專利名稱：巨噬細(xì)胞炎性蛋白-3，-4和-1r的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新鑒別的多核苷酸，這些多核苷酸編碼的多肽、這些多核苷酸和多肽的用途、以及這些多核苷酸和多肽的生產(chǎn)。更具體地說，本發(fā)明的多肽是人巨噬細(xì)胞炎性蛋白-3(MIP-3)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-4(MIP-4)和巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1γ。本發(fā)明還涉及抑制這些多肽的活性。
巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)是由某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，對刺激物如革蘭氏陰性菌、脂多糖和伴刀豆球蛋白A反應(yīng)生成的蛋白質(zhì)。因此，MIP分子具有檢測和治療感染、癌癥、發(fā)炎、骨髓組織生成異常、和自身免疫疾病的診斷和治療用途。鼠MIP-1是一種來自脂多糖刺激的RAW264.7(一種鼠巨噬細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系)的主要分泌蛋白。該蛋白質(zhì)已被純化，并發(fā)現(xiàn)它是由兩種蛋白質(zhì)組成的，MIP-1α和MIP-1β。
幾個(gè)研究組已經(jīng)克隆了似為MIP-1α和MIP-1β類似物的東西。在所有情況下，都是從活化的T細(xì)胞RNA制備的基因文庫中分離出cDNA。
巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP-1α和MIP-1β)已顯示出促炎的性質(zhì)。MIP-1α可誘導(dǎo)人嗜酸性細(xì)胞和單核細(xì)胞的移行和活化并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的趨化性。另外，鼠MIP-1α對人造血干細(xì)胞增殖有抑制作用，而鼠MIP-1β可消除MIP-1α的抑制作用。最后，MIP-1蛋白可在早期創(chuàng)傷炎性細(xì)胞中檢測出來，并已顯示出誘導(dǎo)創(chuàng)傷成纖細(xì)胞產(chǎn)生IL-1和IL-6的作用。
MIP-1是具有與炎癥或創(chuàng)口愈合、免疫調(diào)節(jié)有關(guān)的多種功能的趨化因子系統(tǒng)的一部分，并在許多疾病狀態(tài)中起積極作用。另外，已發(fā)現(xiàn)MIP-1具有加強(qiáng)造血功能的作用。Broxmeyer，H.E.等，J.Exp.Med.，1701583-94(1989)和Broxmeyer，H.E.等，Blood，761110-6(1990)。
已廣泛研究了MIP-1的生物活性的定義，并使用了天然MIP-1和最新的重組MIP-1α和MIP-1β。當(dāng)皮下注射到小鼠足墊或腦池內(nèi)注射到兔腦脊髓液時(shí)，純化的天然MIP-1(包括MIP-1、MIP-1α和MIP-1β多肽)引起了急性炎癥(Wolpe和Cerami，1989，F(xiàn)ASEB J.32565-73)。除了MIP-1的這些直接或間接的促炎癥性質(zhì)外，在使用無菌創(chuàng)傷腔的實(shí)驗(yàn)室小鼠模型中，在傷口愈合的炎性早期發(fā)現(xiàn)了MIP-1(Fahey等人，1990，Cytokine，292)。例如由Chiron公司遞交的PCT申請U.S.91/06489公開了一種DNA分子，它作為在酵母中生產(chǎn)哺乳動(dòng)物巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)的模板。
鼠MIP-1α和MIP-1β是不同但又緊密相關(guān)的細(xì)胞因子。這兩種蛋白的部分純化的混合物可影響中性白細(xì)胞的功能并引起局部炎癥和發(fā)熱。已鑒別出MIP-1α的特定性質(zhì)與造血干細(xì)胞生長抑制劑是一致的。MIP-1α已在酵母細(xì)胞中得以表達(dá)并純化為純品。結(jié)構(gòu)分析證實(shí)了MIP-1α具有與血小板因子4和白細(xì)胞介素8極為近似的二級和三級結(jié)構(gòu)，而MIP-1α與血小板因子4和白細(xì)胞介素8有有限的序列同源性。已發(fā)現(xiàn)MIP-1α具有體外干細(xì)胞抑制性質(zhì)。另外還表明了MIP-1α在體內(nèi)具有保護(hù)鼠干細(xì)胞免受隨后氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷體外殺傷的活性。MIP-1α在對粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的應(yīng)答中還顯示了促進(jìn)更多的定型祖細(xì)胞粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落形成細(xì)胞的增殖的作用。Clemens，J.M.等人，Cy-tokine，476-82(1992)。
MIP-1α是一種6-8千道爾頓的可由脂多糖誘導(dǎo)的單核細(xì)胞、中性白細(xì)胞和嗜酸細(xì)胞的趨化性蛋白質(zhì)。MIP-1α還可誘導(dǎo)人嗜酸性粒細(xì)胞的移行和活化。在急性或慢性炎癥中MIP-1α可能是重要的。已經(jīng)測定了在肺肉芽腫形成過程中鼠MIP-1α在同步曼森氏裂體吸蟲中的連續(xù)產(chǎn)生、來源及體內(nèi)作用。Lukacs，N.W.等人，J.Exp.Med.，1771551-9(1993)。
本發(fā)明一方面提供了新的成熟的多肽，它們是MIP-3、MIP-4和MIP-1γ，以及它們的類似物和衍生物。本發(fā)明的MIP-3、MIP-4和MIP-1γ是人源的。
本發(fā)明另一方面提供了編碼這些多肽的多核苷酸(DNA或RNA)。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一種通過重組技術(shù)生產(chǎn)這些多肽的方法。
本發(fā)明又進(jìn)一步提供了一種將這些多肽、或編碼這些多肽的多核苷酸用于治療目的的方法，例如，包括炎性活性的免疫調(diào)節(jié)、血細(xì)胞生成和淋巴細(xì)胞運(yùn)輸，對骨髓干細(xì)胞集落形成的抑制，對牛皮癬、實(shí)體腫瘤的治療，以及促進(jìn)宿主對抗性慢性感染的防御。
本發(fā)明又進(jìn)一步提供了抗這些多肽的抗體。
本發(fā)明又進(jìn)一步提供了這些多肽的拮抗劑/抑制劑，其可用于抑制這些多肽的活性，例如，用于治療動(dòng)脈硬化、自身免疫和慢性炎癥及感染性疾病、組胺介導(dǎo)的過敏反應(yīng)、嗜酸性細(xì)胞過多綜合癥、硅肺、肉樣瘤病、肺的炎性疾病、IL-1及TNF的抑制、再生障礙性貧血、以及脊髓發(fā)育不良綜合癥。
根據(jù)下面的描述，本發(fā)明的這些方面或其它方面對本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說應(yīng)是顯而易見的。
下列附圖是對本發(fā)明的實(shí)施方案的描述，但并不意味著限制如權(quán)利要求書所包括的本發(fā)明的范圍。


圖1表示編碼MIP-3的cDNA序列以及相應(yīng)推導(dǎo)的氨基酸序列。開始的45個(gè)氨基酸代表推導(dǎo)的前導(dǎo)序列。
圖2表示編碼MIP-4的cDNA序列以及相應(yīng)推導(dǎo)的氨基酸序列。初始的19個(gè)氨基酸代表推導(dǎo)的前導(dǎo)序列。
圖3推導(dǎo)的MIP-3氨基酸序列的一部分與MIP-1α的一部分線性排列后的對應(yīng)關(guān)系。上面的序列為人MIP-3氨基酸序列，下面的序列為人MIP-1α(人扁桃體淋巴細(xì)胞LD78β蛋白前體)。
圖4表示兩種氨基酸序列，其中上面的序列為人MIP-4氨基酸序列，下面的序列為人MIP-1α(人扁桃體淋巴細(xì)胞LD78β蛋白前體)。
圖5表示在大腸桿菌細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)并純化后的相應(yīng)于MIP-4蛋白質(zhì)的蛋白帶。
圖6為MIP-4的northern印跡分析，它表明在哪種細(xì)胞中該蛋白質(zhì)最常見。
圖7為pQE-9載體的圖解說明。
圖8表示編碼MIP-1γ的DMA序列以及相應(yīng)推導(dǎo)的氨基酸序列。初始的24個(gè)氨基酸代表推導(dǎo)的前導(dǎo)序列。
圖9表示兩種人MIP-1蛋白的部分氨基酸序列。上面的序列為人MIP-γ，下面的序列為人MIP-α(人扁桃體淋巴細(xì)胞LD78β蛋白前體)。
圖10表示第5泳道的蛋白帶是相應(yīng)于在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)并純化后的MIP-1γ蛋白。
圖11表示相應(yīng)于MIP-1γ的COS表達(dá)的蛋白帶。
圖12為MIP-1γ的northern印跡分析，它表明在哪種組織中該蛋白質(zhì)最常見。
本發(fā)明一方面提供了已分離的核酸(多核苷酸)，它們編碼具有圖1、2和8中推導(dǎo)的氨基酸序列的成熟多肽，或者編碼由在1994年2月9日以ATCC保藏號75676進(jìn)行保藏的克隆的cDNA編碼的成熟MIP-3多肽，編碼由在1994年2月9日以ATCC保藏號75675進(jìn)行保藏的克隆的cDNA編碼的成熟MIP-4多肽，及編碼由在1993年10月13日以ATCC保藏號75572進(jìn)行保藏的克隆的cDNA編碼的MIP-1γ多肽。
編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸在結(jié)構(gòu)上與促炎超基因“inter-crine”相關(guān)，“intercrine”屬細(xì)胞因子或趨化因子家族。MIP-3和MIP-4均為MIP-1的相似物，并且與MIP-1α比與MIP-1β更接近。編碼MIP-3的多核苷酸是從主動(dòng)脈內(nèi)皮cDNA文庫產(chǎn)生的，并含有編碼121個(gè)氨基酸殘基多肽的開放讀碼框架，該多肽表現(xiàn)了與許多趨化因子的顯著同源性。最大匹配是與人巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α，表現(xiàn)出36％的一致性和66％的相似性(圖3)。
編碼MIP-4的多核苷酸是從成人肺cDNA文庫產(chǎn)生的，它含有編碼89個(gè)氨基酸殘基多肽的開放讀碼框架，該多肽表現(xiàn)了與許多趨化因子的顯著同源性。最大匹配是與人扁桃體淋巴細(xì)胞LD78β蛋白，表現(xiàn)出60％的一致性和89％的相似性(圖4)。此外，出現(xiàn)于所有趨化因子特征基序中的4個(gè)半胱氨酸殘基均保留在這兩種克隆中。實(shí)際上在這些基因中前兩個(gè)半胱氨酸殘基是處于相鄰位置上的，將之分類為趨化因子“C-C”或β亞族。在另一個(gè)亞族，CXC”或α亞族中，前兩個(gè)半胱氨酸殘基是被一個(gè)氨基酸分開的。
編碼MIP-1γ的多核苷酸含有編碼93個(gè)氨基酸多肽的開放性編碼框架，該多肽表現(xiàn)了與巨噬細(xì)胞炎性蛋白-α的顯著同源性，對于伸展的80個(gè)氨基酸鏈有48％的一致性和72％的相似性；對于鼠MIP-β在82個(gè)氨基酸的區(qū)域上有46％的一致性和67％的相似性。此外，保留了特征基序中的4個(gè)半胱氨酸殘基。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式或者是DNA形式，其DNA包括cDNA、基因組DNA、和合成DNA。該DNA可以是雙鏈的或單鏈的，如果是單鏈則可以是編碼鏈或非編碼鏈(反義鏈)。編碼成熟多肽的編碼序列可以與圖1和2所示的或保藏的克隆的編碼序列相同，或者可以是不同的編碼序列，這是由于遺傳密碼的冗余現(xiàn)象或簡并現(xiàn)象，該編碼序列如圖1和圖2的DNA或保藏的cDNA一樣編碼同樣的、成熟多肽。
編碼圖1、2和8的成熟多肽或編碼由保藏的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸可以包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列以及其它編碼序列如前導(dǎo)或分泌序列或蛋白原序列；成熟多肽的編碼序列(任選還有其它編碼序列)以及非編碼序列，如內(nèi)含子或成熟多肽編碼序列的5′和/或3′非編碼序列。
因此，術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”包括僅含有多肽編碼序列的多核苷酸，以及含有其它編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼具有圖1、2和8中推導(dǎo)的氨基酸序列的多肽的或由保藏的克隆的cDNA編碼的多肽的片段、類似物和衍生物。這些多核苷酸變異體可以是天然產(chǎn)生的多核苷酸等位變異體或者是非天然產(chǎn)生的多核苷酸變異體。
