量的組合XIII蛋白質(zhì)皮內(nèi)免疫各組動物4次。
進行皮膚超敏感性試驗以確定免疫后動物是否產(chǎn)生了可檢測的免疫反應。給動物背部剃毛后皮內(nèi)注射每種純化之細胞外產(chǎn)物各含10.0μg的組合XIII蛋白質(zhì)。注射的總體積均為0.1ml。對假免疫的對照組動物也用同樣劑量的組合XIII進行皮膚試驗。注射后24小時測量皮膚試驗部位上紅斑和硬結(jié)的直經(jīng)。
結(jié)果以各組的平均測量值±按傳統(tǒng)方法確定的標準誤差(SE)表示并示于下列表S中。
表S皮膚反應的直徑(mm)疫苗組合疫苗劑量紅斑 硬結(jié)XIII 50 17.8±1.313.2±1.0XIII100 11.2±0.97.3±0.4XIII200 10.0±0.77.0±0.4假 0 5.7±0.5 0.2±0.2這些結(jié)果再次清楚地證明，在用三種不同劑量組合XIII免疫的各組動物體內(nèi)產(chǎn)生了強的抗組合XIII的細胞介導的免疫反應。經(jīng)過免疫的動物表現(xiàn)有比對照組大2至3倍的紅斑。更明顯地是，在所有病例中，經(jīng)過免疫的動物出現(xiàn)了比表現(xiàn)有最小反應的對照組動物至少大35倍的硬結(jié)。
實施例20三種不同劑量的組合XIII抗氣霧化結(jié)核分枝桿菌的免疫保護分析為了進一步證明不同劑量的本發(fā)明疫苗的保護性免疫功能，末次免疫后3周用氣霧化結(jié)核分枝桿菌攻擊用于前述皮膚超敏感性試驗的受到免疫的豚鼠(每組6只)。使用實施例4中所詳述的方法進行氣霧攻擊。同時攻擊12只假免疫的對照組動物。
攻擊后每周測定體重的結(jié)果顯示于圖10中并分別給出了用三種不同劑量的組合XIII免疫的各組豚鼠受到保護而免于體重丟失的情況。用較高劑量組合XIII(100和200μg)免疫的動物實際上顯示有體重的凈增加，用較低劑量組合XIII(50μg)免疫的動物顯示了相對小的體重丟失。相反，假免疫的動物在攻擊后幾周內(nèi)體重約減少總體重的22％，并在10周觀察期間里平均體重減少182g。
下列表U顯示了經(jīng)受免疫的動物和對照組動物的百分體重改變，其中改變值是將攻擊結(jié)束時的平均體重減去攻擊開始時的平均體重并將所得結(jié)果除以攻擊開始時的平均體重而求得的。相似地，百分保護作用則是從被免疫動物的平均百分體重增加或減少值中減去對照組動物的平均百分體重減少值而求得的。
表U免疫原 劑量％體重改變 ％免于體重喪失組合XIII50 -4％ 18％組合XIII100+7％ 29％組合XIII200+5％ 27％假免疫 - -22％ -表U所示的結(jié)果表明，比經(jīng)過免疫的動物相比，假免疫的動物丟失了相當量的體重(18％-29％)。圖10提供了在10周監(jiān)測期間，以每周間隔將各組經(jīng)免疫動物對假免疫動物作圖，圖解說明各組動物的凈體重丟失情況。因為體重丟失或“消耗”是結(jié)核病的典型病征之一，所以這些結(jié)果說明結(jié)核菌在經(jīng)過免疫之動物體內(nèi)的生長和增殖受到了三種不同劑量的本發(fā)明組合疫苗的抑制。
實施例21組合XIV-XVIII疫苗抗組合XIX-XVIII攻擊的免疫保護分析為了進一步證明本發(fā)明的范圍和可按本發(fā)明技術配制之有效疫苗的寬范圍，在豚鼠中試驗了組合XIV至XVIII這五種附加的組合疫苗。根據(jù)以SDS-PAGE方法測得的表觀分子量來認定這些純化的細胞外產(chǎn)物，并給出各組合疫苗的組成如下組合 蛋白質(zhì)組成XIV30、32A、16、32B、24、23、45XV 30、32A、16、32B、24、23、45、23.5、12XVI30、32A、16、32B、24、23XVII 30、32A、16、32B、24、71XVIII 30、32A、32BI 30、32A、16、23、71除了使用新的組合疫苗和適當?shù)膶φ罩?，本實驗系列中還使用了組合I。用各種蛋白質(zhì)各50μg的組合XIV或XV，以及各種蛋白質(zhì)各100μg的組合I、XVI、XVII和XVIII(均加于SAF佐劑中)經(jīng)皮內(nèi)注射免疫豚鼠。每次注射間隔3周，共免疫動物4次。
疫苗接種后按前述方法進行皮膚超敏感性試驗，以確定動物是否已發(fā)展了可檢測的免疫反應。給豚鼠背部剃毛并給予皮內(nèi)注射原用于免疫這些動物的同樣組合的純化的細胞外蛋白質(zhì)。每次攻擊注射含有10μg各種蛋白質(zhì)的適當?shù)慕M合疫苗。注射的總體積均為0.1ml。也用同樣劑量各組合蛋白質(zhì)對假免疫的動物進行皮膚試驗。注射后24小時按實施例3中所述方法測量皮膚試驗部位上紅斑和硬結(jié)的直徑。
這些測量的結(jié)果以平均測量值±按傳統(tǒng)方法確定的標準誤點(SE)表示，并示于下列表V中。
表V皮膚反應的直徑(mm)疫苗組合皮膚試驗組合紅斑硬結(jié)
XIVXIV13.3±0.79.1±0.4XV XV 10.4±0.46.5±0.4XVIXVI8.0±1.8 5.1±1.0XVII XVII 9.4±0.9 6.1±1.1XVIII XVIII 13.6±1.28.7±0.7I I 10.0±0.36.7±0.2假 XIV5.5±1.6 0.4±0.2假 XV 6.1±0.5 0.4±0.2假 XVI4.6±1.4 0.4±0.2假 XVII 5.7±1.2 0.2±0.2假 XVIII 2.1±1.1 0±0假 I 6.0±1.2 0.6±0.2這些結(jié)果清楚地證明，經(jīng)免疫的動物產(chǎn)生了抗組合XIV至XVIII，以及抗組合I的強細胞介導的免疫反應。經(jīng)受免疫的動物表現(xiàn)有約為對照組動物紅斑兩倍大小的紅斑。更明顯的是，在所有病例中，經(jīng)過免疫的動物出現(xiàn)比只表現(xiàn)有最小反應之假免疫組動物至少大10倍的硬結(jié)。
實施例22組合XIV-XVIII和組合I抗氣霧化結(jié)核分枝桿菌的免疫保護分析為了進一步證實實施例21之組合疫苗的免疫反應性并證明它們對抗傳染性結(jié)核病的可應用性，末次免疫后三周用氣霧化結(jié)核分枝桿菌攻擊用于前述皮膚超敏感性試驗的經(jīng)過免疫的豚鼠，并按實施例4的方法監(jiān)測其體重。對用于實施例20中的12只假免疫的對照組動物也進行同樣地攻擊。這些攻擊的結(jié)果圖解顯示于圖11中并直接示于下列表W中。