因此，本發(fā)明包括編碼如圖1、2和8所示的同樣的成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的同樣的成熟多肽的多核苷酸，以及這些多核苷酸的變異體，這些變異體編碼圖1、2和8的多肽的或由保藏的克隆的cDNA編碼的多肽的片斷、衍生物或類似物。這些核苷酸變異體包括缺失變異體、替換變異體和添加或插入變異體。
如上所述，本發(fā)明多核苷酸可含有一編碼序列，該編碼序列是天然產(chǎn)生的如圖1、2和8所示的編碼序列的或保藏的克隆的編碼序列的等位變異體。如本領(lǐng)域中已知的，等位變異體是一種多核苷酸序列的變型，其可以替換、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸，其基本上不改變所編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還包括一些多核苷酸，其中成熟多肽的編碼序列與一多核苷酸序列可被融合于同樣的讀碼框架中，該多核苷酸序列幫助從宿主細(xì)胞中表達(dá)和分泌多肽，例如，有分泌序列功能的前導(dǎo)序列以控制多肽從細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)。具有前導(dǎo)序列的多肽是一種蛋白前體(pre-protein)，宿主細(xì)胞可裂解前導(dǎo)序列而形成成熟型的多肽。多核苷酸也可編碼蛋白原(proprotein)，蛋白原是成熟蛋白加上附加的5′氨基酸殘基。含有原序列(prosequence)的成熟蛋白質(zhì)是蛋白原，是蛋白質(zhì)的非活性形式。一旦原序列被裂解便得到有活性的成熟蛋白。
因此，例如，本發(fā)明的多核苷酸可編碼成熟蛋白質(zhì)，或編碼具有原序列的蛋白質(zhì)或編碼具有原序列和前序列(前導(dǎo)序列)的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的多核苷酸還可含有與標(biāo)記序列融合于框架中的編碼序列，標(biāo)記序列有利于本發(fā)明多肽的純化。在細(xì)菌宿主的情況下，標(biāo)記序列可以是由pQE-9載體提供的六組氨酸標(biāo)記，利于將與標(biāo)記物相融合的成熟多肽進(jìn)行純化；或者，例如，當(dāng)使用哺乳動(dòng)物宿主如COS-7細(xì)胞時(shí)，標(biāo)記序列可以是血細(xì)胞凝集素(HA)標(biāo)記。HA標(biāo)記對應(yīng)于從流感血細(xì)胞凝集素蛋白衍生的表位(Wilson，I.等人，Cell，37767(1984))。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及當(dāng)序列間至少有50％及優(yōu)選70％一致性的情況下能與上述序列進(jìn)行雜交的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及與上述多核苷酸在嚴(yán)緊條件下進(jìn)行雜交的多核苷酸。此處所用術(shù)語“嚴(yán)緊條件”是指只有當(dāng)兩序列間有至少95％及優(yōu)選至少97％一致性的情況下才發(fā)生雜交。在優(yōu)選實(shí)施方案中能與上述多核苷酸進(jìn)行雜交的多核苷酸編碼的多肽，可以同圖1中的cDNA或保藏的cDNA所編碼的成熟多肽保持基本相同的生物功能或活性。
這里指的保藏物保持符合國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約的規(guī)定。提供這些保藏物僅為了對本領(lǐng)域技術(shù)人員方便而不是按35 U.S.C§112.要求保藏的承認(rèn)。保藏物質(zhì)中含有的多核苷酸序列及其編碼的多肽氨基酸序列并入本文作為參照，并且如果這里對序列的描述有任何矛盾之處時(shí)用于對照?？梢蕴岢鲋圃?、使用或銷售保藏物質(zhì)的許可請求，但這里并未授予這樣的許可。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有圖1、2和8推導(dǎo)的氨基酸序列或具有由保藏的cDNA編碼的氨基酸序列的多肽MIP-3、MIP-4和MIP-1γ，以及這些多肽的片段、類似物和衍生物。
當(dāng)指圖1、2和8的或由保藏的cDNA編碼的多肽時(shí)，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”的意思是基本保持了該多肽的同樣的生物功能或活性的多肽。因此，類似物包括可通過蛋白原部分的裂解進(jìn)行活化生成有活性的成熟多肽的蛋白原。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽。優(yōu)選重組多肽。
圖1、2和8的或由保藏的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(I)其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守的氨基酸殘基(優(yōu)選保守氨基酸殘基)取代，并且該被取代的氨基酸殘基可以是或者不是被遺傳密碼編碼的，或者(II)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包括取代基，或者(III)其中的成熟多肽與其它化合物融合，如延長多肽半衰期的化合物(如聚乙二醇)，或者(IV)其中有其它氨基酸融合于成熟多肽，如前導(dǎo)或分泌序列、或用于成熟多肽純化的序列、或蛋白原序列。這樣的片段、衍生物和類似物被視為本領(lǐng)域技術(shù)人員可從本發(fā)明的教導(dǎo)獲得的內(nèi)容范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選是以分離后的形式提供的，優(yōu)選純化為純品。
術(shù)語“分離后的”是指將物質(zhì)從其原始環(huán)境中(例如，如果它是天然產(chǎn)生的則指自然環(huán)境)分離出來。例如，天然生成的多核苷酸或存在于活體動(dòng)物中的多肽是未被分離的，但從天然系統(tǒng)的某些或所有共生物質(zhì)中分離出來的同樣的多核苷酸或DNA或多肽則是被分離后的。這樣的多核苷酸可以是載體的一部分和/或這樣的多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，并且仍是被分離后的，其中這樣的載體或組合物不是其自然環(huán)境中的一部分。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多核苷酸的載體、用本發(fā)明的載體進(jìn)行基因工程處理的宿主細(xì)胞以及用重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
用于基因工程處理(轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)的本發(fā)明的載體可以是，例如，克隆載體或表達(dá)載體，載體可以是，例如，質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等形式?？蓪⒒蚬こ烫幚砗蟮乃拗骷?xì)胞在適當(dāng)時(shí)修飾的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，修飾是為了活化啟動(dòng)子、篩選轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增MIP-3、MIP-4和MIP-1γ基因。培養(yǎng)條件如溫度、pH等是所選來用于表達(dá)的宿主細(xì)胞原來所用的培養(yǎng)條件，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。
可用本發(fā)明的多核苷酸通過重組技術(shù)生產(chǎn)多肽。例如，多核苷酸序列可被包括在各種表達(dá)載體的任一種之中，特別是表達(dá)多肽的載體或質(zhì)粒中。這些載體包括染色體的、非染色體的和合成的DNA序列，如SV40的衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；酵母菌質(zhì)粒；由質(zhì)粒和噬菌體DNA結(jié)合產(chǎn)生的載體，病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、鳥痘病毒、和偽狂犬病毒。但是也可使用任何其它質(zhì)?；蜉d體，只要它們在宿主中可復(fù)制和存活。
可用不同方法將適當(dāng)?shù)腄NA序列插入到載體中。通常，用本領(lǐng)域中已知的方法將DNA序列插入到適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)上。這種或其它方法被視為在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的范圍內(nèi)。
表達(dá)載體中的DNA序列通常與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列(啟動(dòng)子)有效地連接來指導(dǎo)mRNA合成。作為這些啟動(dòng)子的代表性實(shí)例，可以提及的是LIR或SV40啟動(dòng)子、大腸桿菌Lac或trp啟動(dòng)子。噬菌體λPL啟動(dòng)子以及其它已知的在原核或真核細(xì)胞或它們的病毒中控制基因表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯啟始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。載體還可包括適宜的擴(kuò)增表達(dá)的適宜序列。
另外，優(yōu)選表達(dá)載體含有為了選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞提供表型性狀的基因，如真核細(xì)胞培養(yǎng)物中的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或者如大腸桿菌中的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
含有如上面所述的適宜DNA序列、以及適宜啟動(dòng)子或控制序列的載體可被用于轉(zhuǎn)化適宜的宿主，使宿主表達(dá)蛋白質(zhì)。
作為適宜的宿主的代表性實(shí)例，可以提及的是細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈霉菌、鼠傷害沙門氏菌；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲細(xì)胞如果蠅和Sf9；動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；植物細(xì)胞等。適宜宿主的選擇被視為在本領(lǐng)域技術(shù)人員從本發(fā)明教導(dǎo)可以得知的范圍內(nèi)。
更具體地說，象上面的概括性描述的那樣，本發(fā)明還包括含有一個(gè)或多個(gè)序列的重組結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)載體，如質(zhì)粒或病毒載體，其中以正向或反向方向插入了本發(fā)明的序列。在這一實(shí)施方案中，優(yōu)選結(jié)構(gòu)中進(jìn)一步含有與本序列有效地連接的調(diào)節(jié)序列，包括例如啟動(dòng)子。有許多適宜的載體和啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并有市售。提供下列載體作為實(shí)例。細(xì)菌的pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8a、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。但是也可使用任何其它質(zhì)?；蜉d體，只要它們在宿主中可復(fù)制和存活。
啟動(dòng)區(qū)可選自任何使用CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)載體或其它帶選擇性標(biāo)記載體的目的基因。兩種適宜的載體是PKK232-8和PCM7。具體提及的細(xì)菌啟動(dòng)子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶、早期和延遲啟動(dòng)子SV40、來自反轉(zhuǎn)錄病毒的LRT、以及鼠金屬硫蛋白-I。適宜載體和啟動(dòng)子的選擇在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員水平之內(nèi)。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有上述結(jié)構(gòu)的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可為高等真核細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、或低等真核細(xì)胞如酵母細(xì)胞，或者宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞如細(xì)菌細(xì)胞。可通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、或電穿孔法將結(jié)構(gòu)引種到宿主細(xì)胞中。(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in MolecularBiology(1986))。