將攻擊結(jié)束時的平均體重減去攻擊開始時的平均體重，并將所得結(jié)果除以攻擊開始時的平均體重，以確定百分體重改變。相似地，從經(jīng)過免疫之動物平均百分體重增加或減少量中減去對照組動物平均百分體重減少量，以確定百分保持作用。
表W免疫原％體重改變％免于體重喪失組合XIV 3％ 25％組合XV -4％ 18％組合XVI -15％ 7％組合XVII -11％ 11％組合XVIII-12％ 10％組合I-11％ 11％假 -22％如表W中所示，用各組合疫苗免疫的豚鼠受到保護而避免體重丟失。受到假免疫的動物約丟失了其總計體重的22％。相反，組合疫苗的預防作用則導致其中一個試驗組體重增加，而其他組則降低了體重丟失量。具體地說，用組合XIV免疫的動物體重增加了3％，而用其他組合免疫的動物則只減少了其總計體重的4％至15％。
這些結(jié)果示于圖11中，其中就氣霧化攻擊后各組動物的凈體重增加或減少以每周測定值作圖。圖11中顯示的這種經(jīng)受免疫動物和假免疫動物間的統(tǒng)計學上的顯著性差異為使用本發(fā)明的組合疫苗產(chǎn)生免疫保護反應提供了進一步的證據(jù)。
實施例23用三種不同的佐劑免疫的豚鼠體內(nèi)的細胞介導的免疫反應性為了進一步證明本發(fā)明疫苗配制品的廣泛適用性和通用性，使用不同的佐劑進行免疫原性研究。具體地說使用三種不同的佐劑即Syntex佐劑配方I(SAF)、不完全弗氏佐劑(IFA)和含單磷酰脂質(zhì)A的佐劑(MPL)分別配制三種不同的免疫原即純化的30KD蛋白質(zhì)、組合I(30、32A、16、23、71)和組合XIII(30、32A、16)蛋白質(zhì)。已知這些佐劑與免疫原一起使用時可增強生物體的免疫反應性。
分別用加在三種不同佐劑配方中的含每種蛋白質(zhì)各100μg的組合I和XIII，以及大約100μg純化的30KD蛋白質(zhì)，經(jīng)皮內(nèi)注射免疫豚鼠。用每種配方共免疫豚鼠三次，每次間隔三周。
免疫后進行皮膚超敏感性試驗，以確定豚鼠是否已發(fā)展了可檢測的免疫反應。將豚鼠背部剃毛并給予皮內(nèi)注射原用來免疫它們的相同的免疫原。攻擊時，以100ml的總體積注射含每種蛋白質(zhì)各10μg的組合I和XIII或10μg純化的30KD蛋白質(zhì)。用含有相同佐劑的各種免疫原配制品對已接種三種佐劑之一的假免疫的豚鼠進行皮膚試驗。攻擊后24小時按實施例3所述方法測量皮膚試驗部位之紅斑和硬結(jié)的直徑。
這些測量的結(jié)果示于下列表X中，同前面討論的數(shù)據(jù)一樣，這些結(jié)果也以各組的平均測量值±按統(tǒng)計學方法確定的標準誤差(SE)表示。
表X皮膚反應的直徑(mm)疫苗 佐劑 皮膚試驗試劑紅斑硬結(jié)30SAF 30 10.7±1.6 5.8±1.530IFA 30 8.8±0.74.6±0.730MPL 30 10.2±1.7 5.3±1.5XIII SAF XIII 7.3±0.54.1±0.5XIII IFA XIII 6.8±0.93.5±0.5XIII MPL XIII 6.3±0.43.4±0.3I SAFI6.9±0.64.0±0.3I IFAI6.8±0.23.6±0.3I MPLI7.4±0.43.9±0.5假SAF30 0.7±0.71.0±0假IFA30 0±00±0假MPL30 0±00±0假SAF XIII 1.0±1.01.0±0假IFA XIII 0±00.3±0.3假MPL XIII 0±00±0假SAFI4.7±0.31.0±0假IFAI2.0±1.00.7±0.3假MPLI1.0±1.00.7±0.3如表X中給出的數(shù)據(jù)所示，本發(fā)明的組合疫苗和純化的細胞外產(chǎn)物當與不同的佐劑一起配制時，引發(fā)了強的細胞介導的免疫原性反應。此外，對于各自的免疫原來說，三種佐劑中的每一種均提供了大致相同的免疫原反應。一般說來，經(jīng)過免疫的動物出現(xiàn)約比對照組動物大7至10倍的紅斑，而硬結(jié)大小則約比對照組動物大4至6倍。
本發(fā)明的疫苗與不同的佐劑聯(lián)合使用以引發(fā)強免疫原反應的能力，有利于實現(xiàn)疫苗最佳化。即是說，可以主要基于穩(wěn)定性、沒有副作用、低成本和容易貯存等輔助性標準來選擇用于按本文所述技術生產(chǎn)有效疫苗配制品的佐劑。當開發(fā)可在相對原始條件下廣泛使用的疫苗配制品時，這些及其他一些并不與刺激免疫反應直接相關的標準是特別重要的。
實施例24組合XIX-XXVIII對抗組合XIX-XXVIII攻擊的免疫保護分析使用十種其他方式的組合疫苗即組合XIX至XXVIII產(chǎn)生免疫反應，以進一步證明本發(fā)明的寬范圍。除了使用這些新的組合疫苗和適當?shù)膶φ胀?，還使用組合IV和XIII作為陽性對照以引發(fā)豚鼠的免疫反應。根據(jù)以SDS-PAGE方法測得的表觀分子量認定純化的細胞外產(chǎn)物，并給出各組合疫苗的組成如下組合 蛋白質(zhì)組成XIX30，32A，23XX 30，32A，23.5XXI30，32A，24XXII 30，32A，71XXIII 30，32A，16，23XXIV 30，32A，16，23.5XXV30，32A，16，24XXVI 30，32A，16，71XXVII 30，32A，16，32BXXVIII 30，32A，16，45IV 30，32AXIII 30，32A，16豚鼠總共免疫4次，每次注射的間隔期為3周。用于免疫動物的各組合疫苗均由加在SAF佐劑中的各100μg的每種蛋白質(zhì)組成，以提供0.1ml的總注射體積。
使用實施例3中所述方法進行皮膚超敏感性試驗以確定動物是否在接種選擇的組合疫苗后發(fā)展了可檢測的免疫反應。給豚鼠背部剃毛并給予皮內(nèi)注射原用來免疫它們的同樣組合純化的細胞外蛋白質(zhì)。用于攻擊動物的蛋白質(zhì)組合由各10μg每種蛋白質(zhì)組成。還使用同樣劑量的各組全蛋白質(zhì)對經(jīng)過假免疫的對照組動物進行皮膚試驗。按實施例3所述，注射后24小時測量皮膚試驗部位紅斑和硬結(jié)的直徑。
所得測量結(jié)果以各組動物的平均測定值±標準誤差表示，并示于下列表Y中。