可以常規(guī)方法用宿主細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)生產(chǎn)由重組序列編碼的基因產(chǎn)物。另外，可用常規(guī)的肽合成儀合成生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
在適宜的啟動(dòng)子的控制下，成熟蛋白質(zhì)可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母菌、細(xì)菌、或其它細(xì)胞中得以表達(dá)。也可通過無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，使用從本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的RNA生產(chǎn)這些蛋白質(zhì)。對用于原核或真核宿主的適宜的克隆和表達(dá)載體已有描述，見Sambrook等人，Melecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Gold Spring Har-bor，N.Y.(1989)，其公開內(nèi)容在此引為參考。
將增強(qiáng)子序列插入載體可以提高編碼本發(fā)明多肽的DNA在真核細(xì)胞中進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件。通常為約10至300bp，其作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)它的轉(zhuǎn)錄。實(shí)例包括位于復(fù)制起點(diǎn)后部bp100-270的SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、位于復(fù)制起點(diǎn)后部的多形瘤增強(qiáng)子、以及腺病毒增強(qiáng)子。
通常，重組表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)和允許宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化的適宜的選擇標(biāo)記物，如大腸桿菌氨芐青霉素抗性基因和啤酒酵母TRP1基因，以及指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列轉(zhuǎn)錄的來自高度表達(dá)基因的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子可以是由編碼糖酵解酶的操縱子衍生的，這些糖酵解酶如3-磷酸苷油酸激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶、或熱休克蛋白等等。異源結(jié)構(gòu)序列與翻譯起始和終止序列、以及優(yōu)選的、能引導(dǎo)翻譯后蛋白分泌進(jìn)入壁膜間隙或細(xì)胞外介質(zhì)中的前導(dǎo)序列組裝在一個(gè)適當(dāng)?shù)目蚣苤?。任選地，異源序列可編碼含有產(chǎn)生所需特征的N-末端鑒別肽的融合蛋白，所需特征是指例如所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)的穩(wěn)定化或簡化純化過程。
用于細(xì)菌的有用的表達(dá)載體是通過在具有功能性啟動(dòng)子的可操縱讀碼框中插入編碼目的蛋白的結(jié)構(gòu)DNA序列以及適宜翻譯起始和終止信號而構(gòu)建的。載體還包括一個(gè)或多個(gè)表型選擇性標(biāo)記物和一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，以保證載體的維持，并且如需要，提供宿主中的擴(kuò)增。用于轉(zhuǎn)化的適宜的原核宿主包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌以及假單孢菌屬、鏈霉菌屬、和葡萄球菌屬中的各個(gè)種，也可以選擇其它菌種。
作為代表性的但非限制性的實(shí)例，用于細(xì)菌的有用表達(dá)載體可含有選擇性標(biāo)記物和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)，由含熟知的克隆載體pBR322(ATCC37017)的遺傳元件的市售質(zhì)粒衍生得到。這些市售載體包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美國)。這些pBR322“骨架”區(qū)與適宜的啟動(dòng)子和要表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列相組合。在適合的宿主菌株轉(zhuǎn)化以及宿主菌株生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用適當(dāng)方法誘導(dǎo)所選擇的啟動(dòng)子(如溫度變換或化學(xué)誘導(dǎo))，并將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
通過離心收集細(xì)胞，用物理或化學(xué)方法破碎，并將所得粗提取物進(jìn)一步純化。可用任何常規(guī)方法破碎表達(dá)蛋白質(zhì)所用的微生物細(xì)胞，包括冷凍—融化循環(huán)、超聲、機(jī)械碎碎、或用細(xì)胞溶解劑，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
也可用各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)體系表達(dá)重組蛋白質(zhì)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系的例子包括猴腎成纖維細(xì)胞系COS-7，Gluzman在Cell，23175(1981)中進(jìn)行了闡述，以及其它能表達(dá)匹配載體的細(xì)胞系，例如，C127、3T3、CHO、Hela和BHK細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體含有復(fù)制起點(diǎn)、適合的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，以及任何必要的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)、剪接供體和受體位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列、以及5′側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。從SV40剪接位點(diǎn)衍生的DNA序列和聚腺苷酸化位點(diǎn)可用于提供所需的非轉(zhuǎn)錄遺傳元件。
MIP-3、MIP-4和MIP-1γ用以下方法從重組細(xì)胞的培養(yǎng)物中回收和純化，所用方法包括硫酸銨或乙醇沉淀法、酸提取法、陰離子或陽離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水性相互作用色譜、親和色譜、羥基磷灰石色譜和凝集素色譜。優(yōu)選在純化過程中存在低濃度的(約0.15-5毫摩爾)鈣離子。(Price等人，J.Biol.Chem.，244917(1969))。在完成成熟蛋白的構(gòu)型過程中，如需要，可使用蛋白質(zhì)重折疊步驟。最后，可在最后的純化步驟中使用高效液相色譜(HPLC)。
本發(fā)明的多肽可為天然純化產(chǎn)物、或化學(xué)合成的產(chǎn)物、或用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，用細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng))生產(chǎn)。根據(jù)重組生產(chǎn)過程中使用的宿主，本發(fā)明的多肽可用哺乳動(dòng)物或其它真核糖糖基化或不糖基化。本發(fā)明的多肽還可包括一個(gè)起始甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明的多肽可用于各種免疫調(diào)節(jié)和炎性功能中，并可用于許多疾病狀況。MIP-3、MIP-4和MIP-1γ屬于趨化因子家族，因此它們是白細(xì)胞(如單核細(xì)胞、中性白細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞等)的化學(xué)吸引物。因此，MIP-3、MIP-4和MIP-1γ可通過控制靶免疫細(xì)胞向創(chuàng)傷區(qū)侵潤來促進(jìn)傷口愈口。與此類似，本發(fā)明的多肽可通過吸引和活化殺微生物白細(xì)胞來促進(jìn)宿主對慢性感染如分枝桿菌的防御。
另外，本發(fā)明的多肽可用于抗腫瘤治療，因?yàn)橛凶C據(jù)表明向腫瘤中注入趨化因子表達(dá)細(xì)胞可引起腫瘤的退化，例如，對卡波濟(jì)氏肉瘤的治療。MIP-3、MIP-4和MIP-1γ還可刺激宿主防御(殺腫瘤)細(xì)胞如胞毒T-細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的侵入和活化，從而可用于治療實(shí)體腫瘤。
這些多肽還可用于白血病中抑制骨髓干細(xì)胞集落的形成，并可在癌癥化療期作為造血干細(xì)胞的輔助保護(hù)治療。
本發(fā)明多肽的另一個(gè)用途是通過抑制IL-2的生物合成來抑制T-細(xì)胞的增殖，例如，用于自身免疫疾病和淋巴細(xì)胞白血病。
MIP-3、MIP-4和MIP-1γ還可用于抑制表皮角質(zhì)細(xì)胞增殖，其可用于牛皮癬(角質(zhì)細(xì)胞過度增殖)，因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn)皮膚中的朗格罕氏細(xì)胞產(chǎn)生MIP-1α。
MIP-3、MIP-4和MIP-1γ可通過清除碎屑炎性細(xì)胞和促結(jié)締組織炎性細(xì)胞的募集，以及其對過多TGFβ-介導(dǎo)的纖維化的可能性控制來阻止傷口愈合時(shí)的瘢痕形成。另外這些多肽可用于治療中風(fēng)、血小板增多、肺栓塞和骨髓增生癥，因?yàn)镸IP-3、MIP-4和MIP-1γ增加血管通透性。
還可根據(jù)本發(fā)明通過體內(nèi)表達(dá)這些多肽來使用這些多肽，通常將之稱作“基因治療”。
因此，例如，可將來自病人的細(xì)胞與編碼多肽的多核苷酸(DNA或RNA)在體外經(jīng)基因工程處理，然后經(jīng)基因工程處理的細(xì)胞向要治療的病人提供多肽。該方法是本領(lǐng)域中已知的。例如，可用本領(lǐng)域已知的方法通過使用含有編碼本發(fā)明多肽的RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒對細(xì)胞進(jìn)行基因工程處理。
與此類似，可將細(xì)胞在體內(nèi)進(jìn)行基因工程處理，通過例如本領(lǐng)域已知的步驟在體內(nèi)進(jìn)行多肽的表達(dá)。如本領(lǐng)域已知的，可將生成含有編碼本發(fā)明多肽的RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的生產(chǎn)細(xì)胞給予患者，細(xì)胞在體內(nèi)受基因工程處理，并在體內(nèi)表達(dá)多肽。通過本發(fā)明的闡述，這些或其它給予本發(fā)明多肽的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說應(yīng)是顯而易見的。例如，工程細(xì)胞的表達(dá)載體可以是反轉(zhuǎn)錄病毒之外的載體，例如，可將腺病毒與適宜傳遞載體組合后用于體內(nèi)處理細(xì)胞。
本發(fā)明的多肽可與適宜的藥用載體結(jié)合使用。這些組合物含有治療有效量的蛋白質(zhì)，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。該載體包括但不局限于鹽、緩沖性鹽、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其混合物。制劑應(yīng)適于給藥形式。