表Y皮膚反應的直徑(mm)疫苗組合 皮膚試測組合紅斑硬結(jié)XIXXIX 8.5±0.63.9±0.3XX XX8.2±0.33.7±0.3XXIXXI 11.1±1.1 4.5±0.4XXII XXII 9.4±0.84.3±0.4XXIII XXIII 8.3±1.13.0±0.3XXIV XXIV 8.5±0.93.4±0.5XXVXXV 7.9±0.53.2±0.4XXVI XXVI 8.9±0.73.3±0.5XXVII XXVII 7.2±1.02.8±0.5XXVIII XXVIII8.5±0.52.8±0.3IV IV9.0±0.94.1±0.3XIII XIII 9.4±0.94.3±0.3假 XIX 4.0±2.61.0±0假 XX1.3±1.31.0±0假 XXI 3.5±1.01.3±1.3假 XXII 1.3±1.31.0±1.0假 XXIII 0±01.0±0假 XXIV 0±01.0±0
假XXV 0±01.0±0假XXVI 2.3±2.32.0±1.0假XXVII 0±01.0±0假XXVIII2.0±1.21.0±0假IV2.8±1.61.0±0假 XIII 1.5±1.51.0±0表Y中給出的結(jié)果表明，當用同樣的免疫原攻擊時產(chǎn)生了抗組合XIX至XXVIII的強細胞介導的免疫反應。與前述情況相同，組合IV和XIII也引發(fā)了強細胞介導的免疫反應。經(jīng)過免疫的豚鼠所呈現(xiàn)的紅斑至少是相應假免疫對照組動物的兩倍，并證明有一般比對照組動物大四倍以上的反應。同樣，經(jīng)過免疫的動物所呈現(xiàn)的硬結(jié)至少是未免疫的對照組動物的兩倍，并且一般都大3至4倍。在按照本發(fā)明的技術免疫的動物中產(chǎn)生了實質(zhì)上更強的免疫反應再次說明了本發(fā)明組合疫苗的免疫保護可操作性。
本領域技術人員將會理解到本發(fā)明疫苗和方法的其他一些優(yōu)點。例如，由于是將個別化合物或經(jīng)過選擇的高度純化之分子的組合用作目的疫苗，而不是使用整個細菌或其成分，所以本發(fā)明的疫苗與現(xiàn)有技術中的減毒或死菌疫苗相比，其很少有可能引發(fā)毒性反應。另外，本發(fā)明的分子疫苗不會象活菌那樣威脅到免疫受損的個體。事實上，可以將本發(fā)明的組合物為治療目的用于受感染的個體，以刺激抗病原因子的特異性免疫反應。
選擇性使用主要豐富細胞外產(chǎn)物或其免疫原類似物也可阻止調(diào)理性體液反應的發(fā)展，從而可減少細胞內(nèi)細菌的致病作用。由于按本發(fā)明方法產(chǎn)生的保護性免疫是針對未結(jié)合的蛋白質(zhì)的，所以任何調(diào)理性反應都將僅僅導致吞噬或破壞主要豐富細胞外產(chǎn)物，而不是加速包含寄生菌。此外，選擇性使用純化的細胞外產(chǎn)物可減少產(chǎn)生某種不良反應的可能性，由于這一反應將不能利用那些基于宿主對免疫原劑的識別的廣泛使用的篩選和控制技術。與現(xiàn)有技術中的疫苗不同的是，仍可使用由病原體表達的，但不包括在按本發(fā)明方法制得的疫苗中的免疫反應性分子進行篩選試驗。使用這樣的免疫原決定簇將只能在那些已接觸了靶病原體的個體內(nèi)引發(fā)允許進行適當檢測的反應。
與現(xiàn)有技術疫苗的減毒細菌及細菌成分相反，本發(fā)明的另一個優(yōu)點是很容易大量獲得并很容易利用本領域已知的技術分離出純化的細胞外產(chǎn)物。由于對于大多數(shù)感興趣的病原體來說，本發(fā)明的免疫反應性產(chǎn)物都是天然釋放到細胞外環(huán)境介質(zhì)中的，所以簡化了除去細胞內(nèi)污染物及細胞碎片的程序。此外，由于使用最優(yōu)勢或主要的豐富細胞外產(chǎn)物或其免疫原類似物刺激所需的免疫反應，所以在大多數(shù)生產(chǎn)系統(tǒng)中一般均可提高可收獲產(chǎn)物的表達水平及培養(yǎng)物濃度。因此，不管使用什么生產(chǎn)方式，均可通過層析或超濾等常規(guī)生物化學方法很容易地完成對所需產(chǎn)物的大批量分離。用于本發(fā)明之免疫原決定簇的固有屬性和分子特征在很大程度上有利于生產(chǎn)出恒定一致的、標準化的、適于大批量應用的高質(zhì)量組合物。
另外，使用基于靶病原體之最優(yōu)勢或主要的豐富細胞外產(chǎn)物的免疫原性質(zhì)的純化分子化合物，還可相對容易地大批量合成產(chǎn)生本發(fā)明的免疫活性疫苗成分。例如，可以使用重組DNA技術將感興趣的細胞外產(chǎn)物或其它疫原類似物克隆到非病原性宿主細菌中，并可安全地收獲之?？梢允褂帽绢I域已知的分子克隆技術，分離相當于感興趣之細胞外產(chǎn)物、其類似物或其片段的DNA，并借助插入到宿主細胞如大腸桿菌中的高表達載體表達之。舉例的技術可見于IIR.Anon，Synthetic Vaccines31-71(1987)，Tam et al，Incorporationof T and B Epitopes of the Circumsporozoite Protein in a ChemicallvDefined Synthetic Vaccine Against Malaria，171 J.Exp.Med.299-306(1990)，以及Stover et al，Protective Immunity Elicited bv Recom-binant Bacille Calmette-Guerin(BCG)Expressing Outer Surface Pro-tein A(OspA)LipoproteinA Candidate Lyme Disease Vaccine，178 J.Exp.Med197-209(1993)。