本發(fā)明還提供了一種含有一個(gè)或多個(gè)容器的藥品包或藥盒，容器內(nèi)填充有一種或多種本發(fā)明藥物組合物的成份。該容器中同時(shí)有一份說明，以管理藥品或生物制品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式，該通知反映了該機(jī)構(gòu)同意人用藥品的生產(chǎn)、使用或銷售。此外，本發(fā)明的多肽可與其它治療性化合物聯(lián)合使用。
這些藥物組合物可以常規(guī)方式給藥，如通過口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻腔或真皮內(nèi)的途徑。MIP-3、MIP-4和MIP-1γ對于某對象的給藥劑量和給藥次數(shù)決定于許多因素，如給藥方式、所治療的情況特征、以及開處方的醫(yī)生的判斷。一般來說，給予的有效治療劑量為至少約10μg/Kg體重，在大部分情況下，考慮到給藥途徑、癥狀等，給藥量不超過藥mg/Kg體重/每天，優(yōu)選劑量從約10μg/Kg體重/每天。
本發(fā)明的序列還可用于染色體的鑒別。該序列特異性地定向于并與人染色體特定位置相雜交。另外，現(xiàn)今特別需要鑒別染色體上的特定位點(diǎn)。目前很少有基于實(shí)際序列數(shù)據(jù)(重復(fù)多態(tài)性)的染色體標(biāo)記試劑來標(biāo)記染色體位置。在將序列與和疾病相關(guān)的基因關(guān)聯(lián)的過程中，根據(jù)本發(fā)明的染色體DNA基因制圖是重要的第一步。
簡單地說，可通過從cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-25bp)來繪制染色體序列圖譜。用cDNA計(jì)算機(jī)分析快速選擇不跨越一個(gè)以上的基因組DNA外顯子的引物，從而用于擴(kuò)增過程。然后用這些引物進(jìn)行含個(gè)體人染色體的體細(xì)胞雜種的PCR篩選。只有那些含有相應(yīng)于引物的人體基因的雜交體才會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增片段。
體細(xì)胞雜種的PCR繪圖是一種快速將特定DNA分配給特定染色體的方法。用本發(fā)明同樣的寡聚核苷酸引物以類似的方法，可以從特異染色體的系列片段或大基因組克隆庫進(jìn)行再定位。其它可同樣用于繪制其染色體圖譜的繪圖方法包括原位雜交、用標(biāo)記的流動(dòng)分揀的染色體的預(yù)篩選以及通過與構(gòu)建的染色體特異性cDNA文庫雜交來預(yù)選。
可用cDNA克隆與中期染色體展開體的熒光原位雜交(FISH)一步提供精確的染色體定位。這一技術(shù)可用于短至500或600個(gè)堿基的cDNA；但是，長于200bp的克隆更可能與單一染色體位置結(jié)合，并用簡單檢測方法可得到足夠的信號強(qiáng)度。FISH需要使用從中產(chǎn)生EST的克隆，并且越長越好。例如，2000bp為好，4000更好，而大于4000對于以合理比例的時(shí)間獲得好結(jié)果來說則是沒有必要的。對這一技術(shù)的綜述，參見Verma等人Human ChromosomesaManual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦將序列繪制成了精密染色體位置的圖譜，則可使染色體上序列的物理位置與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相關(guān)。這樣的數(shù)據(jù)見于例如V.Mckusick，Mendelian Inheritance in Man(可從Johns Hopkins Univer-sity Welch Medical Library獲得)。然后通過連鎖分析(物理相鄰基因共遺傳)鑒別基因與已繪制成同樣的染色體區(qū)域的疾病之間的關(guān)系。
然后，需要測定受感染的與未受感染的個(gè)體之間cDNA或基因組序列的區(qū)別。如果在某些或所有受感染的個(gè)體中發(fā)現(xiàn)了突變，而在任何正常個(gè)體中沒有發(fā)現(xiàn)，則該突變可能是疾病的致病因素。
根據(jù)目前物理繪圖和遺傳繪圖技術(shù)的分辨率，精密定位于與疾病相關(guān)的染色體區(qū)域的cDNA可以是一個(gè)在50和500之間的潛在致病基因之一(這是假設(shè)1兆堿基的繪圖分辨率和每20kb一個(gè)基因)。
受感染的和未受感染的個(gè)體的比較通常包括首先尋找染色體的結(jié)構(gòu)變化，如可從染色體展開體中觀察到的或用基于該cDNA序列的PCR可檢測到的缺失或易位。最后，需要完全測定來自幾個(gè)個(gè)體的基因的序列，以確認(rèn)突變的存在，并將突變與多態(tài)性區(qū)分開。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過使用反義技術(shù)在體內(nèi)抑制MIP-3、MIP-4和MIP-1γ的方法。反義技術(shù)可通過三股螺旋的形成或者反義DNA或RNA用于控制基因的表達(dá)，這兩種方法都是基于多核苷酸與DNA和RNA的結(jié)合。例如，用編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸序列的5′編碼部分設(shè)計(jì)長度為從約10到40個(gè)堿基對的反義RNA寡聚核苷酸。將DNA寡核苷酸設(shè)計(jì)成與從事轉(zhuǎn)錄的基因區(qū)域互補(bǔ)的DNA(三股螺旋——參見Lee等人，Nucl.Acids Res.，63073(1979)；Cooney等人，Science，241456(1988)；和Dervan等人，Sci-ence，2511360(1991))，從而防止MIP-3、MIP-4和MIP-1γ的轉(zhuǎn)錄和生成。反義RNA寡核苷酸與體內(nèi)mRNA雜交并阻抑mR-NA分子翻譯成MIP-3、MIP-4和MIP-1γ(反義——Okano，J.Neurochem.，56560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense In-hibitors of Gene Express，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1988))。
或者，可用本領(lǐng)域中的方法將上述寡核苷酸輸入細(xì)胞，從而反義RNA或DNA可以在體內(nèi)得以表達(dá)，以上述方式抑制MIP-3、MIP-4和MIP-1的生成。
因此，MIP-3、MIP-4和MIP-1γ的反義結(jié)構(gòu)可用于治療MIP-誘導(dǎo)的或增強(qiáng)的疾病，例如，動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫如多發(fā)性硬化和胰島素依賴型糖尿病，以及慢性炎癥和感染性疾病、組氨酸介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硅肺、肉樣瘤病、特發(fā)的肺纖維化以及其它肺慢性炎癥、特發(fā)的嗜酸性細(xì)胞過多癥、內(nèi)毒素休克、組氨介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)、前列腺素非依賴性發(fā)熱、以及再生障礙性貧血和其它骨髓衰竭情況。
多肽、它們的片段或其它衍生物或其類似物、或表達(dá)它們的細(xì)胞可用作生成其抗體的抗原。這些抗體可以是，例如，多克隆或單克隆抗體。本發(fā)明還包括嵌合的、單鏈的和人源化的抗體、以及Fab片段、或者Fab表達(dá)文庫的產(chǎn)物?？捎酶鞣N本領(lǐng)域中已知的方法生產(chǎn)這些抗體和片段。
可通過直接向動(dòng)物注射多肽或給動(dòng)物服用多肽，優(yōu)選非人體，來獲得針對相應(yīng)于本發(fā)明序列的多肽或其體內(nèi)受體生成的抗體。如此獲得的抗體將與多肽本身結(jié)合。用這種方法，即使僅編碼多肽片段的序列也可用于生成與整個(gè)天然多肽結(jié)合的抗體。然后可將該抗體用于從表達(dá)該多肽的組織中分離多肽。
為了制備單克隆抗體，可使用任何提供由連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)物生成的抗體的技術(shù)。實(shí)例包括雜交瘤技術(shù)(Kohler和Milstein，1975，Nature，256495-497)、trioma技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人，1983，Immunology Today 472)，以及生成人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等人，1985，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss Inc.，pp.77-96)。
為生產(chǎn)單鏈抗體所描述的技術(shù)(U.S.專利4,946,778)可適用于生產(chǎn)本發(fā)明免疫原性多肽產(chǎn)物的單鏈抗體。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明多肽的拮抗劑/抑制劑，其抑制或消除多肽的功能。
這樣，例如，拮抗劑與本發(fā)明的多肽相結(jié)合并抑制或消除其功能。拮抗劑，例如，可以是針對多肽的抗體，其與多肽結(jié)合或者，在某些情況下，與寡聚核苷酸結(jié)合。一個(gè)抑制劑的例子是與多肽催化位點(diǎn)結(jié)合并占據(jù)催化位點(diǎn)從而使催化位點(diǎn)不可與底物接近的小分子，這樣便阻礙了正常的生物活性。小分子的例子包括但不局限于小肽或類肽分子。
或者，可以使用本發(fā)明多肽的拮抗劑，與跟本發(fā)明多肽正常結(jié)合的受體相結(jié)合。這種拮抗劑可以是緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)，這樣它們識(shí)別并與天然蛋白質(zhì)的受體位點(diǎn)結(jié)合，但它們是多肽的非活性形式，從而由于受體位點(diǎn)被占據(jù)便阻礙了MIP-3、MIP-4和MIP-1γ的作用。
這樣，拮抗劑/抑制劑可用作抗炎藥，阻礙白細(xì)胞的吸引和活化。它們還可在自身免疫和慢性炎癥和感染性疾病中用于抑制巨噬細(xì)胞及其前體、中性白細(xì)胞、嗜堿性白細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和某些T-細(xì)胞亞型的趨化性和活化；抑制MIP-誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞脫粒，并且進(jìn)而降低組氨酸介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)；抑制主要由IL-1和TNF引起的有害的級聯(lián)反應(yīng)，IL-1和TNF的生物合成是由MIP刺激的；風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；阻止MIP-驅(qū)動(dòng)的從中性白細(xì)胞主導(dǎo)的炎癥到巨噬細(xì)胞主導(dǎo)的病理狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，這一轉(zhuǎn)變是從急性可恢復(fù)的炎性防御而轉(zhuǎn)至慢性最終破壞性機(jī)理的關(guān)鍵，如自身免疫疾病。
這些拮抗劑/抑制劑還可用于治療硅肺、肉樣瘤病、特發(fā)的肺纖維化和其它慢性肺炎癥；特發(fā)的嗜酸性細(xì)胞過多癥(由于提高了MIP的生成而加劇了嗜酸性細(xì)胞的生成和遷移)；由于MIP對內(nèi)毒素的反應(yīng)水平升高引起的內(nèi)毒素休克；通過抑制MIP誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞脫粒而抑制組氨酸介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)；抑制由MIP-1γ誘導(dǎo)的前列腺素非依賴性發(fā)熱；并防止過多的MIP-1γ在再生障礙性貧血和其它骨髓衰竭情況下的抑制作用。
這些抗體還可用于對跟蹤疾病發(fā)展過程和治療干予的效果的預(yù)后應(yīng)用和臨床篩選。固有巨噬細(xì)胞產(chǎn)生少量或不產(chǎn)生MIP mRNA，能檢測此項(xiàng)的診斷性抗體可用作自身免疫疾病和慢性炎癥以及感染狀態(tài)的指示劑。
這些拮抗劑/抑制劑可與藥用載體一起用于組合物中，如上面所述。
本發(fā)明將參照下列實(shí)施例作進(jìn)一步說明；但應(yīng)理解本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。所有份或量，除另有說明外，均以重量計(jì)。
為了便于理解下列實(shí)施例，對某些經(jīng)常出現(xiàn)的方法和/或術(shù)語解釋如下。
“質(zhì)?！庇闷淝昂?或后有大寫字母和/或數(shù)的小寫p表示。這文中的起始質(zhì)粒是市售的、公眾不受限制可得到的，或者從可得到的質(zhì)粒按公開方法可以構(gòu)建的。另外，同那些所描述的質(zhì)粒相等同的質(zhì)粒是本領(lǐng)域已知的，并且對于普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。
DNA的“消化”是指用僅作用在DNA某序列的限制性內(nèi)切酶催化裂解DNA。此處所用的各種限制性內(nèi)切酶是市售的，并且它們的反應(yīng)條件、輔助因子和所用的其它要求對于普通技術(shù)人員是已知的。為了分析目的，通常于約20μl緩沖液中1μg質(zhì)?；駾NA片段使用約2單位酶。為了分離用于構(gòu)建質(zhì)粒的DNA片段，通常用20至250單位的酶在較大體積中消化5至50μg的DNA。用于特定限制性內(nèi)切酶的適宜緩沖液和底物量已由制造商標(biāo)明。通常使用的孵育時(shí)間為37℃約1小時(shí)，但可根據(jù)供貨商的指導(dǎo)而改變。消化反應(yīng)后，直接將反應(yīng)液在聚丙烯酰胺凝膠電泳上電泳來分離目的片段。
用8％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行裂解片段的大小分離，如Goeddel，D.等人，Nucleic Acids Res.，84057(1980)所述。
“寡核苷酸”是指可被化學(xué)合成的單鏈多聚脫氧核苷酸或兩個(gè)互補(bǔ)的多聚脫氧核苷酸鏈。這些合成的寡核苷酸沒有5′磷酸，因此沒有在激酶存在下加入磷酸和ATP，就不能與另一寡聚核苷酸連接。合成寡核苷酸將與未脫磷酸化的片段連接。
“連接”是指在兩個(gè)雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鏈的過程(Maniatis，T.等人，Id.，P.146)。除非另外提供，可用已知緩沖液和條件，每0.5μg大約等摩爾量的待連接DNA片段用10單位T4DNA連接酶(“連接酶”)完成連接反應(yīng)。
除非另外說明，按照Graham，F(xiàn).和Van der Eb，A.，Virology，52456-457(1973)中所述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例1MIP-3的細(xì)菌表達(dá)和純化
首先，用相應(yīng)于加工后MIP-3蛋白的5′序列(減去信號肽序列)以及MIP-3基因3′的載體序列的PCR寡聚核苷酸引物，使編碼MIP-3的DNA序列ATCC#75676擴(kuò)增。分別向5′和3′序列加入相應(yīng)于BamHI和XbaI的額外核苷酸。5′寡聚核苷酸引物具有序列5′-TCAGGATCCGTCACAAAAGATG CAGA-3′，其含有BamHI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)后是從推測的加工后蛋白質(zhì)末端氨基酸密碼子開始的MIP-3編碼序列的18個(gè)核苷酸。3′序列3′-CGCTCTAGAGTAAAACGAC GGCCAGT-5′含有與XbaI位點(diǎn)互補(bǔ)的序列和與位于MIP-3DNA插入子3′的pBluescript SK-載體序列互補(bǔ)的序列。限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)相應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體PQE-9上的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。(Qiagen，Inc.9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)。PQE-9編碼抗生素抗性(Ampr)、細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、IPTG-可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子操縱子(P/O)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、6-His標(biāo)記和限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。然后用BamHI和XbaI消化pQE-9。將擴(kuò)增后的序列連接到PQE-9中并與編碼組氨酸標(biāo)記和RBS的序列插入同一框架。圖6表示該方法的示意圖。然后將連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15/rep4，該菌株可從Qiagen以商標(biāo)M15/rep4獲得。M15/rep4含有多挎貝的質(zhì)粒，該質(zhì)粒表達(dá)lacI阻抑物，并且還能提供卡那霉素抗性(Kanr)。通過它們在LB平板上的生長能力來鑒別轉(zhuǎn)化子，并篩選氨芐青霉素/卡那霉素抗性克隆。分離質(zhì)粒DNA并用限制酶切分析確認(rèn)。將含有目的結(jié)構(gòu)的克隆在補(bǔ)充有Amp(100ug/ml)和Kan(25ug/ml)的LB培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)生長過夜(O/N)。將培養(yǎng)過夜的培養(yǎng)物用于接種大量的培養(yǎng)液，比例為1∶100至1∶250。使細(xì)胞生長到光密度600(O.D.600)為0.4至0.6之間。然后加入IPTG(“異丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷”)至最終濃度為1mM。IPTG通過使lacI阻抑物失活來釋放P/O，導(dǎo)致基因表達(dá)增強(qiáng)。再使細(xì)胞生長3至4小時(shí)。離心收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀溶解于離液劑6摩爾鹽酸胍中。澄清后，在使含6-His標(biāo)記的蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的條件下，在Nickel-Chelate柱上層析，從該溶液中純化溶解的MIP-3。Hochuli，E等人，J.Chromato-graphy 411177-184(1984)。用6摩爾鹽酸胍pH5.0從柱子中洗脫出MIP-3(純度95％)，并且為了使之復(fù)性將其調(diào)節(jié)至3摩爾鹽酸胍、100mM磷酸鈉、10毫摩爾谷胱甘肽(還原的)和2毫摩爾谷脫甘肽(氧化的)。在該溶液中孵育12小時(shí)將該溶液對10毫摩爾磷酸鈉透析。誘導(dǎo)后相應(yīng)于14Kd的新蛋白質(zhì)的出現(xiàn)驗(yàn)證了MIP-3的表達(dá)。
實(shí)施例2MIP-4的細(xì)菌表達(dá)和純化首先，用相應(yīng)于加工后的MIP-4蛋白質(zhì)5′序列(減去信號肽序列)和MIP-4基因的3′pBSK載體序列的PCR寡核苷酸引物，使編碼MIP-4的DNA序列ATCC#75675擴(kuò)增。分別向5′和3′序列加入相應(yīng)于BamHI和XbaI的額外核苷酸。5′寡聚核苷酸引物具有序列TCAGGATCCTGTGCACAAGTTGGTACC，其含有BamHI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)后是從推測的加工后蛋白質(zhì)末端氨基酸密碼子開始的MIP-4編碼序列的18個(gè)核苷酸；3′序列CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT含有與XbaI位點(diǎn)互補(bǔ)的序列和與位于MIP-4DNA插入子3′的pBluescriptSK-載體序列互補(bǔ)的序列。限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)相應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9上的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。(Qiagen，Inc.9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)。pQE-9編碼抗生素抗性(Ampr)、細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、IPTG-可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子操縱子(P/O)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、6-His標(biāo)記和限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。然后用BamHI和XbaI消化pQE-9。將擴(kuò)增后的序列連接到pQE-9中并與編碼組氨酸標(biāo)記和RBS的序列插入同一框架。圖6表示該方法的示意圖。然后將連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15/rep4，該菌株可從Qiagen以商標(biāo)M15/rep4獲得。M15/rep4含有多挎貝的質(zhì)粒pREP4，該質(zhì)粒表達(dá)lacI阻抑物，并且還能提供卡那霉素抗性(Kanr)。通過它們在LB平板上的生長能力來鑒別轉(zhuǎn)化子，并篩選氨芐氫青霉素/卡那霉素抗性克隆。分離質(zhì)粒DNA并用限制酶切分析確認(rèn)。將含有目的結(jié)構(gòu)的克隆在補(bǔ)充有Amp(100ug/ml)和Kan(25ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中生長過夜(O/N)。將培養(yǎng)過夜的培養(yǎng)物用于接種大量的培養(yǎng)液，比例為1∶100至1∶250。使細(xì)胞生長到光密度600(O.D.600)為0.4至0.6之間。然后加入IPTG(“異丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷”)至最終濃度為1mM。IPTG通過使lacI阻抑物失活來釋放P/O，導(dǎo)致基因表達(dá)增強(qiáng)。再使細(xì)胞生長3至4小時(shí)。離心收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀溶解于離液劑6摩爾鹽酸胍中。澄清后，在使含6-His標(biāo)記的蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的條件下，在Nickel-Chelate柱上層析；從該溶液中純化溶解的MIP-4。Hochuli，E等人，J.Chromatography411177-184(1984)。用6摩爾鹽酸胍pH5.0從柱子中洗脫出MIP-4(純度95％)，并且為了使之復(fù)性將其調(diào)節(jié)至3摩爾鹽酸胍、100mM磷酸鈉、10毫摩爾谷胱甘肽(還原的)和2毫摩爾谷胱甘肽(氧化的)。在該溶液中孵育12小時(shí)后將該溶液對10毫摩爾磷酸鈉透析。誘導(dǎo)后相應(yīng)于14kd的新蛋白質(zhì)的出現(xiàn)驗(yàn)證了MIP-4的表達(dá)。(圖5)。
實(shí)施例3重組MIP-3在COS細(xì)胞中的表達(dá)表達(dá)質(zhì)粒CMV-MIP-3HA是從載體pcDNAI/Amp(Invitro-gen)衍化來的，其含有1)SV40復(fù)制起點(diǎn)，2)氨芐青霉素抗性基因，3)大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)，4)CMV啟動(dòng)子，其后是多接頭區(qū)、SV40內(nèi)含子和聚腺苷酸化位點(diǎn)。將編碼整個(gè)MIP-3前體和同框架融合于其3′末端的HA標(biāo)記物的DNA片段克隆列載體的多接頭區(qū)，從而，在CMV啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)。如前面所述，HA標(biāo)記物對應(yīng)于從流感血細(xì)胞凝集素蛋白衍生的表位(I.Wilson，H.Ni-man，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，和R.Lerner，1984，Cell37，767)。HA標(biāo)記物與我們的靶蛋白的融合使得易于用識(shí)別HA表位的抗體檢測重組蛋白質(zhì)。