同樣，可以使用普通實驗室技術和自動序列分析技術，以相對純的形式大批量化學合成細胞外蛋白質(zhì)、其類似物、同源物或免疫反應性蛋白質(zhì)亞單位。這種生產(chǎn)模式對于構(gòu)建相當于細胞外產(chǎn)物之抗原決定簇的肽亞單位或較低分子量類似物是特別有吸引力的。生產(chǎn)較小蛋白質(zhì)亞單位的技術是本領域已知的，并可見于II R.Anon，Syn-thetic Vaccine15-30(1987)；A.Streitwieser，Jr.Introduetion to Or-ganic Chemistry 953-55(3rd ed.，1985).可代用的技術可參見Gross et al，“Nonenzymatic cleavage of Peptide BondsThe Methion-ine Residues in Boyine Pancreatic Ribonuclease”，237；The Journal ofBiological Chemistry No.6(1962)；Mahoney，“Migh-Yield Cleavageof Tryptophanyl Peptide Bonds by O-Iodosobenzoic Acid”，18，Bio-chemistry No.17(1979)，以及Shoolnik et al.，“Gowococcal Pili”，159，Journal of Experimental Medicine(1984)。也可以使用其他免疫原技術如使用肽、核苷酸或其他分子如模擬物分子的抗獨特型或定向分子進化，以產(chǎn)生有效的、能夠產(chǎn)生所需預防性反應的免疫反應性化合物。利用裸DNA作為疫苗的現(xiàn)有技術可見于Robinson，Pro-tection Against a Lethal Influenza Virus Challenge by Immunizationwith a Hemagglutinin-Expressing Plasmid DNA，11 Vaccine 9(1993)；Ulmer et al.，Heterologous Protection Against Influenza bvInjection of DNA Encoding a Varal Protein，259，Science(1993)。另外，Tao et al.，Idiotype/Granuloeyte-Macrophage Colony-Stimulat-ing Factor Fusion Protein as a Vaccine for B-Ceo Lymphoma，362Nature(1993)中公開了融合強免疫原性蛋白質(zhì)尾部的技術；還有，Good et al.，Human T-Cell Recognition of the Circumsporozoite Pro-tein of Plasmodium FaiciparumImmunodominant T-Cell DomainsMap to the Polymorphic Regions of the Molecule，85，Proc，Natl.A-cad，Sci.USA(1 988)和Gao et al.，Identification and Characterizationof T Halper Epitopes in the Nucleoprotein of Innuenza A Virus，143，The Journal of Inomunology No.9(1989)中描述了T細胞表位基因圖。
由于許多細菌屬都表現(xiàn)有同源性，所以前述實施例只是舉例說明而不是限制本發(fā)明的范圍和內(nèi)容，也不是將本發(fā)明限制到分枝桿菌屬或其中的特定種或血清型或單獨抗結(jié)核病的疫苗。還應再次強調(diào)的是，微生物的DNA和相應蛋白質(zhì)的種間同源性的普通存在，使本發(fā)明的疫苗有可能誘導交叉反應性免疫。因為主要豐富細胞外產(chǎn)物的免疫優(yōu)勢表位可提供對抗選定菌屬之其他種和血清型攻擊的交叉反應性免疫，所以本領域技術人員將會認識到，可使用一個種的細胞外產(chǎn)物或免疫原類似物發(fā)展對抗另一個種之微生物感染的疫苗。
例如，牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌間有90％至100％的同源性，并且在引發(fā)免疫反應方面是有高度交叉反應性的。因此，基于牛分枝桿菌或其他分枝桿菌的豐富細胞外產(chǎn)物的疫苗可提供對抗結(jié)核分枝桿菌感染的不同程度的保護作用，并且反之亦然。因此，使用適當?shù)闹饕S富細胞外產(chǎn)物之高度同源的免疫原決定簇，提供對抗同一菌屬之幾個種細菌的免疫預防性反應應考慮包括于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
還應強調(diào)指出的是，可以按許多不同的形式使用為實踐本發(fā)明而選擇的免疫原性決定簇，借以引發(fā)有效的免疫反應。因此，向宿主免疫系統(tǒng)呈遞選擇之主要豐富細胞外產(chǎn)物的一個或多個免疫原決定簇不是很嚴格的，可以為有利于其生產(chǎn)或給藥而改變之。例如，可以使用全部細胞外產(chǎn)物或其包括前述肽、蛋白質(zhì)亞單位、免疫原性類似物和同系物的任何免疫刺激部分來配制本發(fā)明的疫苗。只要能夠引發(fā)有效的免疫預防反應，主要豐富細胞外產(chǎn)物及其分子類似物的較小蛋白質(zhì)亞單位均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物例如融合蛋白質(zhì)或通過已知的分子重組技術修飾的細胞外產(chǎn)物在總體上是與本發(fā)明的技術相容的。再者，免疫原上產(chǎn)生的所選擇的免疫活性決定簇的類似物，例如抗獨特型抗體、或使用定向進化技術衍生的肽及核苷酸也包括于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
同樣，免疫原劑的配制和向宿主免疫系統(tǒng)的呈遞并不限于蛋白質(zhì)或其類似物在佐劑中制成的溶液。例如，衍生于適當細胞外蛋白質(zhì)的免疫原決定簇可以在不同種的非病原性的細菌、噬菌體、支原體或病毒上表達并用重組技術修飾。在這種情況下，可配制完整的活生物體并用于刺激所需的反應。相反，當在敵對環(huán)境中進行大規(guī)模疫苗接種時，可能需要很穩(wěn)定的沒有加入佐劑或添加劑的配方。另外，當經(jīng)受凍干或口服給藥或膠囊包裹等苛刻條件時，疫苗配制應有利于保持活性成分的穩(wěn)定性和免疫反應性。因此，本發(fā)明包括大量根據(jù)產(chǎn)物的預期用途而定的含目的疫苗之免疫原決定簇的不同配方。
本領域技術人員將會理解到，可利用常規(guī)實驗來確定各種病原體和宿主的疫苗劑量。目前，據(jù)信，最低適用劑量將是0.1μg數(shù)量級，但對于適當?shù)南到y(tǒng)來說，2.0μg、20.0μg、100μg劑量，甚至1mg劑量可能是最適宜的?？墒褂帽绢I域已知的任何常規(guī)免疫技術和次序投用適當?shù)膭┝俊?br> 本領域技術人員還可認識到，本發(fā)明可以用其他特定形式來體現(xiàn)，而不背離本發(fā)明的精神或其中心思想。本發(fā)明說明書中只是公開了其舉例性的實施方案，對其進行的其他改動應屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的。因此，本發(fā)明不只限于本文詳述的特定實施方案。確切地說，本發(fā)明待批權(quán)利要求才明確限定了本發(fā)明的范圍和內(nèi)容。
序列表(1)一般信息(i)申請人(ii)發(fā)明名稱豐富的細胞外產(chǎn)物和其生產(chǎn)與使用方法(iii)序列數(shù)(iv)通信地址(A)收信人(B)街道(C)城市(D)州(E)國家(F)郵編(v)計算機可讀的形式(A)介質(zhì)類型Floppy盤(B)計算機IBM PC兼容性(C)操作系統(tǒng)(D)軟件(vi)目前申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)名稱(B)注冊號(C)參考號/卷號(ix)電訊信息(A)電話(B)電傳(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征
(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Asn Ser Lys Val Ser1 5(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO2Thr Asp Arg Val Ser1 5(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Ala Arg Ala Val Gly1 5(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性
(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設無(v)片段類型N末端(vi)來源(A)生物體結(jié)核分枝桿菌(xi)序列描述SEQ ID NO4Thr Glu Lys Thr Pro1 5(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(xi)序列描述SEQ ID NO5Asp Pro Glu Pro Ala1 5(2)SEQ ID NO6的信息(I)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)序列描述SEQ ID NO6Phe Ser Arg Pro Gly1 5(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(xi)序列描述SEQ ID NO7Phe Ser Arg Pro Gly1 5(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(xi)序列描述SEQ ID NO8Phe Ser Arg Pro Gly1 5(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(xi)序列描述SEQ ID NO9Ala Pro Lys Glu Asn1 5(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(xi)序列描述SEQ ID NO10Ala Glu Thr Tyr Leu1 5(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸
(D)拓撲學線性(xi)序列描述SEQ ID NO11Ala Glu Thr Tyr Leu1 5(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(xi)序列描述SEQ ID NO12Ala Tyr Pro Ile Thr1 5(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲學線性(xi)序列描述SEQ ID NO13Ala Asp Pro Arg Leu1 5(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(xi)序列描述SEQ ID NO14Phe Asp Thr Arg Leu1 5(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征
(A)長度40氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(xi)序列描述SEQ ID NO15Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro1 5 10 15Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Asn Asn20 25 30Ser Pro Ala Val Tyr Leu Leu Asp35 40
權(quán)利要求
1.用于在哺乳動物宿主體內(nèi)激發(fā)抗分枝桿菌屬傳染性病原體之有效免疫反應的疫苗接種劑，所說的疫苗接種劑包含選自結(jié)核分枝桿菌110KD蛋白質(zhì)、80KD蛋白質(zhì)、71KD蛋白質(zhì)、58KD蛋白質(zhì)、45KD蛋白質(zhì)、32AKD蛋白質(zhì)、32BKD蛋白質(zhì)、30KD蛋白質(zhì)、24KD蛋白質(zhì)、23.5KD蛋白質(zhì)、23KD蛋白質(zhì)、16KD蛋白質(zhì)、14KD蛋白質(zhì)和12KD蛋白質(zhì)的至少一種主要豐富細胞外產(chǎn)物。
2.權(quán)利要求1的疫苗接種劑，其中所說的至少一種主要豐富的細胞外產(chǎn)物是結(jié)核分枝桿菌110KD蛋白質(zhì)或其具有N末端氨基酸序列5 1015 20NSKSVNSFGAHDTLA V-ERK RO的免疫反應性同系物或片段，其中從左至右為氨基到羰基末端方向。
3.權(quán)利要求1的疫苗接種劑，其中所說的至少一種主要豐富細胞外產(chǎn)物是結(jié)核分枝桿菌80KD蛋白質(zhì)或其具有N末端氨基酸序列。5TDRVSVGN的免疫反應性同系物或片段，其中從左到右為氨基末端至羧基末端方向。