質(zhì)粒的構(gòu)建方法敘述如下用兩個(gè)引物在原始EST克隆上用PCR方法構(gòu)建編碼MIP-3的DNA序列ATCC#75676，這兩個(gè)引物是5′引物(5′GGAAAGCT-TAT GAAGGTCTCCGTGGCT-3′)含有HindIII位點(diǎn)，該位點(diǎn)后是從起始密碼子開始的MIP-3編碼序列的18個(gè)核苷酸；3′序列(5′-CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAATTCTTCCTGGTCTTGATCC-3′)含有與XbaI位點(diǎn)、翻譯終止密碼子、HA標(biāo)記物和MIP-3編碼序列(不包括終止密碼子)的最后20個(gè)核苷酸互補(bǔ)的序列。因此，PCR產(chǎn)物含有HindIII位點(diǎn)、MIP-3編碼序列、其后有同框架融合的HA標(biāo)記物、跟在HA標(biāo)記物后面的翻譯終止密碼子、以及XbaI位點(diǎn)。用HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化PCR擴(kuò)增的DNA片段和載體pcDNAI/Amp，并進(jìn)行連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株SURE中(可從StratageneCloning Systems獲得，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA92037)。將轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)物鋪到氨芐青霉素培養(yǎng)基平板上，并篩選抗性克隆。從轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA，并用限制酶切分析檢查正確片段的存在。為了表達(dá)重組MIP-3，用DEAE-DEXTRAN法使表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞中(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring LaboratoryPress，(1989))。用放射性標(biāo)記和免疫沉淀法檢測MIP-3-HA蛋白的表達(dá)。(W.Harlow，D.Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988))。轉(zhuǎn)染兩天后，用35S-半胱氨酸將細(xì)胞標(biāo)記8小時(shí)。然后收集培養(yǎng)基并用洗滌劑(RIPA緩沖液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5)溶解細(xì)胞。(Wilson，I.等人，Id，37767(1984))。用HA特異性單克隆抗體沉淀細(xì)胞溶解物和培養(yǎng)基。在15％SDS-PAGE凝膠上分析沉淀的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例4重組MIP-4在COS細(xì)胞中的表達(dá)表達(dá)質(zhì)粒CMV-MIP-4HA的是從載體pcDNAI/Amp(Invit-rogen)衍化來的，其含有1)SV40復(fù)制起點(diǎn)，2)氨芐青霉素抗性基因，3)大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)，4)CMV啟動(dòng)子，其后是多接頭區(qū)、SV40內(nèi)含子和聚腺苷酸化位點(diǎn)。將編碼整個(gè)MIP-4前體和同框架融合于其3′末端的HA標(biāo)記物的DNA片段克隆列載體的多接頭區(qū)，從而在CMV啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)。如前面所述，HA標(biāo)記物對應(yīng)于從流感血細(xì)胞凝集素蛋白衍生的表位(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，和R.Lerner，1984，Cell37，767)。HA標(biāo)記物與我們的靶蛋白的融合使得易于用識(shí)別HA表位的抗體檢測重組蛋白質(zhì)。
質(zhì)粒的構(gòu)建方法敘述如下用兩個(gè)引物在原始EST克隆上用PCR方法構(gòu)建編碼MIP-4的DNA序列ATCC#75675，這兩個(gè)引物是5′引物(5′GGAAAGCT-TAT GAAGGGCCTTGCAGCTGCC-3′)含有HindIII位點(diǎn)，該位點(diǎn)后是從起始密碼子開始的MIP-4編碼序列的20個(gè)核苷酸；3′序列(5′CGCTCTAGATCAABCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGGCATTCAGCTTCA GGTC3′)含有與XbaI位點(diǎn)、翻譯終止密碼子、HA標(biāo)記物和MIP-4編碼序列(不包括終止密碼子)的最后19個(gè)核苷酸互補(bǔ)的序列。因此，PCR產(chǎn)物含有HindIII位點(diǎn)、MIP-4編碼序列、其后有同 框架融合的HA標(biāo)記物、跟在HA標(biāo)記物后面的翻譯終止密碼子、以及XbaI位點(diǎn)。用HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化PCR擴(kuò)增的DNA片段和載體pcDNAI/Amp，并進(jìn)行連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株SURE中(可從Stratagene CloningSystems獲得，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA92037)。將轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)物鋪到氨芐青霉素培養(yǎng)基平板上并篩選抗性克隆。從轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA，并用限制酶切分析檢查正確片段的存在。為了表達(dá)重組MIP-4，用DEAE-DEXTRAN法使表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞中(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring LaboratoryPress，(1989))。用放射性標(biāo)記和免疫沉淀法檢測MIP-4-HA蛋白的表達(dá)。(E.Harlow，D.Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988))。轉(zhuǎn)染兩天后，用35S半胱氨酸將細(xì)胞標(biāo)記8小時(shí)。然后收集培養(yǎng)基并用洗滌劑(RIPA緩沖液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5)溶解細(xì)胞。(Wilson，I.等人，Id，37767(1984))。用HA特異性單克隆抗體沉淀細(xì)胞溶解物和培養(yǎng)基。在15％SDS-PAGE凝膠上分析沉淀的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例5人體組織中MIP-3的表達(dá)模式用Northern印跡分析法檢測人體組織中MIP-3的表達(dá)水平。用RNAzolTMB系統(tǒng)(Biotecx Laboratories，Inc.6023 South LoopEast，Houston，TX77033)分離所有細(xì)胞RNA樣品。將從每種人體組織中分離的所有RNA約10μg在l％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)印到尼龍濾膜上。(Sambrook，F(xiàn)ritsch，和Maniatis，Mole cularCloning，Cold Spring Harbor Press，(1989))。按照StratagenePrime-It試劑盒用50ng DNA片段進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。用Select-G-50柱純化標(biāo)記的DNA，(5 Prime-3 Prime，Inc.5603 ArapahoeRoad’Boulder，CO 80303)。然后將濾膜與放射活性標(biāo)記的全長MIP-3基因以1,000,000cpm/ml于0.5M Na3PO4、pH7.4和7％SDS中于65℃雜交過夜。用0.5XSSC、0.1％SDS在室溫洗滌兩次，在60℃洗滌兩次，然后將濾膜用增敏屏在-70℃暴光過夜。實(shí)施例6人體組織中MIP-4的表達(dá)模式用Northern印跡分析法檢測人體組織中MIP-4的表達(dá)水平。用RNAzolTMB系統(tǒng)(Biotecx Laboratories，Inc.6023 South LoopEast，Houston，TX77033)分離所有細(xì)胞RNA樣品。將從每種人體組織中分離的所有RNA約10μg在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)印到尼龍濾膜上。(Sambrook，F(xiàn)ritsch，和Maniatis，Mole-cularCloning，Cold Spring Harbor Press，(1989))。按照StratagenePrime-It試劑盒用50ng DNA片段進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。用Select-G-50柱純化標(biāo)記的DNA，(5 Prime-3 Prime，Inc.5603 ArapahoeRoad，Boulder，CO 80303)。然后將濾膜與放射活性標(biāo)記的全長MIP-4基因以1,000,000cpm/ml于0.5M Na3PO4、pH7.4和7％SDS中于65℃雜交過夜。用0.5XSSC、0.1％SDS在室溫洗滌兩次，在60℃洗滌兩次，然后將濾膜用增敏屏在-70℃暴光過夜。參見圖6。
實(shí)施例7MIP-1γ的細(xì)菌表達(dá)和純化首先，用相應(yīng)于加工過的MIP-1γ蛋白的5′和3′序列(減去信號肽序列)的PCR寡聚核苷酸引物，使編碼MIP-1γ的DNA序列PBLSKMIP(ATCC#75572)擴(kuò)增。相應(yīng)于BamHI和XbaI的額外核苷酸分別加入5′和3′序列。5′寡聚核苷酸引物具有序列GCC-CGCGGATCCTCCTCACGGGGACCTTAC，其含有BamHI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)后是從推測的加工后蛋白質(zhì)末端氨基酸密碼子開始的MIP-1γ編碼序列的15個(gè)核苷酸。3′序列GC-CTGCTCTAGATCAAAGCAGGGAAGCTCCAG含有與XbaI位點(diǎn)、翻譯終止密碼子和MIP-1γ編碼序列的最后20個(gè)核苷酸互補(bǔ)的序列。限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)相應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9上的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。(Qiagen，Inc.9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)。pQE-9編碼抗生素抗性(Ampr)、細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、IPTG-可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子操縱子(P/O)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、6-His標(biāo)記和限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。然后用BamHI和XbaI消化pQE-9。將擴(kuò)增后的序列連接到pQE-9中并與編碼組氨酸標(biāo)記和RBS的序列插入同一框架。圖6表示該方法的示意圖。然后將連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌，該菌株可從Qiagen以商標(biāo)M15/rep4獲得。M15/rep4含有多挎貝的質(zhì)粒pREP4，該質(zhì)粒表達(dá)lacI阻抑物，并且還能提供卡那霉素抗性Kanr)。通過它們在LB平板上的生長能力來鑒別轉(zhuǎn)化子，并篩選氨芐青霉素/卡那霉素抗性克隆。分離質(zhì)粒DNA并用限制酶切分析確認(rèn)。將含有目的結(jié)構(gòu)的克隆在補(bǔ)充有Amp(100ug/ml)和Kan(25ug/ml)的LB培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)生長過夜(O/N)。將培養(yǎng)過夜的培養(yǎng)物用于接種大量的培養(yǎng)液，比例為1∶100至1∶250。