4.權(quán)利要求1的疫苗接種劑，其中所說的至少一種主要豐富細胞外產(chǎn)物是結(jié)核分枝桿菌71KD蛋白質(zhì)或具有N末端氨基酸序列5ARAVGI的免疫反應性同系物或片段，其中從左到右為氨基末端至羧基末端方向。
5.權(quán)利要求1的疫苗接種劑，其中所說的至少一種主要豐富細胞外產(chǎn)物是結(jié)核分枝桿菌58KD蛋白質(zhì)或具有N末端氨基酸序列5 10 15 20TEKTPDDVFKLAKDEKVLYL的免疫反應性同系物或片段，其中從左到右為氨基末端至羧基末端方向。
6.權(quán)利要求1的疫苗接種劑，其中所說的至少一種主要豐富細胞外產(chǎn)物是結(jié)核分枝桿菌45KD蛋白質(zhì)或具有N末端氨基酸序列5 10 15 20 25 30DPEPA PPVPDDAASP PDDAA APPAP ADPP-的免疫反應性同系物或片段，其中從左到右為氨基末端至羧基末端方向。
7.權(quán)利要求1的疫苗接種劑，其中所說的至少一種主要豐富細胞外產(chǎn)物是結(jié)核分枝桿菌32BKD蛋白質(zhì)或具有N末端氨基酸序列5 10 1520FSRPGLPVEYLQVPS A-MGR DI的免疫反應性同系物或片段，其中從左到右為氨基末端至羧基末端方向。
8.權(quán)利要求1的疫苗接種劑，其中所說的至少一種主要豐富細胞外產(chǎn)物是結(jié)核分枝桿菌32AKD蛋白質(zhì)或具有N末端氨基酸序列5 10 15 20 25 30FSRPG LRVEY LQVPS PSMGR DIKVQ FQSGG3540ANSP-LYLLD的免疫反應性同系物或片段，其中從左到右為氨基末端至羧基末端方向。
9.權(quán)利要求1的疫苗接種劑，其中所說的至少一種主要豐富細胞外產(chǎn)物是結(jié)核分枝桿菌30KD蛋白質(zhì)或具有N末端氨基酸序列51015202530FSRPG LPVEY LQVPS PSMGR DIKVQ FQSGG3540NNSPA VYLLD的免疫反應性同系物或片段，其中從左到右為氨基末端至羧基末端方向。
10.權(quán)利要求1的疫苗接種劑，其中所說的至少一種主要豐富細胞外產(chǎn)物是結(jié)核分枝桿菌24KD蛋白質(zhì)或具有N末端氨基酸序列51015 202530APYEN LMVPS PSMGRDIPVA FVAGG PHAVY354045505560LLDAF NAGPD VSNWV TAGNA MMTLA-KGIC/S的免疫反應性同系物或片段，其中從左到右為氨基末端至羧基末端方向。
11.權(quán)利要求1的疫苗接種劑，其中所說的至少一種主要豐富細胞外產(chǎn)物是結(jié)核分枝桿菌23.5KD蛋白質(zhì)或具有N末端氨基酸序列5 10APKTY-EELKGTD的免疫反應性同系物或片段，其中從左到右為氨基末端至羧基末端方向。
12.權(quán)利要求1的疫苗接種劑，其中所說的至少一種主要豐富細胞外產(chǎn)物是結(jié)核分枝桿菌23KD蛋白質(zhì)或具有N末端氨基酸序列5 10 15 20AETYLDPLDWDYGALEPHIS GQ的免疫反應性同系物或片段，其中從左到右為氨基末端至羧基末端方向。
13.權(quán)利要求1的疫苗接種劑，其中所說的至少一種主要豐富細胞外產(chǎn)物是結(jié)核分枝桿菌16KD蛋白質(zhì)或具有N末端氨基酸序列5 10 15 20 25AYPITGKLGSELTMTDTVGQVVLGW30 35 4045KVSDL F/YKSTAVIPGY TV-EQQI的免疫反應性同系物或片段，其中從左到右為氨基末端至羧基末端方向。
14.權(quán)利要求1的疫苗接種劑，其中所說的至少一種主要豐富細胞外產(chǎn)物是結(jié)核分枝桿菌14KD蛋白質(zhì)或具有N末端氨基酸序列510 1520 25 30ADPRL QFTAT TLSGA PFDGA S/NLQGKPAVLW的免疫反應性同系物或片段，其中從左到右為氨基末端至羧基末端方向。
15.權(quán)利要求1的疫苗接種劑，其中所說的至少一種主要豐富細胞外產(chǎn)物是結(jié)核分枝桿菌12KD蛋白質(zhì)或具有N末端氨基酸序列5 10 15 2025FDTRLMRLEDEMKEGRVEVR AELPG30 35 40 45VDPDKDVDIMVRDGQLTIKAERT的免疫反應性同系物或片段，其中從左到右為氨基末端至羧基末端方向。
16.權(quán)利要求1的疫苗接種劑，其中所說的是以類似于所說病原體之至少一種所說主要豐富細胞外產(chǎn)物的至少一種化合物選自于包括肽、同系物、融合蛋白質(zhì)、糖基化物及其免疫學上可接受的鹽的類似物。
17.權(quán)利要求1的疫苗接種劑，其進一步包含佐劑組合物。
18.能夠在哺乳動物宿主中發(fā)動免疫反應的，實質(zhì)上純的結(jié)核分枝桿菌的主要豐富細胞外蛋白質(zhì)產(chǎn)物，或其免疫反應性類似物或同系物。
19.權(quán)利要求18的實質(zhì)上純的，結(jié)核分枝桿菌的主要豐富細胞外蛋白質(zhì)產(chǎn)物或其免疫反應性類似物或同系物，其中該蛋白質(zhì)產(chǎn)物具有如經(jīng)SDS-PAGE測得的大約12KD的表觀分子量，并具N末端氨基酸序列51015202530FDTRL MRLED EMKEG RYEVR AELPG VDPDR354045DVDIM VRDGQ LTIKAERT其中從左到右為氨基末端至羧基末端方向。
20.權(quán)利要求18的實質(zhì)上純的，結(jié)核分枝桿菌的主要豐富細胞外蛋白質(zhì)產(chǎn)物或其免疫反應性類似物或同系物，其中該蛋白質(zhì)產(chǎn)物具有如經(jīng)SDS-PAGE測得的大約14KD的表觀分子量，并具N末端氨基酸序列5101520 2530ADPPL QFTAT TLSGA PFDGA S/NLQK PAVLW其中從左到右為氨基末端至羧基末端方向。
21.權(quán)利要求18的實質(zhì)上純的，結(jié)核分枝桿菌的主要豐富細胞外蛋白質(zhì)產(chǎn)物或其免疫反應性類似物或同系物，其中該蛋白質(zhì)產(chǎn)物具有如經(jīng)SDS-PAGE測得的大約16KD的表觀分子量，并具N末端氨基酸序列5 10 15 2025AYPITGKLGSEITMTDTVGQ VVLGW30 35 40 45KVSDL F/YKSTAVIPGYIV-EQQI其中從左到右為氨基末端至羧基末端方向。
22.權(quán)利要求18的實質(zhì)上純的，結(jié)核分枝桿菌的主要豐富細胞外蛋白質(zhì)產(chǎn)物或其免疫反應性類似物或同系物，其中該蛋白質(zhì)產(chǎn)物具有如經(jīng)SDS-PAGE測得的大約24KD的表觀分子量，并具N末端氨基酸序列51015 2025 30APVEN LMVPS PSMGRDIPVA FLAGGPHAVY35 404550 55 60LLDAF N AGPD VSNWV TAGNA MMTLA-KGIC/S其中從左到右為氨基末端至羧基末端方向。
23.權(quán)利要求18的實質(zhì)上純的，結(jié)核分枝桿菌的主要豐富細胞外蛋白質(zhì)產(chǎn)物或其免疫反應性類似物或同系物，其中該蛋白質(zhì)產(chǎn)物具有如經(jīng)SDS-PAGE測得的大約45KD的表觀分子量，并具N末端氨基酸序列5 10 15 20 2530DPEPA PPVPD DAASP PDDAA APPAP ADPP-其中從左到右為氨基末端至羧基末端方向。
24.權(quán)利要求18的實質(zhì)上純的，結(jié)核分枝桿菌的主要豐富細胞外蛋白質(zhì)產(chǎn)物或其免疫反應性類似物或同系物，其中該蛋白質(zhì)產(chǎn)物具有如經(jīng)SDS-PAGE測得的大約58KD的表觀分子量，并具N末端氨基酸序列5 10 15 20TEKTPDDVFKLAKDEKVLYL其中從左到右為氨基末端至羧基末端方向。
25.權(quán)利要求18的實質(zhì)上純的，結(jié)核分枝桿菌的主要豐富細胞外蛋白質(zhì)產(chǎn)物或其免疫反應性類似物或同系物，其中該蛋白質(zhì)產(chǎn)物具有如經(jīng)SDS-PAGE測得的大約80KD的表觀分子量，并具N末端氨基酸序列TDRVSVGN其中從左到右為氨基末端至羧基末端方向。
26.權(quán)利要求18的實質(zhì)上純的，結(jié)核分枝桿菌的主要豐富細胞外蛋白質(zhì)產(chǎn)物或其免疫反應性類似物或同系物，其中該蛋白質(zhì)產(chǎn)物具有如經(jīng)SDS-PAGE測得的大約110KD的表觀分子量，并具N末端氨基酸序列。5 1015 20NSKSVNSFGA MDTLK V-ERK RQ其中從左到右為氨基末端至羧基末端方向。
27.用于在哺乳動物宿主體內(nèi)發(fā)動抗分枝桿菌屬傳染性病原體之有效免疫反應的組合疫苗，所說的組合疫苗含有選自結(jié)核分枝桿菌110KD蛋白質(zhì)、80KD蛋白質(zhì)、71KD蛋白質(zhì)、58KD蛋白質(zhì)、45KD蛋白質(zhì)、32AKD蛋白質(zhì)、32BKD蛋白質(zhì)、32KD蛋白質(zhì)、24KD蛋白質(zhì)、23.5KD蛋白質(zhì)、23KD蛋白質(zhì)、16KD蛋白質(zhì)、14KD蛋白質(zhì)和12KD蛋白質(zhì)的多種主要豐富細胞外產(chǎn)物。
28.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌32AKD蛋白質(zhì)、30KD蛋白質(zhì)、24KD蛋白質(zhì)、23KD蛋白質(zhì)和16KD蛋白質(zhì)的混合物。
29.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌32AKD蛋白質(zhì)、32BKD蛋白質(zhì)、30KD蛋白質(zhì)、23KD蛋白質(zhì)和16KD蛋白質(zhì)的混合物。
30.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌32AKD蛋白質(zhì)和30KD蛋白質(zhì)的混合物。
31.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌32BKD蛋白質(zhì)和30KD蛋白質(zhì)的混合物。
32.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌30KD蛋白質(zhì)和16KD蛋白質(zhì)的混合物。
33.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌30KD蛋白質(zhì)和23KD蛋白質(zhì)的混合物。
34.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌71KD蛋白質(zhì)和30KD蛋白質(zhì)的混合物。
35.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌30KD蛋白質(zhì)和23.5KD蛋白質(zhì)的混合物。
36.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌30KD蛋白質(zhì)和12KD蛋白質(zhì)的混合物。
37.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌30KD蛋白質(zhì)和24KD蛋白質(zhì)的混合物。
38.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌58KD蛋白質(zhì)和30KD蛋白質(zhì)的混合物。
39.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌45KD蛋白質(zhì)、32AKD蛋白質(zhì)、32BKD蛋白質(zhì)、30KD蛋白質(zhì)、24KD蛋白質(zhì)、23KD蛋白質(zhì)、16KD蛋白質(zhì)的混合物。
40.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌45KD蛋白質(zhì)、32AKD蛋白質(zhì)、32BKD蛋白質(zhì)、30KD蛋白質(zhì)、24KD蛋白質(zhì)、23.5KD蛋白質(zhì)、23KD蛋白質(zhì)、16KD蛋白質(zhì)和12KD蛋白質(zhì)的混合物。