使細(xì)胞生長到光密度600(O.D.600)為0.4至0.6之間。然后加入IPTG(“異丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷”)至最終濃度為1mM。IPTG通過使lacI阻抑物失活來釋放P/O，導(dǎo)致基因表達(dá)增強(qiáng)。再使細(xì)胞生長3至4小時(shí)。離心收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀溶解于離液劑6摩爾鹽酸胍中。澄清后，在使含6-His標(biāo)記的蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的條件下，在Nickel-Chelate柱上層析，從該溶液中純化溶解的MIP-1γ。Hochuli，E等人，J.Chromatography 411177-184(1984)。用6摩爾鹽酸胍pH5.0從柱子中洗脫出MIP-1γ(純度95％)，并且為了使之復(fù)性將其調(diào)節(jié)至3摩爾鹽酸胍、100mM磷酸鈉、10毫摩爾谷胱甘肽(還原的)和2毫摩爾谷脫甘肽(氧化的)。在該溶液中孵育12小時(shí)后，將該溶液對10毫摩爾磷酸鈉透析。誘導(dǎo)后相應(yīng)于14Kd的新蛋白質(zhì)的出現(xiàn)驗(yàn)證了MIP-1γ的表達(dá)。(圖3)實(shí)施例8重組MIP-1γ在COS細(xì)胞中的表達(dá)表達(dá)質(zhì)粒CMV-MIP-1γHA的是從載體pcDNAI/Amp(In-vitrogen)衍生來的，其含有1)SV40復(fù)制起點(diǎn)，2)氨芐青霉素抗性基因，3)大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)，4)CMV啟動(dòng)子，其后是多接頭區(qū)、SV40內(nèi)含子和聚腺苷酸化位點(diǎn)。將編碼整個(gè)MIP-1γ前體和同框架融合于其3′末端的HA標(biāo)記物的DNA片段克隆列載體的多接頭區(qū)，從而，在CMV啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)。如前面所述，HA標(biāo)記物對應(yīng)于從流感血細(xì)胞凝集素蛋白衍生的表位(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，和R.Lerner，1984，Cell37，767)。HA標(biāo)記物與我們的靶蛋白的融合使得易于用識(shí)別HA表位的抗體檢測重組蛋白質(zhì)。
質(zhì)粒的構(gòu)建方法敘述如下用兩個(gè)引物在原始EST克隆上用PCR方法構(gòu)建編碼MIP-1γ的DNA序列(ATCC#75572)，這兩個(gè)引物是5′引物(5′GGAAAGCTTAT GAAGATTCCGTGGCTGC-3′)含有HindIII位點(diǎn)，該位點(diǎn)后是從起始密碼子開始的MIP-1γ編碼序列的20個(gè)核苷酸；3′序列(5′-CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTTCTCCTTCATGTCCTTG-3′)含有與XbaI位點(diǎn)、翻譯終止密碼子、HA標(biāo)記物和MIP-1γ編碼序列(不包括終止密碼子)的最后19個(gè)核苷酸互補(bǔ)的序列。因此，PCR產(chǎn)物含有HindI-II位點(diǎn)、MIP-1γ編碼序列、其后有同框架融合的HA標(biāo)記物、跟在HA標(biāo)記物后面的翻譯終止密碼子、以及XbaI位點(diǎn)。用HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化PCR擴(kuò)增的DNA片段和載體pcDNAI/Amp，并進(jìn)行連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株SURE中(可從Stratagene Cloning Systems獲得，11099 North Torrey PinesRoad，La Jolla，CA92037)。將轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)物鋪到氨芐青霉素培養(yǎng)基平板上并篩選抗性克隆。從轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA，并用限制酶切分析檢查正確片段的存在。為了表達(dá)重組MIP-1γ，用DEAE-DEXTRAN法使表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞中(J.Sam-brook，E.Fritsch，T.Maniatis，Molecalar CloningA Laboratory Man-ual，Cold Spring Laboratory Press，(1989))。用放射性標(biāo)記和免疫沉淀法檢測MIP-1γ-HA蛋白的表達(dá)。(E.Harlow，D.Lane，Anti-bodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988))。轉(zhuǎn)染兩天后，用35S半胱氨酸將細(xì)胞標(biāo)記8小時(shí)。然后收集培養(yǎng)基并用洗滌劑(RIPA緩沖液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5)溶解細(xì)胞。(Wilson，I.等人，Id，37767(1984))。用HA特異性單克隆抗體沉淀細(xì)胞溶解物和培養(yǎng)基。在15％SDS-PAGE凝膠上分析沉淀的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例9人體組織中MIP-1γ的表達(dá)模式用Northern印跡分析法檢測人體組織中MIP-1γ的表達(dá)水平。用RNAzolTMB系統(tǒng)(Biotecx Laboratories，Inc.6023 South LoopEast，Houston，TX77033)分離所有細(xì)胞RNA樣品。將從各種人體組織中分離的所有RNA約10μg在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)印到尼龍濾膜上。(Sambrook，F(xiàn)ritsch，和Maniatis，Mole cularCloning，Cold Spring Harbor Press，(1989))。按照StratagenePrime-It試劑盒用50ng DNA片段進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。用Select-G-50柱純化標(biāo)記的DNA，(5 Prime-3 Prime，Inc.5603 ArapahoeRoad，Boulder，CO 80303)。然后將濾膜與放射活性標(biāo)記的全長MIP-1γ基因以1,000,000cpm/ml于0.5M Na3PO4、pH7.4和7％SDS中于65℃雜交過夜。用0.5XSSC、0.1％SDS在室溫洗滌兩次，在60℃洗滌兩次，然后將濾膜用增敏屏在-70℃暴光過夜。在脾、肺、肝中有豐富的MIP-1γ的信使RNA，而其它組織中則較少。(圖5)。
基于上述講解，本發(fā)明可以有多種修改和變型，因此在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)，可按上面特別描述以外的方法實(shí)施本發(fā)明。
序列表(1)一般信息(i)申請人LI，等人。
(ii)發(fā)明名稱巨噬細(xì)胞炎性蛋白-3、-4和1γ。
(iii)序列數(shù)6(iv)通信地址(A)收信人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CEC-CHI，STEWART&OCSTEIN(B)大街6 BECKER FARM ROAD(C)城市Roseland(D)州新澤西(E)國別美國(F)郵編07268(v)計(jì)算機(jī)閱讀形式(A)媒介類型3.5英寸軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PS/2(C)操作系統(tǒng)MS-DOS(D)軟件WORD PERFECT 5.1(vi)本申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日.
(C)分類.
(vii)在先申請數(shù)據(jù)
(A)申請?zhí)?8/173,209(B)申請日22-DEC-93(viii)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?8/208,339(B)申請日08-MAR-94(ix)代理人/代理機(jī)構(gòu)信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)注冊號36134.
(C)參考號/卷號325800-163(x)電信(A)電話201-944-1700(B)傳真201-944-1744(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征.
(A)長度474個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1TGAAGCTCCC ACCAGGCCAG CTCTCCTCCC ACAACAGCTT CCCACAGCAT GAAGATCTCC 60GTGGCTGCAA TTCCCTTCTT CCTCCTCATC ACCATCGCCC TAGGGACCAA GACTGAATCC 120TCCTCACGGG GACCTTACCA CCCCTCAGAG TGCTGCTTCA CCTACACTAC CTACAAGATC 180CCGCGTCAGC GGATTATGGA TTACTATGAG ACCAACAGCC AGTGCTCCAA GCCCGGAATT 240GTCTTCATCA CCAAAAGGGG CCATTCCGTC TGTACCAACC CCAGTGACAA GTGGGTCCAG 300GACTATATCA AGGACATGAA GGAGAACTGA GTGACCCAGA AGGGGTGGCG AAGGCACAGC 360TCAGAGACAT AAAGAGAAGA TGCCAAGGCC CCCTCCTCCA CCCACCGCTA ACTCTCAGCC 420CCAGTCACCC TCTTGGAGCT TCCCTGCTTT GAATTAAAGA CCACTCATGC TCTT 474(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征.
(A)長度93個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Lys Ile Ser Val Ala Ala Ile Pro Phe Phe Leu Leu Ile Thr-20 -15 -10Ile Ala Leu Gly Thr Lys Thr Glu Ser Ser Ser Arg Gly Pro Tyr-5 1 5His Pro Ser Glu Cys Cys Phe Thr Tyr Thr Thr Tyr Lys Ile Pro10 15 20Arg Gln Arg Ile Met Asp Tyr Tyr Glu Thr Asn Ser Gln Cys Ser25 30 35Lys Pro Gly Ile Val Phe Ile Thr Lys Arg Gly His Ser Val Cys40 45 50Thr Asn Pro Ser Asp Lys Trp Val Gln Asp Tyr Ile Lys Asp Met55 60 65Lys Glu Asn(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度366個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3ATGAAGGTCT CCGTGGCTGC CCTCTCCTGC CTACATGCCT TTTTACTGCC CTTGGTCCCA 60GGGCCGGGTC ACAAAAGATG CAGAGACAGA GTTCATGAAT GTCAAAGCTT CATTGGAAAG 120ATCCAGTACT TCTGGGACAG ATTCCATGCT ACTAGTGCTG ACTGCTGCAT CTCCTACACC 180CCACGAAGCA TCCCGTGTTC ACTCCTGGAG AGTTACTTTG AAACGAACAG CGAGTGCTCC 240AAGCCGGGTG TCATCTTCCT CACCAAGAAG GGGCGACGTT TCTGTGCCAA CCCCAGTGAT 300AAGCAAGTTC AGGTTTGCAT GAGAATGCTG AAGCTGGACA CACGGATCAA GACCAGGAAG 360AATTGA366(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征.