41.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌32AKD蛋白質(zhì)、32BKD蛋白質(zhì)、30KD蛋白質(zhì)、24KD蛋白質(zhì)23KD蛋白質(zhì)和16KD蛋白質(zhì)的混合物。
42.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌71KD蛋白質(zhì)、32AKD蛋白質(zhì)、32BKD蛋白質(zhì)、30KD蛋白質(zhì)、24KD蛋白質(zhì)和16KD蛋白質(zhì)的混合物。
43.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌32AKD蛋白質(zhì)、32BKD蛋白質(zhì)和30KD蛋白質(zhì)的混合物。
44.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌32AKD蛋白質(zhì)、30KD和16KD蛋白質(zhì)的混合物。
45.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌32AKD蛋白質(zhì)、30KD蛋白質(zhì)和23KD蛋白質(zhì)的混合物。
46.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌32AKD蛋白質(zhì)、30KD和23.5KD蛋白質(zhì)的混合物。
47.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌32AKD蛋白質(zhì)、30KD和24KD蛋白質(zhì)的混合物。
48.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌32AKD蛋白質(zhì)、30KD蛋白質(zhì)和71KD蛋白質(zhì)的混合物。
49.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌32AKD蛋白質(zhì)、30KD蛋白質(zhì)、23KD蛋白質(zhì)和16KD蛋白質(zhì)的混合物。
50.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌32AKD蛋白質(zhì)、30KD蛋白質(zhì)、23.5KD蛋白質(zhì)和16KD蛋白質(zhì)的混合物。
51.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌32AKD蛋白質(zhì)、30KD蛋白質(zhì)、24KD蛋白質(zhì)和16KD蛋白質(zhì)的混合物。
52.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌71KD蛋白質(zhì)、32AKD蛋白質(zhì)、30KD蛋白質(zhì)和16KD蛋白質(zhì)的混合物。
53.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌32AKD蛋白質(zhì)、32BKD蛋白質(zhì)、30KD蛋白質(zhì)和16KD蛋白質(zhì)的混合物。
54.權(quán)利要求27的組合疫苗，其中所說的組合疫苗包含結(jié)核分枝桿菌45KD蛋白質(zhì)、32AKD蛋白質(zhì)、30KD蛋白質(zhì)和16KD蛋白質(zhì)的混合物。
55.免疫哺乳動物宿主以對抗分枝桿菌屬傳染性病原體的方法，所說的方法包括提供含有足以類似于多種主要豐富細胞外產(chǎn)物的化合物之混合物的組合疫苗，其中所說的主要豐富細胞外產(chǎn)物選自于具有刺激抗所說病原體繼后感染之有效免疫反應能力的結(jié)核分枝桿菌110KD蛋白質(zhì)、80KD蛋白質(zhì)、71KD蛋白質(zhì)、58KD蛋白質(zhì)、45KD蛋白質(zhì)、32AKD蛋白質(zhì)、32BKD蛋白質(zhì)、30KD蛋白質(zhì)、24KD蛋白質(zhì)、23.5KD蛋白質(zhì)、23KD蛋白質(zhì)、16KD蛋白質(zhì)、14KD蛋白質(zhì)和12KD蛋白質(zhì)；以及給所說的哺乳動物宿主投用預防有效量的所說的組合疫苗。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所說的傳染性病原體選自結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、海分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、鳥細胞內(nèi)分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、麻風分枝桿菌、非洲分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌和田鼠分枝桿菌。
57.權(quán)利要求55的方法，其中所說的足以類似于所說病原體之所說多種主要豐富細胞外產(chǎn)物的多種化合物是合成產(chǎn)生的。
58.權(quán)利要求55的方法，其進一步包括在所說的投用步驟之前加佐劑組合物配制所說的組合疫苗的步驟。
59.權(quán)利要求55的方法，其中所說的哺乳動物宿主是人。
60.權(quán)利要求55的方法，其中所說的哺乳動物宿主是選自狗、貓、牛、羊、馬和豬的家畜動物。
全文摘要
提供了基于最豐富的病原體細胞外產(chǎn)物組合的疫苗和其使用與生產(chǎn)方法。不考慮其絕對分子免疫原性選擇靶病原體的最普遍或主要豐富細胞外產(chǎn)物，并用作疫苗，以刺激哺乳動物宿主體內(nèi)抗繼后靶病原體感染的保護性免疫反應?？筛鶕?jù)其各自的N末端氨基酸序列鑒定主要豐富細胞外產(chǎn)物并區(qū)分之。因為疫苗可包含細胞外產(chǎn)物的不同組合，所以本發(fā)明提供了寬范圍有效的免疫治療組合物。除了其他感染因子外，可使用如此產(chǎn)生的疫苗刺激對抗細胞內(nèi)病原體特別是結(jié)核分枝桿菌的有效免疫反應。
文檔編號A61P11/00GK1142231SQ94194859
公開日1997年2月5日 申請日期1994年11月18日 優(yōu)先權(quán)日1993年11月23日
發(fā)明者M·A·霍維茨 申請人:加利福尼亞大學