(A)長度121個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu His Ala Phe Leu-45 -40 -35Leu Pro Leu Val Pro Gly Pro Gly His Lys Arg Cys Arg Asp Arg-30 -25 -20Val His Glu Cys Gln Ser Phe His Trp Lys Ile Gln Tyr Phe Trp-15 -10 -5Asp Arg Phe His Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys Ile Ser Tyr Thr5 10 15Pro Arg Ser Ile Pro Cys Ser Leu Leu Gln Ser Tyr Phe Glu Thr20 25 30Asn Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys35 40 45Gly Arg Arg Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys Gln Val Gln Val50 55 60Cys Met Arg Met Leu Lys Leu Asp Thr Arg Ile Lys Thr Arg Lys65 70 75Asn(3)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征.
(A)長度270個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5ATGAAGGGCC TTGCAGCTGC CCTCCTTGTC CTCGTCTGCA CCATGGCCCT CTGCTCCTGT 60GCACAAGTTG GTACCAACAA AGAGCTCTGC TGCCTCGTCT ATACCTCCTG GCAGATTCCA 120CAAAAGTTCA TAGTTGACTA TTCTGAAACC AGCCCCCAGT GCCCCAAGCC AGGTGTCATC 180CTCCTAACCA AGAGAGGCCG GCAGATCTGT GCTGACCCCA ATAAGAAGTG GGTCCAGAAA 240TACATCAGCG ACCTGAAGCT GAATGCCTGA 270(4)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征.
(A)長度89個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)成鏈類型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Lys Gly Leu Ala Ala Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Thr Met-15 -10 -5Ala Leu Cys Ser Cys Ala Gln Val Gly Thr Asn Lys Glu Leu5 10Cys Cys Leu Val Tyr Thr Ser Trp Gln Ile Pro Gln Lys Phe Ile15 20 25Val Asp Tyr Ser Glu Thr Ser Pro Gln Cys Pro Lys Pro Gly Val30 35 40Ile Leu Leu Thr Lys Arg Gly Arg Gln Ile Cys Ala Asp Pro Asn45 50 55Lys Lys Trp Val Gln Lys Tyr Ile Ser Asp Leu Lys Leu Asn Ala60 65 70
權(quán)利要求
1.選自下組中的分離的多核苷酸，該組由如下組成(a)編碼具有圖1中的推導(dǎo)氨基酸序列的MIP-3多肽或該多肽的片段、類似物或衍生物的多核苷酸；(b)編碼具有由保藏在ATCC保藏號為75676的cDNA編碼的氨基酸序列的MIP-3多肽或該多肽的片段、類似物或衍生物的多核苷酸；(c)編碼具有圖2中的推導(dǎo)氨基酸序列的MIP-4多肽或該多肽的片段、類似物或衍生物的多核苷酸；(d)編碼具有由保藏在ATCC保藏號為75675的cDNA編碼的氨基酸序列的MIP-4多肽或該多肽的片段、類似物或衍生物的多核苷酸。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸為DNA。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸為RNA。
4.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸為基因組DNA。
5.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所說多核苷酸編碼具有圖1中推導(dǎo)氨基酸序列的MIP-3。
6.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所說多核苷酸編碼由ATCC保藏號75676的cDNA編碼的MIP-3多肽。
7.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所說多核苷酸編碼具有圖2中推導(dǎo)氨基酸序列的MIP-4。
8.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所說多核苷酸編碼由ATCC保藏號75675的cDNA編碼的MIP-4多肽。
9.權(quán)利要求1的多核苷酸，其具有圖1中所示的MIP-3編碼序列。
10.權(quán)利要求2的多核苷酸，其具有以ATCC保藏號75676保藏的MIP-3編碼序列。
11.權(quán)利要求1的多核苷酸，其具有圖2中所示的MIP-4編碼序列。
12.權(quán)利要求2的多核苷酸，其具有以ATCC保藏號75675保藏的MIP-4編碼序列。
13.含有權(quán)利要求2的DNA的載體。
14.用權(quán)利要求13的載體基因工程處理的宿主細(xì)胞。
15.一種生產(chǎn)多肽的方法，包括從權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞表達(dá)由所述DNA編碼的多肽
16.一種生產(chǎn)能表達(dá)多肽的細(xì)胞的方法，包括用權(quán)利要求13的載體基因工程處理細(xì)胞。
17.一種可與權(quán)利要求2的DNA雜交并編碼具有MIP-3活性的多肽的已分離的DNA。
18.一種可與權(quán)利要求2的DNA雜交并編碼具有MIP-4活性的多肽的已分離的DNA。
19.選自下組中的多肽，該組由如下組成(i)具有圖1中推導(dǎo)氨基酸序列的MIP-3多肽及其片段、類似物或衍生物，(ii)由ATCC保藏號75676的cDNA編碼的MIP-3多肽及該多肽的片段、類似物和衍生物，(iii)具有圖2中推導(dǎo)氨基酸序列的MIP-4多肽及其片段、類似物或衍生物，(iv)由ATCC保藏號75675的cDNA編碼的MIP-4多肽及該多肽的片段、類似物和衍生物。
20.權(quán)利要求19的多肽，其中多肽是具有圖1中的推導(dǎo)氨基酸序列的MIP-3。
21.權(quán)利要求19的多肽，其中多肽是具有圖2中的推導(dǎo)氨基酸序列的MIP-4。
22.抗權(quán)利要求19的MIP-3多肽的抗體。
23.抗MIP-3受體的抗體。
24.抗MIP-4受體的抗體。
25.抗權(quán)利要求19的MIP-4多肽的抗體。
26.權(quán)利要求19的MIP-3多肽的拮抗劑/抑制劑。
27.權(quán)利要求19的MIP-4多肽的拮抗劑/抑制劑。
28.一種治療需要MIP-3的病人的方法，包括給病人服用治療有效量的權(quán)利要求19的多肽。
29.一種治療需要MIP-4的病人的方法，包括給病人服用治療有效量的權(quán)利要求19的多肽。
30.一種治療需要抑制MIP-3的病人的方法，包括給病人服用治療有效量的權(quán)利要求26的拮抗劑/抑制劑。
31.一種治療需要抑制MIP-4的病人的方法，包括給病人服用治療有效量的權(quán)利要求27的拮抗劑/抑制劑。
32.一種含有權(quán)利要求19的MIP-3多肽和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
33.一種含有權(quán)利要求19的MIP-4多肽和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
34.選自下組中的分離的多核苷酸，該組由如下組成(a)編碼具有圖8中的推導(dǎo)氨基酸序列的MIP-1γ多肽或該多肽的片段、類似物或衍生物的多核苷酸；(b)編碼具有由保藏在ATCC保藏號為75572的cDNA編碼的氨基酸序列的MIP-1γ多肽或該多肽的片段、類似物或衍生物的多核苷酸；
35.權(quán)利要求34的多核苷酸，其中多核苷酸為DNA。
36.權(quán)利要求34的多核苷酸，其中多核苷酸為RNA。
37.權(quán)利要求34的多核苷酸，其中多核苷酸為基因組DNA。
38.權(quán)利要求35的多核苷酸，其中所說多核苷酸編碼具有圖8中推導(dǎo)氨基酸序列的MIP-1γ。
39.權(quán)利要求35的多核苷酸，其中所說多核苷酸編碼由ATCC保藏號75572的cDNA編碼的MIP-1γ多肽。
40.權(quán)利要求34的多核苷酸，其具有圖8中所示的MIP-1γ編碼序列。
41.權(quán)利要求35的多核苷酸，具有以ATCC保藏號75572保藏的MIP-1γ編碼序列。
42.含有權(quán)利要求35的DNA的載體。
43.用權(quán)利要求42的載體基因工程處理的宿主細(xì)胞。
44.一種生產(chǎn)多肽的方法，包括從權(quán)利要求43的宿主細(xì)胞表達(dá)由所述DNA編碼的多肽
45.一種生產(chǎn)能表達(dá)多肽的細(xì)胞的方法，包括用權(quán)利要求42的載體基因工程處理細(xì)胞。
46.一種可與權(quán)利要求35的DNA雜交并編碼具有MIP-1γ活性的多肽的已分離的DNA。
47.選自下組中的多肽，該組由如下組成(i)具有圖8中推導(dǎo)氨基酸序列的MIP-1γ多肽及其片段、類似物或衍生物，以及(ii)由ATCC保藏號75572的cDNA編碼的MIP-1γ多肽及該多肽的片段、類似物和衍生物。
48.權(quán)利要求14的多肽，其中多肽是具有圖8中的推導(dǎo)氨基酸序列的MIP-1γ。
49.抗權(quán)利要求47的多肽的抗體。
50.權(quán)利要求47的多肽的拮抗劑/抑制劑。
51.一種治療需要MIP-1γ的病人的方法，包括給病人服用治療有效量的權(quán)利要求47的多肽。
52.一種治療需要抑制MIP-1γ的病人的方法，包括給病人服用治療有效量的權(quán)利要求50的拮抗劑/抑制劑。
53.一種含有權(quán)利要求47的多肽和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
54.權(quán)利要求18的方法，其中通過向病人提供編碼所說多肽的DNA并在體內(nèi)表達(dá)該多肽來給予治療有效量的多肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了人巨噬細(xì)胞炎性蛋白-3、人巨噬細(xì)胞炎性蛋白-4和人巨噬細(xì)胞炎性蛋白1γ多肽和編碼這些多肽的DNA(RNA)。本發(fā)明還提供了用重組技術(shù)生產(chǎn)這些多肽的方法以及生產(chǎn)抗這些多肽的抗體的方法。本發(fā)明還提供了抑制這些多肽的功能的這些多肽的拮抗劑/抑制劑。本發(fā)明另一方面提供了本發(fā)明的多肽與適宜藥用載體的結(jié)合，以為各種相關(guān)疾病的治療提供治療有效量的多肽。
文檔編號A61P17/06GK1143894SQ94194902
公開日1997年2月26日 申請日期1994年6月28日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月22日
發(fā)明者李浩東, C·A·羅森, S·M·魯賓, M·D·亞當(dāng)斯 申請人:人類基因組科學(xué)公司